DIVERSIDADE MOLECULAR E FISIOLÓGICA DE Chromobacterium …
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UFMG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL DIVERSIDADE MOLECULAR E FISIOLÓGICA DE Chromobacterium sp. E OUTRAS BACTÉRIAS ISOLADAS DE DIFERENTES ECOSSISTEMAS TROPICAIS Belo Horizonte 2005 Cláudia Iracema Lima Bittencourt
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UFMG
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
DIVERSIDADE MOLECULAR
E FISIOLÓGICA DE Chromobacterium sp.
E OUTRAS BACTÉRIAS ISOLADAS DE
DIFERENTES ECOSSISTEMAS TROPICAIS
Belo Horizonte
2005
Cláudia Iracema Lima Bittencourt
DIVERSIDADE MOLECULAR
E FISIOLÓGICA DE Chromobacterium sp.
E OUTRAS BACTÉRIAS ISOLADAS DE
DIFERENTES ECOSSISTEMAS TROPICAIS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Genética.
Orientadora: Profa. Andréa Maria Amaral Nascimento Co-orientadores: Prof. Edmar Chartone de Souza
Prof. Fabrício Rodrigues dos Santos
Belo Horizonte
Departamento de Biologia Geral
Instituto de Ciências Biológicas
2005
“And in my view, you believe on the basis of compelling evidence.”
Carl Sagan
Dedico esta Dissertação ao meu pai, à minha mãe, e à minha irmãzinha, Dhrica, por acreditarem em mim e me apoiarem sempre. Ao Sueide, por estar sempre ao meu lado. Muito obrigada por estarem por perto!
AGRADECIMENTOS
A Deus sempre.
À Andréa Amaral, ao Edmar Chartone e ao Fabrício S. dos
Santos, meus orientadores, por acreditarem no meu potencial.
Aos Professores Spártaco Astolfi Filho, Marcos Callisto e
Jacques Nicoli pela contribuição neste trabalho.
Às professoras Adlane, Mônica e Marisa, e ao professor Álvaro,
pela constante transmissão de conhecimento.
Aos colegas de laboratório, Amanda, Ana Alice, Ana Raquel,
Carla, Daniela, Dulce, Frederico, Gabriel, Geovane, Gilka
Híggor, Karla , Kênia, Lília, Marcela, Michele, Rosana e
Rosângela por tornarem as horas mais divertidas.
Principalmente, à Carla, à Daniela, à Dulce, ao Híggor, ao
Leandro, à Lília, à Marcela, à Michele, à Paula, à Renata, ao
Rodrigo, à Rosana e ao Vinício pelo apoio na fase final.
Às Andréa Reis, Maria Rosa e Paixão pela manutenção do
laboratório.
Aos colegas, amigos e parentes, que estiveram presentes ao longo
desta trajetória.
À minha família, à minha avó Geralda e ao meu avô José
Soares por me fazerem acreditar que os obstáculos devem ser
sempre superados.
Ao Sueide, por acreditar em mim.
À CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro
LISTA DE ABREVIATURAS
3HB ácido 3-hidroxibutírico
3HC ácido 3-hidroxihexanóico
3HV ácido 3-hidroxivalérico
AN Agar Nutriente
BNGPC Brazilian National Genome Project Consortium
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIM50 Concentração Inibitória Mínima, na qual 50% dos isolados
foram inibidos.
CIM90 Concentração Inibitória Mínima, na qual 90% dos isolados
foram inibidos.
CN Caldo Nutriente
CNPq Conselho Nacioanal de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico.
HCN Gás cianeto de hidrogênio
ITS Seqüência espaçadora transcrita
MP máxima-parcimônia
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
NJ Neighbor-Joining
ORF Open Reading Frame
PCR Polimerase Chain Reaction
PERD Parque Estadual do Rio Doce
PHA polihidroxialcanoatos
PNSC Parque Nacional da Serra do Cipó
RDPII Ribosomal Database Project II
RRNDB Ribosomal RNA Operon Copy Number Database
UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean
LISTA DE FIGURAS
Pág.
1 Árvore filogenética universal determinada por comparações de
seqüências de rRNA 16S e 18S..................................................................
21
2 Seqüência anotada do gene de rRNA 16S de Escherichia coli com as
localizações dos iniciadores usados neste estudo e regiões variáveis V1-
V9...............................................................................................................
22
3 Mapa do Parque Nacional da Serra do Cipó.............................................. 27
4 Mapa do Parque Estadual do Rio Doce...................................................... 28
5 Mapa da bacia do Rio Negro...................................................................... 29
6 Colônias bacterianas apresentando diversas tonalidades de violeta........... 40
7 Isolado 32 apresentando coloração amarela antes da produção de
violaceína....................................................................................................
40
8 Árvore filogenética envolvendo 47 isolados bacterianos coletados no
PNSC, PERD e Rio Negro. A topologia da árvore foi gerada pelo
método de neighbour-joining (1000 repetições de Bootstrap e modelo
Kimura 2 parâmetros).................................................................................
52
9 Árvore filogenética envolvendo 48 isolados bacterianos, incluindo o
isolado 8, coletados no PNSC, PERD e Rio Negro. O haplótipo
referente a ele está marcado com um ponto azul. A topologia da árvore
foi gerada pelo método de neighbor-joining (1000 repetições de
bootstrap e modelo Kimura 2 parâmetros).................................................
53
10 Árvore filogenética envolvendo 48 isolados bacterianos, incluindo o
isolado 8, coletados no PNSC, PERD e Rio Negro. O haplótipo
referente a ele está marcado com um ponto azul. A topologia da árvore
foi gerada pelo método de máxima parcimônia (1000 repetições de
bootstrap)....................................................................................................
54
11 Ampliação do ramo de Chromobacterium da FIG. 8. Apresenta os
quatro agrupamentos (A, B, C e D) considerados consistentes pelo teste
de bootstrap. Mostra, também, os haplótipos referentes a cada uma das
áreas geográficas estudadas: H01 – Rio Negro; H02 – PERD; H03, H06,
H11, H12, H13 – PNSC............................................................................. 55
12 Concentrações Inibitórias Mínimas de ampicilina frente a 46 isolados
bacterianos..................................................................................................
57
13 Concentrações Inibitórias Mínimas de amoxicilina/ácido clavulânico
frente a 46 isolados bacterianos..................................................................
57
14 Concentrações Inibitórias Mínimas de cefotaxima frente a 46 isolados
bacterianos..................................................................................................
58
15 Concentrações Inibitórias Mínimas de quatro aminoglicosídeos frente a
46 isolados bacterianos. A. Estreptomicina. B. Gentamicina. C.
Amicacina. D. Canamicina.........................................................................
61
16 Concentrações Inibitórias Mínimas de cloranfenicol (A), rifanpicina (B),
ácido nalidíxico (C) e tetraciclina (D) frente a 46 isolados bacterianos.....
62
17 Concentrações Inibitórias Mínimas de bicloreto de mercúrio frente a 46
isolados bacterianos....................................................................................
63
18 Dendrograma do perfil de CIMs aos 11 antimicrobianos e o bicloreto de
mercúrio para os 33 isolados de Chromobacterium sp., determinado pela
medida de similaridade Euclidiana, método de UPGMA..........................
65
19 Isolados bacterianos crescidos em agar nutriente (30 µg/ml de
ampicilina). A coloração laranja ao redor da colônia indica presença de
β-lactamase.................................................................................................
68
20 Isolado 32 crescido em agar nutriente (30 µg/ml de ampicilina). A
coloração em cima da colônia indica presença de β-lactamase e esta não
é exportada..................................................................................................
68
21 Gel de agarose exibindo fragmentos de 1166 pb........................................ 70
22 Número absoluto de produtores de substância antagonista por C.
violaceum ATCC 12472, por 31 isolados de Chromobacterium sp. e 13
isolados de espécies de outros gêneros, frente às linhagens indicadoras:
E. coli K12 Row, S. typhimurium, S. flexineri, K. pneumoniae, P.
aeruginosa e S. aureus...............................................................................
72
23 A. Halo de inibição do isolado de Chromobacterium sp.(isolado 40)
frente à S. aureus. B. Detalhe da figura A..................................................
72
24 Halo de inibição do isolado R. aquatilis (isolado 8) frente à S.
aureus.........................................................................................................
73
LISTA DE TABELAS
Pág
1 Bactérias reveladoras usadas neste estudo................................................. 30
2 Isolados bacterianos coletados nos anos de 2001, 2003 e 2004, em
ecossistemas aquáticos e terrestres dos três sítios de coleta.......................
42
3 Nome específico mais provável alcançado para os 48 isolados
bacterianos..................................................................................................
48
4 Haplótipos gerados pelo programa DnaSP (Rozas & Rozas, 1999),
envolvendo 48 isolados bacterianos...........................................................
51
5 Perfil populacional de prevalência de antimicrobianos e mercúrio frente
a 33 isolados de Chromobacterium............................................................
64
6 Perfis de Concentrações Inibitórias Mínimas para os 46 isolados
bacterianos e a linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC
12472..........................................................................................................
66
LISTA DE QUADRO
Pág.
1 Características gerais do genoma de C. violaceum....................................... 18
SUMÁRIO
Pág
RESUMO......................................................................................................... 12
ABSTRACT..................................................................................................... 13
1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 14
1.1 Diversidade microbiana.................................................................................... 14
1.2 Características de Chromobacterium violaceum.............................................. 15
1.3 Genes de RNA ribossômico 16S – rRNA........................................................ 18
1.4 Resistência bacteriana a drogas........................................................................ 23
2 OBJETIVOS..................................................................................................... 26
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 27
3.1 Área de estudo.................................................................................................. 27
3.2 Amostras de água e solo e isolamento bacteriano............................................ 29
3.3 Estocagem......................................................................................................... 30
3.4 Linhagens bacterianas...................................................................................... 30
3.5 Antimicrobianos............................................................................................... 31
3.6 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos e ao mercúrio.......................... 31
3.7 Teste de detecção da produção de β-lactamase in vitro.................................. 32
3.8 Pesquisa in vitro de produção de substância antagonista (Kelner, 1948,
modificado).......................................................................................................
32
3.9 Teste de susceptibilidade de substâncias antagonistas a enzimas
proteolíticas......................................................................................................
32
3.10 Extração de DNA total..................................................................................... 33
3.11 Extração de DNA plasmidiano......................................................................... 34
3.12 Amplificação de rDNA 16S............................................................................. 34
3.13 Amplificação do gene ampC........................................................................... 35
3.14 Precipitação do produto de PCR para o seqüenciamento................................. 35
3.15 Seqüenciamento do gene de rRNA 16S........................................................... 36
3.16 Análise de dados............................................................................................... 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................... 38
4.1 Isolados bacterianos.......................................................................................... 38
4.2 Identificação molecular e filogenia.................................................................. 43
4.3 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos e ao mercúrio.......................... 55
4.4 Teste de produção in vitro de β-lactamase e amplificação do gene ampC....... 67
4.5 Pesquisa in vitro de produção de substância antagonista................................. 70
5 CONCLUSÃO.................................................................................................. 74
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 76
RESUMO
Chromobacterium violaceum, conhecida desde o século XIX, possui aspectos
biotecnológicos peculiares que a fizeram alvo do seqüenciamento de seu genoma, no
Brasil, a partir de uma linhagem de origem malaia. Assim, o objetivo principal deste
trabalho foi estudar a variabilidade de isolados brasileiros de Chromobacterium violaceum,
por meio de análises fisiológica e molecular, a partir de seqüências amplifcadas, por PCR,
de rDNA 16S. Para isso, foram isoladas bactérias de duas regiões geográficas diferentes,
Minas Gerais e Amazonas. Dos 48 isolados escolhidos, 34 pertenciam ao gênero
Chromobacterium, 12 faziam parte de outros gêneros e dois isolados não puderam ser
inicialmente classificados. No entanto, após análises filogenéticas, um deles, com uma das
seqüências que não foram, inicialmente, associadas com nenhum grupo taxonômico
conhecido, foi incluído no clado monofilético de Chromobacterium. A similaridade entre
os isolados de Chromobacterium e a linhagem padrão Chromobacterium violaceum ATCC
12472 foi de 98,2%. O teste de susceptibilidade aos antimicrobianos e ao mercúrio
mostrou uma alta diversidade nos perfis de CIMs para todos os isolados. Os três β-
lactâmicos – ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico e cefotaxima – foram, dentre os
antimicrobianos testados, os que apresentaram as maiores CIMs. O mecanismo provável de
resistência a essas drogas é a produção de β-lactamases, detectada pelo teste de degradação
de nitrocefina. Os isolados foram, ainda, estudados quanto à produção de substâncias
antagonistas frente a seis linhagens reveladoras, sendo Staphylococcus aureus a mais
sensível a tais substâncias. Os dados abrem perspectivas para empreender estudos no
sentido de conhecer a diversidades de genes, cujas funções biológicas ainda não foram
determinadas, e de outras bactérias isoladas da natureza, que podem apresentar também
potencial biotecnológico.
ABSTRACT
Chromobacterium violaceum, known since the 19th century, possesses peculiar
biotechnological aspects, that led to the sequencing of its genome in Brazil, beginning with
a strain of Malay origin. Thus, the main objective of this work was to study the variability
of Brazilian isolates of Chromobacterium violaceum, through physiologic and molecular
analyses, starting from amplified sequences of 16S rDNA, through PCR. For this purpose,
bacteria of two different geographical areas, Minas Gerais and Amazonas, were isolated.
Of the forty eight chosen isolates, thirty four belonged to the genus Chromobacterium,
twelve belonged to other genera, and two isolates could not be initially classified.
However, after phylogenetic analyses, one of these, having a sequence not associated with
any known taxonomic group, was included in the monophyletic clade of
Chromobacterium. The similarity between the Chromobacterium isolates and the standard
strain Chromobacterium violaceum ATCC 12472 was equivalent to 98,2%. The test of
susceptibility to antimicrobials and to mercury showed a high diversity in the MIC profiles
for all the isolates. The three β-lactamics (ampicilllin, amoxicillin/clavulanic acid e
cefotaxin) were, among the antimicrobials tested, the ones that presented the largest MICs.
The probable mechanism of resistance to those drugs is the production of β-lactamases,
detected by the test of nitrocefin degradation. The isolates were also studied with
relationship to the production of antagonistic substances, and their action tested against six
strains of bacteria, being Staphylococcus aureus the most sensitive to such substances.
These data open perspectives for studies of the diversity of genes, whose biological
functions are not yet determined, and of other bacteria isolated from nature, that can also
present biotechnological potential.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Diversidade microbiana
O mundo microbiano é imenso, existindo mais de 1030 indivíduos em nosso
planeta de inúmeras espécies, das quais conhecemos pouquíssimas. Estima-se que existam
109 vezes mais bactérias na Terra do que estrelas no Universo (Whitman et al., 1998).
Assim, a maior parte da diversidade biológica e da biomassa na Terra são constituídas de
microrganismos.
Os procariotos são capazes de colonizar todos os ecossistemas existentes na
Terra e são imprescindíveis para os ciclos biogeoquímicos e cadeias alimentares, mantendo
interações vitais entre si e com os organismos complexos. Ocorrem em todos os habitats,
inclusive naqueles em que a única fonte de energia consiste em matéria inorgânica
(Newman & Banfield, 2002). Devido a essa flexibilidade adaptativa, as bactérias têm
promovido mudanças geoquímicas na biosfera, favorecendo o surgimento de novos nichos
ecológicos.
A diversidade bacteriana reflete seu genoma que é extremamente dinâmico,
podendo adquirir e perder genes, formando um conjunto genômico adaptado a cada hábitat
determinado. As alterações responsáveis pela plasticidade do genoma são, em sua maioria,
resultantes da transferência gênica horizontal (Dobrindt & Hacker, 2001).
Embora as bactérias possuam multiplicação basicamente clonal, os
mecanismos promotores da plasticidade do genoma eventualmente geram variabilidade nas
populações. Alguns indivíduos que divergiram, por sua vez, produzem uma nova
população que competirá, com a população anterior, pelos recursos existentes naquele
ambiente ou ocuparão um novo nicho. Uma conseqüência deste processo é a manutenção
do equilíbrio da comunidade formada por várias populações de espécies bacterianas (Kerr
et al., 2002).
Estudar a diversidade pode trazer uma melhora na qualidade de vida, ajudando
na conservação e na biorremediação de áreas impactadas. Pode, também, ampliar
conhecimentos sobre os ciclos biogeoquímicos, interações que mantêm uma comunidade e
novos conjuntos gênicos. Pode também gerar novos produtos farmacêuticos, recursos
biotecnológicos e de produção de energia (Davies, 1999).
1.2 Características da Chromobacterium violaceum
Em 1880, um pesquisador de nome Bergonzini, procurando determinar os
mecanismos que atrasam a deterioração de matérias orgânicas, fez soluções à base de
albumina. Porém, esqueceu-se de descartar o material após o experimento e, quando se
lembrou, a solução estava contaminada e apresentava uma coloração violeta. Naquela
época, conhecia-se apenas uma espécie de bactéria que possuía tal coloração –
Cromococcus violaceus. Entretanto, como não conseguiu dissolver a massa violeta em
água, concluiu que a bactéria contaminante era uma nova espécie. Desta forma, a nova
bactéria foi denominada Cromobacterium violaceum. Em 1881, Zimmerman corrigiu o
nome da espécie, acrescentando o h, assim Chromobacterium passou a ser escrito como se
conhece hoje (Durán & Menck, 2001).
O gênero Chromobacterium possuía duas espécies: C. violaceum e C.
fluviatile. No entanto, a espécie C. fluviatile foi transferida para o gênero Iodobacter,
passando a se chamar Iodobacter fluviatilis (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen, 2003). As duas espécies anteriores mais Janthinobacterium lividum
pertencem à classe das β-Proteobacteria, sendo que C. violaceum e I. fluviatilis pertencem
à família Neisseriaceae, enquanto J. lividum, à família Oxalobacteriaceae
(Taxonomy/NCBI). As três espécies são bastonetes Gram-negativos, oxidase e catalase
positivos, produtores de violaceína, ou seja, apresentam coloração violeta (Logan & Moss,
1992). A distinção das três espécies é fundamental para que se possa estudar
individualmente cada uma.
C. violaceum é constituída por bastonetes com espessura variando de 0,6-0,9
µm e 1,5-3,5 µm de comprimento. Esses podem se apresentar pigmentados ou não.
Possuem mobilidade, apresentando um único flagelo polar e flagelos laterais ou subpolares
mais longos. Produzem colônias, em meio sólido, cremosas e violetas, enquanto ocorre a
formação de um halo violeta na superfície do caldo e, em alguns casos, podem colorir o
meio totalmente. São bactérias aeróbicas facultativas. Podem utilizar citrato e amônia
como fontes únicas de carbono, porém seu crescimento é mais lento (Sivendra, et al., 1975;
Holt & Krieg, 1984). C. violaceum também é naturalmente resistente às penicilinas,
possuindo em seu genoma o gene de resistência ampC (Fantinatti-Garboggini et al., 2004).
C. violaceum desperta grande interesse biotecnológico, devido ao seu amplo
potencial para uso industrial, farmacêutico e ecológico (Carepo et al., 2004). Dentre os
vários produtos biológicos interessantes destacam-se: a violaceína, polihidroxialcanoatos
(PHAs), cianeto de hidrogênio, antibióticos e quitinase.
A violaceína é a substância que chama a atenção para a bactéria por ser o
pigmento que tinge suas colônias de violeta. Além disso, atua como antimicrobiano contra
bactérias Gram-positivas e negativas, como fungicida contra o fungo fitopatogênico
Rosellinia necatrix, como antiviral contra Herpes Simplex e Poliovírus e possui atividade
contra Trypanosoma cruzi (Durán & Menck, 2001) e Leishmania amazonensis (Leon et al.,
2001). A violaceína, também, age contra células de alguns tumores in vitro: leucemia,
linfoma, câncer de pulmão e cólon (Durán & Menck, 2001). August et al. (2000)
caracterizaram o operon vioABCD, que é responsável pela síntese de violaceína. O gene
vioA possui o tamanho de 1257 pb, vioB, 2997 pb, vioC, 1290 pb e vioD, 1122 pb.
PHAs são polímeros biodegradáveis que se assemelham ao polietileno,
podendo, assim, substituir os plásticos derivados de petróleo. Eles têm a função de
armazenar energia e prover carbono para bactérias que se encontram em ambientes com
restrições nutricionais. Três monômeros podem estar envolvidos na formação de
polímeros: 3HB (ácido 3-hidroxibutírico), 3HV (ácido 3-hidroxivalérico) e 3HC (ácido 3-
hidroxihexanóico). PHAs podem existir como homopolímeros ou como heteropolímeros.
C. violaceum tem a capacidade de acumular, em sua célula, polímeros compostos por 3HB
e 3HV (Kolibachuk et al., 1999).
C. violaceum pode ser usada, ainda, para solubilizar ouro pela produção do gás
cianeto de hidrogênio (HCN), o qual reage com o ouro para formar o complexo [Au(CN)2-]
(Duarte et al., 2004; Faramarzi et al.; 2004). Isso se torna interessante, pois evita a
contaminação do meio ambiente pelo processo tradicional, quando se usa mercúrio para
resgatar o metal precioso (Brazilian National Genome Project Consortium – BNGPC,
2003). A utilização desse microrganismo para extração de ouro apresenta duas vantagens.
A primeira corresponde à recuperação de mais partículas de ouro que o processo
tradicional, podendo alcançar 1000 partes por milhão de metal após 40 dias de incubação.
A outra vantagem é a extração de ouro de materiais com baixo conteúdo deste metal
(Durán & Menck, 2001).
Metabólitos secundários de C. violaceum têm ação bactericida ou
bacteriostática contra bactérias Gram-negativas e positivas. Essas substâncias
correspondem a antibióticos de várias classes, como glicopeptídeos e β-lactâmicos – agem
contra Gram-negativos – e monobactâmicos, aerocianidina e aerocavin – atuam contra
ambos os tipos de bactérias (Durán & Menck, 2001). Além disso, produz compostos que
atuam sinergisticamente com antibióticos β-lactâmicos (Cooper et al., 1985).
Outra característica interessante de C. violaceum é a produção de quitinase que
tem um papel fundamental para o controle de pragas, uma vez que o controle biológico
evita o uso de agrotóxicos, melhorando a qualidade dos produtos a serem consumidos e
promovendo menor impacto ambiental e desequilíbrio ecológico (Chernin et al., 1998;
BNGPC, 2003).
O quorum sensing, fenômeno de comunicação celular e regulação gênica
controlado pela densidade celular (McClean et al., 1997; Blosser & Gray, 2000), é
observado em C. violaceum. Quando a densidade celular atinge o nível adequado, o
quorum sensing é responsável pela regulação de várias características fenotípicas, como
produção de biofilme, síntese de violaceína, exportação de várias proteases, incluindo
quitinase e elastase, produção de HCN e de antibióticos (Durán & Menck, 2001; BNGPC,
2003).
A C. violaceum ocorre na água doce e no solo dos vários ecossistemas de
regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, está presente em grande quantidade no Rio
Negro, Amazônia (Caldas, 1990), e também em rios e solo do Parque Nacional da Serra do
Cipó, MG (Bittencourt, 2003). É considerada como um organismo saprófito, não
patogênico para humanos, podendo, no entanto, tornar-se um patógeno oportunista (Durán
& Menck, 2001). As infecções são geralmente associadas com pessoas
imunocomprometidas, entretanto existe um relato de infecção, no Brasil, que ocorreu em
uma pessoa saudável (Martinez et al., 2000). C. violaceum pode infectar outros mamíferos,
como porcos, primatas em geral e gado (Zins et al., 2001).
Quando C. violaceum infecta um indivíduo, apresenta-se extremamente
virulenta, com alta mortalidade em um curto período de tempo. A infecção se processa
através da pele lesada ou por ingestão de água contendo o microrganismo, podendo
avançar para uma septicemia. A doença provocada por C. violaceum é caracterizada por
vários abscessos cutâneos e viscerais, sendo o fígado e os pulmões os principais órgãos
atingidos (Martinez et al., 2000).
Essas características peculiares de C. violaceum foram algumas das razões para
que ela fosse selecionada para ter seu genoma seqüenciado pela Rede Nacional de
Seqüenciamento do Projeto Genoma Brasileiro, patrocinado pelo CNPq. As informações
do seqüenciamento do genoma de C. violaceum são mostradas no QUADRO 1. O seu
genoma é formado por um cromossomo circular com 4.751.080 pares de bases, com 89%
de regiões codificantes. Destas ORFs, aproximadamente 61% codificam proteínas
conhecidas. As outras 39% são proteínas hipotéticas, que são divididas em proteínas
conservadas e exclusivas de C. violaceum. O genoma apresenta 98 genes de tRNA, que são
capazes de transcrever transportadores para os 20 aminoácidos da célula. Os genes de
rRNA estão agrupados em oito operons. Todos eles contêm seqüências idênticas da região
codificadora (BNGPC, 2003).
QUADRO 1. Características gerais do genoma de C. violaceum
Comprimento, pb 4.751.080 Conteúdo G + C 64,83% Número total de ORFs 4.431 Porcentagem de regiões codificadoras 89% Comprimento médio por ORF, pb 954 Número de proteínas conhecidas 2.717 Número de proteínas hipotéticas conservadas 958 Número de proteínas hipotéticas exclusivas 756 Operons de rRNAs 8 x (16S-23S-5S) Genes de tRNAs 98 FONTE: BNGPC, 2003 (modificado).
1.3 Genes de RNA ribossômico 16S – rRNA
Os genes de rRNA (rDNA) são fundamentais para a manutenção de qualquer
célula, pois são constituintes do ribossomo, juntamente com as proteínas que o formam,
participando, assim, da síntese de proteínas. Por serem tão importantes, mais de 80% da
transcrição de uma célula (procariótica ou eucariótica) correspondem aos rRNAs (Gorab,
2001; Lewin, 2000). Os genes de rRNA estão presentes em múltiplas cópias. A divergência
entre cópias é praticamente nula, geralmente menos de 1% (Lewin, 2000). Em bactérias, os
genes de rRNA estão organizados em operons. O número de operons em uma bactéria
pode variar de um até 15 destes agrupamentos (Bosshard et al., 2002).
Existem, em procariotos, três tipos de rRNA: 5S, 16S e 23S. Geralmente, os
genes do rRNA 16S (participante da subunidade menor do ribossomo), 5S e 23S
(participantes da subunidade maior do ribossomo) estão agrupados in tanden. Entre os
genes 16S e 23S existe uma seqüência espaçadora transcrita – ITS. Essa região apresenta
elementos repetitivos que variam de número entre ITS. A região intergênica é responsável
pela variação de tamanho de um operon ribossômico para outro. Os quatro elementos são
gerados em um bloco único –rRNA 30S –, sendo considerados rRNAs maduros depois do
processamento pós-transcricional (Lewin, 2000; Ribosomal RNA Operon Copy Number
Database – RRNDB).
O seqüenciamento do rDNA tem sido, atualmente, utilizado para recuperar
dados de diversidade e filogenia entre as espécies bacterianas, mas também para análises
de classificação, identificação de espécies e heterogeneidade interespecífica (Bosshard et
al., 2002). Essa ferramenta possui algumas vantagens – os genes de rRNA permanecem
conservados em toda a sua extensão e estrutura. Portanto, quando ocorrem substituições de
nucleotídeos, esses funcionam como um relógio para a história evolutiva. Além disso, a
molécula como um todo não evolui igualmente, possuindo regiões mais conservadas e
outras mais variáveis (Kolbert & Persing, 1999). Mas também são homólogas entre os
organismos, fornecendo informações suficientes para comparações e parecem não sofrer
interferência da transferência lateral. Assim, os genes de rRNA retratam relações
filogenéticas entre os organismos (Olsen et al., 1986).
Das três moléculas, o rRNA 16S é a mais usada, possuindo em média 1500
nucleotídeos de comprimento. Ela guarda mais informação filogenética que o rRNA 5S
(~120 nucleotídeos), pois apresenta mais nucleotídeos variáveis. Por ser um gene bastante
conservado, reporta eventos evolutivos antigos, sendo utilizado principalmente para
delimitar táxons acima do nível de espécies (Olsen et al., 1986; Madigan et al., 1996). Por
outro lado, o rRNA 23S (~2500 nucleotídeos) tem um poder de resolução maior para
reconstruções filogenéticas e estudos de espécimes próximas, mas por ser menor e de fácil
seqüenciamento o rRNA 16S é mais utilizado (Kolbert & Persing, 1999; Rosselló-Mora &
Amann, 2001).
Atualmente, seqüências com características filogenéticas semelhantes à do
rDNA são consideradas como genes de referência. Esses genes, como citocromo c oxidase
I (Herbert et al., 2004a), mostram-se capazes de conduzir um indivíduo a uma determinada
espécie, mas também são úteis para descobrir espécies novas. Os genes de referência, desta
forma, são denominados DNA Barcodes. (Herbert et al., 2004b; Moritz & Cícero, 2004).
Um dos primeiros estudos de filogenia, usando as seqüências do rDNA 16S e
18S, mostrou que a vida era dividida em três domínios – Bacteria, Archaea e Eucaria (FIG.
1) – ao invés de dois – Procarioto e Eucarioto (Olsen et al., 1986; Woese, 1987; Oliveira &
Menck, 2001).
A utilização da molécula de rDNA 16S determinou um novo conceito de
espécie para bactéria. Assim, dois indivíduos são “conceitualmente” considerados
membros da mesma espécie se apresentarem igual ou mais que 97% de identidade
(Madigan et al., 1996). Entretanto, apenas regiões variáveis do gene (FIG. 2) – podem
existir nove destas regiões – V1-V9 – são suficientes para promover a identificação
bacteriana. Estas regiões são menores, facilitando o seqüenciamento e a análise (Bosshard
et al., 2002; Grahn et al., 2003).
Portanto, uma maneira de acessar a diversidade bacteriana encontrada nos
ambientes naturais é o rRNA 16S. Isso se torna relevante, porque a maior parte dos
microrganismos não é cultivável – apenas 1% dos microrganismos é cultivável utilizando
técnicas de rotina – assim, a amplificação dessa seqüência ou parte dela associada com
abordagens de comparação de DNA facilitam a caracterização da microbiota desconhecida
(Hugenholtz & Pace, 1996; Dahllöf, 2002). Portanto, estudos de ecologia microbiana
podem alcançar uma variedade nova de microrganismos, levando ao melhor entendimento
da dinâmica de um determinado ambiente (DeLong, 1997).
FIGURA 1 – Árvore filogenética universal determinada por comparações de seqüências de rRNA 16S e 18S. FONTE: Woese, 1987 (modificado).
FIGURA 2 – Seqüência anotada do gene de rRNA 16S de Escherichia coli com as localizações dos iniciadores usados neste estudo e regiões variáveis V1-V9. Fonte: Baker et al., 2003 (modificado).
FIGURA 2 – Seqüência anotada do gene de rRNA 16S de Escherichia coli com as localizações dos iniciadores usados neste estudo e regiões variáveis V1-V9. Continuação. Fonte: Baker et al., 2003 (modificado).
1.4 Resistência bacteriana a drogas
Bactérias apresentam uma grande variabilidade genética, o que lhes permite
responder rapidamente às mudanças do ambiente. A resistência a antibióticos é o melhor
exemplo conhecido da rápida adaptação das bactérias a um novo ecossistema. A
capacidade das bactérias de expandir seu nicho ecológico na presença de agentes
antimicrobianos pode ser devido à mutação e/ou à aquisição de genes de resistência pela
transferência gênica horizontal (Anderson & Levin, 1999).
A mutação espontânea e a recombinação de genes são eventos naturais e
primordiais para evolução dos seres vivos e são os responsáveis, ao lado da pressão
seletiva, pelo surgimento de resistência aos antimicrobianos (Chartone-Souza,1998). A
flexibilidade genética e a versatilidade das bactérias contribuem amplamente para
eficiência do fenômeno de resistência que tem se disseminado por diversos ambientes e
entre diferentes gêneros e espécies bacterianas (Levy, 1997). As bactérias tornam-se
resistentes aos antimicrobianos pela alteração, substituição ou superprodução do alvo, por
modificação ou inativação do antimicrobiano por enzimas, por inibição da permeabilidade
ou efluxo da droga (White & McDermott, 2001).
A resistência bacteriana também pode ser devida à estrutura do próprio genoma
da espécie, conhecida como resistência intrínseca. Um exemplo, é o gene ampC, que
codifica β-lactamase – enzima inativadora de penicilina e antibióticos derivados deste –
encontrado em C. violaceum. Outro exemplo envolve as bombas de efluxo, que têm a
capacidade de transportar moléculas estruturalmente não relacionadas, em diversas
bactérias (Normark e Normark, 2002). Esses genes, primariamente, devem ter tido funções
essenciais de manutenção da célula, uma vez que são encontrados em grande parte dos
isolados bacterianos ambientais. Assim, a resistência seria ocasionada por atividades
adicionais desses genes. Um dado que reforça essa hipótese é que nem sempre todos os
antibióticos existentes atualmente estiveram presentes no meio ambiente, mas existem
isolados que apresentam resistência a eles (Baquero e Blázquez, 1997; Alonso et al.,
2001).
Mecanismos como mutações em genes reguladores podem gerar bactérias com
altos níveis de resistência. Um bom exemplo disso é o gene ampC cromossômico. Esse
gene é indutivo, em organismos como Citrobacter freundii e Pseudomonas aeruginosa, na
presença de β-lactâmicos. Ele pode ser expresso em grandes quantidades quando mutações
de ponto e inserções aumentam a sua transcrição, promovendo, assim, uma alta produção
constitutiva da enzima (Hanson & Sanders, 1999; Normark e Normark, 2002).
Desde a descoberta da penicilina, os antibióticos vêm sendo amplamente
utilizados no tratamento de doenças infecciosas nas medicinas humana e veterinária, na
agricultura e pecuária. Levy (2002) relata que nos Estados Unidos são usados 23 x 106 kg
de antibióticos anualmente. Destes, 11,5 x 106 kg foram utilizados na medicina humana, 7
x 106 kg em rações e 45 x 103 kg na agricultura. A utilização constante e indiscriminada
dos antimicrobianos promoveu a seleção e disseminação de linhagens bacterianas
resistentes a tais drogas, contribuindo na seleção das mesmas e na eliminação daquelas que
eram susceptíveis (Levy, 1997; O’Brien, 2002). A seleção e a dominância das linhagens
bacterianas resistentes em um determinado ambiente exposto aos antimicrobianos estão
associados à resistência adquirida desses microrganismos (Rowe-Magnus & Mazel, 1999).
Os principais fatores que contribuem para a rápida disseminação da resistência de
microrganismos comensais para patógenos bacterianos são a exposição das bactérias aos
antimicrobianos, que atuam como agentes seletivos, e a presença e transferência promíscua
dos genes de resistência por elementos móveis: plasmídios, transposons e sistema integron-
cassete (Levy, 1997; Witte, 2000).
Embora a resistência antimicrobiana tenha sido vista tradicionalmente como
um problema clínico ela é também um problema socioeconômico e ecológico (Summers,
2002). Ecológico, pois a poluição do mercúrio, por exemplo, pode contribuir também para
o aumento da resistência a antibióticos (McArthur & Tuckfield, 2000) e para a seleção de
outros marcadores de resistência. Portanto, a expressão simultânea da resistência a
antibióticos e mercúrio pode ser causada por seleção, como conseqüência do mercúrio
presente no ambiente (Sant’ana et al., 1989)
Estudos recentes vêm sendo realizados para avaliar o impacto da utilização dos
antibióticos e a diversidade dos genes de resistência a essas drogas em populações
bacterianas de ambientes naturais (Aminov et al., 2001; Chee-Sanford et al., 2001). Nesses
estudos, a análise filogenética da seqüência conservada de genes de resistência a
antibióticos pode ainda ajudar a elucidar as relações evolutivas entre esses
microrganismos. Esses esforços são importantes para compreender a origem e a
distribuição de resistência em ambientes naturais e desenvolver mecanismos para evitá-la.
2 OBJETIVOS
Considerando a relevância dos aspectos biológicos, o grande potencial
biotecnológico de C. violaceum e que ainda não existem estudos de diversidade dos
isolados brasileiros, uma vez que a linhagem seqüenciada no Brasil é de origem malaia,
este trabalho se propõe analisar a variabilidade de isolados de C. violaceum e alcançar os
objetivos específicos que se seguem:
1. Coletar amostras de água e solo de cabeceiras da bacia do Rio Doce e de solo no
Parque Nacional da Serra do Cipó (MG).
a. Isolar e identificar C. violaceum.
b. Preservar esses isolados, visando estruturar um acervo de longo-termo.
2. Caracterizar a diversidade genética desta coleção representativa de C. violaceum
isoladas de diferentes regiões geográficas: Amazonas e Minas Gerais.
a. Realizar extração de DNA total dos isolados.
b. Desenhar os iniciadores específicos para PCR
c. Confirmar a identificação taxonômica dos isolados por meio de
seqüenciamento e análise filogenética de rDNA 16S.
d. Verificar a presença do gene ampC por PCR.
3. Pesquisar a presença de plasmídios.
4. Determinar a susceptibilidade dos isolados, frente a diversos antimicrobianos.
a. Determinar as concentrações inibitórias mínimas para 11 antimicrobianos
incluindo o mercúrio.
b. Verificar a produção de β-lactamase.
5. Pesquisar a produção de antibióticos ou substâncias antagonistas nesses isolados
contra algumas bactérias patogênicas e oportunistas.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de estudo
O Parque Nacional da Serra do Cipó – PNSC – (19-20ºS; 43-44ºW) situa-se no
centro de Minas Gerais, possuindo o papel de divisor de águas dos rios São Francisco e
Doce (FIG. 3). O PNSC, com 33.800 hectares, abriga uma vegetação composta de cerrado
nas altitudes inferiores a 1.000 m, campos rupestres nas partes mais altas e mata ciliar nos
vales mais úmidos e ao longo dos rios (Galdean et al., 2000). Assim, de acordo com estudo
prévio (Bittencourt, 2003), os sítios de coleta, nos trechos de 1ª, 2ª, 3ª, 4ª e 5ª ordens do
córrego Indaiá, são considerados adequados para o isolamento de C. violaceum. Foi
também realizada uma coleta numa área em torno do córrego Indaiá com amostragem de
solo, em 2004. As coletas de água foram feitas nos anos de 2001, 2003 e 2004.
FIGURA 3 – Mapa do Parque Nacional da Serra do Cipó. FONTE: Galdean et al., 2000 (modificado).
O Parque Estadual do Rio Doce – PERD – (19º29’-19º48’S e 42º28’-42º38’W)
– fica situado no trecho médio do Vale do Rio Doce, MG (FIG. 4). O PERD constitui-se na
maior "ilha" de Mata Atlântica de Minas Gerais, com 36.113,6 hectares e está inserido no
bioma Mata Atlântica. A mata que nele ocorre pertence à formação Floresta Pluvial
Atlântica Baixo-Montana. O seu sistema hídrico é formado por cerca de 50 lagoas,
correspondentes a 6% de sua área (Instituto Estadual de Florestas – online). No PERD, o
local de coleta foi a Lagoa Gambazinho, nos anos de 2001 e 2003.
FIGURA 4 – Mapa do Parque Estadual do Rio Doce. FONTE: Bortoluzzi et al., 2004.
O Rio Negro possui mais de 1.750 km de extensão, atravessando a floresta
amazônica – floresta tropical úmida. A união desse rio com o Rio Solimões, em Manaus –
Estado do Amazonas – forma o Rio Amazonas (FIG. 5). O Rio Negro apresenta águas
escuras devido à dissolução de ácidos e de matéria orgânica. Sua bacia possui uma área de
690.000 km2 (Jardim & Fadini, 2001). Foram amostrados pela equipe do Dr. Spártaco
Astolfi Filho da UFAM, alguns pontos ao longo do Rio Negro, próximo a Manaus.
FIGURA 5 – Mapa da bacia do Rio Negro. FONTE: Jardim & Fadini, 2001.
3.2 Amostras de água e solo e isolamento bacteriano
As amostras de água foram coletadas em frascos esterilizados em
profundidades entre 15 e 20 cm.
Alíquotas de 100 µL de água foram semeadas em placas contendo Agar
Nutriente (AN) ¼ (Agar Difco; Caldo Nutriente Difco) com a concentração de 25% de
nutrientes (Logan & Moss, 1992), e incubadas a 25°C por até sete dias. No em torno do
vale do Córrego Indaiá foi feita também coleta de solo em placas de Petri esterilizadas.
Uma amostra desse solo foi diluída em água deionizada esterilizada e, posteriormente, 100
µL foram semeados utilizando o mesmo procedimento anteriormente descrito. Isso
favoreceu a obtenção e seleção de colônias bacterianas violetas. Posteriormente, essas
colônias foram crescidas também a 4ºC e a 37ºC por sete dias. Os isolados que cresceram a
37ºC e não a 4ºC foram selecionados para análises posteriores.
3.3 Estocagem
Os isolados bacterianos foram repicados em tubos com Caldo Nutriente (CN),
com ¼ de concentração, incubados por 15 horas, a 25°C. Após esse período, misturou-se
uma alíquota de cada cultura, separadamente, com glicerol a 15%. Estes, por sua vez,
foram, primeiramente, armazenados à temperatura de -20 ºC por 24 horas e, em seguida,
estocados em um ultrafreezer a –80°C.
3.4 Linhagens bacterianas
A linhagem de C. violaceum ATCC 12472, da Malásia, seqüenciada no Brasil,
foi usada como controle neste estudo. Ela foi cedida gentilmente pelo Dr. Spártaco Astolfi
Filho (Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas).
Para a detecção da presença de substâncias antagonistas produzidas pelos
isolados em estudo, foram usadas seis linhagens de bactérias reveladoras (TAB. 1).
TABELA 1 – Bactérias reveladoras usadas neste estudo
Linhagens Procedência
Escherichia coli K12 Row
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella thyphimurium
Shigella flexineri
Staphylococcus aureus
LGMM
LGMM
ATCC 27853
ATCC13311
LGMM
ATCC 25923
ATCC: American Type Culture Colection, Colindale UK. LGMM: Coleção do Laboratório de Genética Molecular e de Microrganismos ICB – UFMG.
3.5 Antimicrobianos
Das 12 drogas usadas, 11 são antimicrobianos: tetraciclina (Tc – Teuto
Brasileiro), gentamicina (Gm – Schering-Plough); ácido nalidíxico (Nx – Sanofi),
cloranfenicol (Cm – Medley), rifamicina (Rf – EMS), ampicilina (Ap – BASF GeneRix),
amoxicilina/ácido clavulâmico (Am – Glaxo); estreptomicina (Sm – Sigma), canamicina
(Km – GibcoBRL), amicacina (Am – Bristol-Myers) e cefotaxima (Cf – Unida Química); e
um metal pesado, bicloreto de mercúrio (Hg – Reagen). Essas drogas foram diluídas em
água deionizada esterilizada, nas concentrações adequadas para o experimento de
susceptibilidade aos antimicrobianos e ao mercúrio com exceção de tetraciclina,
cloranfenicol e rifamicina, que foram dissolvidas anteriormente em metanol, e ácido
nalidíxico, em hidróxido de sódio 1 N.
3.6 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos e ao mercúrio
A susceptibilidade a drogas foi determinada pelo método da diluição em meio
sólido (Agar Müller-Hinton – OXOID – para os antimicrobianos e AN acrescido de 0,5%
de cloreto de sódio para o bicloreto de mercúrio). O meio foi suplementado com
concentrações múltiplas de dois (2 até 128 µg/mL) dos 11 antimicrobianos, separadamente,
com exceção de ampicilina e de amoxicilina/ácido clavulâmico para as quais foram feitas
diluições até 1024 µg/mL. As diluições para bicloreto de mercúrio foram até 16 µg/mL.
Utilizou-se um inóculo padrão, contendo cerca de 105 UFC/ponto, de uma
cultura desenvolvida, em caldo, em replicador tipo Steer, o qual Possibilitou a aplicação
simultânea de 32 amostras por placa.
Depois desse procedimento, a leitura dos resultados foi feita após 24 horas de
incubação a 25°C, estabelecendo-se a concentração inibitória mínima (CIM) como a menor
concentração que inibiu o crescimento de cada isolado bacteriano.
3.7 Teste de detecção da produção de β-lactamase in vitro
Sobre cada colônia crescida em Agar suplementado com ampicilina, por 48
horas, acrescentou-se uma gota de nitrocefina (Glaxo Research). Esse composto é uma
cefalosporina cromogênica que apresenta mudança de cor (amarelo para laranja) em
conseqüência de sua clivagem, por qualquer β-lactamase. Assim, a presença de cor laranja
sobre e/ou em torno da colônia foi considerada reação positiva (produção de β-lactamase).
3.8 Pesquisa in vitro de produção de substância antagonista (Kelner, 1948,
modificado)
Os isolados bacterianos estocados no freezer foram transferidos para CN ¼, a
25ºC, por 15 horas. Posteriormente, foram inoculados 3 µL, desta cultura, em pontos no
meio sólido. Em seguida, incubaram-se as placas por 48 horas a 25ºC. Após esse período,
colocou-se 1 mL de clorofórmio na tampa da placa de Petri, invertida, por um período de
30 minutos, a fim de que as colônias fossem mortas com o vapor. Em seguida, abriu-se a
placa, por mais 30 minutos, para que o clorofórmio residual evaporasse.
As linhagens reveladoras também foram crescidas em CN, por 15 horas, a
37ºC. Após esse período, uma alíquota de 100 µL de cada cultura foi transferida para o
meio semi-sólido (Agar 0,7%; Caldo Nutriente), sendo bem homogeneizado. A mistura
formada foi transferida para a superfície da placa de Petri, contendo as colônias já mortas.
Em seguida, a placa foi incubada a 37ºC, por 15 horas, para a visualização do resultado, o
qual quando positivo correspondia à formação de halos de inibição do crescimento das
bactérias reveladoras sobre e/ou em torno das colônias produtoras.
3.9 Teste de susceptibilidade de substâncias antagonistas a enzimas proteolíticas
Os isolados produtores de substância antagonista foram crescidos em CN ¼,
por 15 horas à temperatura de 25ºC. Em seguida, inoculou-se 5 µL dessa cultura sobre um
filtro de nylon de 0,22 µm, em AN ¼. Após o crescimento por 48 horas à 25ºC, retirou-se
o filtro e sobre o local adicionou-se 50 µL de proteinase K (20 µg/ml). Esperou-se 2 horas,
para a enzima agir, antes de realizar o procedimento de sobrecamada. Se o crescimento da
linhagem reveladora mostrasse a redução do halo de inibição, a substância antagonista era
considerada de origem protéica.
3.10 Extração de DNA total
Os isolados bacterianos foram crescidos em 5 mL de caldo Broth Heart
Infusion (BHI), por até 18 horas, a 30ºC, sob agitação. Em seguida, essa cultura foi
transferida para tubos de 1,5 mL e centrifugada por 2 minutos a 13400 rpm. Após esse
procedimento, o sedimento foi ressuspendido em 1 mL de Solução 1 (Tris-HCl 10 mM pH
7,0; EDTA 10 mM pH 8,0; NaCl 300 mM) e novamente centrifugado nas condições
anteriores. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 300
µL de Solução 2 (Tris-HCl 25 mM pH 8,0; EDTA 10 mM pH 8,0; NaCl 10 mM). A essa
mistura foi acrescentado 300 µL de lisozima (10 mg/mL). A lisozima foi dissolvida na
Solução 2. Essa mistura foi incubada em gelo por 10 minutos, sendo transferida para um
banho de água a 37°C por mais 10 minutos. Após esse período, foi acrescentada à mistura
22 µL de sarcosil 30%, à qual foi posteriormente incubada por 20 minutos a 65°C e 5
minutos em gelo. A esse preparo foram adicionados 600 µL de fenol, homogeneizando-se
o tubo vigorosamente durante 1 minuto e centrifugando-o por 15 minutos à temperatura
ambiente, na rotação de 13400 rpm. Após a centrifugação, a fase aquosa foi transferida
para outro tubo, adicionando-se 600 µL de fenol-clorofórmio 1:1. Em seguida,
centrifugou-se por 10 minutos, nas mesmas condições anteriores. Terminado esse passo, a
fase aquosa foi novamente transferida para outro tubo, sendo adicionados 2,5 volumes de
etanol absoluto (-20ºC) e 200 mM de NaCl, virando o tubo até o DNA ser visualizado
(aproximadamente um a dois minutos). Posteriormente, a mistura foi incubada a -20°C
durante 30 minutos e centrifugada a 13400 rpm por 15 minutos. Em seguida, o sedimento
de DNA foi lavado com 600 µL de etanol 70% e centrifugado por 5 minutos na rotação de
13400 rpm. O sobrenadante foi descartado e o sedimento seco ressuspendido em 50 µL de
Tris-EDTA-RNase (Tris-HCl 25 mM pH 7,0; EDTA 10 mM pH 8,0; RNase 10 µL/mL).
3.11 Extração de DNA plasmidiano
Os isolados bacterianos foram crescidos em 5 mL de caldo BHI, por até 18
horas, a 30ºC, sob agitação. Em seguida, essa cultura foi transferida para tubos de 1,5 mL e
centrifugada por 2 minutos a 13400 rpm. Após esse procedimento, o sedimento foi
ressuspendido em 200µL de tampão TE (Tris-HCl pH 8,0 10 mM; EDTA pH 8,0 1 mM) e
mantido à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, acrescentou-se 360 µL de
Solução I (NaOH 0,2 M; SDS 1,0%.) –a solução foi feita no momento da execução do
procedimento – misturando-se bem, por inversão do tubo. Essa mistura foi mantida por 5
minutos à temperatura ambiente. À mistura anterior foram acrescentados 400 µL de
Solução II (Acetato de Potássio 3 M; Ácido Acético Glacial 2 M pH 4,8-5,0), misturando-
se bem, de novo, por inversão. Essa mistura foi incubada em gelo por 5 minutos, sendo
centrifugada na rotação de 13400 rpm 5 minutos. Após esse período, o sobrenadante foi
transferido para outro tubo, sendo adicionado a ele 750 µL de isopropanol. A solução foi
misturada por inversão e mantida à temperatura ambiente por 5 minutos. Logo depois,
centrifugou-se por 15 minutos à temperatura ambiente, na rotação de 13400 rpm. O
sobrenadante foi descartado, sendo o excesso de álcool retirado com uma pipeta
automática. Imediatamente depois, o sedimento de DNA foi lavado com 1 mL de etanol
70% e centrifugado por 5 minutos nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento seco ressuspendido em 50 µL de Tampão R (Tris-HCl pH 8,0 10
mM; EDTA pH 8,0 0,1 mM).
3.12 Amplificação de rDNA 16S
O gene do rRNA 16S foi amplificado completamente com os iniciadores PA
(5’ – TCCTGGCTCAGATTGAACGC – 3’) (Kuske et al., 1997, modificado) e U2 (5` –
ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC – 3’) (Lu et al., 2000). As localizações dos
iniciadores estão ilustradas na FIG.2. A mistura para a reação da PCR (Polimerase Chain
Reaction) continha 100 ng de DNA molde, tampão para PCR, 0,4 µM de cada um dos
iniciadores e 0,4 mM de cada um dos dNTP’s e, por último, 1 U de Taq polimerase,
resultando em um volume total de 20 µL. O tubo contendo essa mistura foi colocado em
um termociclador, que promoveu os seguintes passos: a reação começou com 10 minutos
de desnaturação na temperatura de 95°C, avançando para 30 ciclos, desnaturação por 30
segundos a 95°C, anelamento por 40 segundos a 48°C e extensão por dois minutos a 72°C.
Após os 30 ciclos, a reação terminou com incubação à temperatura de 72°C, por 15
minutos (Lu et al., 2000, modificado). Posteriormente à reação de PCR, 5 µL das amostras
foram aplicados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio na concentração de 5
mg/mL, e submetidas à eletroforese em uma tensão de 80 volts, para se determinar o
tamanho dos fragmentos amplificados.
3.13 Amplificação do gene ampC
O gene ampC foi amplificado completamente com os iniciadores AMPC1 (5’ –
ATGATGCAATCCCTGAAGTT – 3’), que corresponde aos nucleotídeos 1 a 20 e
AMPC2 (5` – GACGGATCCACCGCCGACAATA – 3’), que corresponde aos
nucleotídeos 1166 a 1145 do gene CV1310 de C. violaceum. Os parâmetros da mistura
para a reação da PCR e do programa utilizado no termociclador foram semelhantes àqueles
usados para se amplificar o gene rRNA 16S, com exceção da temperatura de anelamento –
50,5 ºC.
3.14 Precipitação do produto de PCR para o seqüenciamento
Ao produto de PCR adicionou-se igual volume da solução de polietilenoglicol
20% e cloreto de sódio 2,5 M. Essa mistura foi agitada vigorosamente e incubada em
banho-maria a 37 ºC por 15 minutos. Após esse período, a mistura foi centrifugada por
mais 15 minutos na rotação de 13400 rpm. O sobrenadante foi retirado cuidadosamente
com uma pipeta automática e descartado em seguida. Após isso, foram adicionados 125 µL
de etanol 80% gelado e centrifugou-se por 2 minutos à rotação de 13400 rpm. Novamente,
o sobrenadante foi retirado cuidadosamente e descartado. Os procedimentos anteriores de
se adicionar o etanol 80% e retirar o sobrenadante foram repetidos. Após secagem, o
precipitado foi ressuspendido em volume adequado de água bideionizada.
3.15 Seqüenciamento do gene de rRNA 16s
O seqüenciamento parcial do gene de rRNA 16S foi feito com os iniciadores
PA e CFV1 (5’ – TTAACGCTYGCACCCTACG – 3’). CFV1 foi o único iniciador que foi
desenhado a partir de seqüências de Chromobacterium depositadas no GenBank. As
localizações dos iniciadores estão ilustradas na FIG.2. A mistura para a reação de
seqüenciamento continha 150 ng de produto de PCR, DYEnamic ET Dye Terminator
Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences) e 0,5 µM dos iniciadores, separadamente,
resultando em um volume total de 10 µL. Uma placa de 96 poços, contendo essa mistura,
foi colocada em um termociclador, que realizou os seguintes passos. A reação começou
com 2 segundos de desnaturação na temperatura de 95°C; avançando para 35 ciclos de
desnaturação por 25 segundos a 95°C, anelamento por 15 segundos a 54°C e extensão por
3 minutos a 60°C. Cada isolado foi seqüenciado pelo menos três vezes para cada um dos
sentidos forward e reverse.
Para a precipitação da reação de seqüenciamento foram adicionados 1 µL de
acetato de amônio (7,5 M) e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. Em seguida, lacrou-se
a placa com adesivo apropriado, agitando-se vigorosamente. Após esse procedimento,
centrifugou-se por 10 segundos, incubando-se a placa no escuro por 20 minutos à
temperatura ambiente. Posteriormente a esse período, centrifugou-se a uma rotação de
4000 rpm por 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, descartou-se o
sobrenadante por inversão, mantendo-a invertida para escorrer o excesso de álcool e sendo
adicionado 150 µL de álcool 70%. Após isso, a placa foi centrifugada por 15 minutos, na
rotação de 4000 rpm. Descartou-se o sobrenadante por inversão, mantendo-a novamente
invertida e centrifugando-a ainda nesta posição por alguns segundos. Em seguida, a placa
foi deixada secar, no escuro, por 10 minutos, para posteriormente acrescentar 10 µL de
Loading Buffer (70% de formamida. 1 mM EDTA) para ressuspensão do sedimento,
agitando-se vigorosamente e centrifugando-a por alguns segundos. Essa placa é transferida
para o MegaBACE (Amersham Biosciences), onde ocorre a leitura das seqüências.
Os cromatogramas das seqüências foram base called com Phred v.0.20425
(Ewing and Green, 1998). As seqüências parciais de rDNA 16S foram alinhadas e editadas
para produzir uma seqüência consenso de alta qualidade para cada isolado bacteriano
usando Phrap v.0.990319 (Green, 1994) e Consed 12.0 (Gordon et al., 1998).
3.16 Análise de dados
Para o alinhamento das seqüências, cálculo dos valores de divergências entre
seqüências, cálculo de diversidade e número médio de diferenças de nucleotídeos e para
determinar haplótipos, foram usados programas como MEGA 3 (Kumar et al., 2004) e
DnaSP (Rozas & Rozas, 1999). Árvores filogenéticas foram construídas por distintos
procedimentos (neighbor-joining e máxima parcimônia) com o programa MEGA. Critérios
filogenéticos foram adotados para averiguação da identidade taxonômica dos isolados,
quando comparados às amostras já presentes em bancos de dados do GenBank e do projeto
genoma brasileiro (www.brgene.lncc.br). A determinação da diversidade genética foi feita
usando-se o programa ARLEQUIN (Schneider et al., 2000).
Os dados de perfis de CIM dos antimicrobianos para os isolados de
Chromobacterium sp. foram convertidos em código binário e as relações entre esses perfis
foram realizadas por análises de agrupamentos (medida de similaridade Euclidiana,
método de UPGMA). As análises computacionais foram feitas com PAST
(Paleontological Statistics Software Package) (Hammer et al., 2001).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolados bacterianos
As coletas no Parque Nacional da Serra do Cipó (PNSC) foram feitas no
período chuvoso – com exceção dos isolados 7, 8, 9 e 10, que foram coletados na seca –
pois nas primeiras coletas, realizadas em 2001, observou-se a presença mais abundante de
isolados bacterianos violetas no verão do que no inverno (Bittencourt, 2003). Tal fato se
deve, provavelmente, à presença de solo quartzito, com muita matéria orgânica, que
acumula bastante água, levando a um aspecto de brejo no verão (Callisto & Gonçalves
Júnior, 2002). Assim, a água das chuvas lava o solo, carregando facilmente bactérias
(originalmente nos solos) para o rio.
De posse da informação de que a temperatura ótima de crescimento de C.
violaceum é 25ºC (Kimmel & Maier, 1968; Koburguer & May, 1982), todos os isolados
bacterianos foram inoculados em Caldo Nutriente ¼ e incubados, nessa temperatura, em
estufa. Em 2001, foram obtidos 44 isolados bacterianos de coloração violeta. Dos 21, que
mantiveram a viabilidade, foram estudados 10. No entanto, em 2003, de uma coleta de 216
isolados bacterianos, só foram adquiridos seis violetas, dos quais apenas dois
permaneceram viáveis. Por outro lado, do total de 730 isolados bacterianos, da coleta de
2004, incluindo 11 isolados do solo, foram obtidos 698, que apresentaram coloração
violeta, e 32, cinza. Desses, 28 foram escolhidos para esta pesquisa. Isolados de todas as
coletas foram cultivados, simultaneamente, a 4ºC e a 37ºC, durante uma semana. Esse teste
teve como finalidade selecionar C. violaceum, uma vez que Iodobacter fluviatile e
Janthinobacterium lividum também são produtoras de violaceína. Entretanto, C. violaceum
é a única que cresce a 37ºC e não a 4ºC, enquanto que I. fluviatile e J. lividum crescem a
4ºC e não a 37ºC (Logan & Moss, 1992). Todos os isolados bacterianos testados cresceram
somente a 37ºC, sendo assim selecionados. Das coletas no Parque Estadual do Rio Doce
(PERD) e no Rio Negro, foram estudados, respectivamente, três e cinco isolados
bacterianos violetas. Do total, foram escolhidos 48 isolados de diversas origens (TAB. 2),
para a identificação da diversidade molecular do gene de rRNA 16S, teste de
susceptibilidade a antimicrobianos e produção de substâncias antagonistas.
Visando manter um acervo de longo prazo, todos os isolados bacterianos foram
armazenados a -80ºC. Utilizou-se CN com uma concentração mais baixa – ¼ – numa
tentativa de se preservar os isolados viáveis por um período de tempo maior, uma vez que
essas bactérias são encontradas em um ambiente natural com escassez de nutrientes.
Assim, tentou-se mimetizar tal ambiente, com o objetivo de diminuir variáveis que podem
afetar tanto o fenótipo como o genótipo das bactérias, quando cultivadas em laboratório.
Apesar desses procedimentos, perdas progressivas de isolados foram observadas, a partir
do terceiro mês após o armazenamento a –80ºC, alcançando cerca de 50% desses. É
importante destacar que a manutenção de linhagens de Chromobacterium sp. é laboriosa.
Bittencourt (2003) já havia observado que alguns isolados bacterianos, recuperados de
ecossistemas naturais, não sobreviveram a longos períodos de manutenção em laboratório.
Outro fato que despertou atenção foi a diversidade na pigmentação de suas
colônias. Existiam colônias com tons diferentes de violeta, umas mais claras e outras mais
escuras, variando estas últimas, por sua vez, na intensidade, podendo apresentar até um
violeta metálico conforme ilustrado na FIG. 6. A pigmentação violeta tornou-se evidente
entre 24 e 72 horas após o início do cultivo. Isso confirma que a produção de violaceína é
dependente de densidade celular, pré-requisito para o quorum sensing. No entanto, outros
fatores também são fundamentais para a produção desse pigmento, como oxigênio e
presença de triptofano no meio de cultura (Antônio & Creczyuski-Pasa, 2004). Em meio
sólido, as colônias bacterianas podem possuir coloração acinzentada, até atingir a
densidade celular adequada para a produção da violaceína (Sivendra et al., 1975). Todavia,
foi obtido, neste estudo, um isolado de Chromobacterium sp. com coloração amarela (FIG.
7). Holt & Krieg (1984) relatam a formação de um halo violeta na superfície da cultura em
tubo. Neste estudo, contudo, notou-se uma pigmentação total do meio de cultura para a
maioria dos isolados.
FIGURA 6 – Colônias bacterianas apresentando diversas tonalidades
de violeta.
FIGURA 7 – Isolado 32 apresentando coloração
amarela antes da produção de
violaceína.
É interessante mencionar que todos os isolados (colônias), obtidos nas coletas
de 2001 e 2003, a princípio apresentaram coloração violeta. No entanto, após alguns
repiques todos deixaram de apresentar essa pigmentação. Após a identificação molecular
desses isolados não pigmentados, verificou-se que a maioria não era da espécie
Chromobacterium sp., sendo que apenas dois desses isolados – 4 e 12 (TAB. 2) –
pertenciam à espécie em estudo. De posse dessas informações, e considerando que esse
comportamento se repetiu com alguns dos isolados de 2004, presumiram-se três hipóteses:
− pela primeira, os isolados deixariam de produzir violaceína, uma vez que
esse pigmento não é necessário para a sobrevivência das células in vitro. Como a
violaceína não participa das vias bioquímicas essenciais da célula, o gene poderia ser
desligado (Antônio & Creczyuski-Pasa, 2004). Por outro lado, em um ambiente que possui
limitação de recursos, como o ecossistema natural, a violaceína poderia ter um papel
fundamental na sobrevivência de C. violaceum. Desta forma, a violaceína agiria, não só
como um escudo contra os raios solares, mas também geraria uma proteção contra
predação e competição. Matz et al. (2004) relatam que C. violaceum e J. lividum produzem
alta toxicidade sobre os bacterívoros nanoflagelados. Assim, a produção e manutenção da
violaceína deve ser uma característica adaptativa importante.
− A segunda hipótese leva em consideração a plasticidade do genoma dos
procariotos. Sabe-se que o genoma bacteriano pode sofrer aquisição e perda de seqüências
sendo isso promovido por plasmídios, transposons e sistemas integrons-cassetes (Davison,
1999) Desta forma, o operon vioABCD pode ter sido transferido do genoma de C.
violaceum para o das outras espécies, sendo desta forma mantido, uma vez que organismos
que compartilham o mesmo ambiente apresentam seqüências em comum (Berg & Kurland,
2002).
− A terceira hipótese baseia-se na associação de duas espécies bacterianas.
Assim, essas espécies viveriam em associação íntima naqueles ecossistemas com ausência
de fatores modificadores humanos. Esse tipo de cooptação poderia ser favorável para todas
as espécies pertencentes ao consórcio, pois podem ocorrer trocas de metabólitos – por
exemplo, vitaminas e aminoácidos – favorecendo desta forma a sobrevivência em
ambientes naturais com pouca disponibilidade de nutrientes. Ou ainda, uma das linhagens
envolvidas no consórcio realizaria uma parte da via metabólica, que seria completada por
outros membros da associação, gerando, assim, uma fonte de nitrogênio que beneficiaria
todos no consórcio (Souza et al., 1998). Portanto, quando essas bactérias são trazidas para
o laboratório pode ocorrer um desequilíbrio nessa associação, uma vez que o meio não é
mais tão pobre nem indicador/seletivo, proporcionando um mecanismo de competição. No
caso específico de C. violaceum, que pode levar até sete dias para crescer, a competição
poderia ser ganha por aquele microrganismo com menor tempo de geração. Portanto, deve-
se ter cuidado especial na fase de coleta de material no campo. Assim, após a obtenção de
colônias, deve-se acrescentar mais uma etapa de verificação, utilizando-se técnicas para
conseguir colônias isoladas.
TABELA 2 – Isolados bacterianos coletados nos anos de 2001, 2003 e 2004, em ecossistemas aquáticos e terrestres dos três sítios de coleta.
Isolados Área de estudo Ecossistema Ano de Coleta
1*
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
28(1)
43 (1)
81 (1)
85 (1)
178 (1)
295 (1)
11 (2)
72 (2)
77 (2)
92 (2)
11-3-503
13-3-503
2-3-404
3-3-404
4-3-404
19-3-404
25-3-404
26-3-404
35-3-404
39-3-404
40-3-404
43-3-404
50-3-404
62-3-404
76-3-404
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
Aquático (1ª ordem)
Aquático (1ª ordem)
Aquático (2ª ordem)
Aquático (2ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (4ª ordem)
Aquático (1ª ordem)
Aquático (2ª ordem)
Aquático (2ª ordem)
Aquático (2ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2003
2003
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
* Isolado bacteriano que nunca apresentou coloração violeta. Bittencourt (2003) obteve esse isolado através da amplificação da região intergênica (ITS).
TABELA 2 – Isolados bacterianos coletados nos anos de 2001, 2003 e 2004, em ecossistemas aquáticos e terrestres dos três sítios de coleta. Continuação.
Isolados Área de Estudo Ecossistema Ano de Coleta
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41**
42**
43
44
45
46
47
48
81-3-404
82-3-404
109-3-404
135-3-404
145-3-404
147-3-404
33-4-404
121-4-404
127-4-404
174-4-404
224-4-404
6-S-404
9-S-404
10-S-404
11-S-404
P11
P31
GA202
CVAC53
CVPF43
CVMO33
CVRP43
CVT193
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PNSC
PERD
PERD
PERD
Presidente Figueiredo
Margem oposta
Rio Preto da Eva
Tropical Hotel
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (3ª ordem)
Aquático (4ª ordem)
Aquático (4ª ordem)
Aquático (4ª ordem)
Aquático (4ª ordem)
Aquático (4ª ordem)
Terrestre
Terrestre
Terrestre
Terrestre
Aquático
Aquático
Aquático
Aquático
Aquático
Aquático
Aquático
Aquático
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2001
2001
2003
NI
NI
NI
NI
NI
NI – não informado ** Perderam a viabilidade após três meses, mas o DNA extraído permitiu a realização da
identificação da diversidade molecular 1Isolados gentilmente cedidos pelo Dr. Carlos Rosa (Departamento de Microbiologia – UFMG). 2 Isolado gentilmente cedido pela doutoranda Daniela Pontes (Departamento de Biologia Geral – UFMG). 3 Isolados gentilmente cedidos pelo Dr. Spártaco Astolfi Filho (Departamento de Biologia – Universidade Federal do Amazonas).
4.2 Identificação molecular e filogenia
O uso da ferramenta molecular – representada pela amplificação do gene de
rRNA 16S– seguida das análises com BLAST sugeriram homologia dos isolados
bacterianos com seqüências de espécies depositadas no GenBank. A linhagem padrão de C.
violaceum ATCC 12472 foi usada como controle. A TAB. 3 mostra os resultados
alcançados para os 48 isolados com o BLAST, apresentando a seqüência com o maior
valor Score. Desta forma, foram encontradas homologias com 11 espécies e a seguinte
distribuição: 27 isolados são relacionados à Chromobacterium sp., seis, à C. violaceum,
três à Stenotrophomonas maltophilia, dois a cada uma das espécies Serratia marcescens e
Staphylococcus sp e um isolado a cada uma das seguintes espécies – C. suttsuga,
Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas sp, Pseudomonas sp., Staphylococcus
saprophyticus e Rahnella aquatilis. Dois isolados coincidiram com seqüências do banco de
dados que ainda não foram associadas com nenhum grupo taxonômico conhecido (isolados
1 e 7).
As espécies acima fazem parte de dois grandes Filos bacterianos –
Proteobacteria e Firmicutes (FIG. 8). Dentro de Proteobacteria estão incluídos os gêneros
Chromobacterium da Classe Betaproteobacteria e Klebsiella, Serratia, Rahnella,
Stenotrophomonas e Pseudomonas da Classe Gammaproteobacteria. Ao Filo Firmicutes,
pertence Staphylococcus da Classe Bacilli (RDPII – online).
C. suttsuga é candidata a uma espécie nova do gênero Chromobacterium,
pertencente à família Neisseriaceae (FIG. 8 e 11). Possui características diferentes de C.
violaceum, como não crescimento a 25ºC, o que reforça essa classificação. Essa espécie
possui toxinas capazes de eliminar insetos, principais pragas da agricultura, tornando-se de
interesse para o controle biológico (Martin et al., 2004). Entretanto, o isolado, cuja
seqüência foi similar a C. suttsuga cresceu a 25ºC.
As espécies K. pneumoniae, S. marcescens, R. aquatilis, S. maltophilia e S.
saprophyticus são patógenos envolvidos com infecções hospitalares em seres humanos,
mas também são ubiquamente distribuídas nos ecossistemas naturais (Kloos & Bannerman,
1994; Alonso & Martínez, 1997; Chang et al., 1999; Su et al., 2003; Struve & Krogfelt,
2004). As espécies K. pneumoniae, S. marcescens e R. aquatilis são da família
Enterobacteriaceae, sendo, portanto, constituintes naturais da microbiota intestinal de
vários animais (Koneman et al, 2001). Já a espécie S. maltophilia (Xanthomonadaceae) é
encontrada principalmente em ecossistemas aquáticos e terrestres, sendo considerada como
um patógeno emergente. No entanto, sendo uma espécie de vida livre, pode atuar no
controle biológico contra fungos fitopatógenos e na biorremediação de ambientes
impactados (Berg et al., 1999). S. saprophyticus (Staphylococcaceae) também possui
capacidade de biorremediação, removendo metais tóxicos de ambientes aquáticos (Ilhan et
al., 2004).
Um total de 409 bases alinhadas entre os sítios 134 e 558 – excluindo-se gaps –
do gene de rRNA 16S foi usado para inferir a filogenia entre 47 isolados bacterianos e as
seqüências depositadas no GenBank. O isolado 8 possuía apenas uma seqüência com 220
bases; desta forma foi feita uma análise filogenética à parte para poder incluí-lo. Dos 409
nucleotídeos, 297 foram empregados, sendo excluídos aqueles com gaps e dados ausentes.
Quando todas as seqüências dos isolados bacterianos foram alinhadas, percebeu-se que
algumas se apresentavam idênticas, tornando a apresentação da árvore filogenética muito
confusa. Desta forma, decidiu-se por agrupar tais seqüências e tratá-las por haplótipos.
Duas seqüências foram consideradas haplótipos distintos quando apresentavam, pelo
menos, a diferença de um nucleotídeo, na seqüência de DNA. Assim, foram obtidos 14
haplótipos (TAB. 4), que melhorou a apresentação da árvore filogenética. A filogenia foi
inferida através dos métodos de neighbor-joining (NJ), com o modelo Kimura 2-
parâmetros, e máxima-parcimônia (MP), ambos utilizando o programa Mega 3 (Kumar et
al., 2004). A confiança estatística dos agrupamentos nas árvores foi testada com 1000
repetições de bootstrap.
Para as seqüências dos 47 isolados, o método de MP gerou 52 árvores
igualmente parcimoniosas, sendo, a partir dessas, composta uma árvore consenso, cuja
topologia foi semelhante àquela produzida pelo método NJ (FIG. 8). No entanto, ao se
acrescentar a seqüência do isolado 8, a árvore consenso (FIG. 10), gerada a partir das 364
árvores igualmente parcimoniosas do método de MP, se mostrou diferente daquela
produzida por NJ (FIG. 9). Para se construir as árvores das FIGs. 9 e 10 foram utilizados
apenas 135 sítios das seqüências de DNA, diminuindo, assim, a resolução das árvores
filogenéticas. Contudo, no método de NJ (FIG. 9), com exceção do clado de
Chromobacterium, que foi agrupado com o de Neisseria, todos os outros clados
permaneceram agrupados, como a árvore da FIG. 8, mostrando que o tamanho da
seqüência utilizada, inferior a 300 pares de bases, é inadequado para resolver diferenças
entre espécies inseridas em cada um dos ramos, mas, apesar disso, com seqüências desse
tamanho é possível chegar ao nível de gênero, para alguns grupos taxonômicos. Todavia,
através do método de MP as seqüências dos isolados foram agrupadas, preferencialmente,
ao nível de Filos, com exceção para alguns agrupamentos taxonômicos, que foi possível
chegar ao nível de gênero (FIG. 10).
Os isolados relacionados ao gênero Chromobacterium formam um grupo
monofilético com o valor de Bootstrap de 100 e 99 para os métodos de NJ e MP,
respectivamente, reforçando esse agrupamento. No entanto, vários isolados que se
agruparam com a linhagem padrão C. violaceum ATCC 12472 se agruparam também com
C. suttsuga e se mostraram bem divergentes de ambas, sugerindo que fossem classificados
como Chromobacterium sp. Esta classificação deve permanecer até a execução de outros
testes moleculares e novas provas bioquímicas, bem como melhor caracterização das
bactérias deste gênero a fim de melhorar a identificação desses isolados.
Os isolados bacterianos presentes no ramo de Chromobacterium totalizaram 35
juntamente com a linhagem padrão de C. violaceum, todos agrupados em sete haplótipos –
H01, H02, H03, H06, H11, H12, H13 (TAB. 4). A determinação dos haplótipos foi
realizada pelo programa DnaSP (Rozas & Rozas, 1999). O haplótipo H12 apresentou a
freqüência relativa de 0,639, seguido pelos haplótipos H01 (0,167), H02 e H06, ambos
apresentando o valor de 0,0556. Os menos freqüentes foram os haplótipos H03, H11 e H13
com uma freqüência de 0,0278, apresentando apenas um isolado em cada haplótipo. Por
outro lado, os haplótipos H01, H02, H06 e H12 reuniram, respectivamente, isolados do Rio
Negro, do Parque Estadual do Rio Doce e os dois últimos haplótipos do Parque Nacional
da Serra do Cipó. Portanto, não houve haplótipo compartilhado entre as áreas, refletindo a
origem geográfica dos isolados bacterianos.
O estudo de diversidade dos isolados de Chromobacterium sp. (isolados do
PNSC, PERD e Rio Negro) foi feito pelo programa Arlequin (Schneider et al., 2000). A
diversidade haplotípica foi de 0,5714 e a diversidade nucleotídica de 0,009845. Essa
diversidade haplotípica pode ser considerada alta já que há uma probabilidade de 57,1% de
que dois isolados tomados ao acaso tenham seqüências distintas. No entanto, o número de
haplótipos (7) encontrados para o gênero Chromobacterium não foi tão alto, considerando
o total de isolados bacterianos obtidos no estudo. Por outro lado, a diversidade nucleotídica
foi pequena, indicando que a diversidade entre os isolados é baixa em termos de acúmulo
de substituições nucleotídicas. Isso também pode ser notado nas FIGs. 8 e 11, através dos
braços curtos dos ramos no agrupamento das Chromobacterium sp.
A análise de homologia entre os isolados de Chromobacterium sp., incluindo a
linhagem C. violaceum ATCC 12472, mostrou que os 35 isolados compartilham com a
linhagem padrão 98,2% de similaridade na seqüência do gene de rRNA 16S. De acordo
com alguns autores (Madigan et al., 1996; Bosshard et al., 2002), microrganismos que
compartilham valores de similaridade superiores a 97% poderiam ser considerados como
pertencentes à mesma espécie. No entanto, esta análise é indicada para comparações do
gene completo (~1600 pb) e a análise deste estudo incluiu apenas 409 pb. Além disto, a
inclusão de um organismo dentro de uma espécie ou mesmo a determinação de uma
espécie nova não deve ser baseada somente em seqüências de DNA, sendo necessárias
outras análises (Rosselló-Mora & Amann, 2001). A FIG. 11 é uma ampliação do ramo de
Chromobacterium e mostra a existência de quatro grupos, cujos valores bootstrap foram
superiores a 50 – agrupamentos A (bootstrap = 99), B (bootstrap = 80), C (bootstrap = 75)
e D (bootstrap = 86). A distribuição ilustrada nessa figura pode representar a existência de
subespécies, ou mesmo distintas espécies, dentro do gênero de Chromobacterium. No
entanto, o tamanho limitado da seqüência e a localização do fragmento do gene de rRNA
16S usados para construir essa árvore filogenética podem representar poucos sítios
informativos. Assim, os quatro agrupamentos formados podem ser considerados como
sugestivos e devem ser confirmados, talvez com a análise da seqüência completa do rRNA
16S ou de outras seqüências para melhorar a resolução dentro do clado de
Chromobacterium sp.
Os isolados de outros gêneros também fizeram parte de ramos monofiléticos
suportados por valores de bootstrap superiores a 50, como ilustrado na FIG. 8. Esses 13
isolados foram agrupados em sete haplótipos diferentes – H04, H05, H07, H08, H09, H10
e H14. Os haplótipos H04, H09 e H14 foram encontrados cada um em apenas um isolado.
Com exceção do H10, que possuiu um isolado do PNSC (11) e um isolado do PERD (43),
os outros seis haplótipos representaram isolados do PNSC.
É interessante notar que a seqüência do isolado 1 revelou 99% de similaridade,
de acordo com o BLAST, com a seqüência de Bacterium G5_GreenLake (AY345393),
mostrando a existência de uma seqüência parecida no banco de dados do GenBank, sem
taxonomia conhecida. No entanto, ao ser realizada a inferência filogenética através dos
métodos de NJ e MP, as seqüências do isolado 1 e de AY345393 foram agrupadas no clado
de Chromobacterium. Isto foi confirmado pelas ferramentas do banco de dados do
Ribosomal Database Project II (RDPII – online), que através de Sequence Match agrupou
essas seqüências hierarquicamente no gênero Chromobacterium. O mesmo foi realizado
para as seqüências do isolado 7 e de Arctic sea ice bacterium (AF468443), que
apresentaram 100% de similaridade entre elas. Como resultado, essas seqüências foram
inseridas no clado de Staphylococcus. Essa observação ilustra a importância de se utilizar
os métodos de filogenia para confirmar as possíveis classificações e tentar relacionar
seqüências não classificadas (Rosselló-Mora & Amann, 2001).
TABELA 4 – Haplótipos gerados pelo programa DnaSP (Rozas & Rozas, 1999), envolvendo 48 isolados bacterianos.
Haplótipos Isolados bacterianos
H01 44, 45, 46, 47, 48
H02 41, 42
H03 1
H04 2
H05 3, 34, 35, 36
H06 4, 33
H07 5, 6
H08 7, 10
H09 9
H10 11, 43
H11 12
H12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 37, 38, 39, 40
H13 30
H14 8
FIGURA 8 – Árvore filogenética envolvendo 47 isolados bacterianos coletados no PNSC, PERD e Rio Negro. A topologia da árvore foi gerada pelo método de neighbour-joining (1000 repetições de Bootstrap e modelo Kimura 2 parâmetros).
FIGURA 9 – Árvore filogenética envolvendo 48 isolados bacterianos, incluindo o isolado 8, coletados no PNSC, PERD e Rio Negro. O haplótipo referente a ele está marcado com um ponto azul. A topologia da árvore foi gerada pelo método de neighbor-joining (1000 repetições de bootstrap e modelo Kimura 2 parâmetros).
FIGURA 10 – Árvore filogenética envolvendo 48 isolados bacterianos, incluindo o isolado 8, coletados no PNSC, PERD e Rio Negro. O haplótipo referente a ele está marcado com um ponto azul. A topologia da árvore foi gerada pelo método de máxima parcimônia (1000 repetições de bootstrap).
FIGURA 11 – Ampliação do ramo de Chromobacterium da FIG. 8. Apresenta os quatro agrupamentos (A, B,
C e D) considerados consistentes pelo teste de bootstrap. Mostra, também, os haplótipos
referentes a cada uma das áreas geográficas estudadas: H01 – Rio Negro; H02 – PERD; H03,
H06, H11, H12, H13 – PNSC.
4.3 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos e ao mercúrio
Foram determinadas as CIMs de 46 isolados bacterianos, juntamente com a
linhagem padrão C. violaceum ATCC 12472. Os isolados 41 e 42 perderam a viabilidade
no início do estudo, sendo usados somente nas análises filogenéticas. De 46, 33 pertenciam
ao gênero Chromobacterium e 13 pertenciam a espécies de outros gêneros –
Stenotrophomonas sp. (1), S. maltophilia (3), K. pneumoniae (1), S. marcescens (2),
Pseudomonas sp. (1), S. saprophyticus (1), Staphylococcus sp. (3), R. aquatilis (1) (TAB.
3). O isolados 1 e 7 foram incluídos nos gêneros Chromobacterium e Staphylococcus,
respectivamente, de acordo com a filogenia obtida no item 4.2 e demonstrada na FIG. 8.
Das 12 drogas testadas, a ampicilina, a amoxicilina/ácido clavulâmico e a cefotaxima
foram as que apresentaram as maiores CIMs (FIG. 12, 13 e 14). Dos 32 isolados de
Chromobacterium sp., 76% apresentaram CIM maiores que 1024 e 128 µg/ml de
ampicilina e de cefotaxima, respectivamente. Surpreendentemente, observaram-se altas
CIMs para cefotaxima, droga pertencente às cefalosporinas de terceira geração, com
espectro de ação contra bactérias Gram-negativas e positivas, possuindo, assim, uma
⇒ Rio Negro
⇒ PERD
⇒ PNSC
modificação contra β-lactamases (Prince, sem data). Para amoxicilina/ácido clavulânico a
CIM50 foi 1024 µg/ml – no qual 50% dos isolados foram inibidos até 1024 µg/ml – e a
CIM90 foi >1024 µg/ml (TAB. 5). Ao contrário do esperado, uma vez que é descrita a
presença intrínseca do gene ampC em C. violaceum, um dos isolados de Chromobacterium
sp. (isolado 12) mostrou CIM <2 µg/ml de ampicilina. Esse gene codifica uma β-lactamase
capaz de degradar certa gama de antibióticos β-lactâmicos, sendo primeiramente relatada
como cefalosporinase. O produto do gene ampC também é pouco resistente ao inibidor de
β-lactamase, ácido clavulâmico (Hanson & Sanders, 1999). Entretanto, como mostrado na
FIG. 13, observou-se neste estudo, que a β-lactamase produzida por esse gene pode ser
bastante resistente ao ácido clavulâmico.
Os valores de CIMs alcançados, para ampicilina e amoxicilina/ácido
clavulânico, foram altos para as espécies de outros gêneros também. A CIM, para a
primeira droga foi de 256 µg/ml, conseguindo inibir o crescimento de 38% dos 13 isolados
bacterianos. Para a outra droga 62% desses isolados não cresceram (31% em 256 µg/ml e
31% em >1024 µg/ml). Ao contrário do encontrado para Chromobacterium sp., 69% dos
isolados das outras espécies foram sensíveis à concentração de 2 µg/ml de cefotaxima.
O gene ampC é um gene cromossômico que confere à bactéria altos níveis de
resistência a antimicrobianos β-lactâmicos, principalmente à ampicilina. Mas é possível
que apresente outras funções em ecossistemas naturais, uma vez que é observada uma alta
prevalência de resistência à ampicilina na maioria dos isolados coletados desses ambientes
(Ash et al., 2002, Normark & Normark, 2002, Bittencourt, 2003). Assim, a existência
desse gene parece ser importante na sobrevivência nesses ecossistemas. Ele pode, por
exemplo, participar do metabolismo da parede celular, agindo na formação de
peptidoglicanos, mas nada ainda foi comprovado (Alonso et al., 2001)
0
5
10
15
20
25
30
< 2 16 128 256 1024 > 1024
Ampicilina (µg/ml)
Núm
ero
de is
olad
os
Chromobacterium violaceum Outras Espécies
FIGURA 12 – Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) de ampicilina frente a 46 isolados
bacterianos. ATCC: Linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
< 2 16 32 64 128 256 512 1024 > 1024
Amoxicilina/Ácido Clavulâmico (µg/ml)
Núm
ero
de is
olad
os
Chromobacterium violaceum Outras Espécies
FIGURA 13 – Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) de amoxicilina/ácido clavulânico frente a 46
isolados bacterianos. ATCC: Linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
ATCC
ATCC
0
5
10
15
20
25
30
< 2 32 128 > 128
Cefotaxima (µg/ml)
Núm
ero
de is
olad
os
Chromobacterium violaceum Outras Espécies
FIGURA 14 – Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) de cefotaxima frente a 46 isolados bacterianos. ATCC: Linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
Quanto aos outros oito antimicrobianos, os isolados de Chromobacterium sp.
apresentaram CIMs diversas. Os quatro antimicrobianos da classe dos aminoglicosídios –
estreptomicina, gentamicina, amicacina e canamicina – apresentaram, respectivamente,
CIM50 de 32, 4, 16 e 16 µg/ml. Mostraram também CIM90 de 64 µg/ml, para as duas
primeiras drogas, e de 32 µg/ml, para as duas últimas (TAB. 5). Assim, para gentamicina, a
CIM foi de 4 µg/ml para 72,7% desses isolados (FIG. 15B). Por outro lado, para
estreptomicina (FIG. 15A), 63,6% do isolados foram inibidos por uma CIM de 32 µg/ml.
Já para amicacina (FIG. 15C), 81,8% dos isolados não cresceram em CIMs de 16 µg/ml
(48,5%) e 32 µg/ml (33,3%). Para o último dos antimicrobianos dessa classe, canamicina,
a CIM de 16 µg/ml impediu o crescimento de 66,7% desses isolados bacterianos (FIG.
15D).
A FIG. 16 mostra as CIMs de cloranfenicol, rifamicina, ácido nalidíxico e
tetraciclina. Frente aos 33 isolados de Chromobacterium sp., os antimicrobianos
cloranfenicol e rifamicina apresentaram CIM50 de 32 µg/ml e de 16 µg/ml,
respectivamente, e CIM90 de 128 µg/ml, para ambas as drogas (TAB. 5). Ácido nalidíxico
e tetraciclina inibiram o crescimento de 54,5% e de 75,8%, respectivamente, desses
isolados na concentração de 2 µg/ml.
ATCC
Em alguns relatos de infecção por C. violaceum, descreveu-se a sensibilidade
desse organismo à gentamicina, ao cloranfenicol e à tetraciclina e resistência à amicacina
(Kaufman et al., 1986; Lee et al., 1999; Martinez et al., 2000). No presente estudo,
observou-se que o antimicrobiano cloranfenicol apresentou resultado contraditório, quando
comparado com relatos anteriores. Contudo, com o seqüenciamento de seu genoma
(BNGPC, 2003) e a abordagem de genômica comparativa, foram descritos genes de
resistência nesse organismo, como genes para bombas de efluxo, dimetiladenosina
transferase, proteína de resistência à metilenomicina A e proteína de resistência à
bacitracina. Um dos genes identificados foi o homólogo do mdfA. O produto desse gene –
MdfA – é considerado o mediador de transporte, em direções opostas, simultaneamente, de
moléculas e/ou íons para a célula. Isso possibilita o transporte de compostos quimicamente
não relacionados, incluindo os seguintes antibióticos: cloranfenicol, rifamicina, tetraciclina
e eritromicina (Fantinatti-Garboggini et al., 2004). Assim, mesmo que C. violaceum não
consiga crescer em todos esses antimicrobianos, como ocorreu com alguns isolados
crescidos em tetraciclina, esse organismo possui potencial para sobreviver em ambientes
contendo moléculas com estruturas similares a ela.
Observou-se que a maioria dos isolados de Chromobacterium sp. foi inibida
por uma CIM de 4 µg/ml de gentamicina. Contraditoriamente aos outros relatos de
infecção por C. violaceum, esse valor foi considerado resistência por Moore et al. (2001).
Essa CIM pode ser considerada baixa, quando comparada à CIM de 16 µg/ml para
Enterobacteriaceae (NCCLS, 1999). Entretanto, quando se leva em consideração o
mecanismo de ação desse antimicrobiano e o mecanismo de resistência ao mesmo, o valor
encontrado nesse trabalho não é tão baixo. Os aminoglicosídios agem diretamente na
síntese protéica da bactéria, interferindo na subunidade 30S do ribossomo. Um dos
mecanismos de resistência a essas drogas é a mutação cromossômica, alterando, assim, o
seu alvo celular. No entanto, essa mutação pode provocar certo custo biológico para a
bactéria, diminuindo a sua adaptabilidade em ecossistemas com a ausência dessa pressão
seletiva. A produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos apresenta custo-
benefício, mais favorável para as bactérias resistentes (Chartone-Souza, 1998; Anderson &
Levin, 1999).
Frente aos 13 isolados dos outros gêneros, os oito antimicrobianos –
estreptomicina, gentamicina, amicacina, canamicina, cloranfenicol, rifamicina, ácido
nalidíxico e tetraciclina – apresentaram CIMs variando de < 2 µg/ml a >128 µg/ml (FIG.
15 e 16). Isso ilustra uma diversidade de perfis de marcadores genéticos de resistência que
podem ser encontrados nos ambientes naturais.
Para os isolados de Chromobacterium sp., 48,5% foram inibidos pela
concentração de 2 µg/ml de mercúrio. Nas concentrações de 4 µg/ml e 8 µg/ml houve a
inibição, respectivamente, de cinco (15,2%) e 11 isolados (33,3%). No entanto,
somente, o isolado 22 não cresceu na concentração ≥ 16 µg/ml (FIG. 17). Já para os
isolados das outras espécies, as CIMs <2 µg/ml e 4 µg/ml inibiram quatro isolados cada,
e as CIMs 8 µg/ml e >16 µg/ml impediram o crescimento de dois isolados cada. Por
outro lado, para a CIM 16 µg/ml, somente o isolado 36 foi inibido.
O mercúrio é ubiquamente distribuído, em pequenas quantidades, pelos
ecossistemas do planeta, sendo o sexto elemento mais tóxico. Os genes de resistência ao
mercúrio estão presentes no operon mer, que pode ser encontrado em plasmídios, em
transposons, em sistemas integrons-cassetes e no cromossomo. Tanto bactérias Gram-
negativas quanto Gram-positivas apresentam esse operon. No entanto, o número dos
genes do operon mer varia entre os grupos de bactérias (Nascimento & Chartone-Souza,
2003).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
< 2 4 8 16 > 16
Bicloreto de Mercúrio (µg/ml)
Núm
ero
de is
olad
os
Chromobacterium violaceum Outras Espécies
FIGURA 17 – Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) de mercúrio frente a 46 isolados bacterianos.
ATCC
TABELA 5 – Perfil populacional de prevalência de antimicrobianos e mercúrio frente a 33 isolados de Chromobacterium.
Drogas Concentração
Inibitória mínima Ap Am Cf Sm Gm Ak Km Cm Rf Nx Tc Hg
CIM50 (µg/mL) >1024 1024 >128 32 4 16 16 32 16 <2 <2 4
CIM90 (µg/mL) >1024 >1024 >128 64 64 32 32 128 128 16 32 8
(CIM50, CIM90) – Concentração Inibitória Mínima (CIM) para 50% e 90% dos isolados. Antimicrobianos usados: Ap – ampicilina, Sm – estreptomicina, Cm – cloranfenicol, Tc – tetraciclina, Nx – ácido nalidíxico, Rf – rifamicina, Am – amoxicilina/ácido clavulânico, Gm – gentamicina, Km – canamicina , Ak – amicacina, Cf – cefotaxima e Hg – bicloreto de mercúrio.
A FIG. 18 mostra as relações, baseadas em medidas de similaridade
Euclidianas, dos perfis de CIMs, para os 11 antimicrobianos e o bicloreto de mercúrio,
entre os isolados de Chromobacterium sp. A escala Euclidiana varia de 0,0 a -0,9.
Quanto mais próximo de zero, os perfis são mais semelhantes; assim, o dendrograma da
FIG. 18 exibe uma diversidade de perfis de CIMs. A TAB. 6 mostra os perfis de CIMs
obtidos para cada um dos isolados bacterianos desse estudo, juntamente com o da
linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC 12472. Cada perfil continha
todas as 11 drogas e o bicloreto de mercúrio, variando, apenas, a CIM para cada droga.
Desta forma, esses isolados apresentaram 31 perfis diferentes. Somente quatro isolados,
16 e 20, e 18 e 28, agrupados dois a dois, possuíram o mesmo perfil com o menor índice
de diversidade – zero.
A capacidade de uma bactéria resistir a vários antimicrobianos e a metais
pesados é, geralmente, associada à presença de plasmídios nesse microrganismo (Guerra
et al., 2001; Mavroidi et al., 2001; Nascimento & Chartone-Souza, 2003). A partir da
observação de que os isolados de Chromobacterium sp. apresentavam uma grande
diversidade de perfis de CIMs aos antimicrobianos, incluindo o bicloreto de mercúrio,
procurou-se, assim, verificar a presença de plasmídios, através da extração de DNA,
específica para esses elementos móveis. No entanto, a presença de plasmídios não pôde
ser determinada. Contudo, essa informação não exclui a possibilidade da existência
desses elementos móveis, uma vez que o método não é adequado para a extração de
plasmídios muito grandes, muito pequenos ou em baixas cópias (Barberio et al., 2001).
Entretanto, Esiobu et al. (2002) relatam a baixa freqüência de plasmídios (29%) entre os
isolados coletados de ambientes aquáticos e terrestres.
Por outro lado, no seqüenciamento do genoma de C. violaceum ATCC
12472, também não foi descrita a presença de plasmídios (BNGPC, 2003). Assim, a
capacidade de os isolados de Chromobacterium sp. crescerem em certas concentrações
das 12 substâncias aqui analisadas pode estar associada a outros mecanismos de
resistência, como bombas de efluxo. Isso pode ser reforçado pela identificação na C.
violaceum seqüenciada (BNGPC, 2003) de pelo menos 40 genes envolvidos com
sistemas de resistência a múltiplas drogas (Fantinatti-Garboggini et al., 2004).
Resistência múltipla a drogas é bem distribuída entre bactérias Gram-negativas, sendo o
principal mecanismo de resistência à extrusão de antimicrobianos e compostos tóxicos
para fora da célula (Alonso & Martinez, 1997; Fantinatti-Garboggini et al., 2004). No
entanto, as funções principais de sistemas de transporte são a captação de nutrientes e
íons, excreção de metabólitos secundários e moléculas de comunicação celular,
permitindo o relacionamento da bactéria com seu habitat. Assim, as funções de efluxo
de metais pesados, como mercúrio e arsênico, e de antimicrobianos, seriam secundárias,
mas essenciais para assegurar níveis altos de resistência (Grangeiro et al., 2004).
FIGURA 18 – Dendrograma do perfil de CIMs aos 11 antimicrobianos e ao bicloreto de mercúrio para os 33 isolados de Chromobacterium sp., determinado pela medida de similaridade Euclidiana, método de UPGMA.
TABELA 6 – Perfis de Concentrações Inibitórias Mínimas para os 46 isolados bacterianos e a linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
Isolados Perfis de Concentrações Inibitórias Mínimas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
Ap256 Sm>128 Cm64 Tc128 Nx8 Rf16 Am256 Gm128 Km>128 Ak>128 Cf<2 Hg8
Ap256 Sm128 Cm32 Tc<2 Nx4 Rf<2 Am128 Gm8 Km8 Ak<2 Cf<2 Hg<2
Ap256 Sm16 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf64 Am64 Gm16 Km4 Ak8 Cf<2 Hg4
Ap256 Sm64 Cm32 Tc4 Nx<2 Rf64 Am128 Gm8 Km16 Ak16 Cf<2 Hg4
Ap16 Sm8 Cm16 Tc16 Nx16 Rf32 Am256 Gm<2 Km8 Ak<2 Cf<2 Hg<2
Ap256 Sm<2 Cm128 Tc>128 Nx16 Rf64 Am256 Gm<2 Km4 Cf<2 Ak8 Hg8
Ap128 Sm<2 Cm<2 Tc<2 Nx8 Rf8 Am32 Gm<2 Km<2 Ak<2 Cf<2 Hg4
Ap256 Sm16 Cm8 Tc<2 Nx16 Rf<2 Am256 Gm<2 Km4 Ak4 Cf<2 Hg4
Ap256 Sm4 Cm>128 Tc32 Nx128 Rf8 Am256 Gm<2 Km4 Ak<2 Cf<2 Hg<2
Ap<2 Sm4 Cm8 Tc<2 Nx16 Rf<2 Am16 Gm<2 Km<2 Ak<2 Cf<2 Hg<2
Ap128 Sm8 Cm8 Tc<2 Nx<2 Rf<2 Am<2 Gm<2 Km4 Ak<2 Cf<2 Hg8
Ap<2 Sm8 Cm32 Tc<2 Nx64 Rf<2 Am<2 Gm<2 Km<2 Ak<2 Cf<2 Hg4
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx8 Rf128 Am>1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg8
Ap>1024 Sm64 Cm128 Tc<2 Nx8 Rf128 Am>1024 Gm4 Km8 Ak32 Cf>128 Hg8
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx16 Rf128 Am>1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg8
Ap>1024 Sm16 Cm16 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc4 Nx4 Rf128 Am>1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg8
Ap>1024 Sm32 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx4 Rf128 Am>1024 Gm4 Km64 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm16 Cm16 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm16 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx4 Rf128 Am>1024 Gm>128 Km16 Ak>128 Cf>128 Hg>16
Ap>1024 Sm16 Cm16 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm64 Tc4 Nx8 Rf128 Am>1024 Gm4 Km32 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm32 Tc<2 Nx4 Rf16 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm64 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf16 Am1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg<2
Ap1024 Sm32 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf128 Hg<2
Ap>1024 Sm128 Cm32 Tc4 Nx8 Rf8 Am1024 Gm64 Km 64 Ak>128 Cf>128 Hg4
Ap>1024 Sm16 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm>128 Cm128 Tc>128 Nx16 Rf<2 Am>1024 Gm64 Km>128 Ak64 Cf>128 Hg8
Ap>1024 Sm128 Cm64 Tc64 Nx<2 Rf32 Am256 Gm128 Km64 Ak8 Cf32 Hg8
Ap>1024 Sm>128 Cm64 Tc16 Nx16 Rf8 Am>1024 Gm>128 Km>128 Ak>128 Cf>128 Hg>16
Ap>1024 Sm>128 Cm16 Tc8 Nx16 Rf8 Am>1024 Gm>128 Km>128 Ak>128 Cf>128 Hg>16
Ap>1024 Sm>128 Cm128 Tc>128 Nx32 Rf64 Am>1024 Gm>128 Km>128 Ak128 Cf>128 Hg16
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx4 Rf128 Am>1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg8
TABELA 6 – Perfis de Concentrações Inibitórias Mínimas para os 46 isolados bacterianos e a linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC 12472. Continuação.
Isolados Perfis de Concentrações Inibitórias Mínimas
38
39
40
43
44
45
46
47
48
ATCC 12742
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx8 Rf32 Am>1024 Gm4 Km16 Ak32 Cf>128 Hg8
Ap>1024 Sm32 Cm32 Tc<2 Nx16 Rf64 Am>1024 Gm4 Km<2 Ak32 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm32 Cm128 Tc<2 Nx16 Rf128 Am>1024 Gm4 Km<2 Ak32 Cf>128 Hg8
Ap1024 Sm16 Cm32 Tc128 Nx4 Rf128 Am>1024 Gm<2 Km8 Ak4 Cf>128 Hg4
Ap1024 Sm32 Cm16 Tc<2 Nx<2 Rf16 Am512 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg4
Ap1024 Sm32 Cm8 Tc<2 Nx<2 Rf16 Am1024 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap>1024 Sm>128 Cm32 Tc32 Nx<2 Rf16 Am1024 Gm64 Km16 Ak16 Cf>128 Hg<2
Ap1024 Sm32 Cm16 Tc<2 Nx<2 Rf8 Am512 Gm4 Km16 Ak16 Cf>128 Hg4
Ap>1024 Sm32 Cm16 Tc32 Nx<2 Rf8 Am1024 Gm16 Km32 Ak16 Cf>128 Hg4
Ap1024 Sm16 Cm32 Tc<2 Nx<2 Rf32 Am256 Gm<2 Km4 Ak <2 Cf>128 Hg8
4.4 Teste de produção in vitro de β-lactamase e amplificação do gene ampC
Investigou-se a produção in vitro de β-lactamase, usando o teste de
nitrocefina, nos isolados bacterianos e na linhagem C. violaceum ATCC 12472 – 30
isolados de Chromobacterium sp.e 12 de espécies de outros gêneros (TAB. 5),
totalizando 43 bactérias – todas com resistência à ampicilina. Os isolados 38 e 39 não
puderam ser testados, pois perderam a viabilidade durante o estudo, mas os
experimentos de amplificação gênica foram possíveis, pois o DNA já havia sido
extraído. Concomitantemente, os isolados 10 (Staphylococcus saprophyticus) e 12
(Chromobacterium sp.) possuíam CIM <2 µg/mL, impossibilitando também o teste.
100% dos isolados de Chromobacterium sp. apresentaram produção de β-lactamase,
sendo que 28 dos 29 isolados exportavam tal enzima (FIG. 19); somente o isolado 32
não foi exportador (FIG. 20). Por outro lado, 92,3% dos isolados de espécies de outros
gêneros também apresentaram a produção dessa enzima. A produção de β-lactamase
parece ser o mecanismo principal de resistência a β-lactâmicos em bactérias Gram-
negativas, principalmente naquelas de ambientes naturais (Ash et al., 2002; Philippon et
al., 2002). No entanto, outros mecanismos, como bombas de efluxo, podem estar
envolvidos, uma vez que nem todos os isolados de outras espécies produziram tal
enzima, embora fossem resistentes à ampicilina.
FIGURA 19 – Isolados bacterianos crescidos em Agar nutriente (30 µg/ml de ampicilina). A coloração laranja ao redor/sobre da colônia indica presença de β-lactamase.
FIGURA 20 – Isolado 32 crescido em Agar nutriente (30µg/ml de ampicilina). A coloração sobre a colônia indica presença de β-lactamase e que esta não é exportada.
De acordo com a literatura (BNGPC, 2003; Fantinatti-Garboggini et al.,
2004), C. violaceum apresenta naturalmente o gene ampC em seu genoma. Visando o
estudo da diversidade do gene ampC realizou-se a PCR para sua amplificação. Tentou-
se amplificar o gene ampC na linhagem padrão de C. violaceum ATCC 12472 e em 33
dos isolados de Chromobacterium sp – e 13 isolados de outros gêneros. Nem todos os
isolados testados para a amplificação do gene ampC foram produtores de β-lactamase,
os isolados 7 (Arctic sea ice bacterium), 10 (Staphylococcus saprophyticus) e 12
(Chromobacterium sp.) não apresentaram produção de β-lactamase nem amplificação
do gene. Dos 31 isolados bacterianos restantes, apenas 29% apresentaram o fragmento
de 1166 pb correspondente ao gene ampC em gel de agarose (FIG. 21). É importante
ressaltar que apesar das várias tentativas, a amplificação só ocorreu uma vez, gerando
um baixo rendimento de produtos de PCR, impossibilitando, assim o seu
seqüenciamento. Somente a linhagem padrão foi, relativamente, constante nas
amplificações, sendo possível seqüenciar o fragmento amplificado.
Apesar da produção de β-lactamase pela maioria dos isolados, não houve
equivalência em relação à amplificação do gene ampC. Duas situações podem estar
envolvidas com a ausência da amplificação desse gene: i) as condições para a PCR
podem ainda não ter sido adequadamente padronizadas, diminuindo, assim, a eficiência
do método; e ii) pode ser devido a pequenas variações no gene ampC (Pérez-Pérez &
Hanson, 2002), levando a um pareamento inadequado dos iniciadores e dessa forma não
resultando em produto de PCR.
FIGURA 21 – Gel de agarose exibindo fragmentos de
1166 pb. As setas apontam os fragmentos. Os números sobre as canaletas indicam os isolados usados no teste. 1: mix para PCR sem DNA , 2: C. violaceum ATCC 12472, 3-5: isolados 18, 41 e 3 respectivamente, 6: Padrão de peso molecular 1kb plus, 7-11: isolados 40, 24, 10, 29 e 19, respectivamente.
4.5 Pesquisa in vitro de produção de substância antagonista
A FIG. 22 apresenta os resultados sobre a produção de substâncias
antagonistas pela linhagem padrão C. violaceum ATCC 12472 e por 44 isolados: 31
isolados de Chromobacterium sp. e 13, de espécies de outros gêneros. Dos isolados do
gênero Chromobacterium, um isolado (isolado 1) nunca apresentou pigmentação
violeta, dois interromperam a produção de violaceína (isolados 4 e 12) e 28 continuaram
sendo produtores desse pigmento. A linhagem reveladora que apresentou maior
sensibilidade à grande maioria dos isolados de Chromobacterium sp. foi S. aureus
(84,4%), seguida E. coli K12 Row (9,4%) de S. typhimurium (6,3%) e K. pneumoniae
(6,3%). Por outro lado, S. flexineri e P. aeruginosa foram resistentes aos metabólitos
secundários produzidos por C. violaceum. Curiosamente, o isolado 27, que é violeta,
não inibiu o crescimento de nenhuma das linhagens reveladoras, podendo, este
resultado, ser considerado inesperado, pois as propriedades antimicrobianas – contra
bactérias Gram-negativas e positivas – de violaceína são relatadas por vários autores
(Durán & Menck, 2001; BNGPC, 2003; Duarte et al., 2004; Silva et al., 2004). O
isolado 1 também não revelou qualquer capacidade inibitória sobre as linhagens
reveladoras testadas. É necessário testar outras linhagens reveladoras contra esses
isolados de Chromobacterium, pois é possível que outras linhagens produzissem
resultados positivos. Dentre os 13 isolados de outras espécies, S. maltophilia (2), K.
pneumoniae (1), S. marcescens (2), Pseudomonas sp. (1), Stenotrophomonas (1)
Staphylococcus sp. (2), R. aquatilis (1) inibiram pelo menos uma das linhagens
reveladoras. Novamente, S. aureus foi a linhagem teste mais sensível (53,8%), seguida
de P. aeruginosa (15,4%) e S. flexineri (15,4%), K. pneumoniae (15,4%), S.
typhimurium (30,8%) e E. coli K12 Row (30,8%). É interessante ressaltar que o único
isolado que inibiu todas as linhagens reveladoras foi R. aquatilis (isolado de número 8),
mostrando, portanto, potencial para estudos biotecnológicos futuros. Por outro lado, os
isolados 7, 10 e 34 não inibiram nenhuma das linhagens teste.
As bactérias são consideradas verdadeiras fabriquetas, pois possuem
capacidade imensa de gerar metabólitos secundários, devido às suas diversas
habilidades fisiológicas (Matz et al., 2004). Dentre esses metabólitos, estão incluídas
substâncias antagonistas como as colicinas (Lenski & Riley, 2002) e os antibióticos
(Challis & Hopwood, 2003), que possuem ação bactericida e/ou bacteriostática. Além
disso, alguns outros compostos, ainda não conhecidos, podem agir de forma citotóxica
sobre eucariotos, como protozoários, invertebrados e plantas (Challis & Hopwood,
2003; Matz et al., 2004). Assim, quando comunidades bacterianas são expostas às
relações ecológicas, tais como predação e competição, os metabólitos secundários, com
algum tipo de atividade antimicrobiana, se tornam fundamentais para a manutenção da
comunidade.
Os experimentos para se tentar caracterizar a natureza protéica ou não-
protéica das substâncias inibidoras do crescimento, detectadas nessa pesquisa, ainda
estão em andamento, com o uso de Proteinase K. Esta protease cliva aminoácidos
alifáticos, aromáticos e hidrofóbicos (Fermentas Life Sciences). Assim, caso a molécula
produzida fosse proteína e clivada com essa enzima, haveria a redução do halo de
inibição. As FIG. 23 e 24 mostram os halos de inibição dos isolados 40 e 8,
respectivamente, identificados como Chromobacterium sp. e R. aquatilis.
0
5
10
15
20
25
30
Núm
ero
de Is
ola
dos
Staphylococcusaureus
Pseudomonasaeruginosa
Klebsiellapneumoniae
Shigella flexineri Salmonellatyphimurium
Escherichia coliK12 Row
Linhagens Reveladoras
Chromobacterium violaceum Outras Espécies
FIGURA 22 – Número absoluto de produtores de substância antagonista por C. violaceum ATCC
12472, por 31 isolados de Chromobacterium sp. e 13 isolados de espécies de outros gêneros, frente às linhagens indicadoras: E. coli K12 Row, S. typhimurium, S. flexineri, K. pneumoniae, P. aeruginosa e S. aureus.
A
B
FIGURA 23 – A. Halo de inibição do isolado de Chromobacterium sp.(isolado 40) frente à S. aureus. B. Detalhe da figura A.
FIGURA 24 – Halo de inibição do isolado R. aquatilis (isolado 8) frente à S. aureus.
5 CONCLUSÃO
Com o objetivo de analisar a variabilidade genética, por meio do gene de
rRNA 16S, e fisiológica de isolados de C. violaceum brasileiros, foram coletados nos
anos de 2001, 2003 e 2004, 48 isolados bacterianos: 40 isolados do Parque Nacional da
Serra do Cipó, três isolados do Parque Estadual do Rio Doce e cinco isolados do Rio
Negro, sendo os critérios de seleção dos isolados a presença de cor violeta e
crescimento a 37ºC.
� A partir da comparação das seqüências dos 48 isolados com as do banco de dados
do GenBank foi possível determinar as espécies/gêneros mais prováveis para cada
um dos isolados: 34 pertencem provavelmente ao gênero de Chromobacterium; 12
isolados faziam parte de espécies de outros gêneros, – Klebsiella,
Stenotrophomonas, Serratia, Rahnella e Staphylococcus; dois isolados coincidiram
com seqüências ainda não classificadas.
� A partir da análise filogenética foi possível observar a formação de um grupo
monofilético com o gênero Chromobacterium, sendo importante ressaltar que uma
das seqüências não classificadas previamente com o Blast foi agrupada nesse
mesmo clado, mostrando, assim, a importância de reconstruções filogenéticas nas
classificações de organismos ainda não identificados ou para confirmar as
classificações existentes.
� A similaridade das seqüências parciais (409 pb) do rRNA 16S desses isolados com a
linhagem padrão C. violaceum ATCC 12472 foi de 98,2%, no entanto, outras provas
bioquímicas poderão futuramente ser úteis para confirmar a classificação desses
isolados.
� As CIMs dos antimicrobianos β- lactâmicos foram as mais altas.
� Para 89,1% dos isolados testados, as CIMs da ampicilina foram maiores ou
iguais a 256 µg/mL.
� Para 89,1% dos isolados testados, as CIMs da amoxicilina/ácido clavulânico
foram maiores ou iguais a 128 µg/mL.
� Para 71,7% dos isolados testados, as CIMs da cefotaxima foram maiores ou
iguais a 128 µg/mL.
� O mecanismo de resistência, provavelmente envolvido, é a produção de β- lactamase, uma vez que os isolados resistentes aos β- lactâmicos hidrolisaram a
nitrocefina, podendo, no entanto, o mecanismo de bombas de efluxo também estar
presente nesses isolados ambientais, sugerido pela grande diversidade de perfis de
CIM e pela ausência de plasmídios podem ser uma indicação disto.
� Chromobacterium sp. é capaz de produzir substâncias antagonistas, contra diversas
reveladoras, sendo a linhagem mais susceptível Staphylococcus aureus, sendo
entretanto, necessário testar outras linhagens que podem se apresentar sensíveis aos
metabólitos secundários desses isolados.
� Os dados fornecem perspectivas para empreender estudos no sentido de conhecer a
diversidades de genes, cujas funções biológicas ainda não foram determinadas, e de
outras bactérias isoladas da natureza, que podem também apresentar potencial
biotecnológico.
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