Diversidade Microbiana da Amazônia -...

Diversidade Microbiana da

AmazôniaVol. 2

Editores: Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,Fernandes

O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L.

Copyright © 2017, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

PRESIDENTE DA REPÚBLICAMichel Temer

MINISTRO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, INOVAÇÕES E COMUNICAÇÕESGilberto Kassab

DIRETOR DO INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIALuiz Renato de França

EDITORA INPAEditor: Mario Cohn-Haft. Produção editorial: Rodrigo Verçosa, Shirley Ribeiro Cavalcante, Tito Fernandes. Bolsistas: Brenda Costa, Alan Alves, Mariana Franco de Sá e Sabrina Trindade.

FICHA CATALOGRÁFICA

D618 Diversidade microbiana da Amazônia Vol.2 /Editor L. A. Oliveira... [et.al.].--Manaus: Editora INPA, 2017.348.: il. color.

ISBN 978-85-211-0175-8

1. Microbiologia - Amazônia. 2. Diversidade. I. Oliveira, L. A.

CDD 576.9811

Editora do Instituto Nacional de Pesquisas da AmazôniaAv. André Araújo, 2936 – Caixa Postal 2223Cep : 69067-375 Manaus – AM, BrasilFax : 55 (92) 3642-3438 Tel: 55 (92) 3643-3223www.inpa.gov.br e-mail: [email protected]

AGRADECIMENTOS

Pelo apoio financeiro para a realização do evento.

Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017.

Editora INPA, 348p.

Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L.

Luiz Antonio de Oliveira

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

[email protected]

Jania Lilia da Silva Bentes

Universidade Federal do Amazonas [email protected]

Maria Aparecida de Jesus

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

[email protected]

Liliane Coelho da Rocha

Universidade do Estado do Amazonas

[email protected]

Ormezinda Celeste Cristo Fernandes Instituto Leônidas e Maria Deane/Fiocruz-Amazônia

[email protected]

Suanni Lemos de Andrade

Universidade do Estado do Amazonas

[email protected]

Antonia Queiroz Lima de Souza

Universidade Federal do Amazonas [email protected]

mailto:[email protected]



mailto:antoniaqlsouza@gmail.

Esse é o segundo volume do livro Diversidade Microbiana da Amazônia, tendo como

conteúdo, parte dos trabalhos apresentados no 6° CDMicro – Congresso sobre Diversidade

Microbiana da Amazônia - realizado no final de 2016 na cidade de Manaus. O CDMicro é

um evento que já se consolidou na região e serve como referência para todos os profissionais

que trabalham com a microbiota amazônica.

Ao compilarmos as informações divulgadas no congresso na forma de capítulos de um livro

digital, damos oportunidade para que todos os que estiverem interessados possam acessá-las

sem restrição, facilitando os avanços necessários para conhecermos melhor a microbiota

regional na busca de novas tecnologias e bioprodutos advindo da sua utilização racional.

Esperamos com essa atitude, estar contribuindo para que as pesquisas com microrganismos

da Amazônia sejam mais intensamente compartilhadas entre os estudantes, professores e

pesquisadores que se dedicam a conhecê-los melhor.

A Comissão Organizadora

5

Sumário

Páginas

Alimentos Fermin A.S., Klehm K.G., Souza E.O., Lima C.R.T., Silva C.M.A. Presença de

coliformes em hambúrguer caseiro comercializado em food truck na cidade de

Manaus-AM.

1

Machado A.R.G., Martim S.R., Prado F.B., Teixeira M. F. S. Caracterização parcial

de proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis.

9

Minelli-Oliveira C., Brito L.L., Menezes N.C., Cáuper F.R.M., Clement C.R., Oliveira L.A. Crescimento de bactérias isoladas de queijos e iogurtes em meio

contendo lactose.

14

Nunes C.O., Souza F.S. Ocorrência de Salmonella spp. em amostras de queijos

comercializados em feiras na cidade de Manaus, AM.

21

Reis D. M., Nunes A.S., Pedreno G.Y.O., Galúcio V.C.A., Sales-Campos C. Crescimento micelial e atividade enzimática qualitativa de macromicetos

amazônicos em meio de cultivo à base de casca de tucumã (Astrocarium aculeatum

Meyer).

30

Santos R.A., Fernandes F.S., Farias A.V., Souza J.V.B., Souza, E.S. Potencial da

levedura Candida humilis inpa1105 para a produção de proteína unicelular e etanol a partir dos hidrolisados ácidos de resíduos vegetais Amazônicos.

40

Souza J.A., Pedreno G.Y.O., Nunes A.S., Galúcio, V.C.A.; Sales-Campos C.

Análise microbiológica de resíduos de Musa sp. (bananeira) empregados no cultivo

de fungos comestíveis.

48

Ambiental

Almeida A.F., Bentes J.L.S., Hidalgo A.F. Atividade antifúngica de Picrolemma

sprucei Hook sobre o crescimento de fitopatógenos. 58

Alves E.S.F., Oliveira F.R., Moreira F.W. , Oliveira L.A. Atividade proteolítica de

rizobactérias de nódulos de leguminosas de municípios circunvizinhos de Manaus /

Amazonas.

66

Aparício J.F., Silva S.R.S, Souza A.Q.L., Freitas A.D.G. Isolamento, identificação e produção de celulases dos microrganismos associados aos Cupins Nasutitermes

sp.

74

Brito L.L., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Cáuper F.R.M., Moreira F.W.,

Oliveira L.A. Avaliação da capacidade de produção de biossurfactantes e

degradação de petróleo por isolados de rizóbactérias.

83

Brito L.L., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Cáuper F.R.M., Moreira F.W., Oliveira L.A. Biodegradação de petróleo por isolados de rizobactérias.

89

Carvalho W.O., Fonseca N.F. , Silva J.R. Produção de lacase por uma cepa de

Trametes elegans coletada no Município de Alvarães-Amazonas.

98

Cáuper F.R.M., Brito L.L., Minelli-Oliveira C., Oliveira L.A., Costa S.S., Menezes

N.C. Potencial de produção de amilase por rizóbios isolados de nódulos de feijão

caupi cultivado em solo da Amazônia.

107

Costa S.C.F.C., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Oliveira L.A. Produção de 115

6

amilases por rizobactérias em meio contendo farinha da babaçu.

Couceiro D.M., Jesus M.A. Macrofungos Polyporaceae (Basidiomycota) no Jardim

Botânico Adolpho Ducke, Amazonas.

124

Fernandes K.R.P., Souza A.Q.L., Alencar L.F., Silva H.F., Pereira J.O., Rodrigues-

Filho E., Souza, A.D.L. Constituintes químicos do fungo Trichoderma koningii

isolado de Strychnos cogens.

133

Ferreira A.S., Jesus M.A. Biodegradação dos corantes azul brilhante de remazol R e vermelho congo por linhagens de Basidiomycetes.

142

Figueiredo T.F., Souza V.C., Cortez A.C.A., Souza J.V.B. Identificação de fungos

de água doce pelo sequenciamento das regiões Its, isolados de madeira submersa

em decomposição de um lago do município de Iranduba-AM.

152

Galúcio V.A., Teixeira N.S., Prestes A.G., Nunes A.S., Sales-Campos C. Análise

nutricional e microbiológica de resíduos de abacaxi Ananas sp.

161

Gomes D.M.D., Nascimento A.P.F., Silva L.P., Amaral P.A.S., Machado A.R.G., Martim S.R., Alecrim M.M., Teixeira M.F.S. Caracterização parcial de protease

alcalina produzida por Aspergillus pulverulentus em resíduo lignocelulósico.

171

Jesus M.A., Oliveira D.A.S., Santos J.F.S., Magalhães F.F.C., Souza D.H.,

Couceiro, D.M. Macrofungos (Aphyllophorales, Basidiomycetes) da área urbana de Manaus

180

Machado A.R.G., Martim S.R., Prado F.B., Teixeira M.F.S. Caracterização parcial

de proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis.

194

Magalhães A.A.S.., Carvalho T.B., Souza A.Q.L., Pereira J.O. Efeito da

temperatura e do pH no crescimento micelial do fungo amazônico Lentinus crinitus

(L.) Fr.

200

Martim S.R., Silva L.S.C., Prado F.B., Machado A.R.G., Teixeira M.F.S. Estabilidade e toxicidade de extratos proteolíticos de Pleurotus ostreatoroseus e

Lentinus citrinus cultivados em resíduo lignocelulósico da Amazônia.

208

Moura D.C.G. , Oliveira L.A. Capacidade de microrganismos autóctones de solos

amazônicos em usar o petróleo como fonte de carbono com meios nutricionais distintos.

218

Nonato L.S., Nascimento N.J.C., Silva M. S., Santos S. F., Mota A. J. Análise

comparativa de captação de fosfato usando bactérias isoladas do rio Negro e rio

Solimões.

225

Ohse, K.C., Gorayeb, G., Sabino, C.V.M., Lima, B.R., Silva, F.M.A., Souza,

A.Q.L., Souza, A.D.L., Lima, E.S. Biotransformação de rutina por Guinardia sp.

233

Oliveira F.R., Moreira F.W., Oliveira L.A. Rizobactérias de solos amazônicos com habilidade de degradar gasolina obtida da Refinaria de Manaus (REMAN).

242

Oliveira K.K.C., Moreira, F.W.; Oliveira, L.A. Rhizoctérias de solos amazônicos

com habilidade para degradar óleo diesel.

249

Oliveira R.C., Santos J.P., Santos S.F., Mota A.J. Uso de resíduos de abacaxi

(Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis) para a produção de bioplásticos

por bactérias.

259

7

Queiroz C.A., Sousa S.B., Hanada R.E., Silva G.F. Distribuição de mating type e

diversidade de Fusarium decemcellulare isolados de mudas de guaranazeiro em

viveiro.

265

Silva L.S.C., Silva L.P., Souza B.C., Silva T.A., Vieira L.F.S., Durán, N.,

Teixeira M.F.S. Síntese de nanopartículas de prata por espécies de

Aspergillus do grupo Niger

275

Silva P.H.F., Silva S.R.S., Batista R.M., Soares L.N., Souza A.D.L., Costa E.V.,

Koolen H.H.F., Souza A.Q.L. Isolamento e caracterização de policetídeos diméricos em Talaromyces sp., um fungo endofítico de Duguetia stelachantha.

282

Siqueira, R.H.S., Evald A., Melo V.F., Rocha P.R.R., Matos K.S., Espindola I.C.,

Maia, S.S. Indicadores microbiológicos do solo sob diferentes manejos de água no

cultivo de arroz na Amazônia Setentrional.

287

Sousa A.S., Almeida M.F.O., Souza A.Q.L., Souza A.D.L. Sorbicilinoide de

Penicillium chrysogenum isolado de Gustavia sp.

295

Sousa T.F., Queiroz C.A., Sousa S.B., Silva G.F. Diferenciação genética entre as formas homotálicas e heterotálicas de Fusarium decemcellulare por meio de

marcadores moleculares.

305

Médica

Carvalho W.O., Fonseca N.F., Silva J.R. Avaliação de consórcios de fungos amazônicos (Trametes lactinea e Hexagonia glabra) contra as bactérias

Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris.

312

Grisolia M.E., Alves, G.S.B., Cruz, K.S., Jackisch-Matsuura A.B. Avaliação de

métodos de extração de DNA genômico para fungos dermatófitos.

320

Silva, T.G., Teles, A.L.M., Souza, L.C.A., Araujo, K.S., Cordeiro, A.T.D., Santos, J.G., Cruz Filho, R.F. Detecção de Micobactérias de Crescimento

Rápido em aparelhos videoscópicos na cidade de Manaus - AM.

326

Souza I. S., Silva D. M., Fernandes O.C.C., Rodrigues J. C. Avaliação da

patogenicidade de fungos filamentosos: Aldeia Fronteira – Mundurukú, Borba–

AM.

333

Xavier M.S., Lisbôa R.S., Guedes V.T.M., Souza F.S. Microbiota bacteriana da mucosa oral de cães (Canis lupus familiaris) atendidos em clínica veterinária na

cidade de Manaus, AM.

340

1

Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,

Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA

Presença de coliformes em hambúrguer caseiro

comercializado em food truck na cidade de Manaus-AM.

Fermin A.S.1, Klehm K.G.

2, Souza E.O.

3, Lima C.R.T.

4, Silva C.M.A.

5

1Especialista em Ensino da Biologia, Faculdade Arthur Thomas,

2Graduada em Licenciatura em

Química, Instituto Federal do Amazonas, 3Graduada em Licenciatura em Ciências Biológicas,

Centro Universitário do Norte, 4Graduada em Administração de Empresas, Faculdade

Metropolitana de Manaus,5Mestre em Biologia de Água Doce e Pesca Interior, INPA.

Emails:[email protected],

[email protected],

[email protected],

[email protected],

[email protected].

Resumo

O comércio de alimentos de rua apresenta aspectos positivos devido à sua importância

socioeconômica, cultural e nutricional, e negativo quanto às questões higiênico-sanitárias.

O hambúrguer por ter como matéria-prima principal a carne, necessita de cuidado e uma

correta manipulação, pois facilmente pode ser contaminado por microrganismos

patógenos. Sendo assim o objetivo deste estudo é avaliar a qualidade microbiológica de

hambúrguer caseiro e as condições higiênico-sanitárias através de ocorrência de

microrganismos indicadores como: Coliforme Total e Termotolerante através do método

de plaqueamento em superfície. Um total de 15 amostras de hambúrguer de diferentes

estabelecimentos food trucks foram analisadas. Coliformes termotolerantes ocorreram em

todos os estabelecimentos analisados e o de coliformes totais em dois estabelecimentos. As

amostras se encontravam fora dos parâmetros preconizados pela RDC 12/2001 da

ANVISA, não estando adequadas para o consumo humano, demonstrando que boas

práticas devem ser implantadas e que sejam fiscalizadas tanto a produção como a venda

desses alimentos.

Palavras-chave: Análise microbiológica, Hambúrguer, Grupo Coliforme.

Introdução

Embora o comércio ambulante seja uma atividade centenária, a modalidade Food

Trucks (caminhões de alimentos) surgiu a partir da primeira década do século XXI. Essa

tendência virou moda, pois muitos consumidores passaram a buscar os caminhões como

forma de acesso a alimentos mais sofisticados e a preços acessíveis (SEBRAE, 2015).

O comércio de alimentos de rua apresenta aspectos positivos devido à sua

importância socioeconômica, cultural e nutricional, e negativo quanto às questões

higiênico-sanitárias pois a venda de alimentos de rua é muito controversa, por representar






2

uma ameaça à saúde do consumidor, principalmente devido às técnicas inadequadas de

higiene e manipulação dos alimentos (Lucca e Torres, 2002).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que, a cada ano, mais de dois

milhões de pessoas morram por doenças diarreicas, muitas das quais adquiriram ao ingerir

alimentos e/ou água contaminados (Brasil, 2014).

Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs) são todas as ocorrências clínicas

consequentes da ingestão de alimentos que possam estar contaminados com

microrganismos patogênicos (infecciosos, toxinogênicos ou infestantes), substâncias

químicas, objetos lesivos ou que contenham em sua constituição estruturas naturalmente

tóxicas, ou seja, são doenças consequentes da ingestão de perigos biológicos, químicos ou

físicos presentes nos alimentos (Silva Junior, 2014). Existem mais de 250 tipos de DTA e a

maioria é infecção causada por bactérias e suas toxinas, vírus e parasitas (Brasil, 2014).

Muitos casos de enfermidades causadas por alimentos não são notificados, pois

seus sintomas são geralmente parecidos com gripes. Os sintomas mais comuns de doenças

de origem alimentar incluem dor de estômago, náusea, vômitos, diarreia e febre, ao fato de

que muitos patógenos presentes em alimentos causam sintomas brandos, e a vítima não

busca auxílio médico (Forsythe, 2013), sendo que o período de incubação varia conforme o

agente etiológico, porém usualmente é curto, variando de 1 a 7 dias (Brasil, 2014).

Existe um grande número de fatores que contribuem para tornar um alimento não

saudavel, causando toxinfecções àquelas pessoas que os ingerirem. As principais causas

são: controle inadequado da temperatura durante o cozimento, o resfriamento e a

estocagem; higiene pessoal insuficiente; contaminação cruzada entre produtos crus e

processados e monitoramento inadequado dos processos (Forsythe, 2013), tornando-os

veículos de microrganismos patogênicos ou não, tais como: bactérias, fungos, protozoários,

dentre outros.

Coliformes são definidos como bactérias tipo bastonetes gram-negativos aeróbicos

ou anaeróbicos facultativos, não-formadores de endósporos (Tortora et al., 2017). O grupo

dos coliformes totais é um subgrupo da família Enterobacteriaceae que, inclui 44 gêneros e

176 espécies. No grupo dos coliformes totais estão apenas as enterobactérias capazes de

fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 35 °C. O grupo dos

coliformes termotolerantes, é um subgrupo dos coliformes totais, restrito aos membros

capazes de fermentar a lactose em 24 horas a 44,5-45,5 °C, com produção de gás. São

microrganismos indicadores usados para avaliar a segurança e higiene dos alimentos (Silva

et al. 2010).

3

Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que,

quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de

contaminação de origem fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a

deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias

inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (Franco e Landgraf,

2005) de alimentos de origem vegetal ou animal.

O hambúrguer por ter como matéria-prima principal a carne, necessita de cuidado e

uma correta manipulação, pois facilmente pode veicular microrganismos patógenos (Melo

et al., 2012). Carnes moídas comercializadas, originárias de vários cortes, manipuladas

excessivamente e por ter uma grande superfície de contato (moedor de carne, facas

destinadas ao corte e os utensílios do estoque) contribuem para o aumento da flora

microbiana (Jay, 2005).

A chave para a produção de alimentos seguros é produzir alimentos

microbiologicamente estáveis. É necessário certificar-se de que nenhum microrganismo do

alimento vai se multiplicar até doses infecciosas. O ideal é que os microrganismos estejam

inativados e que não haja toxinas (Forsythe, 2013).

Para tal, é importante avaliar as condições higiênico-sanitárias e qualidade

microbiológica dos alimentos comercializados, devido o processo de manipulação

excessivo e possível problemático sistema de conservação, favorecendo sua contaminação

por patógenos.

Torna-se necessária a avalição de sua qualidade higiênico-sanitária do ponto de

vista microbiológico a fim de garantir que o consumo ocorra de forma segura e livre de

contaminação.Assim, objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica de hambúrguer

caseiro e as condições higiênico-sanitárias através de ocorrência de microrganismos

indicadores como: Coliforme Total e Termotolerante comercializado na cidade de Manaus-

AM através do método plaqueamento em superfície.

Material e Métodos

Os hambúrgueres caseiros utilizados nesse estudo são comercializados em food

trucks da Cidade de Manaus-AM. A coleta foi em cinco pontos na zona centro-sul da

cidade, localizados em uma das principais ruas dos bairros: 1 (Parque das Laranjeiras), 2

(Parque 10 de Novembro), 3 (Adrianopólis), 4 (Dom Pedro) e 5 (Adrianopólis). Os

4

caminhões estão instalados nas ruas com grande movimentação de carros e pessoas; o

estabelecimento 3 está localizado em uma vila food truck.

Em cada estabelecimento foram compradas três amostras, totalizando quinze

hambúrgueres imediatamente identificados e transportados em embalagem para viagem

conforme cada estabelecimento, até o Laboratório Multidisciplinar da Esbam para

realização das análises. Foram analisadas através da metodologia plaqueamento em

superfície, usando os meios de cultura M Endo Agar e M FC Agar de acordo com as

instruções do fabricante e vertido os meios em placa de Petri, em ambiente asséptico

usando-o ao solidificar. De cada amostra foram pesados 25 g do hambúrguer caseiro,

adicionados 225 mL de água peptonada a 0,1 % estéril e procedeu-se a homogeneização

das amostras, obtendo a diluição inicial 10ˉ¹. Em seguida, preparou-se diluições decimais

sucessivas até 10ˉ³ (Silva et al., 2007).

Para determinação de coliforme total e coliforme termotolerante, foram transferidos

0,1 mL da diluição 10ˉ³ das amostras para as placas de Petri contendo os meios de cultura

especifíco, espalhando o inóculo por toda a superfície do meio. Incubou-se em estufa

bacteriológica a 35 °C para Coliforme total e 45 °C para Coliforme termotolerante, ambos

por 48 h para o desenvolvimento das colônias. Todo o material utilizado para o

processamento das amostras estava estéril e todo procedimento foi realizado próximo ao

bico de Bunsen com a chama a meia altura em uma câmara de fluxo laminar (Silva et al.,

2007).

O resultado considerado positivo foi a formação de colônias com características

compatíveis ao de Coliformes, com a contagem das colônias e expressas em UFC/g

(Unidades Formadoras de Colônias por grama).

Resultados e Discussão

Os dados da pesquisa para coliforme total encontram-se na Tabela 1. Observa-se

que dos cinco estabelecimentos analisados, as amostras dos estabelecimentos 1 e 2

apresentaram esse grupo de microrganismos. A RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001 não

estabelece limites de tolerância para o grupo dos coliformes totais em hambúrgueres.

Entretanto, a presença desses microrganismos pode indicar condições higiênico-sanitárias

deficientes, colocando em risco a saúde dos consumidores (Silva et al., 2010).

5

Menezes e Alexandrino (2014) também observaram níveis altos de contaminação

por coliformes totais em hambúrgues comercializados em mercados na Cidade de Campo

Mourão-PR, indicando condições higiênico-sanitárias precárias.

Tabela 1. Presença de Coliformes Totais em amostras de hambúrguer caseiro

comercializado na cidade de Manaus-AM.

Frequência de UFC/g

Estabelecimentos Coliformes Totais

1ª Coleta 2ª Coleta 3ª Coleta

1 7 x 10⁴ Aus 1 x 10³

2 1 x 10³ Aus Aus

3 Aus Aus Aus

4 Aus Aus Aus

5 Aus Aus Aus

LMA - - - Legenda; LMA= Limite Máximo Aceitável (RDC N° 12, 2001)

Nas Tabela 2 e 3 estão representados os dados obtidos na pesquisa de Coliformes

Termotolerantes. Observa-se que as amostras dos estabelecimentos 1 e 2 apresentaram

presença de coliforme de origem fecal, sendo considerados fora dos padrões legais

vigentes preconizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Então de

acordo com a legislação, tais amostras foram consideradas como “produtos em condições

higiênico-sanitárias insatisfatórias” para o consumo.

Tabela 2. Presenças de Coliformes Fecais em amostras de hambúrguer caseiro

comercializado na cidae de Manaus-AM.

Frequência de UFC/g por aquisição

Estabelecimentos Coliforme Termotolerante (Fecal)


1 2 x 10⁴ Aus Aus

2 4 x 10⁴ Aus 1 x 10⁵ 3 - - - 4 - - -

5 - - -

LMA 5 x 102 5 x 10

2 5 x 10

2

Legenda; LMA= Limite Máximo Aceitável (RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001)

Na Tabela 3 observa-se o crescimento de coliformes a 45°C de origem não fecal.

Segundo Silva et al. (2010), o grupo inclui membros de origem não fecal (várias cepas de

Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Enterobacter aerogenes, Enterobacter

6

cloacae e Citrobacter freundii). Em função disso, o termo coliformes fecais tem sido,

gradativamente, substituído por coliformes termotolerantes.

Segundo Sabota et al. (1998), dentre as espécies de Klebsiella, a K. pneumoniae

enteroinvasiva foi isolada, no final dos anos 1990, de hambúrguer servido por uma cadeia

de restaurantes fast food nos EUA, tendo causado gastrenterite.

O argumento de que elevados números de coliformes termotolerantes em alimentos

estão correlacionados com contaminação fecal já não é válida, pois as enterobactérias

mencionadas não são obrigatoriamente habitantes do trato intestinal de animais de sangue

quente, podendo ser encontradas em reservatórios naturais. Além disso, são organismos

comuns nos ambientes de manipulação de alimentos, podendo se tornar parte da

microbiota residente (Silva et al., 2010).

Tabela 3. Contagem das Unidades Formadoras de Colônias de Não Fecal em amostras de

hambúrguer caseiro comercializado na cidae de Manaus-AM.

Frequência de UFC/g por aquisição

Estabelecimentos Coliforme Termotolerante (Não Fecal)


1 - - -

2 - - - 3 2,4 x 10

6 - 1 x 10

3

4 4,4 x 106

2,8 x 106

2,6 x 106

5 3 x 106

1,8 x 106

2,6 x 106

LMA 5 x 102 5 x 10

2 5 x 10

2

Legenda; LMA= Limite Máximo Aceitável (RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001)

A RDC n° 216, de 15 de setembro de 2004 dispõe sobre regulamento técnico de

boas práticas para serviços de alimentação a fim de garantir as condições higiênico-

sanitárias do alimento preparado. Aplica-se aos serviços de alimentação que realizam

atividades de manipulação, preparação, fracionamento, armazenamento, distribuição,

transporte, exposição à venda e entrega de alimentos preparados ao consumo. Ressalta-se

a importância da prática desse procedimentos para que se tenha alimentos seguros.

Nota-se também, que é essencial a implementação de ações que regularizem e

fiscalizem as condições higiênico-sanitárias de estabelecimentos food trucks, a fim de

promover a distribuição de alimentos seguros aos consumidores.

7

Conclusões

De acordo com os parâmetros conferidos pela ANVISA, foram encontrados

hambúrgueres caseiros comercializado em food trucks na cidade Manaus-AM não

recomendados para consumo devido à contaminação por coliformes totais e

termotolerantes, dois grupos de microrganismos indicadores das condições higiênico-

sanitárias.

Diante do exposto, destacamos a importância da higiene, do controle de

temperatura das instalações onde se processam alimentos cárneos e da adoção de boas

práticas de manipulação de alimentos, em virtude de a carne moída ser a principal matéria-

prima do hambúrguer caseiro e por ser um alimento com grande potencial para causar

doenças de origem alimentar.

Referências

ANVISA (2001). Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 12, de 02

de janeiro de 2001. Dispõe sobre os princípios gerais para o estabelecimento de critérios e

padrões microbiológicos para alimentos. Disponível em: < http://www.

vigilanciasanitaria.gov.br/anvisa.html>. Acesso em 30 set. 2016.

ANVISA (2004). Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução RDC

n° 216, de 15 de setembro de 2004. Diário Oficial da República Federativa do Brasil,

Brasília, 15 set. 2004, Seção 1, p. 25.

Brasil (2014). Descrição da Doença. Ministério da Saúde. Disponível em:

http://portalsaude.saude.gov.br/. Acesso em 29 set 2016.

Brasil (2014). Doenças transmitidas por alimentos. Ministério da Saúde. Disponível em:

http://portalsaude.saude.gov.br/. Acesso em 29 set 2016.

Franco BDGM, Landgraf M (2005). Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu.

196p.

Forsythe, SJ (2013). Microbiologia da Segurança dos Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2ª

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9



Caracterização parcial de proteases de extratos orgânicos de cogumelos

comestíveis

Machado A.R.G.1, Martim S.R.

1, Prado F.B.

2 Teixeira M. F. S.

3

1PG Biodiversidade Biotecnologia – Rede Bionorte, Universidade Federal do Amazonas,

2 PG

Biotecnologia , Universidade Federal do Amazonas, 3Professora associada e curadora da coleção de

culturas DPUA, Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],

[email protected], [email protected], [email protected].

Resumo

As proteases são enzimas que possuem ampla utilização comercial e industrial. As

peptidases de origem fúngica apresentam vantagens como alta diversidade, fácil produção

em larga escala e recuperação. O objetivo deste estudo foi caracterizar parcialmente

proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis. A cultura matriz foi preparada

em meio OMYA (aveia + extrato de levedura. Os extratos dos cogumelos foram obtidos

por processo de extração com etanol e álcool:água (1:1). O extrato bruto foi filtrado

sucessivamente em tecido de algodão e membrana polietersulfônica de 0,22 µm. Nos

extratos enzimáticos foi determinada a atividade proteolítica utilizando azocaseína como

substrato. Os resultados demonstraram que o extrato de P. ostreatoroseus obtido da

mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de proteases que apresentaram atividade catalítica

significativa em pH 5 a 40˚C.

Palavras-chave: Peptidases, Pleurotus albidus, Pleurotus ostreatoroseus.

Introdução

Cogumelos são fontes de nutrientes e compostos bioativos que conferem

propriedades medicinais e terapêuticas. São produtos que despertam pouco interesse para

comercialização, embora que contribuem de forma significativa para a subsistência de

várias populações, no mundo (Bernaud e Rodrigues, 2013; Mattila et al. 2016; Zoho et al.

2016).

Os fungos do gênero Pleurotus, conhecidos por causar a podridão branca da

madeira, apresentam a capacidade de se desenvolver em vários resíduos agroindustriais

que contenham celulose, hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas. (Figueiró e

Graciolli, 2011; Minotto et al. 2011).

10

Proteases são enzimas utilizadas em diferentes setores industriais. Estes

biocatalisadores são usados na fabricação de queijo e de pães, amaciamento de couro,

aditivo de detergentes, além de possuírem importância medicinal e cosmética (Sawant;

Nagendran, 2014). As peptidases são obtidas de diversas fontes vegetais, animais e de

micro-organismos, Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como produtores de

enzimas proteolíticas, além de serem utilizados como alimentos (Fonseca et al., 2014).

Diversos estudos têm sido realizados sobre a extração de compostos bioativos de

cogumelos por solventes orgânicos (Silva et al. 2009). Contudo ainda há poucos relatos

sobre o potencial biotecnológico deste macrofungo.

Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar parcialmente proteases de

extratos orgânicos de cogumelos comestiveis.

Material e Métodos

Para a produção de enzimas, foram utilizados Pleurotus albidus DPUA 1692 e

Pleurotus ostreatoroseus DPUA 1720 do acervo da Coleção de Culturas DPUA/UFAM.

As culturas foram reativadas e cultivadas em placas de Petri contendo ágar OMYA (aveia

+ extrato de levedura) durante sete dias a 25°C.

Os extratos de cogumelo foram obtidos por processo de extração com etanol e

álcool:água (1:1). O processo de extração ocorreu sob agitação contínua em agitador

orbital a 150 rpm, a 25 °C. Posteriormente os extratos foram filtrados em papel de filtro

Whatman n°1 e foram feitas as análises subsequentes.

Determinação da atividade proteolítica quantitativa

Para a determinação da atividade enzimática proteolítica foram adicionados 250 µL

de solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2 em 150 µL de

extrato bruto. Os tubos reação foram incubados por 1 hora a 25 °C em câmara escura. Para

a interrupção da reação foram adicionados 1,2 mL de ácido tricloroacético 10% (p/v) e em

seguida procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 10000 rpm, a 4 °C. Em seguida, de

cada sobrenadante, foram retirados 0,8 mL e transferidos para tubos de ensaio contendo 1,4

mL de hidróxido de sódio 1M. A leitura das amostras foi realizada a 440 nm. Como branco

foi utilizada solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2.

11

Efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica

A partir do extrato bruto onde foi determinada a maior atividade proteolítica

analisou-se o efeito do pH na atividade proteolítica, incubando-se o extrato enzimático em

diferentes faixas de pH (5,0 – 10,0), a 25 ºC por 60 minutos. Os tampões utilizados foram

Citrato Fosfato 0,2 M (pH 5,0-6,0), Tris-HCl 0,2M (pH 7,0-8,0), Glicina-NaOH (pH 9,0-

10,0). O efeito da temperatura foi determinado em 25 ºC, 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70

ºC, em 60 minutos. A atividade das proteases foi determinada conforme descrito

anteriormente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva média, desvio padrão,

gráfico e os cálculos de atividade enzimática (R2 ≥ 95%) por meio de análise de variância

(Anova) e teste Tukey (p < 0,05), utilizando o software Minitab ® versão 17.0.


Pleurotus albidus e P. ostreatoroseus excretaram proteases em todas as condições

avaliadas, sendo que o maior quantitativo de proteases (185 U/mL) foi verificado quando

P. ostreatoroseus foi extraído com água: álcool (1:1). Os menores valores de atividade

proteasica (80 U/mL e 102 U/mL) foram observados nos extratos de P. albidus em

solventes etanol e água:álcool (1;1) respectivamente.

Tabela 1. Atividade proteolítica de P. albidus e P.ostreatoroseus extraídos em

diferentes solventes orgânicos

Taxa Solvente Atividade proteolítica

(U/mL)

Pleurotus albidus Água:álcool (1:1) 102±0,1c

P. ostreatoroseus Água:álcool (1:1) 185±0,1ª

P. albidus Etanol 80±0,0d

P. ostreatoroseus Etanol 129±0,1b

O extrato bruto com maior atividade proteolítica foi submetido à caracterização

parcial de proteases. O efeito do pH na atividade proteolítica consta na figura 1 (A). As

proteases do extrato de P. ostreatoroseus extraído com água:álcool (1:1) apresentaram

12

atividade máxima em pH 5,0 com valores de 308 U/mL. Esses dados sugerem a presença

de proteases ácidas no extrato enzimático avaliado. Nos trabalhos realizados por Fonseca

et al. (2014), os autores verificaram que as proteases extraídas dos basidiomas de P.

ostreatoroseus demonstraram máxima atividade em pH 6,0.

Conforme indicado na Figura 1 (B), a temperatura ótima de atividade proteolítica

foi de 40 °C, com decréscimo de atividade nas temperaturas subsequentes, enquanto que

em 70 °C e 80 °C ocorreram perdas de 63,3 % e 60,5 %, respectivamente. Dados

semelhantes foram obtidos por Fonseca et al. (2014) e Kirsch et al. (2013) nos trabalhos

realizados com extratos dos basidiomas de P. ostreatoroseus e outros cogumelos

comestíveis.

Em relação à importância das proteases ácidas, pesquisas mostram que a maior

significância está associada à propriedade coagulante das proteínas do leite (caseínas),

processo evidenciado mundialmente e que tem contribuído para substituição da quimosina

animal pelas proteases microbianas por questões dos direitos dos animais. Espécies de

Mucor, Rhizopus, Aspergillus e Penicillium são reportadas como fonte dessas proteases

(Daboor et al., 2010).

Figura 1- Efeito do pH (A) e da temperatura (B) na atividade proteolítica de P.

ostreatoroseus

0

50

100

150

200

250

300

350

5 6 7 8 9 10

Ati

vid

ade

pro

teolí

tica

(U

/mL

)

pH

0

50

100

150

200

250

300

350

400

20 30 40 50 60 70 80

Ati

vid

ade

Pro

teolí

tica

(U

/mL

)

Temperatura C°

A B

13

Conclusões

O extrato P. ostreatoroseus obtido da mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de

proteases com atividade catalítica significativa em pH 5 a 40˚C.

Este estudo sugere a possibilidade do uso de P. ostreatoroseus obtido da mistura de

água e álcool como fonte de proteases para aplicação industrial com extrato orgânico.

Referências

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14



Crescimento de bactérias isoladas de queijos e iogurtes em meio contendo

lactose.

Minelli-Oliveira C.1, Brito L.L.

1, Menezes N.C.

2, Cáuper F.R.M.

3, Clement C.R.

4, Oliveira

L.A.4

1PPG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas,

2Mestre em Agricultura no Trópico

Úmido, INPA, 3Universidade Paulista, UNIP,

4Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia. E-mails: [email protected], [email protected],

[email protected], [email protected], [email protected],

[email protected]

Resumo

A lactose está presente em diversos tipos de leite, e todos os mamíferos, inclusive o

ser humano, nascendo em condições normais, estão aptos a digerir este açúcar. Porém,

entre 5% das pessoas no norte da Europa e 90% em alguns países asiáticos sofre de algum

grau de intolerância à lactose, uma inabilidade para digerir completamente esse

dissacarídeo. O tratamento da intolerância à lactose consiste na retirada ou diminuição

desse componente da dieta. A utilização de microrganismos não patogênicos ou suas

enzimas capazes de degradar a lactose pode ser uma alternativa para pessoas com

intolerância à lactose consumirem uma maior quantidade de alimentos sem a preocupação

com essa substância. Este trabalho teve como objetivo estudar o crescimento de 12

bactérias isoladas de queijos e iogurtes vendidos no município de Manaus, em meio

contendo lactose com contagem de células em câmara de Neubauer nos tempos de inóculo

e, 4, 8, 12, 24 e 28 horas de incubação a 37°C. As bactérias BLG01, BLG25, BLG28,

BLG38 e BLG45 esporularam e apresentaram concentrações de células bem abaixo das

demais, sugerindo que a composição do meio não favorece os seus crescimentos. As

bactérias esporulantes BLG06 e BLG33 apresentaram elevadas concentrações de esporos,

sendo necessários mais estudos para identificar os fatores que induzem a essa modificação

morfo-fisiológica. Cinco das bactérias não esporularam nas condições ambientais, com a

BLG52 apresentando dificuldade para crescer no meio nas condições experimentais,

enquanto que as BLG02, BLG16 e BLG56 mostraram crescimentos medianos. Por

apresentar elevado crescimento sem esporular, a bactéria BLG73 é a que apresenta maior

potencial como degradadora de lactose, merecendo ser melhor estudada visando ser usada

na produção de algum bioproduto capaz de minimizar a intolerância á lactose encontrada

na população humana.

Palavras-chave: Metabolismo microbiano, microbiota de queijos, Biotecnologia.

Introdução

A intolerância à lactose é uma anormalidade digestiva que causa problemas de

saúde em uma parte da população mundial. Entre 5% das pessoas do norte da Europa e

90% em alguns países asiáticos sofrem dessa intolerância (Wikipédia, 2015), que é uma



15

inabilidade para digerir completamente esse dissacarídeo predominante no leite (Téo,

2002). A intolerância à lactose pode ser classificada como primária, quando há um defeito

intrínseco da enzima, ou secundária, quando ocorre um dano na mucosa intestinal com

consequente falta da mesma. Algumas causas do distúrbio primário são: deficiência de

lactase do prematuro, deficiência de lactase congênita e deficiência de lactase do tipo

adulto. O distúrbio secundário pode ter como causas: doença celíaca, fibrose cística,

alergia à proteína heteróloga, desnutrição, retocolite ulcerativa, síndrome do cólon irritável,

giardíase, utilização de alguns medicamentos com efeitos colaterais, entre outras situações

indesejáveis (Sabra e Wills, 1994; Téo, 2002). A lactose não digerida, conforme passa pelo

cólon, é fermentada por colônias de bactérias, havendo produção de ácidos orgânicos de

cadeia curta e gases (Téo, 2002). Isto resulta em diversos sinais e sintomas clínicos, como

diarreia acompanhada de desidratação, principalmente nas crianças de baixa idade,

evacuação explosiva logo após a ingestão do alimento, assadura perianal, distensão e dor

abdominal, flatulência, desnutrição, acidose metabólica e enterite necrosante (Sabra e

Wills, 1994; Moriwaki e Matioli, 2000; Téo, 2002; Lopes et al. 2008).

Diversas pesquisas têm mostrado que microrganismos encontrados na cavidade

bucal e nos intestinos apresentam habilidade de degradar esse componente do leite (Di

Cagno et al., 2001; Montalto et al., 2006; Fujimura et al. 2010; Rowat et al., 2010;

Fernandez-Feo et al. 2013). Em derivados do leite, como nos queijos e iogurtes, também

foram encontradas diversas bactérias com essa capacidade (Heller, 2001; Gobbetti, 2005;

Masotti et al., 2013), criando perspectivas de se obterem, através de isolamentos, novos

gêneros e espécies de bactérias presentes nas populações humanas de todas as regiões do

planeta com capacidade de solucionarem ou minimizarem os problema de saúde devido a

intolerância a lactose.

A utilização de microrganismos não patogênicos capazes de degradar a lactose

pode ser uma alternativa para pessoas que possuem essa intolerância em consumirem uma

maior quantidade de alimentos sem a necessidade de preocupação com essa substância.

Essa utilização pode ser: a) pelas suas ingestões no trato digestivo (digestório), caso eles

sejam compatíveis e possam fazer parte da flora intestinal; b) usando suas enzimas como

um complemento medicamentoso, junto com a alimentação; c) usando suas enzimas na

área industrial para degradarem a lactose presente em alimentos antes que sejam digeridos

pelos seres humanos. Esse trabalho teve como objetivo, avaliar o crescimento de 12

bactérias isoladas de queijos e iogurtes em um meio de cultura contendo lactose como

fonte de carbono.

16

Material e Métodos

Foram escolhidas 12 bactérias Gram negativas isoladas de queijos e iogurtes em

testes anteriores denominadas Bactéria Lactose e Glúten (BLG).

Um volume de 50 mL de meio contendo lactose (1%) foi adicionado em

erlenmeyers com capacidade de 125 mL e esterilizados a 120ºC por 40 min. Após o

esfriamento, cada um dos microrganismos (concentração inicial de 105 células bacterianas

mL-1

) foi inoculado e colocado em agitador constante sob uma temperatura de 37°C.

Uma alíquota de 1 mL do caldo foi retirada no exato momento da inoculação (0), 4,

8, 12, 24 e 28 horas de crescimento. Foi feita a contagem de células pela câmara de

Neubauer. Todas as análises foram feitas com 4 repetições.


Na tabela 1 consta o numero de células das bactérias que cresceram no meio líquido

contendo lactose como fonte de carbono na câmara de Neubauer após diferentes tempos de

incubação. Todas as 12 bactérias são bastonetes Gram negativos, mas as BLG01, BLG05,

BLG25, BLG28, BLG33, BLG38 e BLG45 se converteram em esporos, sendo que essa

transformação celular ocorreu na BLG28 em 12 horas de crescimento e nas demais, após

24 horas de incubação a 37°C.

Apesar de inicialmente apresentarem a mesma concentração de células por mL

(1x105 bactérias), após 4 horas de crescimento observou-se uma diferença de crescimento

entre as 12 bactérias, com a BLG02 se sobrepondo às demais. Após essa alta taxa de

crescimento inicial, essa bactéria apresentou um crescimento mais equilibrado até às 24

horas de incubação, com sua densidade dobrando a cada período de avaliação,

estabilizando-se após esse tempo de incubação.

Diferenças de crescimento entre microrganismos são bastante conhecidas na

literatura, sendo provenientes das suas adaptações às condições de nutrientes, elementos

químicos, temperaturas, pHs, entre outros fatores (Ferreira e Lund 1987; Mossel et al.,

1995; Higgins e Dworkin, 2012; Vieira e Fernandes, 2012).

Sete das 12 bactérias produziram esporos ao longo do tempo de crescimento no

meio contendo lactose, mostrando certa dificuldade em usarem a lactose ao longo do

tempo. A formação de esporos varia com o tipo de microrganismo e as condições

ambientais em que se encontram. Segundo Higgins e Dworkin (2012), a formação de

esporos em Bacillus subtilis é uma resposta à limitação de nutrientes no meio de cultura.

17

Esse comportamento pode ser observado nas bactérias BLG01, BLG25, BLG28, BLG38 e

BLG45, cujas concentrações de células até o final foram abaixo das demais e que

esporularam 12 ou 24 horas após o início da inoculação no meio de cultura. Esse

comportamento sugere que a constituição do meio pode limitar os seus crescimentos e que

em um determinado momento, essa limitação se intensificou, provocando a mudança

morfo-fisiológica para esporos como uma estratégia de sobrevivência quando as condições

ambientais não são mais favoráveis para elas.

Tabela1. Crescimento das células bacterianas pela contagem por câmara de Neubauer

Bactérias

INPA

Horas

Tipo de célula 0 4 8 12 24 28

Número de células bacterianas (105 /mL)

BLG01 1 26 156 118 268 242 Esporos 24hs

BLG02 1 232 526 938 2038 2054 Bastonetes

BLG06 1 29 184 716 6412 6956 Esporos 24hs

BLG16 1 51 307 587 1046 1041 Bastonetes

BLG25 1 41 187 216 514 512 Esporos 24hs

BLG28 1 42 316 574 550 654 Esporos 12hs

BLG33 1 15 502 3913 5919 5538 Esporos 24hs

BLG38 1 86 312 328 291 995 Esporos 24hs

BLG45 1 36 172 369 454 529 Esporos 24hs

BLG52 1 19 82 138 891 641 Bastonetes

BLG56 1 55 312 659 1306 1297 Bastonetes

BLG73 1 20 309 762 4475 4538 Bastonetes

Esse comportamento, no entanto, não foi observado nas bacterias esporulantes

BLG06 e BLG33, que apresentaram elevadas concentrações nos tempos de 24 e 28 horas

de crescimento, mas nesses casos, os números mostrados na tabela 1 refletem a

concentração de esporos no meio de cultura e não o de bastonetes. Outro detalhe observado

nessa tabela é que apenas a bactéria BLG02 esporulou aos 12 dias de crescimento,

18

sugerindo que ela foi precocemente afetada pelas condições do meio de cultura nas

condições ambientais em que foi realizado o experimento.

As demais bactérias estudadas não esporularam durante o período experimental,

evidenciando um metabolismo e fisiologia diferente. Pode ser que em outras situações

algumas delas esporulem, mas isso não aconteceu nas condições experimentais em que

foram avaliadas.

Pode-se dividir as bactérias que não esporularam em três grupos, com base nas suas

concentrações de células nas condições experimentais. Dentre essas, a bactéria BLG52

apresentou dificuldade para crescer no meio, com uma concentração baixa de células,

sugerindo certa dificuldade em degradar a lactose e usá-la para seu crescimento, enquanto

que BLG02, BLG16 e BLG56 tiveram crescimento mediano, cujas populações variaram

entre 1041x105 e 2054x10

5 células mL

-1. A bactéria BLG73, por outro lado, se destacou

com maior crescimento, mostrando-se a com maior potencial para degradar a lactose e

usá-la como fonte de carbono.

Conclusões

As bactérias BLG01, BLG25, BLG28, BLG38 e BLG45 esporularam e

apresentaram concentrações de células bem abaixo das demais, sugerindo que a

composição do meio não favorece os seus crescimentos.

As bactérias esporulantes BLG06 e BLG33 apresentaram elevadas concentrações

de esporos, sendo necessários mais estudos para identificar os fatores que induzem a essa

modificação morfo-fisiológica.

Cinco das bactérias não esporularam nas condições ambientais, com a BLG52

apresentando dificuldade para crescer no meio nas condições experimentais, enquanto que

as BLG02, BLG16 e BLG56 mostraram crescimentos medianos.

Por apresentar elevado crescimento sem esporular, a bactéria BLG73 é a que

apresenta maior potencial como degradadora de lactose, merecendo ser melhor estudada

visando ser usada na produção de algum bioproduto capaz de minimizar a intolerância á

lactose encontrada na população humana.

Agradecimentos

Ao INPA, UFAM, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro para

a realização da pesquisa.

19

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Universidade Federal de Santa Maria, 100 p.

21



Ocorrência de Salmonella spp. em amostras de queijos comercializados

em feiras na cidade de Manaus, AM.

Nunes C.O.1, Souza F.S.

2

1PG em Microbiologia Geral, Escola Superior Batista do Amazonas,

2Doutor em Ciências

Veterinárias, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. E-mails: [email protected],

[email protected]

Resumo

A causa mais comum de doenças transmissíveis por alimento é a contaminação

microbiana, sendo na maioria das vezes, as bactérias com certo destaque para o gênero

Salmonella principalmente em alimentos como o queijo. A contaminação ocorre tanto pela

falta de conhecimento e por negligência do manipulador de alimentos, quanto pela

inadequação do espaço de trabalho e dos locais de armazenamento e, ainda por deficiências

na higienização de equipamentos bem como pela higiene pessoal. O objetivo da pesquisa

foi verificar a presença de Salmonella sp. em queijos comercializados em feiras. Durante o

período de março a abril de 2015 foram coletadas 48 amostras de queijos (de coalho, de

manteiga e mussarela) comercializados em 12 feiras do tipo livres e fixas nas diferentes

zonas da cidade de Manaus. As amostras dos queijos foram analisadas qualitativamente

para a presença de Salmonella spp. em 25g de queijo. Os resultados mostraram que

96,87% dos queijos comercializados não possuíam selo de inspeção oficial de produto de

origem animal e das 48 amostras de queijos examinadas, 37 (77,08%) apresentaram

Salmonella spp. Portanto, a maioria dos queijos comercializados nas feiras pode ser

imprópria para o consumo humano.

Palavras-chave: Risco, Contaminação, Saúde pública, Microbiologia, Bactéria.

Introdução

A tradição do consumo de queijo artesanal é bastante relevante em algumas regiões

do Brasil; na cidade de Manaus existe uma cultura em caracterizar os queijos artesanais

frescos como mais saborosos, sendo os mais consumidos em tapiocas e pães.

Embora haja legislação que dispõe sobre o Regulamento Técnico de Identidade e

Qualidade de Queijos, e nela estabeleça que o leite a ser processado e comercializado deva

ser pasteurizado, ainda existem municípios do Estado do Amazonas produtores de leite

com produção de queijo de forma artesanal utilizando leite cru (sem pasteurização) e

manipulado inadequadamente e improvisado.

22

A comercialização destes produtos na cidade de Manaus consiste na principal renda

dos produtores rurais de municípios como Iranduba e Autazes; entretanto, o queijo

fabricado de forma artesanal está sujeito a fontes de contaminações microbiológicas.

Apesar da comercialização de queijos artesanais sem selo de inspeção oficial de

produtos de origem animal ser legalmente proibida no Brasil, a sua venda ocorre de

clandestinamente.

Atualmente, Salmonella spp. é um dos microrganismos mais frequentes no

envolvimento em casos e surtos de doenças de origem alimentar em diversos países,

inclusive no Brasil. Neste país, um levantamento indicou que S. typhimurium, S. agona, S.

anatum e S. oranienburg são os quatro sorotipos mais frequentes encontrados no homem,

em alimentos e amostras ambientais (Yamaguchi et al., 2013).

Sendo assim, o presente trabalho teve o objetivo de verificar em feiras livres e fixas

da cidade de Manaus a qualidade microbiológica dos queijos quanto à presença de

Salmonella spp.

Material e Métodos

No período de março a abril de 2015 foram coletadas 48 amostras de queijos

comercializados nos boxes de 12 feiras (livres e fixas) nas diferentes zonas administrativas

de Manaus: duas Feiras livres (Feira Volante Prefeito sendo uma localizada no bairro

Aparecida e a outra na Feirinha do Parque 10) e, dez Feiras fixas (Feira Municipal do

Santo Antônio, Feira Modelo da Compensa, Feira Coberta da Alvorada I, Feira do Mutirão,

Feira da União Jorge Teixeira 4° etapa, Feira da Bola do Produtor, Feira da Banana, Feira

Comunitária do Aripuanã, Feira do 10 - Novo Israel, Feira do Manoa).

Foram coletadas 32 amostras de queijos tipo artesanal coalho bovino, 11 amostras

do artesanal manteiga bovino, três de artesanal mussarela búfala, uma de artesanal

pasteurizado bovino e uma de industrial coalho bovino com selo de inspeção estadual. As

amostras dos queijos de 32 boxes foram armazenadas em sacos plásticos transparentes

comuns, os mesmos utilizados pelos feirantes manipuladores ao comercializarem o

produto, e identificadas por tipo de queijo, data e local de coleta (Tabela 1).

23

Tabela 1. Amostras de diferentes tipos de queijos em feiras de diferentes zonas da cidade

de Manaus, AM.

AMOSTRA FEIRA ZONA DA

CIDADE BOXE TIPO DE QUEIJO

DATA DA

COLETA 1 Modelo da Compensa Oeste 01 Mussarela 20.03.15

2 Modelo da Compensa Oeste 01 Coalho-SIE 20.03.15

3 Modelo da Compensa Oeste 01 Coalho 20.03.15

4 Modelo da Compensa Oeste 02 Coalho 20.03.15

5 Municipal do Santo Antônio Oeste 01 Coalho 20.03.15

6 Municipal do Santo Antônio Oeste 02 Coalho 20.03.15

7 Bola do Produtor Leste 01 Coalho 20.03.15





12 Mutirão Leste 01 Coalho 20.03.15

13 Mutirão Leste 02 Coalho 20.03.15

14 Mutirão Leste 02 Manteiga 20.03.15

15 União Jorge Teixeira 4 etapa Leste 01 Coalho 20.03.15

16 União Jorge Teixeira 4 etapa Leste 01 Manteiga 20.03.15

17 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Coalho 14.04.15

18 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Manteiga 14.04.15

19 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Mussarela 14.04.15

20 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Coalho Pausterizado 14.04.15










30 Coberta do Alvorada 1 Centro-Oeste 01 Coalho 17.04.15

31 Coberta do Alvorada 1 Centro-Oeste 02 Coalho 17.04.15

32 Municipal da Banana Sul 01 Coaho 17.04.15

33 Municipal da Banana Sul 02 Coalho 17.04.15

34 Municipal da Banana Sul 02 Manteiga 17.04.15






40 Municipal da Banana Sul 05 Mussarela 17.04.15



43 Manoa - Hiper varejão do Peu Norte 01 Coalho 20.04.15

44 Comunitária do Aripuanã Norte 01 Coalho 20.04.15

45 Do 10 – Novo Israel Norte 01 Coalho 20.04.15

46 Do 10 – Novo Israel Norte 02 Coalho 20.04.15

47 Feirinha do Parque 10 Centro-Sul 01 Coalho 24.04.15

48 Feirinha do Parque 10 Centro-Sul 02 Coalho 24.04.15

Para o transporte das amostras ao laboratório foi utilizada caixa isotérmica. Foi

utilizado uma cabine fluxo laminar da marca Opti-mair modelo ESCO, onde foram

realizadas as análises sensoriais e comparados de acordo com Instrução Normativa (IN) Nº

30 de 26 de junho de 2001 (Brasil, 2001) para queijos tipo coalho e manteiga e a IN Nº 68

de 12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006) para queijo mussarela.

O controle de qualidade em queijos é de grande relevância para contribuição nos

padrões sensoriais e microbiológicos nos alimentos de origem animal. Portanto, a referida

pesquisa foi baseada em legislações como Instrução Normativa Nº 30 (Brasil, 2001),

Instrução Normativa N° 68 de 12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006), Código Sanitário de

24

Manaus formado pela Lei 392/97 de 27/06/97 e 3910/97 decreto (Manaus, 1997),

Resolução RDC nº 12, de 02/01/01 Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos

(Brasil, 2001) e Lei Municipal N° 123 DE 25/ 11/ 2004 referente à Organização e o

Funcionamento dos Mercados e Feiras no Município de Manaus (Manaus, 2004).

Também foi realizado o isolamento de Salmonella spp. de acordo com Hirsh e Zee

(2012), Koneman et al. (2012) e IN 62 de 26 de agosto de 2003 (Brasil, 2003) (método

analíticos para analise microbiológica de P.O.A e água) pela qual 25g de amostra de cada

queijo foi adicionada em 225mL no enriquecimento não seletivo água peptona tamponada

0,1% por 24h a 36ºC em estufa bacteriológica marca Odontobras modelo E.C.B 1.2 digital.

Posteriormente, foram pipetados 1mL (pipeta automática de volume fixo 1000µL, marca

Kacil) e transferidos para tubos de ensaio contendo 9mL meio de enriquecimento seletivo

caldo Rappaport Vassiliadis Soja (RVS) por 48h a 42ºC em estufa bacteriológica marca

Odontobras modelo E.C.B 1.2 digital. Utilizando um swab esterelizado da marca Absorve,

o material foi semeado em triplicata contendo meio ágar Salmonella-Shigella (SS) em

placas de Petri usando a técnica do estriamento, foram levados a estufa bacteriológica

marca Odontobras modelo E.C.B 1.2 digital por 20h a 42ºC.

Como determina a Resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, a pesquisa de

Salmonella spp. foi realizada de forma qualitativa, da presença ou ausência do

microrganismo em 25g de alimento.


Das 48 amostras de queijos examinadas, 37 (77,08%) apresentaram Salmonella spp.

Segundo manual Himedia, o crescimento de espécies de S. sorotipo Typhimurium, S.

sorotipo Typhi e S. sorotipo Enteritidis não é inibido, e as colônias aparecem incolores com

o centro negro (Figuras 1 a 5).

De acordo com Hirsh e Zee (2012), as salmonelas aparecem como colônias não

fermentadoras de lactose no meio contendo lactose e como a maioria das cepas produzem

H2S, as colônias em meio contendo ferro produzem um centro negro.

Existem poucas pesquisas publicadas quanto à qualidade microbiológica de queijos

fabricados e comercializados em Manaus. Ramos e Costa (2003) encontraram Listeria spp.

em queijo coalho, comprovando haver risco de transmissão de enfermidades pelo consumo

do referido alimento, não sendo observados outros microrganismos nas mesmas amostras.

Em pesquisas envolvendo surtos por doenças transmitidas por alimentos em Manaus, AM

entre os anos de 2005 e 2009 observou-se, por exemplo, problemas microbiológicos com

25

queijo coalho (Ruwer et al., 2011) assim como a falta de estudos microbiológicos nos

queijos comercializados na cidade e sua relevância para saúde pública.

Figura 1 – Amostras de 1 a 16 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C,

apresentaram coloração incolor com centro preto, total de onze amostras.

Figura 2 –Amostras de 17 a 29 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C,

apresentaram coloração incolor com centro preto, total de treze amostras.

26


apresentaram coloração incolor com centro preto, as amostras de número 30, 31, 33, 34,

35, 38, 39 e 40.


apresentaram coloração incolor com centro preto, as amostras números 43, 44 e 45.

Figura 5 –Amostras de 47 e 48 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C, ambas

apresentaram coloração incolor com centro preto.

27

Deve ser enfatizado que grande parte da população não consegue perceber que a

compra de queijos sem selo de inspeção sanitária pode trazer consequências negativas à

saúde uma vez que os alimentos contaminados aparentemente são normais, com pouca ou

sem alterações sensoriais no que se refere ao odor e sabor.

As amostras coletadas de queijos de números 2, 5, 7, 11, 12, 32, 36, 37, 41, 42 e 46,

que representam (22,91%), não tinham Salmonella spp.. Estas amostras são oriundas de

seis das doze feiras inspecionadas (Feira Modelo da Compensa; Feira Municipal do Santo

Antônio; Feira da Bola do Produtor; Feira do Mutirão; Feira Municipal da Banana e Feira

do 10-Novo Israel).

Com relação às características sensoriais, de acordo com as Instruções Normativas

com relação ao requisito olhaduras, as amostras (5, 32, 36, 41 e 46) apresentaram-se com

muitas olhaduras, já as amostras (7, 11, 32) são de odor ácido a ácido forte, já a amostra

número 46 apresentou uma textura quebradiça. Somente quatro amostras (8,34%) de

número 2 (queijo de coalho- SIE), 12 (queijo de coalho), 37 (queijo de manteiga) e 42

(queijo de manteiga) estão dentro das normas que envolvem características sensoriais e

análise qualitativa aceitáveis para Salmonella, sendo um queijo com o selo ou identificação

do serviço de inspeção produto de origem animal SIE (Serviço de Inspeção Estadual).

O queijo artesanal comercializado em feiras na cidade de Manaus, AM, apresenta

grande ocorrência (77,08%) de Salmonella spp. Em termos qualitativos, a presença de

Salmonella spp. assemelhou-se com outros achados como os realizados por Feitosa et al.

(2003) no nordeste brasileiro, onde afirmaram que Salmonella sp. foi detectada em 9% das

amostras de queijo de coalho e em 15% das de queijo de manteiga no Rio Grande do

Norte. Já Duarte et al. (2005) detectaram Salmonella sp. em 5,5% das amostras analisadas

no Estado de Pernambuco, demonstrando que o consumo deste tipo de queijo poderia

representar risco à saúde da população, já que este é um alimento típico e acessível à

maioria das classes sociais.

Dados qualitativos semelhantes também foram encontrados em estudos realizados

por Pinto (1996), Florentino e Martins (1999) e Nassu (2000), os quais, em suas pesquisas,

encontraram Salmonella sp. em queijos de coalho e manteiga produzidos em diferentes

locais no Brasil.

Segundo o Departamento de Vigilância Epidemiológica e Ambiental do município

de Manaus, AM, na distribuição da frequência e percentual de agente etiológico por surtos

12

42 41 37

32 36

46

28

de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA), durante período de 2005-2009,

Salmonella foi uma das bactérias patogênicas encontrada no estudo de Ruwer et al. (2011).

Dados do Ministério da Saúde, setor de Vigilância Epidemiológica, apuraram no

período de 1999 a 2008, que os agentes etiológicos mais frequentes em surtos de DTA no

Brasil foram Salmonella sp. (42,9%) e Staphylococcus sp. (20,2%) (Ruwer et al., 2011),

concordando com os presentes dados.

Conclusões

As amostras de queijos oriundas das doze feiras de diferentes zonas administrativas

da cidade de Manaus, não apresentam segurança alimentar, pois 37 amostras (77,08%)

estavam com Salmonella spp. (S. typhimutium, S. typhi ou S. enteritidis).

Nas condições observadas, os queijos artesanais tipo coalho, manteiga e mussarela

de 47 amostras coletadas seriam classificados como impróprios para o consumo humano,

por não possuírem validação de serviço de inspeção oficial.

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30



Crescimento micelial e atividade enzimática qualitativa de macromicetos

amazônicos em meio de cultivo à base de casca de tucumã (Astrocarium

aculeatum Meyer)

Reis, D. M.¹, Nunes A. S.², Pedreno G. Y. O.³, Galúcio V. C. A.

4, Sales-Campos C.

5.

1Universidade do Estado do Amazonas,

2Univeridade Federal do Amazozas,

3Pesquisador, Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected],

[email protected], [email protected], [email protected]

Resumo

O aproveitamento de resíduos da agroindústria tem recebido destaque devido ser fonte rica

em nutrientes, podendo ser aplicados em processos biotecnológicos com fungos.

Assim,utilizou-se farinha da casca do tucumã para o crescimento de fungos basidiomicetos

e avaliou-se sua capacidade proteolítica. Os fungos CESP-03 e CEP-45foram incubados a

30°C durante 8 dias em meio semi-sólido à base de farinha da casca de tucumãe seu

crescimento mensurado diariamente. O delineamento foi inteiramente casualizado com

quatro repetições. Para detecção da atividade qualitativa proteolítica foi utilizado meio

agar-gelatina-leite, sendo mensurado o halo incolor ao redor da colônia. Ao nível de 5% de

significância foi observada diferença estatística entre o crescimento micelial com farinha

de tucumã e seu controle. Ambos os fungos estudados não apresentaram atividade de

fenoloxidase através do teste utilizado. Quanto à atividade proteolítica, os dois fungos

apresentaram halo incolor, porém não foi observada diferença estatística. Portanto, a

farinha da casca de tucumã influenciou positivamente no crescimento dos fungos,

apresentando potencial para enriquecimento de meios de cultura, bem como os fungos

basidiomicetos estudados apresentaram potencial qualitativo quanto à produção de

proteases.

Palavras-chave: Aproveitamento de resíduos, protease, fenoloxidase, fungos

basidiomicetos

Introdução

Nas últimas décadas há uma crescente busca pela utilização de resíduos

agroindustriais, devido a incessante demanda das atividades agrícolas. O acúmulo destes

resíduos gera poluição do meio ambiente e perda de recursos, com contribuição

significante para o problema da reciclagem e conservação da biomassa, pois são substratos

persistentes no meio ambiente.






31

Dentre os principais resíduos gerados pela agroindústria destacam-se o bagaço de

cana-de-açúcar, bagaço de laranja, casca de arroz, farelo de soja, serragem de madeira,

casca do tucumã, entre outros. Desta forma, aminimização dos impactos ambientais

causados pelo homem utilizando estratégias ambientais sustentáveis como forma de

diferenciação e agregação de valor tem se tornado o objetivo de diversas organizações

(Dias, 2009).

Com a grande quantidade de resíduos descartadas no meio ambiente, processos

biotecnológicos procuram métodos para a utilização dos mesmos (Bernabé-Gonzáles et al.,

2006; Nyochembeng et al., 2008, Sales-Campos, 2008). A possibilidade de aproveitamento

dos resíduos agroindustriais no setor biotecnológico pode ser feita através da utilização dos

próprios, para fins enzimáticos, no setor farmacêutico e na bioconversão de produtos de

valor agregado, entre outros.Várias pesquisas neste âmbito indicam o uso de diversos

resíduos para produção de enzimas por microrganismos (entre eles fungos que produzem

enzimas extracelulares) como fontes de carbono e nitrogênio.

As enzimas fúngicas tem se mostrado úteis na degradação de uma variedade de

persistentes poluentes ambientais. O gupo Basidiomiceto apresenta grande potencial

enzimático no que se refere à capacidade degradadora, cuja classificação é baseada nas

diferenças dos padrões de degradação da madeira que estes apresentam, sendo levada em

consideraçãoa característica macroscópica da degradação. Fungos da decomposição branca

são bastante conhecidos pelas habilidades de produzir enzimas extracelulares oxidativas

que iniciam o processo de despolimerização ligninolítica. Esta capacidade permite a sua

aplicação em uma série de processos biotecnológicos, baseados na degradação das

estruturas de diversos compostos aromáticos (Mielgo et al., 2001).

Dentre as enzimas secretadas pelos fungos de podridão branca com maior

interesse econômico, destaca-se as fenoloxidases, que compreendem um conjunto de

enzimas fúngicas ligninolíticas como lacase e manganês peroxidase-MnP (D’Souza et al.,

1999). Estas enzimas são utilizadas principalmente na indústria de biopolpação da madeira,

aproveitamento de resíduos lignocelulósicos para ração animal, degradação de

xenobióticos e biorremediação (Maciel et al., 2010; Valmaseda et al., 1990).

O interesse também é voltado para a produção de proteases, que são capazes de

hidrolisar proteínas com consequente modificação das propriedades físicas, químicas e

biológicas originais, sendo a proteólise essencial para todos os organismos e envolvida em

diferentes processos fisiológicos (Sabotic et al., 2007). A característica de ação da protease

pode variar em função de sua origem e estrutura química. A diversidade aliada à ação

32

hidrolitica altamente especifica e a capacidade de síntese das proteases encontradas na

natureza têm estimulado cada vez mais a procura por enzimas proteolíticas para a

aplicação biotecnológica. São enzimas que executam diversas funções nos mais variados

setores, cerca de 60% do mercado mundial de enzimas hidrolíticas corresponde à aplicação

de proteases na indústria (Silva, 2010). As proteases são empregadas na indústriano

tratamento de couro e peles, na formulação de detergentes, na indústria dealimentos, assim

como na panificação, juntamente com as amilases, sendo responsáveis pela hidrólise do

glúten e no processamento de carnes, conservas e peixes (Bom e Pereira, 1999).

No que se refere aos resíduos com potencial para substrato de cultivo fúngico com

objetivo de produção enzimática, a casca de tucumã ganha evidência, especialmente em

Manaus, no Amazonas, poisessa frutatem um consumo tradicional intenso pela população

amazonense e um significante valor financeiro, representando uma atividade econômica

crescente. Apenas sua polpa é utilizada, gerando grandes quantidades de resíduos da casca,

que é desperdiçada sem nenhum aproveitamento (Nunes et al., 2011).

O tucumã é uma fruta de palmeira natural da Amazônia muito conhecida e

apreciada. É uma palmeira grande, podendo atingir até 15 metros de altura, possui um

único tronco grosso e temido por seus espinhos compridos (Costa et al., 2008). Seu fruto é

encontrado em grandes cachos protegido por palmeira espinhosa, colhido ao cair quando

maduro e consumido in natura ou como ingrediente de várias receitas amazonenses.

Estudos científicos demonstram o potencial do tucumã (polpa e casca) como fonte de

potássio, cálcio, selênio e a polpa com teores expressivos de lipídios, logo, um alimento

abundante em energia, assim como fibra alimentar, predominantemente na casca (Yuyama

et al., 2008), demonstrando a viabilidade de sua utilização como substrato em processos

biotecnológicos paraconversão em produtos de valor agregado. Neste contexto, este estudo

teve por finalidade utilizar farinha da casca do tucumã para o crescimento micelial de

fungos basidiomicetos amazônicosdeterioradores de madeira ocorrentes no município de

Parintins-AM, bem como avaliação de sua capacidade proteolítica.

Material e Métodos

Foram selecionados ao acaso carpóforos de dois fungos pertencentes à classe dos

Basidiomicetos degradadores de madeira coletados no interior do município de Parintins-

AM, região do Baixo Amazonas. As amostras foram embaladas em sacos de papel e

transportadas para o Laboratório de Estudos Fúngicos – LabEF, do Centro de Estudos

33

Superiores de Parintins-CESP, com as devidas informações sobre local, data, coletor e tipo

de substrato, onde foi realizado o isolamento para obtenção das culturas puras e posterior

uso nos testes experimentais. As linhagens fúngicas coletadas não foram identificadas a

nível taxonômico, codificadas como CESP-F03 e CESP-F45 (Figura 1), para inoculação

em meio de cultura BDA (Batata, Dextrose, Agar).

Figura 1. Carpóforos dos fungos A) CESP-03 e B) CESP-45.

As amostras dos fungos foram submetidas à assepsia, retirando fragmentos do

basidiocarpo e mergulhando-os em soluções de álcool a 70% com a finalidade de quebrar a

tensão superficial, o hipoclorito de sódio a 20 % para eliminar microrganismos agregados e

água destilada para retirar o excesso das soluções e evitar oxidação, por um período de

3,2,1 minutos em cada solução respectivamente.

O preparo do inoculo foi em meio de cultura BDA (Batata, Dextrose Agar), nas

proporções de 11,7g de Agar BDA e 300 mL de água destilada. As amostras foram

inoculadas em placas de Petri e incubadas em BOD a 30ºC por um período de 5 dias.

O processo de repicagem ocorreu no meio BDA, em ambiente estéril (interior da

Câmara UV), para a obtenção de culturas puras. As placas de Petri foram identificadas,

lacradas com fita plástica (Parafilm “M”). As culturas foram armazenadas em temperatura

de 30ºC, para posterior utilização.

O meio de cultivo utilizado como substrato para o crescimento fúngico foi

composto de matéria prima regional a partir da casca do tucumã (Astrocaryum aculeatum

Meyer). As cascas dos frutos do tucumã foram coletadas na Feira Municipal dos

Produtores do município de Parintins-AM, desidratadas e em seguida trituradas em moinho

de facas, tormando-se desta forma, a farinha da casca de tucumã (MFT). Foram utilizados

3g da farinha de tucumã e 300 mL de água destilada (MFT). Foram realizados também

A B

34

tratamentos com o meio sem suplementação deste resíduo (M1), ambos devidamente

autoclavados.

Para avaliar o crescimento micelial dos fungos, discos de 5mm de diâmetro

previamente miceliados foram transferidos para o centro das placas de Petri e mantidos em

período de incubação durante 08 dias até preenchimento micelial total da placa. A

avaliação do crescimento foi realizada com auxílio de régua milimetrada, realizando-se as

medições nas duas direções perpendiculares diariamente para a obtenção da media geral do

crescimento fúngico. O controle foi realizado em meio contendo apenas Ágar. As placas

foram distribuídas inteiramente ao acaso com quatro repetições para cada tratamento.

Os fungos basidiomicetos estudados foram avaliados quanto a sua capacidade

enzimática proteolítica e oxidativa através de métodos qualitativos. Os experimentos foram

realizados inteiramente ao acaso com quatro repetições para cada tratamento.

A capacidade de distinguir isolados capazes de produzir fenoloxidase foi

determinada pelo teste de Bavendamm (Davidson et al.,1938). O meio de cultura foi

preparado nas proporções: 400 mLdo meio de cultura BDA com 50 mL a menos de água

destilada, que foi esterilizada separadamente em autoclave. Após esterilização e resfriada,

à água acrescentou-se em condições assépticas 2g de ácido tânico e agitou-se até a

homogeinização. Após esse procedimento adicionou-se esta solução ao meio de cultura

BDA levemente morno. Os fragmentos fúngicos previamente miceliados foram inoculados

no centro da placa e distribuídos ao acaso para observação dos aspectos de indicação de

fenoloxidases. Após 24 horas de incubação, realizou-se a avaliação visual quanto à

formação de um halo marrom considerado como reação positiva para produção de

fenoloxidases.

Para a avaliação qualitativa de protease utilizou-se 300ml do meio de Ágar

nutriente, acrescentou-se ao meio 3g de leite em pó desnatado, 3g de gelatina sem sabor

como substrato e agitou-se até a formação da mistura homogênea. Após serem misturados,

os ingredientes foram homogeneizados com água destilada e devidamente autoclavados.Os

fragmentos fúngicos previamente miceliados foram inoculados no centro da placa e as

placas foram distribuídas inteiramente ao acaso para observação dos aspectos de indicação

de protease. Após 24 horas de incubação, a protease foi identificada pela formação de um

halo indicando a degradação da gelatina, através do aparecimento de zonas transparentes

em torno das colônias.

Para a análise estatística dos dados coletados foi usado o software Bioestat 7.0 para

obter os parâmetros descritivos (média, desvio padrão, variância) e correlação entre as

35

variáveis. Para a inferência sobre a relação entre as variáveis a serem mensuradas foi

utilizado o teste ANOVA e para contraste das médias, o Teste de Tukey.


Crescimento em meio suplementado com farinha da casca de tucumã

Estatisticamente ao nível de 5% de significância não foi evidenciada diferença

estatística entre os fungos CESP-03 e CESP-45 em meio de cultivo suplementado com a

farinha da casca do tucumã. Porém quando os fungos são comparados aos seus respectivos

controles são observadas diferenças significantes, ambas ao nível de 95% de probabilidade.

A média observada para o CESP-45 em meio com farinha da casca foi 2,84cm, enquanto

seu controle foi de 1,85cm respectivamente. Para CESP-03 com suplementação de farinha

foi 3,41cm e seu respectivo controle, 1,45cm (Figura 2).

Figura 2. Crescimento dos fungos CESP-45 e CESP-03 em meio suplementado com

farinha da casca de tucumã.

O crescimento micelial em meio suplementado com farinha da casca de tucumã

demonstrou as maiores médias de velocidade de crescimento comparadas aos seus

controles sem acréscimo da farinha, demonstrando que o resíduo testado oferece

substâncias nutricionais que otimizaram o metabolismo fúngico.

Estudos de Yuyama et al. (2005) relatam que o tucumã (polpa e casca) possui fonte

de potássio, cálcio, e selênio e a polpa com teores expressivos de lipídios, assim como fibra

alimentar.Efeito contrário foi observado em estudos de Aguiar e colaboradores (2011), que

relataram não haver diferença entre tratamento e controle para o crescimento do fungo

basidiomiceto Lentinula edodes em meio acrescido de farelo da casca de tucumã

suplementado com farelo de trigo.

Possivelmente a casca do tucumã contém substâncias macromoleculares que foram

utilizadas como fonte de nutrientes, para isto as enzimas hidrolíticas, secretadas pelos

0,00

2,00

4,00

Méd

ia d

e

cresc

imen

to (

cm

)

FUNGOS E CONTROLE

CESP-45

CESP-03

CONTR CESP-45

CONTR CESP-03

36

fungos estudados, hidrolisaram estas macromoléculas e liberaram pequenas moléculas

solúveis que puderam ser utilizadas para o crescimento destes microorganismos.

Vale ressaltar que os requisitos nutricionais de qualquer organismo são

determinados pelo seu metabolismo energético característico e pela sua capacidade

biossintética (Santos, 2009).

Os fungos CESP-03 e CESP-45 não apresentaram nenhuma reação de oxidação

através do teste de Bavedanm. Estudos de Anguiano (2009) e Regina et al. (2009)

demonstraram que o fungo Lentinula edodes apresentou enzimas fenoloxidativas pela

análise quantitativa, mas no estudo qualitativo o resultado é negativo.

É importante destacar que embora não tenha sido detectada atividade enzimática de

alguns fungos, não se pode descartar completamente a sua ausência, pois são vários os

fatores que contribuem para a ativação do sistema lignocelulolítico, como condições

nutricionais e culturais, substrato metabolizável, altos níveis de oxigênio, nitrogênio e

várias outras condições de cultivo (Regina et al., 2009).

Para os testes qualitativos para protease, os dois fungos CESP-03 e CESP-45

exibiram capacidade em degradar o leite desnatado do meio semi-sólido a partir do terceiro

dia de incubação, apresentando halos enzimáticos translúcidos sem a necessidade de

adicionar solução reveladora na superfície do ágar, ou seja, mostrando reação positiva

quanto à competência em produzir proteases. Os índices enzimáticos variaram de 0,35 a

0,5 cm, para os isolados CESP-03 e CESP-45 respectivamente (Figura 3).

Figura 3. Índice enzimático da atividade qualitativa de protease de CESP-03 e CESP-45

respectivamente.

Estes resultados corroboram com estudos de Alves et al. (2002), os quais

verificaram a produção de proteases por diferentes espécies de Mucor spp. cultivadas em

meio sólido durante 96 horas. As colônias apresentaram halos que variaram de 3 a 6,4 cm.

O principal papel das enzimas proteolíticas é nutricional, em que grandes cadeias

0

0,2

0,4

0,6

CESP-03 CESP-45

Ati

vid

ad

e e

nzim

áti

ca

(cm

)

Fungos

CESP-03

CESP-45

37

polipeptídicas são hidrolisadas em pequenas moléculas que a célula possa absorver

(Fedatto, 2004).

Estudos de Campos et al. (2011) com os basidiomicetos Pleorotus ostreatus e

Lentinula edodes também comprovam o aparecimento do halo indicador da presença de

protease variando de 0,42 a 0,26 mm para os fungos acima citados respectivamente. Por

outro lado, os autores também relatam basidiomicetos que não produzem proteases.

É necessário estudos que selecionem uma maior quantidade de fungos

basidiomicetos produtores de proteases, uma vez que, a hidrólise proteica pode liberar

peptídeos bioativos que atuam no metabolismo, em glândulas excretoras, pressão

sanguínea e no desenvolvimento corporal de forma geral (Wang e Mejia, 2005). Além

disso, proteases representam um dos três maiores grupos de enzimas de interesse industrial

e tem ampla aplicação biotecnológica, especialmente na indústria de alimentos, couro,

detergentes e em processos de biorremediação (Raoet al., 1998).

Ao nível de 95% de probabilidade não houve diferença estatística na produção de

protease entre os fungos testados.

Conclusões

A farinha da casca de tucumã influenciou positivamente no crescimento dos fungos,

apresentando potencial para enriquecimento de meios de cultura para os fungos

basidiomicetos estudados.

Os dois fungos estudados apresentaram atividade proteolítica, com destaque para o

fungo CESP-45.

Não foi detectada atividade enzimática oxidativa pelo método utilizado.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio da CAPES, CNPq, FAPEAM, INPA, e UEA

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40



Potencial da levedura Candida humilis inpa1105 para a produção de

proteína unicelular e etanol a partir dos hidrolisados ácidos de resíduos

vegetais Amazônicos

Santos, R.A.¹, Fernandes, F.S.¹ Farias, A.V.¹, Souza, J.V.B.², Souza, É,S.¹

¹PG Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia, Universidade do Estado do Amazonas, ²Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Email: [email protected],

[email protected],[email protected],[email protected]

m.br, [email protected]

Resumo

A hidrólise química da biomassa é uma das séries de tecnologias viáveis desenvolvidas

como um processo de conversão de biomassa em açúcares, esses açúcares podem ser

usados por microrganismos como fonte de energia para produção de etanol e de Single Cell

Protein (SCP) que é uma terminologia utilizada para designar células microbianas

crescidas em substratos orgânicos e posteriormente colhidas como proteína para ser usada

como suplemento alimentar. Diante disso o presente estudo teve por objetivo estudar uma

levedura da espécie Candida humilis INPA1105 para produção de etanol e SCP através dos

hidrolisados ácidos dos resíduos vegetais amazônicos. No bioprocesso submerso foram

utilizados os hidrolisados das cascas de cupuaçu, cascas de tucumã e casca da raiz de

macaxeira. A produção de SCP pela C. humilis INPA1105 foi eficiente no hidrolisado das

cascas do tucumã tendo o máximo de concentração celular de 7,60 células/mL em 72

horas. Já a produção de etanol no caldo de cana a cepa consumiu cerca de 90% do ART

com a produção de 31,0% de etanol. Portanto, entre os hidrolisados analisados, o que teve

mais destaque para produção de biomassa foi o hidrolisado da casca do tucumã e a

levedura apresentou potencial para produção de etanol quando cultivada em caldo de cana-

de-açúcar.

Palavras chave: Proteína unicelular, Etanol, Candida humilis

Introdução

Devido ao grande crescimento populacional e o vasto aumento no uso de fontes de

energias, tanto para o setor automotivo com a utilização de derivados do petróleo, quanto

ao setor alimentício (Silva et al., 2015). E isso tem incentivado a procura por

microrganismos que sejam capazes de atender esta demanda, principalmente com a

produção de bioprodutos de interesse industrial, dentre eles podemos citar os

biocombustíveis e a produção de proteína unicelular (Single cell protein) (Sauer, 2007).

41

O Termo single cell protein (SCP) ou proteína unicelular refere-se à proteína

obtida a partir de um único organismo biológico, podendo ser de fungos, bactérias e algas

(Gabriel et al. 1981; Litchfield, 1983). Dentre os fungos, as leveduras destacam-se por

crescerem em diversos ambientes, se adaptarem em vários substratos, rápido crescimento

celular, alta diversidade biológica, são produtoras de enzimas e outros metabólitos e

possuem em sua estrutura bioquímica, proteínas, lipídeos, carboidratos, vitaminas e sais

minerais, o que viabiliza sua produção, levando a necessidade de buscar substratos

alternativos para o crescimento microbiano e posteriormente a produção de moléculas de

interesse (Kihlberg, 1972).

Para a produção de moléculas de interesse, a hidrolise ácida de resíduos da

agroindústria surge como alternativa para a obtenção de açúcares fermentescíveis e não

fermentescíveis, que podem estar sendo utilizados como fonte de energia para o

crescimento microbiano (Oberoi et al., 2010), pois os resíduos agroindustriais apresentam

alto teor de matéria orgânica e um grande teor de nutrientes necessários para o

desenvolvimento microbiano (Gabriel et al., 1981). Entre esses resíduos para a produção

de SCP destacam-se o bagaço de maçã, bagaço de laranja, cascas de abacaxi (Vendruscolo,

2007; Albuquerque, 2003).

Das leveduras comumente estudadas para a produção de SCP e para a produção

de etanol destacam-se Candida utilis, Candida lipolítica, Candida tropicalis, Candida

novellas, Candida intermedia e Saccharomyces cerevisiae (Bhalla et al., 2007). Além das

leveduras, alguns fungos filamentosos também são estudados para produzir SCP, como

Gongronella butleri (Vendruscolo, 2007) e Rhizopus oligosporus (Albuquerque, 2003).

A fermentação submersa é uma alternativa para a produção de SCP e etanol, pois

proporciona uma melhor disponibilidade de nutrientes ao meio, proporcionando um melhor

desempenho microbiano, gerando assim, maior concentração da biomassa celular e melhor

produção de metabolitos (Suhet e Fioreze, 2011). Diante disso, o presente estudo teve por

objetivo estudar a produção de proteína unicelular e etanol pela Candida humilis INPA

1105 a partir dos hidrolisados ácidos de resíduos vegetais amazônicos.

Material e Métodos

A levedura utilizada foi a Candida humilis INPA1105 e faz parte da coleção

Microbiológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), isolada em 2013 da

manipueira, um efluente oriundo da produção de farinha de mandioca. Também foi

utilizada uma cepa padrão da levedura Saccharomyces cerevisiae Pe-2, cedida pelo

42

Laboratório de Bioprocessos da Universidade Federal do Amazonas. As leveduras foram

reativadas em meio Ágar Sabouraud com extrato de levedura (20 g Agar, 20 peptona, 40 g

dextrose, 250 mg de cloranfenicol, 1000 mL de água destilada) e mantidas à temperatura

de 25 oC.

Os resíduos utilizados nesse estudo foram: cascas de cupuaçu (Theobroma

grandiflorum), casca da raiz de mandioca (Manihot esculenta) e cascas de Tucumã

(Astrocaryum aculeatum), obtidos das feiras abertas da cidade de Manaus.

A hidrólise ácida dos resíduos das feiras foi realizada como descrito por Oberoi

(2011). Resumidamente, em Erlenmeyers de 2000 mL foram colocados 100 g do resíduo

seco e 1000 mL de uma solução de ácido sulfúrico a 2%. Essa foi aquecida à temperatura

de 121 oC a 1,2 atm por 15 min. O hidrolisado obtido teve seu pH corrigido para 5,0 com

hidróxido de sódio, em seguida foi filtrado em carvão mineral ativado e então submetido

ao bioprocesso para produção de biomassa pela levedura C. humilis INPA1105. O

bioprocesso foi realizado em Erlenmeyers de 125 mL, contendo 25 mL do hidrolisado

estéril que foi inoculado com a razão de 1,0x104 cel.mL

-1. A incubação foi realizada à

temperatura ambiente, entre faixa de 25º C e 28º C, em um ambiente climatizado e com

agitação orbital de 100 rpm. Durante as 72 horas de bioprocesso, foram retiradas alíquotas

para avaliar a produção de biomassa (P) e o consumo dos açucares redutores totais (ART)

a cada 24 horas.

O processo para a avaliação do potencial de fermentação por Candida humilis

INPA1105 usando como substrato o caldo de cana-de-açúcar foi realizado em Erlenmeyers

de 250 mL, contendo 100 mL de caldo de cana (12o Brix) e inóculo de 1x10

6 cel.mL

-1. A

incubação foi realizada à temperatura ambiente na faixa de 25º C a 28º C, sendo um

ambiente climatizado e de forma estática. A cada 24 horas, durante 96 horas, foram

retiradas alíquotas para avaliar a produção de etanol (P), biomassa produzida (X) e o

consumo dos açucares redutores totais (ART).

O crescimento celular no bioprocesso para a produção de SCP de S. cerevisiae Pe-

2 e C. humilis INPA 1105 foi realizado a partir de contagem de células em câmara de

Neubauer, para cada microrganismo.

A concentração de açúcares redutores totais (ART) foi determinada pelo método

do ácido 3,5 dinitrossalicílico (DNS) como proposto por Miller (1959).

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e então calculados a média

e o desvio padrão para cada uma das determinações realizadas.

43


A produção de biomassa e o consumo de açúcares redutores totais se encontram

nas figuras abaixo. A Figura 1 apresenta a produção de biomassa e seu consumo de

açúcares redutores totais nos hidrolisados das cascas de macaxeira pela levedura C.humilis

INPA1105 pelo período de 72 horas de bioprocesso em agitação orbital. Durante a

produção de biomassa, houve o consumo de açúcares redutores totais de 26,4 g.L-1

com

aumento na biomassa da levedura de 1,0x104 cél.mL

-1 para 2,71 x10

7 cél.mL

-1.

Figura 1. Produção de biomassa e consumo de açúcares redutores totais (ART)

por C. humilis INPA 1105 no hidrolisado da macaxeira.

A Figura 2 mostra a produção de biomassa e seu consumo de açúcares redutores

totais nos hidrolisados das cascas de tucumã pela levedura C. humilis INPA1105 pelo

período de 72 horas de bioprocesso em agitação orbital. Durante a produção de biomassa,

houve o consumo dos açúcares redutores totais de 2,59 g/L-1

, com aumento na biomassa

celular da levedura de 1,00x 104 para 5,29 x10

7 cel.mL

-1.

4

8

12

16

20

24

28

32

1,00E+04

5,01E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

3,00E+07

0 24 48 72

AR

T(

g/L

)

Bio

mass

a c

el.m

L-1

Horas Biomassa

ART

44

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1,00E+04

5,01E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

3,00E+07

3,50E+07

4,00E+07

4,50E+07

0 24 48 72

AR

T(

g/L

)

Bio

mass

a c

el.m

L-1

Horas Biomassa

ART

Figura 2. Produção de biomassa e consumo de açúcares redutores totais (ART)

por Candida humilis INPA 1105 no hidrolisado da cascas do tucumã.

A Figura 3 apresenta a produção de biomassa e seu consumo de açúcares

redutores totais nos hidrolisados das cascas de cupuaçu pela C.humilis INPA1105 pelo

período de 72 horas de bioprocesso em agitação orbital. Durante a produção de biomassa,

houve o consumo dos açúcares redutores totais de 3,00 g.L-1

, com aumento na biomassa

celular da levedura de 1,00 x104 para 3,57 x10

7 cel.mL

-1.

Figura 3. Produção de biomassa e consumo de açúcares redutores por

C.humilis INPA 1105 no hidrolisado da cascas do Cupuaçú.

Foi possível notar que não houve declínio celular durante as 72 horas de produção

de biomassa, devido o meio de cultivo ainda ter açúcares disponíveis para o crescimento

celular. Râbelo (2011) verificou que o declínio celular da levedura S. cerevisiae ocorreu a

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

1,00E+04

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

5,00E+07

6,00E+07

0 24 48 72

AR

T(

g/L

)

Bio

mass

a c

el.m

L-1

Horas

Biomassa

ART

45

partir de 72 horas de cultivo em meio contendo a Algoroba (Prosopis juliflora). Foi

possível perceber que o crescimento celular no período de 72 horas, se manteve estável em

torno de 3,5.107 cel.mL

-1.

Dentre os hidrolisados, as cascas de tucumã foram mais adequadas para a

produção de biomassa. Segundo Rodrigues (2007), a hidrólise ácida é uma das técnicas

mais eficientes, pois é capaz de recuperar até 90% dos açúcares fermentescíveis dos

resíduos lignocelulósicos, mas uma parte dos açúcares formados durante a hidrólise pode

ser degradados e transformando-se em outros compostos, que muitas vezes são tóxicos

para o metabolismo microbiano.

A Candida humilis INPA1105 apresentou uma produção de biomassa diferente

nos três substratos. Essa diferença se deve principalmente ao fato da disponibilidade inicial

dos açúcares nos hidrolisados. O processo de hidrolise ácida pode resultar em açúcares não

fermentáveis, com a formação de pentoses (xilose e outros), muitas vezes não

metabolizadas pelas leveduras do gênero Saccharomyces. Chandel et al. (2007)

especificam que algumas leveduras do gênero Candida são capazes de assimilar tais

pentoses. Pode ser que a levedura Candida humilis INPA1105 tenha consumido esses

açúcares, explicando que no período de 24 horas houve uma queda drástica na

concentração de açúcares redutores totais. Nesse contexto, as cepas padrões de

Saccharomyces cerevisiae, que são empregadas na indústria para processos fermentativos,

não são capazes de fermentar tais pentoses, tornando o estudo deste microrganismo

atrativo com características para processos biotecnológicos.

Com a finalidade de investigar a produção de etanol por C. humilis INPA1105, foi

realizada uma batelada, avaliando os parâmetros cinéticos. Durante a cinética, a levedura

C. humilis INPA1105 apresentou maior velocidade de remoção de açúcares redutores e de

crescimento celular. Assim como neste estudo, Fugita (2010) obteve no caldo de cana-de-

açúcar, um bom crescimento celular, indicando que as quantidades de açúcares presentes

no caldo eram na maior parte, metabolizadas pelas leveduras.

A Figura 4 apresenta a produção de etanol produzido pelas leveduras Candida

humilis INPA1105 e Saccharomyces cerevisiae Pe-2 pelo período de 96 horas de

bioprocesso. A C.humilis INPA1105 produziu durante as 24 horas, 19,6 % de etanol, sendo

que nas 48, 72 e 96 horas de fermentação o etanol aumentou para 28,4 %, 29,9% e 31,0%.

Durante as 96 horas de fermentação, a levedura C. humilis INPA1105 consumiu 61,9 g/L

de ART, produzindo 31,0 % de etanol, enquanto no mesmo período, a S. cerevisiae Pe-2

teve um consumo de 64,8 g/L de ART, formando 32,3 % de etanol, ou seja, a levedura

46

C.humilis INPA1105 obteve um nível bem próximo na produção de etanol durante o

período da fermentação, tendo uma diferença de 1,40 % de etanol gerado durante as duas

fermentações.

Figura 4. Produção de etanol e consumo de açúcares por C.humilis INPA1105 e S.

cereviasiae Pe-2 a partir do caldo de cana-de-açúcar.

Ao observar o etanol teórico produzido pela levedura C. humilis INPA1105, a

mesma pode ser considerada como uma boa produtora, semelhante ao produzido pela cepa

padrão. O presente trabalho demonstrou que uma levedura isolada de manipueira (C.

humilis INPA1105) foi capaz de apresentar grande crescimento celular utilizando

hidrolisados ácidos como substrato e fermentar caldo de cana para produzir etanol. Para

confirmar a produção de etanol por ambos os microrganismos, o etanol foi destilado e

queimado para comprovação.

Conclusões

A levedura C. humilis INPA1105 produz proteína unicelular usando hidrolisados

ácidos de resíduos vegetais e para a produção de etanol utilizando o caldo de cana de

açúcar.

Dos três resíduos estudados o que apresentou maior potencial para a produção de

biomassa foi o tucumã, com uma concentração de 5,29.107 células.mL

-1 e para produção de

etanol com cerca de 31,0 % a partir do caldo de cana.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

4,0

9,0

14,0

19,0

24,0

29,0

34,0

39,0

44,0

49,0

54,0

59,0

64,0

69,0

0 24 48 72 96

Eta

no

l (%

)

AR

T(g

/L)

Horas

ART (S.cerevisiae Pe-2)

ART(C. humilis INPA1105)

Etanol S.cerevisiae Pe-2

Etanol C.humilis INPA1105

47

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48



Análise microbiológica de resíduos de Musa sp. (bananeira) empregados no

cultivo de fungos comestíveis

Souza J.A.1, Pedreno G. Y. O.

2, Nunes A.S.

3, Galúcio, V.C.A

4; Sales-Campos C.

5

1Graduada em Ciências Biológicas, Universidade do Estado do Amazonas,

2Acadêmica

Universidade do Estado do Amazonas, 3, 4

Doutorandas em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, UFAM,

5 Pesquisadora, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Email:

[email protected]

Resumo

A importância dos cogumelos comestíveis vem crescendo devido ao avanço da tecnologia

de cultivo, que possibilita a utilização de resíduos agropecuários e industriais, a produção

pode ser realizada aproveitando-se resíduos agroindustriais, principalmente por possibilitar

o aproveitamento lignocelulósico comumente desperdiçados. Neste sentido, este trabalho

teve como objetivo a análise microbiológica de resíduos de bananeira (pseudocaule e

engaço) utilizados no cultivo de fungo comestível Lentinula edodes. A linhagem do fungo

foi acessada da Micoteca do laboratório de Fungos Comestíveis do Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia. Foram separados resíduos das cultivares prata-anã e thap maeo,

divididos em dois pares de mesma grandeza e unidade interdependentes e calculada a

porcentagem da umidade perdida na secagem. Foram utilizadas 4 amostras de 10g de cada

resíduo das duas cultivares de Musa para a análise microbiológica. Para o meio de cultivo,

inóculos crescidos em BDA foram transferidos para placas de Petri contendo meio RDA. O

pseudocaule da cultivar thap maeo apresentou menor rendimento (3,6%), mas o seu engaço

apresentou maior rendimento com 18,33% do total de matéria seca extraída. Na análise

microbiológica, em 100% das amostras foram detectados coliformes totais e fecais, bem

como a presença da bactéria Escherichia coli. No crescimento micelial, as médias de

crescimento de L. edodes em meios de cultivo suplementados com farelo de cereais, o

maior crescimento foi no tratamento com engaço thap maeo. O protocolo inicial para

assepsia utilizado não foi suficiente para a inibição dos microrganismos contaminantes,

sendo necessária uma outra esterilização e ajuste no protocolo.

Palavras-Chave: Resíduos agroindustriais, cultivares de bananeira, crescimento micelial,

assepsia.

Introdução

A preservação ambiental tem despertado o interesse por fontes renováveis e os

resíduos agroindustriais tornaram-se uma fonte importante para a produção de novos


49

materiais, de produtos químicos e de energia. O desenvolvimento e implementação de

processos sustentáveis capazes de converter biomassa em vários produtos com valor

agregado é uma necessidade absoluta para aproveitar resíduos agroindustriais e gerar

menor impacto ambiental (Rosa et al., 2011).

Nesse contexto, o Brasil é um dos grandes produtores mundiais de banana, sendo

a terceira fruta mais exportada no Brasil (FAO, 2014), consistindo a região norte na

terceira maior produtora. O Amazonas é o segundo maior produtor da região, ficando atrás

apenas do Estado do Pará (IBGE, 2008).

Após a produção do cacho de banana, uma vez a cada 18 meses de cultivo, grande

parte da bananeira é descartada, deixando-se apenas 50 cm do pseudocaule que servirá de

fonte nutricional aos brotos. O restante da planta é inutilizada (Alves e Oliveira, 1999), o

que gera grande quantidade de resíduos pós-colheita (Coelho et al., 2001). Tanto o

pseudocaule quanto as folhas da bananeira são ricas em fibras lignocelulósicas (Soffner,

2001), o que os tornam substratos propícios ao desenvolvimento de fungos comestíveis.

O avanço na introdução dos cogumelos comestíveis na alimentação ocidental tem

obtido destaque devido às suas características nutricionais e funcionais. No entanto, há a

necessidade de estudos a cerca da matéria-prima utilizada para a formulação de substratos

de cultivo (Cunha et al., 2013). Por outro lado, vale ressaltar que na produção de

alimentos, um fator importante é a qualidade microbiológica desse produto, que permite

avaliá-lo quanto às condições de processamento, armazenamento e distribuição para o

consumo, sua vida útil e quanto ao risco à saúde da população. A geração de resíduos

provenientes da bananicultura gera preocupação não apenas na utilização deste em alguma

formulação, mas também em se conhecer a sua qualidade conforme os parâmetros legais.

Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi a avaliação microbiológica de

resíduos de bananeira (pseudocaule e engaço) utilizados no cultivo de fungo comestível,

como parâmetro para a qualidade do produto de valor agregado (cogumelo) produzido.

Material e Métodos

As duas cultivares de bananeira (prata-anã e thap maeo) e seus respectivos

resíduos (pseudocaule e engaço) foram cedidas por produtores rurais do município de

Parintins/AM.

Os resíduos in natura coletados foram pesados na coleta e após a secagem para

avaliação do percentual de umidade perdida. O pseudocaule e o engaço de bananeira in

natura foram triturados em triturador de resíduos orgânicos Trap 200. O material triturado

50

foi seco ao ar livre em estufa solar, e posteriormente, acondicionados em depósitos

plásticos em sala refrigerada até posterior utilização.

Meios de cultura específicos para cada grupo de microrganismos tanto para

coliformes, Escherichia coli, como para bolores e leveduras, foram utilizados nas análises.

Para as análises microbiológicas, 10g das amostras de resíduos foram transferidas

para 490 mL de água destilada autoclavada para realização da diluição (1:50) preconizada

para amostras sólidas. Desta diluição foram transferidos assepticamente 25 mL para

frascos contendo 225 mL de água peptonada estéril (diluição 10–1

). A partir dessa diluição,

foram feitas as diluições seriadas até 10–3

com o mesmo diluente.

A determinação do número mais provável (NMP.g–1

) de coliformes totais e

termotolerantes foi realizada com a retirada de alíquotas de 1 mL de cada diluição,

inoculadas em séries de três tubos contendo 9 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST),

com tubo de Duhran invertido (teste presuntivo) e incubados a 35°C por 24-48 horas.

Para a confirmação da presença de E. coli, o conteúdo dos tubos contendo caldo

EC que apresentaram turbidez (com ou sem produção de gás no interior do tubo de

Durhan) foram semeadas em placas de Petri contendo ágar eosina azul de metileno (EMB)

e incubadas à 35°C por 24-48 horas para confirmação.

Para a contagem de bolores e leveduras, foi utilizado o método de plaqueamento

direto em superfície das diluições 10–1

e 10–2

, em meio batata dextrose ágar (BDA).

Alíquotas de 100 μL foram semeadas na superfície do BDA e as placas incubadas a 22ºC

por 3 a 5 dias. Os resultados foram expressos pelo número de Unidades Formadoras de

Colônia por grama de material (UFC.g–1

).

A linhagem do fungo Lentinula edodes LED 96/13 foi acessada da Micoteca do

Laboratório de Fungos Comestíveis do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia –

INPA – Procedente da UNESP de Botucatu.

Inóculos da cultura crescido em BDA foram transferidos para placas de Petri

contendo meio resíduo-dextrose-ágar (RDA), preparados conforme Eira e Minhoni (1997)

e Eira et al. (1997), com adaptações de Sales-Campos (2008), para promover adaptação do

micélio do fungo ao substrato de cultivo. Os meios de cultura foram feitos utilizando-se em

base seca, 100g de substrato/L, preparado com 80% de resíduo, 18% farelo de cereais

(mistura de arroz, trigo e milho) e 2% de CaCO3, para ajuste do pH (6,50). Os meios de

cultura contendo os diferentes resíduos foram preparados a partir da infusão de cada

substrato em 1,5L de água fervente durante 30 minutos. Foram filtrados em algodão e

51

completados os volumes para 1L. Após a filtração, foram adicionados a cada meio, 12g de

dextrose e 15g de agar/L. Os meios de cultura foram elaborados a partir do pseudocaule e

do engaço das cultivares prata-anã e thap-maeo, conforme código: PSPA – pseudocaule de

prata-anã, PSTM – pseudocaule de thap-maeo, ENPA – engaço de prata-anã e ENTM –

engaço de thap-maeo.

Para a esterilização dos meios alternativos foi adotado o processo de autolavagem

a 1 atm durante 15 minutos. Em seguida foram vertidos em placas de Petri e inoculados em

com o micélio do fungo crescido em meio BDA e incubadas a 25º C. Ao grupo controle

não foi adicionada a mistura de farelos.

A mensuração do crescimento de L. edodes foi realizada a cada 24 horas até a

colonização total do meio na placa de Petri, através da progressão linear da fronteira micelial,

feita com régua milimetrada na base de cada placa de Petri. As medidas foram mensuradas em

duas direções perpendiculares. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com

fatorial 2x2 (duas cultivares de bananeira e dois tipos de resíduos) com cinco repetições para

cada tratamento. Para análise estatística dos dados foi utilizado o software BioEstat 7.0.

Resultados e discussão

De acordo com os dados da Tabela 1, as duas cultivares de bananeira apresentam

pseudocaule rico em água, refletindo em baixo rendimento da matéria seca. O pseudocaule

da cultivar thap maeo apresentou menor rendimento (3,6%), mas o seu engaço apresentou

maior rendimento com 18,33% do total de matéria seca extraída do resíduo seco. Ao nível

de 5% de significância foram observadas diferenças estatísticas entre o rendimento do

engaço da cultivar thap-maeo e os demais resíduos estudados.

De acordo com Jarman et al. (1997), o pseudocaule da bananeira é constituído de

feixes fibrosos com comprimentos relacionados ao comprimento do pseudocaule e

representa de 1-1, 5% da composição. Os outros constituintes são substâncias

mucilaginosas (4 a 8%) e água (90 a 96%). Além do elevado teor de umidade, Silva (1998)

e Cordeiro et al. (2004) verificaram um elevado teor de extrativos para o pseudocaule de

bananeira: 14,1% de extrativos (em base seca). Kluge et al. (1999) obtiveram uma média

para o peso do engaço de 8% do peso do cacho para o grupo Cavendishii.

52

Tabela 1. Percentuais de umidade e matéria seca de pseudocaules e engaços das cultivares

de bananeira.

Variedades de

bananeira

UMIDADE E MATÉRIA SECA

Peso in natura

(kg)

Peso após

secagem (kg)

Umidade (%) Matéria seca

(%)

Pseudocaule prata-

anã - PSPA

70,27 2,72 96,13 3,87 A

Pseudocaule thap

maeo – PSTM

80,97 2,91 96,40 3,60 A

Engaço de thap

Maeo - ENTM

3,6 0,660 81.67 18,33 B

Engaço de prata-

anã - ENPA

16 1,90 88,12 11,87 C

Obs.: Médias em letras iguais não diferem entre si pelo (teste de Tukey, 1%).

Nas amostras de engaço e pseudocaule das cultivares de bananeira foram

detectadas presença de coliformes totais e termotolerantes (Tabela 2). 90% dos tratamentos

com as diluições seriadas apresentaram indicação de turbidez ou produção de gás no

interior do tubo de Duhran. Em 100% das amostras foram detectados coliformes, tanto do

grupo totais quanto fecais. Nos engaços de Musa sp., a presença de coliformes totais e

termotolerantes foi maior que nos pseudocaules, sendo detectado no engaço de prata-anã,

quantidades >1100 NMP/g e no pseudocaule de prata-anã, 210 NMP/g (Tabela 2).

Tabela 2. Determinação do número mais provável (NMP.g–1) de coliformes e

termotolerantes.

De acordo com a legislação vigente RDC nº 12/2001ª da ANVISA – técnica

utilizada para alimentos, os resíduos estão fora dos padrões exigidos, pois estabelece o

Resíduo Coliformes totais e termotolerantes

(NMP/g)

Pseudocaule de prata-anã 210

Pseudocaulde de thap maeo 27

Engaço de prata-anã >1100

Engaço de thap maeo >1100

53

valor <3,0 NMP/g para a amostra. Porém, vale ressaltar que os resíduos utilizados são

descartes de lavouras, sendo considerado lixo e não possuindo uma legislação especifica

para análise microbiológica.

O número elevado de coliformes pode significar contaminação direta com material

fecal, ou manipulação inadequada, como higiene do manipulador, transporte e

acondicionamento inadequados (Franco e Landgraf, 1996).

Para a confirmação de E. coli, foram observadas as características da coloração da

colônia após semeadura em caldo EC – pigmentação verde metálico indicativo da presença

da bactéria (Figura 1). Essas características foram observadas nos meios elaborados com

engaços das duas cultivares, prata-anã e thap-maeo. Por esse tipo de resíduo

lignocelulósico ser coletado em feiras ou mesmo lixeiras, pode refletir em material

altamente contaminado microbiologicamente com coliformes do grupo termotolerantes.

Figura 1. Presença de E. coli no resíduo do engaço de prata-anã (a) e engaço de thap-maeo

(b).

Para bolores e leveduras, não houve crescimento significativo. Por outro lado,

observaram-se quantidades elevadas de bactérias. Acredita-se que as mesmas inibiram o

crescimento do cogumelo. Microrganismos contaminantes crescem no substrato,

destruindo o micélio, infectando os esporos ou meramente competindo com o cogumelo e

impedindo o seu crescimento em todo o substrato.

Após análise microbiológica procedeu-se com o cultivo do cogumelo comestível L.

edodes utilizando os resíduos das cultivares de bananeira, seguindo o protocolo de assepsia

proposto por Sinoga et al. (2003), observando-se a presença ou ausência de contaminações.

De acordo com as observações, houve contaminações tanto no tratamento quanto

no controle. Possivelmente a esterilização do meio de cultivo realizada em autoclave

(a) (b)

54

durante 15 minutos a 1 atm não foi suficiente para eliminar os microrganismos presentes

nos resíduos, refletindo nos percentuais de contaminações observados na tabela 3.

Tabela 3. Percentuais de contaminação dos meios alternativos elaborados a partir de

resíduos de cultivares de bananeira esterilizados a 1 atm durante 15 minutos em autoclave. Resíduos Tratamento Controle

Pseudocaule de Prata-anã 0% 40%

Pseudocaule de Thap maeo 60% 0%

Engaço de Prata-anã 20% 0%

Engaço de Thap maeo 20% 0%

O tempo de autoclavagem do resíduo é crucial para o êxito do cultivo. Neste processo

que utiliza a temperatura e a pressão para a eliminação de microorganismos indesejados, por

diversas vezes faz-se necessário aumentar o tempo do processo de esterilização para assegurar

a qualidade do cultivo. O tempo de assepsia foi alterado de 15 para 45 minutos para eliminação

de microrganismos contaminantes.

Mazaro (2007) observou em seu trabalho que o tempo de autoclavagem é um fator

determinante no processo de esterilização do substrato, ele elevou o tempo de assepsia para 60

minutos, pois com 30 minutos de autoclavagem não foi suficiente para eliminação completa

dos microrganismos contaminantes.

Após esses processos serem adotados procedeu-se novamente com o cultivo em placas

de Petri utilizando os resíduos (engaço e pseudocaule) das cultivares de bananeira. Não foram

observadas contaminações após as medidas adotadas para assepsia do substrato.

Na figura 3 observa-se que o tratamento com engaço da cultivar thap maeo apresentou

a maior média de crescimento micelial (1,34 cm), seguido do crescimento em pseudocaule de

prata-anã (1,27 cm). Quando comparado ao grupo controle (sem adição da mistura de farelos),

observa-se que o fungo L edodes apresentou melhor crescimento em meio à base de

pseudocaule de prata-anã sem suplementação de farelos (1,44 cm), seguido do crescimento em

engaço da mesma cultivar sem suplementação (1,33 cm). Por outro lado, vale ressaltar, que no

meio de cultivo a base de engaço de thap maeo, o fungo apresentou maior crescimento com a

suplementação de farelos (1,34 cm) quando comparado ao seu controle, porém sem diferenças

estatísticas significativas.

Ao nível de 99% (p < 0,01) de probabilidade, pelo teste de Tukey foram evidenciadas

diferenças estáticas entre o crescimento micelial em meio de cultivo à base de pseudocaule de

prata-anã suplementado com mistura de farelos e seu respectivo controle. Sendo que a maior

55

média (1,44 cm) observada no grupo controle. Assim, supõe-se que os níveis de carbono e

nitrogênio presentes no meio de cultivo à base de pseudocaule de prata-anã, são suficientes

para promover um crescimento micelial mais eficiente e que a adição de cereais possivelmente

ocasionou excesso de nitrogênio e consequentemente inibiu o crescimento fúngico.

Segundo Gomes-Da-Costa et al. (2008) e Sales-Campos e Andrade (2010), o tipo de

substrato e a suplementação podem influenciar na velocidade do crescimento micelial. Maziero

et al. (1990) e Ragunathan et al. (1996) também citaram que a velocidade de crescimento e o

vigor são parâmetros que podem ser influenciados pela composição do substrato, pelos isolados

testados e pela suplementação fornecida.

De acordo com Donini et al. (2005), um substrato muito enriquecido pode

desfavorecer a degradação da lignina pelo fungo podendo retardar ou até reprimir seu

crescimento micelial. A suplementação de substratos ligninocelulósicos altera a relação C:N,

elevando os níveis de nitrogênio que em excesso pode inibir o crescimento micelial do fungo

(Dias et al., 2003; Singh e Verma, 1996; Boyle, 1998, Sales-Campos, 2008).

Figura 3: Medias de crescimento micelial (cm) de L. edodes em meios de cultivo elaborados com

resíduos de bananeira com e sem suplementação de cereais. Códigos dos meios de cultivo

seguidos de letra t correspondem ao tratamento e seguidas de letra c correspondem ao controle –

PSPA-pseudocaule de prata-anã, PSTM-pseudocaule de thap-maeo, ENPA-engaço de prata-anã,

ENTM-engaço de thap-maeo. Médias com letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey.

Eixo x: médias em cm do crescimento micelial, eixo y: grupos de tratamentos e controles.

1,05

1,1

1,15

1,2

1,25

1,3

1,35

1,4

1,45

1,5

PSPAt PSPAc PSTMt PSTMc ENPAt ENPAc ENTMt ENTMc

Cre

scim

ento

mic

elila

d L

.ed

ode

s em

mei

os

elab

ora

do

s co

m r

esíd

uo

s d

e b

anan

eira

Meios de cultivo

A

A

A

B

A A A

A

56

Conclusões

Foram detectadas a presença de coliformes totais e termotolerantes em todos os

tratamentos, com NMP maiores (>1100) nos tratamentos com engaços das duas cultivares

de bananeira;

Não foram encontradas presenças de bolores e leveduras;

Foi necessário elevar o tempo de esterilização em autoclave a 1 atm de 15 para 45

minutos para eliminação de contaminantes.

L. edodes obteve seu melhor crescimento em meio suplementado com pseudocaule

de prata-anã sem mistura de farelos.

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58



Atividade antifúngica de Picrolemma sprucei Hook sobre o crescimento

de fitopatógenos

Almeida, A.F.

1; Bentes, J.L.S.

2; Hidalgo, A.F.

2

1Aluna de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tropical-UFAM;

2Faculdade

de Ciências Agrárias-UFAM. Av. Rodrigo Otávio, 6200, 69080-000, Manaus-AM. E-mails:


Resumo

O trabalho teve por objetivo avaliar in vitro o efeito de duas concentrações do extrato

vegetal aquoso de caferana sobre o crescimento micelial de Colletotrichum guaranicolla,

Corynespora cassicola e Colletotrichum spp. O delineamento experimental utilizado foi

inteiramente casualizado, com 4 repetições. Foram utilizadas alíquotas de 100µL (0,01%) e

200µL (0,02%) de extrato aquoso de caferana. Para obtenção do extrato foi utilizado 50g

do material vegetal, triturado e misturado em 500mL de água destilada. O extrato foi

filtrado em papel filtro e sistema millipore® com membrana 0,45µm e distribuído em

placas de petri com auxílio de alça de Drigalsky, onde foram depositados discos de micélio

de cada um dos fungos, medindo 0,3 cm de diâmetro. As placas foram incubadas a 28 °C

no escuro. A avaliação do crescimento micelial foi realizada através de medições em dias

alternados do diâmetro das colônias, e os tratamentos foram analisados em relação ao

crescimento micelial da colônia e a porcentagem de inibição de crescimento. O extrato

bruto aquoso de caferana reduziu o crescimento micelial de Corynespora cassicola,

podendo ter potencial para uso como medida alternativa de controle deste fitopatógeno. Os

fungos Colletotrichum guaranicolla e Colletotrichum spp não foram inibidos com o uso do

extrato aquoso de caferana nas concentrações de 0,01 e 0,02%.

Palavras-chave: caferana, inibição de crescimento, fungos.

Introdução

Em todos os lugares onde se pratica uma agricultura econômica, a intervenção para o

controle de doenças de plantas é largamente realizada por meio de agrotóxicos. O uso

racional destes produtos pode ter, em curto prazo, um efeito positivo para o produtor. No

entanto, em longo prazo, os resultados para a sociedade e para o ambiente podem se tornar

negativos, devido a poluição causada pelos resíduos, além do surgimento de isolados dos

patógenos resistentes às substâncias químicas utilizadas (Kimati et al., 1997; Zadoks,

1992).



59

Desse modo se faz necessária a busca de medidas alternativas de manejo fitossanitário

compatíveis com a qualidade ambiental visada no manejo sustentável, surgindo medidas de

controle alternativo para as doenças de plantas (Franzener et al., 2003; Fonseca et al.,

2015).

Plantas medicinais possuem compostos secundários que tanto podem ter ação

fungitóxica, como eliciadora, ativando mecanismos de defesa nas plantas, tornando-se uma

alternativa no controle de fitopatógenos com potencial ecológico para substituir o emprego

de agrotóxicos, por meio da utilização de seus subprodutos, como extrato bruto e óleo

essencial (Matos, 1997; Stangarlin et al., 1999).

Neste sentido, algumas plantas se destacam, como é o caso da planta medicinal

Picrolemma sprucei Hook (caferana). Pertence à família Simaroubaceae, que se distingue

pela presença nos seus tecidos de substâncias terpênicas altamente oxigenadas, conhecidas

como quassinóides (Thomas, 1990).

Estudos químicos realizados em folhas de P. sprucei isolaram 15-desacetilsergeolida,

sergeolida e isobruceína (Polonsky et al. 1984). Os quassinóides sergeolida, isobruceína e

15-desacetilsegeolida apresentaram potente atividade antifágia e inibição do crescimento

do verme Heliothis virescens f. (lagarta do broto do tabaco ou lagarta-da-maça) e da praga

do milho Agrotis ípsilon Hfn. (lagarta-rosca negra), sem provocar a morte dos insetos

(Lidert et al., 1987).

Polonsky et al. (1989) demonstraram que a isobruceína apresenta forte atividade

antifágica frente à espécie de pulgão Myzus persocaes s.s (Sulzer) (Hemíptera, Aphididae),

a uma concentração de 0,05%, com uma baixa fitotoxicidade a Brassia campestres var.

Chinensis (L.) Makino (repolho branco chinês – pak choi), enquanto que a sergeolida não

se mostrou eficaz até uma concentração de 0,1%; porém, causou danos consideráveis às

folhas de repolho.

Tendo em vista as propriedades existentes na caferana, objetivou-se avaliar in vitro o

efeito de diferentes concentrações do extrato aquoso de caferana sobre o crescimento de

Colletotrichum guaranicolla, Corynespora cassicola e Colletrotrichum spp.

Material e Métodos

O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de Microbiologia e Fitopatologia

da Universidade Federal do Amazonas – UFAM. Os fungos, Colletotrichum guaranicola e

Corynespora cassicola, foram obtidos da coleção fitopatológica do laboratório, e o fungo

60

Colletotrichum spp. foi obtido a partir de frutos de pimenta de cheiro (Capiscum spp.),

com sintomas de antracnose.

Para a obtenção do extrato, folhas frescas de P. sprucei Hook foram coletadas no

período da manhã, no mini-campus da UFAM, lavadas com água corrente e foram

dispostas em uma bancada para secar em temperatura ambiente durante 7 dias. Para

obtenção do extrato bruto, as amostras foram trituradas em liquidificador, obtendo-se 50g

de material, e adicionados 500mL de água destilada, permanecendo 48 horas em

temperatura ambiente e ao abrigo da luz, sendo agitado 1 vez por dia. Após esse período,

foi realizada a filtragem em gaze e papel filtro esterilizado, seguido de esterilização a

vácuo em filtro Milipore® com membrana de porosidade de 0,45 µm. A solução final foi

armazenada em frasco esterilizado, identificado, fechado e conservado em freezer (± 4 ⁰C)

(Bonaldo, 2004; Bandeira, 2013).

Para avaliar o crescimento micelial foram utilizadas duas doses de extrato bruto

vegetal de caferana 0,01% e 0,02%. Alíquotas de 100µL e 200µL do extrato de caferana

foram colocados no centro de placas de Petri contendo cerca de 15 mL de BDA e

distribuídas sobre a superfície do meio com auxílio de alça de Drigalsky. Em seguida,

discos de 3 mm de diâmetro contendo micélio dos fungos C. guaranicolla, C. cassicola e

C. spp. com nove dias de cultivo foram depositados no centro das placas, que foram

vedadas com filme plástico e mantido a 28°± 2°C, no escuro. A testemunha constou da

adição água destilada e esterilizada ao meio (Hillen, 2012).

A avaliação do crescimento micelial foi realizada por meio de medições em dias

alternados do diâmetro das colônias, obtida pela média de duas medidas diametralmente

opostas, até que as colônias no tratamento testemunha atingisse a borda da placa. A

porcentagem de inibição do crescimento (PIC) foi obtida por meio da fórmula: PIC =

[(diâmetro da testemunha – diâmetro do tratamento)/diâmetro da testemunha] x 100, para

cada extrato em relação à testemunha (Fernandes, 2015).

O delineamento experimental foi inteiramente casualisado, com quatro repetições. Os

resultados foram analisados estatisticamente com o auxílio do programa ASSISTAT v. 7.7

(Silva e Azevedo, 2016) e comparação de médias pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.


O extrato aquoso da caferana promoveu significativa redução no crescimento do fungo

Corynespora cassicola, com a dose de 100 µL diferindo do tratamento testemunha (Tabela

1). Houve também, uma tendência do extrato aquoso dessa planta em inibir os

61

crescimentos do Colletotrichum guaranicolla e do Colletotrichum spp., mas não ao ponto

de ser um efeito significativo estatisticamente. Os resultados obtidos estão de acordo com

as avaliações de outros autores, em estudos com fungos fitopatogênicos, nas quais se

verificaram ocorrer maior inibição do crescimento micelial com o emprego das maiores

concentrações dos extratos vegetais (Franzener et al., 2003; Souza et al., 2007). É possível

que uma dose mais concentrada desse extrato resulte numa inibição significativa desses

dois fungos, pois pode-se verificar pelos dados da Tabela 1, que à medida que a dose é

aumentada, menor é o crescimento micelial dos mesmos.

Tabela 1. Média do crescimento micelial de Colletotrichum guaranicolla,

Corynespora cassiola e Colletotrichum spp. sob influência de extrato aquoso

de caferana em duas diferentes concentrações. Alíquota/Extrato

Aquoso

Fungos Fitopatógenos

Colletotrichum guaranicola

Corynespora cassicola

Colletotrichum spp.

Testemunha 8,00 a 8,00 a 8,00 a

100µL 7,66 a 5,60 b 7,71 a

200µL 7,61 a 6,21 ab 7,21 a

CV (%) 7,65 14,35 9,35

Venturoso (2011), observou menores porcentagens de inibição com o uso do extrato

de canela sobre o crescimento de Colletrotichum sp. e para o Fusarium solani não se

verificou altas inibições, mesmo nas maiores concentrações.

O extrato aquoso de caferana não resultou em redução no diâmetro da colônia de

Colletotrichum spp. e Colletotrichum guaranicolla em comparação ao tratamento controle

(Figura 1, Figura 3, Tabela 1).

Figura 1. Crescimento micelial (cm) de Colletotrichum spp. sob influência de duas

concentrações de extrato aquoso de caferana.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 2 4 6 8 10 12 14

Diâ

met

ro d

a C

olô

nia

(cm

)

Dias de Incubação

Testemunha

0,01%

0,02%

62

Para o fungo Colletotrichum guaranicolla não foi observada redução do crescimento

micelial (Figura 2).

Figura 2. Crescimento micelial (cm) de Colletotrichum guaranicolla sob influência

de duas concentrações de extrato aquoso de caferana.

Segundo Simões e Spitzer (2000) os extratos podem perder sua capacidade de inibição

devido à volatilização dos seus constituintes químicos na presença de luz, calor, ar e

umidade no interior das placas de Petri.

Outro aspecto que deve ser levado em consideração são os aspectos agronômicos. Essa

possibilidade é reforçada pelos estudos de Morais (2009) e Ehlert et al. (2013) que, ao

estudarem os efeitos dos fatores abióticos e de diferentes épocas e horário de colheita na

composição química de óleos essenciais, constataram melhor adaptação das plantas às

condições de alta intensidade luminosa, e que época e horários de colheita influenciaram

na percentagem relativa dos principais constituintes químicos dos óleos essenciais.

O extrato aquoso de caferana promoveu uma redução no crescimento do fungo

Corynespora cassicola (Figura 3) quando comparado ao tratamento controle. No entanto,

não houve diferença significativa com o aumento da concentração de extrato.

Resultado semelhante foi encontrado por Cunico et al. (2006), que não verificou

diferenças sobre o crescimento micelial de Fusarium oxysporum, utilizando extratos de

Ottonia martiana nas concentrações de 12, 5, 25 e 50%.

De acordo com Silva (2006), a discrepância entre os resultados obtidos com o uso de

extratos vegetais no controle de fitopatógenos justifica-se pela quantidade e composição

Diâ

met

ro d

a C

olô

nia

(cm

)

Dias de Incubação

Testemunha

0,01%

0,02%

63

química variáveis dos extratos. Leme et al. (2007) verificaram que a forma de esterilização

e o tempo de armazenamento do extrato de capim-limão interferiram na atividade do

mesmo em relação ao desenvolvimento micelial.

Figura 3. Crescimento micelial (cm) de Corynespora cassicola sob influência de

duas concentrações de extrato aquoso de caferana.

Conclusões

O extrato bruto aquoso de caferana reduziu o crescimento micelial de Corynespora

cassicola, podendo ter potencial para uso como medida alternativa de controle deste

fitopatógeno

Os fungos Colletotrichum guaranicolla e Colletotrichum spp não foram inibidos

estatisticamente com o uso do extrato aquoso de caferana nas concentrações de 0,01% e

0,02%.

Agradecimentos

À CAPES pela concessão da bolsa e ao PGATR (UFAM) pela estrutura de

laboratórios oferecida para o desenvolvimento do trabalho.

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Diâ

met

ro d

a C

olô

nia

(cm

)

Dias de Incubação

Testemunha

0,01%

0,02%

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66



Atividade proteolítica de rizobactérias de nódulos de leguminosas de

municípios circunvizinhos de Manaus / Amazonas

Alves E.S.F.1, Oliveira F.R.

2, Moreira F.W.

3, Oliveira L.A.

3

1Graduanda do curso de Agronomia, Universidade Federal do Amazonas,

2Bolsista

FIXAM/FAPEAM, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. 3Pesquisador, Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia, E-mails: [email protected], [email protected] [email protected], [email protected]

Resumo

Os microrganismos são uma rica fonte de proteases, entre eles, destacam-se as

rizobactérias encontradas nas rizosferas das plantas e dentro de nódulos de leguminosas. A

Doença Celíaca (DC), caracterizada por um processo inflamatório na mucosa do intestino

delgado devido à presença do glúten, não tem tratamento além da dieta, assim, uma

alternativa seria o uso de algum bioproduto capaz de neutralizar ou evitar os efeitos

nocivos dessa proteína para os celíacos. Em vista disso, foram realizados experimentos

iniciais para obter rizobactérias produtoras de proteases capazes de degradar o glúten

eficientemente. Mais de 20% de um total de 164 rizobactérias testadas apresentaram

atividade proteolítica no glúten sob diferentes condições de tratamento: a uma temperatura

de 26 e 36 °C em meios de cultivos sólido e líquido MG (manitol e glúten) e G (somente

glúten). Mais de 20% das rizobactérias testadas apresentaram habilidade em degradar o

glúten, entre as quais, sete (INPA 959, 962, 963, 964, 965, 967, 968) destacaram-se pelos

altos índices enzimáticos. O meio de cultivo mais adequado foi o MG a uma temperatura

de 26 °C, em que houve a maior produção de proteases.

Palavras-chave: Microbiota do solo, metabolismo microbiano, proteases.

Introdução

As proteases são largamente utilizadas tanto na área de saúde quanto na alimentícia.

Essas enzimas têm sido incorporadas, por exemplo, aos alimentos das aves e suínos com o

propósito de melhorar a digestão de várias fontes proteicas. As dietas desses animais,

compostas principalmente de milho e soja, possuem alguns componentes que podem

dificultar a digestão e prejudicar a sua integridade intestinal. A soja, alimento de alto valor

nutritivo (com cerca de 45% de proteína) e o milho (com cerca de 10% de proteína)

possuem compostos de baixa digestibilidade, reduzindo assim, a absorção dos nutrientes

(Carvalho, 2012). Dessa forma, enzimas proteolíticas são utilizadas como alternativa para

melhorar a qualidade do farelo com esses ingredientes proteicos.




67

Outro fator importante relacionado à área alimentícia e da saúde é que existem

pessoas com predisposição genética para intolerância ao glúten, caracterizada pela Doença

Celíaca (DC). A ingestão contínua dessa proteína desencadeia um processo inflamatório na

mucosa do intestino delgado, levando ao atrofiamento das vilosidades intestinais e,

consequentemente, a má absorção dos nutrientes durante a digestão. Quando não tratada

pode levar a uma série de patologias que podem envolver a pele, o fígado, sistema nervoso,

reprodutivo, endócrino e ossos (Silva et al., 2006; Silva e Furlanetto, 2010; Stoven et al.,

2012).

O glúten, o causador da manifestação da doença, é um composto protéico

encontrado em cereais como o trigo, cevada, centeio e aveia de grande importância na

dieta. Ele constitui cerca de 90% das proteínas presentes no endosperma do grão do trigo e

subdivide-se em duas frações de acordo com suas características moleculares – glutenina e

gliadina, que são parcialmente digeridas pelas enzimas do sistema digestório, sendo

consideradas altamente tóxicas para os celíacos (Wieser, 2007; Araujo et al., 2010; Stoven

et al., 2012).

Mundialmente, a DC é considerada um problema de saúde pública devido a sua

morbidade e à probabilidade do aparecimento de complicações graves, principalmente

linfomas e carcinomas associados ao trato gastroentérico. E o único tratamento para a

doença é a total exclusão do glúten na dieta (Nascimento et al., 2012; Andreoli et al., 2013;

Mooney et al., 2014). Até o ano de 1970, acreditava-se que a prevalência da DC na

população geral fosse de 0,03% (Tack et al., 2010). No entanto, este valor aumentou

significativamente e encontra-se em torno de 1-2%, com uma distribuição bastante

homogênea em todo o mundo (Rodrigo Saez et al., 2011). Uma das razões para este

aumento é a maior sensibilidade dos métodos diagnósticos, porém os fatores de risco

ambientais também devem ser considerados (Lebwohl et al., 2014).

Buscando uma alternativa para o tratamento da DC, muitos microrganismos, tais

como as rizobactérias estão sendo estudadas quanto à sua capacidade na produção de

enzimas proteolíticas com inúmeras funções bioativas (Oliveira, 2014). Em vista disso, o

objetivo do presente trabalho foi obter rizobactérias de nódulos de leguminosas capazes de

degradar o glúten, avaliando sua eficiência em consumir esse composto em meios de

cultivo sólido e líquido, em diferentes temperaturas, a fim de se obter aquelas com um

maior potencial enzimático, visando o interesse para a saúde pública com base no possível

uso de seus metabólitos na bioindústria em benefício das pessoas com a DC.

68

Material e Métodos

Os isolados bacterianos foram obtidos de nódulos de raízes de leguminosas

coletadas às margens de estradas federais (em municípios circunvizinhos de Manaus /

Amazonas) e dentro de reservas pertencentes ao INPA. No laboratório, cada nódulo foi

lavado com etanol (92%) por 3 minutos, seguido por uma desinfecção superficial com

hipoclorito de sódio por 4 minutos e dez lavagens com água estéril. Em seguida, os

nódulos foram pressionados com auxílio de espátula estéril e estriados com alça

bacteriológica em placas de Petri contendo meio YMA (Yeast Manitol Agar) esterilizado

(Vincent, 1970). As placas com os isolados foram incubadas a 26 ºC até o crescimento das

colônias (cerca de 3 dias). Após o crescimento de colônias de bactérias, estas foram

novamente isoladas e repicadas para novas placas contendo YMA para obtenção de

colônias puras.

Os isolados de rizobactérias purificados foram testados em meio de cultura sólido

YMA, onde se substituiu o manitol pelo glúten. Cada isolado de rizobactéria foi inoculado

nas placas de Petri contendo YA com glúten para visualização do crescimento da colônia e

do halo proteolítico (região transparente ao redor das colônias). Com o auxílio de uma alça

bacteriológica, foi retirada uma porção da colônia bacteriana, realizando-se um leve toque

no meio de cultura. Cada placa conteve quatro repetições de uma colônia selecionada. As

placas foram incubadas a 26 ºC e avaliadas após três dias.

A avaliação da atividade proteolítica se deu por difusão radial em meio sólido, em

que o índice enzimático ou índice de degradação do glúten (IDG) para cada isolado foi

obtido pela fórmula: DD (média do diâmetro da zona de degradação em mm) / DC (média

do diâmetro da colônia em mm) (Hankin e Anagnostakis, 1975).

Com o objetivo de selecionar o meio de cultivo adequado para a produção de

metabólitos enzimáticos, as bactérias com os maiores IDGs foram testadas quanto ao

crescimento em meio líquido em duas temperaturas (26 e 36 °C) e em duas formulações de

fontes de carbono: a) 0,2 % de glúten (meio G) (0,2 % glúten, 0,5 g K2HPO4, 0,2 g

MgSO4, 0,1 g NaCl, 0,5 g extrato de levedura em 1 L de água destilada, pH 7,0); b) 1,0 %

de manitol + 0,2 % de glúten (meio MG). Um volume de 50 mL de cada meio foi

adicionado separadamente em erlenmeyers e esterilizados a 120 ºC por 35 min. Após o

esfriamento, cada bactéria (concentração de 1,5 x 108 UFC/ mL - tempo 0) foi inoculada

em triplicata e colocada sob agitação constante em incubadora a 26 e 36 °C,

separadamente.

69

Um total de 15 mL de cada amostra foram retirados após 24h (tempo 1), 48h

(tempo 2), 72h (tempo 3) e 96h (tempo 4) e armazenados em geladeira para posterior

obtenção dos extratos brutos e realização da atividade enzimática.

Em seguida, um total de 15 mL de cada amostra do teste anterior foi coletado com a

finalidade de se obter os extratos brutos para a detecção de proteases capazes de degradar o

glúten. Primeiramente, cada amostra foi centrifugada a 5000 rpm por 5 min. Em seguida, o

sobrenadante foi filtrado em membrana Millipore 0,22 µm, armazenado em microtubos e

mantidos a 4 °C. Um total de 100 µL do extrato bruto obtido de cada amostra foi

depositado em 4 poços (6 mm cada) perfurados em placas com meio ágar-glúten e

incubado a 26 e 36 ºC, separadamente. Posteriormente, as amostras foram avaliadas a cada

24h por um período de 4 dias, quanto ao tamanho dos halos de transparência, medidos por

um paquímetro digital.

Os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey a 5% de

probabilidade para a comparação das médias, pelo programa Assistat versão 7.7 beta (pt)

para os diferentes tratamentos.


Dos 164 isolados de rizobactérias testados, 35 apresentaram atividade proteolítica

no glúten, dos quais, sete apresentaram altos índices enzimáticos (>4) (Figura 1, Tabela 1).

Figura 1. Colônias do isolado INPA 960 com os respectivos halos de transparência,

evidenciando atividade proteolítica em meio de cultivo sólido contendo 1,0% de

glúten após incubação a 26 °C por quatro dias.

Segundo Lealem e Gashe (1994), um valor de índice de atividade enzimática ≥ 2,0

é o recomendado para considerar um microrganismo como produtor potencial de enzimas

em meio sólido. Essa é uma boa metodologia para avaliar a habilidade na produção de

enzimas extracelulares em meio sólido, pois permite a triagem de uma grande quantidade

70

de microrganismos (Ceska, 1971; Hankin e Anagnostakis, 1975; Neto e Cunha, 1987; Lin

et al., 1991). É possível inferir, com base nos resultados do presente trabalho, que os

isolados mostraram capacidade quanto à degradação do glúten, produzindo enzimas

proteolíticas de forma bastante eficiente.

Os sete isolados que apresentaram altos índices de degradação enzimática foram

utilizados para os testes em meio líquido MG (manitol + glúten) e G (glúten) em duas

temperaturas distintas (26 e 36 °C), com o objetivo de selecionar o meio de cultivo e a

temperatura mais indicados para a produção de proteases capazes de degradar o glúten.

Tabela 1. Atividade proteolítica dos extratos brutos obtidos dos isolados de rizobactérias

cultivados em diferentes meios líquidos por um período de 4 dias, avaliada em

meio sólido com glúten.

Extrato brutos

dos isolados

Meios de cultivo

MG (1,0% manitol + 0,2% glúten) G (0,2% glúten)

----------halos de transparência em milímetros----------

INPA 959 2,71 eB 7,84 aA

INPA 962 7,66 bcA 7,85 aA

INPA 963 5,48 dA 0,00 cB

INPA 964 10,80 aA 8,11 aB

INPA 965 7,43 cA 5,91 bB

INPA 967 8,12 bA 0,00 cB

INPA 968 7,42 cA 0,00 cB

Obs.: Médias com letras maiúsculas iguais nas linhas e minúsculas nas colunas não diferem pelo teste de

Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Figura 2. Atividade proteolítica dos extratos brutos obtidos do isolado INPA 962 cultivado

em meio: (A) MG a 26 °C e (B) meio G a 26 °C, evidenciada pelos halos de

transparência em meio sólido contendo 1,0% de glúten após incubação a

temperatura ambiente por quatro dias.

B A

71

O meio de cultivo em que as rizobactérias apresentaram maiores atividades

proteolíticas foi o MG, destacando-se a INPA 964. As únicas exceções foram a

rizobactéria INPA 959, que apresentou maior atividade proteolítica no meio G e, a INPA

962, que mostrou atividade proteolítica igual nos dois meios (Tabela 1, Figura 2).

Quanto à temperatura, a maioria dos isolados apresentou maior atividade

proteolítica a 26 °C. As exceções foram a INPA 965 que mostrou maior atividade a 36 °C

e a INPA 959 que apresentou atividade igual nas duas temperaturas. (Tabela 2).

Tabela 2. Atividade proteolítica dos extratos brutos obtidos dos isolados de rizobactérias

cultivados em diferentes temperaturas por um período de 4 dias, avaliada em

meio sólido com glúten.

Extrato brutos

dos isolados

Temperatura

26 °C 36 °C

-------halos de transparência em milímetros-------

INPA 959 5,28 cA 5,26 cA

INPA 962 8,09 bA 7,42 bB

INPA 963 5,48 cA 0,00 gB

INPA 964 9,14 aB 9,76 aA

INPA 965 9,59 aA 3,74 dB

INPA 967 5,71 cA 2,41 fB

INPA 968 4,42 dA 2,99 eB

Obs.: Médias com letras maiúsculas iguais nas linhas e minúsculas nas colunas não diferem pelo teste de


Esses dados mostram que essas rizobactérias apresentam moléculas bioativas

capazes de degradar o glúten eficientemente, mas que ainda precisam ser identificadas. É

necessário, a partir desses resultados, purificá-las e caracterizá-las molecularmente,

visando o uso futuro para aplicações biotecnológicas na área da saúde.

Conclusões

Mais de 20% das rizobactérias testadas apresentaram habilidade em degradar o

glúten, entre as quais, sete (INPA 959, 962, 963, 964, 965, 967, 968) destacaram-se pelos

altos índices enzimáticos.

O meio de cultivo mais adequado foi o MG a uma temperatura de 26 °C, em que

houve a maior produção de proteases.

72

Agradecimentos

Ao INPA pela infraestrutura e, FAPEAM e CNPq pelos recursos financeiros e bolsa que

permitiram a realização dessa pesquisa.

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74



Isolamento, identificação e produção de celulases dos microrganismos

associados aos cupins Nasutitermes sp.

Aparício J.F.1, Silva, S.R.S

2, Souza A.Q.L

3, Freitas A.D.G

4

1Biotecnologista, Universidade Federal do Amazonas, ISB/Coari,

2Discente do PPG Bionorte, da

Universidade Federal do Amazonas, 3Docente, Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade

Federal do Amazonas, Manaus,4Docente, Universidade Federal do Amazonas, ISB/Coari. Emails:


Resumo

Os cupins são consumidores de madeira, material orgânico, e em estágios de

decomposição. Existem poucos experimentos com enzimas de cupins, logo, tais

experimentos foram realizados na UFAM, Campus do ISB/Coari, AM. Os isolados foram

conservados, nesse trabalho observou-se a riqueza fúngica associada aos cupins, fungos do

gênero: Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp. e Xylaria sp., além de outros não

identificados. Os resultados das atividades enzimáticas da FPase, β-glicosidase e CMCase

foram significativas, porém, a atividade da FPase expressa em UI mLˉ¹ de extrato

enzimático, foi mais eficaz em relação a β-glicosidase e CMCase.

Palavras-chave: Cupins, Lignina e Celulose

Introdução

Os cupins são insetos sociais que formam colônias de indivíduos interdependentes

entre si, onde há sobreposição de gerações e cuidados com a prole. Sua estrutura social é

composta por indivíduos que se desenvolvem por paurometabolia e compreende machos e

fêmeas que se distribuem em categorias ou castas (Oliveira et al. 1986).

Os cupins são os invertebrados dominantes em ambientes terrestres tropicais e estão

espalhados desde as florestas úmidas até as savanas, sendo encontrados até mesmo em

regiões áridas (Wood, 1978; Wood e Thomas, 1982; Eggleton et al., 1996). Os térmitas

desempenham um papel importante na dinâmica dos ecossistemas em que encontram-se

presentes. O comportamento social juntamente com seus hábitos alimentares e de

nidificação, propiciam o desenvolvimento de colônias com grande número de indivíduos e

grande longevidade. Deste modo, os térmitas podem causar impactos ambientais maiores

que as atividades de muitos organismos mais conspícuos, incluindo modificações nas




75

propriedades físicas e químicas do solo, no processo de decomposição, na distribuição de

plantas e animais termitófilos e na ciclagem de nutrientes (Wood, 1978).

A grande abundância dos cupins nos ecossistemas, associada à existência de

diferentes simbiontes intestinais, confere a estes insetos a possibilidade de desempenhar

importantes papeis como super decompositores e auxilio no balanço Carbono-Nitrogênio

(Higashi e Abe, 1997). Algumas espécies possuem simbiontes intestinais capazes de fixar

nitrogênio atmosférico (Breznak et al., 1994; Tayasu, 1994).

Termitidae é a maior família de cupins e consiste de ¾ de todas as espécies conhecidas,

agrupadas em 3 subfamilias: Amitermitinae, Macrotermitinae, Nasutitermitinae. É formada

pelas espécies de cupins que fazem ninhos em formas de montículos, embora haja as que

constroem ninhos subterrâneos, e por outras que tem ninhos arborícolas ou semi-

arborícolas (Berti Filho, 1993; Constantino, 2002).

Nasutitermes é o gênero de cupins com maior número de espécies do mundo,

apresentando maior diversidade em região neotropical, além de representar o táxon com

maior número de evolução e especialização. Poucas são as espécies deste gênero que

modificam somente no solo. Algumas espécies de Nasutitermes têm a tendência de

construir ninhos vulgarmente denominados cabeça de nego em galhos de árvores,

indicando ser este o principal local de formação da colônia, ainda que o casal real

inicialmente nidifique no solo; mais tarde a colônia acaba transferindo-se para locais acima

do nível do mesmo (Fontes, 1987; Constatino, 1999).

Segundo Moore (1996), muitas fontes alimentares dos cupins são ricas em lignina e

em carboidratos, especialmente celulose, mas pobres em vitaminas, proteínas e outras

formas de nitrogênio orgânico. A lignina não é completamente degradada durante a

passagem pelo canal alimentar dos cupins (Breznak e Brune, 1994) e a nutrição desses

insetos depende do auxílio de microrganismos simbióticos. Tais relações simbióticas

tiveram um papel essencial na evolução dos térmitas, já que eles proporcionaram novas

vias metabólicas de processamento de carbono e fixação de nitrogênio a partir da quebra

dos componentes lignocelulosicos sob ação dos microrganismos simbiontes (Lima e Costa-

Leonardo, 2007). O principal alimento dos cupins vem da celulose. A celulose é um

polímero, formado por várias moléculas idênticas. A celulose é um composto duro e

resistente encontrado nas plantas, sendo ela que dá às árvores e arbustos sua estrutura. As

moléculas que compõem a celulose são de glicose, chegando a até 3 mil.

Esses simbiontes agem bem sobre a celulose, porém pouco se conhece sobre as

enzimas que atuam sobre a molécula de lignina, cuja digestão feita através de bactérias e

76

fungos são apoiadas pela ação de micélios de basidiomicetos e ascomicetos e, certamente,

também por protozoários flagelados que se alimentam de lignina. As celulases são

utilizadas em diversas aplicações biotecnológicas. Na indústria têxtil, essas enzimas são

usadas para dar melhor acabamento aos tecidos, tornando-os mais lisos, macios e com

melhor caimento. Também são utilizadas na indústria de bebidas para produção de sucos

de frutas e nos processos de vinificação. Exercem papel importante na nutrição animal. Na

fabricação de detergentes, proporcionam maior limpeza e menor degradação dos tecidos e

na indústria de polpa e papel, tornam o papel mais branco e liso. Entretanto, o interesse por

essas enzimas tem aumentado muito devido a sua utilização no processo de produção de

etanol a partir de resíduos vegetais.

Assim, considerando as boas perspectivas da utilização dessas Enzimas de origem

vegetal em diversas aplicabilidade este trabalho tem como objetivo investigar, isolar

purificar identificar e conservar fungos associados ao cupim Nasutitermites sp.

Material e Métodos

Os recipientes contendo os cupins foram conduzidos para o Laboratório de

Microbiologia do ISB (Instituto de Saúde e Biotecnologia), onde foi realizado o isolamento

dos microrganismos presentes nos cupins. Os mesmos foram levados ao freezer a 28oC

para adormecimento e em seguida levados para câmara de fluxo para assepsia. Para o

isolamento, os insetos foram divididos em cabeça, tórax e abdômen, além de termos os

insetos completos (com todas as estruturas) transferindo pequenos fragmentos dos insetos

para placa de Petri com o meio de cultura BDA (Batata Dextrose Ágar), As culturas foram

transferidas para estufa tipo B.O.D (Biological Oxygen Demand) a 26ºC. Após 7 dias, foi

realizado o isolamento, transferindo-se fragmentos de ágar contendo hifas, para novas

placas contendo o referido meio de cultura BDA. Para se obter colônias de fungo puras

realizou-se a purificação dos isolados e posteriormente a diluição seriada seguida de

plaqueamento de acordo com o protocolo de Azevedo e Costa (1973). Os fungos foram

armazenados usando os métodos de Castellani (1939) e do glicerol a 15%.

Para a identificação dos isolados, realizaram-se observações macroscópicas da

colônia (crescimento, coloração, textura e pigmento difuso) e observações microscópicas

das estruturas vegetativas (hifas) por meio de microcultivos. O aspecto macromorfológico

das colônias dos isolados foi examinado a olho nu, com atenção especial ao crescimento

micelial, a forma das bordas a presença de pigmento difuso, a textura e a coloração de

77

colônia. O aspecto micromorfológico das estruturas vegetativas e reprodutivas foi

examinada sob microscopia, em aumento total de 400X.

Para o crescimento fúngico e indução da atividade enzimática, foram preparadas

duas soluções de Manachinni sólido, uma contendo o indutor enzimático e outra sem o

indutor com a seguinte composição: KH2 PO4 – 2g; (NH4)2 SO4–1g; MgSO4 7H2O – 0,1g;

Na2HPO4- 0,98 g; Extrato de Levedura-1g; Ágar – 7,5g; Água destilada - 1000 mL.

Para a indução da enzima celulase, foi adicionado o substrato carboximetilcelulose

– CMC (0,5%). O pH para detecção de celulase foi de 5,0. Após a solução foi levada para

autoclave por 15min a 120ºC. Percorrido o tempo determinado verteu-se o meio em placas

de Petri e estas foram acondicionadas na estufa B.D.O. por 10dias.

Para a quantificação da atividade da celulase total (FPase), utilizou-se a

metodologia descrita por Ghose (1987) e para a quantificação da atividade β-glicosidase

utilizou-se o kit glucose Liquicolor em tubos de ensaios.

Para determinar a atividade CMCase (endoglucanase) utilizou-se tubo de ensaio

onde foram adicionados 450μL de CMC em tampão acetato de sódio a 1% 50 mM, pH 5,0

e 50μL das amostras. Após equilíbrio térmico em banho-maria por 10 min a 50ºC,

adicionou-se 500μL de DNS e mais 50μl das amostras nos controles totalizando 1mL os

mesmos foram levados para o banho fervente por 5 min. Após o tempo reacional foram

retirados e colocados em banho gelado nesse processo foi acrescentado 4mL de agua

destilada. As absorbâncias foram verificadas em espectrofotômetro a 540nm.


Foram encontrados 450 isolados fungicos e 300 isolados de bactérias nos cupins

Nasutitermites sp., tanto nos insetos completos como nos fragmentos (cabeça, tórax e

abdômen). Isto demonstra que o meio de cultura utilizado mostrou-se eficiente em garantir

uma grande diversidade de microrganismos, além das condições empregadas para o

isolamento como temperatura, pH, entre outros foram favoráveis.

A observação da diversidade fúngica foi possível quando analisamos as estruturas

macroscópica (crescimento, coloração e textura). Os gêneros Penicillium sp., Aspergillus

sp., Tricoderma sp., Fusarium sp. e Xylaria sp. foram encontrados, segundo Visser (2009).

Ninhos abandonados de Macrotermitinae geralmente apresentam os jardins de fungos

cobertos por espécie fúngica do gênero Xylaria sp. No entanto, no presente trabalho

78

encontramos este microrganismo em um ninho ativo de cupins, e no inseto principalmente

se localizando na cabeça do mesmo.

Observou-se fungos com colorações esverdeadas, amareladas marrom e branca.

Alguns com texturas liguenta e alguns esporulentos. Foi notada presença de hifas, de

conidióforo sem os conídios, e conídios de forma dispersa.

Os cupins Nasutitermites sp. apresentaram fungos do gênero Penicillium sp.,

Aspergillus sp. e Trichoderma sp. Suas presenças corrobora estudos anteriores (Grace,

1990; Zoberi, 1993). Esses fungos são capazes de produzir celulases. Em geral, esses

fungos celulolíticos produzem um grande número de celulases e muitos as usam para a

degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal. A análise qualitativa da atividade

da celulase total (FPase) mostrou eficiência nas amostras estudadas (Figura 1).

Figura 1. Produção de FPase; β-glicosidase e CMCASE dos fungos oriundos dos

fragmentos e inseto inteiro dos Cupins Nasutitemites sp.

79

Os isolados que apresentaram maior atividade foi o 40-T/C seguido de 33-

INS(S.A). Os mesmos são classificados como Trichoderma sp. Os fungos filamentosos,

especialmente os Basidiomycetes, são os mais utilizados para a produção dessas enzimas

(Pandey et al., 2000). Entre esses fungos, Trichoderma reesei é reconhecido pela produção

de diversos sistemas extracelulares de enzimas envolvidas na hidrolise de polissacarídeos

(Beguim, 1990). Em estudos anteriores, Khan et al. (2007) utilizaram e obtiveram

atividade celulósica total de 0,10 UI mL¹ de extrato enzimático. Os microrganismos

estudados apresentaram uma boa produção enzimática quando utilizado o indutor de

FPase. No entanto, os fungos 18-C/C e 15-T/C não apresentaram atividade enzimática, mas

fato este não diminui a sua produção de enzimas celulolíticas, pois mostraram uma ótima

produção como indutores de CMCase e β- glicosidase.

Nem todos os isolados mostraram uma produção significativa de β-glicosidase. O

isolado 37-C/C foi o que apresentou uma maior produção de β- glicosidase, seguido do

isolado 40-T/C.

O isolado 37-C/C foi classificado como Penicillium sp. Os Penicillium, em

condições naturais ou in vitro, são fontes de biocompostos; por isso muitos deles tornam-se

valiosos por produzirem pigmentos, enzimas e outros compostos com atividades

hipocolesterolêmica, anticancerígenos, antitumoral, antioxidantes inibidores de ά-

glucosidase, inseticidas, herbicidas, antimicrobianos e fungicidas (Paterson et al., 2004;

Oliveira et al., 2006). Os mesmos estão envolvidos em estudos ecológicos como:

patógenos oportunistas, contaminantes de alimentos e em processos biotecnológicos, por

isso a identificação desse fungo é essencial em nível de espécie.

Para atividades enzimáticas da CMCase, os isolados 12-INS(A) e 11-A/C

apresentaram maior atividade enzimática em relação aos demais. A atividade especifica da

CMCase em relação à β-glucosidase mostrou maior produção nos isolados citados, sendo

que os mesmos não mostrarm resultados significantes quanto à produção da β-glicosidase.

Os maiores produtores de CMCase foram os isolados 12- INS(A) e 11-A/C

classificados como Aspergillus sp. Os Aspergillus são representados por mais de 200

espécies e comumente são isolados do solo, vegetais ou como patógenos oportunistas.

Entre estes, diversas linhagens produzem compostos com atividade biológica de

importância econômica, propriedade que contribui para o impacto desses fungos nos

diversos setores industriais, na agricultura e medicina (Asan, 2004; Samson, 2007;

Stephenson, 2010).

80

Na indústria alimentícia, os fungos Aspergillus são muito utilizados, porém,

somente aqueles reconhecidos como mais seguros assim como: Generally Regarded As

Safe, por não serem fontes de compostos tóxicos, além de produzirem altos níveis de

compostos com atividade biológica como enzimas, em particular pectinase, protease,

celulases, biocatalizadores de grande valor alimentício. Devido à importância

biotecnológica de Aspergillus, várias pesquisas já estão sendo concretizadas e em

desenvolvimento focalizando o uso industrial desses fungos e estratégias de estudos

taxonômicos.

Conclusões

Foi possível perceber a riqueza fúngica associada aos cupins, entre os quais, fungos

do gênero: Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp. Fusarium sp e Xylaria sp.,

além de outros ainda não identificados.

As atividades enzimáticas da celulase total (FPase), β-glicosidase e endoglucanase

(CMCase) dos isolados 11-A/C, 33-INS(S.A), 37-C/C, 12-INS(A), 32-INS(A), 40-T/C, 18-

C/C 35-A/C, 15-T/C e 04-T/C foram significativas no transcorrer dos testes enzimáticos.

A atividade da FPase mostrou-se maior em relação a β-glicosidase e CMCase.

Somente os isolados 15-T/C e 18-C/C não apresentaram atividade enzimática de

FPase, porém mostraram atividades significantes para β-glicosidase e CMCase.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas FAPEAM pela concessão da

bolsa.

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83



Avaliação da capacidade de produção de biossurfactantes e degradação

de petróleo por isolados de rizobactérias

Brito L.L.1, Menezes N.C.

2, Minelli-Oliveira C.

1, Cáuper F.R.M.

3, Moreira F.W.

4, Oliveira

L.A.4

1PG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas,





[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

Resumo

A biorremediação é um processo que utiliza microrganismos que degradam e

transformam compostos orgânicos, como o petróleo. É importante testar microrganismos

com capacidade para degradar ou que auxiliem na solubilização do petróleo como forma

de minimizar os danos causados por derrames desse poluente. Esse trabalho teve como

objetivos testar a capacidade de 7 isolados e 3 consórcios de rizobactérias em degradar

petróleo em meio líquido, avaliando sua capacidade quanto à produção de biossurfactantes.

A metodologia de teste foi qualitativo utilizando do colapso da gota, que consistiu da

adição de 1µL de suspensão microbiana padronizada a 105 UFC.mL

-1 dispostas

separadamente em placas de multipoços previamente preenchidos com 2,0 mL de meio

nutricional SYM (sais do meio YMA) líquido e 1 gota de petróleo, com avaliação a cada

24 horas. As rizobactérias INPA R692, INPA, R702, INPA R735, INPA R759, INPA

R762, INPA R764 e INPA R785 e os consórcios 1, 2 e 3 possuem capacidade para

degradar o petróleo utilizando-o como fonte de carbono, mesmo não havendo formação de

biossurfactantes. O consórcio 3, formado pelas rizobactérias INPA R759, INPA R762,

INPA R764 e INPA R785, foi o único em que houve a dispersão total da gota de petróleo.

Essas bactérias demonstraram potencial para serem utilizadas no processo de

biorremediação de petróleo.

Palavras-chave: Biorremediação, Petróleo, Rizobactérias, Amazônia.

Introdução

Atualmente existe uma enorme preocupação quanto ao uso sustentável dos recursos

naturais. A grande demanda pelo petróleo poderá acarretar em sua escassez e a extração e

produção deste composto são atividades de alto risco ambiental.

A poluição causada por hidrocarbonetos constitui séria preocupação ambiental e de

saúde, merecendo maior investimento em tecnologias compatíveis para sua remediação. Os





84

maiores problemas são os danos ambientais causados por derrames acidentais e descarga

de petróleo ou de resíduos oleosos intencionalmente descartados (Lai et al., 2009).

A biorremediação é um processo de tratamento que utiliza microrganismos que

degradam e transformam compostos orgânicos, como o petróleo, existentes nos solos

contaminados, aquíferos, lodos e resíduos sólidos, em compostos menos complexos e

geralmente mais facilmente degradáveis (Wetler-Tonini et al., 2010). A capacidade dos

microrganismos de degradar compostos orgânicos é cientificamente reconhecida e vem

sendo utilizada ao longo do tempo em processos de tratamento biológico. Neste contexto,

bactérias aeróbicas e anaeróbicas vêm sendo utilizadas com sucesso em diversas técnicas

para atenuar naturalmente, bioaumentação, bioestimualação, produção de biossurfactantes,

entre outras.

Biosurfactantes são metabólitos produzidos por uma grande variedade de bactérias,

leveduras e fungos filamentosos que podem aumentar a disponibilidade dos

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) a estes microrganismos degradadores,

auxiliando na solubilização do poluente, além de apresentarem vantagens como baixa

toxicidade, natureza biodegradável e eficácia em amplas variações de temperatura, pH e

salinidade (Maniasso et al., 2001; Tabatabaee et al., 2005). Dentre esses, as rizobactérias

têm se mostrado capazes de degradar o petróleo, gasolina e óleo diesel (Brito et al., 2015,

2017; Oliveira et al., 2017 a,b), sendo altamente promissoras para uso na descontaminação

de ambientes contaminados por esses compostos orgânicos por fixarem o nitrogênio

atmosférico e não serem patogênicas aos animais e às plantas.

Diante disso, torna-se fundamental selecionar microrganismos com capacidade para

degradar ou que auxiliem na solubilização do petróleo como forma de minimizar os danos

causados por derrames desse poluente. Portanto, esse trabalho teve como objetivos testar a

capacidade de isolados de rizobactérias em degradar petróleo e seus derivados em meio

líquido e avaliar o potencial desses isolados quanto à produção de biossurfactantes,

baseando-se na redução da tensão superficial e aumento da atividade emulsificante.

Material e Métodos

Foram utilizados sete isolados de rizobactérias (INPA R692, INPA, R702, INPA

R735, INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785 da Coleção de Microbiológica-

INPA, selecionados previamente em testes anteriores e três tipos de consórcios diferentes,

onde o potencial das cepas identificadas para degradar derivados do petróleo e produzir

85

biossurfactantes foi analisado mediante o teste qualitativo do colapso da gota, segundo

Boduor e Miller-Maier (1998), que consistiu da adição de 1,0 µL de suspensão microbiana

padronizada a 105 UFC.mL

-1, foram dispostas separadamente em placas de multipoços

previamente preenchidos com 2,0 mL de meio nutricional SYM (sais do meio YMA)

líquido e 1 gota de petróleo. Foram feitas avaliações visuais a cada 24 horas durante 6 dias.

Quando houve o colapso da gota de petróleo, formação de microemulsões, o resultado foi

considerado positivo, avaliadas pela comparação com os poços em que foi inoculado 1 μL

de água destilada estéril utilizada como controle negativo. Foram selecionados 7 isolados e

3 consórcios, sendo: Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA

R702 e INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).

Neste teste, as suspensões de microrganismos em meio YMA líquido foram

aplicadas ao petróleo para formar microemulsões, fazendo com que as moléculas polares

da água repelida pela superfície hidrofóbica do petróleo interajam entre si. Foi adicionada

água destilada estéril como controle em substituição aos microrganismos. Nas placas de

multipoços onde foram realizados os testes, a vertical foi enumerada de um a seis, sendo

cada número uma rizobactéria e na horizontal, a quadruplicata do teste (Figura 1).


Na placa 1 estão as rizobactérias (INPA R692, INPA R702, INPA R735, INPA

R759, INPA R762 e INPA R764), na placa 2, INPA R785), Consórcio1, Consórcio2 e

Consórcio3). Os resultados demonstraram que não houve formação de microemulsões,

apontando que esses isolados não produziram biossurfactantes. No entanto, houve

degradação da gota de óleo pela quantidade observada em cada poço, que a cada dia se

mostrou menor, com uma tonalidade cada vez mais clara.

A tonalidade do petróleo nos tratamento foi avaliada 24 horas. A tonalidade mais

clara ocorreu onde se inoculou os isolados INPA R785 e Consórcio1 (Tabela 1). Todos os

tratamentos, com exceção da INPA R692 apresentavam tonalidade mais clara do óleo em

48h. A partir das 72hs de avaliação, todos os tratamentos apresentaram dispersão da gota

de óleo para as bordas dos poços, enquanto que o Consórcio 3 mostrou total dispersão do

petróleo após 144h de avaliação.

86

Figura 1 – Teste qualitativo do colapso da gota

Tabela 1. Descoloração do DCPIP utilizando manitol como fonte de carbono. Isolado 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas 144 horas

Controle 1 1 SD SD SD SD

CMINPA R692 1 1 D D D D







C01 2 2 D D D D

C02 1 2 D D D D

C03 1 2 D D D DT

Tonalidades: 1= normal, 2= mais clara; SD= Sem dispersão da gota; D = dispersão da gota; DT =

dispersão total da gota.

A influência da fonte de carbono na produção de biossurfactante por diferentes

cepas de microrganismos tem sido bastante estudada. A literatura aponta uma ampla

diversidade entre as fontes de carbono (Fontes et al., 2008; Brito, 2011).

Silva et al. (2010) isolaram 112 colônias de bactérias a partir de sedimento de um

manguezal do Estado do Rio de Janeiro e verificaram que 59 produziram biossurfactante

(aproximadamente 53%). Percentuais de degradação ainda maiores foram descritos por

Catter et al. (2007) quando descreveram que 13 cepas identificadas (12 espécies de

bactérias) e avaliadas pelo método qualitativo do colapso da gota, todas (100%) mostraram

1 2

87

capacidade de produzir surfactantes, sendo que sete (53,8%) delas excretaram-no para o

meio de cultura.

Valores semelhantes já tinham sido descritos por Tugrul e Cansunar (2005), que

utilizaram a mesma metodologia para demonstrar a capacidade de produção de

biossurfactantes por microrganismos coletados na Universidade de Hacettepe na Turquia.

Safary et al. (2010) demonstram a capacidade de produção de biossurfactantes por 10

colônias de bactérias isoladas do Mar Cáspio no Irã. De acordo com Bodour et al. (2003),

estudos sugerem que a produção destes metabólitos aumentam a disponibilidade dos

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), constituindo uma importante ferramenta

para a sobrevivência destes organismos em ambientes contaminados.

Conclusões

As rizobactérias INPA R692, INPA R702, INPA R735, INPA R759, INPA R762,

INPA R764, INPA R785 e os consórcios 1, 2 e 3 possuem capacidade para degradar o

petróleo utilizando-o como fonte de carbono, mesmo não havendo formação de

biossurfactantes.

O consórcio 3, formado pelas rizobactérias INPA R759, INPA R762, INPA R764 e

INPA R785, foi o único tratamento onde ocorreu a dispersão total da gota de petróleo.

Essas bactérias demonstraram potencial para serem utilizadas no processo de

biorremediação de petróleo.

Agradecimentos

Ao INPA, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro para a

realização da pesquisa.

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89



Biodegradação de petróleo por isolados de rizobactérias

Brito L.L.1, Menezes N.C.


1, Cáuper F.R.M.

3, Moreira F.W.

4, Oliveira

L.A.4







[email protected]

Resumo

O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outros compostos. A

contaminação ambiental por esta substância e por seus derivados causa impacto ecológico,

que vêm sendo minimizado por técnicas de remediação. A biorremediação é uma dessas

técnicas que emprega microrganismos ou suas enzimas para destoxificar ambientes

contaminados. O estudo da população microbiana do solo poderá ter grande valor

econômico para a biorremediação. Estudos já realizados com alguns grupos de

rizobactérias mostraram que apresentam a habilidade de usarem petróleo como fonte de

carbono e, por serem não patogênicos a animais e plantas, apresentam potencial de uso na

biorremediação de ambientes contaminados com esse produto. Este trabalho teve como

objetivo testar a capacidade de isolados de rizobactérias em degradar petróleo e seus

derivados, indicando os mais aptos para serem utilizados no processo de biorremediação de

solos contaminados com petróleo. A metodologia utilizada foi a da técnica do indicador

redox 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP) com duas fontes de carbono: manitol e petróleo.

Os resultados indicam diferenças significativas entre as velocidades de biodegradação do

manitol e petróleo pela ação dos microrganismos utilizados. Os isolados INPA R702,

INPA R759, INPA 764 e o consórcio C01 (todas as bactérias) foram os que se

apresentaram os mais promissores, por degradarem o petróleo mais rapidamente.

Palavras-chave: Biorremediação, Petróleo, Rizobactérias, Enzimas.

Introdução

O petróleo bruto e produtos do petróleo são misturas complexas de estruturas variáveis que

exibem uma ampla variedade de propriedades físicas, compreendendo os compostos de

hidrocarbonetos, responsável por 50-98% do total da composição, e os compostos sem

hidrocarbonetos, contendo enxofre, nitrogênio, oxigênio e vários metais (Tyagi et al.,

2011)





90

A presença desses compostos no solo e sedimentos, causado principalmente por

derrame acidental ou descarte irregular, despertou grande preocupação em autoridades

ambientais e pesquisadores, uma vez que, comprometem a sobrevivência de muitas

espécies, e ainda estão associados com o aumento de incidência de diversos tipos de

cânceres no homem (Weber, 2013). Esses compostos podem causar uma gama de ameaças

para a saúde humana e ambiental, alterando o equilíbrio ecológico (Cohen et al., 2013)

Na tentativa de fazer reparo adequado em áreas contaminadas, utiliza-se uma

técnica muito explorada nas últimas décadas conhecida como biorremediação. Essa

tecnologia compreende o processo de transformação e/ou degradação de compostos tóxicos

para torná-lo ecologicamente inofensivo. Esse processo é feito através do emprego de

microrganismos inerentes ou não ao próprio meio ambiente e adaptáveis ao produto

contaminante. A eficiência da biorremediação é limitada se as condições fisíco-química

não forem favoráveis à sobrevivência e à atividade dos microrganismos degradadores. É,

portanto, necessário, um rigoroso controle e definição de parâmetros para aplicação dessa

técnica (Jacques, 2010).

Trabalhos realizados constataram que os diferentes compostos de hidrocarbonetos

nem sempre são degradados em igual proporção pelo mesmo microrganismo, defendendo

assim, a ideia de que cada espécie é responsável por degradar um tipo de componente do

óleo fazendo-se necessário o uso de consórcios para melhorar a eficiência da

biorremediação (Weber, 2013).

A população microbiana do solo e seu estudo pode conduzir à descoberta de

estirpes de grande valor econômico para serem usadas na biorremediação de ambientes

contaminados com compostos de petróleo, visto que podem mostrar maior eficiência,

competitividade e tolerância às condições de estresse. Estudos já realizados com grupos de

rizobactérias mostraram a habilidade de usarem petróleo, gasolina e óleo diesel como fonte

de carbono (Brito et al., 2015, 2017; Oliveira et al., 2017 a,b) e, por serem não patogênicos

a animais e plantas, apresentam potencial de uso na descontaminação de ambientes

impactados com esse contaminante ou seus derivados, o que poderá ter grande valor

econômico e ambiental.

Material e Métodos

A avaliação do potencial de degradação de derivados de petróleo em meio líquido

pelos isolados foi realizada através da técnica do indicador redox 2,6-diclorofenol-

91

indofenol (DCPIP), segundo Hanson et al. (1993). O princípio deste teste é que durante a

oxidação microbiana dos hidrocarbonetos, elétrons são transferidos até aceptores (como

oxigênio e nitrato) e ao incorporar um aceptor de elétron como o DCPIP ao meio de

cultura, é possível averiguar a capacidade dos microrganismos em utilizar hidrocarbonetos

como substrato pela observação da mudança de cor do DCPIP de azul (oxidado) para

incolor (reduzido) (Mariano et al., 2007).

Esse teste foi realizado através da transferência de 2 mL de suspensão bacteriana

das placas de Petri para erlenmeyers de 125 mL, contendo 50 mL de meio YM líquido,

deixando-os em mesa agitadora a 75 rpm a 30 °C por 48 horas. Após o crescimento

bacteriano, fez-se a contagem de células em câmara de Neubauer para padronização das

bactérias a 105

células mL-1

. Foram selecionados 7 isolados e 3 consórcios, sendo:

Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e INPA R735) e

Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).

O ensaio foi realizado em tubos de ensaio previamente estéreis, contendo 7,5mL de

meio YM líquido (Vincent, 1970), 400μL do DCPIC, 25μL de derivado de petróleo (diesel,

querosene gasolina e nafta), fornecido pela REMAN e óleo lubrificante e 100μL de inóculo

padronizado a 105 UFCmL

-1 de isolados de rizobactériasmL

-1, sendo determinado o

número de células em Câmara de Neubauer. O experimento foi realizado em triplicata,

com três tratamentos controle: dois controles negativos, um contendo meio mineral YM,

indicador DCPIP e derivado de petróleo (óleo diesel, querosene gasolina, nafta e óleo

lubrificante) o outro com meio YM e DCPIP. O controle positivo continha meio mineral

YM, indicador DCPIP e inóculo de isolados de rizobactérias. Os tubos de ensaio foram

incubados a 30ºC e a cada 24 horas foi observado o desaparecimento da coloração azul do

indicador DCPIP (forma oxidada) para a incolor (forma reduzida) (Mariano et al., 2007). A

leitura positiva foi dada com a atribuição de notas após estes tempos, pela descoloração do

DCPIP, onde:

Nota 1: Coloração Total; Nota 2: Início da Descoloração; Nota 3: Descoloração Parcial

Nota4: Descoloração Quase Total; Nota 5: Descoloração Total.

Foram retiradas a cada 24 horas, por um período de seis dias, para análise

quantitativa, alíquotas, onde foram quantificadas a biodegradação em fontes de carbono

distintas e DCPIP em Espectrofotometria em 465 nm. O delineamento foi em parcelas

subdivididas de 11 x 7 x 3, sendo cada tratamento representado pelas estirpes e consórcios

utilizados e em sete tempos diferentes (0, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas), contendo três

repetições cada. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), pelo teste F

92

e as médias dos tratamentos ao teste Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade,

utilizando o programa ASSISTAT.


Esse teste mostra a capacidade de rizobactérias em utilizar hidrocarbonetos como

substrato utilizando o indicador redox diclorofenol indofenol (DCPIP), observando a

mudança de cor do azul (oxidado) para incolor (reduzido). Esta mudança oscila entre

coloração total e descoloração total. A leitura desse teste foi realizada durante um período

de seis dias em intervalos de 24 horas, onde foi observada a redução total do DCPIP.

Segundo Cruz et al. (2013a), após a oxidação total do DCPIP o meio volta a ficar azul

novamente por ser um indicador reversível. Para a realização desse teste, foram utilizadas

fontes distintas de carbono como manitol e petróleo. A tabela 1 mostra os resultados de

descoloração visual utilizando-se a fonte de carbono manitol, indicando que após 24 horas

de incubação, não ocorreu descoloração nas amostras.

Tabela 1. Avaliação visual relacionada à descoloração do DCPIP utilizando

manitol como fonte de carbono. Isolado 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas 144 horas

Controle 1 1 1 1 1 1

INPA R692 1 1 1 4 5 5

INPA R702 1 1 5 5 5 5

INPA R735 1 1 2 2 2 2

INPA R759 1 1 1 3 3 3

INPA R762 1 1 5 5 5 5

INPA R764 1 1 5 5 5 5

INPA R785 1 1 4 4 5 5

C01 1 3 5 5 5 5

C02 1 2 5 5 5 5

C03 1 1 5 5 5 5

Obs.: Notas 1: Coloração Total; 2: Início da Descoloração; 3: Descoloração Parcial; 4: Descoloração Quase

Total; 5: Descoloração Total. Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e

INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).

Com 48 horas, apenas o Consórcio 1 apresentou descoloração parcial e o Consórcio

2, coloração quase total. No decorrer das horas, os tratamentos apresentaram alteração na

descoloração e, após 144 horas de incubação, oito tratamentos apresentaram descoloração

total. Esse resultado era esperado, pois o manitol é tradicionalmente usado para isolar e

para os estudos de crescimento desse microrganismo em laboratório (Vincent, 1970).

93

Com relação à descoloração usando petróleo, a ação da bactéria INPA R702

resultou na descoloração total já nas primeiras 24 horas de incubação. Um dado relevante

foi que com 48 horas de incubação, a ação das bactérias INPA R702 ou INPA R764

degradou totalmente o petróleo, indicando-as como as com os maiores potenciais de

degradação desses hidrocarbonetos. Exceto o tratamento controle e os com as bactérias

INPAR762 e INPA R785 todos os demais tratamentos atingiram, até seis dias, a nota

máxima de descoloração (INPA R692, INPA R702, INPA R735, INPA R759, INPA R764,

C01, C02 e C03). Esses resultados confirmaram que essas bactérias ou seus consórcios

mostraram capacidade de degradar totalmente o petróleo durante o período de incubação.

(Tabela 2).

Tabela 2. Avaliação Visual relacionada a descoloração do DCPIP utilizando

petróleo como fonte de carbono. Isolado 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas 144 horas

Controle 1 1 1 1 1 1

INPA R692 1 1 1 4 5 5

INPA R702 5 5 5 5 5 5

INPA R735 1 2 2 5 5 5

INPA R759 1 4 4 5 5 5

INPA R762 1 1 1 1 1 1

INPA R764 1 5 5 5 5 5

INPA R785 1 2 2 2 2 2 C01 1 4 5 5 5 5

C02 1 1 1 2 4 5

C03 1 3 3 5 5 5

Obs.: Notas 1: Coloração Total; 2: Início da Descoloração; 3: Descoloração Parcial; 4: Descoloração Quase

Total; 5: Descoloração Total. . Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e

INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).

Além da avaliação visual dos sete isolados de rizobactérias e seus consórcios com

DCPIP, foi realizada ainda uma avaliação quanto à biodegradação usando a absorbância

em espectrofotometria, quando submetidos a fontes de carbono distintas (manitol e

petróleo).

Tendo a absorbância do controle (branco) como referência, e o manitol como fonte

de carbono (Tabela 3) no tempo de 0 horas, observou-se que os tratamentos com as INPA

R692 e INPA R762 apresentaram as maiores absorbâncias (0,769 e 0,696) respectivamente.

Ao se analisar os dados de absorbância após 24 horas de incubação, observou-se que

apenas os tratamentos com os isolados INPA R759, INPA R764 e o consórcio C01 não se

diferenciaram estatisticamente do controle. Os demais tratamentos já apresentaram

capacidades de degradação do manitol. O máximo de diferenciação dos tratamentos em

relação ao controle ocorreu na avaliação das 48 horas de incubação, quando todos eles

94

foram significativamente diferentes do controle, indicando que esse tempo de avaliação

seria o mais adequado para uma melhor interpretação dos resultados. Com o tempo, essas

diferenças foram mudando, devido à reversão da coloração do indicador redox DCPIP.

Tabela 31. Avaliação da biodegradação em espectrofotômetro por isolados de rizobactérias com

manitol como fonte de carbono.

Isolados 0 hora 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

120

horas 144 horas

Absorbância (465 nm)

Branco 0,661 bA 0,663 aA 0,666 aA 0,675 aA 0,646 aA 0,707 aA 0,637 aA

INPA R692 0,769 aA 0,573 bB 0,234 bE 0.356 bD 0.467 bC 0,573 bB 0,725 aA

INPA R702 0,633 bA 0,298 cB 0,265 bB 0.337 bB 0.393 bB 0.744 aA 0,668 aA

INPA R735 0,616 bA 0,181 dE 0,299 bD 0,666 aA 0,419 bC 0,522 cB 0,367 bC INPA R759 0,607 bA 0,661 aA 0,230 bC 0,366 bB 0,355 cB 0,625 bA 0,649 aA

INPA R762 0,696 aA 0,515 bB 0,253 bD 0,383 bC 0, 316 cD 0,554 bB 0,671 aA

INPA R764 0,630 bA 0,674 aA 0,249 bC 0,348 bC 0,304 cC 0,527 cB 0,659 aA INPA R785 0,577 bB 0,530 bC 0.295 bD 0,650 aB 0,472 bC 0,823 aA 0,651 aB

C01 0,628 bB 0,669 aB 0,236 bC 0,276 bC 0,309 cC 0,773 aA 0,664 aB

C02 0,653 bB 0,490 bC 0,259 bD 0,278 bD 0,345 cD 0,774 aA 0,693 aB C03 0,674 bA 0,456 bB 0,235 bC 0,301 bC 0,249 cC 0,453 cB 0,439 bB Obs.: As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Scott-Knott ao

nível de 5% de probabilidade), considerando as minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas. . Consórcio

1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759,

INPA R762, INPA R764 e INPA R785).

Ao se analisar os dados de absorbância usando o petróleo como fonte de carbono

(Tabela 4), observaram-se resultados diferentes aos encontrados com o uso do manitol. O

máximo de degradação do petróleo em cada tratamento deve ser observado pelo menor

valor de absorbância de cada um, tendo em vista que depois, a coloração do indicador

redox DCPIP se reverte com o tempo. Assim, o referencial de degradação máxima para os

isolados INPA R692, INPA R702 e os consórcios C01 e C02 ocorreram na leitura feita 24

horas de incubação, que foram significativamente menores do que as absorbâncias

observadas por esses tratamentos nos outros tempos de avaliação. Usando o mesmo

raciocínio, a degradação máxima do petróleo quando se usou os isolados INPA R735,

INPA R759, INPA R764 ocorreram às 96 horas. Por outro lado, não se observou redução

significativa da absorbância quando se usou os isolados INPA R762, INPA R785 ou o

consórcio C03, que foram estatisticamente iguais ou superiores (INPA R785) às

absorbâncias do controle, sugerindo que não são degradadores de petróleo usando essa

metodologia como parâmetro comparativo.

95

Tabela 42. Avaliação da biodegradação em espectrofotômetro por isolados de rizobactérias com

petróleo como fonte de carbono.

Isolados 0 hora 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

120

horas 144 horas

Absorbância (465 nm)

Branco 0,647 aB 0,633 aB 0,623 aB 0,642 aB 0,621 bC 0,839 aA 0,747 aA INPA R692 0,818 aA 0,725 aA 0,723 aA 0,720 aA 0,325 cB 0,385 cB 0,630 aA

INPA R702 0,880 aAz 0,234 bD 0,614 aB 0,470 cC 0,466 cC 0,386 cC 0,424 bC

INPA R735 0,782 aA 0,747 aA 0,705 aA 0,785 aA 0,573 bB 0,870 aA 0,524 bB

INPA R759 0,864 aA 0,696 aA 0,776 aA 0,530 bB 0,407 cB 0,544 bB 0,479 bB INPA R762 0,855 aA 0,722 aB 0,796 aA 0,736 aB 0,628 bB 0,901 aA 0.654 aB

INPA R764 0,817 aA 0,731 aA 0,755 aA 0,427 cB 0,325 cB 0,434 cB 0,412 bB

INPA R785 0,831 aA 0,719 aA 0,731 aA 0,717 aA 0,572 bB 0,822 aA 0,732 aA C01 0,765 aA 0,196 bC 0,424 bB 0,369 cB 0,369 cB 0,374 cB 0,401 bB

C02 0,859 aA 0,211 bD 0,403 bC 0,586 bB 0,294 cD 0,547 bB 0,417 bC

C03 0,846 aA 0,709 aA 0,738 aA 0,749 aA 0,830 aA 0,816 aA 0,679 aA Obs.: As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Scott-Knott ao

nível de 5% de probabilidade), considerando as minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas. . Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759,

INPA R762, INPA R764 e INPA R785).

O alto índice de descoloração pode não estar associado a um número elevado de

microrganismos, isso porque alguns, quando atuam em quantidades populacionais baixas,

podem possuir boa capacidade para biodegradabilidade. Todavia, esses resultados são

semelhantes aos descritos por Souza et al. (2010), que demonstraram a capacidade de 90%

de seus isolados em degradarem a gasolina comercial. Muitos outros trabalhos envolvendo

o uso do corante DCPIP utilizaram bactérias (Mariano et al., 2008; Furlan, 2011). Cruz

(2013b), ao avaliar a capacidade de degradação de Bacillus subtilis em solo contaminado,

demonstrou através de ensaios de DCPIP, que o petróleo é menos biodegradável quando

comparado com o diesel e o biodiesel.

Lima (2010) obteve bons resultados com o teste de biodegradabilidade usando o DCPIP e

mostrou que dos 106 microrganismos isolados dos solos rizosféricos de Vismia guianensis,

Mucuna pruriens, Brachiaria decumbens e Brachiaria humidicola coletados na Província

Petrolífera de Urucu, 65 (61,32%) apresentaram potencial de degradação do petróleo após

5 dias (120 horas), sendo 25 bactérias, 27 fungos filamentosos e 13 leveduras.

Estudos relacionados ao uso de microrganismos para biorremediação de áreas

contaminadas mostram-se promissores, pois estes possivelmente são capazes de

metabolizar as estruturas químicas complexas, fazendo com que aconteça uma diminuição

dos agentes contaminantes do meio.

96

Conclusões

Os resultados indicaram diferenças significativas entre as velocidades de

biodegradação dos diferentes tipos de fontes de carbono na presença dos mesmos

microrganismos utilizados.

As rizobactérias INPA R702, INPA R759, INPA 764 e o consórcio C01 (todas as

bactérias) foram os que se apresentaram como os mais promissores, por degradarem o

petróleo mais rapidamente.

Agradecimentos

Ao INPA, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro.

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98



Produção de lacase por uma cepa de Trametes elegans coletada no

Município de Alvarães-Amazonas

Carvalho W.O.1, Fonseca N.F.

2 , Silva J.R.

3

1 Especializando em Micorobiologia Geral, Escola Superior Batista do Amazonas,

2Graduada em

Licenciatura em Ciências Biológicas, Universidade do Estado do Amazonas,3Especializando em

Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Cândido Mendes. Emails: [email protected], [email protected], [email protected]

Resumo

Vários estudos estão sendo desenvolvidos para utilização de enzimas fúngicas e poucos são

os realizados com fungos pertencentes à biodiversidade Amazônica. A lacase (p-difenol;

dioxigêniooxidoredutase EC 1.10.3.2) é uma polifenol oxidase atuante numa variedade de

doadores de hidrogênio aromáticos e espécies inorgânicas, incluindo íons Mn+2

. A ampla

gama de substratos sobre os quais a lacase pode atuar é uma característica que direciona

seu emprego na biorremediação de ambientes complexos. Dada a relevância desta pesquisa

e ressaltando o aproveitamento de resíduos, utilizou-se o resíduo da casca da castanha-do-

brasil (Bertholletia excelsa), sendo lavados, colocados em estufa elétrica a 40ºC e

triturados em moinho de facas a 60 mesh. A “farinha” foi utilizada como substrato de

crescimento em meio líquido onde o meio de cultivo foi incubado a 30ºC em fase

estacionária e em triplicata. O substrato seringaldazina foi utilizado para determinação da

enzima lacase, através do método que se baseia na oxidação do substrato enzimático

seringaldazina para sua forma de quinona. O substrato de crescimento em fase estacionária

apresentou atividade de lacase para a cepa amazônica de Trametes elegans, determinados

por espectrofotômetro de absorbância. A cepa de Trametes elegans produziu lacase usando

casca da castanha-do-brasil como fonte de carbono. A maior produção de lacase foi aos

nove dias, com 38U/L.

Palavras-chave: Biorremediação, fungos, enzimas oxidativas

Introdução

Vários estudos estão sendo desenvolvidos para utilização de enzimas fungicas em

várias aplicações industriais, e a demanda por enzimas mais estáveis, altamente ativas e

específicas tem crescido rapidamente. O interesse crescente pela enzima “manganês-

peroxidase” vem em função do seu potencial de uso na indústria de celulose e papel


99

(biopolpação e bioclarificação) assim como em processos de biorremediação (Hofrichter et

al., 1998, Breen e Singleton, 1999, Rogalski et al., 2006).

Manganês-peroxidase (MnP) é uma heme-dependente Mn extracelular enzima (E.

C. 1.11.1.13), geralmente relacionada à mineralização da lignina, produzida somente por

basidiomicetos ligninolíticos (Gold et al., 2000). Esta enzima catalisa Mn2+

para altamente

reativo Mn3+

, este estabilizado por ácidos dicarboxilicos é um mediador difusível de baixa

massa molecular, o qual oxida uma variedade de substâncias fenólicas e não-fenólicas,

incluindo lignina e poluentes tóxicos (Perez e Jeffries, 1992, Moreira et al., 1997).

Devido ao importante potencial de degradação da manganês-peroxidase (MnP), há

interesse geral em produzí-la biotecnologicamente. Pesquisas vêm sendo realizadas

buscando-se conhecer os requisitos nutricionais, fatores fisiológicos e ambientais

relacionados à reativação dos sistema MnP e desenvolvimento de um eficiente sistema de

produção para operações em larga escala (Bonnarme e Jeffries, 1990), Gold e Alic, 1993).

Poucos ou raros são os estudos feitos nesse sentido com fungos pertencentes à

biodiversidade amazônica. A lacase (p-difenol; dioxigêniooxidoredutase EC 1.10.3.2) é

uma polifenol oxidase hidrogênio aromáticos e espécies inorgânicas, incluindo ions Mn+2

(Palma, 2003). Segundo esse autor, estudos têm mostrado que a produção enzimática por

Fermentação Semi-Sólida (FSS) apresenta bons níveis de atividade e propriedades

funcionais adequadas às aplicações industriais quando comparada com a Fermentação

Submersa (FSm) (Palma, 2003).

De acordo com Pandey (2003), no se refere à escolha do substrato, para este

experimento foi escolhido a casca da semente da Castanha do Brasil (Bertholletia excelsa).

Buscando encontrar alternativas para a sua utilização, neste experimento foi utilizada a

farinha feita a partir deste resíduo, onde os principais constituintes da casca da castanha-

do-Brasil (Bertholletia excelsa) são a lignina e a holocelulose que é constituída pela

celulose e hemicelulose (Bonelli et al., 2001).

O grupo dos basidiomicetos inclui os fungos que produzem esporos (basidiósporos)

de origem sexuada em uma estrutura especializada denominada de basídio e popularmente

chamados de cogumelos e orelhas de pau. Desta forma, a cepa escolhida para o

experimento foi a Trametis elegans, que é um basidiomiceto, e tem a sua carne dura

branca; sua tampa esbranquiçada, que é irregular para o ponto de ligação e mais suave em

direção à margem, e sua função ecológica, que serve para decompor a madeira morta de

folhosas (Gugliota e Capelari, 1998).

100

Dada a relevância da presente pesquisa e ressaltando o aproveitamento de resíduos,

se faz necessário a busca incrementar pesquisas no que se refere à produção e atividade de

enzimas peroxidases.

Através deste estudo buscou-se avaliar a atividade enzimática de uma cepa

amazônica de Trametes elegans, determinando a atividade de lacase utilizando como fonte

de carbono o resíduo da casca de Bertholletia excelsa, avaliando a atividade enzimática na

temperatura de 30°C e pH 5,0, verificando a secreção de lacase na fase estacionária.

Material e Métodos

A Coleta dos basidiocarpos (Trametes elegans) foi realizada no mês de março de

2011, durante o período de verão no perímetro rural do município de Alvarães-Am, na

comunidade de Nogueira (Lat.: 3°, 30’, 13”; Long.: 64°, 78’, 4”)

Estes foram coletados e acondicionados em sacos de papel, previamente

identificadas, registrados, anotados os substratos e encaminhadas ao laboratório de

Biologia do Centro de Estudos Superiores de Tefé – CEST/Universidade do Estado do

Amazonas – UEA, para então serem devidamente isolados e recebidos às respectivas

metodologias e códigos de identificação, sendo que uma amostra foi enviada a coleção de

Fungos do Mestrado em Biotecnologia para identificação taxonômica.

Utilizou-se o meio sintético BDA (Batata, Dextrose e Agar), sendo 38g para 1000

mL de água destilada e com o auxilio de um bastão de vidro foi dissolvido em Enlermeyer

de 1.000 mL. Posteriormente foi vedado e levado para autoclave a 121 0C por 20 min a 1

atm para esterilização final. O meio foi vertido em placas de Petri 90x15mm.

Dos basidiocarpos coletados foi retirada a amostra de fungo (30 mm), utilizada para

inoculação, a qual passou por um procedimento de assepsia, que consta das seguintes

etapas: mergulhar a amostra por 2 minutos em álcool 70%, em seguida em hipoclorito de

sódio a 3%, logo após deixou-se o inóculo imerso por 2 minutos em água destilada . Esses

procedimentos foram executados em ambiente estéril (interior da câmara de fluxo laminar

adaptado) (Bononi e Trufem 1985).

Após estes procedimentos, as amostras inoculadas, seguindo a metodologia

proposta por Castro e Silva (1996), colocadas em placas de Petri 90x15mm com meio com

BDA, posteriormente lacradas com fita plástica do tipo Parafilm e devidamente

identificadas. As placas de Petri inoculadas foram incubadas em BOD a 30º C ( 2ºC) para

o crescimento micelial.

101

As cascas de Castanha do Brasil foram coletadas na área da comunidade de

Nogueira no Município de Alvarães. Elas foram lavadas e colocadas em estufa elétrica a

40ºC e em seguida passadas em moinho de facas a 60 mesh. A farinha formada foi

autoclavada a 1,5atm por 15 min a 121° C, para eliminação de possíveis microrganismos

presentes na casca. A “farinha” produzida foi utilizada como substrato de crescimento em

meio líquido.

Foram retirados três fragmentos fúngicos de aproximadamente 5mm de diâmetro

das bordas das placas e transferidos para o meio de cultivo composto por 1000 mL de água

destilada estéril, 1g de glicose e farinha da casca da castanha na concentração 10g/L em

erlenmeyer com capacidade de 150 mL, os quais posteriormente foram incubados em

estufa BOD em condição estacionária à temperatura de 30°C. Todos os experimentos

foram realizados em triplicata.

Foram determinadas as atividades de lacase dos fungos Trametes elegans e na

concentração de 2% de farinha da casca da castanha testada nos períodos de 03, 06 e 09

dias. Para a determinação das atividades da enzima foi utilizado o aparelho

espectrofotômetro de absorbância para leitura das amostras coletadas, onde foi posto o

substrato seringaldazina juntamente com a mistura reacional em uma cubeta.

As alíquotas foram enviadas ao laboratório de biorgânica da Universidade do

Estado do Amazonas – Mestrado em Biotecnologia e Recursos Naturais / MBT, situada em

Manaus, , para serem determinadas em espectrofotômetro.

O substrato seringaldazina foi utilizado para determinação da enzima lacase,

utilizando-se o método proposto por Szklarz et al. (1989), que baseia-se na oxidação do

substrato enzimático de seringaldazina para sua forma de quinona. A mistura reacional foi

composta de 1 mL da amostra filtrada; 0,95 mL tampão tartarato de sódio pH 4,5; 0,1mL

seringaldazina (produção estoque de 5mg/ 1mL de etanol) e 0,1mL de água destilada,

sendo monitorado o aumento da absorbância em 525 nm durante 60 segundos, utilizando-

se o coeficiente de absorção ɛ= 6,5x104 cm¹.M¹.

Uma unidade de atividade enzimática corresponde à quantidade de produto (µmol)

liberada em um minuto por mL de amostra (U= µmol. mim¹).

No presente estudo, foi possível determinar a cinética enzimática da enzima lacase

obtida a partir da cepa do fungo Trametes elegans, sob a condição estacionária e utilizando

a concentração de 2% utilizando o suplemento do resíduo da casca da castanha do Brasil

(Bertholletia excelsa ) como fonte de carbono, fermentados em pH 5,0 e ainda dentro de

102

um intervalo de tempo de 09 dias de atividade. A atividade enzimática foi calculada

utilizando a metodologia proposta por Ander e Eriksson (1976).

Atividade enzimática = Δ ABS*10

6

ɛ.R ΔT

onde:

ɛ= coeficiente de absorção de cada substrato, conforme dados da literatura;

Δ ABS= Absorção final – Absorção inicial;

R= Volume em ml

Δt= tempo de reação em minutos.


O Trametes elegans produziu a enzima lacase logo no terceiro dia de atividade,

evidenciando assim, um pico de 14,67 U/L de cinética enzimática, resultado este que foi

potencializado na segunda leitura da amostra, no sexto dia de atividade. Ressalta--se que

houve um acréscimo na secreção de lacase de 29,07 U/L. No nono dia de secreção houve

ainda um acréscimo evidenciando a secreção destes metabólitos, obtendo um pico

enzimático de 38,00 U/L (Figura 01).

Figura 1 - Atividade Enzimática de Lacase utilizando uma cepa amazônica Trametes

elegans.

Diversos fatores influenciam a produção de lacase e consequentemente a formação

de produtos. Pode-se destacar entre outros, a composição do meio de crescimento, tempo

de cultivo, pH, razão carbono:nitrogênio, temperatura, natureza química do substrato,

103

luminosidade e aeração (Ikehata et al., 2004). As funções biológicas da lacase nos

microrganismos ainda não estão muito claras. Em fungos há relatos sobre sua participação

no rápido crescimento celular (Leonowicz et al., 2001), esporulação (Gianfreda et al.,

1999) e degradação de lignina (Eggert et al., 1996). De acordo com Rothschild et al.,

(2002), a atividade da Lipase e da Lacase tem sido relatada em alguns fungos da podridão

branca.

Segundo Mayer e Staples (2002), do ponto de vista evolucionário, a lacase fúngica

é uma enzima bastante antiga e a ligação da atividade enzimática associada a três diferentes

sítios de cobre é um processo evolucionário muito precoce. A atividade catalítica das lacases

está relacionada à presença de quatro átomos de cobre por unidade de proteína, sendo os

mesmos denominados de acordo com suas características espectrofotométricas (Claus,

2004), Leontievsky et al., 1997).

Entre a diversidade de compostos oxidados pela lacase, a oxidação da

seringaldazina na ausência de H2O2 é típica para identificação de lacase fúngica. A

seringaldazina é um substrato fenólico dimetoxilado apresentando em sua estrutura dois

átomo de nitrogênio ligados por uma dupla ligação, caracterizando assim um composto

azo. A reação com a seringaldazina gera inicialmente um radical livre. Em seguida ocorre

a liberação do segundo elétron através de ação enzimática e/ou desprotonoção,

formando uma quinona de coloração púrpura intensa e que aparentemente não é

propensa à polimerização (Thurston, 1994), (Figura 2).

Figura 2 - Reação de oxidação da seringaldazina até formação da correspondente

quinona.

104

Outro ponto que merece nossas considerações, foi a faixa de pH 5,0 utilizada neste

estudo por exemplo: a faixa de pH, ótima para basidiomicetos esta entre 4,0 e 5,0.

Portanto, estes organismos tem preferência por meios ácidos (Damasceno, 2009). Cabe

ainda mencionar a composição do resíduo da casca da castanha do Brasil (Bertholletia

excelsa), onde seus principais constituintes são a lignina e a holocelulose que é constituída

pela celulose e hemicelulose (Bonelli et al., 2001).

Conclusões

A cepa de Trametes elegans produziu lacase usando casca da castanha-do-brasil

como fonte de carbono.

A maior produção de lacase foi aos nove dias, com 38U/L.

Agradecimentos

À FAPEAM, CNPq, CAPES e UEA/CEST pelo apoio financeiro e de infraestrutura.

Referências

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107



Potencial de produção de amilase por rizóbios isolados de nódulos de

feijão caupi cultivado em solo da Amazônia

Cáuper F.R.M.1, Brito L.L.


2, Oliveira L.A.

3, Costa S.S.

3, Menezes

N.C.4

1Universidade Paulista,


3 Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia, 4Mestre em Agricultura no Trópico Úmido, INPA. E-mails:



Resumo

As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande

importância na biotecnologia. O espectro de aplicação das amilases tem cada vez mais se

expandido para outras áreas, incluindo as clínicas farmacêuticas, médicas e químico-

analíticas. Entre um grande número de microrganismos não patogênicos capazes de

produzir enzimas úteis, os rizóbios são particularmente interessantes devido a seu fácil

cultivo e elevada produção de enzimas extracelulares de grande potencial industrial. Esse

trabalho teve como objetivo, avaliar a capacidade de rizóbios em produzir Amilase. Para a

obtenção de 12 isolados de rizóbios, foram realizadas coletas de nódulos presentes nas

raízes de caupi (Vigna unguiculata). Foram realizados testes que verificaram a capacidade

de crescimento desses isolados e a produção de amilase. Os isolados de rizóbios que

apresentaram maiores crescimentos no meio contendo amido como fonte de carbono foram

UNIP R1, UNIP R2, UNIP R4, UNIP R5, UNIP R6, UNIP R7, UNIP R8, UNIP R11 e

UNIP R12. Os isolados com maiores Índices de Degradação de Amido (IDA) foram UNIP-

R6 e UNIP-R8, demostrando que foram superiores aos demais como produtores de

amilases.

Palavras-chave: Enzimas, Amido, Vigna unguiculata.

Introdução

As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande

importância na biotecnologia. Além de serem usadas como aditivos em detergentes, elas

são empregadas na sacarificação do amido e nas indústrias de alimentos, fermentação,

papel e têxtil. O espectro de aplicação das amilases tem cada vez mais se expandido para

outras áreas, incluindo as farmacêuticas, médicas e químico-analíticas (Pandey et al.,

2000).

Entre os vários parâmetros que estimulam a produção de amilases, as condições de

crescimento microbiano e a fonte de carbono usados no meio de cultivo tem recebido



108

atenção especial (Haq et al., 2002). A dextrina, frutose, glicose, lactose, maltose, amido

solúvel, além de outros encarecem sua produção. No meio de cultivo, esses substratos

podem ser substituídos por subprodutos agrícolas de baixo custo, o que torna o processo de

produção dessas enzimas mais econômica. Existem várias fontes para a produção de

amilases, tais como bactérias, fungos e plantas. O Bacillus spp. é considerado a mais

importante fonte de amilase. As Beta-amilases são geralmente obtidas a partir de fontes

vegetais. Os fungos filamentosos aparentemente constituem a principal fonte de

glucoamilase (Pandey et al., 2000).

Um grande número de microrganismos não patogênicos capazes de produzir

enzimas úteis, como os rizóbios, são particularmente interessantes devido ao seu fácil

cultivo e elevada produção de enzimas extracelulares de grande potencial industrial. Estas

enzimas são aplicadas nas indústrias de detergentes, produtos de amido, de alimentos para

animais, panificação, papel e celulose, couro, produtos químicos e biomédicos. O uso de

enzimas degradantes de amido foi a primeira aplicação em grande escala das enzimas

microbianas na indústria alimentar (Bennett, 1998). Esse trabalho teve como objetivo,

avaliar a capacidade de rizóbios em produzir Amilase.

Material e Métodos

Foram realizadas coletas de nódulos presentes nas raízes feijão caupi (Vigna

unguiculata), para a obtenção de rizóbios. Após a obtenção dos nódulos, foram isoladas as

estirpes de rizóbios usando a metodologia descrita por Vincent (1970) e Somasegaran e

Hoben (1985), com modificações. Os nódulos passaram por uma desinfecção superficial

com álcool 92 % (1 minuto) e hipoclorito de sódio 10 % (4 minutos) e dez lavagens com

água estéril. Em seguida, foram pressionados com uma pinça e feitas as repicagens em

placas de Petri contendo meio YMA (yeast manitol agar). Após o isolamento, as placas

foram incubadas a 28 °C até o crescimento de colônias de bactérias para então serem

repicadas para novas placas contendo o mesmo meio e novamente incubadas até o novo

crescimento bacteriano. Os isolados obtidos foram mantidos em tubos de ensaio contendo

o meio YMA inclinado.

Para avaliar a capacidade de crescimento, foram testados 12 isolados de rizóbios,

através do método de riscagem proposto por Oliveira e Magalhães (1999) modificado,

realizados em placa de Petri contendo o meio de cultura YMA. Esse teste foi realizado em

quadruplicata. As avaliações foram feitas a cada três dias, no período de 15 dias, no qual as

109

bactérias foram mantidas em laboratório a uma temperatura de 23 – 28

oC. De acordo com o

desenvolvimento das colônias nas quatro zonas da placa (Figura 1A) foram dados valores

para o crescimento para cada isolado variando de 1 (sem crescimento visível na placa) a 4

(máximo crescimento em todas as zonas), segundo escala em faixa apresentada na Figura

1B. Com base no crescimento em placas de Petri, os isolados foram classificados como

pouco, moderado ou elevado.

Figura 1A: Zona de pontuação para avaliação do crescimento bacteriano utilizando no meio YMA

(Oliveira e Magalhães, 1999). Figura 1B: Valores para crescimento de bactérias, proposto pelo método de Oliveira e Magalhães (1999).

A caracterização morfológica das bactérias foi feita segundo Vincent (1970) e

Martins et al. (1997), onde foram observadas as seguintes características: Forma da colônia

(circular ou irregular), borda (inteira ou irregular), transparência, cor, aparência

(homogênea ou heterogênea); Aparência do muco (homogêneo ou heterogêneo) e

elasticidade (com ou sem).

A seleção de bactérias produtoras de amilase foi realizada segundo Mariano e

Silveira (2005), com modificações. As bactérias foram inoculadas em placas de Petri com

meio TSA 10% (Tripcase Soy Agar), acrescido com 1% de amido de milho. Placas foram

incubadas a 28 oC por 72 h e, em seguida, realizadas as leituras. Para tanto, foram

adicionados 5 mL de solução de Iodo (1%) e mantido por 20 min, em seguida, a solução

foi descartada e observada a presença de halo claro em torno da colônia, indicando

secreção de amilase. Os experimentos foram realizados em quadruplicata e para aquelas

linhagens que apresentaram halo visível, a atividade amilolítica foi estimada mediante um

índice enzimático (IE), que expressa a relação do diâmetro médio do halo de hidrólise e o

diâmetro médio da colônia. Baseado nos índices de degradação do amido, as bactérias

foram classificadas como estirpes com baixa (IS < 2), média (2 IS < 4), e alta

110

solubilização (IS > 4), segundo Hankin e Anagnostakis (1975). O delineamento

experimental constituiu-se de 12 tratamentos e quatro repetições.

Foi realizada a análise de variância pelo teste F e quando significativo, as

comparações de médias foram feitas pelo teste de Scott-Knott (quando comparado pelo

controle) ao nível de 5% de probabilidade, programa ASSISTAT Versão 7.7 beta 2014.


Os 12 isolados de rizóbios apresentaram características distintas em meio YMA, de

acordo com a forma, borda, transparência, aparência, cor da colônia e, aparência e

elasticidade do muco (Tabela 1).

Tabela 1. Morfologia dos 12 isolados de rizóbios

Isolados Forma da

colônia Borda Transp. Aparência

da colônia Cor da

colônia Aparência

do muco Elasticidade

do muco UNIP R1 Irregular Irregular Não Homogênea Branca Homogênea Sem

UNIP R2 Irregular Regular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem

UNIP R3 Irregular Irregular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem

UNIP R4 Circular Regular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem


UNIP R6 Circular Regular Não Homogênea Amarela Homogênea Sem


UNIP R8 Circular Regular Não Homogênea Branca Homogênea Sem

UNIP R9 Circular Regular Sim Homogênea Amarela Homogênea Sem

UNIP R10 Circular Irregular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem



Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por Hungria (1994) quando os

isolados apresentaram as características de cor, elevação, transparência e formação de

ácido e álcalis compatíveis. Essa diversidade morfológica também foi verificada por

Martins et al. (1997) estudando as características de 27 isolados de rizóbios de

Discolobium sp., nativos do Pantanal Mato-Grossense.

Ao serem analisadas as amostras durante o período de incubação em temperatura

média de 28 ºC, foi possível observar que no 3° dia de avaliação, houve diferença

significativa entre as rizobactérias, com os isolados UNIP R1, UNIP R7 e UNIP R8,

apresentando notas iguais ou próximas a 4,0 (Tabela 2).

111

Tabela 2. Crescimento de isolados de rizóbios em meio de cultura contendo amido como

fonte de carbono.

---------------------------Dias de crescimento ---------------------------

Rizóbios 3 6 9 12 15 18

UNIP R1 3,6 aA 3,8 aA 3,8 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA

UNIP R2 0,0 bC 0,2 bD 0,2 bC 0,3 bC 0,3 bC 1,1 aC

UNIP R3 0,0 aC 0,2 aD 0,3 aC 0,3 aC 0,3 aC 0,3 aD

UNIP R4 3,0 bB 3,7 aA 3,8 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA

UNIP R5 0,0 bC 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA

UNIP R6 3,0 bB 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA



UNIP R9 0,0 bC 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA

UNIPR10 0,0 cC 2,3 bB 3,3 aA 3,7 aA 3,7 aA 3,7 aA

UNIPR11 0,0 bC 0,6 bD 2,3 aB 3,0 aB 3,0 aB 3,0 aB

UNIPR12 0,0 cC 1,3 bC 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA

Médias seguidas de mesma letra, minúsculas (rizóbios) nas colunas e maiúsculas (dias) nas linhas não

diferem entre si. Foi aplicado o teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.

Na tabela 3 estão as médias dos rizóbios levando em conta todo o período de

avaliação. Os isolados que apresentaram melhores notas foram UNIP R1, UNIP R4, UNIP

R6, UNIP R7 e UNIP R8, pois, tinham notas superiores a 3,5. Em seguida, com notas

intermediárias, UNIP R5 e UNIP R9 com médias superiores a 3. As amostras com menores

médias de crescimento foram UNP R10, UNIP R11 e UNIP R12, com notas oscilando

entre 2,0 a 2,8 e as que tiveram as piores médias foram UNIP R2 e UNIP R3, com notas

inferiores a 2.

Os resultados foram similares aos obtidos por Brockwell et al. (1995), quando

descreveram que 88 isolados oriundos dos nódulos coletados em experimento de

infectividade e com base na escala de valores de 45% (40 isolados) apresentaram alto

crescimento, 21,5% baixo e 33% crescimento médio.

De acordo com Vincent (1970), os isolados procedentes dos solos salinos formaram

colônias em menos de 24 horas, o que caracteriza estirpes de crescimento rápido. Para

Stamford et al. (1996), que isolaram rizóbios de caupi, soja e jacatupé em amostras de

solos da Zona da Mata e da região Semi-árida de Pernambuco, a ocorrência de rizóbios de

crescimento lento ou rápido parece estar relacionada com aspectos ambientais, pois

112

observaram que 90% dos isolados da região Semi-árida tiveram crescimento rápido e

100% dos isolados da zona da mata, crescimento lento.

Tabela 3. Crescimento dos isolados de rizóbios em meio contendo amido.

Amostra Média de cada

amostra somando

todos os dias

Amostra Média de cada

amostra somando

todos os dias

UNIP R1 3,9 a UNIP R7 3,9 a

UNIP R2 0,4 e UNIP R8 4,0 a UNIP R3 0,3 e UNIP R9 3,2 b

UNIP R4 3,7 a UNIP R10 2,8 c UNIP R5 3,2 b UNIP R11 2,0 d

UNIP R6 3,7 a UNIP R12 2,8 c

Um microrganismo é considerado bom produtor de enzimas extracelulares quando

no meio sólido este apresente um índice enzimático (IE) ≥ 2,0 (Lealem e Gashe, 1994).

Dos isolados submetidos à avaliação com iodo em meio TSA 10% (presença de amilase),

os que apresentaram atividade amilolítica foram UNIP R1, UNIP R2, UNIP R4, UNIP R5,

UNIP R6, UNIP R7, UNIP R8, UNIP R11 e UNIP R12. Estes isolados apresentaram

formação de halo ao redor da colônia. Já os isolados UNIP R9 E UNIP R10 não foram

bons produtores de enzimas extracelulares, pois tiveram baixos índices enzimáticos. Os

isolados UNIP R8 e UNIP R6 mostraram os maiores índices enzimáticos (IE) ≥ 2,0.

Alguns autores como Stamford et al. (1998) e Oliveira et al. (2006), recomendaram

um índice enzimático ≥ 2,0, para considerar um microrganismo como produtor potencial

de enzimas em meio sólido. Com base no IE, foi observado que os isolados UNIP R9 e

UNIP R10 exibiram os menores índices amilolíticos, inferiores a 1,0.

Tabela 4. Índices amilolíticos dos isolados de rizóbios

Rizóbios IA

UNIP-R1 1,8 c UNIP-R2 1,4 c

UNIP-R4 1,7 c UNIP-R5 2,1 b

UNIP-R6 3,3 a UNIP-R7 2,3 b

UNIP-R8 3,8 a UNIP-R9 0,3 d

UNIP-R10 0,6 d UNIP-R11 2,3 b

UNIP R12 2,6 b

113

Conclusões

Os isolados de rizóbios que apresentaram maiores crescimentos no meio contendo

amido como fonte de carbono foram UNIP R1, UNIP R2, UNIP R4, UNIP R5, UNIP R6,

UNIP R7, UNIP R8, UNIP R11 e UNIP R12.

Os isolados com maiores Índices de Degradação de Amido (IDA) foram UNIP-

R6 e UNIP-R8, demostrando que foram superiores aos demais como produtores de

amilases.

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115



Produção de amilases por rizobactérias em meio contendo farinha de

babaçu

Costa S.C.F.C.1, Menezes N.C.


2, Oliveira L.A.

2

1Bolsista do PIBIC/INPA/CNPq, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

3PG

Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, E-mails: [email protected],


Resumo

As amilases vêm sendo muito utilizadas na biotecnologia para aprimorar a produção de

etanol. Diversas usinas vêm investindo em culturas contendo amido como fonte primária

para a produção do álcool. Para isso, torna-se necessário encontrar fontes biológicas de

amilases, com os microrganismos apresentando-se como uma alternativa de potencial

elevado. A Amazônia possui uma grande quantidade de microrganismos ainda

desconhecidos que podem ter esse potencial, como as bactérias encontradas nas raízes e

nódulos de leguminosas. Esse trabalho teve como finalidade isolar e testar rizobactérias

quanto à produção de amilases, utilizando a farinha do babaçu. As rizobactérias foram

coletadas de nódulos de leguminosas em solos da Região Metropolitana de Manaus. Dos

111 isolados testados, 30 foram considerados de crescimento baixo, 6 de crescimento

médio e 76 de elevado, por um período de quinze dias. Os isolados identificados como

761, INPA-046, INPA-001, ARABA 2, ARABA 3, ARABA 5, ARABA 7, ARABA 17,

MAN-3.2.2, 781 foram os que apresentaram maiores potenciais de degradação do amido

do mesocarpo do babaçu, por apresentarem Índices de Degradação do Amido (IDAs)

superiores a 4,0.

Palavras-chave: Rizóbios, metabolismo microbiano, Amazônia.

Introdução

O Programa Nacional do Álcool – Proálcool - foi criado em 14 de novembro de 1975,

através do Decreto n° 76.593, com o objetivo de estimular a produção de álcool para

atender aos mercados interno e externo, diminuindo a dependência da política de preços

praticada pela Organização dos Países Exportadores de Petróleo (OPEP) e, a redução do

consumo da gasolina, uma das responsáveis pelo Efeito Estufa. A cana-de-açúcar é a

principal cultura utilizada pelo Proálcool, mas nos últimos anos, o programa vem

investindo em espécies amiláceas, como o sorgo açucareiro, milho, cultivados nas

entressafras da cana. Na Amazônia, essa nova estratégia permite a produção de álcool a


116

partir da mandioca, batata doce e até algumas espécies negligenciadas, como o babaçu, de

ampla ocorrência na região, mas pouco explorada economicamente.

O babaçu (Attalea speciosa Mart.) é uma palmeira pertencente à família Arecaceae,

com vasta distribuição em toda a Região Norte do Brasil, sendo ainda encontrada nos

estados do Maranhão, Piauí, Mato Grosso, Ceará, Pernambuco e Alagoas, além da Bolívia,

Guianas e Suriname (Lorenzi, 2010). É um importante recurso utilizado há séculos para a

produção de óleo, sendo um vegetal em destaque para mais de 300 mil famílias

extrativistas no Maranhão, que têm na quebra manual do coco para retirada da amêndoa,

sua principal fonte de renda (Santos, 2007). A farinha de babaçu possui entre 50-70% de

amido (Peixoto, 1973), podendo ser uma grande fonte na produção de biocombustíveis.

Para isso são necessárias enzimas de interesse econômico, como amilases, que já foram

encontradas em isolados de rizobactérias, tais como as do gênero Rhizobium (Oliveira et

al., 2006, 2007a,b).

Torna-se importante obter rizobactérias produtoras da enzima amilase, capaz de

converter o amido da farinha de babaçu em subprodutos que serão convertidos em álcool

no processo de fermentação. Essa enzima ainda é, na sua maioria, importada, uma vez que

a produção interna é insuficiente para atender as necessidades brasileiras.

As enzimas termoestáveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação

na indústria, visto que os processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas

têm o risco de contaminação por microrganismos mesófilos, que são a maioria em um

ambiente industrial, significativamente reduzido. Por isso o interesse em testar o

crescimento dos microrganismos em temperaturas elevadas (Palma-Fernandez e Gomes,

2002). Para interesse na produção de etanol, o ideal é que a bactéria cresça a altas

temperaturas para produzir enzimas termofílicas e termoestáveis (Arikan, 2008).

O objetivo desse trabalho foi avaliar o crescimento de rizobactérias isoladas de

nódulos de leguminosas em meio de cultura contendo farinha de babaçu como um teste

inicial quanto às suas capacidades em degradarem o amido.

Material e métodos

Foram coletados nódulos de raízes de leguminosas de diferentes locais (Tabela 1),

para isolamento de rizobactérias usando o meio de cultura YMA (Vincent, 1970),

substituindo o manitol pela farinha de babaçu (1%). Foram testadas rizobactérias da

coleção bacteriana do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Microrganismos da

Amazônia (LEBMAM), do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).

117

Tabela 1. Rizobactérias isoladas de nódulos de leguminosas e seus locais de coleta no

Estado do Amazonas. Rizobactérias Local Planta

INPA R001, INPA R007, INPA R012, INPA R014, INPA R015,


INPA R600

Município de Rio

Preto da Eva

Rhynchosia

macrocarpum

INPA R817(1), INPA R818(1), INPA R819 (1), INPA R820 (1),

INPA R821 (1), INPA R822 (1), INPA R823 (1), INPA R824 (1),

INPA R825 (1), INPA R826 (1), INPA R827 (1), INPA R828 (1),

INPA R829 (1), INPA R830 (1), INPA R831 (1)

Município de Rio

Preto da Eva

Inga edulis

(Ingá)

ARABA 3, ARABA 4, ARABA 5, ARABA 6, ARABA 7,



ARABA 15, ARABA 16

INPA, campus

V8, Manaus

Swartzia

polyphylla

(Arabá)

INPA R959, INPA R1001, INPA R1002, INPA R1005, INPA

R1007, INPA R964, INPA R962, INPA R1003, INPA R963,

BALB 5.8/17.1, BALB 2.4/10.2.2, BALB 1/12.1, BALB 1/11

Balbina,

município de

Presidente

Figueiredo

Pueraria

phaseoloides

INPA 976

Novo Remanso;

Ramal do Macaco

Cego

Inga cinnamomea

(Ingá chinelo)



INPA R315, INPA R722, INPA R548

Lago do Paru Inga edulis

(Ingá)

INPA R1062, INPA R1065, INPA R1060, INPA R1067, INPA

R1068, MAN 3.6.4, MAN- 3.2.2, MAN- 10.8.7, MAN-3.2.4,

MAN-10.8.10, MAN-10.8.16, MAN-10.8.2, MAN-10.8.4, MAN-

10.8.1, MAN- 5.4.6

Estrada do

Acajatuba

Pueraria

phaseoloides

INPA R966 Município de

Iranduba

Inga

heterophylla




INPA R781, INPA R301, INPA R303, INPA R304, INPA R305, INPA R306, INPA R308, INPA R309, INPA R310, INPA R311,


INPA R762, INPA R721

Ramal do Caldeirão km3

Pueraria phaseoloides

Para a avaliação do crescimento, os isolados foram estriados em placas de Petri

com meio contendo farinha do babaçu, submetidos à temperatura de 25 ºC. O experimento

foi realizado com quatro repetições usando o método de Oliveira e Magalhães (1999) para

as avaliações que consiste na atribuição de notas de 1,00 (sem crescimento visível na zona

1) a 4,00 (máximo crescimento até a zona 4, podendo ser atribuídas notas intermediárias,

subdivididas em 0,25, ou seja, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75, 2,00, até 4,00, aumentando assim a

precisão do método. Para fins de comparações, foram considerados três graus de

crescimento, segundo apresentado na Tabela 2.

118

Figura 1. Método de avaliação do crescimento bacteriano (Oliveira e Magalhães, 1999).

Figura 2. Pontuações (notas) aplicadas para o crescimento das bactérias segundo Oliveira e

Magalhães (1999).

Tabela 2. Faixas de pontuação para avaliação do crescimento das bactérias em meio

sólido contendo babaçu.

Grau de crescimento Faixa de pontuação

Baixo 1,00 – 2,00

Médio 2,06* - 3,00

Elevado 3,06** - 4,00

* Três repetições com nota 2,0 e uma com 2,25. ** Três repetições com nota 3,0 e uma

com 3,25 (Oliveira e Magalhães, 1999).

Os isolados foram avaliados quanto à capacidade de degradação do amido do

mesocarpo do babaçu, pela visualização do halo de degradação (região transparente ao

redor das colônias). As rizobactérias foram repicadas em placas de Petri com o auxílio de

palitos de dentes esterilizados, retirando-se uma porção da colônia bacteriana, com um leve

toque no meio de cultura; cada placa teve quatro colônias como repetições.

Os diâmetros da colônia bacteriana e do halo de degradação foram medidos em

intervalos de dois dias usando um paquímetro digital, até estabilização dos diâmetros. A

Nota 1.0 Nota 1.25 Nota 2,0 Nota 3,0 Nota 4,0

119

partir dessas medidas, foram obtidos os Índices de Degradação do Amido (IDA) para cada

isolado, pela fórmula: DD (diâmetro da zona de degradação em mm)/DC (diâmetro da

colônia em mm), adaptando-se os critérios e cálculos de Berraquero et al. (1976). Com

base nos índices, os isolados foram classificados de acordo com a capacidade de

degradação do amido, em: baixa (IDA <2), média (2≤ IDA <4) e alta (IDA ≥4).

O experimento seguiu o delineamento inteiramente casualizado com 4 repetições.

Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos ao teste

Scott-Knott a 5% de probabilidade usando o programa ASSISTAT.


Dos 111 isolados cultivados em meio contendo farinha de babaçu, 30 foram

considerados de crescimento baixo, 6 de crescimento médio e 76 de elevado, por um

período de quinze dias segundo o método de Oliveira e Magalhães (1999) (Tabela 3).

Tabela 3. Crescimento das rizobactérias em meio de cultura contendo farinha do

mesocarpo de babaçu como fonte de nutrientes.

Rizobactérias Dias*

INPA R293, INPA R548, INPA R762, INPA R721, INPA R315, INPA R722, MAN 5.4.6,

INPA R1062, INPA R1065, INPA R278, INPA R284, INPA R325, INPA R689, INPA R739,

INPA R301, INPA R304, INPA R305, INPA R306, INPA R308, INPA R309, INPA R310,

INPA R311, INPA R312, INPA R959, INPA R1001, INPA R1002, INPA R1005, INPA

R1007, INPA R001, INPA R007, INPA R012, INPA R014, INPA R015, INPA R600, INPA

R826 (1), INPA R827 (1), INPA R831 (1), INPA R823 (1), INPA R826 (1), INPA R830 (1),

INPA R964, INPA R976, INPA R962, ARABA 4, ARABA 7, ARABA 10, ARABA 11,

ARABA 2, ARABA 15, ARABA 16, BALB 1/12.1, BALB 1/11, MAN 3.2.2, MAN 3.2.4

3

INPA R781, INPA R733, INPA R287, INPA R781, INPA R303, INPA R1003, INPA R829 (1),

ARABA 5, ARABA 6, ARABA 8, ARABA 9, ARABA 12, ARABA 13, ARABA 17, ARABA

1, ARABA 14

6

INPA R1067, INPA R769, INPA R727, ARABA 3, INPA R825 (1), INPA R827 (1) 9

INPA R318 12

INPA R1060, INPA R792, INPA R302, INPA R702, INPA R818 (1), INPA R819 (1), INPA

R829 (1), INPA R830 (1), INPA R976 **

INPA R020, INPA R026, INPA R046, INPA R028, INPA R817 (1), INPA R820 (1), INPA R821 (1), INPA R822 (1), INPA R823 (1), INPA R824 (1), INPA R825 (1), INPA R828 (1),

INPA R828 (1), INPA R831 (1), INPA R1068, INPA R739, INPA R548, INPA R692, INPA

R761, INPA R966, INPA R710, INPA R270, INPA R709, INPA R963, BALB 5.8/17.1, BALB

2.4/10.2.2, MAN-10.8.7, MAN-10.8.10, MAN-10.8.16, MAN-10.8.2, MAN-10.8.4, MAN-

10.8.1

***

* Número de dias para atingir crescimento 3,06 segundo notas de Oliveira e Magalhães (1999).

** Notas de 2,06 a 3,00 durante o período de avaliação. ***Notas de 1,00 a 2,00 durante o período de avaliação.

120

Dentre as bactérias testadas, 54 apresentaram crescimento alto a partir do terceiro

dia de crescimento (Tabela 3). Segundo Oliveira e Magalhães (1999), microrganismos que

apresentam valores elevados já no 3° dia de crescimento são os que estão mais bem

adaptados às condições do meio, indicando, que esses isolados estão usando os

constituintes do meio com mais eficiência para os seus crescimentos.

O índice de degradação de amido variou de 0,29 a 9,21 entre os isolados (Tabela 4).

Valores de IDA maiores ou iguais a 2,0 indicam elevada produção de enzimas extra

celulares (Lealem e Gashe, 1994). O IDA para amilases acima de 2,0 foi observado em 19

isolados. Resultados semelhantes foram observados por Oliveira et al. (2007 a, b).

Os tratamentos INPA R001, INPA R046, INPA R761, INPA R781, ARABA 2,

ARABA 3, ARABA 5, ARABA 7, ARABA 17 e MAN 3.2.2 apresentaram valores de IDA

maiores do que 4,0, indicando maiores potenciais biotecnológicos para serem usados como

fontes de amilases.

Tabela 4. Índices de Degradação do Amido (IDA) apresentados pelas rizobactérias.

Bactérias Diâmetro (mm) IDA (dh/dc)

Halo (dh) Colônia (dc)

INPA R001 10,37 c 1,55 c 6,69

INPA R007 5,15 d 3,72 a 1,38

INPA R012 15,19 a 2,27 c 6,69

INPA R014 10,35 c 3,46 b 3,00

INPA R015 1,88 e 1,88 c 1,00

INPA R020 4,39 d 3,90 a 1,12

INPA R028 4,19 d 4,88 a 0,86

INPA R034 12,18 b 2,15 c 2,36

INPA R046 9,64 c 2,11 c 4,56

INPA R278 1,13 e 1,98 c 0,57

INPA R287 1,49 e 1,49 c 1,00

INPA R302 4,59 d 2,05 c 2,24

INPA R315 2,42 e 2,70 c 0,89

INPA R318 4,50 d 1,99 c 2,26

INPA R325 2,43 e 2,59 c 0,93

INPA R548 5,71 d 3,28 b 1,74

INPA R689 4,83 d 4,32 a 1,11

INPA R721 3,73 d 3,73 a 1,00

INPA R722 1,00 e 3,34 b 0,29

INPA R733 1,55 e 2,35 c 0,66

INPA R761 8,97 c 1,88 c 4,77

INPA R781 5,94 d 1,45 c 4,09

INPA R783 4,85 d 1,88 c 2,58

INPA R784 1,22 e 2,16 c 0,56

INPA R792 4,69 d 3,90 a 1,20

INPA R959 2,53 e 2,54 c 0,99

121

INPA R976 4,81 d 1,42 c 3,38

INPA R1001 4,71 d 3,03 b 1,55

INPA R1002 2,38 e 1,67 c 1,42

INPA R1005 1,78 e 1,63 c 1,09

INPA R1007 2,49 e 2,49 c 1,00

INPA R1060 3,21 e 2,99 b 1,07

INPA R1062 4,35 d 2,02 c 2,15

INPA R1065 4,90 d 1,48 c 3,31

INPA R1067 2,91 e 1,67 c 1,74

INPA R1068 2,02 e 2,02 c 1,00

ARABA 1 1,63 e 1,49 c 1,09

ARABA 2 11,63 b 1,70 c 6,84

ARABA 3 9,18 c 1,88 c 4,88

ARABA 5 13,73 a 1,49 c 9,21

ARABA 7 15,41 a 2,15 c 6,60

ARABA 17 13,59 a 2,84 b 4,78

BALB 1/12.1 4,71 d 3,02 b 1,56

MAN 3.2.2 6,68 d 1,59 c 4,20

MAN 5.4.6 1,48 e 2,13 c 0,69

MAN 10.8.7 5,13 d 4,97 a 1,03

MAN 10.8.10 2,27 e 2,27 c 1,00 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de


Conclusões

A maioria dos isolados de rizobactérias apresentou crescimento médio ou elevado

no meio contendo farinha do mesocarpo de babaçu.

Os isolados identificados como INPA R001, INPA R046, INPA R761, INPA R781,

ARABA 2, ARABA 3, ARABA 5, ARABA 7, ARABA 17, MAN 3.2.2 foram os que

apresentaram maiores potenciais de degradação do amido do mesocarpo do babaçu, por

apresentarem Índices de Degradação do Amido (IDAs) superiores a 4,0.

Agradecimentos

Ao INPA, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro para a

realização da pesquisa.

122

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124



Macrofungos polyporaceae (basidiomycota) no Jardim Botânico Adolpho

Ducke, Amazonas, Brasil

Couceiro D.M.1, Jesus M.A.

2

1Bolsista AT PAIC FAPEAM/INPA,

2Pesquisadora INPA, Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia. E-mail: [email protected], [email protected]

Resumo

Os fungos Polyporaceae (Polyporales) compreendem aqueles conhecidos como

“orelha-de-pau”. São fungos cosmopolitas que ocorrem com maior frequência nas regiões

tropicais e subtropicais. O presente trabalho teve como objetivo realizar um levantamento

de macrofungos Polyporaceae no Jardim Botânico de Adolpho Ducke, Manaus. As coletas

foram realizadas no período entre março de 2015 a maio de 2016 em diferentes substratos

lignocelulolíticos das trilhas interpretativas na floresta, seguiu-se a metodologia para

identificação de Polyporaceae. Um total de 40 macrofungos foi coletado e todos

identificados, distribuídos em nove gêneros e 20 espécies. Das espécies, Fomes

fomentarius e Trametes hirsuta são relatadas pela primeira vez no Estado do Amazonas.

Existem diferenças notáveis com relação à ocorrência de espécies, nas trilhas, sendo que

nas trilhas Azul, Laranja, Marrom, Rosa, Verde não há registro de Polyporaceae no

período coletado. Os substratos com maior registro de macrofungos foram galhos e

troncos. A ocorrência de F. fomentarius e T. hirsuta é registrada pela primeira vez no

Estado do Amazonas. As espécies L. elegans, P. badius, P. tenuiculus, P. sanguineus e

T. hirsuta possuem potencial biotecnológico. As espécies fitopatogênicas encontradas

foram F. fomentarius, H. hydnoides, L. stereoides, M. cavernulosa, P. martia e T.

epimiltinus.

Palavras-chaves: Área Protegida, Biodiversidade, MUSA, Poliporoides.

Introdução

Polyporaceae Corda (1839) é uma família pertencente à ordem Polyporales,

comumente conhecida como “orelha-de-pau”. A maioria das espécies deste grupo é

degradadora de substrato lignocelulolítico (Ryvarden, 1991), tendo um papel fundamental

na reciclagem dos nutrientes no ecossistema (Alexopoulos et al. 1996). A família abriga 79

gêneros e 636 espécies, as quais estão amplamente distribuídas em diversas regiões do

mundo (Kirk et al., 2008).



125

Segundo Ryvarden e Iturriaga (2003), as principais características de

Polyporaceae são os basidiomas perenes, estipitados, pileados e ressupinados com uma

ampla variedade de cores: branca, creme, marrom, vermelho, violeta. Geralmente, o

himenóforo pode ser poroíde, lamelado, labiríntico a hidinoides, o que difere das demais

famílias de Basidiomycetes (Volk, 2000; Vieira et al., 2006). O sistema hifal é monomítico

quando o basidioma apresenta hifas generativas; dimítico que apresenta hifas generativas e

esqueléticas ou conectivas e trimítico quando o macrofungo é formado pelos três tipos de

hifas (generativa, esquelética e conectiva). A maioria das espécies de Polyporaceae possui

hifas hialinas e poucas hifas dextrinóides ou amilóides. As cistidias (estruturas

ornamentais) é uma das características utilizada na diferenciação entre os gêneros pela

ausência ou presença. Os basidiósporos variam de truncado, globoso, subgloboso,

cilíndrico e elipsóide, e podendo ser hialino, dextrinóide ou amilóide (Ryvarden e

Iturriaga, 2003).

A família Polyporaceae ocorre com frequências nas regiões tropicais e

subtropicais. A riqueza das espécies encontrada nestas regiões difere da relatada nas

regiões temperadas (Tokumasu et al., 1988). Algumas espécies são fitopatógenas, como

Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo, que atacam árvores vivas (Gugliota e Bononi,

1999). Outras espécies são comestíveis, apresentando um alto valor nutricional, como

Pleurotus ostreatus (Fr.) P. Kumm. comercializada mundialmente e Polyporus tenuiculus

(P. Beauv.) Fr., consumida pelos índios Yanomamis (Franco-Molano et al., 2005).

Espécies de Polyporaceae podem apresentar potencial biotecnológico como P.

badius (Pers.) Schwein., Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill e Lenzites elegans (Spreng.)

Pat., as quais são fonte de investimento em processos, tais como: biorremediação de solos

contaminados, tratamentos de resíduos têxteis, papelaria, e recentemente, na produção de

etanol e produção de enzimas (Soares et al., 2011).

O trabalho teve como objetivo realizar um levantamento de macrofungos

Polyporaceae no Jardim Botânico de Adolpho Ducke, visando contribuir com novos

exemplares identificados taxonomicamente e possibilitando, assim, associar as espécies

com a distribuição desses macrofungos na região Amazônica.

Material e Métodos

O Jardim Botânico Adolpho Ducke localiza-se no bairro Cidade de Deus, Zona

Leste de Manaus-AM, em 500 hectares de floresta primária de terra firme, na borda da

Reserva Florestal Adolpho Ducke (Figura 1).

126

As coletadas de macrofungos (Polyporaceae) foram realizadas no período entre

março de 2015 a maio de 2016 em diferentes substratos lignocelulolíticos das trilhas

interpretativas na floresta, identificadas pelos nomes Arecaceae, Amarela, azul, Branca,

Laranja, Lilás, Marrom, Rosa, Verde e Vermelha (Figura 2). A área amostral possui três

quilômetros de extensão do Jardim Botânico Adolpho Ducke.

Figura 1. Localização do Jardim Botânico Adolpho Ducke. Fonte JDABM, 2010.

Figura 2. Mapa das trilhas interpretativas do Jardim Botânico Adolpho Ducke.

A identificação dos basidiomas foi baseada na análise macroscópica, tais como:

forma do basidioma, modo de fixação no substrato, cor e poros (tamanho e tipo), e na

127

análise microscópica: basídias, esporos, tipos de hifa, presença ou ausência de estruturas

ornamentais (cistídios e cistídiolos) (Ryvarden e Johansen, 1980). As espécies foram

identificadas a partir dos trabalhos taxonômicos descritos por Gilbertson e Ryvarden

(1986, 1987), Gugliota e Bononi (1999), Ryvarden e Johansen (1980), Ryvarden (1991) e

Ryvarden e Gilbertson (1993).


Um total de 40 espécimes de macrofungos Polyporaceae foi coletado no Jardim

Botânico Adolpho Ducke. Todo o material foi identificado, e está distribuído em nove

gêneros e 20 espécies (Tabela 1). De acordo com Gilbertson (1980) e Alexopoulos et al.

(1996), a família é a que possui maior diversidade dentro da ordem Polyporales.

Dentre os representantes de Polyporaceae, destacam-se: Fomes fomentarius (L.) Fr.

(Figura 3A) e Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát (Figura 3B) como primeiros registros para o

Estado do Amazonas, de acordo com a Lista de Espécies da Flora do Brasil (Flora do Brasil,

2016) E L. elegans (Figura 3C), P. badius, P. tenuiculus (P. Beauv.) Fr., P. sanguineus (Figura

3D), T. hirsuta (Wulfen) Pilát são espécies com potencial biotecnológico (Chye et al., 2008;

Soares et al. 2011; Silva, 2014; Costa, 2015). As demais espécies, F. fomentarius (L.) Fr.,

Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo, L. stereoides (Fr.) Ryv., Megasporoporia cavernulosa

(Berk.) Ryv. (Figura 3E), Perenniporia martia (Berk.) Ryv. (Figura 3F) e Tinctoporellus

epimiltinus (Berk. , Broome) Ryv. são consideradas fitopatogênicas (Gilbertson, 1980; Ryvarden

e Johansen, 1980; Schwarze et al., 2013).

Dentre as espécies registradas, a mais representativa é L. elegans com cinco

espécimes, ocorrendo na Trilha Amarela, Lilás e Vermelha, seguido de M. cavernulosa

com quatro que ocorrem na Trilha Branca e Vermelha, como também P. inflexibilis

(Figura 3G) registrado na Trilha Amarela e vermelha, Perenniporia sp. 1 (Figura 3H) e P.

dictyopus que ocorre somente na Trilha Lilás e T. modesta ocorre na Trilha Amarela e

Vermelha todas essas espécies estão representadas por três espécimes (Tabela 1), estes

macrofungos são de ocorrência em regiões tropicais (Gilbertson, 1980).

Os macrofungos Polyporaceae encontrados no Jardim Botânico Adolpho Ducke

estão amplamente distribuídos em diversos tipos de substrato (Tabela 1). Nota- se que há

um registro em árvore morta e árvore viva (Figura 4), enquanto que seis espécimes

atacaram galhos e três em troncos na Trilha Amarela.

128

Figura 3. Basidiomas das espécies (A – H). A – Fomes fomentarius. B – Trametes hirsuta.

C – Lenzites elegans. D – Pycnoporus sanguineus. E – Megasporoporia cavernulosa. F –

Perenniporia martia. G – P. inflexibilis. H – Perenniporia sp. 1.

1 cm 1 cm

A B

C D

E F

G H

129

Na Trilha Vermelha ocorreu o inverso, nove fungos em troncos e dois em galhos,

e na Trilha Lílás ocorreram dois espécimes em galhos, sete em troncos e três em solo.

Entretanto, na Trilha Arecaceae ocorreram dois espécimes em galhos e na Trilha Branca,

dois em galhos e troncos. Verifica-se que a maioria dos espécimes ocorreu em galhos e

troncos de árvores caídas, o que indica a preferência desses fungos com estes dois tipos de

substratos lignocelulolíticos (Figura 4). Nas trilhas Azul, Laranja, Marrom, Rosa e Verde

não houve registro de Polyporaceae, dado que merece ser mais estudado tendo em vista

que essas trilhas são preservadas.

Os macrofungos Polyporaceae encontrados no Jardim Botânico Adolpho Ducke

estão amplamente distribuídos em diversos tipos de substrato (Tabela 1). Há um registro

em árvore morta e árvore viva (Figura 4), enquanto que seis espécimes atacaram galhos e

três em troncos na Trilha Amarela. Na Trilha Vermelha ocorreu o inverso, nove fungos em

troncos e dois em galhos, e na Trilha Lílás ocorreram dois espécimes em galhos, sete em

troncos e três em solo. Entretanto, na Trilha Arecaceae ocorreram dois espécimes em

galhos e na Trilha Branca, dois em galhos e troncos. Verifica-se que a maioria dos

espécimes ocorreu em galhos e troncos de árvores caídas, o que indica a preferência desses

fungos com estes dois tipos de substratos lignocelulolíticos (Figura 4). Nas trilhas Azul,

Laranja, Marrom, Rosa e Verde não houve registro de Polyporaceae, dado que merece ser

mais estudado tendo em vista que essas trilhas são preservadas.

Figura 4. Distribuição de macrofungos Polyporaceae em diferentes substratos lignocelulolíticos nas trilhas interpretativas do Jardim Botânico Adolpho Ducke. TA: Trilha Amarela; TAR: Trilha

Arecaceae; TB: Trilha Branca; TL: Trilha Lilás; TV: Trilha Vermelha.

A riqueza de espécies registradas no Jardim Botânico Adolpho Ducke pode estar

provavelmente associada às clareiras formadas ao longo das trilhas por fatores abióticos

devido às condições climáticas atípicas em 2016 causadas pelo fenômeno El Niño, que

130

provoca flutuações no clima devido ao aumento da temperatura das águas do Oceano

Pacífico, e que é responsável pela estiagem no Norte do Amazonas, considerada atípica

(Agência Brasil, 2016). Nesse caso, a falta de chuva pode ter contribuído para o não

desenvolvimento dos fungos, os quais necessitam de umidade para o seu crescimento. Em

vista da estiagem, novas coletas dos fungos devem ser realizadas assim que o período

chuvoso se normalize visando consolidar o conhecimento da diversidade de macrofungos

Polyporaceace no Jardim Botânico Adolpho Ducke, Manaus.

Conclusões

A ocorrência de F. fomentarius e T. hirsuta é registrada pela primeira vez no

Estado do Amazonas.

As espécies L. elegans, P. badius, P. tenuiculus, P. sanguineus e T. hirsuta

possuem potencial biotecnológico.

As espécies fitopatogênicas encontradas foram F. fomentarius, H. hydnoides,

L. stereoides, M. cavernulosa, P. martia e T. epimiltinus.

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131

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132

Tabela 1. Macrofungos (Polyporaceae) que ocorrem em diversos substratos em trilhas interpretativas do Jardim Botânico Adolpho Ducke, Manaus.

Táxon

Trilhas

TOTAL TA TAR TB TL TV

Subs tratos

AM AV G T AM AV G T AM AV G T AM AV G S T AM AV G T

Fomes fomentarius (L.) Fr. – – – – – – – – – – – 1 – – – – – – – – – 1

Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1 1

H. tenuis (Hook.) Fr. – – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – 1

Lenzites elegans (Spreng.) Pat. – – 1 1 – – – – – – – – – – 2 – – – – – 1 5

L. stereoides (Fr.) Ryv. – – – – – – – – – – – – – – – – 1 – – – 1 2

Megasporoporia cavernulosa (Berk.) Ryv. – – – – – – – – – – 2 – – – – – – – – 2 – 4

M. setulosa (Henn.) Rajchenb. – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1

Perenniporia inflexibilis (Berk.) Corner – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 3 3

P. martia (Berk.) Ryv. – – – – – – – – – – – 1 – – – – – – – – – 1

P. mundula (Wakef.) Ryv. – – 1 – – – – – – – – – 1 – – – – – – – – 2

Perenniporia sp. 1 – – – – – – – – – – – – – – – 3 – – – – – 3

Perenniporia sp. 2 – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – 1 2

Polyporus badius (Pers.) Schwein. – – – – – – 1 – – – – – – – – – – – – – – 1

P. dictyopus Mont. – – – – – – – – – – – – – – – – 3 – – – – 3

P. grammocephalus Berk. – – – 1 – – – – – – – – – – – – 1 – – – – 2

P. tenuiculus (P. Beauv.) Fr. – – – – – – 1 – – – – – – – – – 1 – – – – 2

Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1

Tinctoporellus epimiltinus (Berk. & Broome) Ryv. – – – – – – – – – – – – – – – – 1 – – – – 1

Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1 – – 1

T. modesta (Fr.) Ryv. – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – 2 3

TOTAL 0 0 6 3 0 0 2 0 0 0 2 2 1 0 2 3 7 0 1 2 9 40

Legenda: Trilha TA = Trilha Amarela; TAR = Trilha da Arecaceae; TB = Trilha Branca; TL = Trilha Lilás; TV = Trilha Vermelha; Substrato: AM = Árvore morta; AV =

Árvore viva; G = Galho; T = Tronco.

133



Constituintes químicos do fungo Trichoderma koningii isolado de

Strychnos cogens

Fernandes, K.R.P.1, Souza, A.Q.L.de.

2, 3,4, Alencar, L.F.

3, Silva, H.F.

4, Pereira, J.O.

.2,

Rodrigues-Filho, E.5, Souza, A.D.L.

1

1PPGQ/UFAM, Programa de Pós Graduação em Química da Universidade Federal do Amazonas,

2FCA/UFAM, Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas,

3MBT/UEA,

Mestrado em Biotecnologia e Recursos Naturais da Universidade do Estado do Amazonas, 4DGEV/UFSCar, Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos,

5DQ/UFSCar, Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos. Emails:

[email protected]; [email protected]

Resumo

Os fungos do gênero Trichoderma produzem substâncias conhecidas como koningininas

que têm semelhanças estruturais com a vitamina E e são capazes de inibir microrganismos

patogênicos. Em diversas publicações, foram indicadas possíveis aplicações para as

koningininas: controle biológico de crescimento de plantas, atividades antimicrobianas e

capacidade de inibir atividades enzimáticas relacionadas à fosfolipase A2. Além disso, esta

classe de substâncias é promissora como marcadora taxonômica para este gênero. Neste

trabalho, apresenta-se o resultado do estudo químico de uma linhagem de Trichoderma

koningii, fungo endofítico obtido de Strychnos cogens, planta amazônica coletada na

região de Manaus – AM. Foram obtidas treze substâncias, com destaque para as

koningininas A, D, E e F, as quais apresentaram alguma inibição a Aspergillus flavus,

Staphylococcus aureus e Xanthomonas axonopodis. A menor concentração inibitória foi

proveniente da koninginina E, com 31µg/mL contra a A. flavus. O isolamento dessas

koningininas de T. koningii em boa quantidade indica que são relevantes para este

microrganismo.

Palavras – chave: Koningininas, fungo endofítico, potencial biológico.

Introdução

Espécies de Trichoderma podem ocorrer como fungos endofíticos ou saprófitas,

produzem diversos compostos com propriedades antibióticas e têm recebido considerável

atenção como agentes de controle biológico de inúmeros fitopatógenos. Entre os

metabólitos de Trichoderma spp. estão as koningininas A-M, compostos pirânicos,

furânicos, carotenos e diversos peptídeos N-acilados e com uma função amino álcool no

carbono terminal, os quais foram denominados peptaibois e são antibióticos que agem

como desestabilizadores de membranas celulares (Macias et al., 2000; Souza et al., 2004,

Lang et al., 2014).



134

Espécies vegetais amazônicas têm sido reveladas como abundantes fontes de

fungos endofíticos, muitos dos quais produzem compostos com atividades antimicrobianas

contra cepas patogênicas (Souza et al., 2004). Desta forma, este trabalho teve como

objetivo apresentar o resultado do estudo químico de uma linhagem de T. koningii, fungo

endofítico de Strychnos cogens. Entre os metabólitos obtidos, destacam-se as koningininas,

que foram avaliadas quanto a atividades antimicrobianas.

Material e Métodos

O fungo foi isolado a partir de um indivíduo da planta amazônica S. cogens

coletada em Manaus-AM e foi morfologicamente identificado como Trichoderma sp.

(Souza et al., 2004). Para a identificação molecular, o isolado foi cultivado em caldo (BD)

batata-dextrose à temperatura ambiente sob agitação durante 36 horas (a 120 rpm). Após a

separação do meio cultivado por filtração, o micélio foi tratado pelo método de CTAB para

a obtenção do DNA genômico (Doyle e Doyle, 1987).

A concentração de DNA foi estimada em 100 ng/µL em comparação com o

marcador de 1 kb em 1% de gel de agarose, e confirmada em espectrofotômetro de UV

visível, marca Cary 100 Varian (260 nm). A PCR foi realizada com volume de 25 µL

contendo 10,2 µL de água, 2,5 µL de Tp 10x, 3,0 µL de MgCl2 a 25 mM, 3,0 µL de dNTP

a 1,25 mM, 2,0 µL de cada um dos iniciadores Its 1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG–

3’) e 2 (5`-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3`) a 10 mM, 0,3 µL de Taq polimerase (5U)

e 2,0 µL de DNA genômico diluído para 10 ng/µL (White et al., 1990).

Após a desnaturação inicial a 94 ºC por 4 min, a amplificação gênica foi feita em 40

ciclos através dos seguintes passos: desnaturação por 2 min. a 94 ºC, anelamento dos

primers por 2 min. a 55 ºC e alongamento por 2 min. a 72 ºC. A finalização foi realizada

com 10 min. a 72 ºC. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de

agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio, em comparação com marcador de 1000 pb,

estimado em 50 ng/µL. Ao todo, 2 µL do produto da PCR foram sequenciados em gel de

acrilamida e as sequências obtidas, com 539 pares de bases, foram comparadas com os

dados do Gene bank do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Souza,

2006).

Para o cultivo do fungo, 14 frascos erlenmeyer de 500 mL, cada um contendo 200

mL de meio BD com 0,2% de extrato de levedura, foram inoculados individualmente com

uma suspensão de 50 L de conídios do fungo T. koningii, na concentração de 9.107

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

135

cel/mL. O pH inicial do meio de cultura foi de 5,5. O cultivo ocorreu sob agitação

constante de 120 rpm e 25 ºC até o meio de cultura atingir o pH constante de 8,0 durante 3

dias, o que ocorreu entre o nono e o décimo primeiro dia, quando o crescimento foi

interrompido. O meio líquido cultivado foi filtrado em papel de filtro no funil de Büchner

(Souza, 2005).

Para o isolamento e caracterização das moléculas, o meio líquido cultivado foi

particionado com solventes orgânicos (CHCl3, acetato de etila e n-butanol) e o micélio foi

macerado com metanol e etanol. Os extratos foram concentrados sob pressão reduzida a

temperaturas entre 45 e 60 ºC, de acordo com a volatilidade de cada solvente. Após a

comparação dos extratos por cromatografia de camada delgada (CCD), os extratos do

líquido cultivado foram agrupados, dadas suas semelhanças e baixos rendimentos,

resultando em 1,0 g do material. Este material foi aplicado em coluna cromatográfica de

sílica de 230-400 mesh e eluído com misturas de hexano, diclorometano, acetato de etila e

metanol, em ordem de polaridade crescente, obtendo-se 36 frações. Tratamentos

cromatográficos complementares por HPLC resultaram em seis substâncias.

O extrato do micélio foi tratado com acetato de etila/ metanol 97:3 a quente e a

parte solúvel foi fracionada em coluna cromatográfica de sílica de 230-400 mesh e eluída

com misturas de hexano, acetato de etila e metanol, em ordem de polaridade crescente,

obtendo-se 19 frações. Tratamentos cromatográficos complementares permitiram a

obtenção de sete substâncias. Estas e as obtidas do meio líquido cultivado foram

submetidas à identificação através de análises por RMN (Ressonância Magnética Nuclear)

unidimensional e bidimensional e por espectrometria de massa.

Para os testes de sensibilidade das koningininas, foram utilizadas as cepas de

bactérias gram-positivas Staphyloccoccus aureus e Bacillus subtilis, cepas de bactérias

gram-negativas Escherichia coli, Xanthomonas axonopodis e Pseudomonas aeruginosa e

cepas dos fungos Candida tropicalis, Guignardia citricata, Fusarium monoliforme,

Aspergillus flavus e Colletotritchum sp. As koningininas foram submetidas aos ensaios de

detecção de antibióticos por difusão em ágar e para as amostras que apresentaram

atividades, foi realizada a dosagem mínima inibitória em microplacas de 96 poços

(Aligianis et al., 2001, Souza, 2006).


A identificação da linhagem foi confirmada por sequenciamento da região Its-1 do

rDNA e confrontados com sequências do GenBank. As comparações revelaram 99% de

136

identidade com T. koningii com e value de 0,0. Alguns aspectos macro e microscópicos são

mostrados na Figura 1, para facilitar o reconhecimento do fungo.

Figura 1– Aspectos macroscópicos de T. Koningii em A. Estruturas micro-morfológicas de

T. koningii, conidióforo com conídios em B.

As substâncias isoladas do meio líquido e do micélio de T. koningii (Figura 2)

foram caracterizadas através da análise dos espectros de RMN de 1H e

13C uni e

bidimensional e de espectrometria de massas, e confirmadas por comparação com dados da

literatura. Nos espectros de massas e de RMN 1D e 2D de 1 foram observados dados

compatíveis com a fórmula molecular C16H28O4: um pico em m/z 285,3 ([M+H]+), obtido

por ESI-MS; sinais entre 4,4-3,1, correspondentes a hidrogênios carbinólicos, e abaixo de

2,5, no espectro de RMN de 1H; e 16 sinais de

13C correspondentes a diversos carbonos:

um metílico, nove metilênicos, cinco metínicos e um de carbono tetrassubstituído em

109,2, nos espectros PENDANT e HSQC. A comparação desses dados com os da literatura

confirmaram a identificação de 1 como a koninginina A (Parker et al., 1995a; Xu e Zhu,

1995).

As outras koningininas foram identificadas seguindo o mesmo tipo de análise: 2,

com íon em m/z 299,5 ([M+H]+) no espectro de massas por ESI-MS, foi identificada como

a koninginina D; 3, com íon em m/z 283,4 ([M+H]+) foi identificada como a koninginina

E; e 4, com íon em m/z 299,6 ([M+H]+) foi identificada como a koninginina F.

A B

137

OO

OH

O

HOH

O

R3

R1

R2

2 K. D: R1=OH, R

2=OH, R

3=H

3 K. E: R1=H, R

2=OH, R

3=H

4 K. F: R1=OH, R

2=H, R

3=OH

5 Solerol

4-( 1-hidroxietil) -butan-4-olídeo

(CH2)12CH3

N O

O

OH

H

CH2OH

HOOH

H

H

H

H

H

H

HO

O

R

H

HO

H H

7 Ergosterol: D5

8 Cerevisterol: 5a-OH, 6b-OH 9 Peróxido de ergosterol

HO

H H

O

O

10 Cerebrosida

O

NH2

HO

6a 3-Amino-5-hidróxi-5-vinil-

2-ciclopenten-1-ona

O

HO

OH

O

OH

11 Ácido málico

O

HOO

OH

12 Ácido fumárico

O

HO

OH

OHO

O

OH

13 Ácido cítrico

O

NH2

HO

6b 3-Amino-4-hidróxi-4-vinil-

2-ciclopenten-1-ona

OU

O

OH

H

H

OH

OH

1 Koninginina A ( K. A)

Figura 2 – Substâncias isoladas de Trichoderma koningii.

138

Para as demais moléculas foram realizados os mesmos segmentos de análises até a

elucidação estrutural de todas as substâncias 13 apresentadas na Fig. 2. Seguem abaixo

tabelas dos deslocamentos químicos e multiplicidades observados nos espectros de RMN

de duas dessas konigininas, em comparação com a literatura.

Tabela 1 – Identificação de 1 como koninginina A pelos dados de RMN.

Koninginina A

1

13C

I 1H

II 13C

III 1H

1 72,66 d 3,89, 1H, dd (2,9;11,0) 72,75 d 3,90, 1H, tipo dd (2,8;11,2)

1-OH 3,15, 1H, d (11,0) 3,19, 1H, d (11,2)

2 30,85 t 1,54-1,47, 3H, m, HAa

1,87, 1H, m, HB

30,85 t 1,55-1,48, 3H, m, HAc

1,87, 1H, m, HB

3 25,38 t 1,82, 1H, dddd (3,9;11,8;13,0;13,0), HA

1,96, 1H, m, HB

25,25 t 1,82, 1H m, HA

1,96, 1H, m, HB

4 69,78 d 3,61, 1H, dd (4,8;11,8) 69,91 d 3,62, 1H, dd (4,4;11,9) 5 109,20 s 109,25 s

6 41,43 d 1,58, 1H, dd (2,9;7,3) 41,42 d 1,58, 2H, m, HÁd

7 20,60 t 2,10, 1H, m, HA

1,72, 1H, dd (6,5;13,9), HB

20,60 t 2,09, 1H, dddd (6,9;6,9;13,3;13,9), HA

1,72, 1H, tipo dd (6,5;13,9), HB

8 27,26 t 2,27, 1H, dddd (3,8;6,5;13,3;13,3), HA

1,54-1,47, 3H, m, HBa

27,30 t 2,27, 1H, dddd (3,7;6,5;12,8;13,3), HA

1,55-1,48, 3H, m, HBc

9 79,00 d 4,32, 1H, m 79,14 d 4,33, 1H, tipo d (2,8)

10 79,30 d 4,03, 1H, t (7,0) 79,39 d 4,04, 1H, t (6,9)

11 35,12 t 1,60-1,57, 1H, m, HA

1,54-1,47, 3H, m, HBa

35,23 t 1,58, 2H, m, HÁd

1,55-1,48, 3H, m, HBc

12 25,54 t 1,41-1,26, 8H, mb 25,59 t 1,34-1,26, 8H, me

13 29,08 t 1,41-1,26, 8H, mb 29,09 t 1,34-1,26, 8H, me

14 31,69 t 1,41-1,26, 8H, mb 31,72 t 1,34-1,26, 8H, me

15 22,53 t 1,41-1,26, 8H, mb 22,57 t 1,34-1,26, 8H, me

16 14,02q 0,88, 3H, t (7,0) 14,05q 0,88, 3H, t (6,9) IRMN de 13C a 75 MHz em CDCl3

(Parker et al., 1995a). IIRMN de 1H a 600 MHz em CDCl3 (XU e ZHU, 1995).

IIIDeslocamentos e multiplicidades observadas no PENDANT a 50 MHz em CDCl3. Espectro de RMN de 1H a 400 MHz em CDCl3. Correlações 1H-13C observadas no HSQC. Constantes de acoplamento (Hz) em parêntesis.

Nos ensaios biológicos contra as cepas das bactérias S. aureus, B. subtilis, E. coli,

X. axonopodis e P. aeruginosa e cepas dos fungos C. tropicalis, G. citricata, F.

monoliforme, A. flavus e Colletotritchum sp., as koningininas revelaram poder de inibição

moderado a ausente, sendo mais ativas contra as linhagens de B. subtilis, S. aureus, A.

flavus e X. axonopodis (Tabelas 3 e 4). Estes resultados são coerentes com os citados em

diversas publicações que indicaram serem estas substâncias mais importantes para o

controle de crescimento de plantas. O isolamento das koningininas em T. koningii em boa

quantidade e variedade indica que elas são relevantes para o microrganismo. Esta classe de

substâncias, juntamente com os peptaibois é, certamente, uma das mais promissoras como

marcadora taxonômica para este gênero (Souza, 2005).

139

Tabela 2 - Identificação de 3 como koninginina E pelos dados de RMN.

Koninginina E

3

13C

I 1H

I 13C

II 1H

1 197,3 197,6 s

2 33,8 2,61, 1H, m, HA

2,35, 1H, m, HB

33,4 t 2,63, 1H, ddd (4,8;7,6;16,9), HA

2,33, 1H, ddd (4,8;9,1;16,9), HB

3 29,3 2,45, 1H, m , HA

2,20-1,95, 3H, m, HBa

29,2 t 2,23, 1H, m , HA*

2,05-1,95, 2H, m, HBd

4 66,6 4,40, 1H, t (5,3) 66,0 d 4,43, 1H, t (5,9) 5 169,3 169,2 s

6 111,9 111,5 s

7 17,3 2,20-1,95, 3H, ma 17,6 t 2,47, 1H, tipo ddt (n.m.;5,4;16,9), HA*

2,11, 1H, ddd (5,8.;11,0;16,9), HB

8 22,9 1,75-1,60, 4H, mb 22,8 t 2,05-1,95, 2H, m, HAd

1,60-1,37, 5H, m, HBe

9 80,6 3,81, 1H, ddd (1,9;6,0;10,6) 81,2 d 3,81, 1H, ddd (2,1;6,9;10,9)

10 72,9 3,65, 1H, dd (2,9;7,2) 73,5 d 3,66, 1H, tipo dt (3,2;7,5)

11 32,8 1,75-1,60, 4H, mb 32,7 t 1,60-1,37, 5H, me

12 25,3 1,30, 8H, mc 25,1 t 1,60-1,37, 5H, me

13 29,3 1,30, 8H, mc 29,2 t 1,36-1,29, 6H, mf

14 31,8 1,30, 8H, mc 31,8 t 1,36-1,29, 6H, mf

15 22,6 1,30, 8H, mc 22,6 t 1,36-1,29, 6H, mf

16 14,1 0,89, 3H, t (6,8) 14,1 q 0,89, 3H, t (6,7) IRMN de 13C e 1H a 75/300 MHz em CDCl3

(LIU & WANG, 2001). IIDeslocamentos e multiplicidades

observadas no PENDANT a 50 MHz em CDCl3. Espectro de RMN de 1H a 400 MHz em CDCl3. Correlações

1H-13C observadas no HSQC. Constantes de acoplamento (Hz) em parêntesis.

Tabela 3 – Inibição de fungos e bactérias por koningininas em ensaios de difusão em ágar.

Linhagens

Koningininas

Mistura A D E

Bacillus subtilis +++ ++ ++ ++

Escherichia coli ++ - - - Pseudomonas aeruginosa ++ - - -

Guignardia citricata - - - -

Candida tropicalis - - - -

Amostras a 1 mg/mL. +++ indicam halos com mais de 20 mm de diâmetro. O sinal – indica que não houve inibição.

Tabela 4 – Ensaios de dosagem mínima inibitória de koningininas contra fungos e

bactérias.

Linhagens

Koningininas

Mistura A D E F

Staphylococcus aureus 125 250 125 125 125

Fusarium moniliforme 125 Nd Nd Nd Nd

Aspergillus flavus 62 62 125 31 62

Colletotrichum sp. 125 Nd Nd Nd Nd

Xanthomonas axenopodis 62 250 250 250 62

Valores em µg/mL; (Nd) Não detectado.

140

Analisando os resultados expressos na Tabela 4, pode-se perceber que as

konigininas A, D, E e F apresentaram os melhores desempenhos de inibição da A. flavus,

com destaque para a koninginina E, que inibiu o crescimento do fungo na mais baixa

concentração. Em outra abordagem, Souza et al. (2008) relataram que as konigininas A, E

e F isoladas de T. koningii possuem grande capacidade de inibir atividades indutoras de

edema e enzimáticas do veneno de Bothrops jararacussu (cobra jararacuçu), com destaque

para E e F.

O presente estudo é um exemplo da importância dos fungos endofíticos para a

obtenção de substâncias com potencial farmacológico e biotecnológico e um estímulo para

a continuidade dos estudos de fungos da Amazônia.

Conclusões

O trabalho de investigação de uma linhagem endofítica de T. koningii, isolada da

planta amazônica Strychnos cogens, resultou na caracterização de treze substâncias, com

destaque para as koningininas A, D, E e F.

Essas substâncias apresentaram moderada ou nenhuma atividade antimicrobiana,

com destaque para a koninginina E que inibiu o crescimento de A. flavus na concentração

de 31µg/mL.

Outras possíveis atividades citadas na literatura, como: herbicida, inibitória a

enzimas e antioxidante, reforçam a importância e a necessidade de novos estudos da classe

das koningininas.

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142



Biodegradação dos corantes azul brilhante de remazol R e vermelho

congo por linhagens de Basidiomycetes

Ferreira A. S.1, Jesus M. A.

2

1Mestrando em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Universidade Federal do Paraná -

UFPR, 2Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia- INPA. Emails:

[email protected], [email protected]

Resumo

As enzimas lignocelulolíticas produzidas pelos fungos do filo Basidiomycota

possuem a capacidade de degradar, além da lignina, uma série de substâncias tóxicas,

como os resíduos originados pela indústria têxtil. Dentro deste contexto, o presente estudo

teve como objetivo, avaliar o potencial biodegradador dos corantes Azul Brilhante de

Remazol R e Vermelho Congo em meio sólido de onze linhagens de Basidiomycetes

isoladas da região Amazônica, acessadas na Coleção Microbiológica do INPA. È reportada

pela primeira vez a atividade degradativa dos corantes Vermelho Congo e RBBR por

Perenniporia sp., assim como a capacidade adsortiva dos mesmos corantes por Flavodon

flavus e a ação enzimática descolorante de ambos os corantes por Daedalea sp. Com base

nesses resultados, outros estudos são necessários para se avaliar melhor a atividade

lignocelulítica desses fungos, tal como o potencial biorremediador deles, visando

selecionar linhagens com alto potencial degradativo e que possam ser empregados em

processos de biorremediação representando uma alternativa sustentável e de menor custo

em substituição aos tratamentos de efluentes têxteis convencionais.

Palavras Chaves: Basidiomycetes, biodegradação e lignocelulolítico.

Introdução

A avaliação da atividade lignocelulolítica de fungos causadores da podridão branca

permite selecionar espécies com grande potencial enzimático para as mais diversificadas

aplicabilidades comerciais. Na natureza, grande parte destes fungos pertence ao filo

Basidiomycota e exercem um importante papel na ciclagem de nutrientes principalmente

do carbono nos ecossistemas florestais, representando os organismos mais eficientes

degradadores da lignina (Tuomela et al., 2000), por exemplo, os fungos causadores da

podridão branca, capazes de degradar a lignina, a celulose e a hemicelulose de um

substrato lignícola, reduzindo-as em moléculas menores até CO2 e H2O para obtenção de

energia em prol do fungo colonizador. A madeira torna-se esbranquiçada e com resistência

143

comprometida e os vários compostos formados no processo são liberados ao ambiente

(Matheus e Okino, 1998).

O complexo de enzimas inespecífico sintetizado pelos fungos Basidiomycetes

causadores da podridão branca é capaz de degradar compostos químicos clorados que

representam uma ameaça ambiental (D’Souza et al., 1999). Dentre os principais

constituintes desses complexos estão as enzimas da classe das fenoloxidases: Lacases,

Manganês Peroxidase e Lignina Peroxidase (Silva, 2004). Um exemplo desse complexo

enzimático, é o do macrofungos Phanerochaete chrysosporium Burds, descoberto na

década de 80 como um potente degradador de poluentes (Cameron et al., 2000). Com base

nesse estudo, Zouari et al. (2002) verificaram que os Basidiomycetes são capazes de

degradar substâncias como DDT [1,1-bis (4 clorofenol) -2,2,2-tricloetano], lindano

(hexaclorociclohexano), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), dioxinas, assim

como outros poluentes orgânicos clorados. Atualmente, P. chrysosporium ainda é usado

como fungo padrão nos ensaios de avaliação de atividade lignocelulolítica de macrofungos

e devido a isso, buscam-se novas espécies tropicais de interesse em pesquisas em

aplicabilidade em processos de biorremediação, que consiste na decomposição de

compostos poluentes em substâncias inertes (Jacques et al., 2010).

Considerando a intensa atividade das indústrias de manufatura que gera uma maior

emissão de subprodutos, grande parte destes não são tratados previamente antes de serem

lançados na natureza, constituindo um risco ao ambiente natural (Babá e Rosado, 2009).

Dentre estes, pode-se citar os resíduos da indústria têxtil, em que são usados corantes no

processo de tingimento de tecidos, os quais contêm constituintes químicos de alta

toxicidade com potencial mutagênico, como anéis aromáticos, fenóis e grupos azo (Brown

e Devito, 1993; Bumpus e Aust, 1987). Por serem descartados no meio ambiente, seus

efeitos tóxicos podem persistir por décadas, o que representa uma ameaça ao ecossistema e

à saúde humana (Dellamatrice, 2005). Além disso, a alta concentração de efluentes

coloridos despejados em corpos d’água reduz a penetração de luz solar, diminuindo a

atividade fotossintética e a concentração de oxigênio dissolvido na água, alterando os

ciclos biológicos naturais (Yesilada et al., 2003).

Para minimizar estes efeitos, a legislação ambiental tem sido cada vez mais

rigorosa quanto à remoção de corantes de efluentes industriais (Rosolen et al., 2004). No

entanto, na solução dos problemas, algumas limitações como custo elevado e baixa

eficiência estão presente nos atuais métodos de tratamento de efluentes o que contribue

para a não aplicabilidade de medidas preventivas no controle ambiental. Dessa maneira, o

144

aprimoramento dos métodos já existentes ou desenvolvimento de novas técnicas que sejam

mais eficientes na remoção ou contenção dos rejeitos químicos industriais antes de serem

descartados no meio ambiente são necessários (Gaylarde et al., 2005), assim como na

busca de novos organismos com potencial biodegradador, podendo ser adotado como um

pré-tratamento combinado com o sistema de tratamento convencional (Banat et al., 1996).

Neste contexto, o presente estudo visa selecionar espécies de Basidiomycetes

tropicais com potencial biorremediador. Como objetivo geral: Avaliar o potencial de

biodegradação dos corantes Azul Brilhante de Remazol R e Vermelho Congo em meio

sólido por linhagens de Basidiomycetes. Como objetivos específicos: Comparar a

degradação do corante Azul Brilhante de Remazol R e Vermelho Congo pelas linhagens de

Basidiomycetes testadas com a linhagem testemunha e selecionar as com possível

potencial biorremediador para desses corantes.

Material e Métodos

Um total de 11 linhagens de culturas de Basidiomycetes, listadas na Tabela 1, foi acessado

da Coleção Microbiológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (CMINPA).

Tabela 3: Relação das linhagens de macrofungos (Basidiomycetes) testadas no

bioensaio.

Taxa N° de registro

Agaricales CMINPA,1713

Schizopyllaceae

Schizophyllum commune Fr. CMINPA,1720

Polyporales

Polyporaceae CMINPA,1695

Antrodiella sp. CMINPA,1716

Daedalea sp. CMINPA,

Earliella corrugata (Pers.) Murrill CMINPA,1727

Panus sp. CMINPA,1729

Perenniporia sp. CMINPA,1851

Trametes modesta (Kunze ex Fr.) Ryvarden CMINPA,1737

Trametes villosa (Sw.) Kreisel CMINPA,406

Meruliaceae

Flavodon flavus (Klotzsch) Ryvarden CMINPA,1738

145

Reativação das Linhagens e preparo de inóculos padrões

As linhagens dos fungos foram repicadas em meio de cultura Extrato de Ágar Malte em

placas de Petri 5,0x1,5 cm e incubadas a 28 °C até o crescimento micelial completo na

superfície da placa. Lâminas de cada cultura foram preparadas com água destilada para

checar se as características do macrofungo estavam de acordo com as descritas na

literatura. Com auxílio de uma ponteira estéril invertida foram feitos discos miceliais

padrões de 6 mm de diâmetro, que foram transferidos para uma placa de Petri estéril,

mantida a 28 °C na estufa por 3 dias visando obter inóculos viáveis e sem presença de

contaminantes.

Teste Qualitativo de Detecção de Atividade Lignocelulolítica em Meio Sólido

Para o bioensaio adotou-se o método de avaliação de atividade lignocelulolítica descrito

por Borokhov e Rothenburger (2000), utilizando o meio de cultivo Extrato de Ágar Malte

acrescido do corante Azul Brilhante de Remazol R (RBBR) e Vermelho Congo na

concentração de 0,025%. Cada placa de 15 x 1,5 cm foi marcada com pincel dividindo-a

em quatro quadrantes de mesmo tamanho e foi colocado um inóculo padrão do fungo por

quadrante, totalizando quatro amostras sobre o meio de cultura e mantida a 28 °C. A

capacidade de descoloração foi feita medindo-se o diâmetro dos halos de descoloração e do

crescimento da colônia fúngica, retirando-se uma média do diâmetro na vertical e na

horizontal por inóculo e uma média das quatro amostras a cada 3 dias durante 12 dias.


As linhagens de Antrodiella sp., Daedalea sp., Perenniporia sp., Panus sp. e de

Polypoaraceae cresceram por completo no meio de cultivo contendo RBBR ao sexto dia,

crescimento similar ao da linhagem testemunha T. villosa, enquanto que F. flavus ocupou

toda a placa no 4° dia, com crescimento mais rápido do que o de T. villosa. Por outro lado,

E. corrugata e Agaricales apresentaram um crescimento mais lento em que o primeiro

preencheu a superfície da placa no 9° dia e o segundo no 12° dia de incubação.

Não houve formação do halo de descoloração em torno dos inóculos dos fungos testados,

com exceção os da cepa de Agaricales, que apresentou um halo de degradação com

diâmetro de 0,2 cm no terceiro dia. No entanto, houve um crescimento micelial que atingiu

o halo e ambos cresceram paralelamente até o 12° dia. O mesmo ocorreu com a linhagem

de T. modesta (CMINPA, 1737), que formou um halo de degradação com diâmetro de 0,5

cm em torno da colônia no sexto dia, sendo superado no 9° dia pelo crescimento radial das

146

hifas. Notou-se ainda que a descoloração do RBBR ocorreu até o 12° dia (Figura 1),

concordando com os de Nyanhongo et al. (2002), que observaram a capacidade desta

espécie em degradar o mesmo corante.

Figura 1- Degradação do corante Azul Brilhante de Remazol R pelas linhagens de

Basidiomycetes da Coleção Microbiológica do INPA - CMINPA (reverso da placa de

Petri), no 12° dia. A: 406. B: 1646. C: 1695. D: 1713. E: 1716. F: 1720. G: 1727. H: 1729.

I: 1737. J: 1738 e K: 1851.

As linhagens de Daedalea sp., Polyporaceae, Antrodiella sp., Agaricales, E.

corrugata, Panus sp., F. flavus e Perenniporia sp. descoloriram RBBR restritamente sob o

micélio (Figura 1). Dentre os Basidiomycetes, Perenniporia medulla-panis (Jacq.) Donk.

degradou o corante Azure B. Segundo Arantes (2008), Daedalea flavida Lév. também é

eficiente na produção de lacase. Arora e Sandhut (1985) sugerem que este fungo apresenta

147

tal atividade, que pode estar presente na cepa de Daedalea sp em vista da degradação dos

corantes RBBR e Vermelho Congo neste estudo. Dentre os fungos, S. comune e T. modesta

não foram eficientes na degradação dos corantes testados.

Outro aspecto observado nas placas de Petri trata-se da mudança da coloração das

hifas hialinas para uma tonalidade azulada, que pode ser resultante da absorção do corante

RBBR pelos fungos Polyporaceae, S. commune, T. modesta, F. flavus e Perenniporia sp.

(Figura 1.C, F, G, I, J e K).

Quanto à degradação do Vermelho Congo, o micélio das cepas de Daedalea sp.,

Polyporaceae, Panus sp., Antrodiella sp. e Perenniporia sp. ocuparam toda a placa no 6°

dia de incubação, comparável com o da testemunha T. villosa, sendo que Daedalea sp.

(CMINPA, 1646) degradou totalmente o corante vermelho congo no sexto dia (Figura 2B).

Os demais fungos degradaram totalmente o corante ao final do 12° dia. A atividade

descolorante também ocorreu sob o micélio das linhagens acima citadas. Dentre os fungos,

somente S. commune e E. corrugata não degradaram o corante, nem mesmo sob o micélio,

diferindo dos obtidos por Barbosa e Santiago (2005), que relatam que S. commune degrada

o corante Vermelho Congo e o Remazol Brilhante Laranja. No entanto, neste ensaio

observou-se que houve absorção dos corantes por esses fungos (Figura 2. F e I).

O corante Vermelho Congo também foi absorvido pelas cepas de Antrodiella sp., S.

commune, E. corrugata, Panus sp., F. flavus que apresentaram um crescimento mais

rápido que as demais testadas e a testemunha T. villosa. Além da degradação, notou-se

uma intensa absorção de ambos os corantes (Vermelho congo e RBBR), tanto pelos

inóculos quanto pelas hifas dos fungos (Figura 1J e 2J). A absorção de corantes pelos

fungos é pouco relatada em literatura. Dentre os fungos testados, F. flavus (isolado de

ambiente marinho) em testes realizados por Raghukumar et al. (2000) degradou de 60 a

90% dos corantes sintéticos entre 3 e 10 dias.

No presente ensaio observou ainda a mudança na tonalidade do meio de cultura

com a degradação do corante Vermelho Congo, tornando-o escuro. Provavelmente, a

alteração de cor deve-se à produção de exocompostos sintetizados pela linhagem de T.

modesta (Figura 2.I). Estudos posteriores de caracterização dos biocompostos gerados que

são lançados no meio após a degradação dos corantes se faz necessário no sentido de se

conhecer se estes são tóxicos ou não.

As linhagens de Daedaea sp., Polyporaceae, Agaricales, Antrodiella sp., E.

corrugata, Panus sp. e Perenniporia sp. apresentaram maior potencial de degradar o

RBBR, enquanto que Agaricales, Polyporaceae, Antrodiella sp., Daedaea sp., Panus sp.,

148

T. modesta, Perenniporia sp. em descolorir Vermelho Congo. Dentre os fungos, Daedaea

sp., Polyporaceae, Agaricales, Antrodiella sp., Panus sp. e Perenniporia sp. apresentaram

capacidade degradativa de ambos os corantes corantes RBBR e Vermelho Congo testados.

A restrição da degradação dos corantes RBBR e Vermelho Congo ao micélio, assim

como formação de halo de descoloração dos fungos testados, provavelmente deve estar

diretamente relacionado as estratégias de colonização e degradação dos macrofungos no

meio ambiente relatada por Barrasa et al. (2014). Sabe-se que os fungos de podridão

branca da madeira, principalmente os pertencentes a Polyporales por decompor substratos

de difícil metabolização necessitam secretar suas enzimas próximo ao centro da hifa, de

modo que, a descoloração ocorre no interior do micélio, enquanto os fungos de podridão

branca de liteira, principalmente os Agaricales, por colonizarem substratos mais simples,

como a serapilheira suas são secretadas por hifas jovens que se encontram nas regiões

periféricas do micélio, este fato faz com que produzam os halos de descoloração ao redor

da colônia em presença do corante. A degradação e absorção dos corantes Vermelho

Congo e RBBR pelas cepas Daedaea sp., Polyporaceae, Agaricales, trodiella sp., E.

corrugata, Panus sp., Perenniporia sp., Trametes villosa, S. commune e Flavodon flavus

mostra que a maioria apresenta potencial biorremediador. De modo que mais estudos são

necessários para elucidar melhor a capacidade biodegradativa destes fungos. Estes dados

indicam a possível aplicabilidade de novas espécies de Basidiomycetes no tratamento

sustentável alternativo de efluentes de novas espécies de Basidiomycetes no tratamento

sustentável alternativo de efluentes contaminados por corantes, principalmente do grupo

químico azoico (Melo et al., 2014), reduzindo os custos do processo em substituição aos

tratamentos convencionais.

149

Figura 2 - Degradação do corante Vermelho Congo pelas linhagens de Basidiomycetes da Coleção

Microbiológica do INPA - CMINPA (reverso da placa de Petri), no 12° dia. A: 406. B: 1646. C:

1695. D: 1713. E: 1716. F: 1720. G: 1727. H: 1729. I: 1737. J: 1738 e K: 1851

Conclusões

O crescimento micelial das linhagens de Basidiomycetes difere para cada corante (Azul

Brilhante de Remazol R e Vermelho Congo), assim como a absorção e degradação dos

mesmos.

A maioria dos fungos testados apresenta potencial biorremediador.

Dentre estes estão Daedalea sp., Polyporales, Agaricales, Antrodiella sp., Panus sp. e

Perenniporia sp., que degradaram ambos os corantes comparado com a testemunha

Trametes villosa, e S. commune, Earliela corrugata e Flavodon flavus que absorvem

ambos os corantes em meio sólido.

150

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior - CAPES pelo apoio

financeiro.

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Identificação de fungos de água doce pelo sequenciamento das regiões Its,

isolados de madeira submersa em decomposição de um lago do município

de Iranduba-AM.

Figueiredo T.F.1, Souza V.C.

2, Cortez A.C.A.

3, Souza J.V.B.de

3

1Bolsista PIBIC/CNPq - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia;

2 Pesquisador, Instituto

Leônidas e Maria Deane - FIOCRUZ - Amazônia, 3 Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected], [email protected],

[email protected]

Resumo

No ecossistema aquático, os fungos exercem vários papéis como o de decomposição de

materiais orgânicos, parasitária, predadora e mutualista. No bioma Amazônico, atuam na

decomposição do material orgânico que se deposita no fundo dos rios promovendo a

clivagem dessas matérias, suprindo toda uma cadeia alimentar a partir dos substratos

gerados por essa ação. Embora representem grande importância, estudos científicos que

relatem a biodiversidade desses microrganismos presentes no ecossistema de água doce

amazônico são escassos. Dessa forma, observando-se a necessidade de preencher essa

lacuna, este trabalho teve como objetivo, realizar a identificação de fungos de água doce

provenientes de um lago do Município de Iranduba, através da aplicação da metodologia

de sequenciamento das regiões Its do rDNA de 11 amostras que se encontravam

preservadas sob refrigeração em geladeira há mais de um ano. Obteve-se o sequenciamento

satisfatório de quatro amostras, onde Spinulospora pucciophila apresentou 90% de

similaridade com o fungo Rigidopurus crocatus, Dothideomycetes 1 apresentou 99% de

similaridade com o fungo Exophiala oligosperma, Mitosporico 1 apresentou 100% de

similaridade com a classe Calosphaeriales, e Sordariomycetes 4 apresentou 97% de

similaridade com Aquaticola hogkongensis. A aplicação da metodologia de

sequenciamento das regiões Its do rDNA demonstrou-se satisfatória na identificação de

microrganismos pouco conhecidos.

Palavras-chave: Decomposição, Biodiversidade, Amazônia, Dothideomycetes,

Mitosporico

Introdução

Os fungos são seres aclorofilados e heterotróficos, ou seja, incapazes de produzir os

nutrientes necessários para a sua alimentação, vivendo dessa forma como saprófitos ou

parasitas; são eucariontes e possuem em sua membrana celular, um esterol encontrado

exclusivamente neles, o ergosterol. São divididos pela diferença apresentada em sua

morfologia em duas formas distintas: unicelulares (leveduras) e pluricelulares (bolores)

(Oliveira, 2012). Atualmente, estima-se que haja no mundo aproximadamente 1,5 milhões

https://www.facebook.com/ILMD-Fiocruz-Amaz%C3%B4nia-228237057251701/

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153

de espécies desses microrganismos (Hawksworth, 2001). Estão presentes nos mais diversos

ecossistemas e podem ser facilmente isolados dos mais diversos substratos (Oliveira,

2012).

A partir de 1971, o Instituto de Micologia das Comunidades Britânicas, responsável

pela edição do Dicionário de Fungos de Ainsworth e Bisby, elevou os fungos à categoria

de Reino, devido ao seu peculiar modo de alimentação através de absorção e as relações

filogenéticas que possuem entre si (Whittaker, 1969). Até então, a identificação das

espécies era realizada através da análise de suas características macro e micromorfológicas

(taxonomia clássica). Porém, com o advento das técnicas moleculares, mais

especificamente da sequência de multilocus, os cientistas melhoraram a classificação

filogenética desses microrganismos, analisando e avaliando as relações existentes entre

suas famílias e baseando-se nas similaridades das suas sequências gênicas. De acordo com

a classificação mais moderna, são identificados oito Filos, sendo alguns deles ainda

praticamente desconhecidos por falta de material científico que os descreva (ICB, 2012).

No ecossistema aquático, os fungos exercem vários papeis, como o de

decomposição de materiais orgânicos, parasitária, predadora e mutualista (Shearer et al.,

2007). No bioma amazônico, atuam na decomposição do material orgânico que se deposita

no fundo dos rios, promovendo a clivagem dessas matérias, suprindo toda uma cadeia

alimentar a partir dos substratos gerados por essa ação. Além disso, auxiliam na limpeza

das águas dos rios e lagos (Pusch et al., 1998). Embora representem grande importância,

são escassos os estudos científicos que relatem a biodiversidade desses microrganismos

presentes no ecossistema de água doce amazônico (Galliza, 2011).

No Brasil, poucos trabalhos foram realizados investigando-se a diversidade de

fungos em ambientes aquáticos (Silveira, 2012). Um estudo realizado por Galliza (2011)

explorou a diversidade de fungos em água doce no sudeste do país. Especificamente na

Amazônia, apenas um trabalho foi realizado, porém, diz respeito à Amazônia peruana, e

foi realizado por Shearer et al. (2015). Isso demonstra a pobreza de informações a respeito

dos microrganismos existentes nos ecossistemas aquáticos amazônicos. Essa ausência de

informações acarreta em atraso científico, perda de material biológico em função da

biopirataria, perda do desenvolvimento de possíveis novos compostos para o combate de

doenças, além do desconhecimento do real valor e papel dos fungos nesse habitat

(Drummond et al., 2009).

Na Amazônia existem três tipos de águas: pretas, brancas e claras, e cada uma delas

possui uma microbiota típica (Silva, 2013). A coleta de material biológico fúngico nesses

154

ambientes foi realizada através de coleta randômica de pedaços de madeiras dos fundos

dos rios e lagos. Em seguida o material foi incubado, e após sete dias, as estruturas

fúngicas existentes foram observadas por meio de microscopia, visando sua identificação;

as características fenotípicas apresentadas pelos microrganismos encontrados foram

submetidas a chaves taxonômicas e seu DNA investigado através da técnica de

sequenciamento genético (Barbosa, 2011).

Trabalhos com esse desenho de investigação são importantes, uma vez que a

sociedade tem invadido e destruído o meio ambiente, ocasionando perdas da diversidade.

Dessa forma, a necessidade de se conhecer as espécies de fungos que habitam as águas

doces da Amazônia aponta para um potencial de descoberta científica ainda não explorada,

e abre portas para a busca de novos compostos químicos e farmacológicos que poderão

auxiliar no combate de inúmeras doenças.

Em vista disso, a proposta deste trabalho foi realizar a identificação de fungos de

água doce provenientes de um lago do Município de Iranduba, através da aplicação da

metodologia de sequenciamento das regiões Its do rDNA.

Material e Métodos

Através de expedições de coleta realizadas em um lago de águas negras localizado no

Km 23 da estrada Manuel Urbano – Iranduba, foram coletadas 40 amostras de madeiras

que estavam depositadas no fundo do mesmo. São pedaços de paus e pequenos gravetos

em decomposição (Figura 1). Esse material foi trazido ao Laboratório de Micologia onde

foi incubado por sete dias à temperatura ambiente. Após, através de microscopia, foram

observadas as estruturas reprodutivas desses microrganismos (Figura 2). Os mesmos foram

isolados para cultivo em placas de Petri contendo meio Agar Batata Dextrose (BDA) para a

produção de biomassa.

Figura 1- Material vegetal coletado do fundo do lago em Iranduba

155

Figura 2- Estruturas reprodutivas isoladas utilizadas para semeadura

Foram selecionados 11 isolados e semeados em triplicata em tubos de ensaio contendo

meio Batata Dextrose Ágar (BDA), incubando-os à temperatura ambiente, aguardando-se

sua maturação durante cerca de quatro meses. Em seguida, as amostras foram submetidas

ao processo de extração de DNA através da metodologia descrita por Ferrer et al. (2009),

que consiste em:

Extração do DNA: Os micélios foram transferidos para microtubos de 2 mL. A seguir,

adicionou-se ao tubo 500 µL de tampão de lise (contendo SDS a 0,5%, NaCl a 1,4%,

EDTA a 0,73% e 20 mL de Tris-HCl para 100 mL de água destilada) e 5 µL de β-

mercaptoetanol. Os microtubos foram submetidos a aquecimento de 65 ºC por 1 hora, com

a finalidade de romper as estruturas celulares. Foram adicionados 500 µL de uma solução

fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (v:v:v 25:24:1). O material foi agitado em vortex até a

obtenção de uma suspensão homogênea. Em seguida, essa suspensão foi centrifugada

(14.000 rpm, 15 minutos) e o sobrenadante foi retirado e transferido para um novo

microtubo de 1,5 mL. Adicionou-se Isopropanol ao sobrenadante em volume igual; a

mistura foi homogenizada e incubada a -20 oC overnight, para precipitação do DNA. O

DNA precipitado foi centrifugado (14.000 rpm por 15 minutos), lavado duas vezes

seguidas com etanol 70% e ressuspendido em 100 µL de água-bidestilada estéril.

Quantificação do DNA: A concentração de DNA foi estimada em espectrofotômetro Gene

Quant pro 127 V; a absorbância medida foi a de 230 nm a 260 nm. Foram realizadas duas

quantificações do DNA puro. Em seguida, as amostras foram submetidas ao processo de

Reação de PCR, de acordo com o protocolo descrito por White et al. (1990):

Reação de PCR: Teve um volume final de 50 µL consistindo de Tampão de PCR (10 mM

Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 0,5 µM dos primers ITS-1 (5'-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS-4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), 200

µM dNTPs, 1,5U ampli-tag DNA polimerase e 100 ng do DNA fúngico. As amostras

foram levadas ao termociclador onde: após desnaturação inicial de 94 o

C por 5 min, foram

realizados 35 ciclos de desnaturação do DNA 94oC por 1 min, anelamento a 55

oC por 1

156

min e extensão a 72 oC por 2 min e por fim foi realizada uma extensão final a 72

oC por 10

minutos. Os produtos de DNA foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%,

corados com brometo de etídio a 0,5µg.mL-1

, visualizados em transiluminador e

fotografados. Por fim, as reações amplificadas foram purificadas seguindo a descrição de

Dunn e Blattner (1987):

Purificação do DNA amplificado: Os produtos de amplificação foram purificados

utilizando-se uma solução de polietilenoglicol-PEG (10g de polietilenoglicol 800, 7,3 g de

NaCl em 35 mL de água). Volumes iguais das soluções de PEG e de amplicons foram

transferidos para microtubo (1,5 mL), homogeinizados e incubados (37 ºC por 15 minutos).

Em seguida, a mistura foi centrifugada (15 minutos a 6.000 g), o sobrenadante foi

descartado, o precipitado foi lavado duas vezes com etanol a 70%, seco em estufa de

secagem até a evaporação completa de todo o etanol. Em seguida, os produtos foram

ressuspensos em água-bidestilada estéril em volume igual ao da PCR e receberam agitação

de 10 segundos. Foram armazenados à temperatura de - 20 o

C overnight para melhor

eluição do DNA.

Edição e alinhamento das sequências: Os fragmentos de DNA foram sequenciados nas

direções senso e antissenso no Laboratório de Genômica do Instituto Leônidas e Maria

Deane - ILMD/Fiocruz, Manaus. A edição dos eletroferogramas gerados foi realizada com

o auxílio do programa BioEdit v7.2.5. Sequências de referência correspondentes a região

genômica do Its foram comparadas com outras regiões depositadas no GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) pela ferramenta BLAST. As sequências que

mostraram boa qualidade foram submetidas à análise filogenética através dos softwares:

MUSCLE, T-Coffee, ClustalW e ProbCons, encotrados no site www.phylogeny.fr.


Das 11 amostras que tiveram seu DNA sequenciado, quatro apresentaram

sequências satisfatórias para a análise filogenética (Figura 3).

157

Figura 3- Árvore filogenética das amostras sequenciadas e suas similaridades.

Os representantes do filo Basidiomycota estão divididos em três classes/sub-filos:

Agaricomycotina, Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. São considerados cosmopolitas

que vivem predominantemente em ambiente terrestre, mas podem ocorrer em ambiente

aquático. Conhecidos popularmente como cogumelos, têm como característica principal a

presença de basídio contendo basidiósporos. São predominantemente miceliais, podendo

também ser unicelulares ou pseudomiceliais. A reprodução é sexuada e ou assexuada. São

sapróbios, porém, alguns são parasitas de animais, algas, vegetais e de outros fungos

(Hibbett et al., 2007). O pareamento das sequências genicas da amostra Spinulospora

pucciophila com o fungo Rigidopurus crocatus apresentou 90% de similaridade e seu

posicionamento na árvore filogenética demonstra a alta semelhança entre essas espécies.

A classe Dothideomycetes, filo Ascomycota, apresenta o ascomata na forma de

cleistotécio ou peritécio com ascos bitunicados ou fissitunidados. Podem ser patógenos de

vegetais, endófitos ou sapróbios. Crescem em restos de madeira e folhas em decomposição

(Spatafora et al., 2006). As espécies de água doce correspondem a aproximadamente 30%

158

dos Ascomycetes aquáticos e pertencem ao táxon Pleosporomycetidae, principalmente nas

ordens Pleosporales e Jahnulales (Shearer et al., 2007). Os Dothideomycetes mais descritos

em ambientes de água doce são Jahnula e Mamillisphaeria (Vijaykrishna et al., 2006;

Zhang et al., 2006). No presente trabalho, a amostra Dothideomycete 1 apresentou 99% de

similaridade com o fungo Exophiala oligosperma, e sua localização na árvore filogenética

indica alta similaridade entre os microrganismos.

Fungos Anamorfos ou Mitospóricos têm como característica principal, a

reprodução assexuada, onde ocorre a produção de conídios. Podem ter a forma filamentosa

ou leveduriforme, onde a reprodução é por brotamento e formação de pseudomicélio. São

sapróbios, parasitas e mutualistas. Neste grupo encontram-se os Hifomicetos aquáticos, os

quais apresentam os conídios hidrodinâmicos ou tetraradiados, classificados como fungos

ingoldianos e aeroquáticos, são cosmopolitas, mas predominando em ambientes lóticos

(Shearer et al., 2007; Barlocher, 2009; Jones e Pang, 2012). No presente trabalho, a

amostra Mitosporico 1 apresentou 100% de similaridade com a classe Calosphaeriales e

sua posição na árvore indica alta semelhança entre esses microrganismos.

A classe Sordariomycetes do filo Ascomycota é a mais importante entre os fungos

de água doce. Na atual classificação, encontram-se três subclasses a Hypocreomycetidae,

Sordariomycetidae e Xylariomycetidae. Apresentam o ascoma em forma de peritécio ou

com menos frequência, cleistotécio; os ascos são inoperculados e unitunicados ou

prototunicados. A presença ou ausência de um anel apical (amilóide ou não amilóide) é

uma característica importante na classificação. Esses são organismos cosmopolitas e atuam

em quase todos os ecossistemas como sapróbios, agentes patogênicos, endofíticos e

parasitas, de artrópodes, mamíferos e fungos (Zhang et al., 2006; Donga et al., 2009). Os

gêneros, pertencentes aos Sordariomycetes, exclusivos de água doce são Aquaticola,

Cataractispora, Pseudoproboscispora, Rivulicola e Torrentispora (Vijaykrishna et al.,

2006; Zhang et al., 2006). No presente trabalho, a amostra Sordariomycete 4 apresentou

97% de similaridade com Aquaticola hogkongensis, e sua localização na árvore

filogenética indica alta similaridade entre os microrganismos.

Conclusão

Através do sequenciamento das regiões Its do rDNA das 11 amostras, obteve-se

quatro sequenciamentos satisfatórios, possibilitando um alinhamento ao nível de gênero e

159

classe, demonstrando dessa forma, que a técnica é satisfatória para encontrar correlação

genética de microrganismos pouco conhecidos.

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Análise nutricional e microbiológica de resíduos de abacaxi Ananas sp.

Galúcio V.A.1, Teixeira N.S.

2, Prestes A.G.

2, Nunes A.S.

1, Sales-Campos C.

3

1

Doutoranda em Biotecnologia – Universidade Federal do Amazonas, 2

Bacharel em Zootecnia –

Universidade Federal do Amazonas, 3

Doutora em Biotecnologia – Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected],


Resumo

O Brasil é um país de grande atividade agrícola, sendo o terceiro maior produtor de frutos

tropicais. O processo de industrialização nesta área gera resíduos, causando sérios

problemas, como a poluição ambiental, porém o seu aproveitamento é uma forma para

gerar produtos de valor agregado, como na alimentação animal, por serem fontes valiosas

de proteínas, fibras, vitaminas, minerais e compostos antioxidantes, como é o caso dos

resíduos de abacaxi (Ananas sp.), fruta bastante consumida tanto in natura quanto

industrializada. Além do valor nutricional, é importante observar as características

microbiológicas que indicam se as condições sanitárias destes resíduos são satisfatórias.

Sendo assim, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a composição

nutricional e microbiológica dos resíduos de abacaxi (casca e coroa), visando sua

utilização como suplemento na alimentação animal. As análises nutricionais realizadas

quanto ao teor de umidade, matéria seca, MM, NT, PB, EE, FDN, FDA, pH e SST,

demonstraram que importantes características nutricionais da fruta in natura são mantidas

nas partes residuais. Nas análises microbiológicas, realizadas através da Técnica de Tubos

Múltiplos, observou-se a presença de colônias características do grupo coliformes. As

análises bromatológicas realizadas demonstraram a viabilidade do aproveitamento destes

resíduos para a alimentação animal.

Palavras-chave: Alimentação animal; Análise microbiológica; Aproveitamento de

resíduos; Valor nutricional.

Introdução

O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e líder na produção de

frutas tropicais, chegando a aproximadamente 44 milhões de toneladas de frutos por ano

(IBGE 2012). Por ser um país de grande atividade agrícola, é um dos que mais produzem

resíduos agroindustriais, que podem representar sérios problemas, como a poluição

ambiental gerada pelas indústrias, sendo que o destino correto para os mesmos ainda não é

feito de maneira ecologicamente correta (Silva et al., 2013).

Uma das alternativas para a utilização dos resíduos agroindustriais é seu uso na

alimentação animal, por serem fontes valiosas de proteínas, fibras, vitaminas, minerais e



162

compostos antioxidantes, importantes para um bom desempenho das funções fisiológicas

humanas ou animais (Kim et al., 2007, Pieniz et al. 2009). Além do valor nutricional, é

importante observar as características microbiológicas que indicam se as condições

sanitárias destes resíduos são satisfatórias, principalmente quanto à presença de

microrganismos patogênicos como coliformes termotolerantes, o que pode ser facilmente

avaliado através de análises microbiológicas.

Segundo Martins et al. (2000), na criação de ruminantes, a alimentação é

responsável por grande parte dos custos (60 a 70%), principalmente em regiões de difícil

acesso como a Amazônia. Portanto, é de fundamental importância conhecer as

características dos alimentos e seu balanceamento na formulação de rações, as quais devem

ser formuladas para suprir as necessidades dos animais, explorando sua máxima

capacidade digestiva.

Sendo assim, as pesquisas que visam alimentos alternativos vêm ganhando atenção,

especialmente a utilização de resíduos que seriam descartados na natureza e que

apresentam valor nutricional e propriedades semelhantes a outras partes da fruta, como é o

caso do abacaxi, Ananas sp., utilizado tanto para o consumo in natura quanto na

industrialização, em diferentes formas: pedaços em calda, suco, pedaços cristalizados,

geleias, licor, vinho, vinagre e aguardente (Franco, 1989).

A composição química do abacaxi varia muito de acordo com o local e clima onde

é produzido, possuindo elevado valor energético, devido à sua alta composição de açúcares

e valor nutritivo pela presença de sais minerais (cálcio, fósforo, magnésio, potássio, sódio,

cobre e iodo) e de vitaminas, principalmente ácido ascórbico, tiamina, riboflavina e

Niacina (Franco, 1989).

Conhecendo-se a qualidade nutritiva dos subprodutos gerados e os baixos custos

dos mesmos, pode-se determinar a forma de inclusão em dietas para ruminantes. Sendo

assim, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a composição

nutricional e microbiológica dos resíduos de abacaxi (casca e coroa), visando sua

utilização como suplemento na alimentação de ruminantes.

Material e Métodos

Os resíduos de abacaxi (casca e coroa) foram doados pela Fábrica de Polpa de

Frutas de Parintins Parintins Polpas e levados ao Laboratório de Nutrição Animal do

163

ICSEZ – Parintins/AM para serem triturados, expostos ao sol para secagem, sendo

posteriormente moídos e armazenados para análises bromatológicas descritas abaixo.

O teor de umidade foi determinado pelo método de dessecação de cada amostra até

massa constante, em estufa modelo 315 SE a 105°C (AOAC, 2012). A umidade foi

expressa em %, pela fórmula abaixo e a massa seca foi calculada como sendo MS% = 100

– U.

U% = M1 – M2 x 100

M1

U = Percentual de umidade; M1 = Massa inicial da amostra; M2 = Massa final da amostra

As análises de cinzas foram feitas com adição de 1,0g das amostras em cadinhos,

em triplicata, posteriormente submetidos em forno mufla a 550°C por 4 horas. As cinzas

foram pesadas e os resultados expressos em porcentagem (AOAC, 2012)

Para análise do nitrogênio total aplicou-se o método de Kjeldahl, envolvendo três

etapas: digestão, destilação e titulação. As amostras foram digeridas com ácido sulfúrico

até conversão em sulfato de amônia. Após este processo, o sulfato de amônia foi destilado

em destilador de nitrogênio Marcone-MA036 em meio básico (NaOH 60%), liberando gás

amônia o qual foi recolhido em ácido bórico formando borato de amônia. O borato de

amônia foi titulado com ácido clorídrico a 0,1N (Silva e Queiroz 2002). Os resultados

foram expressos em % de nitrogênio utilizando-se a fórmula abaixo.

Nitrogênio % = (V x N x 0,014 / M) x 100

V = Volume em mL de HCL gasto na titulação; N = 0,1; M = Massa da amostra (g)

Para a conversão do nitrogênio em proteína foi utilizado à fórmula: N% x 6,25,

considerando-se que 100g de proteína contêm, em média, 16% de nitrogênio.

O extrato etéreo foi realizado através da adição de 1g de amostra em cartuchos tipo

Soxhlet o qual passou por um processo de extração contínua em conjunto Soxhlet por um

período de 4 a 5 horas em temperatura de 30 a 60°C, tendo o éter de petróleo como

reagente extrator. A gordura extraída foi calculada pela diferença de peso (AOAC 2012).

Os teores de fibra em detergente neutro e em detergente ácido (FDN e FDA) foram

determinados através da adição de 0,350g da amostra em saquinho (TNT gramatura

164

100g/m2) o qual passou por um processo de hidratação por 30 minutos, seguida pela adição

da solução de ureia e alfa amilase. Essa mistura permaneceu em Banho Maria a

temperatura de 90°C por 15 minutos. Após esse processo, foi realizada a digestão em

detergente neutro para FDN e digestão em detergente ácido para FDA. As amostras foram

então lavadas com água deionizada e os saquinhos passaram por um processo de secagem

em estufa de circulação de ar forçada a 105°C por 4 horas (Silva e Queiroz, 2002).

Para a medição do pH foram adicionadas 10 gramas das amostras em 90 mL de

água destilada, em triplicata (AOAC, 2012). As suspensões foram submetidas à agitação

por cinco minutos e, após sedimentação, foi realizada a leitura em potenciômetro digital

portátil KASVI – K390014P.

Para medir o índice da solução de açúcar contido nas amostras (sólidos solúveis

totais) foi utilizada a refratometria. Com o uso de refratômetro portátil Instrutherm RTB-

300 foram medidos os índices de refração da solução de açúcar contido nas amostras, onde

10 gramas destes foram homogeneizados em 100 mL de água destilada e os resultados

expressos em grau BRIX como sólidos solúveis (AOAC, 2012).

Foi realizada a contagem padrão de Coliformes Totais e microrganismos

Termotolerantes, através da Técnica de Tubos Múltiplos e os resultados dados em

Números Mais Prováveis (NMP) e Unidade Formadora de Colônia (UFC), segundo a

AOAC (2012). As análises foram realizadas de acordo com a legislação determinada pela

ANVISA sobre padrões microbiológicos – RDC nº12 (Brasil 2001).

Inicialmente, como padrão para amostras sólidas, foram realizadas duas diluições,

sendo a primeira 1:50 (10 gramas de amostra em 490 mL de água destilada) e a segunda

1:10 (25 mL da primeira diluição em 225 mL de água peptonada a 0,1%). A partir desta

segunda diluição, considerada 5.10-2

, foram preparadas diluições decimais sucessivas, pela

transferência de 1 mL da diluição anterior em 9 mL de diluente água peptonada a 0,1%, até

10-4

. Essas diluições foram utilizadas para a determinação dos microrganismos em meios

de cultura vertidos em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos em seu interior.

Foram utilizados os seguintes meios de cultura, Caldo Lauryl e Caldo EC para o

crescimento de coliformes totais e Escherichia coli e Caldo SC (Selenito de Cistina) para

Salmonella sp. Após a inoculação, os tubos foram encubados em estufa bacteriológica a

35ºC por 3 dias, a leitura foi realizada a cada 24 horas para a observação de produção de

gás e turvação do meio. Após este período, alíquotas de 100 µL retiradas dos tubos

contendo Caldo SC foram adicionadas em placas de Petri, em triplicata, contendo os meios

TSI (Triple Sugar Iron Agar) e BVB (Agar Verde Brilhante modificado), incubadas a 35ºC

165

por 3 dias para a confirmação da presença de Salmonella sp. A identificação das colônias

foi feita de acordo com as características morfológicas descritas pelo fabricante de cada

meio específico, baseado na cor, aspecto e alteração do meio pelo crescimento de colônias

características.

Os dados das análises foram avaliados segundo a Instrução Normativa nº 7, de 5 de

abril de 1999, da Secretaria de Desenvolvimento Rural do Ministério da Agricultura e do

Abastecimento (Brasil 1999).


Os dados das análises nutricionais constam na Tabela 01, sendo relevantes para

avaliar características fundamentais para o aproveitamento dos resíduos de abacaxi

coletados, transformando-os em produtos de valor agregado para suplementação da ração

animal.

Tabela 1: Dados das análises nutricionais de resíduos de abacaxi (casca e coroa).

Resíduo Característica físico química dos resíduos

U MS MM NT PB EE FDN FDA pH SST

Abacaxi

(Casca) 89,62 10,38 3,47 1,13 7,08 1,56 51,41 21,71 4,1 2,9

Abacaxi

(Coroa) 83,42 16,57 4,98 1,78 11,15 1,68 58,49 30,50 5,6 1,3

U (%) – umidade; MS (%) – matéria seca; MM (%) – matéria mineral; NT (%) – nitrogênio total; PB (%) –

proteína bruta; EE (%) – extrato etéreo; FDN (%) – fibra em detergente neutro; FDA (%) – fibra em

detergente ácido; pH – potencial hidrogeniônico; SST (ºBrix) – sólidos solúveis totais.

As análises realizadas demonstraram que importantes características das frutas in

natura são mantidas nos resíduos após seu processamento (Soares 2004, Gondim 2005).

Verifica-se que a umidade obtida nos resíduos, casca (89,62%) e coroa (83,42%)

aproximam-se do valor de teor de água da fruta in natura, que é de 86,46% (Costa et al.,

2007). Após processo de secagem, os teores de matéria seca obtidos nos resíduos casca e

coroa foram de 10,38% e 16,57%, respectivamente. A umidade é uma característica

importante demonstrada na coloração e sabor das frutas (Souza et al., 2008). Estes

resultados indicam a influência do clima da região Amazônica na umidade das frutas como

um alto valor presente também nos resíduos, fator este destacado por Abud e Naraim

(2009), como sendo de grande importância, uma vez que a umidade presente no material

interfere na preservação do alimento.

166

De acordo com Bortolatto e Lora (2008), os teores de cinzas variam em função da

localidade da plantação e da composição do solo onde crescem. Os valores das cinzas

foram de 3,47% e 4,98% para casca e coroa, respectivamente. Costa et al. (2007)

encontraram valores de cinzas de 2,15% para o pó do resíduo de abacaxi desidratado e

2,03% na casca do abacaxi. É importante observar que a composição das cinzas

corresponde à quantidade de substâncias minerais presentes nos alimentos, são

consideradas como medida geral de qualidade e frequentemente é utilizada como critério

na identificação dos alimentos (Chaves et al. 2004).

Em relação ao conteúdo de nitrogênio, observaram-se valores de 1,13% e 1,78%

para casca e coroa, respectivamente (Tabela 1). Os teores de proteína acompanharam os

mesmos valores de nitrogênio já que a proteína é determinada pela quantidade de N% em

cada amostra multiplicada pelo fator 6,25.

A casca do abacaxi apresentou teor de PB de 7,08% e 1,56% de EE; enquanto que a

coroa apresentou 11,15% de PB e 1,68% de EE, segundo Van Soest (1994) as condições

mínimas para satisfazer o bom funcionamento do rúmen varia de 6 a 8% de proteína bruta.

Com relação aos alimentos convencionais, o valor de PB dos resíduos de abacaxi

aproximou-se dos valores encontrados para o milho com 7,88% de PB e polpa cítrica com

6,77% (Rostagno et al. 2011) esses resíduos quando devidamente balanceados podem ser

uma alternativa prática e econômica para as épocas de escassez de forragem.

Os valores de FDN e FDA da casca do abacaxi foram de 51,41% e 21,71%,

respectivamente, e para coroa de abacaxi estão entre 58,49% e 30,50%, respectivamente.

Segundo Figueiredo (1996) os alimentos com percentuais de FDN acima de 35% garantem

teor normal de gordura do leite e, segundo as recomendações do NRC (1989) para

alimentação de vacas em lactação o valor exigido é no mínimo de 21% de FDA. Segundo

Van Soest (1994), elevados níveis de FDA das forragens estão associados à menor

digestibilidade do alimento. Alimentos fibrosos são importantes na manutenção da taxa de

passagem no trato gastrointestinal, mas que em maiores concentrações pode limitar o

consumo e comprometer o desempenho dos animais, podendo ser necessário algum tipo de

tratamento químico ou biológico dependendo do processo de aproveitamento empregado

(Alencar 2005, Sales-Campos 2008).

O pH encontrado foi de 4,1 e 5,6 para casca e coroa, respectivamente. A acidez do

abacaxi é devida, principalmente, aos ácidos cítrico e málico, que contribuem,

respectivamente, com 80 e 20% da acidez total (Dull 1971). Segundo Costa et al. (2007), a

acidez é um parâmetro importante na apreciação do estado de conservação de um produto

167

alimentício, sendo este um fator de fundamental importância na limitação dos diferentes

microrganismos capazes de se desenvolver no produto (Hoffmann 2001).

Os valores de sólidos solúveis totais expressos em °Brix encontrados nas amostras

dos resíduos de abacaxi foram de 2,9 para a casca e 1,3 para a coroa. O alto suprimento de

água diminui a percentagem de açúcarese estão de acordo com Sales-Campos (2008) que

evidenciou pouca ou ausência desses compostos, indicando baixo conteúdo de açúcares.

Foram realizadas análises microbiológicas com intuito de verificar fatores que

pudessem potencializar a possibilidade de contaminação, demonstrando as condições

higiênico-sanitárias dos resíduos após secagem e trituração, avaliando-se assim a

necessidade de se aplicar técnicas mais eficientes de desinfecção antes de seu

aproveitamento, pois alterações microbiológicas são indesejáveis em qualquer tipo de

alimento bem como a presença de patógenos.

Os resultados das análises microbiológicas (Tabela 2) demonstraram características

preocupantes, pois apresentaram resultados positivos elevados para coliformes nas cascas e

nas coroas dos frutos de abacaxi.

Tabela 2: Avaliação microbiológica com pesquisa de Coliformes a 35ºC (Totais e

Termotolerantes) e Salmonella sp. em amostras de resíduos de Abacaxi (casca e coroa).

Amostra Microrganismo

Coliformes (NMP/g) Salmonella sp. em 25g

Abacaxi (Casca) 150 +

Abacaxi (Coroa) >1.100 +

Os testes quantitativos em placas de Petri contendo os meios TSI e BVB seletivos

para a detecção de Salmonella sp. foram positivos, demonstrados pela presença de

crescimento de colônias características nas amostras de abacaxi (casca e coroa). Entretanto,

dependendo do uso a que se destinam tais resíduos, como para a produção de ração animal

em condição asséptica, recomenda se o processo de esterilização do resíduo.

Os resultados foram avaliados a partir do critério de presença e ausência de

crescimento microbiano, de acordo com a legislação vigente para polpa de frutas, tendo em

vista que não existe uma legislação específica para análise de resíduos, mas levou-se em

consideração a característica patogênica dessas bactérias, principalmente quando se busca

o aproveitamento para a nutrição animal.

168

Conclusões

As análises realizadas demonstraram a viabilidade do aproveitamento dos resíduos

de abacaxi para a suplementação na alimentação animal.

As análises nutricionais confirmaram que muitas características dos resíduos de

abacaxi in natura são semelhantes as das partes residuais após processamento, importantes

na nutrição animal, podendo o resíduo ser utilizado como suplemento na dieta dos

ruminantes, de modo a reduzir os custos com alimentação.

Os resíduos de abacaxi secos apresentaram boas características (acidez, pH e

umidade), permitindo o armazenamento destes por longos períodos, em condições

adequadas.

As análises microbiológicas evidenciaram a necessidade de se empregar técnicas de

desinfecção antes do processo de aproveitamento, tais como a autoclavagem a 121 ºC,

capaz de eliminar microrganismos mais resistentes.

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Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA

Caracterização parcial de protease alcalina produzida por Aspergillus

pulverulentus em resíduo lignocelulósico

Gomes, D.M.D.

1, Nascimento, A.P.F.

1, Silva, L.P.

1, Amaral, P.A.S.

1, Machado, A.R.G.

2,

Martim, S.R.2, Alecrim, M.M.

2, Teixeira, M.F.S.

3

1Graduando em Ciências Biológicas na Universidade Federal do Amazonas,

2Mestre em Ciências

do Alimentos na Universidade Federal do Amazonas, 3Professor Associado na Universidade

Federal do Amazonas. E-mail: [email protected], [email protected],

[email protected].

Resumo

As proteases são enzimas de origem vegetal, animal e microbiana que apresentam ampla

aplicabilidade industrial. Este trabalho teve por objetivo caracterizar as proteases de A.

pulverulentus obtidas por fermentação em matriz sólida. A. pulverulentus foi cultivado em

exocarpo de cupuaçu e semente de açaí suplementados com farelo de arroz, amido e

peptona, na proporção de 9:1, pH 6,0. O bioprocesso foi conduzido a 30ºC por sete dias.

As enzimas foram extraídas com água destilada esterilizada, sob agitação (200 rpm) por 15

minutos e o extrato bruto foi recuperado por filtração a vácuo. A atividade proteolítica foi

determinada utilizando azocaseína como substrato. As proteases desse fungo apresentaram

maiores atividades sob pH 8 e temperatura de 60°C e, os íons Cu2+

e Zn2+

reduziram a

atividade das peptidases, enquanto os íons Ca2+

estimularam a atividade. A. pulverulentus

produz proteases com potencial para aplicação na indústria de detergentes.

Palavras-chave: peptidases, fermentação, atividade proteolítica.

Introdução

Proteases, peptidases ou proteinases são enzimas produzidas por bactérias, fungos,

animais e vegetais que podem ser usadas no processamento de alimentos, couro, produtos

farmacêuticos, na recuperação de prata de filmes de raios-x, tratamento de resíduos

industriais e como aditivos detergentes. Entre essas enzimas que diferem uma da outra pela

especificidade do substrato, sítio ativo e mecanismo de ação, as de origem microbianas são

as mais importantes e constituem aproximadamente 70% do mercado total de enzimas

comercializadas (Rodarde et al., 2011; Srilakshmi et al., 2014).

Entre os produtores de proteases, os fungos são fonte potencial, por sua

susceptibilidade à manipulação genética, pela diversidade bioquímica ampla, alta




172

produtividade e por serem facilmente recuperáveis do meio de fermentação. Além desses

fatores, a maioria das espécies tem comprovado potencial econômico e capacidade de

sintetizar e excretar biocompostos em larga escala (Neustadt et al., 2009).

Várias espécies de fungos filamentosos têm sido exploradas em processos

industriais para a produção de metabolitos, em especial enzimas que são usadas na

indústria de alimentos, farmacêutica e como aditivo de detergentes. Dentre estes, os

Aspergillus são geralmente considerados como seguros, condição que favorece o uso de

espécies para a produção de proteases ácidas, neutras e alcalinas (Tichota et al., 2010;

Cavalcante-Silva, 2015; Escaramboni1 et al., 2013; Castro e Sato, 2014).

Aspergillus pulverulentus está classificado no grupo niger, representado por

espécies de ocorrência mundial e que podem ser isolados de diversos substratos, solo,

grãos, produtos lácteos e forragens, várias frutas, legumes, feijões, nozes, tecidos e carnes.

As espécies não toxigênicas desse grupo são utilizadas na indústria de fermentação para

produzir várias enzimas e ácidos orgânicos (Jurjević et al., 2012).

Entre os processos usados para a produção de proteases, a fermentação no estado

sólido vem sendo um método mais adequado, porque os substratos sólidos oferecem

condições semelhantes ao habitat natural dos fungos, proporcionando assim, crescimento

adequado e a secreção de uma variedade de enzimas extracelulares. Também é um

processo simples, de baixo custo, que favorece rendimentos elevados e concentrações das

enzimas e o uso de resíduos agrícolas de baixo valor econômico e amplamente disponível

ambientalmente. No Brasil, esse processo desperta interesse nas áreas que disponibilizam

quantidades de resíduos agroindustriais, por exemplo, os resíduos do processamento de

soja, trigo, algodão, laranja e de frutos (Chutmanop et al., 2008; Castro et al., 2014). O

objetivo desse estudo foi caracterizar parcialmente as proteases de A. pulverulentus obtidas

por fermentação no estado sólido.

Material e Métodos

Para a produção de enzimas foi selecionado A. pulverulentus DPUA 478 do acervo da

Coleção de Culturas DPUA/UFAM. A cultura estoque foi preparada em meio CYA

(Czapek-Dox + extrato de levedura), utilizando cultivos em CYA, mantidos sob

refrigeração (4 oC). A obtenção da colônia e do microcultivo em meio de cultura seletivo

foi realizado conforme Klich (2002).

173

Para a fermentação em estado sólido (FES), o inóculo foi preparado com água

destilada na cultura estoque, suspensão celular (concentração 10-1

). Dessa suspensão

celular foi retirado volume equivalente a 2% (p/v) do volume de substrato e semeado nos

resíduos lignocelulósicos, em tubo de ensaio.

A fermentação foi realizada utilizando resíduos de cupuaçu (exocarpo) e de açaí

(semente) suplementados com farelo de arroz, amido e peptona, na proporção de 9:1. O

substrato foi umedecido com uma solução salina (g/L) contendo fosfato monobásico (0,1),

sulfato de magnésio (0,5), cloreto de sódio (0,5) e sulfato ferroso (0,004). O pH foi

ajustado para 6,0, e o substrato foi distribuído em tubos de ensaio (200x25mm). Os

substratos acondicionados em tubo de ensaio foram esterilizados a 121ºC por 15 minutos.

A fermentação foi realizada a 30ºC por sete dias. As enzimas foram extraídas por

adição de água destilada esterilizada ao substrato fermentado e submetidos à agitação de

200 rpm por 15 minutos. O extrato bruto foi separado por filtração a vácuo usando papel

filtro Whatman® nº 1.

Para a determinação da atividade enzimática proteolítica, foram adicionados 250

µL de solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2, em 150 µL de

extrato bruto. Os tubos reação foram incubados a 25ºC por 60 minutos em câmara escura.

A reação foi interrompida adicionando-se 1,2 mL de ácido tricloroacético 10% (p/v) e em

seguida procedeu-se a centrifugação a 10.000 rpm por 10 minutos. Em seguida, foram

transferidos 0,8 mL do sobrenadante para tubos de ensaio contendo 1,4 mL de hidróxido de

sódio 1M. A leitura das amostras foi realizada a 440 nm. Como branco, foi utilizada a

solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2. Todas as análises

foram realizadas em triplicatas (Tavares et al., 2012 e Alecrim et al., 2015).

Para avaliar o efeito do pH e temperatura na atividade proteolítica, o extrato bruto

com maior atividade proteolítica foi selecionado para avaliação do efeito do pH na

atividade das proteases. Nestes experimentos, as proteases de Aspergillus foram testadas

em diferentes faixas de pH (5,0 – 10,00), a 25ºC por 60 minutos. E os tampões utilizados

foram Citrato Fosfato 0,2M (pH 5,0 e 6,0), Tris-HCl 0,2M (pH 7,0 e 8,0) e Glicina-NaOH

(pH 9,0 e 10,0). A atividade das enzimas também foi avaliada sob diferentes temperaturas

(30 oC a 80

oC) (Alecrim et al. 2015). Todos os experimentos foram realizados em

triplicata e os dados foram apresentados como valor médio.

174

Para verificar a estabilidade das enzimas na presença de íons, o extrato bruto foi

incubado na presença da solução de sulfato ferroso (FeSO4), sulfato de magnésio (MgSO4),

sulfato de cobre (CuSO4), sulfato de zinco (ZnSO4), sulfato de manganês (MnSO4), cloreto

de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl) e cloreto de cálcio (CaCl2), na concentração

final de 10 mM. Os experimentos foram realizados em temperatura ótima de atividade das

proteases por 30 minutos. Como controle foi utilizada mistura reacional sem a adição dos

íons metálicos e, em seguida, a atividade proteolítica e os resultados foram expressos em

média (Alecrim et al. 2015).

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de

Tukey (p < 0,05), utilizando o software Minitab® versão 17.0. Com o auxílio do mesmo

programa, foram construídos gráficos para melhor visualização dos resultados.


No estudo realizado por Silva et al. (2016), foi verificado que A. pulverulentus

produziu quantidade significativa de proteases quando cultivado em exocarpo de cupuaçu

suplementado com peptona. Para investigar a importância industrial dessas enzimas, o

extrato bruto obtido por esses autores foi analisado visando à caracterização parcial das

proteases desse fungo quanto ao efeito do pH, temperatura e de íons metálicos.

Os resultados mostraram que as proteases de A. pulverulentus foram ativas na faixa

de pH avaliada, nas condições de análise. Contudo, a maior atividade das proteases foi

observada no pH 8,0 (Figura 1), característica que indica a presença de peptidases

alcalinas no extrato bruto da espécie investigada. Resultados semelhantes foram reportados

em diversos estudos para A. terreus (Chellapandi, 2010), A. flavipes (Ortiz, 2016). Sharma

e De (2011) relataram que as proteases de A. tamarii apresentaram máxima atividade

catalítica na faixa de pH entre 8,0 e 9,0. As peptidases alcalinas de origem microbiana são

enzimas utilizadas principalmente em formulações de detergentes para facilitar a limpeza

de manchas proteicas, tais como sangue, leite, ovos e carne (Mushtaq et al., 2014).

175

Figura 1 . Influência do pH na atividade proteolítica de A. pulverulentus

As proteases de A. pulverulentus apresentaram maiores atividades na temperatura

de 60 °C (Figura 2). As melhores temperaturas para a atividade de proteases fúngicas, com

poucas exceções, varia entre 35 e 50 °C (Nirmal et al., 2011). Nesta mesma temperatura

(60°C) foi verificada as melhores atividades de A. oryzae e A. tamarii, conforme relatado

por Yin et al. (2013) e Sharma e De (2011), respectivamente. Outros estudos reportaram

máxima atividade de proteases neutras de espécies de Aspergillus em temperaturas

distintas das apresentadas neste estudo. Abidi et al. (2014) relataram que as peptidases de

A. niger apresentaram significativa atividade catalítica a 50 °C. Ahmed et al. (2011)

verificaram máxima atividade proteolítica de A. tamarii na temperatura de 45 °C.

O efeito de íons na atividade proteolítica de A. pulverulentus está demonstrado na

tabela 1. Pela análise estatística, observa-se que não houve efeito significativo dos íons

testados quando comparados ao tratamento controle, exceto quando ocorreu a adição de

Cu2+

, Zn2+

e Ca2+

. Ao adicionar-se Ca2+

, a atividade enzimática foi aumentada em 31%; em

contrapartida, a adição de Cu2+

e Zn2+

reduziu a atividade das enzimas de A. pulverulentus

em 43% e 36%, respectivamente.

Diversos autores relatam o aumento da atividade de proteases alcalinas de

Aspergillus na presença de Ca2+

(Yin et al., 2013; Anitha e Palanivelu, 2013; Niyonzima e

More, 2015). Niyonzima e More (2015) também afirmam que os íons de cálcio são

importantes na manutenção do sítio ativo e termoestabilidade de enzimas proteolíticas de

Aspergillus.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

5 6 7 8 9 10A

tivid

ad

e P

rote

olí

tica (

U/m

L)

pH

176

Figura 2 - Influência da temperatura na atividade proteolítica de A. pulverulentus

Registros na literatura mostram que os cátions de zinco (Zn2+

) são capazes de

reduzir a atividade de peptidase de Aspergillus de 15% até 23% (Anitha e Palanivelu,

2013; Castro e Sato, 2014). Quanto à atividade inibitória do cobre, outros estudos também

relatam esse efeito sobre proteases de A. niger e A. oryzae (Siala et al., 2012; Yin et al.,

2013).

Tabela 1 - Efeito de íons na atividade proteolítica de A. pulverulentus

Íons (10 mM) Atividade relativa (%)

Controle 100 ± 0 b,c

Cu2+

57,37 ± 1,76 e

Zn2+

64,48 ± 2,78 d,e

K+ 83,05 ± 3,36

b,c,d

Ca2+

131,14 ± 1,15 a

Mg2+

103,27 ± 2,00 b

Fe2+

79,23 ± 2,34 c,d,e

Mn2+

103,27 ± 1,15 b

Na+ 105,46 ± 8,06

b

Obs.:Médias com letras iguais nas colunas não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

30 40 50 60 70 80

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca (

U/m

L)

Temperatura (°C)

177

Conclusões

Aspergillus pulverulentus DPUA 478 produz protease alcalina com as maiores

atividades catalíticas em pH 8,0 e temperatura de 60°C.

As proteases desse fungo se mostraram sensíveis a íons Cu2+

e Zn2+

e estimuladas

pela adição de íons Ca2+

.

De acordo com as características de atividade enzimática, as peptidases produzidas

por A. pulverulentus apresentam potencial para aplicação na indústria de detergentes.

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110.

180



Macrofungos (Aphyllophorales, Basidiomycetes) da área urbana de Manaus Jesus M.A.

1, Oliveira D.A.S.

2, Santos J.F.S.

2, Magalhães F.F.C.

2. Souza D.H.

2, Couceiro D.M.

3

1Pesquisador, COTEI - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Emails: [email protected];

2Coloborador, COTEI- Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA.

3 Bolsista Apoio Técnico, COTEI – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

Resumo

As árvores desempenham um papel fundamental no bem estar das comunidades

urbanas. No entanto, elas estão sujeitas aos macrofungos lignocelulolíticos que

podem causar danos em árvores vivas e até mesmo leva-las á morte. O trabalho teve

como objetivo identificar as espécies de macrofungos (Aphyllophorales) da área

arborizada da cidade de Manaus e verificar as zonas urbanas com maiores

ocorrências destes fungos, com o intuito de ampliar o conhecimento da diversidade

macrofungica urbana. Os basidiomas foram coletados de árvores vivas e mortas ou

tombadas, troncos de árvores cortados ou quebrados e galhos nas copas e caídos nas

ruas, avenidas, praças e parques das vias públicas de 22 bairros das zonas (Centro-

Sul, Centro-Oeste, Leste, Norte, Oeste e Sul). A identificação das espécies foi

realizada através da análise de características macroscópicas e microscópicas. Um

total de 560 macrofungos foi coletado. Destes, 116 espécimes estão distribuídos na

zona urbana Oeste, 198 Centro-Sul, 137 Sul, 26 Centro-Oeste, 43 Leste, e 40 na

Norte. Auricularia cornea, A. polytricha Earliella scabrosa Hexágona hydnoides,

Perenniporia compacta, Plebiopsis roumeguerii, Phanerochaete sórdida, G.

australe, Fomitiporia punctata, P. gilvus e Flavodon flavus são as espécies de maior

ocorrência nas seis zonas da cidade Manaus.

Palavras-chave: vegetação urbana, cidade de Manaus, fungos fitopatogenicos

Introdução

As áreas arborizadas públicas, como as dos parques e praças são alternativas para a

relação do homem com a natureza, pois a vegetação urbana de acordo com (Pivetta, 2002)

contribue para a recreação e lazer estimulando a sociabilidade urbana, tendo em vista que

as árvores desempenham um papel fundamental na qualidade de vida das comunidades,

além da valorização ornamental dos espaços urbanos (Azevedo et al., 2011), amenizam a

poluição sonora; reduzem o impacto da água de chuva e seu escorrimento superficial,

diminuem a temperatura, pois, absorvem os raios solares e refrescam o ambiente pela

grande quantidade de água transpirada pelas folhas; melhoram a qualidade do ar (Pivetta,

2002 e Brazolin, 2010). No entanto, as árvores estão sujeitas a danos biológicos, e dentre


181

estes, os macrofungos que causam maior dano em árvores vivas, pois favorecem a

degradação da madeira e que podem levar à morte das árvores (Brazolin et al., 2010).

Estudos relacionados com a ocorrência de macrofungos em áreas urbanas são poucos

realizados para o Brasil, com ressalva os de Campos et al., 2006; Silva e Gibertoni, 2006;

Figueirêdo, 2008; Freitas et al., 2009; Leal e Gugliota, 2008; Brazolin et al., 2010 e

Quevedo et al., 2010. Esses autores relatam que Ganodermataceae, Hymenochaetaceae e

Polyporaceae apresentam maior diversidade de espécies em árvores urbanas. Dentre os

macrofungos associados ao apodrecimento do lenho que podem causar a morte das árvores

destacam-se muitos representantes destas famílias (Tovar et al., 2007). Com intuito de

ampliar o conhecimento da diversidade de macrofungos (Basidiomycetes,

Aphyllophorales), foi realizado um levantamento destes em árvores na área urbana da

cidade de Manaus, a fim de conhecer a diversidade de Aphyllophorales, visando obter

informações que forneçam subsídios para o manejo adequado para a preservação da

vegetação urbana.

Material e Métodos

A cidade de Manaus está localizada no centro da maior floresta tropical do mundo,

sua superfície total é de 377 Km², com população estimada em 2,1 milhões de habitantes

(IBGE, 2016). Apresenta clima tropical úmido, com temperatura média anual de 26,5 °C e

ocorre alternância entre duas estações, sendo uma estação úmida chuvosa, que ocorre entre

os meses de novembro a maio e outra seca entre junho e outubro (Velloso et al., 2002).

O levantamento dos macrofungos foi realizado entre 2015 e 2016 nas principais

avenidas, praças e parques das vias públicas de 28 bairros (Tabela 1) de seis zonas,

(Centro-Sul, Centro-Oeste, Leste, Norte, Oeste e Sul) (Figura 1). Os basidiocarpos foram

coletados de árvores vivas e mortas ou tombadas, troncos de árvores cortados, quebrados

ou tombados, e galhos caídos. Os fungos foram secos em ambiente natural ou com ar

condicionado a 20o

C. Os dados de coleta de cada fungo, tais como: coletor, tipo de

substrato e local foram informatizados de acordo com a planilha do programa BRAHMS

(Botanical Research and Herbarium Management System) adotado pelo Herbário do

INPA. As exsicatas dos macrofungos foram depositadas no Herbário-INPA.

As características macroscópicas dos espécimes como a forma, tamanho, cor e

consistência do basidiocarpo, assim como as micro estruturas como hifas (generativas,

esqueléticas ou de conexão); elementos estéreis (cistídios, gleocistídios, dentre outras; e

https://pt.wikipedia.org/wiki/Instituto_Brasileiro_de_Geografia_e_Estat%C3%ADstica

182

estruturas reprodutivas (basídios e basidiósporos) foram analisadas. Os corantes KOH 3%,

vermelho congo e o reagente Melzer foram usados para visualizar as microestruturas e

verificar as reações dextrinoídes e amiloídes dos esporos, hifas e cistídios conforme

descrito por Ryvarden e Johansen (1980).

A identificação das espécies foi realizada com auxílio das chaves taxonômicas

elaboradas por Eriksson e Ryvarden (1975; 1976), Eriksson et al. (1978; 1981; 1984),

Boidin et al. (1985), Hallenberg e Eriksson (1985), Jung (1987), Hjortstam et al. (1987,

1988), Stalpers (1996), Ryvarden (1991), Nunez e Ryvarden (1995), Ryvarden e Johansen

(1980), Lowy (1951, 1952, 1968, 1971), Montoya-Alvarez et al. (2011), Jesus (1988) e

Sierra (2008). Foram acessados os sites Index Fungorum, Flora do Brasil e Mycobank que

disponibilizam as descrições e distribuição das espécies.

Tabela 4. Relação das zonas e bairros da área urbana de Manaus em que os macrofungos

foram coletados de diversos substratos lignoceluloliticos.

Zona Bairro

Centro-Sul Adrianópolis, Chapada, Aleixo, Flores, Parque 10, São Geraldo

Sul Cachoeirinha, Educandos, Distrito Industrial I, Japiim, Centro,

Petrópolis e Raiz.

Norte Cidade Nova, Cidade de Deus, Nova Cidade, Novo Aleixo,

Novo e Israel.

Oeste Compensa, Ponta Negra, São Jorge e Tarumã.

Centro- Oeste Alvorada, Com Pedro e Planalto.

Leste Armando Mendes, Coroado, Distrito Industrial II e Jorge

Teixeira.


Um total de 560 espécimes de Aphylophorales foi coletado nas seis zonas da cidade

de Manaus, deste, 116 registrados na zona Oeste, 198 Centro-Sul e 137 Sul, 26 Centro-

Oeste, 43 Leste, e 40 na Norte. Destes macrofungos, 142 espécimes pertencem a

Polyporaceae, 134 a Hymenochaetaceae, seguida de Corticiaceae com 95,

Ganodermataceae 82, e Auriculariaceae com 67, Merulliaceae com 21, e as demais

famílias com menos de 9 espécimes (Tabela 2).

183

Tabela 2. Relação dos macrofungos (Basidiomycetes) que ocorrem em diferentes zonas

urbanas da cidade de Manaus.

Táxon

Zona

Total Centro-

Oeste

Centro-

Sul Leste Norte Oeste Sul

AURICULAREACEAE

Auricularia auricula-judae (Bull.) Schröt. - 2 - 2 - - 4

A. cornea Ehrenb. - 5 1 4 7 3 20

A. delicata (Mont.) Henn. - 2 - 2 2 2 8

A. fuscosuccinea (Mont.) Henn. - 2 - - - - 2

A. mesentrica (Dicks.) Pers. - 7 - - 1 1 9

A. polytricha (Mont.) Sacc. - 14 1 3 3 3 24

CORTICIACEAE

Aleurodiscus sp. - - - - - 1 1

Botryobasidium obtusisporum J.Erikss. - - - 1 - - 1

B. pruinatum (Bres.) J. Erikss. - 1 - - - - 1

Cystostereum artocreas (Berk. & M.A. Curtis

: Cooke) Hallenb. & Ryv. - - 1 - - - 1

Gloeocystidiellum convolvens (P. Karst.) Donk - 1 - - - - 1

G. luridum (Bres.) Boidin - - - - - 1 1

Hyphoderma incrustatissimum Bodin & Gilles - 1 - - 3 1 5

H. incrustatum K.H. Larss. - - - - 3 - 3

H. nemorale K.H. Larss. 1 - - - 1 - 2

H. neopuberum Sheng H. Wu - - - - 1 2 3

H. orphanellum (Bourdot & Galzin) Donk - 1 - - - - 1

H. praetermissum (P. Karst.) J.Erikss. & A. Strid - - - - 1 - 1

H. subsphaerosporum Boidin & Gilles - 1 1 3 6 2 13

Hyphodontia abieticola (Bourdot & Galzin)

J.Erikss. - - - - - 1 1

H. aspera (Fr.) J. Erikss. - 1 - - - - 1

H. crustosa (Pers.) J. Erikss. - - - - - 1 1

Leucogyrophana sp. - - - - - 1 1

Peniophora incarnata (Pers.) P. Karst. - - 1 - 1 - 2

P. lilacea Bourdot & Galzin - 1 - - - - 1

P. lycii (Pers.) Höhn. & Litsch. - - - - - 1 1

P. pubera (Fr.) Sacc. - - - - - 1 1

P. quercina (Pers.) Cooke - - 1 - - - 1

Peniophora sp. - 2 - 1 2 4 9

Phanerochaete calotricha (P. Karst.) J.Erikss & Ryv. - 1 1 - - 1 3

P. galactites (Bourdot & Galzin) J. Erikss. &

Ryv. - - - - - 1 1

P. himalayensis (Dhingra) Sheng H. Wu - - - - - 1 1

P. laevis (Fr.) J. Erikss. & Ryv. - - - 1 1 - 2

P. sordida (P. Karst.) J. Erikss. & Ryv. 2 11 2 2 6 5 28

Plebiopsis roumeguerii (Bres.) Jülich & Stalpers - - - - 2 3 5

Resinicium bicolor (Alb. & Schwein.) Parmasto 1 - - - - - 1

Tubulicrinis borealis J. Erikss. - 1 - - - - 1

FOMITOPSIDACEAE

Antrodia serialis (Fr.) Donk. 1 - - - - - 1

A. ramentacea (Berk:Br) Donk. - 1 - - - - 1

184

Cont. tabela 2. Relação dos macrofungos (Basidiomycetes) que ocorrem em diferentes zonas


Táxon Zona

Total Centro-

Oeste

Centro-


GANODERMATACEAE

Ganoderma amazonense (Fr.) Pat. - 4 3 - 1 - 8

G. applanatum (Pers.) Pat. 1 2 - - 1 - 4

G. australe (Fr.) Pat. 2 11 3 1 2 - 19

G. chalceum (Cooke) Steyaert - 5 - - - - 5

G. citriporum Ryv. & Iturr. - 2 1 - - - 3

G. curtisii (Berk.) Murrill - - 1 - - - 1

G. resinaceum Boud. 2 5 4 - 1 1 13

Ganoderma spp. - 12 6 - 7 4 29

GLOEPHYLLACEAE

Gloeophyllum abietinum (Bull.:. Fr.) Karst. - - 1 - - - 1

HYMENOCHAETACEAE

Cyclomyces setiporus (Berk.) Pat. - 1 1 - - - 2

Fomitiporella umbrinella (Bres.) Murrill - - - - - 3 3

Fomitiporia expansa Decock & Amalfi - - 1 - - - 1

F. maxonii Murrill 2 2 1 2 3 5 15

F. punctata (P. Karst.) Murrill - 8 2 3 10 18 41

Fulvifomes cesatii (Bres.) Y.C. Dai - 2 - 3 1 1 7

F. kanehirae (Yasuda) Y.C. Dai - 1 - - - - 1

F. melleoporus (Murrill) Baltazar & Gibertoni - - - - - 1 1

F. nilgheriensis (Mont.) Bondartseva & S. Herrera - - - - 1 - 1

Hymenochaete adusta (Lév.) Pat. - - - - 1 - 1

H. aspera Berk. & M.A. Curtis - - 1 - - - 1

H. damicornis (Link) Lév. - - - - - 1 1

H. rubiginosa (Dicks.) Lév. - - - - - 3 3

H. sordida Speg. - - - - - 1 1

Inonotus costaricensis Ryv. - - - - - 1 1

I. micantissimus (Rick) Rajchenb. - - - - - 1 1

I. pruinosus Bondartsev - - - 1 - - 1

I. venezuelicus Ryv. - - - - - 1 1

Phellinus apiahynus (Speg.) Rajchenb. & J.E.

Wright - - - - - 1 1

P. appositus (Lév.) Pat. - - - - - 1 1

P. calcitratus (Berk. & M.A. Curtis) Ryv. - - - - - 1 1

P. callimorphus (Lév.) Ryv. - 1 - - - - 1

P. caryophylleus (Cooke) Ryv. - - - - - 1 1

P. chryseus (Lév.) Ryv. - - - - - 1 1

P. contiguus (Pers.) Pat. - - - - - 1 1

P. extensus (Lév.) Pat. - 1 - - - 1 2

P. gilvus (Schwein.) Pat. 2 9 1 - 2 10 24

P. glaucescens (Petch) Ryv. - - - - - 2 2

P. linteus (Berk. & M.A. Curtis) Teng 1 5 - - - - 6

P. luctuosus (Ces.) Ryv. - - - - - 1 1

P. rhabarbarinus (Berk.) G. Cunn. - - - - - 1 1

P. shaferi (Murrill) Ryv. - - - - - 1 1

P. undulatus (Murrill) Ryv. - - 1 - - - 1

185

Cont. tabela 2. Relação dos macrofungos (Basidiomycetes) que ocorrem em diferentes zonas


Táxon Zona

Total Centro-

Oeste

Centro-


Phylloporia fruticum (Berk. & M.A. Curtis)

Ryv. 1 1 - - - - 2

P. spathulata (Hook.) Ryv. - - - 1 - - 1

MERIPILACEAE

Rigidoporus biokoensis (Lloyd.) Ryv. - 1 - - - - 1

R. lineatus (Pers.) Ryv. - 2 - - 3 2 7

Meripilus giganteus (Pers.) P. Karst. - - - - 1 - 1

MERULLIACEAE

Flavodon flavus (Kl.). Ryv. - 4 3 3 6 5 21

POLYPORACEAE

Coriolopsis byrsina (Mont.) Ryv. - 8 - - 1 - 9

C. caperata (Berk.) Murrill. - 2 - - - - 2

C. gallica (Fr) Ryv. - 2 - - - - 2

C. polyzona (Pers) Ryv. - 3 - - 1 - 4

Earliella scabrosa (Pers.) Gilb. & Ryv. 5 15 2 - 17 6 45

Fomes fasciatus (Sw.) Cooke. 1 - - - - - 1

Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo 1 23 - 2 2 12 40

H. variegata Berk. - 1 - - - 2 3

H. tenuis (Hook.) Fr. 1 1 - - - 1 3

Lenzites elegans (Spreng.) Fr. - - - - 1 - 1

Megasporoporia cavernulosa (Berk.). Ryv. 1 - - - 4 - 5

M. setulosa (Henn.) Rajch. 1 - - 4 - - 5

Polyporus brumalis Pers.: Fr. - 1 - - - - 1

P. tenuiculus (P. Beav.) Fr. - 1 - - 1 2 4

Polyporus sp. - - - - - 1 1

Perinniporia compacta (Over.) Ryv. & Gilb. - 2 - - - - 2

Pycnoporus sanguineus (L.) Murril - 3 - - 1 2 6

Trametes elegans (Spreng.) Fr. - - - - 1 - 1

T. hirsuta (Fr.) Pilát. - - 1 - - - 1

T. leonina (Kl.) Pat. - 2 1 - - - 3

T. villosa (Sw.). Kreisel. - - - - 1 - 1

T. versicolor (L.) Lloyd. - - - 1 - 1 2

SCHIZOPHYLLACEAE

Schizophyllum commune Fr. - - - - 5 2 7

Total 26 198 43 40 116 137 560

Dentre estas famílias, Hymenochaetaceae está representada com o maior numero de

espécies (35), Corticiaceae 32, Polyporaceae 23 e Ganodermataceae por 8, enquanto que

Fomitopsidaceae, Gloeophyllaceae, Meripilaceae, Merulliaceae e Schizophyllaceae

apresentam até três espécies (Tabela 2).

186

Nas Polyporaceae Fr. ex Corda (1839) estão agregados os basidiomas contendo

himenio com tubo vertical terminando em poros; alguns apresentam lamelas e outros,

tubos alongados, destacando-se entre as familias listadas por estar amplamente distribuída

com 142 espécimes nas seis zonas da cidade (Figura 1). E. scabrosa (Fig. 2 D) é de maior

ocorrência com 45 espécimes, sendo que a maioria ocorre nas copas de muitas árvores bem

altas, localizadas nas zonas Centro Sul e Oeste. Também, H. hydnoides (Fig.2A), coletada

em arvores das zonas Centro Sul e Sul, sendo que muitas delas estavam mortas, porém em

pé. Este macrofungo fitopatogênico ataca árvores, principalmente aquelas sujeitas á

poluição urbana (Leite, 2010) e geralmente crescem quando os galhos já estão mortos.

Outro fungo lignocelulolitico saprofita, C. byrsina (Fig. 2 F) ocorre com nove espécimes,

principalmente em troncos caídos ou troncos de árvores cortadas e galhos caídos.

Os representantes de Hymenochaetaceae Donk (1948) são saprófitas ou parasitas de

muitas espécies de plantas. São causadores de podridão branca (Ryvarden, 1991). Seus

basidiocarpos variam de amarelo para marrom escuro, alguns com setas. Esses fungos

estão distribuídos nas seis zonas da cidade de Manaus, 60 na zona Sul, 31 Centro Sul e 19

na Oeste (Figura 1). Phellinus, representado com maior número de espécies, P. appositus,

P. calcitratus, P. caryophylleus, P. extensus, P. laucescens, P. linteus, P. luctuosus, P.

shaferi, P. undulatus e P. gilvus (Tabela 2). Fomitiporia com maior número de espécimes,

sendo que 41 e 15 são de F. punctata e P. maxonii, respectivamente.

Figura 1. Numero de espécimes de cada família de Basidiomycetes distribuído em cada

zona urbana da cidade de Manaus.

Centro-oesteCentro-sul

LesteNorte

OesteSul

0

10

20

30

40

50

60

Zona

Familia

Num

ero

de e

specím

es

https://es.wikipedia.org/wiki/Himenio

187

Ambas as espécies são as maiores causadoras de doenças em essências florestais (Cabrera

et al.. 2014). P. gilva, com 24 espécimes distribuidos nas zonas, Sul e Centro Sul (10 e 9),

respectivamente. Muitas árvores atacadas por Phellinus e, Fomitiporia, principalmente

aquelas das avenidas Rodrigo Otavio, São Jorge, Joaquim Nabuco e da Ponta Negra,

estavam mortas, ou foram retiradas das vias públicas durante o levantamento dos

macrofungos, pela Secretaria Municipal de Meio Ambiente e Sustentabilidade (SEMMAS)

ou por outros meios.

Corticiaceae Herter apresenta basidiomas ressupinados, efuso-reflexos,

cupuliformes-discoides ou dimidiados a estipitados. Foram coletados 95 espécimes, sendo

27 para cada zona Oeste e Sul, e 22 para Zona Centro Sul (Figura 1), com destaque para

Hyphoderma com sete espécies, dentre estas H. subsphaerosporum (Fig. 2 E) com

distribuição de 13 espécimes. Phanerochaete está representado por Phanerochaete.

calotricha (03), P. galactites (01), P. himalayensis (01), P. laevis (02) e P. sordida (28)

(Tabela 2).

A maioria dos macrofungos corticoides ocorre em árvores vivas, no entanto estes

fungos não podem ser considerados fitopatogênicos, tendo em vista que há poucos estudos

sobre a atuação deles como fitopatógenos, com rara exceção de Phanerochaete

chrysosporium Burds que de acordo com o site Mycobank é fitopatogênico. Na literatura

há relato de Corticiaceae em galhos e galhos finos que caem das árvores e permanecem no

solo em ambiente florestal. Já no ambiente urbano, a maioria dos galhos e galhos finos

caídos é recolhida das vias pela limpeza pública, ou é descartada por vários meios. E neste

caso, houve registro somente daqueles fungos atacando os galhos da copa. É importante

ressaltar que apesar de Corticiaceae não ser registrada em áreas urbanas, na cidade de

Manaus ocorrem 35 espécies, muitas delas com um único espécime (Tabela 2).

Ganodermataceae (Donk) Donk 1997 é caracterizada basicamente pelos esporos

truncados e ornamentados (Ryvarden, 1997). São associados ao apodrecimento do cerne

das árvores vivas, por exemplo, Ganoderma Karsten (1881), que causa a morte de diversas

árvores em ambiente urbano, atacando inicialmente a parte basal do tronco até a copa

(Tovar e Garza, 2013). Um total de 82 espécimes de Ganodermataceae ocorre na área

urbana, com maior distribuição nas zonas Centro Sul e Leste (41e 18) para cada (Figura 1).

G. australe (Fr.) Pat., considerado parasita e saprófito, ocorre com 19 espécimes, destes, 11

foram coletados na arborização da zona Centro Sul. Número semelhante de espécimes

deste fungo foi registrado para a mesma zona por Cruz (2012). As árvores com ataque de

Ganoderma observadas por esse autor não foram encontradas, em alguns casos, restaram

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944501307000365#bib11

http://www.first-nature.com/fungi/~biog-fries.php

188

os troncos cortados e, geralmente com os basidiomas. Já neste estudo, muitas das arvores

com Ganoderma encontravam se em estádio avançado de degradação ou mortas ou

tombadas, sendo que muitas delas estavam infestadas com outros macrofungos

considerados fitopatogenicos, principalmente H. hydnoides e ou Auricularia.

Dentre as famílias listadas na Tabela 2, Auriculariaceae Fr. difere das demais com

relação ao basidiocarpo, o qual é gelatinoso com coloração variando entre marrom e verde

musgo, e os basídios com septos longitudinais (Teixeira, 1945). Um total de 67 espécimes

de Auricularia ocorre nas zonas urbanas, (32) na zona Centro Sul e (13) Oeste (Figura 1).

A maioria destes (24) é de A. polytricha (Tabela 2). É relatada como saprófita ou

fracamente parasita, causando podridão branca. No entanto, arbustos apresentaram

basidiomas nos galhos altos, principalmente os das mortas, como a que se encontrava em

frente o Condomínio Residencial Ephigênio Salles na Avenida Rodrigo Otavio. Muitas das

arvores atacadas por A. polytricha também estavam com H. hydnoides e S. commune (Fig.

2 A e B).

Nas zonas urbanas existe também um número significativo de espécies de outras

famílias de macrofungos (Basidiomycetes) considerados fitopatogênicos e ou causadores

de podridão do lenho ou degradadores de madeira, por exemplo S. commune

(Schizophyllaceae) um oportunista e patógeno (Freitas et al., 2009), que infectou a parte

superior dos arbustos da Avenida Rodrigo Otavio, e das do Parque do Bilares, os quais

ficam secos e de cor escura (preto), resultando na morte de todos rapidamente. F. flavus

(Merulliaceae) (Fig. 2C), distribuído com 21 espécimes em galhos das árvores e galhos

caídos (Tabela 2), registrou-se por fotografia em árvores com copas bem altas em todas as

zonas da cidade de Manaus, principalmente aquelas da ponta Negra, Centro e Centro Sul.

É importante, ressaltar que provavelmente, o número de espécies de macrofungos na

área urbana da cidade de Manaus deve ser maior do que o registrado, tendo em vista que

muitos são recolhidos junto com os resíduos lignoceluloliticos das vias pela limpeza

pública, assim como os galhos podados devido à fiação, ou os galhos são descartados por

diversos meios. Além disso, as árvores, principalmente das grandes avenidas como

Joaquim Nabuco, Getulio Vargas, as das praças das zonas Centro Sul são bastante altas, ou

as árvores se localizam em locais de difícil acesso ou de risco, particularmente devido a

fiação aérea da rede elétrica, acúmulo de lixo, dentre outros aspectos de infraestrutura

urbana que inviabilizam a coleta dos macrofungos.

https://en.wikipedia.org/wiki/Saprophyte

https://en.wikipedia.org/wiki/Parasitism

189

Os diversos fatores acima mencionados, dentre outros podem ter contribuído para o

descarte de muitos fungos. No entanto, 102 espécies de Aphyllophorales são registradas na

área urbana da cidade de Manaus.

Figura 2. Macrofungos (Basidiomycetes) em diferentes substratos na área urbana de

Manaus- AM. (A) H. hydnoides. (B) ). S. commune. (C) F. flavus atacando galho em

árvore morta, (D) E. scabrosa atacando árvore viva, (E) H. subsphaerosporum e (F) C.

byrsina.

Este número pode ser associado ao tamanho da área amostral que abrange 28

bairros, as condições fitossanidade das árvores do ambiente urbano e climáticas,

principalmente pelo fato que a maior ocorrência de macrofungos é nas zonas Centro e Sul,

Sul e Oeste que apresentam intenso fluxo de carros, e considerando que as chuvas ácidas

podem contribuir com a alta taxa de poluição emitida pelos veículos, e consequentemente

com a diminuição da resistência das árvores e ou provocar injúrias nas raízes das árvores,

190

deixando-as susceptíveis a ataques de macrofungos lignoceluloliticos (Brena, 2000, Pivetta

2002 e Leite, 2010).

Em vista da ocorrência de 560 espécimes de macrofungos nas áreas verdes da

cidade de Manaus, recomenda-se estudos complementares das espécies conhecidas como

fitopatogênicas, visando o conhecimento de doenças causadas por eles na vegetação e

assim, contribuir para o estudo de controle das doenças das áreas urbanas da cidade de

Manaus. Com isso, permite a busca de alternativas ecológicas e sustentáveis para a

melhoria da qualidade da vegetação urbana, uma vez que as espécies de árvores do

ambiente urbano, principalmente das zonas Centro-sul, Oeste e Sul, demonstram ser

suscetíveis aos macrofungos fitopatogênicos e muitas delas morreram ou se encontravam

em estádio avançado de degradação. Por exemplo, se todas as árvores da avenida Joaquim

Nabuco em estádio avançado de degradação, com risco de queda ou tombamento, dentre

outros, fossem retiradas, praticamente poucas restariam. Diante disso, a revitalização das

áreas verdes torna se necessária.

Muitas árvores encontram-se em condições fitossanitárias criticas, com ataque de

macrofungos associados ou não com outros agentes degradadores que podem favorecer a

queda ou tombamento delas, o que podem causar inúmeros impactos ambientais e sociais

para o ambiente urbano. De modo que se recomenda o controle da vegetação com ataque

destes macrofungos, reposição das árvores por espécies resistentes aos mesmos visando a

manutenção e preservação das comunidades urbanas da cidade.

Neste contexto, a preservação e conservação da vegetação devem ser inseridas em

programa de arborização urbana com mapeamento e sistema de controle que possibilitem

realizar tanto a reposição como o plantio de arvores, considerando que os benefícios da

arborização estão relacionados com o planejamento urbano adequado visando melhoria da

qualidade de vida da fauna e do homem que vivem na cidade.

Conclusões

Um total de 104 espécies de macrofungos (basidiomycetes) ocorre nas áreas


Dentre as espécies, destacam-se Earliella scabrosa, Hexágona hydnoides e

Fomitiporia punctata, com mais de 40 espécimes cada uma, distribuídos nas seis zonas da

cidade de Manaus.

Nas zonas Centro Sul, Sul e Oeste de Manaus ocorrem os maiores numeros de

macrofungos Aphylophorales.

191

Hymenochaetaceae, Corticiaceae, Ganodermataceae, e Auriculariaceae são

representadas com maior numero de espécimes, enquanto que Fomitopsidaceae,

Gloeophyllaceae, Meripilaceae, Merulliaceae e Schizophyllaceae com os menores nas áreas

verdes da cidade de Manaus.

Maior atenção deve ser dada a Ganodermataceae, tendo em vista que a maioria das

árvores atacadas com Ganoderma morreu ou encontra-se em estádio avançado de

degradação, ou tombadas.

As árvores com Hymenochaetaceae, principalmente com Phellinus e Fomitiporia,

considerados fitopatógenos, persistem por mais tempo, pois degradam o lenho mais

lentamente.

As árvores das avenidas e parques infectadas por S. comune morrem rapidamente,

principalmente os arbustos.

Agradecimentos

Á Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do Amazonas-Fapeam pelos recursos

financeiros e bolsas que permitiram a realização deste trabalho.

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194



Caracterização parcial de proteases de extratos orgânicos de cogumelos

comestíveis

Machado A.R.G.1, Martim S.R.

1, Prado F.B.

2 Teixeira M. F. S.

3

1PG Biodiversidade Biotecnologia – Rede Bionorte, Universidade Federal do Amazonas,

2 PG

Biotecnologia , Universidade Federal do Amazonas, 3Professora associada e curadora da coleção de

culturas DPUA, Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],

[email protected], [email protected], [email protected].

Resumo

As proteases são enzimas que possuem ampla utilização comercial e industrial. As

peptidases de origem fúngica apresentam vantagens como alta diversidade, fácil produção

em larga escala e recuperação. O objetivo deste estudo foi caracterizar parcialmente

proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis. A cultura matriz foi preparada

em meio OMYA (aveia + extrato de levedura. Os extratos dos cogumelos foram obtidos

por processo de extração com etanol e álcool:água (1:1). O extrato bruto foi filtrado

sucessivamente em tecido de algodão e membrana polietersulfônica de 0,22 µm. Nos

extratos enzimáticos foi determinada a atividade proteolítica utilizando azocaseína como

substrato. Os resultados demonstraram que o extrato de P. ostreatoroseus obtido da

mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de proteases que apresentaram atividade catalítica

significativa em pH 5 a 40˚C.

Palavras-chave: Peptidases, Pleurotus albidus, Pleurotus ostreatoroseus.

Introdução

Cogumelos são fontes de nutrientes e compostos bioativos que conferem

propriedades medicinais e terapêuticas. São produtos que despertam pouco interesse para

comercialização, embora que contribuem de forma significativa para a subsistência de

várias populações, no mundo (Bernaud; Rodrigues, 2013; Mattila et al. 2016; Zoho et al.

2016).

Os fungos do gênero Pleurotus, conhecidos por causar a podridão branca da

madeira, apresentam a capacidade de se desenvolver em vários resíduos agroindustriais

195

que contenham celulose, hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas. (Figueiró e

Graciolli, 2011; Minotto et al., 2011).

Proteases são enzimas utilizadas em diferentes setores industriais. Estes

biocatalisadores são usados na fabricação de queijo e de pães, amaciamento de couro,

aditivo de detergentes, além de possuírem importância medicinal e cosmética (Sawant;

Nagendran, 2014). As peptidases são obtidas de diversas fontes vegetais, animais e de

micro-organismos, Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como produtores de

enzimas proteolíticas, além de serem utilizados como alimentos (Fonseca et al., 2014).

Diversos estudos tem sido realizados sobre a extração de compostos bioativos de

cogumelos por solventes orgânicos (Silva et al. 2009). Contudo ainda há poucos relatos

sobre o potencial biotecnológico deste macrofungo.

Sendo assim o objetivo deste trabalho foi caracterizar parcialmente proteases de

extratos orgânicos de cogumelos comestiveis.

Material e Métodos

Para a produção de enzimas, foram utilizados Pleurotus albidus DPUA 1692 e

Pleurotus ostreatoroseus DPUA 1720 do acervo da Coleção de Culturas DPUA/UFAM.

As culturas foram reativadas e cultivadas em placas de Petri contendo ágar OMYA (aveia

+ extrato de levedura) durante sete dias a 25°C.

Os extratos de cogumelo foram obtidos por processo de extração com etanol e

álcool:água (1:1). O processo de extração ocorreu sob agitação contínua em agitador

orbital a 150 rpm, a 25 °C. Posteriormente os extratos foram filtrados em papel de filtro

Whatman n°1 e foram feitas as análises subsequentes.

Para determinação da atividade enzimática proteolítica foi adicionado 250 µL de

solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2 em 150 µL de extrato

bruto. Os tubos reação foram incubados por 1 hora a 25 °C em câmara escura. Para

interrupção da reação foi adicionado 1,2 mL de ácido tricloroacético 10% (p/v) e em

seguida procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 10000 rpm, a 4 °C. Em seguida, de

cada sobrenadante, foi retirado 0,8 mL e transferido para tubos de ensaio contendo 1,4 mL

de hidróxido de sódio 1M. A leitura das amostras foi realizada a 440 nm. Como branco foi

utilizado tampão na solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2.

Para avaliar o efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica, a partir do extrato

bruto onde foi determinada a maior atividade proteolítica analisou-se o efeito do pH na

atividade proteolítica, incubando-se o extrato enzimático em diferentes faixas de pH (5,0 –

196

10,0), a 25 ºC por 60 minutos. Os tampões utilizados foram Citrato Fosfato 0,2 M (pH 5,0-

6,0), Tris-HCl 0,2M (pH 7,0-8,0), Glicina-NaOH (pH 9,0-10,0). O efeito da temperatura

foi determinado em 25 ºC, 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC, em 60 minutos. A atividade

das proteases foi determinada conforme descrito anteriormente. Todos os experimentos

foram realizados em triplicata

Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva média, desvio padrão,

gráfico e os cálculos de atividade enzimática (R2 ≥ 95%) por meio de análise de variância

(Anova) e teste Tukey (p < 0,05), utilizando o software Minitab ® versão 17.0.


Neste estudo, P. albidus e P. ostreatoroseus excretaram proteases em todas as

condições avaliadas, sendo que o maior quantitativo de proteases (185 U/mL) foi

verificado quando P. ostreatoroseus foi extraído com água:álcool (1:1). Os menores

valores de atividade proteasica (80 U/mL e 102 U/mL) são observados nos extratos de P.

albidus em solventes etanol e água:álcool (1;1) respectivamente (Tabela 1).

Tabela 1. Atividade proteolítica de P. albidus e P.ostreatoroseus extraídos em

diferentes solventes orgânicos.

Taxa Solvente Atividade proteolítica

(U/ml)

Pleurotus albidus Água:álcool (1:1) 102±0,1c

P. ostreatoroseus Água:álcool (1:1) 185±0,1ª

P. albidus Etanol 80±0,0d

P. ostreatoroseus Etanol 129±0,1b

O extrato bruto com maior atividade proteolítica foi submetido à caracterização

parcial de proteases. O efeito do pH na atividade proteolítica consta na figura 1 (A). As

proteases do extrato de P. ostreatoroseus extraído com água:álcool (1:1) apresentaram

atividade máxima em pH 5,0 com valores de 308 U/mL. Esses dados sugerem a presença

de proteases ácidas no extrato enzimático avaliado. Nos trabalhos realizados por Fonseca,

et al (2014), os autores verificaram que as proteases extraídas dos basidiomas de P.

ostreatoroseus demonstraram máxima atividade em pH 6,0.

Conforme indicado na Figura 1 B, a temperatura ótima de atividade proteolítica é

de 40°C, com decréscimo de atividade nas temperaturas subsequentes, enquanto que em

70°C e 80 °C ocorre perdas de 63,3% e 60,5%, respectivamente. Dados semelhantes foram

197

obtidos por Fonseca et al. (2014) e Kirsch et al. (2013) nos trabalhos realizados com

extratos dos basidiomas de P. ostreatoroseus e outros cogumelos comestíveis.

Em relação à importância das proteases ácidas, pesquisas mostram que a maior

significância está associada à propriedade coagulante das proteínas do leite (caseínas),

processo evidenciado mundialmente e que tem contribuído para substituição da quimosina

animal pelas proteases microbianas por questões dos direitos dos animais. Espécies de

Mucor, Rhizopus, Aspergillus e Penicillium são reportadas como fonte dessas proteases

(Daboor et al., 2010).

Figura 1- Efeito do pH (A) e da temperatura (B) na atividade proteolítica de

P.ostreatoroseus

Conclusões

O extrato P. ostreatoroseus obtido da mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de

proteases com atividade catalítica significativa em pH 5 a 40˚C.

Este estudo sugere a possibilidade do uso de P. ostreatoroseus obtido da mistura de

água e álcool como fonte de proteases para aplicação industrial com extrato orgânico.

0

50

100

150

200

250

300

350

5 6 7 8 9 10

Ati

vid

ade

pro

teolí

tica

(U

/mL

)

pH

0

50

100

150

200

250

300

350

400

20 30 40 50 60 70 80

Ati

vid

ade

Pro

teolí

tica

(U

/mL

)

Temperatura C°

A B

198

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1108.

Zoho FGA, Amoikon KE, Ahui-Bitty ML, Kouamé K G, Kati-Coulibaly S (2016)


journal of north America.

200


Efeito da temperatura e do pH no crescimento micelial do fungo

amazônico Lentinus crinitus (L.) Fr.

Magalhães A.A.S1., Carvalho T.B.

2, Souza A.Q.L

3., Pereira J.O.

3

1Doutoranda do Curso de Pós-Graduação da Rede BIONORTE, Universidade Estadual do

Amazonas, 2Professora do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas,

3Professor da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas, Emails:


[email protected].

Resumo

A Amazônia é uma região de grande biodiversidade, seu clima tropical com altas

temperaturas justifica essa pluralidade ecológica que abriga uma enorme quantidade de

espécies. Dentre estas, há os basidiomicetos, comumente utilizados na medicina popular de

povos asiáticos devido ao seu valor terapêutico. Cogumelos são capazes de sintetizar uma

grande variedade de metabólitos secundários que apresentam atividade antitumoral,

antioxidante, antiinflamatória, hipoglicêmica e antibiótica. Neste estudo avaliou-se o

crescimento micelial in vitro de Lentinus crinitus (L.) Fr. em meio de cultura sólido BDA

em diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 °C) e faixas de pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e

7,5). As avaliações foram realizadas por meio de medições de quatro diâmetros das

colônias, a cada 24 horas, durante quatro dias de incubação no escuro. Com base nos

resultados, verificou-se que a temperatura de 35 °C foi a mais favorável para o crescimento

micelial, assim como, a faixa de pH entre 5,0 e 5,5 se mostrou mais adequada para o

cultivo deste fungo. A maior biomassa micelial foi obtida nos dez primeiros dias de

crescimento no meio de cultivo. O cultivo in vitro pode contribuir para o conhecimento das

potencialidades de um basidiomiceto da Amazônia e despertar o interesse no uso dos

cogumelos como suplementos nutracêuticos.

Palavras-chave: Basidiomiceto, Cogumelo, Biomassa micelial.

Introdução

Os fungos compreendem um dos maiores grupos de organismos do planeta em

número de espécies, participando praticamente de quase todas as modificações físicas ou

químicas na natureza, pois são decompositores importantes nos ecossistemas e associados

essencialmente a muitos organismos (Floudas et al., 2015). Apesar disso, a diversidade

microbiana da Amazônia e suas relações ecológicas é pouco conhecida (Pereira et al.,

2017).



mailto:antoniaqlsouza@gmail.


201

O fungo Lentinus crinitus (L.) Fr. é sapróbio, lamelar e decompositor de madeira,

pertencente à família Polyporaceae (filo Basidiomycota), representada por 40 espécies

conhecidas (Kirk et al., 2001). O gênero tem distribuição essencialmente tropical e

algumas espécies são raramente encontradas em regiões polares (Rolén, 2001). Estudos

etnomicológicos têm identificado diferentes espécies de fungos comestíveis do gênero

Lentinus, consumidos por grupos indígenas como os Yanomami na Amazônia brasileira

(Prance, 1984). De acordo com a literatura científica, são escassos os estudos sobre L.

crinitus, logo o conhecimento das potencialidades dessa espécie poderá contribuir para o

aproveitamento racional da biodiversidade brasileira, permitindo reverter à riqueza do solo,

fauna e flora brasileira em desenvolvimento econômico sustentável. Para isso, torna-se

necessário conhecer as condições ótimas de crescimento deste fungo. Hatvani (2001) relata

a importância de se conhecer os meios de cultura, tempos de incubação, pH e temperaturas

mais adequados para o crescimento dos microrganismos. A avaliação do crescimento

micelial pode ser feita de diferentes formas, tais como crescimento radial, vigor,

velocidade de crescimento e massa do micélio (Hatvani, 2001).

Em condições experimentais, o uso de meio de cultura sólido para avaliação do

crescimento de fungos é considerado adequado, pois na natureza, os fungos comumente

desenvolvem-se em substratos sólidos, tais como resíduos vegetais e animais, ou no solo

(Bononi et al. 1999). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da

temperatura e do pH no crescimento micelial de L. crinitus em meio de cultura sólido afim

de se determinar as melhores condições de obtenção da biomassa e a partir destes dados

realizar o cultivo em meio liquido e encontrar o tempo ideal da produção da biomassa.

Material e Métodos

O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia Industrial do

Centro de Apoio Multidisciplinar (CAM) da Universidade Federal do Amazonas (UFAM),

Manaus, AM. Foi utilizada uma linhagem de L. crinitus coletada na Reserva do Campus

Universitário da UFAM depositada no acervo da Micoteca DPUA da Universidade Federal

do Amazonas. O crescimento micelial foi avaliado por meio de testes em placa de Petri

inoculado com discos de 5 mm de diâmetro da linhagem de L. crinitus em meio de cultura

Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (Figura 1).

202

Figura 1. Lentinus crinitus (L.) Fr cultivado em placa de Petri por oito dias à temperatura

de 35 °C.

As placas foram distribuídas inteiramente ao acaso e mantidas em estufa

incubadora BOD nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 °C, com seis repetições para cada

tratamento. A cada 24 horas foram realizadas medições de crescimento radial do fungo na

superfície do meio de cultura por meio de quatro medições equidistantes entre si. Essas

medidas foram realizadas durante quatro dias de incubação, período em que a colônia

fúngica atingiu a proximidade das bordas da placa de Petri. Foi considerada a média diária

do crescimento micelial após quatro dias de observações em cada temperatura.

O crescimento micelial também foi avaliado em placas de Petri inoculado com

discos de 5 mm de diâmetro com a linhagem de L. crinitus em meio de cultura BDA

submetidas à seis tratamentos experimentais com diferentes pH: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e

7,5. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com os seis pH

em meio de cultura BDA. Cada tratamento foi composto por cinco repetições, sendo cada

repetição correspondente a uma placa de Petri, totalizando 30 placas.

Para o teste da curva de crescimento foram inoculados cinco fragmentos de 5mm de

diâmetro de L. crinitus em frascos erlenmeyer contendo 100 mL de meio líquido Batata

Dextrose com extrato de levedura 0,5% (p/v) (BDL) e incubado sob agitação (120 rpm) a

35 ° C por 30 dias (Souza et al., 2004). Foram preparados 25 erlenmeyers, sendo 24 para

inóculo do fungo e um controle. A cada cinco dias eram retirados quatro frascos

(quadruplicatas) da incubadora para filtração à vácuo, utilizando papel filtro estéril com o

peso previamente determinado. A biomassa fúngica foi pesada em balança analítica e em

seguida colocada em estufa a 60 º C. Em intervalos de 24 horas, os papéis de filtro foram

pesados e esse procedimento repetiu-se até que o peso constante fosse atingido. A

biomassa foi calculada pela diferença entre a massa do papel de filtro juntamente com o

micélio e a massa do papel antes da filtração

203

Os dados de crescimento nas diferentes temperaturas e condições de pH foram

submetidos à Análise de Variância de uma via. Para a comparação da massa fúngica ao

longo dos 30 dias foi utilizada Análise de Variância para medidas repetidas. O teste de

Tukey foi utilizado para as comparações múltiplas, sendo considerado α ≤ 0,05 para

significância estatística. Todas as análises citadas acima são baseadas em Zar (1999).


Houve efeito da temperatura no crescimento micelial de L. crinitus após quatro dias

de incubação (ANOVA, F=38,89; p=0,001; Figura 2), sendo o maior crescimento

observado a 35 oC e o menor a 40

oC. O crescimento micelial de cogumelos do gênero

Lentinus já foram relatadas em diversos estudos. Gbolade et al. (2006), analisando o

comportamento de L. subnudus, um cogumelo comestível da Nigéria em temperaturas

variando entre 0 ºC e 45 ºC observaram que, embora o fungo tenha crescido na faixa de

temperatura entre 15 ºC a 40 ºC, o melhor crescimento foi obtido a 30º C; Lechner e

Albertó (2007) testaram a temperatura ótima para o crescimento micelial de linhagens de

L. tigrinus e observaram que a temperatura de 30° C foi a mais favorável. Manjunathan et

al. (2011) observaram em L. tuberregium coletado da floresta de Keeriparai na Índia, um

crescimento mais favorável na temperatura de 25° C.

Figura 2. Média diária (± dp) do crescimento micelial (mm) de Lentinus crinitus

submetidos a diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 °C). Letras diferentes indicam

diferença estatística significativa (Tukey, p < 0,05).

Vargas-Isla e Ishikawa (2008) avaliando as condições ótimas do crescimento

micelial de uma linhagem de L. strigosus isolada da Amazônia brasileira, verificaram que a

temperatura mais adequada foi de 35° C. Sales-Campos et al. (2010) testaram sete

204

temperaturas de incubação (20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 °C) no cultivo de uma linhagem de

L. strigosus de ocorrência na Amazônia em meios de cultura à base de malte acrescido com

diferentes substratos, verificaram que a temperatura de 35 °C foi a mais promissora para o

crescimento micelial. Os resultados destes trabalhos na Amazônia corroboram com os

achados deste estudo.

Houve efeito do pH no crescimento micelial de Lentinus crinitus após quatro dias

de incubação (ANOVA, F=8,94; p=0,001; Figura 3) sendo mais evidente nas condições

submetidas aos pH 5,0 e 5,5. Este resultado difere do que foi encontrado por De Leon et al.

(2017) ao testarem sete pH (5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0) no cultivo de um cogumelo

comestível selvagem recentemente domesticado nas Filipinas (Lentinus squarrosulus), os

autores observaram que pH de 6,5-7,0 foi o mais adequado para o crescimento micelial.

Segundo Chang e Miles (1989), a concentração de O2 e o pH influenciam os processos

metabólicos dos fungos e, conseqüentemente, a habilidade de utilizar substâncias nutritivas

tais como carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. A importância do pH está

primordialmente relacionada com metabolismo dos nutrientes, evidenciando a necessidade

de se conhecer a faixa ótima para o cultivo desses fungos.

Câmara de Assessoramento Científico - PESQUISA

Figura 3. Média diária (± dp) do crescimento micelial (mm) de Lentinus crinitus

submetidos a diferentes condições de pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e 7,5). Letras diferentes

indicam diferença estatística significativa (Tukey, p < 0,05).

Os resultados do cultivo submerso mostraram que a maior massa micelial de L.

crinitus foi obtida nos primeiros dez dias de incubação (ANOVA para medidas repetidas,

F=16,21; p=0,001, Figura 4), o que provavelmente está relacionado à presença de maior

substrato energético durante esse período. Como não houve diferença de produção de

205

biomassa fúngica entre o quinto e décimo dia (Tukey, p=0,002), conclui-se que os cinco

primeiros dias é suficiente para a obtenção de uma maior produção de biomassa. Hassan et

al. (2012) testaram o melhor período de incubação (5, 10, 15 e 20 dias) no cultivo

submerso de um cogumelo comestível e medicinal (Flammulina velutipes) em diferentes

meios de cultura e verificaram que 15 dias de fermentação foi o mais adequado para uma

maior produção de biomassa micelial. Segundo Anike et al. (2015) fatores como

nutrientes, volume, agitação, temperatura podem afetar a produção de biomassa micelial;

conhecer as melhores condições de cultivo podem gerar benefícios na busca de novos

compostos bioativos.

Figura 4. Média (± dp) da biomassa micelial (grama) de Lentinus crinitus cultivado em

meio BDL durante trinta dias à temperatura de 35° C. Letras diferentes indicam diferença

estatística significativa (Tukey, p < 0,05).

Conclusões

Foi possível evidenciar a temperatura e a faixa de pH ótimos para o crescimento

micelial de L. crinitus.

Um rápido crescimento micelial é importante, uma vez que reduz os índices de

contaminações e crescimento de outros organismos competidores.

O conhecimento das melhores condições de cultivo in vitro deste fungo pode

contribuir na geração de subsídios para o desenvolvimento de adjuvantes alimentares,

nutracêuticos ou fármacos com novas substâncias bioativas.

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208



Estabilidade e toxicidade de extratos proteolíticos de Pleurotus

ostreatoroseus e Lentinus citrinus cultivados em resíduo lignocelulósico da

Amazônia

Martim S.R.1, Silva L.S.C

1, Prado F.B

2, Machado A.R.G

1, Teixeira M.F.S

3

1Doutorado Rede BIONORTE, Universidade Federal do Amazonas,

2Mestrado em Biotecnologia,

Universidade Federal do Amazonas, 3Professora, Universidade Federal do Amazonas. Emails:

salomã[email protected], [email protected], [email protected],


Resumo

As proteases catalisam diversas reações químicas vitais para manutenção de micro-

organismos e apresentam ampla aplicação industrial. Este estudo teve por objetivo avaliar

o efeito do tempo e da temperatura de armazenamento na estabilidade e a toxicidade de

extratos proteolíticos de Pleurotus ostreatoroseus e Lentinus citrinus. Os macrofungos

foram cultivados em semente de açaí suplementada com farelo de arroz (90:10, p/p), pH 6,

umidade (60%). O bioprocesso foi conduzido por 10 dias a 25 °C. As proteases foram

extraídas em água destilada esterilizada. Os extratos brutos foram filtrados e armazenados

durante oito meses a 4°C e -10°C. A atividade proteolítica foi determinada utilizando

azocaseína como substrato. A toxicidade dos extratos foi determinada pelo método de

difusão em ágar contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans. As

proteases de todos os extratos testados se mantiveram ativas durante oito meses de

armazenamento. No extrato de P. ostreatoroseus mantido a 4°C, houve redução de 8% de

atividade proteolítica, contudo na temperatura de -10oC o extrato manteve 97,35% de

atividade residual. Os extratos de L. citrinus mantiveram estabilidade nas condições

avaliadas. Os extratos testados não apresentaram toxicidade contra E. coli, S. aureus e C.

albicans e apresentam possível potencial para aplicação na indústria de alimentos.

Palavras-chave: peptidase, Pleurotus ostreatoroseus, Lentinus citrinus, armazenamento.

Introdução

As proteases ou peptidases são enzimas que catalisam reações hidrolíticas em que

as moléculas de proteínas são degradadas em peptídios e aminoácidos. A proteólise é um

processo essencial para o desenvolvimento e manutenção da vida de diferentes organismos.

Em fungos as proteases estão relacionadas com a germinação e formação de esporos, na

patogênese e nos processos de regulação pós-traducional (Mandujano-González et al.,

2016).

Microrganismos são as fontes mais comuns de enzimas comerciais devido as suas

propriedades fisiológicas e bioquímicas, facilidade das condições de cultivo e de

209

manipulação celular. Dentre as enzimas microbianas, as proteases são as mais importantes

para a indústria, constituindo 65% do mercado total de enzimas industriais. Estes

biocatalisadores são usados para processamento de alimentos, elaboração de produtos

farmacêuticos, beneficiamento do couro, produção de detergentes e em processos de

biorremediação. Os estudos relacionados com a estabilidade dos extratos proteásicos, em

diferentes condições de armazenamento, são imporatntes para indicar suas aplicações

industriais (Rodarte et al., 2011; Inácio et al., 2015).

Dentre os microrganismos os cogumelos têm se destacado como produtores de

peptidases: Lentinus edodes (Alemu, 2014), L. citrinus (Machado et al., 2016), Pleurotus

ostreatoroseus (Fonseca et al., 2014), P. sajor-caju (Ravikumar et al., 2012).

Além de serem utilizados como fonte de alimento, os cogumelos sintetizam

metabólitos bioativos, como por exemplo, espécies de Pleurotus, Ganoderma e Lentinula.

Pleurotus ostreatus têm sido utilizadas para combater cepas resistentes de Escherichia coli,

Staphylococcus epidermidis e S. aureus e espécies de Candida (Sharma et al., 2014).

Este estudo teve por objetivo avaliar a estabilidade enzimática de extratos de

Pleurotus ostreatoroseus e Lentinus citrinus armazenados em temperaturas de 4 °C e -

10 °C e verificar a toxicidade dos extratos contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli

e Candida albicans.

Material e Métodos

Neste trabalho foram usadas culturas viáveis e puras dos cogumelos comestíveis

Pleurotus ostreatororeus DPUA 1720 e Lentinus citrinus DPUA 1693 acessados da

Coleção de Culturas do Departamento de Parasitologia da Universidade do Amazonas –

Coleção DPUA. As culturas foram cultivadas em ágar batata dextrose + extrato de

levedura 0,5% (p/v) (Figura 1). Para o bioprocesso em estado sólido foram utilizados,

como meio de cultivo, semente de açaí, suplementados com farelo de arroz (90:10, p/p).

Esta mistura teve o pH corrigido para 6 e a umidade ajustada para 60%, seguido de

esterilização a 121 °C por 1 hora. Foram adicionados cinco discos miceliais de 50 mm (Ø)

sobre o meio de cultivo solido e o bioprocesso foi conduzido por 10 dias a 25 °C. As

proteases produzidas por fermentação em estado sólido foram extraídas a 30 oC, em água

destilada esterilizada na razão 1:5 (substrato:água, m/v), a 150 rpm. Após 30 minutos o

extrato bruto foi recuperado por filtração sob vácuo utilizando papel Whatman no

1. Em

seguida o extrato enzimático foi filtrado em membrana de éster de celulose com

210

porosidade de 0,45 µm (Ø) e armazenados em temperaturas de 4 °C e -10 °C, em

refrigerador doméstico. Nos extratos enzimátcos foi determinada a atividade proteolítica

no tempo inicial (tempo zero) e a cada dois mêses durante 8 meses. A atividade proteolítica

foi determinada de acordo com a metodologia descrita por Leighton et al. (1973) que

utiliza azocaseína a 1% (p/v) como substrato enzimático. Uma unidade de atividade

proteolítica foi definida como a quantidade de enzima capaz de produzir um aumento na

absorvância de 0,01 em 1 hora e expressa em U/mL.

Figura 1. L. citrinus (A) e P. ostreatoroseus (B) cultivados em BDA suplementado com

extrato de levedura (0,5%).

A avaliação da toxicidade foi realizada pelo método de difusão em ágar. Os micro-

organismos testados foram cultivados em ágar Sabouraud a 25°C por 48 horas (Candida

albicans DPUA 1340) e em ágar Müeller-Hinton, a 37°C por 24 horas (Staphylococcus

aureus (CCT 1352), Escherichia coli (CCT 0547). Nesses cultivos foi preparada uma

suspensão celular de concentração semelhante à coluna no1 da escala de MacFarland. De

cada suspensão, foram retirados 100 µL para serem semeados na superfície ágar Sabouraud

e ágar Müeller-Hinton, em placa de Petri (10 mm x 90 mm, Ø), formando uma camada

uniforme. Nesses cultivos foram retirados discos com 8 mm (Ø) e adicionados 100 µL de

extrato bruto obtido por fermentação em matriz sólida. As placas foram incubadas a 25 °C

e 37 °C por 24 e 48 horas, respectivamente. Como padrão foram utilizados itraconazol e

cloranfenicol (200 µg/ mL). A toxicidade dos extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus

contra os micro-organismos testados foi avaliada medindo-se o halo de inibição.

Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva (média e desvio

padrão) a um nível de significância de 95 % pelo Teste de Tukey utilizando o software

Minitab, versão 16.0. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

(A) (B)

211


A temperatura e o perfil de estabilidade são características bioquímicas que são

usadas para indicar a aplicação de enzimas em processos industriais e biotecnológicos

(Castro et al., 2013). A inativação de enzimas durante a estocagem é um fator limitante

para sua aplicação industrial (Merheb-Dini, 2010).

As atividades proteolíticas dos extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus, no tempo

zero foram 87 U/mL e 93 U/mL, respectivamente. O efeito do tempo e da temperatura de

armazenamento na atividade proteásica dos extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus

constam nas figuras 2 e 3, respectivamente.

Figura 2. Efeito do armazenamento na atividade proteolítica de P. ostreatoroseus.

As proteases de P. ostreatoroseus e L. citrinus se mantiveram ativas durante o

armazenamento a 4 °C e a -10 °C. O tempo e a temperatura de armazenamento

influenciaram significativamente na atividade proteolítica de P. ostreatoroseus, mas a

atividade proteásica dos extratos de L. citrinus se mantiveram estáveis nas condições de

estudo. Houve redução de atividade dos extratos enzimáticos de P. ostreatoroseus

mantidos em temperaturas de 4° C durante o tempo de armazenamento. No segundo mês

de análise, a atividade proteolítica do extrato bruto de P. ostreatoroseus reduziu 3% e após

oito meses foi verificada decréscimo de 8% de atividade proteolítica. Apesar da redução na

atividade proteolítica, o extrato de P. ostreatoroseus manteve atividade residual superior a

90 %. Enquanto que sob congelamento, o extrato de P. ostreatoroseus manteve 97,35% de

atividade proteásica, após oito meses de armazenamento. Ito et al. (2010) também

observaram decréscimo de atividade das peptidases excretadas por Beauveria bassiana

durante o tempo de armazenamento, sendo que sob condições de refrigeração as enzimas

50

60

70

80

90

100

110

0 2 4 6 8 10

Ati

vid

ade

resi

dual

(%

)

Armazenamento (meses)

4 °C

10°C

Temperatura de armazenamento

212

mantiveram 80 % de atividade proteolítica. Merheb-Dini (2010) relataram que as proteases

de Thermomucor Indicae-Seudaticae N31 mantiveram estáveis durante dez semanas sob

refrigeração a 7 °C.

A atividade proteolítica dos extratos de L. citrinus no tempo zero foi de 93,00

(±0,00) U/mL. Esta atividade se manteve estável independente do tempo e das condições

de armazenamento. Merheb-Dini (2010) também verificou estabilidade das peptidases do

extrato enzimático de Thermomucor indicae-seudaticae N31 sob condições de temperatura

de -7 °C. Ito et al. (2007) relataram que as proteases de Beauveria bassiana mantiveram 90

% de atividade a -18 °C. Contudo Silva (2013) verificou que as proteases de T. indicae-

seudaticae N31 perderam 25 % de atividade durante armazenamento a -20 °C.

Segundo Oetterer et al. (2006), as enzimas perdem atividade devido à ação do frio e

ao método de congelamento utilizado para conservação de matérias-primas e produtos

alimentícios. Os métodos de congelamento podem ser classificados em lento e rápido. O

congelamento lento é realizado em freezer doméstico, enquanto que no congelamento

rápido são utilizados equipamento específicos como congeladores de ar forçado ou de

placa. Quanto menor a temperatura de estocagem sob congelamento, menor é a taxa de

alterações bioquímicas. Contudo, o congelamento e o armazenamento congelado não

inativam completamente as enzimas (Fellows, 2006). Merheb-Dini (2010) relata que a

perda de atividade proteolítica em temperaturas de congelamento ocorrem devido à

formação de cristais de gelo que podem ter alterado a estrutura conformacional da proteína

resultando em perda de atividade e menor conservação do extrato proteolítico de T.

indicae-seudaticae N31.

A utilização de microrganismos vivos como fungos e bactérias para investigar a

toxicidade em compostos químicos e em produtos naturais, tornou-se uma opção viável ao

longo dos anos (Viera et al., 2013). O consumo de cogumelos tem crescido nos últimos

anos. Estes macrofungos, além de serem ricos nutricionalmente, sintetizam compostos

bioativos com potencial medicinal e antimicrobiano (Nidadavolu et al., 2010).

213

Figura 3. Efeito do armazenamento na atividade proteolítica de L. citrinus.

A toxicidade dos extratos brutos de L. citrinus e P. ostreatoroseus frente a

Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans está demonstrada nas figuras

4, 5 e 6, respectivamente. Nas condições avaliadas, os extratos de P. ostreatoroseus e de L.

citrinus não apresentaram toxicidade contra S. Aureus. Estes resultados estão de acordo

com os estudos de Akyuz et al. (2009) e Gbolagade e Fasidi (2005) que não verificaram

atividade tóxica dos extratos de P. ostreatus e Auricularia polytricha, respectivamente,

contra S. aureus. Contudo os resultados obtidos no presente estudo diferem dos relatados

por Alves et al. (2012) que avaliaram a atividade dos extratos de Russula delica e de

Fistulina hepática contra S. aureus.

Figura 4. Teste de toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus contra S.

aureus: A1: L. citrinus (-10°C); A2: L. citrinus (4 °C); B1: P. ostreatoroseus (-10 °C); B2:

P. ostreatoroseus (4°C); C: (Controle – Cloranfenicol).

Os extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus também não demonstraram toxicidade

contra Escherichia coli. Estes resultados corroboram com os dos estudos de Akyuz et al.

(2010) que não verificaram toxicidade dos extratos de Terfezia boudieri, Pleurotus

ostreatus e Pleurotus sajor-caju frente a E. coli. Dados diferentes daqueles apresentados

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

Ati

vid

ade

resi

dual

(%

)

Armazenamento (meses)

4 °C10…

Temperatura de armazenamento

A1 A2

B1 B2

C

214

por Ramesh e Pattar (2010) que verificaram toxicidade dos extratos de Lycoperdon

perlatum, Pleurotus pulmonarius, Marasmius oreades e Clavaria vermiculris contra E.

coli.

Figura 5. Teste de toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus contra E. coli:

A1: L. citrinus (-10°C); A2: L. citrinus (4 °C); B1: P. ostreatoroseus (-10 °C); B2: P.

ostreatoroseus (4°C); C: (Controle – Cloranfenicol).

Não foi verificada toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus frente a

Candida albicans. Gbolagade e Fasidi (2005) também não relataram ação dos extratos

obtidos de macrofungos Basidiomycetes (Auricularia polytricha e Tricholoma lobayensis)

e Ascomycetes, Daldinia concentrica contra C. albicans. Contudo os extratos de Pleurotus

pulmonarius e Marasmius oreades foram ativas contra C. albicans, conforme Ramesh e

Pattar (2010).

Figura 6. Teste de toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus contra C.

albicans. A1: L. citrinus (-10°C); A2: L. citrinus (4 °C); B1: P. ostreatoroseus (-10 °C);

B2: P. ostreatoroseus (4°C); C: (Controle – Itraconazol).

A1 A2

B1 B2

C

A1 A2

B1 B2

C

215

A produção em grandes quantidades e a eficiência catalítica sem processamento

adicional (in natura) são requisitos essenciais para que as peptidases sejam aplicadas a

nível industrial (El-Baky et al., 2011).

Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que os extratos

proteolíticos de P. ostreatoroseus e L. citrinus não são tóxicos e apresentam potencial para

aplicação na indústria de alimentos. Proteases obtidas de cogumelos Termitomyces

clypeatus (Majumder et al. 2015), Hericium erinaceum (Nakamura et al. 2014) e Coprinus

lagopides (Shamtsyan et al., 2014). Apresentam possíveis potenciais para aplicação na

indústria de laticínios como agentes coagulantes do leite:

Estudos recentes têm evidenciado a aplicação segura de cogumelos na produção de

produtos alimentícios. Souza et al. (2016) desenvolveram três bioprodutos formulados com

exocarpo de abacaxi e micélio de Pleurotus albidus, Pleurotus florida e Lentinus citrinus.

Machado et al. (2016) relatam que o corpo de frutificação de L. citrinus é fonte de

proteínas, aminoácidos essenciais e fibras, demonstrando potencial para utilização na

alimentação humana e em processos industriais.

Conclusões

Os extratos de Pleurotus ostreatoroseus e Lentinus citrinus mantêm atividade em

temperaturas de 4 °C e a -10 °C, após oito meses sob armazenamento.

A estocagem a 4°C interfere na estabilidade do extrato proteolítico de P.

ostreatoroseus, contudo a atividade proteásica dos extratos de L. citrinus não é afetada

pelo armazenamento refrigerado.

Os extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus não são tóxicos para Escherichia coli,

Staphylococcus aureus e Candida albicans e apresentam possíveis potenciais para

aplicação na indústria de alimentos.

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218



Capacidade de microrganismos autóctones de solos amazônicos em usar

o petróleo como fonte de carbono com meios nutricionais distintos

Moura D.C.G1 , Oliveira L.A.

2

1Mestre em Biotecnologia, Universidade do Estado do Amazonas,

2Pesquisador, Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected]

Resumo

A biorremediação é uma técnica que vem alcançando importância mundial, uma

vez que o aumento da atividade industrial está degradando, cada vez mais, os ecossistemas

naturais. Para os hidrocarbonetos, em especial, a velocidade de degradação comumente

depende da concentração do contaminante e da quantidade de espécies catalisadoras, como

as enzimas geradas in situ pelos microrganismos. Estimular esses microrganismos a se

reproduzirem e liberar enzimas é possível por meio da adição de soluções de fertilizantes.

O objetivo desta pesquisa foi estudar duas soluções de nutrientes que estimule o

crescimento de microrganismos naturais do solo, de forma a otimizar o processo de

biodegradação de petróleo. Foram selecionadas previamente seis linhagens de

microrganismos potencialmente degradadoras de petróleo isoladas a partir de solos da

Província Petrolífera de Urucu, Coari-Amazonas. A capacidade das linhagens estudadas

foi avaliada utilizando uma metodologia previamente testada, em placas de Petri, onde

avaliou-se a taxa de crescimento das bactérias ao usarem o petróleo como fonte de

carbono. A solução de nutrientes INPA, quando comparada à BH, proporcionou maiores

taxas de crescimento das bactérias a partir do sexto dia de avaliação até o final do

experimento, aos 15 dias, sendo considerada a mais apropriada para as linhagens

estudadas.

Palavras-chave: Biorremediação, metabolismo microbiano, petróleo, solos amazônicos,

microbiologia ambiental.

Introdução

O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outras substâncias,

resultantes de processos físico-químicos sofridos pela matéria orgânica, que se depositou

juntamente com fragmentos de rochas durante a formação de estruturas sedimentares,

milhões de anos atrás. Hidrocarbonetos parafínicos, naftênicos, aromáticos e oleofinas

constituem essencialmente o petróleo. Em proporções menores, encontram-se compostos

contendo nitrogênio, oxigênio, enxofre e metais pesados (Santestavan, 2008).

Com a exploração e comercialização do petróleo e seus derivados, vazamentos

indevidos e acidentais vêm ocorrendo, gerando graves danos ao meio ambiente o que torna

imprescindível o desenvolvimento de tratamentos a fim de remediar a área contaminada

(Biello, 2010), uma vez que devido, principalmente, à complexidade dessa mistura,

normalmente o tratamento de áreas contaminadas por essas substâncias torna-se difícil e

problemático (Andrade et al., 2010).

219

A descontaminação de sítios pode ser obtida por técnicas de biorremediação. A

biorremediação pode ser considerada como uma nova tecnologia para tratar locais

contaminados mediante o uso de agentes biológicos capazes de modificar ou decompor

poluentes alvos. Estratégias de biorremediação incluem: a utilização de microrganismos

autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de tecnologias ativas de

remediação (biorremediação intrínseca ou natural); a adição de agentes estimulantes como

nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestimulação); e a inoculação de consórcios

microbianos enriquecidos (bioaumento). O benefício desses processos é a mineralização do

poluente, isto é, a transformação em gás carbônico, água e biomassa (Mariano, 2006). Um

super microrganismo fracassa porque compete com as comunidades adaptadas ao meio.

Contudo, encorajar esses microrganismos a trabalhar mais, é teoricamente possível por

meio de uso de fertilizantes como o ferro, nitrogênio e fósforo. De fato, este processo

acelerou a atividade microbiana no sedimento ao longo da costa do Alasca, após desastre

com Exxon Valdez (Biello, 2010).

Tendo essas definições e reconhecendo a importância da biorremediação para a

recuperação de ambientes degradados, tem-se um cenário propício e estimulante à

pesquisas que visem identificar novas e melhores formas de reduzir impactos ambientais

ou, atuando na correção de agressões já geradas, promovendo alternativas na remediação

de locais contaminados.

Assim, essa pesquisa buscou avaliar a capacidade de consumo de petróleo como

fonte de carbono por seis linhagens de bactérias isoladas de solos Amazônicos por meio de

duas soluções de nutrientes, INPA e BH, através da avaliação de taxas de crescimento

microbiano.

Material e Métodos

Para o teste de capacidade microbiana em usar petróleo como fonte de carbono em

meios nutricionais distintos foram utilizados os tratamentos com os meios BH e INPA,

ambos com pH 6,0 com três repetições cada, em placas de Petri, com petróleo como fonte

de carbono na superfície do Agar, utilizando as bactérias seis linhagens previamente

selecionadas.

O meio BH – Bushnell Haas é recomendado desde 1963 em uma publicação

especial pelo Comitê da Sociedade de Microbiologia Industrial – SIM – para a análise

microbiológica de combustíveis na deterioração por microrganismos de uma variedade de

hidrocarbonetos como querosene, óleos minerais, parafina e gasolina. É um meio mineral,

que contém alguns dos nutrientes necessários para o crescimento de bactérias que são

capazes de decompor hidrocarbonetos. Neste estudo foi feito um comparativo entre o meio

INPA, meio também mineral, diferenciado por conter nutrientes como Se2+

, Zn2+

, Cu2+

,

Fe2+

, Mn2+

, estudado na degradação de hidrocarbonetos por microrganismos, em análise ao

meio BH.

220

Tabela 1 - Meio Mineral Bushnell Haas (Meio BH)

Componentes Quantidade

KH2PO4 1,0g

K2HPO4 1,0 g

*NH4NO3 1,0 g

MgSO4.7H2O 0,2 g

FeCl3. H2O 0,05 g

CaCl2.2H2O 0,02 g

H2O destilada 1000 mL

Nota: *Substituído por 1,65g de (NH4)2SO4. Fonte: Atlas (1995)

Tabela 2 - Meio Mineral INPA (Meio INPA)

Componentes Quantidade

KH2PO4 1,5 g

K2HPO4 0,5 g

(NH4)2SO4 2,5 g

MgSO4.7H2O 0,4 g

Ca(CH3COOH)2. H2O 0,02 g

FeSO4.7H2O 0,05 g

FeCl3.6H2O 0,05 g

ZnSO4.7H2O 0,01 g

CuSO4. 5H2O 0,01 g

MnSO4 .7H2O 0,01 g

Na4Se O3 0,01 g

H2O destilada 1000 mL

Para a avaliação do crescimento microbiano foi utilizado o método de riscagem

proposto por Oliveira e Magalhães (1999). As avaliações foram feitas a cada três dias

durante um período de 15 dias, no qual as bactérias ficaram no laboratório a uma

temperatura de 28 oC ± 2 ºC. De acordo com o crescimento celular nas respectivas zonas

(Figura 1), foram dados valores de crescimento para cada microrganismo variando de 1

(sem crescimento visível após riscagem) a 4 (máximo crescimento), podendo ter valores

intermediários entre esses extremos.

O método consiste em riscar o microrganismo em 4 zonas, como descrito abaixo:

Zona 1: consiste em uma linha, riscando-se várias vezes os microrganismos com

auxílio de uma alça de platina, em ambas direções conforme indica a seta;

221

Zona 2: é compreendida por quatros linhas paralelas entre si, cada uma com uma

intercessão na zona 1, na parte direita-terminal, no sentido indicado pela seta;

Zona 3: formada por quatros linhas paralelas entre si, cada uma com intercessão na

zona 2, na parte direita-terminal;

Zona 4: Composta por quatros linhas paralelas entre si, com uma intercessão na

zona 3, na parte direita-terminal, no sentido indicado pela seta.

Figura 1. Ilustração do método de riscagem proposto por Oliveira e Magalhães (1999).

Figura 2. Valores de crescimento para as bactérias selecionadas nos respectivos

tratamentos em placas de Petri com meio BH e INPA.

2.0 3.0 4.0

1.0 1.25 1.5

Zona 3

Zona 4

Zona 2

Zona 1

222

Este método permitiu ainda avaliar as bactérias a partir da escala determinada na

Tabela 3 e classificá-las de acordo com o grau de tolerância.

Tabela 3 - Escala de valores para a avaliação do crescimento da bactéria nos meios BH e

INPA (pH 6,0; pH 6,0 respectivamente).

Graus de crescimento Intervalos de pontuação

Baixo 1,00 - 2,00

Médio 2,06 * - 3,00

Elevado 3,06 * - 4,00

* Três repetições com nota 2,0 e uma com 2,25.

** Três repetições com nota 3,0 e uma com 3,25.


Ao se usar o método de Oliveira e Magalhães (1999) para a mesma avaliação de

crescimento em meio de cultura contendo o petróleo de Urucu como fonte de carbono e as

soluções de nutrientes INPA e BH como complementos em placas de petri (Tabela 4),

observou-se de um modo geral, que onde a solução INPA foi adicionada houve maior

crescimento das bactérias a partir do sexto dia de crescimento até o final do experimento,

aos 15 dias de incubação em laboratório.

Tabela 4- Classificação da capacidade dos microrganismos consumirem petróleo pelo

método de Oliveira e Magalhães (1999).

Monitoramento 3º dia 6º dia 9º dia 12º dia 15º dia

Tratamento INPA BH INPA BH INPA BH INPA BH INPA BH

Bactéria 1 1,00 1,00 2,00 1,50 3,50 2,50 3,75 2,75 4,00 3,00

Bactéria 2 1,00 1,00 2,50 2,50 3,66 3,25 3,75 3,50 4,00 3,75

Bactéria 3 1,00 1,00 2,50 2,00 3,50 3,00 3,75 3.25 4,00 3,66

Bactéria 4 1,00 1,00 2,00 1,00 3,25 1,25 3,50 2,50 3,83 3,00

Bactéria 5 1,00 1,00 2,00 1,75 3,25 3,00 3,50 3,25 3,83 3,50

Bactéria 6 1,00 1,00 1,75 2,50 3,25 3.00 3,50 3,25 3,75 3,50

Médias 1,00 1,00 2,12 1,87 3,40 2,66 3,62 3,08 3,90 3,40

Esse método foi utilizado primeiramente para avaliar graus de tolerância à acidez e

Al tóxico por isolados de rhizobia (Magalhães e Oliveira, 1999; Hara e Oliveira, 2004,

223

2005, 2007), considerando-se tolerantes, aqueles quando atingem a nota mínima de 3,06.

Usando o mesmo raciocínio, poder-se-ia usar a mesma nota para indicar maiores

capacidades das bactérias aqui estudadas, em degradarem o petróleo. Desse modo,

observa-se que todas as seis bactérias já apresentam essas notas já no nono dia de

crescimento quando foi usada a solução mineral INPA, enquanto que nesse mesmo dia,

apenas uma das seis bactérias apresentou essa nota quando se usou o meio BH. Aos 12

dias, somente três das seis bactérias apresentaram essa nota no meio com BH e aos 15 dias,

ainda haviam duas bactérias por atingir essa nota mínima nesse meio.

Esses dados comprovam que o meio mineral INPA se mostrou superior ao BH

quanto à habilidade dos microrganismos usarem o petróleo como fonte de carbono, que em

termos práticos significa maior capacidade de degradação desse composto orgânico.

Desta forma, ficou evidente que o meio INPA aumentou consideravelmente a

capacidade dos microrganismos em consumirem petróleo como fonte de carbono quando

comparado ao meio BH (Figura 3), evidenciando que a solução ajustada com nutrientes

como Se2+

, Zn2+

, Cu2+

, Fe2+

, Mn2+

aumenta a velocidade de crescimento microbiano, e por

conseguinte, uma maior taxa de degradação.

Conclusões

A capacidade de degradação de petróleo pelas seis bactérias foi aumentada

utilizando meio INPA quando comparado ao BH.

A solução INPA apresentou ser uma alternativa viável como técnica de

bioestímulo, pelo uso de nutrientes que favorecem o crescimento de microrganismos

naturais de ecossistemas contaminados.

Agradecimentos

Ao INPA e UEA pelo apoio da infraestrutura e, CNPq, FAPEAM e FINEP, pelo apoio

financeiro para a realização dessa pesquisa.

224

Referências

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rizóbio oriundos de solo ácido do município do Rio Preto da Eva. Amazonas. Revista de

Ciências Agrárias (Belém), 48:55-72.

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cromatografia gasosa. Trabalho de conclusão de curso, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, 42p.

225


Análise comparativa de captação de fosfato usando bactérias isoladas do

rio Negro e rio Solimões Nonato L. da S.

1, Nascimento N. J. C. do

2, Silva M. da S.

3 ,Santos S. F.

4, Mota A. J.

5

1 Graduanda de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas,

2 Graduanda de

Zootecnia da Universidade Federal do Amazonas, 3Mestrando de Biotecnologia na Universidade

Federal da Amazonas, 4

Pesquisadora da Universidade Federal do Amazonas, 5Docente da

Universidade Federal do Amazonas.

E-mails: [email protected], [email protected], [email protected],

[email protected] , [email protected]

Resumo

O fósforo é um dos elementos mais importantes para os seres vivos por ser constituinte de

várias moléculas essenciais sem as quais não existiria vida. Porém, há uma possível crise

desse elemento, devido à grande exploração de suas jazidas. Apesar de finito, o fósforo

pode ser reciclado através de processos químicos e biológicos, sendo este último

empregando microrganismos. Estudos limnológicos mostram que há uma diferença de

riqueza e limitação desse nutriente entre os rios Solimões e Negro, respectivamente. Logo,

a hipótese que naturalmente surge é que a pressão seletiva do rio Negro selecione

captadores eficientes de fosfato. O objetivo foi comparar a capacidade de captação de

fosfato entre as cepas isoladas dos dois rios. Foram isoladas 756 bactérias desses ambientes

e até o momento foi possível testar 55 isolados usando um meio de cultura salino e com

baixa concentração de fosfato. A mensuração da captação de fosfato foi feita por diferença

de concentração do elemento existente no meio de cultura no início do experimento menos

a concentração residual depois do cultivo. De forma qualitativa foi possível observar que

houve uma maior prevalência de bactérias eficientes na captação de fosfato isoladas a

partir do rio Negro.

Palavras-chave: Captação de Fosfato, Regulon PHO, Microbiologia, Sistemas PIT/PST

Introdução

O fósforo é um dos elementos mais importantes para a existência e manutenção dos

seres vivos. É constituinte, por exemplo, do material genético, além de lipídios, proteínas e

açúcares (Wanner, 1993; 1996), a vida, portanto, seria inviável em uma eventual escassez

desse nutriente.

O fósforo é explorado principalmente pela indústria de fertilizantes, visto que é um

dos três nutrientes necessários para o crescimento das plantas, juntamente com o



226

Nitrogênio (N) e o Potássio (K) (Abelson, 1999). Porém, uma possível crise do elemento

fósforo vem sendo discutida pelos especialistas há algumas décadas, devido à grande

exploração das jazidas de rochas fosfáticas pelo mundo (Hubbert, 1956). De acordo com o

United States Geological Survey (USGS), a estimativa (2010) de exploração

economicamente viável da reserva mundial de fosfato, com a tecnologia existente à época,

é da ordem de 16.000 Mt (megatonelada = 1 milhão de tonelada). Em 2011, já haviam sido

extraídas 191 Mt de rocha fosfática, e nesse ritmo de consumo, as reservas de fósforo irão

se esgotar num prazo de 80 anos (Jasinski, 2012). Colheitas sucessivas que retiram o

fósforo do solo e o crescimento populacional, que acelera a taxa de depleção de suas

reservas, são outros fatores que contribuem para um cenário preocupante em relação à crise

do fósforo.

Não há nenhum substituto para o fósforo na natureza. Porém, diferentemente do

petróleo, este elemento pode ser reciclado. Existem maneiras de recuperação/captação de

fosfato do meio ambiente, como a recuperação química do fosfato a partir de águas

residuais e uso de microrganismos.

Os microrganismos armazenam naturalmente fosfato na forma de polifosfato

inorgânico, polímero com cadeias de dezenas a centenas de resíduos de fosfato, os quais

podem ser clivados e liberar moléculas de ortofosfato (Rao et al., 1999).

O processo biológico de remoção de Pi de águas residuárias, por exemplo, tem sido

objeto de pesquisas para compreender melhor os mecanismos utilizados pelos

microrganismos para captar Pi e possibilitar a substituição do processo de remoção

química do fosfato. Bactérias como Escherichia coli (Taschner et al. 2004) e Pseudomonas

aeruginosa, são protagonistas em estudos no tema “captação de fosfato”. As descobertas

feitas até o momento levaram à descrição de um conjunto de genes, denominado Regulon

PHO, responsável pelo controle de proteínas relacionadas ao metabolismo de fosfato em

condições limitantes desse nutriente, em geral abaixo de 4 mM.

Na natureza, as plantas e animais perecem e os microrganismos degradam moléculas

complexas ao nível de estruturas químicas simples que são então utilizadas para o

crescimento de outras plantas e animais, constituindo um ciclo fechado e contínuo. Antes

do advento da Revolução Verde, a resposta à depleção de fosfatos e de outros nutrientes,

era, entre outras, devolver estrume animal para cultivar o solo. Só nos EUA, mais de 1.800

Mt de estrume animal são produzidos anualmente. Porém, a agricultura necessária para

alimentar 7 bilhões de pessoas não pode apoiar-se neste tipo de adubação primitiva.

227

Sendo o fósforo um mineral “finito e insubstituível”, há uma grande preocupação com

a escassez desse elemento dentro de algumas décadas, causada pelo esgotamento das

reservas naturais. A “reciclagem contínua” constitui o “motif” básico do ecossistema

global, mas o homem tende a interromper este balanço ecológico natural, introduzindo um

sistema linear para fora do ciclo, extraindo matérias-primas, drenando recursos naturais

finitos e produzindo bioprodutos prejudiciais durante o processo. Há necessidade de uma

intercessão neste processo, evitando desta forma o acúmulo de lixos tóxicos, o

esgotamento de recursos naturais e o perecimento do ecossistema.

A reciclagem do fosfato é uma alternativa. O processo químico já está bem

estabelecido, principalmente aqueles voltados para a formação de cristais de estruvita.

Entretanto as pesquisas agora avançam para a fronteira da recuperação biológica, como por

exemplo, o projeto Phos Farm coordenado pela companhia Fraunhofer Institute for

Interfacial Engineering and Biotechnology IGB, que usa enzimas imobilizadas para isolar

fosfatos ligados a compostos orgânicos/bioquímicos. Nesse projeto, estrumes suínos,

bovinos e de aves apresentam mais de 50% de fósforo na forma de compostos orgânicos.

Contudo, o custo do processo encarece o produto final, os fertilizantes, o que ainda

inviabiliza uma aplicação comercial.

Outra alternativa é o uso de microrganismos eficientes na captação de fosfato e com

grande capacidade para estocá-lo na forma de polímeros. Nesse sentido, duas frentes se

destacam: o uso de microalgas e o uso de bactérias. É interessante notar que tanto algas

como bactérias usam o mesmo mecanismo genético para captura e estoque de fosfato, o

regulon PHO, o qual controla vários genes que respondem à carência de fosfato. O regulon

PHO de Escherichia coli é um dos mais conhecidos, composto por pelo menos 31 genes e

operons (Wanner, 1996; Baek e Lee, 2006).

Esse regulon é ativado apenas em concentrações de extrema carência de fosfato

(Lamache et al. 2008), abaixo de 4 µmM. Assim, espera-se que ambientes onde

naturalmente a oferta desse nutriente seja baixa, a pressão seletiva tenha selecionado

bactérias com potencial de captação mais eficiente de fosfato quando comparado com

bactérias que vivem em outros ambientes ricos nesse mineral. No presente estudo

resolvemos testar essa hipótese e isolamos bactérias tanto do Rio Negro, devido à sua

característica de baixa concentração de fosfato, cerca de 30 µM, sugerindo que as bactérias

que naturalmente crescem neste ambiente devem estar expressando um sistema de

incorporação de fosfato mais eficiente, e também bactérias isoladas do Rio Solimões,

228

ambiente rico em fosfato e, portanto, com uma microbiota menos eficiente na captação

desse nutriente.

Material e Métodos

As amostras foram coletadas em quatro pontos: (1) rio Araçá (afluente do rio

Negro); (2) rio Solimões próximo à cidade de Manacapuru; (3) rio Negro, nas

dependências do Centro de Projetos e Estudos Ambientais do Amazonas e (4) Fazenda

Experimental da UFAM. As coletas foram realizadas nos meses de Fevereiro a Março de

2015 na profundidade de 15 cm, conforme determina CETESB (2011) para esse tipo de

coleta.

As amostras coletadas foram diluídas sucessivamente em 0,9% Solução Salina até a

concentração de 10-5

. Cada diluição, incluindo a amostra não diluída, foi semeada pela

técnica de espalhamento de placa no meio de cultura Ágar Triptona de Soja (TSA) e Ágar

Luria-Bertuni (LB) e incubadas a 28°C pelo período de 24 horas (Hitchins et al. 1992). Os

isolados foram categorizados de acordo com a coloração Gram e depois criopreservados

em LB 15% glicerol, em ultracongelador -70°C.

O teste de verificação da eficiência de algumas bactérias em captar fosfato consiste

em medir a concentração de fosfato inorgânico remanescente no sobrenadante do meio de

cultura em que as bactérias foram cultivadas (Chen et al. 1956). A quantificação de fosfato

remanescente baseia-se em uma solução reveladora duas vezes concentrada: 1 volume de

167 mM de ácido sulfúrico, 1 volume de 2,5% de molibdato de amônia, 1 volume de 10%

de ácido ascórbico e 2 volumes de água deionizada. Para curva de calibração mistura-se

2X reagente de trabalho e fosfato de potássio (KH2PO4) volume/volume para as seguintes

concentrações finais de fosfato de sódio: 0,16 mM; 0,08 mM; 0,04 mM; 0,02 mM; 0,01

mM.

As bactérias foram cultivadas em meio de cultura, denominado TGP (Tris, Glicose

e Fosfato) (Tabela 1) durante 18 horas a 37°C com agitação.

Após 18 horas, as bactérias cultivadas foram centrifugadas por 10 min a 5.000 g. O

sobrenadante foi coletado e diluído 50 vezes para então ser misturado ao reagente de

trabalho volume/volume e incubado a 37°C por um intervalo de uma a duas horas. A

reação entre o fosfato remanescente com molibdato de amônio e posterior redução com

ácido ascórbico resulta na formação de um complexo de cor azul, cuja intensidade da cor

está diretamente relacionada à concentração de fosfato; o teste colorimétrico pode ser

229

quantificado por absorbância utilizando espectrofotômetro ajustado para o comprimento de

onda de 820 nm. (Chen et al., 1956).

Tabela 5: Meio de Cultivo TGP

Composição Concentração

Glicose 0,4%

Cloreto de sódio 4,68 g.L-1

Cloreto de potássio 1,5 g.L-1

Cloreto de amônia 1,08 g.L-1

Tris-base 14,52 g.L-1

Cloreto de magnésio 0,2 g.L-1

Sulfato de sódio 0,35 g.L-1

Cloreto de cálcio 0,1 M

Cloreto de ferro 1 mM

Cloreto de zinco 1 mM

Fosfato de potássio 4 mM

Fonte: Chen et al. (1956)

Para transformar os valores absolutos da absorbância em concentração de Pi foi

utilizada uma equação da reta calculada a partir dos valores obtidos na curva de calibração,

tomada por referência.

Duas cepas de Pseudomonas aeruginosa foram usadas como controle. Uma cepa

selvagem, usada como controle negativo de captação de Pi, e uma geneticamente

modificada, ∆phoU, que capta eficientemente fosfato de forma constitutiva.

Essa metodologia foi adaptada para microplacas de 96 poços, a fim de economizar

tempo e reagentes, visto a quantidade de amostras a serem processadas. Para tanto, as

bactérias foram cultivadas em microplacas de 96 poços contendo 100 µl TGP por 18h e

centrifugadas a 2.500 g por 20 min. Em seguida 2 µL do sobrenadante foram transferidos

para nova placa contendo 98 µL de água ultrapura e 100 µL da solução reveladora,

incubada a 37°C/1h e lido em λ de 820 nm.


Dos quatro locais de coleta, foram isoladas e preservadas 756 bactérias. Dessas, 39%

foram do Rio Araçá, 35% do Rio Solimões, 19% do Rio Negro (CEPEAM) e 7% da

Fazenda Experimental da UFAM (Fig. 1). Quanto à forma, há predominância de bacilos e

quanto à estrutura da parede, há predominância de Gram (+) (Fig. 2). Segundo Madigan

(2010), a maioria das bactérias encontradas no meio ambiente é Gram (+) na forma de

bacilo.

230

Figura 3. Percentual de bactérias isoladas em cada ponto de coleta

Figura 4. Análise dos perfis morfotintoriais das bactérias testadas.

Um total de 756 cepas foram isoladas e destas, foi possível testar até o momento,

quanto à capacidade de captação de fosfato, apenas 55. Dessas, 10 captaram pelo menos

50% do fosfato total disponível no meio mínimo TGP.

De acordo com a hipótese proposta nesse trabalho, espera-se uma predominância de

microrganismos eficientes na captação, isolados a partir do rio Negro. Apesar de os

resultados começarem a apontar essa tendência, ainda não temos dados suficientes para

aceitar a hipótese proposta. Na Figura 3 destacamos em vermelho os isolados que captaram

acima de 50% do fosfato total disponível no meio TGP. Observa-se que no rio Negro,

cinco isolados ultrapassaram a marca de 50%, contra um do rio Solimões. Considerando os

231

desvios, pelo menos oito isolados do rio Negro potencialmente ultrapassam 50% de

acúmulo desse nutriente.

Figura 5 - Consumo de fosfato das bactérias isoladas nos diferentes locais

Conclusão

Os resultados preliminares indicam que há uma frequência maior de bactérias que

captam fosfato de forma eficiente entre os isolados do rio Negro, resultado previsto na

hipótese proposta.

Agradecimentos

Ao CNPq e FAPEAM pelo apoio financeiro.

Referências

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233



Biotransformação de rutina por Guinardia sp.

Ohse, K.C.

1,2, Gorayeb, G.

2, Sabino, C.V.M.

2, Lima, B.R.

4,5, Silva, F.M.A.

5, Souza,

A.Q.L1,3,5

, Souza, A.D.L1,4,5

, Lima, E.S.1,2

1PPG Bionorte,

2Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UFAM,

3Faculdade de Ciências

Agrárias/UFAM, 4PPG Química,

5CAM-Central Analítica/UFAM,

UFAM (Universidade Federal

do Amazonas). E-mails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected],


Resumo

As biotransformações são reações químicas realizadas por um agente biológico, onde

ocorre a conversão de um substrato em produtos através de catalisadores enzimáticos. É

significativo usar micro-organismos para efetuar reações na síntese assimétrica de

flavonóides bioativos, devido a regiosseletividade destes. A partir de um screening,

contendo cinco linhagens de Ascomicetos endofíticos isolados de Murraya paniculata e

três moléculas, foram realizados bioensaios a fim de comparar os processos de

biotransformações dessas moléculas pelos diferentes fungos endofíticos. Foi verificado que

os resultados obtidos da biotransformação com Guignardia sp. e Rutina, apresentaram as

maiores atividades anti-glicantes. Ocorreu o desaparecimento das moléculas de rutina em

até quatro dias, visualizado nas análises de LC-MS. As analises das amostras de micélio do

fungo mostrou que a molécula não estava presente também, indicando sua

biotransformação e neste período foram detectados os íons moleculares em m/z 575 e m/z

721. As análises de PCA indicam que esses íons são os principais responsáveis pela

segregação dos grupos formados e foram estas réplicas que apresentaram a maior atividade

anti-glicante. Os grupos aparecem separados, caracterizando que são diferentes entre si

com maior intensidade.

Palavras-chave: bioconversão, fungos endofíticos, flavonóides, produtos glicados.

Introdução

As biotransformações são reações químicas realizadas por um agente biológico,

onde ocorre a conversão de um substrato, sendo esta na maioria das vezes uma substância

orgânica, em um ou mais produtos através de catalisadores enzimáticos (Demirjian et al.,

1999). A biotransformação pode ser compreendida como um conjunto de alterações

químicas (ou estruturais) que as substâncias sofrem no organismo, geralmente, ocasionadas

por processos enzimáticos, com o objetivo de formar derivados mais polares e mais

234

hidrossolúveis. As enzimas são capazes de catalisar a transformação do substrato num

único passo (Müller, 2009).

A biotransformação é uma alternativa com potencial para produzir novos

flavonóides bioativos (Bartmańska et al., 2013). Abordagens biológicas disponíveis para a

produção de flavonóides bioativos incluem biotransformação microbiológica, engenharia

enzimática e engenharia metabólica (Hosoda et al., 2013; Ludwig-Müller et al., 2014). É

significativo usar micro-organismos para efetuar reações na síntese assimétrica de

flavonóides bioativos (Shimoda et al., 2010), em vista que a transformação é um processo

que modifica as estruturas naturais e produz bioativos de flavonoides e de outras classes de

substâncias. O uso de produtores microbiológicos naturais apresentam vantagens, por

crescer rapidamente, facilidade de produção em larga escala, favorável ao meio ambiente e

livre de solventes. Além disso, a biotransformação melhora a seletividade dos produtos

naturais sem quaisquer produtos químicos tóxicos. A aplicação de microrganismos para a

biotransformação de chalconas, por exemplo, pode formar novos flavonoides por meio de

ciclização, hidroxilação, redução, metilação e reações de desidrogenação. Cepas de

Cunninghamella, Penicillium e Aspergillus são muito populares para converter flavonóides

com excelentes rendimentos, por meio de hidroxilação, desidroxilação, O-metilação, O-

desmetilação, glicosilação, desglicosilação, desidrogenação, hidrogenação, ciclização e

redução (Cao et al., 2015).

Os microrganismos endofíticos (vivem no interior do seu hospedeiro) são capazes

de produzir uma variedade de metabólitos secundários com atividades biológicas

(Masurekar, 1992; Weber et al., 2007). O endófito Guignardia sp, que ainda é pouco

explorado quanto a sua diversidade metabólica, no entanto é uma importante fonte de

produtos naturais a ser explorada na medicina, agricultura e indústria, pois possui atividade

antifúngica e bactericida, cujo principal metabólito derivado é o ácido guignardico

(Rodrigues-Heerklotz et al., 2002), usado em composições farmacêuticas. Considerando

que não há registros de estudos de biotransformação com linhagens de Guignardia

associada a rutina. Este estudo visa verificar a capacidade de Ascomicetos endofíticos em

biotransformar moléculas da classe dos flavonoides.

Material e Métodos

Os cinco Ascomicetos endofíticos utilizados foram cedidos pelo LabMicrA/UFAM

(Laboratório de Bioensaios e Microrganismos da Amazônia, da Central Analítica da

UFAM). Estes isolados foram repicados, cultivados e associados às moléculas de rutina,

235

cumarina e estigmasterol, a fim de obter as biotransformações. Os ensaios foram realizados

no LabMicrA e as análises químicas dessas biotranformações foram realizadas no

Laboratório de Espectrometria de Massas (LEMAH), da Central Analítica da Universidade

Federal do Amazonas. O teste biológico de inibição da formação de produtos glicados in

vitro foi realizado no Laboratório de Atividade Biológica (Biophar), da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Amazonas.

Os ascomicetos endofíticos isolados de M. paniculata no bairro do Coroado,

Manaus-AM: Guinardia sp., Colletotrichum sp., Xylaria sp., Fusarium sp. e um

ascomiceto não identificado foram repicados e cultivados de acordo com Souza (2006),

durante oito dias em temperatura de 28 °C. Após o crescimento, a biomassa foi transferida

por meio de fragmento de ágar contendo as hifas (5x5 mm), para 25 erlenmeyers de 125

mL (três fragmentos para cada erlenmeyer), contendo 30 mL de meio Saboraud HiMedia®

M063-500G, reduzindo a fonte de carbono para 50%. Os erlenmeyer foram submetidos à

agitação orbital em incubadora da Solab® a 120 rpm, a 28 °C. Após 5 dias de cultivo

foram acrescentados 10 mg de cada molécula em cada erlenmeyer. Decorrido os 10 dias

de incubação, foi realizada a filtragem a vácuo em sistema de filtração com membrana

Milipore® 0,22 µm, e o micélio foi transferido para outro erlenmeyer de 125mL contendo

50 mL de metanol.

As análises dos extratos biotransformados, obtidos a partir da técnica de extração

em fase sólida (Solid Phase Extraction-SPE), foram realizadas no aparelho de

espectrometria de massas marca Thermo Fisher, modelo íon trap (LCQ Fleet) equipado

com fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo negativo.

A análise multivariada foi realizada através do software Chemoface 17, versão 1.5.

Íons com intensidade abaixo de 5 % em relação ao íon mais abundante foram

negligenciados. Os componentes principais (PCA) foram calculados através da variação de

seis variáveis, correspondendo aos 54 íons registrados.

Para os ensaios de inibição de produtos glicados, foram preparadas as soluções:

tampão fosfato, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, solução de

albumina sérica bovina (BSA), solução de glicose 0,1M, solução de frutose 0,1M e solução

de gliceraldeído, conforme protocolo de Kumagai et al. (2015), inclusive a solução da

amostra. Estas foram incubadas em temperatura controlada de 37 °C, com ausência de luz

por 15 dias para glicose. Para avaliação da formação de produtos glicados, realizou-se

Espectrofluorometria, com comprimento de onda de excitação 370 nm e 440 nm de

emissão.

236

O delineamento experimental consistiu em biotransformações, ou seja, cinco

fungos x três moléculas usadas para a biotransformação, cujo tratamento foi 5 x 3, sendo

realizado 3 repetições (são 3 replicas de cada experimento e três análises em massas de

cada replica, totalizando 9 analises de cada experimento). Os dados gerados pela analise de

LC/MS foram tratados por PCA, conforme descrito anteriormente.


A partir de um screening com cinco isolados de Ascomicetos endofíticos isolados

de M. paniculata, (Guinardia sp., Colletotrichum sp., Xylaria sp., Fusarium sp. e um

ascomiceto não identificado) coletada no bairro do Coroado em Manaus/AM e três

moléculas, verificou-se que os resultados obtidos com Guignardia sp. e rutina, resultaram

no sumiço da molécula, a presença de dois ions m/z 575 e m/z 721, e a melhor atividade

anti-glicante quando comparado aos outros sistemas (Tabela 1).

Tabela 1. Reações de biotranformações utilizando linhagens de fungos endofíticos e três

substâncias naturais.

Obs.: (0 = Ausência da substância e 1 = Presença da substância, indicando o consumo ou não da substância

pelo fungo nas triplicatas de biotransformações). Guinardia sp, consumiu toda a Rutina inserida no meio, ao

longo do tempo de reação – 2-4 dias, indicada a ausência da Rutina (0 - zero)

Na análise por espectrometria de massa, o pico característico de rutina, em m/z de

609 [M-H], no tempo, após 1 dia de incubação, já com adição da substância (Figura 1).

Desta forma, a partir do padrão de espectros de massa para Rutina há indícios de

biotransformação da molécula pela linhagem de Guignardia sp. Nos espectro de ESI-MS

abaixo, pode-se observar que a rutina foi metabolizada pelo fungo após 2 dias de

incubação (Figura 1). O surgimento desses íons em determinados pontos e

desaparecimento ou diminuição de intensidade em outros pontos ao longo do tempo,

resulta da atividade enzimática realizada pelo fungo.

A análise de Componentes Principais (PCA) da biotransformação de Rutina pelo

fungo endofítico Guignardia (Figura 12), foi calculado através da variação de 54 variáveis,

Substância

Microrganismos

Fusarium sp.

Ascomiceto não identificado

Colletotrichum sp.

Xylaria sp. Guignardia sp.

Cumarina 1 1 0 - - - 1 1 1 0 0 0 1 0 0

Estigmasterol 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0

Rutina 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

237

correspondendo aos 54 íons registrados, sendo a ligação média dos seis primeiros

componentes principais, cuja variação acumulada representa 99,86%.

É possível verificar que os íons em m/z 609 (Rutina), 575 e 721, são os principais

responsáveis pela segregação dos grupos formados. Ambos os grupos, gerados a partir da

metabolização da rutina, aparecem bem separados, caracterizando possíveis diferentes

grupos entre si, com maior intensidade.

Figura 1. Espectro de íons totais (full scan) das biotransformações de Rutina pelo fungo

endofítico Guignardia sp. após 1, 4 e 8 dias de incubação da molécula no meio.

A

B

C

Após 1 dia

Após 4 dias

Após 8 dias

238

A análise de Componentes Principais (PCA) da biotransformação de Rutina pelo

fungo endofítico Guignardia (Figura 2), foi calculado através da variação de 54 variáveis,

correspondendo aos 54 íons registrados, sendo a ligação média dos seis primeiros

componentes principais, cuja variação acumulada representa 99,86 %.

Figura 2. ACP (Análise dos Componentes Principais) da dispersão dos íons de grupos das

variáveis.

Considerando a importância de se estudar fontes naturais de inibidores de formação

de produtos glicados e como também que a rutina é descrita como um anti-glicante natural,

podendo agir nas fases iniciais e tardias da glicação competindo por aminogrupos,

atenuando a glicoxidação e/ou estresse oxidativo pelo sequestro de radicais livres (Barbosa

et al., 2008), foi observado que algumas das réplicas biológicas nos ensaios apresentaram

A B

C

239

maior atividade anti-glicante, quando comparadas com outros ensaios envolvendo outros

fungos endofíticos (Figura 3) e em testes envolvendo diferentes extratos de réplicas

biológicas de amostras biotransformadas após 15 dias de cultivo (Figura 4).

Figura 3. Formação de produtos glicados de biotransformações de rutina por ascomicetos

endofiticos isolados de M. paniculata.

Figura 4. Formação de produtos glicados de biotransformações de rutina, utilizando

Guignardia sp., com maior atividade anti-glicante (Bt= biotransformação).

Conclusões

Ocorreu o metabolismo da molécula de rutina pelo ascomiceto endofítico

Guignardia sp., considerando o seu desaparecimento durante a biotransformação, em até

dois dias, visualizado nas análises de LC-MS.

A análise por CG-MS indicou que a rutina não estava presente no micélio e

portanto, há mais uma indicação de sua biotransformação.

Os produtos da biotrasnformação foram capazes de inibir a reação da frutose com a

albumina, como produtos de glicação.

05

1015202530

Form

ação

de

Pro

du

tos

Glic

ado

s %

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

Bt 1a Bt 1b Bt 2a Bt 2b Bt 3a Bt 3b Rutina

Form

ação

de

Pro

du

tos

Glic

ado

s %

240

Agradecimentos

À CAPES, (Pró-Amazônia), FAPEAM e Bionorte pelo incentivo e financiamentos. À

Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela infraestrutura ee condições de trabalho.

Referências

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242



Rizobactérias de solos amazônicos com habilidade de degradar gasolina obtida da

Refinaria de Manaus (REMAN)

Oliveira FR1; Moreira, FW

1, Oliveira LA

1

1Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA. E-mail: [email protected],


Resumo

A contaminação ambiental por derivados do petróleo, como a gasolina, diesel e entre

outros, causa grande impacto ecológico e as técnicas para sua remediação têm recebido

destaque nas últimas décadas. O presente trabalho teve como objetivo testar isolados de

rizobactérias com habilidade em degradar gasolina. Foi utilizado o método de estriagem

em placa, contendo meio de cultura YMA modificado com 0,1 mL de gasolina como fonte

de carbono. Em seguida foi verificada a capacidade dos microrganismos em tolerar e

degradar esse composto, avaliando seu crescimento em meio contendo 0,1 mL de gasolina

na superfície da placa de Petri. Os resultados mostraram que os isolados testados foram

capazes de crescer e usar a gasolina como fonte de carbono. Do total de 90 rizobactérias

avaliadas, 12 cresceram bem usando a gasolina como fonte de carbono, pois apresentaram

um crescimento elevado na presença desse combustível no meio sólido, sendo elas,

INPA_R561, R586, R589, R610, R614, R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732.

Das demais, 41 mostraram crescimento moderado e as outras 37 tiveram dificuldades de

crescer nesse meio.

Palavras-chave: Biorremediação, rizobactérias, tolerância à gasolina.

Introdução

O petróleo é um composto orgânico, formado por processos biogeoquímicos,

constituído em sua maior parte por uma mistura complexa de hidrocarbonetos. A

contaminação ambiental por esta substância e por seus derivados (gasolina, álcool, diesel,

etc.) causa grande impacto ecológico e as técnicas para sua remediação têm recebido

destaque nas últimas décadas. A maior parte dos compostos de petróleo é passível de

biodegradação; no entanto, trata-se de um processo lento, podendo levar décadas até a total

descontaminação do ambiente.


243

A comercialização da gasolina tem como consequências negativas a possibilidade

de derramamento nos solos e águas regionais. Não há ainda no Estado do Amazonas,

estudos sobre o impacto negativo da contaminação dos solos e rios por esse composto

químico, bem como as características da população microbiana tolerante e possivelmente

responsável pelo processo de biorremediação natural.

Os processos biológicos de descontaminação, enquadrados na categoria de

biorremediação, utilizam, geralmente, microrganismos autóctones ou introduzidos com

capacidade de biodegradar, resultando em produtos de degradação com estruturas menos

recalcitrantes em relação à molécula original. A biorremediação é uma tecnologia que

utiliza microrganismos para minimizar ou remover poluentes, assim como os

hidrocarbonetos dos compostos derivados do petróleo no ambiente sem afetar o equilíbrio

ecológico (Autry e Ellis, 1992; Desai e Banat, 1997; Oliveira et al., 2017).

Rizobactérias tem se mostrado capazes de degradar o petróleo e o óleo diesel (Brito

et al., 2015, 2017a,b; Oliveira et al., 2017) e por serem não patogênicas ao homem, plantas

e outros animais, são uma fonte segura de microrganismos. Desse modo, elas podem

também, degradar componentes mais simples como a gasolina. O presente trabalho teve

como objetivo, avaliar a capacidade de 90 rizobactérias em degradarem a gasolina visando,

portanto, indicar as com maiores potenciais de degradação desse produto para serem

utilizados no processo de biorremediação de solos e/ou rios contaminados.

Material e Métodos

Os isolados de rizobactérias foram obtidos do banco de microrganismos do

LEBMAM (Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Microrganismos da Amazônia) no

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA. Cada isolado foi inoculado em

placas de Petri contendo meio de cultura YMA (10g manitol, 0,5 g K2HPO4, 0,2g MgSO4,

0,1g NaCl, 0,5g extrato de levedura, 15g ágar em 1 L de água destilada) (Vincent, 1970) e

incubados a 26,5º- 28º C até o crescimento das colônias (por cerca de 3 dias) para

posteriores estudos e análises com gasolina. O meio de cultivo YMA é historicamente

utilizado para o isolamento, purificação e crescimento de bactérias indutoras de nódulos

em leguminosas, genericamente denominadas de rizóbios. As bactérias utilizadas foram

isoladas dos nódulos das raízes de plantas e de solos da rizosfera coletados em diferentes

localidades de Manaus/AM e municípios circunvizinhos.

Para avaliar a capacidade de degradação da gasolina e o crescimento bacteriano,

foram testados 90 isolados de rizobactérias por meio do método proposto por Oliveira e

244

Meio Agar-Manitol Meio Agar-Gasolina

Magalhães (1999), realizado em placas de Petri contendo meio de cultura YMA

modificado, onde foram utilizados 0,1 mL de gasolina como fonte de carbono ao invés de

manitol, colocados na superfície do meio após sua solidificação nas placas de Petri. Como

controle usou-se o meio sem gasolina e os testes foram realizados em quadruplicata. As

avaliações foram feitas após 10 dias de crescimento à temperatura ambiente (± 26 ºC). O

processo de avaliação consistiu na atribuição de notas de 1,00 (sem crescimento visível) a

4,00 (máximo crescimento). Foram também atribuídas notas intermediárias, subdivididas

em 0,25, ou seja, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75, 2,00 até 4,00. Consideraram-se como as de

melhores crescimentos, as que apresentaram notas médias acima de 3,06.


Na figura 1 observa-se a nota 4 de crescimento bacteriano, indicando uma

rizobactéria (INPA_R586) com crescimento elevado usando o manitol e a gasolina como

fontes de carbono.

Figura 1. Método segundo Oliveira e Magalhães, 1999 (em duplicata). Bactéria

INPA_R586 cultivada em meio Agar-Manitol e Agar-Gasolina por um período de 10 dias

em temperatura ambiente usando o método de Oliveira e Magalhães (1999).

Conforme o método proposto por Oliveira e Magalhães (1999), foi observado que

todos os isolados avaliados apresentaram crescimento no meio de cultura YMA

modificado, adicionado com 0,1 mL de gasolina, uma vez que a menor nota observada foi

1,13, indicando pouco crescimento na zona 1 de crescimento na placa de Petri (Tabela 1).

Do total de 90 isolados bacterianos avaliados, 12 cresceram bem usando a gasolina

como fonte de carbono, pois apresentaram um crescimento elevado na presença desse

combustível no meio sólido (notas acima de 3,06), sendo eles INPA_R561, R586, R589,

R610, R614, R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732. Dos demais isolados, 41

245

mostraram crescimento moderado (notas 2,06 - 3,00) e os outros 37 tiveram dificuldades

de crescer nesse meio (notas 1,13 - 2,00) (Tabela 1).

Observa-se (Tabela 1), que houve pouca diferença em relação ao crescimento dos

isolados nos dois meios utlizados (Agar-Manitol e Agar-Gasolina), uma vez que as

bactérias que cresceram bem em manitol também mostraram bom crescimento no meio

contendo gasolina e, as que tiveram dificuldades para usarem o manitol também

apresentaram baixos crescimentos no meio com manitol, sem excessão para as 90

rizobactérias.

A gasolina é um dos principais produtos resultantes da destilação do petróleo,

podendo apresentar de 6-12 átomos de carbono em sua cadeia (Farias, 2008);. É um

composto complexo e que pode servir como fonte utilizável no metabolismo de

determinados microrganismos. Esses podem ser utilizados por meio do uso de suas

enzimas capazes de degradar essa substância presente em solos ou outros ambientes

contaminados.

Ecologicamente, microrganismos degradadores de hidrocarbonetos são amplamente

distribuídos e as dificuldades encontradas para caracterizar comunidades microbianas de

ambientes impactados por esses compostos são agravadas pela grande quantidade de

substratos específicos e interações metabólicas possíveis (Wetler-Tonini et al., 2011). Tais

microrganismos podem ser encontrados no próprio ambiente impactado, sendo na sua

maioria, os responsáveis pelo desaparecimento dos contaminantes e são capazes de

degradar a maioria desses compostos para suprir as suas necessidades energéticas e de

crescimento, iniciando assim o processo de biodegradação (Bernoth et al,. 2000). Alguns

trabalhos foram realizados utilizando isolados de rizóbios na degradação de compostos

derivados do petróleo (Lindström et al. 2003; Poonthrigpun et al. 2006; Coelho et al. 2010;

Wen et al. 2011; Brito et al., 2015, 2017 a,b).

A grande motivação de pesquisas e estudos de biodegradação é, sem dúvida, a busca de

microrganismos versáteis capazes de degradar, de maneira eficiente, uma grande variedade

de poluentes a baixo custo operacional, utilizando aqueles que não prejudiquem a vida

existente nas áreas contaminadas. Entre as rizobactérias de interesse, o gênero Rhizobium

apresenta características adequadas para ser utilizado num processo de biorremediação,

pois além de apresentar todas as características citadas, não são patogênicas, não

prejudicando assim o homem, a fauna e a flora existentes no meio ambiente.

246

Tabela 1. Crescimento dos isolados de rizobactérias em meio Agar-manitol (M) e Agar-

gasolina (G) após 10 dias de incubação à temperatura ambiente (Notas segundo Oliveira e

Magalhães, 1999).

Com base nos resultados obtidos, foi possível constatar que todas as rizobactérias

testadas apresentaram crescimento no meio contendo gasolina, sendo que 12 se

Isolados M G Isolados M G Isolados M G

INPA R007 1,3 1,3 INPA R571 2,0 2,0 INPA R621 3,8 3,4






























247

sobressaíram em relação às demais. Há, entretanto, necessidade de uma busca de um maior

número de isolados e testes mais aprofundados para avaliar a eficiência enzimática dessas

bactérias, como forma de indicar as mais aptas para serem utilizadas no processo de

biorremediação de solos e rios amazônicos contaminados.

Conclusões

Do total de 90 isolados de rizobacterias, apenas doze mostraram-se altamente

capazes de degradarem a gasolina, sendo eles, INPA_R561, R586, R589, R610, R614,

R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732.

Dos demais isolados, 41 mostraram crescimento moderado e os outros 37 tiveram

dificuldades de crescer no meio contendo gasolina.

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petroleum hidrocarbon-contaminated soil. Environmental Progress, 11 (4):318-323.

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249


Rhizobactérias de solos amazônicos com habilidade para degradar óleo

diesel

Oliveira, K.K.C.1; Moreira, F.W.

2; Oliveira, L.A.

2

1PPG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas;

2Pesquisador, Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia. E-mails: [email protected], [email protected],

[email protected]

Resumo

O óleo é um combustível derivado do petróleo sendo constituído basicamente

por hidrocarbonetos. A contaminação de solos por este combustível tem aumentado devido

a acidentes causados durante o seu transporte e armazenamento. Por isso, é necessária a

aplicação de técnicas para descontaminação de ambientes poluídos. Assim, o objetivo

deste trabalho foi avaliar o crescimento e tolerância de rizobactérias de solos da Amazônia

na presença de óleo diesel. Foi utilizado o método de estriagem em placas contendo óleo

diesel como fonte de carbono. A avaliação consistiu na avaliação de crescimento e

atribuição de notas, classificando as bactérias como baixo, moderado ou alto crescimento.

Os resultados mostraram que a maior parte dos isolados testados. A maior parte das

rizobactérias testadas mostrou-se tolerante à presença de óleo diesel no meio de cultivo,

além de utilizá-lo como fonte de carbono para seu crescimento. Do total de 81

rizobactérias, dez apresentaram baixo crescimento, oito moderado e, 63 alto crescimento

em meio com óleo diesel. Destas últimas, INPA_R28, R76, R233, R517, R555, R557,

R560, R569, R572, R575, R577, R578, R586, R602, R613, R626, R627, R633, R648,

R649, R654, R655, R657, R668, R674 e R676, mostraram crescimento elevado no 3º dia

de incubação no meio com óleo diesel e poderão então, ser submetidas a novos testes

visando uma futura utilização na biorremediação de solos contaminados com esse óleo.

Palavras-chave: Rizobactérias, biorremediação, Amazônia.

Introdução

O óleo diesel é proveniente do processo de refinamento do petróleo cru, via

destilação fracionada. É uma mistura complexa composta principalmente por alcanos de

cadeia linear, mas também possui hidrocarbonetos de cadeia ramificada e compostos

aromáticos (Knothe, 2010). Estes, por sua vez, são moléculas que possuem átomos de

carbono e hidrogênio, podendo também ser encontrados enxofre, nitrogênio e oxigênio em

menores quantidades (Bento, 2005).

250

A intensificação na exploração do petróleo como fonte de energia gera um aumento

dos riscos de contaminação ambiental ligado às etapas de extração, refino, transporte,

armazenamento e distribuição deste e de seus derivados, como o óleo diesel (Das e

Chandran, 2011).

Como uma das estratégias para recuperar e minimizar estes impactos destaca-se a

biorremediação, que pode ser definida como uma tecnologia para o tratamento de áreas

contaminadas através do uso de agentes biológicos capazes de modificar ou decompor

determinados poluentes. Este é um processo realizado por meio da adição de

microrganismos nativos ou exógenos, cujo maior benefício é a mineralização do poluente,

levando por fim à formação de CO2, H2O e biomassa (Schneider, 1990; Prince, 1996).

Além disso, seu conjunto de tecnologias é compatível com as rotas biogeoquímicas

naturais de reciclagem de nutrientes (El Fantroussi e Agathos, 2005).

A biodegradação de hidrocarbonetos por população natural de microrganismos é

uma prática usada em diversas regiões do planeta. Para comprovar esta capacidade, foram

realizadas diversas pesquisas usando bactérias e fungos degradadores de petróleo, gasolina

e óleo diesel (Saratale et al., 2007; Souza, 2009; Zanaroli et al., 2010; Brito et al., 2015;

2017a,b; Oliveira et al., 2017). Os microrganismos são os seres vivos preferenciais para

desempenhar essa função devido à sua natureza ubíqua, sua ampla diversidade genética e

catalítica e capacidade de atuação sob condições ambientais extremas. Estas e outras

características têm levado a busca pela compreensão de suas rotas biogeoquímicas de

degradação, caracterização genética e ao desenvolvimento de metodologias para aplicação

desses organismos em campo (Megharaj et al., 2011; Moraes e Tornisielo, 2009).

Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de rizobactérias

usarem o óleo diesel para seus crescimentos em meio de cultivo, visando selecionar as

mais aptas para serem utilizadas no processo de biorremediação de solos contaminados

com este hidrocarboneto.

Material e Métodos

Foram selecionadas 81 rizobactérias do banco de microrganismos do LEBMAM

(Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Microrganismos da Amazônia) do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA. Estas foram reativadas em meio Yeast

Manitol Ágar (YMA) (Vincent, 1970) e incubadas à temperatura ambiente por três dias.

251

Para avaliar a capacidade de degradação de óleo diesel e o crescimento bacteriano,

as rizobactérias foram testadas pelo método de riscagem de Oliveira e Magalhães (1999)

modificado, sendo inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura YA, utilizando-

se 0,1 mL de óleo diesel como fonte de carbono. Como controle utilizou-se o meio de

cultura YMA. Esse teste foi realizado em quadruplicata. As avaliações foram feitas a cada

três dias, no período total de 15 dias, no qual as bactérias foram mantidas em laboratório à

temperatura ambiente. De acordo com o desenvolvimento das colônias nas quatro zonas da

placa (Figura 1), foram atribuídos valores para o crescimento de cada microrganismo

variando de 1 (sem crescimento visível na placa) a 4 (máximo crescimento em todas as

zonas), segundo escala apresentada na Figura 2. Com base no crescimento em placas de

Petri, os isolados foram classificados como pouco, moderado ou elevado crescimento

(Tabela 1). Esta análise foi feita ao 6º dia de incubação e serviu para identificar os isolados

com maior potencial a serem utilizados em testes posteriores.

Figura 1. Esquema ilustrando o método de riscagem para avaliação

do crescimento de bactérias (Oliveira e Magalhães, 1999).

Figura 2 - Valores atribuídos de acordo com o crescimento

bacteriano (Oliveira e Magalhães, 1999).

252

Tabela 1. Faixa de pontuação para avaliação do

crescimento bacteriano (Oliveira e Magalhães,

1999).

Crescimento Pontuação

Pouco 1,00 - 2,00

Moderado 2,06 – 3,00

Elevado 3,06 – 4,00


Todas as rizobactérias testadas neste trabalho foram capazes de crescer em meio de

cultura YA acrescido de óleo diesel (Figura 3, Tabela 2), adaptando-se a este

hidrocarboneto e usando-o como fonte de carbono. Entretanto, é necessária a execução de

novos testes para verificar o potencial destas bactérias para serem utilizadas em processos

de biorremediação.

Figura 3. Crescimento de rizobactéria em meio com óleo diesel após três dias de incubação

A fim de demonstrar o potencial de bactérias na biorremediação de óleo diesel,

vários trabalhos têm sido realizados. Souza (2009) realizou testes de biodegradação de óleo

diesel em água do mar utilizando um isolado de Candida lipolytica, obtendo resultados

positivos. Este autor concluiu que este microrganismo tem potencial para ser utilizado em

processos de biorremediação de ambientes marinhos contaminados por óleo diesel e outros

derivados de petróleo. Silva (2012) isolou microrganismos de amostras poluídas por

A

253

derivados de petróleo, a partir dos quais formou consórcios, testando sua eficiência em

biodegradar óleo diesel. Os microrganismos com maiores potencialidades para esta

finalidade e que não desenvolveram atividade antagônica foram Staphylococcus

saprophyticus, Serratia marcescens, Rhodotorula aurantiaca e Candida ernobii.

Na tabela 2 pode-se observar o crescimento das rizobactérias utilizando as duas

fontes de carbono (óleo diesel e manitol), notando-se diferenças com relação aos tempos de

crescimento. Isso sugere que, além da velocidade de crescimento natural de cada

rizobactéria, cada uma possui um tempo de adaptação às condições impostas pela fonte de

carbono no meio.

Dentre os isolados analisados, cinco (6,17%) apresentaram baixo crescimento, 11

(13,58%) moderado e 65 (80,2%) alto crescimento no 6º dia de incubação em meio YMA

(controle). Em meio com óleo diesel, dez (12,3%) apresentaram baixo crescimento, oito

(9,9%) moderado e 63 (77,8%) alto crescimento. Assim, observa-se que praticamente o

mesmo número de bactérias que tiveram crescimento moderado e alto em YMA (76) foi

capaz de se adaptar e crescer em meio contendo óleo diesel (71) como fonte de carbono.

As rizobactérias com melhor crescimento em meio YA com óleo diesel foram

INPA_R28, R76, R233, R517, R555, R557, R560, R569, R572, R575, R577, R578, R586,

R602, R613, R626, R627, R633, R648, R649, R654, R655, R657, R668, R674 e R676,

todas com notas que variaram de 3,06 a 4,00 no 3º dia de incubação. Estas bactérias

poderão então ser submetidas a novos testes para futura utilização na biorremediação de

solos contaminados com óleo diesel.

Conclusões

A maior parte das rizobactérias testadas mostrou-se tolerante à presença de óleo

diesel no meio de cultivo, além de utilizá-lo como fonte de carbono para seu crescimento.

As rizobactérias mostraram poucas diferenças quando comparadas ao meio de

cultivo contendo manitol como fonte de carbono.

As 26 rizobactérias que apresentaram crescimentos superiores a 3,0 aos três dias de

avaliação nas placas de Petri são as mais promissoras para futuros testes visando indicar

como inoculantes para biorremediar solos contaminados com óleo diesel.

254

Agradecimentos

Ao INPA pelo apoio de infraestrutura e, ao CNPq, FINEP e FAPEAM pelos recursos

financeiros. À FINEP pela bolsa de pesquisa dada à primeira autora do trabalho.

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256

Isolado 3º dia 6º dia 9º dia 12º dia 15º dia

Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel

INPA_R1 2,31 1,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R7 2,06 2,18 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R20 2,00 1,00 2,25 1,00 2,25 1,00 2,25 1,06 2,25 1,06

INPA_R21 1,75 1,31 3,62 3,12 3,75 3,37 3,75 3,37 3,75 3,56

INPA_R26 2,87 2,81 3,37 3,19 3,37 3,19 3,50 3,19 3,50 3,19

INPA_R28 3,62 3,75 3,62 3,81 3,62 3,81 3,62 3,81 3,62 3,94

INPA_R76 3,75 3,37 3,75 3,56 3,75 3,56 3,75 3,56 3,75 3,56

INPA_R178 3,12 2,19 3,75 2,44 3,75 2,75 3,75 2,81 3,75 2,87

INPA_183 1,00 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R233 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R505 2,75 2,81 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R517 4,00 3,56 4,00 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R529 2,19 2,00 2,75 3,19 2,75 3,75 3,06 3,75 3,06 3,75

INPA_R532 2,62 1,37 3,87 2,75 4,00 3,37 4,00 3,37 4,00 3,50

INPA_R546 1,12 1,00 1,62 1,50 3,00 2,69 3,62 3,87 3,87 3,87

INPA_R547 1,25 1,37 2,62 2,31 3,19 4,00 3,19 4,00 3,31 4,00

INPA_R548 1,25 2,37 1,62 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R549 1,31 1,06 3,75 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R550 1,06 1,00 2,25 1,50 3,25 3,44 3,25 3,50 3,25 3,50

INPA_R551 1,00 1,00 3,37 4,00 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R552 2,00 2,12 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R553 1,50 1,00 3,56 2,31 3,87 4,00 3,87 4,00 3,87 4,00

INPA_R555 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R556 1,00 1,25 2,37 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00

INPA_R557 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R560 2,37 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

Tabela 2. Crescimento de rizobactérias em meio sólido utilizando manitol e óleo diesel como fontes de carbono

257



INPA_R561 3,44 3,00 4,00 3,56 4,00 3,81 4,00 3,87 4,00 3,87

INPA_R562 1,00 1,00 2,25 1,44 2,94 3,81 3,19 4,00 3,37 4,00

INPA_R564 3,37 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R566 1,00 1,00 3,81 3,19 4,00 3,75 4,00 3,87 4,00 3,87

INPA_R568 2,12 2,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R569 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R572 3,37 3,50 3,50 3,62 3,62 3,75 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R575 2,00 3,25 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R576 1,00 1,00 3,93 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R577 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R578 2,12 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R580 1,25 1,00 3,25 2,12 3,81 3,87 3,81 3,87 4,00 4,00

INPA_R581 1,00 1,00 3,50 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R582 1,00 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R583 2,44 3,00 3,94 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R586 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R588 1,00 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R589 1,37 1,00 1,87 1,75 2,62 2,00 3,87 2,37 3,87 2,50

INPA_R590 1,87 1,00 3,06 2,12 3,37 3,87 3,37 3,87 3,37 3,87

INPA_R592 1,50 1,25 2,31 3,62 4,00 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R593 2,06 2,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R595 2,00 2,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R602 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R610 2,19 1,19 4,00 2,00 4,00 3,81 4,00 3,87 4,00 3,87

INPA_R613 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R614 3,37 3,00 3,75 3,94 3,94 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

258



INPA_R615 1,19 1,00 2,87 1,44 3,56 4,00 3,56 4,00 3,69 4,00

INPA_R618 3,25 3,00 3,87 3,12 4,00 3,31 4,00 3,50 4,00 3,50

INPA_R620 3,56 2,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R621 2,25 2,75 3,00 3,44 3,25 3,81 3,75 3,87 3,87 4,00

INPA_R624 1,00 1,00 3,50 4,00 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R626 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R627 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R630 3,00 2,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R631 2,00 2,25 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R633 2,12 3,12 3,56 4,00 3,81 4,00 3,81 4,00 3,81 4,00

INPA_R634 1,81 1,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R640 1,75 1,00 2,25 1,00 3,00 2,69 3,62 3,25 4,00 3,44

INPA_R642 1,00 1,12 2,00 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00

INPA_R644 1,00 1,00 3,81 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R645 1,00 1,06 3,44 3,94 3,75 3,94 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R648 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R649 3,12 3,19 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R651 1,06 1,00 4,00 3,56 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R652 1,06 1,00 3,50 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R654 1,25 3,50 1,25 3,62 2,06 3,75 2,06 3,75 2,06 3,75

INPA_R655 4,00 3,25 4,00 3,62 4,00 3,94 4,00 3,94 4,00 3,94

INPA_R657 3,00 3,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R662 1,25 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA_R668 3,31 3,06 4,00 3,50 4,00 3,56 4,00 3,69 4,00 3,75

INPA_R674 3,25 3,44 3,62 3,87 3,69 4,00 3,75 4,00 3,75 4,00

INPA_R676 4,00 3,75 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

259

Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C., Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L.

Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA

Uso de resíduos de abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora

edulis) para a produção de bioplásticos por bactérias.

Oliveira R. C.1, Santos J. P.

1, Santos S. F.

2, Mota A. J.

3

1 Graduação em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Amazonas – UFAM,

2

Graduação em Ciências Biológicas, Centro Universitário do Norte – UNINORTE, 3

Professsor,

Universidade Federal do Amazonas - UFAM. Emails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

Resumo

Os polihidroxialcanoatos (PHAs), biopolímeros armazenados por bactérias como fontes de

carbono, são alternativas viáveis aos polímeros petroquímicos, usados como matéria-prima

para os plásticos convencionais, porque possuem propriedades termoplásticas semelhantes,

porém são biodegradáveis. Contudo, o alto custo dos substratos para a sua produção é um

fator limitante. Por outro lado, o descarte inadequado de resíduos de alimentos,

provenientes de empresas alimentícias, gera impactos socioambientais, além do

desperdício energético, uma vez que esses resíduos são fontes ricas de carbono. No intuito

de solucionar os problemas com o descarte inapropriado de resíduos, e diminuir os custos

da produção de PHA, é proposto nesse trabalho um processo de reaproveitamento dos

resíduos agroindustriais, provenientes das empresas de alimentos de Manaus-AM, como

fonte de carbono para produção de PHA. Foram testadas diversas formulações de meio de

cultivo acrescido de resíduos de abacaxi e maracujá e o acúmulo de PHA foi monitorado

pelo corante vermelho do nilo. Os meios adaptados com resíduos de abacaxi e maracujá

apresentaram grande potencial para a produção de PHA, sobretudo o meio de abacaxi na

concentração de 2% (m/v).

Palavras-chave: biopolímero, polihidroxialcanoatos, resíduos de alimentos.

Introdução

A humanidade sempre busca tecnologias que ofereçam conforto às pessoas, em

geral, explorando os recursos naturais do planeta. Porém, muitas vezes esses recursos não

são aproveitados integralmente e geram mais resíduos sólidos para o meio ambiente. Nesse

contexto, esses resíduos devem ser considerados matérias-primas para a produção de novos

produtos naturais, evitando a exploração massiva dos recursos naturais e reduzir a

produção de resíduos sólidos (Andreoli et al., 2013).

260

Com o desenvolvimento de países emergentes como o Brasil, a produção de

resíduos sólidos orgânicos tem aumentado, o que tem sido responsável pela contaminação

de solos e águas superficiais e subterrâneas em áreas próximas a aterros sanitários (Herbets

et al. 2005). Além disso, esses resíduos geram “chorume”, líquidos percolados que causam

mau cheiro e atraem animais vetores de doenças (Portal Educação 2013). As indústrias de

alimentos contribuem majoritariamente na produção desses resíduos, sendo evidente a

necessidade de aproveitar e transformar essa matéria-prima rica em carbono.

Polihidroxialcanoatos são polímeros naturais sintetizados e acumulados na forma

de inclusões celulares por uma grande quantidade de bactérias, podendo representar cerca

de 80% da massa seca da célula. Esses biopolímeros armazenam energia, e ainda são

fontes de carbono para o anabolismo microbiano. (Figueiredo et al., 2014, Rodrigues,

2005, Kessler e Withoult, 2001). Os PHAs são produzidos na presença de fonte de carbono

abundante e carência de nutrientes essenciais para o crescimento celular como: nitrogênio,

oxigênio, enxofre, fósforo, magnésio entre outros.

Estes biopolímeros tem despertado interesse biotecnológico, pois os mesmos

apresentam características físicas, químicas e termoplásticas muito semelhantes as dos

polímeros de natureza petroquímica (ex: polipropileno) (Bucci, 2003) que são largamente

utilizados em todos os setores das indústrias em geral, e que se acumulam densamente nos

lixos urbanos, pois o tempo de decomposição é excessivamente longo. Em contraste, os

PHAs são completamente biodegradáveis na presença de micro-organismos, em condições

aeróbicas e anaeróbicas (Lavorato, 2008), pois são substratos que as bactérias metabolizam

em busca de carbono e energia.

Em contrapartida, a produção em escala industrial desses biopolímeros ainda é

modesta, devido ao alto custo da biomassa necessária para sua produção (glicose e

sacarose). Frente ao custo na síntese de polímeros a base de petróleo, a produção de PHA

fica para segundo plano. Uma alternativa para a solução desse problema seria reduzir o

custo dos meios de cultivo microbiano, o que podem representar até 40% de economia no

processo de produção de PHA (Figueiredo et al., 2014)

Como a grande problemática de inserir este biopolímero nas indústrias está no alto

custo da matéria-prima, e concomitantemente existe um cenário de desperdício de matéria

orgânica associado à danos ambientais, pretende-se utilizar resíduos ricos em carbono

derivados das indústrias como o abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis)

para síntese microbiana de PHA, o que poderá contribuir para uma melhor relação

261

custo/benefício, favorecendo o crescimento desse mercado, e ainda, beneficiando a política

de uso sustentável dos recursos naturais.

Material e Métodos

As bactérias utilizadas no presente trabalho foram acessadas da coleção do

Laboratório de Biotecnologia da UFAM. As linhagem foram isoladas de diferentes

microambientes do Rio Negro. Estas bactérias foram testadas quanto à capacidade de

acumular PHA através do teste em placa com Vermelho do Nilo (Spiekerman, 1999).

Foram utilizadas 5 linhagens de bactérias: MM1.2.10-8, 2SAT1bLB, 7RP1T3LB,

MagLB e 1423. Os isolados MM1.2.10-8 e 2SAT1bLB foram coletadas no Rio Negro e

são produtoras de biopolímero. Os isolados 7RP1T3LB e MagLB também foram coletados

no Rio Negro, porém não produzem PHA e foram usados nesse trabalho como controle

negativo. O controle positivo foi realizado com a linhagem ICB/USP 1423 de Ralstonia

eutropha (cortesia do Prof. Beny Spira, ICB/USP), que acumula PHA em até 80% da sua

massa seca (Rodrigues, 2005).

O meio sintético TGP (Tris, Glicose, Fosfato), que induz a produção de PHA, foi

usado em todas as etapas do trabalho. Consiste de um meio mínimo que possui minerais

essenciais para crescimento microbiano em concentrações baixas: [4,67 g/L de NaCl; 1,49

g/L de KCl; 1,32 g/L de NH4Cl; 14,53 g/L de Tris; 0,54 g/L de KH2PO4; 17 g/L de Ágar;

0,199 g/L de MgCl2; 0,28 g/L de Na2SO4; 0,022 g/L de CaCl2; 20 g/L de Dextrose, 0,6 mL

de 1M FeCl2; 1 mL de 1M Zn2SO4; 1 mL de Elemento Traço [0.22 g/L CoCl2·6H2O, 9.70

g/L FeCl3, 7.80 g/L CaCl2, 0.12 g/L NiCl2·6H2O, 0.11 g/L CrCl3·6H2O, e 0.16 g/L

CuSO4·5H2O]] (Numata e Doi, 2012). Para indicar a produção e acúmulo de PHA foi

acrescido ao TGP, o corante vermelho do Nilo na concentração de 0,5 μg/L; o complexo

corante PHA emite um brilho rosa/lilás característico quando excitado por luz UV. Quanto

maior for o brilho, maior é a capacidade do microrganismo em produzir o biopolímero

(Spiekerman, 1999).

Com o objetivo de se obter um um extrato rico em fonte de carbono solúvel, açúcares,

os resíduos de abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis) foram triturados

em liquidificador industrial com 250 mL água destilada nas concentrações de 10%, 6% e

2% (m/v) para abacaxi e 3%, 2% e 1% (m/v) para maracujá, com posterior filtração em

toucas do tipo turbante. O ajuste na concentração para o extrato de maracujá foi necessário

porque o resíduo é muito higroscópico, o que impedia o processo de filtração em

262

concentrações maiores. O tempo de extração foi de 20s. Após obtidos os extratos

(aproximadamente 200 mL), foi adicionado ágar para concentração final de 1,7% (m/v),

0,5 μg/L de Vermelho do Nilo. O pH foi ajustado para 7,3 e o meio foi esterilizado a 121º

C por 15 min em autoclave. As bactérias foram semeadas sobre o meio solidificado, e as

placas foram incubadas em estufa a 30 ºC durante 72h. O teste foi realizado em triplicata e

o acúmulo de PHA foi avaliado com auxílio de transluminador UV (λ 354 nM). As

bactérias também foram inoculadas no meio sintético TGP para efeitos de comparação.


Os ensaios com os meios de cultura modificados, i. e., suplementados com resíduos

de abacaxi e maracujá apresentaram resultados semelhantes àqueles obtidos com TGP, pois

o brilho caracterísito do complexo vermelho do Nilo PHA foi observado apenas nos

isolados produtores (Fig. 1).

Figura 1. Placa de Petri com 2% de resíduo de abacaxi (Ananas comosus) em 250 mL de

meio. As bactérias 1423(1) e 1423(2) são cepas diferentes da mesma espécie. Mag LB e

7RP1T3LB são as bactérias de controle negativo.

Observou-se maior eficiência do acúmulo de PHA para os extratos obtidos a partir

dos resíduos de abacaxi (Tabela 1), havendo ainda, uma relação entre a concentração de

resíduo e produção de PHA, uma vez que concentrações menores resultaram em brilho

mais intenso (dados não mostrados). Em estudos cinéticos para o crescimento de Ralstonia

eutropha e acúmulo de PHA, Rodrigues (2005) verificou que para a produção de PHA ser

eficiente, a concentração de carbono deve ser mantida em uma quantidade ótima.

1423 (1)

1423

(2)

2SAT1b

MM1.2.10-8

7RP1T3LB

Mag LB

263

Suwannasing et al. (2015) realizaram o teste com o resíduo de abacaxi para produção de

PHA com Bacillus sp. e em seus testes a concentração ótima foi de 3% (v/v) do suco de

resíduo do abacaxi. É preciso encontrar a concentração ótima para os resíduos usados nesse

trabalho, considerando-se o cultivar e os microrganismos empregados.

Tabela 1. Intensidade do brilho em UV para detecção da produção de PHA por bactérias

em meio de cultura com resíduos.

Legenda: +++ : Brilho intenso; ++ : Brilho moderado; + : Brilho discreto; - : Não houve brilho.

A utilização de resíduos da agroindústria como matéria-prima para outros

produtos é uma fronteira que vem sendo desafiada. O presente trabalho apresenta uma

alternativa viável que pode solucionar o problema do descarte inadequado de resíduos

orgânicos das indústrias de alimentos do Amazonas, por empregar tais resíduos na cadeia

produtiva dos biopolímeros. Assim, é possível vislumbrar em um futuro próximo, a

possibilidade de produção de bioplástico cujo valor seja competitivo com os plásticos

petroquímicos. Para que esse produto, ainda sem valor agregado, possa ser de fato utilizado

pelas indústrias de bioplásticos, é necessário realizar mais estudos sobre a cinética de

produção, a caracterização do polímero produzido e verificar condições de suplementação

que ofereçam melhores condições de acúmulo de polihidroxialcanoatos.

Conclusão

Os resíduos de abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis) são

matérias-primas potenciais para a produção de PHA, sobretudo o resíduo de abacaxi, em

formulações com concentrações próximas a 2% (m/v).

Linhagens

Residuo

(concentração do extrato - %)

Abacaxi Maracujá

TGP

10 6 2 3 2 1

MM1.2.10-8

+ ++ +++ - - + ++

2SA1T1b LB + + +++ - - + ++

Mag LB - - - - - - -

7RP1T3LB - - - - - - -

1423 + + +++ + + + ++

264

Referências

Andreoli CV, Andreoli FN, Trindade T V, Hoppen C (2013). Resíduos sólidos: Origem,

Classificação e Soluções para destinação final adequada. Coleção Agrinho. 22p.

Bucci, DZ (2003). Avaliação de embalagens de PHB (poli (ácido 3-hidroxibutírico) para

alimentos. Florianópolis, Brasil. (M.Sc Dissertação, Universidade Federal de Santa

Catarina. UFSC). 166p.

Figueiredo TVB, Campos M I, Sousa L S, Silva J R da, Druzian J I (2014). Produção e

caracterização de polihidroxialcanoatos obtidos por fermentação da glicerina bruta residual

do biodiesel. Quim. Nova 30:1111-1117.

Herbets RA, Coelho CDA, Miletti LC, Mendonça M D (2005). Compostagem de resíduos

sólidos orgânicos: aspectos biotecnológicos. Revista Saúde e Ambiente 6:41-50

Kessler B, Witholt B (2001). Factors involved in the regulatory network of

polyhydroxyalkanoate metabolism. Journal of biotechnology 86:97-104.

Lavorato, GC (2008). Prospecção de microrganismos produtores de polihidroxialcanoatos

(PHAs) com ênfase em Chromobacterium violaceum, isolados do Parque Nacional da

Serra do Cipó (MG). Belo Horizonte, Brasil. (M.Sc Dissertação, Universidade Federal de

Minas Gerais. UFMG). 79p.

Portal Educação (2013). Resíduos Sólidos Orgânicos. [on line]. Brasil,Disponível em:<

https://www.portaleducacao.com.br/biologia/artigos/50868/residuos-solidos-organicos>.

Acesso em: 05 de nov. 2016.

Rodrigues RC (2005). Condições de cultura para a produção de poli (3- hidroxibutirato)

por Ralstonia eutropha a partir de resíduos de indústrias de alimentos. Florianópolis,

Brasil. (M.Sc Dissertação, Universidade Federal de Santa Catarina. UFSC). 100p.

Spiekermann P, Rehm BH, Kalscheuer R, Baumeister D, Steinbüchel A (1999). A

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Microbiology, 171(2):73-80.

Suwannasing W, Imai T, Kaewkannetra P (2015). Potential utilization of pineapple waste

streams for polyhydroxyalkanoates (PHAs) production via batch fermentation. Journal of

Water and Environment Technology, 13:335-347.

265



Distribuição de mating type e diversidade de Fusarium decemcellulare

isolados de mudas de guaranazeiro em viveiro

Queiroz C.A. de1, Sousa S.B.de

2, Hanada R.E

3, Silva G.F.

4

1;2

PPG em Biotecnologia - Universidade Federal do Amazonas / Embrapa Amazônia Ocidental; 3Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia;

4Pesquisador, Embrapa Amazônia

Ocidental; Email: [email protected]

Resumo

O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis) é uma espécie nativa da região

amazônica de importância econômica devido ao alto teor de cafeínas e outros compostos

bioativos produzidos nas sementes que são utilizadas como matéria-prima para a produção

de bebidas industrializadas. Entre os problemas responsáveis pela baixa produção de

guaraná no Amazonas estão as doenças causadas por fungos, entre elas o superbrotamento

causado por Fusarium decemcellulare, que coloniza tecidos meristemáticos em mudas e

plantas adultas. Visando comparar a distribuição de mating type e diversidade genética, o

patógeno entre mudas obtidas de viveiro e plantas adultas em fase de produção, no

presente trabalho foram analisados 81 dos diferentes sintomas da doença, sendo 64 obtidos

de mudas sintomáticas e 17 de plantas cultivadas no campo. A distribuição de mating type

(Mat-1 e Mat-2) revelou uma significativa diferença na proporção 1/1 nos e entre os fungos

isolados em mudas de viveiro (58 dos 64 isolados pertencem ao Mat-1), em relação aos

isolados em condições de campo, onde a razão entre Mat-1 e Mat-2 foi igual, indicando

uma possível habilidade do patógeno em realizar reprodução sexuada e consequente

aumento da variabilidade genética em ambiente aberto. Os dados de agrupamento com

base em 72 bandas polimórficas obtidas com o marcador ISSR mostraram uma maior

correlação entre os isolados obtidos de mudas conforme o esperado. Contudo, não houve

nenhuma correlação genética entre sintomas e tipo de mating nos grupos formados.

Palavras-chave: Superbrotamento, ISSR, mating type, marcador molecular, reprodução

sexuada

Introdução

O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.) Ducke) é uma espécie

nativa da Amazônia de grande importância econômica para a região. As sementes de

guaraná são ricas em cafeína, flavonoides e taninos, que lhes conferem características

estimulantes e medicinais (Campos et al., 2011). Essas sementes servem de matéria-prima


266

para a produção de bebidas industrializadas, antitérmico, antidiarreico, estimulante,

analgésico e antigripal (Costa et al., 2005).

O principal produtor nacional, até a década de 80, era o município de Maués com

90% da pequena produção brasileira, seguido por outros, como Parintins, Itacoatiara,

Manacapuru e Manaus (Correa et al., 1989). Nessa época, com a ampliação do uso

comercial da semente, vários agricultores do baixo Sul da Bahia, antiga zona cacaueira

iniciou cultivo de guaraná. Em menos de dez anos, com plantios mais novos e produtivos,

a Bahia tornou-se o maior produtor, com 2.800 mil toneladas de sementes anuais, enquanto

o Amazonas passou para a segunda posição, com a produção média de 1.100 toneladas na

safra (IBGE 2014). Atualmente, o sul da Bahia exporta o produto em pó e em grãos para

diversos países, como Estados Unidos, Alemanha, Itália e França (EBDA, 2014). Na Bahia

praticamente não havia problemas de pragas e doenças que causam danos econômicos aos

guaranazeiros, ao contrário do município amazonense de Maués, que com a antracnose em

seu plantio associada com outras doenças como o superbrotamento causado por F.

decemcellulare, atinge órgãos em crescimento ativo como as gemas vegetativas e

apresentam pelo menos três sintomas bem característicos, como o superbrotamento das

gemas vegetativas, hipertrofia floral e galhas no caule (Araujo et al., 2007).

O superbrotamento atinge tecidos meristemáticos e ocorre desde a muda até a

planta adulta, independente, portanto, do estádio fenológico, podendo ocorrer durante todo

o ano. A doença provoca maiores perdas quando atinge os tecidos florais, pois inviabiliza a

produção de frutos.

Quanto ao sistema de reprodução, o F. decemcellulare possue as formas

homotálica e heterotálica. A habilidade de autofecundação dos isolados homotálicos em

comparação com os heterotálicos, não necessitam do encontro de mating types distintos,

que promove, o aumento da diversidade genética da população (Leslie e Summerel, 2006).

Desde a identificação do agente etiológico do superbrotamento em guaranazeiro

na década de 80 por Batista & Bolkan (1982) e os trabalhos epidemiológicos realizados por

Araújo et al. (2007), pouca importância foi dada a este patossistema e questões sobre os

mecanismos moleculares utilizados pelo patógeno no desenvolvimento da doença ainda

são uma incógnita.

Este trabalho teve como foco o estudo da distribuição de mating type e

diversidade genética de isolados de F. decemcellulare obtidos de mudas em viveiro e

análise comparativa com isolados obtidos de plantas adultas em fase de produção, ambos

oriundos da cidade de Manaus, e analise da distribuição de mating type e das correlações

267

genéticas entre os sintomas de hiperplasia de gemas vegetativas, hipertrofia floral ou

galhas no caule por meio do marcador molecular ISSR.

Material e Métodos

A pesquisa foi realizada no laboratório de Biologia Molecular na Embrapa da

Amazônia Ocidental (CPAA) localizada na cidade de Manaus-AM.

O isolamento foi realizado conforme descrito por Batista e Bolkan (1982) a partir

de três diferentes sintomas de superbrotamento (galhas, superbrotamento de gemas e

hipertrofia floral). A partir do isolamento foi realizado o cultivo monospórico. Os isolados

foram obtidos em meio batata-dextrose BD sob agitação de 150 rpm para obtenção de

massa micelial, que foi filtrada e em seguida realizada a extração de DNA utilizando o

protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990). A quantificação de DNA foi mensurada por

meio de espectrofotômetro Nanodrop e em gel de agarose (0,8%).

A verificação de mating types na população de F. decemcellulare foi realizada

com base em dois pares de primers para cada Mating (Tabela 1). As reações de PCR foram

realizadas com um volume final de 20 µL, com 1µL de primers (0,25 µM), tampão 10X

(500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,4; 1% Triton X-100), 1,2 µL MgCl2 (1,5 mM), 0,4

µL dNTP (0,2 mM), 0,05 U/µL Taq polimerase, 20 ng/µL de DNA.

Tabela 1. Lista de primers utilizados para verificação de mating type em F.

decemcellulare

As condições dos ciclos foram: desnaturação inicial de 94 ºC por 03 minutos; 30

ciclos de desnaturação (94 ºC por 30 segundos), anelamento (60 ºC por 01 minuto para os

MATING

TYPE PRIMERS ORIENTAÇÃO SEQUÊNCIA (5’-3’)

N° DE

BASES pb

MAT-1

FDC MAT 1.1.1

Forward

Reverse

ACGCTTTCATGGCTTTTCG

GCCCATTTGTTGCGATTATG

19

20

190

FDC MAT 1.1.3

Forward

Reverse

TGCTTTGACTTCTGGATTCTCA

CCCAAATTCGAGGTCCCTAT

22

20 591

MAT-2

FDC MAT 1.2.1

Forward

Reverse

ATGAGCTCCTTCACTGGCGC

CCATTGCCGTCAAGAGCAAAC

20

21 300

FDC MAT 1.2.3

Forward

Reverse

ACAGTCATGGCTGGAATGCA

CCCACCCCAAATCACCTGAAT

20

21 400

268

primers do mat1 e 62° C por 01 minuto para o primers do mat 2) e extensão (72 ºC – 02

minutos); e extensão final em 70 °C por 10 minutos.

Os isolados foram genotipados com 5 marcadores (Tabela 3) previamente

selecionados da lista de 100 primers de ISSR (UBS set#9). As reações de PCR foram

realizadas em volume de 20µL utilizando 50ng de DNA; tampão 1X com 1,5 mM de

MgCl2; 0,5mM de dNTPs; 1U de Taq DNA Polimerase e 0,25 µM de primer. As

condições de amplificação foram: desnaturação inicial a 94 °C por 3 minutos, 40 ciclos de

desnaturação a 92 ºC por 30 segundos, anelamento por 1 minuto (com temperatura

variando de acordo com cada primer selecionado), síntese a 72 °C por 2 minutos e

extensão final por 10 minutos a 72°C. Os produtos da PCR foram separados em gel de

agarose 1,0% e fotodocumentados para posterior análise do perfil de bandas obtido para

cada isolado.

A dispersão dos isolados de F. decemcellulare, de acordo com os dados de

diversidade dos marcadores ISSR, foi realizada por Análise de Coordenadas Principais

(PCoA), assim como a variação genética entre e dentro de populações pela análise de

variância molecular (AMOVA) foram realizadas usando o GenAlex 6.5 (Peakall e Smouse

2012). Para análise da dissimilaridade foi utilizado o programa DARwin 6 (Perrier e

Jacquemoud-Collet, 2006), utilizando o coeficiente de similaridade de jaccard pelo método

Neighbor-joining.

A estrutura genética da população foi estimada por meio de análise bayesiana

utilizando o programa STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) como proposto por Falush et

al. (2007). Para cada valor de número de populações K (1 a 5), foram feitas vinte

simulações independentes, onde em cada simulação foram feitas 100.000 iterações com um

descarte inicial (burn-in), para evitar distorção dos resultados. O número provável de

populações (K) foi determinado por meio dos valores de ΔK, segundo Evanno et al.

(2005). O limite arbitrário de 80% foi considerado para a inclusão de determinado isolado

de acordo com o número de população determinado pelo valor de K.


Utilizando 64 mudas de guaranazeiro crescidas em viveiro e 17 plantas de

guaranazeiro do campo em fase de produção, obtivemos 81 isolados de F. decemcellulare

(Tabela 2).

269

Tabela 2. Distribuição de mating type dos isolados de F. decemcellulare obtidos de diferentes

sintomas de superbrotamento em guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis)

Sintomas Tecidos: HGV (Hiperplasia gema vegetativa); HF (Hipertrofia floral); G (galha);

ISOLADOS

MATING

TYPE LOCAL DA COLETA ORIGEM DO GENÓTIPO SINTOMAS ISOLADOS

MATING

TYPE

LOCAL DA

COLETA ORIGEM DO GENÓTIPO SINTOMAS

F02 2 EMBRAPA (A100) PLANTA 002 HGV F132 2 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP HGV

F04 1 EMBRAPA (A100) CLONE 003 HGV F133 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP HGV

F06 1 EMBRAPA (A100) CLONE 003 HGV F135 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP HGV

F15 1 EMBRAPA (A100) PLANTA 001 HGV F136 1 VIVEIRO MANAUS 574 BAG G

F85 1 AREA ORGANICA 41 HF F137 1 VIVEIRO MANAUS 575 BAG G

F87 1 AREA ORGANICA 41 HF F138 1 VIVEIRO MANAUS 576 BAG G

F91 2 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A HGV F139 1 VIVEIRO MANAUS 577 BAG G

F92 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A HGV F140 2 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS HF



F95 2 VIVEIRO MANAUS 305 B G F143 2 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS HF

F97 1 VIVEIRO MANAUS 307 B G F145 1 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS

HF


HF


HF

F100 1 VIVEIRO MANAUS 310 B G F148 1 VIVEIRO MANAUS PL 1779 CLONE 217

HF

F101 1 VIVEIRO MANAUS 311 B G F150 1 VIVEIRO MANAUS PL 1779 CLONE 217

HF

F102 1 VIVEIRO MANAUS 312 B G F151 1 VIVEIRO MANAUS BAG 296 E 145 A HGV

F103 1 VIVEIRO MANAUS P382 G F152 1 VIVEIRO MANAUS BAG 296 E 145 A HGV

F104 1 VIVEIRO MANAUS P383 G F155 1 VIVEIRO MANAUS BAG 296 E 145 A HGV

F106 1 VIVEIRO MANAUS P385 G F156 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609

HGV

F107 1 VIVEIRO MANAUS P386 G F157 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 610

HGV

F108 2 VIVEIRO MANAUS P387 G F158 1 VIVEIRO MANAUS P702 G

F109 1 VIVEIRO MANAUS P382 G F159 1 VIVEIRO MANAUS P702 G

F111 1 VIVEIRO MANAUS P384 HF F160 1 VIVEIRO MANAUS P702 G

F112 1 VIVEIRO MANAUS P385

HF F163 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609 G

F113 1 VIVEIRO MANAUS P386

HF F164 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609 G

F114 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F165 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609 G

F115 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F166 1 VIVEIRO MANAUS P 328 G

F116 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F167 1 VIVEIRO MANAUS P 329 G

F117 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F170 1 MANAUS Embrapa HF

F118 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F398 1 MANAUS Embrapa HGV

F119 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F400 1 MANAUS Embrapa HGV

F120 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F401 1 MANAUS Embrapa G

F121 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F402 2 MANAUS Embrapa G

F125 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A G F403 2 MANAUS Embrapa G

F126 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A G F404 2 MANAUS Embrapa G

F127 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A G F406 2 MANAUS Embrapa HGV

F128 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G F407 2 MANAUS Embrapa G

F129 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G F408 2 MANAUS Embrapa G

F130 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G F409 2 MANAUS Embrapa HGV

F131 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G - - - - -

270

A análise do mating type dos 81 isolados não mostrou a ocorrência de

homotálicos e identificou 63 isolados do Mat-1 e 18 Mat-2 (Tabela 2). A distribuição de

mating nos isolados analisados difere da proporção 1/1, contudo, a ocorrência dos dois

mating type na população indica o potencial para a reprodução sexuada na população de F.

decemcellulare em guaranazeiro. Dos 17 isolados de F. decemcellulare do campo, nove

são do Mat 1 e oito do Mat 2, com distribuição similar de 1/1 o que é esperado para

reprodução sexuada. Já dos 64 isolados de viveiro, 58 pertencem ao Mat 1 e apenas 6 ao

Mat 2. Essa diferença na distribuição de mating type se deve provavelmente às condições

limitadas de dispersão do patógeno.

De acordo com MCDonalds e Linde (2002), um fator determinante no aumento da

diversidade genética de um patógeno é a possibilidade de ocorrência de diferentes tipos de

reprodução podendo ser sexuada/fluxo gênico, assexuada/fluxo genotípico ou mista,

aumentando capacidade de mutação e seleção de genes de virulência que é maior que a

capacidade de mutação e seleção de gene de resistência do hospedeiro.

A diversidade genética dos 81 isolados foi analisada por meio do marcador

molecular ISSR com base em 72 bandas polimórficas. O número de bandas por marcador

usado variou de 11 (UBC 811) a 16 (UBC 827). Todas as bandas foram polimórficas,

indicando que os primers de ISSR selecionados foram altamente informativos (Tabela 3).

Hinz et al. (2009), analisando 95 isolados de Fusarium oxysporum com oito marcadores

ISSR, obtiveram apenas 52 bandas das quais 92,3% foram polimórficos, diferente do

resultado encontrado neste estudo onde 100% das bandas é polimórfica para todos os 5

marcadores utilizados. Bayraktar e Dolar (2011) analisaram a diversidade genética de 70

isolados de Fusarium spp. usando primers ISSR obtiveram uma alta variabilidade genética

entre os isolados reforçando a aplicação desta técnica em estudo de diversidade genética.

Com base na similaridade genética, foi possível reunir os isolados em 6 grupos

relacionados ao local de coleta, entretanto sem nenhuma correlação com o tipo de tecido

sintomático do qual o fungo foi isolado (galha, gema vegetativa e flor) ou mating type

(mat-1 e mat-2) (Tabela 2 e Figura 1). Esses resultados demonstram que a variação do tipo

de sintoma não está relacionada com possível especialização fisiológica ou genética do

patógeno e sim com o local de infecção no hospedeiro.

Queiroz et al. (2016) analisaram 72 isolados de F. decemcellulare de diferentes

sintomas pela técnica de Eric-PCR e encontraram uma alta diversidade entre os indivíduos

e nenhuma correlação entre os sintomas. Silva (2009) usaram os marcadores RAPD e SSR

em 66 isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense de diferentes municípios de Santa

271

Catarina, observando que não se agruparam por origens geográficas e que são distribuídos

indistintamente nos grupos apresentando uma alta diversidade entre eles.

Tabela 3. Primers ISSR selecionados para análise da diversidade em Fusarium decemcellulare.

N = Número de bandas. P (%)b Percentagem de polimorfismo

Figura 1. Dendrograma da similaridade entre os 81 isolados de F. decemcellulare, obtido

pelo método UPGMA

Primer Repetição Anelamento N

P (%)b

UBC 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 49°C 15 100

UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 51°C 11 100

UBC 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 49°C 15 100

UBC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 50°C 16 100

UBC 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 49°C 15 100

272

A relação entre os 81 isolados foi comparada pela análise das coordenadas

principais (PCoA) entre os isolados de viveiro e de campo. As duas primeiras coordenadas

principais apresentaram 21,26% e 31,37% da variação total. Nesta análise foi observada

uma tendência de agrupamento dos isolados obtidos em viveiro que foi confirmada pela

análise da estrutura das duas populações (Figura 2 A e B). A variância dentro das

populações apresentou o maior valor (72%) da variação total, enquanto que 28% da

variação foi observada entre as populações.

A

B

Figura 2. Em A representação gráfica da análise de coordenadas principais (PCoA) representa a diversidade genética entre os 81 isolados de Fusarum decemcellulare

avaliados a partir de marcadores moleculares ISSR. Em B estrutura da população

do patógeno obtida em viveiro em verde e no campo em vermelho. Escala na vertical corresponde à porcentagem de probabilidade de atribuição ao grupo

genético pertencente ao viveiro ou campo.

Co

ord

. 2 =

31,

37%

Coord. 1= 21,26%

Analíse das Coordenadas Principais (PCoA)

Viveiro

Campo

Campo Viveiro

273

Conclusões

A diferença significativa na razão entre Mat-1 e Mat-2 identificada na população

de isolados obtidas em viveiro indica ausência de reprodução sexuada.

Uma elevada diversidade foi identificada em ambas as populações analisadas com

base no marcador molecular ISSR independente da destruição e proporção 1/1 de mating

type.

Duas populações estruturadas foram identificadas de acordo com o local de coleta

e ausência de correlação genética entre os isolados e o sintoma do qual o fungo foi obtido.

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275



Síntese de nanopartículas de prata por espécies de Aspergillus do grupo

Niger

Silva L.S.C.1, Silva L.P.

2, Souza B.C.

3, Silva T.A.

1, Vieira L.F.S.

4, Durán, N.

5, Teixeira

M.F.S.6

1Doutorado Rede BIONORTE, Universidade Federal do Amazonas,

2Graduação em Ciências

Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, 3Graduação em Farmácia, UniNorte,

4Bolsista,

Universidade Federal do Amazonas, 5Professor, Universidade Estadual de Campinas,

6Professora,

Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected], larissa-



Resumo

A síntese biogênica de nanopartículas de prata por Aspergillus está sendo uma alternativa

vantajosa por secretarem enzimas extracelulares que reduzem íons metálicos. Este estudo

foi realizado com a finalidade de investigar a síntese de nanopartículas de prata por

Aspergillus do grupo Niger. As espécies foram autenticadas com base nas características

morfológicas e moleculares. Nos cultivos em meio sólido foi preparada suspensão de

esporos com água destilada esterilizada e transferida para frascos Erlenmeyer de 500 mL,

contendo 200 mL de Extrato de malte, glicose, extrato de levedura-peptona, obtendo-se

concentração final de 106

esporosmL de meio. A fermentação foi realizada a 25 ºC, 180

rpm. Após 96h, a biomassa foi separada em papel de filtro por filtração a vácuo, lavada

com água deionizada e armazenada em frascos Erlenmeyer de 1000 mL, contendo 200 mL

de água e incubada nas condições de fermentação. No extrato micelial recuperado foi

adicionado solução de AgNO3 até concentração final 1 mM. A mistura reacional foi

incubada por 96h, na ausência de luz, 25 ºC, 180 rpm. As leituras foram realizadas a 200 a

800 nm. A mudança de cor na solução e presença de banda a 433 nm indicaram a síntese

de nanopartículas de prata.

Palavras-chave: Aspergillus niger, Biossíntese, Bioprocesso, Extrato micelial, Coleção de

fungos.

Introdução

Dentre as nanopartículas metálicas, as nanopartículas de prata (AgNPs) são utilizadas

na indústria de eletrônicos, alimentos e bebidas, embalagens, farmacêutica, têxtil e

cosméticas (Lateef e Adeeyo, 2015). Estudos mostram que as AgNPs possuem atividade

antimicrobiana contra uma ampla faixa de microrganismos patogênicos devido sua maior

276

área superficial (Singh et al., 2014). Estas nanopartículas podem sem sintetizadas através

de métodos químicos, fotoquímicos, físicos ou biológicos, porém as produzidas por meios

físicos e químicos possuem custos maiores e toxicidade elevada (Hemath et al., 2010;

Elgorban et al., 2016). Por isso, a síntese biológica intermediada por microrganismos está

sendo utilizada para reduzir esses efeitos adversos (Vahabi et al., 2011; Maliszewska et al.,

2014). Os fungos apresentam vantagens em relação às bactérias, devido ao quantitativo da

secreção de proteínas extracelulares com propriedade de reduzir íons metálicos mais

rapidamente. Além disso, tem ciclo de crescimento mais lento, o micélio suportar

procedimentos industriais, como pressão de fluxo e agitação em biorreatores, o que

proporciona um maior rendimento das nanopartículas (Pavani et al., 2012; Barabadi et al.,

2014). Entre os deuteromicetos, o gênero Aspergillus se destaca devido ao seu grande

potencial de adaptação fisiológica e além disso, muitas espécies são importantes produtoras

de moléculas com atividade biológica relevante para as indústrias (Bracarense, 2013;

Niyonzima e More, 2013). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi selecionar linhagens

de Aspergillus do grupo Niger depositadas na Coleção de culturas DPUA da Universidade

Federal do Amazonas que sejam eficientes na síntese de nanopartículas de prata.

Material e Métodos

As espécies de Aspergillus do grupo Niger, A. niger DPUA 398, A. niger DPUA

399, A. pulverulentus DPUA 478, A. japonicus DPUA 542, A. japonicus DPUA 613, A.

awamorii DPUA 1473 e A. japonicus DPUA 1727, preservadas em água destilada

esterilizada, foram cedidas pela Coleção de Culturas DPUA, da Universidade Federal do

Amazonas. A autenticação foi feita com base nas características morfológicas e

moleculares. Para confirmação das características macro e micro morfológicas, as espécies

foram cultivadas em ágar CYA (Czapek-Dox + extrato de levedura), CZ (Czapek-Dox) e

Malte (Klich, 2002). Os cultivos foram mantidos a 30 °C durante sete dias. Para

identificação molecular foi feita a extração do DNA fúngico (método CTAB) modificado

nas condições do Laboratório de Princípios Bioativos de Origem Microbiana. A

amplificação da região ITS foi realizada por meio da técnica da PCR em termociclador,

marca MyGenie 96 ThermalBlock da Bioneer, utilizando os primers ITS 1, ITS 4, ITS3

fungal ribosomal generic, Uni-R e 28S. O produto das reações foi analisado em gel de

agarose 1% (p/v) para visualização dos fragmentos. Para reação de sequenciamento foi

utilizado o kit BigDye® Terminator v 3.1 CycleSequencing Kits. A reação de

sequenciamento foi feita em termociclador da marca MyGenie 96 ThermalBlock da

277

Bioneer. As sequências obtidas a partir do gene ITS pelo sequenciamento foram utilizadas

para confirmação das espécies, por meio do banco de dados NCBI (National Center for

Biotechnology Information - http://ncbi.nlm.nih.gov), ferramenta BLASTn. Para síntese de

AgNPs, os fungos foram cultivados em CYA (ágar Czapek extrato de levedura), em tubos

de ensaio, a 25 °C, por sete dias. Nos cultivos CYA foi preparada uma suspensão de

esporos com água destilada esterilizada. Dessa suspensão, uma amostra foi transferida para

frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de MGYP [Extrato de malte 0,3% (p/v),

glicose 1% (p/v), extrato de levedura 0,3% (p/v) e peptona 0,5% (p/v)], para obtenção da

concentração final de 106

esporosmL de meio. A fermentação foi realizada em 96 h, a

25ºC, 180 rpm. Para a extração das biomoléculas, a biomassa foi separada do extrato bruto

por filtração a vácuo e em seguida lavada com água ultra pura e acondicionado em frascos

de Erlenmeyer de 1000 mL, contendo 200 mL de água e deixado nas condições de

fermentação. No extrato micelial aquoso recuperado foi adicionada solução de AgNO3 (1

mM), incubada por 96 h, sem luz, a 25 ºC, 180 rpm. As AgNPs foram detectadas por

visualização da mudança de cor da solução e por espectrofotometria de UV-Vis (Cary 50

ProbeAgilent). As leituras foram realizadas nos comprimentos de onda de 200 a 800 nm

(Sudhakar et al., 2014).


Nos testes de autenticação, as análises morfológicas e moleculares confirmaram a

idenficação de A. niger DPUA 398, A. niger DPUA 399, A. pulverulentus DPUA 478, A.

japonicus DPUA 542, A. japonicus DPUA 613, A. awamorii DPUA 1473 e A. japonicus

DPUA 1727. Na síntese biogênica, os resultados obtidos mostraram que das quatro

espécies avaliadas no extrato micelial aquoso intermediado por A. niger DPUA 398 foi

observada a síntese de AgNPs. Gade et al. (2008) também relataram a biossíntese

extracelular de nanopartículas de prata por A. niger isolado de solo. Com base nesses dados

estão apresentadas nas figuras 1 e 2, as características morfológicas de A. niger DPUA 398

em meio padrão [CYA (Figura 1A), Cz (Figura 1B e ágar Malte (Figura 1C). Segundo

Schuster et al. (2002), foi definido que espécies que apresentam esporos de cor

castanha/preta, vesícula na extremidade de conidióforo, esterigmas e conídios em cadeia

fazem parte do grupo A. niger.

278

(A) (B)

Segundo Silva et al. (2015), a taxonomia de espécies de Aspergillus precisa ter uma

abordagem que integre características fenotípicas, juntamente com sequências de DNA.

Sendo assim, a similaridade obtida por comparação de sequências da região ITS de A.

niger DPUA 398 com as sequências contidas no banco de dados do GenBank através da

ferramenta Blastn, foi de 99% para A. niger (número de acesso KX664417.1).

Na síntese de nanopartículas foi observada visualmente a mudança de cor na

solução aquosa obtida da lavagem da massa micelial de A. niger DPUA 398, após 96h de

reação (Figura 3 A e B). Phanjom e Ahmed (2015) citaram que a alteração na cor durante a

síntese se deve à ressonância de plasma de superfície das nanopartículas de prata. A

espectroscopia de UV-vis é a técnica mais utilizada para determinação da redução dos íons

de prata (Jain et al., 2010). Deste modo, a figura 3C mostra os resultados da leitura em 200

a 800 nm que revela a presença de banda única com pico máximo em 433 nm. Isto mostra

Figura 1 – Características macromorfológicas de A. niger DPUA 398 nos cultivos obtidos em sete

dias em meio sólido (A) CYA; (B) CZ; (C) Malte.

Figura 2 – Microestruturas de A. niger DPUA 398: (A) Conídios e hifa septada; (B) Conidióforo, vesícula,

esterigmas e conídios.

279

a possível relação da liberação de proteínas na solução pelo microrganismo e a síntese de

nanopartículas de prata (Prahbu e Poulose, 2012). Afonso (2015) citou que A. niger

sintetiza proteínas únicas responsáveis por mecanismos de biossíntese de compostos que

não ocorrem em outras espécies de fungos filamentosos, sendo altamente versátil.

Figura 3 – (A) Filtrado celular de A. niger DPUA 398 isento de AgNO3 e (B) Nano partículas de prata

sintetizas após 96h de reação; (C) Espectroscopia de UV-vis com a presença de banda com pico máximo em

433 nm.

Conclusões

A. niger DPUA 398 despontou como um bom produtor de metabólitos que

participam da síntese extracelular de nanopartículas de prata.

A formação das nanopartículas de prata foi confirmada pela mudança de cor da

solução e o aparecimento da banda de ressonância plasmônica de superfície no espectro de

UV-Vis.

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282



Isolamento e caracterização de policetídeos diméricos em Talaromyces

sp., um fungo endofítico de Duguetia stelachantha

Silva P.H.F.1, Silva S.R.S.

1,2, Batista R.M.

3, Soares L.N.

4, Souza A.D.L.

2,5, Costa E.V.

5 de,

Koolen H.H.F.1,6

, Souza A.Q.L. de1,2,5

1PPG Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazonia - Universidade do Estado do Amazonas, ,

PPG Bionorte – Universidade do Estado do Amazonas , 2PIBIC - Universidade Federal do

Amazonas, 3Graduação em Quimica - UFAM,

4Pesquisador, Universidade Federal do Amazonas

5Pesquisador, Universidade do Estado do Amazonas. E-mails: [email protected],


[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

Resumo

Os principais metabólitos secundários produzidos por indivíduos do gêneto

Talaromyces são derivados de alcaloides, peptídeos e principalmente policetídeos, que são

de interesse para estudos químicos e biotecnológicos. O presente estudo teve como

objetivo a caracterização química de metabólitos produzidos pelo fungo Talaromyces sp.

(DgCr22.1b), um endófito isolado de Duguetia stelachantha e que apresentou potencial

citotóxico e antimicrobiano em avaliações preliminares. O fungo foi cultivado em meio

ISP2 por 28 dias sob temperatura de 28 ºC. Após o cultivo, foi obtido o extrato bruto que

em seguida foi fracionado em coluna de sílica gel usando eluição gradiente. Após análises

cromatográficas, a fração 03 apresentou características compatíveis com policetídeos

(baixo fator de retenção e coloração da revelação amarelada). Esta fração foi submetida à

CCD preparativa levando ao isolamento de cinco substâncias puras. Após análise estrutural

por RMN e MS foi possível identificar as substâncias isoladas como ácido secalônico A

(1), blenolídeo G (2), peniciloxantona A (3), versixantona A (4), além de uma nova

substância denominada paecilina D (5). A linhagem estudada é capaz de sintetizar como

principais metabólitos dímeros de xantonas, em detrimento às espécies monoméricas, bem

como outros policetídeos. A linhagem de Talaromyces DgCr22.1b mostrou-se capaz de

sintetizar como principais metabólitos, dímeros de xantonas, em detrimento às espécies

monoméricas. Adicionalmente, a paecilina D descrita neste trabalho apresentou potencial

antifúngico, até então não relatado na literatura.

Palavras-chave: Talaromyces, Xantonas, Endófito.

Introdução

Os fungos são microrganismos utilizados na produção de alimentos, na

fermentação, na indústria farmacêutica entre outras. Também estão inseridos em processos

de biodegradação, tratamento de efluentes, produção de enzimas, além de apresentar

grande importância no equilibrio ecológico (Abreu et al., 2015).








283

Algumas espécies de fungos são capazes de produzir metabólitos biologicamente

ativos, como os antibióticos penicilinas obtidos de Penicillium spp., o imunossupressor

ciclosporina de Beauveria nivea e agentes redutores do colesterol como as estatinas de

Aspergillus terreus.

O gênero Talaromyces, pertencente a familia Trichocomaceae é um estado

teleomórfico de Penicillium (Zhai et al., 2016) e que compreende aproximadamente 75

espécies. Fungos pertencentes a este gênero foram inicialmente isolados de amostras de

solo, sendo em seguida descritos em alimentos, algas e mais recentemente como endofítos

(Miao et al., 2012). Segundo Strobel et al. (2004), fungos endofíticos constituem uma

promissora fonte de substâncias que estão em constante avaliação de suas potencialidades

biológicas, o que visa atender a crescente necessidade da indústria farmacêutica. Uma das

principais características dos fungos endofíticos, diz respeito a capacidade destes não

causarem danos visíveis a sua planta hospedeira (Clay, 1988). Os metabólitos produzidos

são a resposta a certas condições ambientais, acreditando-se que estes metabólitos estejam

diretamente ligados a processos de interação microrganismo/planta, bem como diversas

outras finalidades (Vieira, 2008). Quimicamente, este gênero é pouco explorado, sendo

descritos até então alcaloides, peptídeos e principalmente, policetídeos como principais

metabólitos produzidos por diferentes espécies (Zhai et al., 2016).

O presente estudo teve como objetivo a caracterização química dos principais

dímeros de xantonas produzidos pelo fungo Talaromyces sp. (DgCr22.1b), um endófito

isolado de Duguetia stelachantha e que apresentou potenciais citotóxico e antimicrobiano

em avaliações preliminares de triagem de atividades biológicas.

Material e Métodos

O cultivo da linhagem DgCr22.1b foi realizado no Laboratório de Bioensaios e

Microrganismos da Amazônia (LabMicra) da Universidade Federal do Amazonas

(UFAM). Esta linhagem faz parte da coleção de trabalho do Grupo de Pesquisa GEMMA,

sendo reativado em meio cultura ISP2 sólido (amido, extrato de malte, extrato de levedura,

dextrose e agarose) suplementado com 0,05% de ampicilina. Em sequência, preparou-se a

solução de esporos (100 μL), estes foram inoculados em frascos Erlenmeyer de 1000 mL

contendo 300 mL de meio ISP2 líquido por 28 dias a 28 ºC.

A extração dos metabólitos foi realizada por meio da partição líquido-líquido.

Inicialmente, o caldo foi separado do micélio por meio de uma filtração a vácuo. O

284

procedimento de extração foi conduzido utilizando acetato de etila como solvente extrator.

Aproximadamente 1 g do extrato em acetato de etila foi fracionada em coluna de sílica gel

(mesh 230-400), sendo obtidas 4 frações. A fração 3 (eluída com 100% acetato de etila)

apresentou substâncias com fator de retenção semelhante a um padrão autêntico de ácido

secalônico D. Cerca de 100 mg desta fração foram submetidas a um procedimento de

isolamento em cromatografia de camada delgada preparativa (CCDP). Deste

procedimento, foram isoladas quatro substâncias posteriormente caracterizadas por

ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e

13C e espectrometria de massas (MS).


Do fracionamento do extrato de acetato de etila do fungo Talaromyces DgCr22.1b,

quatro substâncias foram isoladas. A comparação dos dados de RMN de 1H e

13C e MS

conduziram a identificação destes metabólitos como sendo policetídeos pertencentes à

classe das xantonas. Diferente de outras linhagens de Talaromyces, DgCr22.1b foi capaz

de priorizar em sua via biossintética a formação de compostos diméricos. Após

aprofundada comparação dos dados espectroscópicos com dados previamente publicados,

foi possível caracterizar as substâncias isoladas como sendo: ácido secalônico A (1),

blenolídeo G (2), peniciloxantona A (3), versixantona A (4), além de uma nova substância

denominada paecilina D (5). (Figura 1).

Figura 1. Substância isoladas: ácido secalônico A (1), blenolídeo G (2), peniciloxantona A

(3), versixantona A (4) e paecilina D (5). Fonte: Silva, P.H.F., 2016.

285

Ácidos secalônicos são dímeros de tetraidroxantonas que incialmente foram

descritos em Claviceps purpurea (Wazeman et al., 2015). Posteriormente, ácidos

secalônicos (A-F) foram descritos em linhagens dos fungos Gliocladium, Aspergillus e

mais recentemente Talaromyces (Liu et al., 2007). Moléculas pertencentes a este restrito

grupo são conhecidas por seu potencial citotóxico. Estudos indicam que o ácido secalônico

D induz apoptosis em células de leucemia (Zhang et al., 2009). Adicionalmente, os ácidos

secalônicos D e F mostraram potentes atividades alelopáticas (Zeng et al., 2004). Como

contra partida, ambos foram descritos como substâncias de elevada toxidez, além disso,

foram observados efeitos teratogênicos em ratos, o que levou ao descontinuamento dos

estudos ainda em fases inciais (Wang e Polya, 1996). Estes compostos foram obtidos como

majoritários nos extratos de Talaromyces DgCr22.1b, o que nos leva a concluir que

potencialmente a alta atividade citotóxica observada no extrato bruto possa estar

diretamente relacionada a presença destes dois metabólitos.

Os Blenolídeos inicialmente foram descritos como sendo unidades monoméricas

dos ácidos secalônicos (ácidos hemisecalônicos) (Siddiqui et al., 2011). Estudos

posteriores conduziram ao isolamento de blenolídeos rearranjados, tanto nas formas

monoméricas como diméricas, estes últimos recebendo a denominação de versixantonas

(Zhang et al., 2008). O metabólito blenolídeo G foi anteriormente isolado apenas de

Blennoria sp. e Alternaria sp. (Cai et al., 2014). As paecilinas são outro grupo restrito de

homodímeros, anteriormente encontrados em poucos registros. Até então apenas três

compostos desta subclasse eram descritos, e sem qualquer atividade biológica relatada.

Nos testes antimicrobianos, a versixantona A apresentou moderada atividade antifúngica

(31,3 μg/mL), enquanto que a nova molécula paecilina D apresentou potencial pode

fungicida com CIM de 15 μg/mL contra Candida albicans.

Conclusões

A linhagem de Talaromyces DgCr22.1b mostrou-se capaz de sintetizar como

principais metabólitos, dímeros de xantonas, em detrimento às espécies monoméricas.

O estudo destas frações permitiu a identificação de cinco substâncias, entre elas

uma nova xantona homodimérica da subclasse das paecilinas, raras como produto natural.

Adicionalmente, a paecilina D descrita neste trabalho apresentou potencial

antifúngico, até então não relatado na literatura.

286

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287



Indicadores microbiológicos do solo sob diferentes manejos de água no

cultivo de arroz na Amazônia Setentrional

1Siqueira, R.H.S.,

1Evald, A.,

1Melo, V.F.,

1Rocha, P.R.R., Matos, K.S.

1, Espindola, I.C.

2,

Maia, S.S2.

1POSAGRO, Universidade Federal de Roraima.

2Universidade Federal de Roraima, 69310-000,

Boa Vista, RR, Brasil. E-mail: [email protected]; [email protected].

Resumo

Nos últimos anos tem se buscado conciliar o incremento da produção de alimento com a

manutenção da sustentabilidade dos sistemas de produções agrícolas, onde o uso racional e

otimizado da água na agricultura irrigada tem sido destaque. Objetivou-se com esse estudo,

avaliar os indicadores microbiológicos do solo cultivado com arroz submetido a diferentes

manejos de água. O experimento foi instalado em blocos casualizados em esquema de

faixas. Os tratamentos foram constituídos pelos sistemas de manejos: M1: Inundação

intermitente; M2: Inundação intermitente na fase vegetativa, seguida de inundação

contínua; M3: Inundação contínua na fase vegetativa, seguida de inundação intermitente

até a maturação e M4: Inundação contínua durante todo o ciclo, além destas também foi

inserida uma área adjacente não cultivada (testemunha) e por duas cultivares de arroz: C1:

BRS Tropical e C2: IRGA 424. Foram avaliados os seguintes atributos químicos,

microbiológicos e bioquímicos: carbono orgânico do solo (COS), carbono da biomassa

microbiana (C-BMS), coeficiente metabólico (qMIC), fosfatase ácida e urease. Maiores

teores de COS proporcionam melhores condições para atividade dos microrganismos em

área de cultivo de arroz em várzea, denotada por maiores teores de C-BMS e maior

atividade enzimática.

Palavras-chave: Indicadores do solo, enzimas do solo, Oryza sativa, água na agricultura.

Introdução

No estado de Roraima, a rizicultura é a única cadeia produtiva efetivamente bem

estabelecida (Cordeiro et al., 2007). O Estado possui uma área de várzea de cerca de 160

mil hectares com grande parte apresentando aptidão para o cultivo de arroz (Barberena et

al., 2011).

No entanto, a produção não deve ser a única preocupação no manejo agrícola das

culturas, com a qualidade do solo e da água devendo ser consideradas, pois estes recursos

naturais são afetados com os tipos de manejo empregados, e tem consequências positivas

ou negativas na sustentabilidade nos sistemas de produção.

288

O alagamento para o cultivo de arroz promove mudanças nas propriedades

químicas, físicas e biológicas dos solos, sendo que a principal alteração ocorre em virtude

do processo de redução do solo, que surge a partir da respiração anaeróbica de bactérias,

resultante da diminuição do oxigênio, que ocasiona oxidação menos eficiente da matéria

orgânica, levando a alterações significativas no potencial redox e no pH (Leisack et al.,

2001; Vahl, 2004; Adhya e Rao, 2005; Nayak et al., 2007). As propriedades biológicas são

alteradas pela mudança do ambiente aeróbico para anaeróbico, o que promove a

diminuição da biota microbiana do solo (Moreira e Siqueira, 2006).

Com o desenvolvimento de pesquisas nas áreas de microbiologia e bioquímica do

solo, observou-se que os atributos microbiológicos e bioquímicos apresentavam boa

sensibilidade em detectar mudanças, mesmo mínimas, no manejo do solo (Mendes et al.,

2012). O entendimento das interações entre os atributos do solo, químicos, físicos,

microbiológicos e bioquímicos (Carneiro et al., 2009; Vezzani e Mielniczuk, 2011),

levaram os cientistas a estudar não apenas um compartimento do solo, mas sim, o conjunto

de indicadores das diferentes propriedades do solo que melhor possam inferir sua

qualidade (Carneiro et al., 2009; Lima et al., 2013).

Baseado na abordagem exposta e a falta de estudos referente às mudanças nas

propriedades dos solos cultivados com arroz irrigado em Roraima, objetivou-se com este

estudo, avaliar alguns indicadores microbiológicos do solo em cultivo de arroz submetido a

diferentes manejos de água, em solos de várzea.

Material e Métodos

O experimento foi realizado no município do Cantá-RR, Fazenda Santa Cecília, na

várzea do Rio Branco, nas coordenadas geográficas de referência 60° 39’ 19’’ W; 02° 48’

29’’ N. O clima da região tipo Aw, tropical chuvoso (KÖPPEN-GEIGER), com

precipitação média anual de 1600 mm e temperatura média de 27,4 °C (Araújo et al.,

2001). O experimento foi conduzido dentro do programa de melhoramento de arroz da

EMBRAPA – RORAIMA. No período de dezembro a abril do ano agrícola 2014/2015.

O solo da área experimental foi classificado como Gleissolo Háplico Tb Distrófico

(EMBRAPA, 2013), formado em terraço fluvial de sedimentos holocênicos (Riker e

Horbe, 2007). As características química e granulométrica da área antes do plantio na

camada de 0 a 0,20 m foram pH em H2O = 4,9; MO = 12,9 g kg-1

; P =10,14 mg dm-3

; K+ =

43,00 mg dm-3

; Ca2+

= 0,58 cmolc dm-3

; Mg2+

= 0,27 cmolc dm-3

; Al3+

= 1,11 cmolc dm-3

;

argila = 340 g kg-1

; silte = 410 g kg-1

; areia = 250 g kg-1

.

289

O experimento foi instalado em delineamento de blocos ao acaso em esquema de

arranjo em faixas, com quatro repetições, sendo que nas faixas foram aleatorizados quatro

sistemas de manejo de água de irrigação e nas parcelas, dentro de cada faixa, as repetições

com as cultivares. As cultivares de arroz utilizadas foram: BRS Tropical (C1) e IRGA 424

(C2).

Os sistemas de manejos de irrigação foram: M1- Inundação intermitente; M2-

Inundação intermitente na fase vegetativa até 50% de floração média, seguida de

inundação contínua até a maturação (90% de panículas maduras); M3- Inundação contínua

na fase vegetativa até 50% de floração, seguida de inundação intermitente até a maturação

e M4- Inundação contínua durante todo o ciclo. Além de uma área adjacente, considerada

testemunha.

O preparo do solo foi realizado com o solo seco e consistiu de uma aração e duas

gradagens a 0,20 m de profundidade, nivelamento e construção de taipas, trinta dias antes

da semeadura, utilizando-se implementos de discos e a entaipadeira. Junto com o preparo

do solo foi feita a calagem com o equivalente a 1 t ha-1

de calcário dolomítico (PRNT

85%), tendo como base as análises químicas do solo. Essa correção ocorre a cada dois

anos, para fornecer Ca2+

e Mg2+

à cultura.

A semeadura foi realizada no dia 27/12/2014 com o solo drenado. As sementes

viáveis foram distribuídas diretamente nos sulcos de plantio, em uma densidade de 100

sementes por metro linear, com sete linhas de 5,0 m de comprimento, espaçadas de 0,20 m.

Todos os procedimentos foram realizados de forma manual. A emergência das plântulas

ocorreu no dia 09/01/2015.

A adubação de base foi de 450 kg ha-1

da fórmula 08-28-16 + micronutrientes (36

kg de N; 126 kg de P2O5;72 kg de K2O; 2,25 kg de Zn; 0,45 kg de B; 0,9 kg de Mn), com

adubação em cobertura de 300 kg ha-1

de ureia (45% de N), aplicada em duas doses de 150

kg ha-1

, no início do perfilhamento (15 dias após a emergência - DAE), e na diferenciação

do primórdio floral (45 DAE).

A água foi captada do Rio Branco, bombeada e conduzida em tubos de PVC (100

mm) até a parcela experimental, cujo sistema constou de um canal principal e derivações

laterais para a distribuição da água em cada uma das parcelas.

A irrigação foi iniciada no estádio V4 (4 folhas), correspondendo a 23 DAE,

utilizando-se como referência a escala de Counce et al. (2000). Durante o período da

irrigação, cada parcela recebeu o manejo de água correspondente, mantendo uma lâmina de

água de 0,05 m de altura para o manejo contínuo, e as parcelas de manejo intermitente

290

receberam irrigação a cada dois dias, mantendo-se as parcelas sempre em solo saturado,

com controle diário. O período de irrigação total foi de 100 dias.

As amostragens de solo ocorreram após a colheita da cultura. Em cada parcela

foram coletadas três amostras simples que formaram amostra composta por parcela, com

quatro repetições por tratamento. Foram coletadas amostras de área não cultivada, com

vegetação secundária denominada testemunha, a qual encontra-se localizada próximo ao

experimento. A testemunha foi dividida em quatro blocos de 10 m x 10 m (100 m2), os

quais compreendiam as repetições. As amostragens foram feitas na camada de 0-0,10 m.

As amostras foram divididas em duas, uma para análise química e a outra para as análises

microbiológicas e bioquímicas, sendo que essas últimas foram acondicionadas em sacos

plásticos em caixa térmica para o transporte até o laboratório da Universidade Federal de

Roraima e mantidas sob refrigeração com temperatura variando de 4º C a 7º C até a

realização das análises.

Para a realização das análises químicas, microbiológicas e bioquímicas, as amostras

foram peneiradas em malha de 2 mm, retirando os fragmentos vegetais por catação com

auxílio de pinça. Na tabela 1 estão apresentados os indicadores estudados, os métodos

utilizados para suas respectivas avaliações e suas respectivas referências.

Tabela 1. Indicadores químicos, físicos, microbiológicos e bioquímicos do solo e os

respectivos métodos utilizados para a sua determinação. Indicador Extrator Método Referência

Químico

Carbono orgânico do

solo (COS)

Dicromato (Cr2O72-) Walkley-Black Modificado Embrapa

(2009)

Microbiológico

Carbono da biomassa

microbiana (C-BMS)

Clorofórmio/Sulfato de

potássio

Fumigação e extração Vance et al. (1987);

Tate et al. (1988)

Quociente microbiano

(qMic)

-------------------- Razão entre o C-BMS e o COT

Anderson e Domsch (1993)

Bioquímica

Fosfatase ácida p-nitrofenol-fosfato Espectrofotometria Tabatabai (1994)

Urease Método do salicilato Espectrofotometria Kandeler e Gerber

(1988)

Os dados foram submetidos à análise da variância pelo teste F (p<0,05) e, quando

significativos, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05). As análises

foram realizadas utilizando o software Sisvar versão 5.5 (Ferreira, 2011). Os dados foram

comparados com os obtidos na área de referência (testemunha), aplicando a prova não

paramétrica de Kruskal Wallis (p<0,05) utilizando o programa Info-Gen (Di Rienzo et al.,

2013).

291


O COS apresentou diferenças significativas entre os manejos estudados e destes em

relação a testemunha. O C-BMS apresentou diferença apenas dos manejos em relação a

testemunha (Tabela 2), onde os manejos influenciaram de forma negativa o C-BMS. Já o

atributo qMic não diferiu estatisticamente entre os manejos, nem desses, em relação a

testemunha.

Tabela 2. Indicadores químicos e microbiológicos de qualidade de um gleissolo háplico

Tb Distrófico sob cultivo de arroz com diferentes manejos de água no solo.

Manejo de Irrigação

Variáveis

COS

g kg-1

C-BMS

mg C. kg-1

qMic

%

M1 4,02 b * 139,03 a* 3,45 a

M2 3,86 b * 108,72 a* 2,81 a

M3 4,37 ab * 117,0 a* 2,67 a

M4 4,47 a 142,4 a* 3,18 a

CV (%) 9,54 28,85 32,06

Testemunha 8,15 271,61 1,24

Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey

(p<0,05); e as seguidas de asterisco (*) diferem significativamente da vegetação nativa pelo teste de Kruskal

Wallis (p<0,05). M1: Inundação intermitente; M2: Inundação intermitente na fase vegetativa até 50% de

floração média, seguida de inundação contínua até a maturação (90% de panículas maduras); M3: Inundação

contínua na fase vegetativa até 50% de floração, seguida de inundação intermitente até a maturação e M4:

Inundação contínua durante todo o ciclo.

Menores valores de COS encontrado nos manejos de água em relação a testemunha

(Tabela 2), como também, o ambiente anaeróbio que o manejo de água proporciona no

solo, influenciam na diversidade e quantidade de microrganismos, como também na

eficiência dos mesmos. É sabido que ambientes anaeróbicos apresentam menores

diversidades e quantidades de microrganismos quando comparados aos de ambientes

aeróbicos (Moreira e Siqueira, 2006).

O índice qMic encontrados em todos os tratamentos estão dentro dos valores que

são considerados normais, que variam entre 1 a 4 % (Jakelaitis et al., 2008), podendo

inferir que a transformação do COS em C-BMS, ou a mineralização do COS estão

adequados ao sistema.

A fosfatase ácida diferiu estatisticamente entre os manejos, apresentando maior

atividade no M3, sendo que, em relação a testemunha apenas este manejo não apresentou

diferença. Quanto a atividade da urease, não foram observadas diferenças entre os manejos

da água, no entanto, estes apresentaram diferenças em relação a testemunha, na qual a

urease apresentou maior atividade (Tabela 3).

292

Em relação à testemunha, apenas o M3 não diferiu desta, os demais manejos

apresentaram decréscimos na atividade da fosfatase ácida. Esse resultado está relacionados

com os valores de COS, onde maior presença de COS resultou em maior atividade da

fosfatase.

Tabela 3. Indicadores bioquímicos de qualidade de um GLEISSOLO HÁPLICO Tb

Distrófico sob cultivo de arroz com diferentes manejos de água no solo.

Manejo de Irrigação

Variáveis

Fosfatase ácida

mg p-nitrofenol kg-1 solo h -1

Urease

mg NH4+ kg-1 solo h -1

M1 136,08 b* 2,91 a*

M2 148,92 ab* 3,18 a*

M3 178,99 ajjj 3,48 a*

M4 158,35 ab* 3,56 a*

CV (%) 17,18 24,84

Testemunha 267,94 6,32

Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey

(p<0,05); e as seguidas de asterisco (*) diferem significativamente da vegetação nativa pelo teste de Kruskal Wallis (p<0,05). M1: Inundação intermitente; M2: Inundação intermitente na fase vegetativa até 50% de

floração média, seguida de inundação contínua até a maturação (90% de panículas maduras); M3: Inundação

contínua na fase vegetativa até 50% de floração, seguida de inundação intermitente até a maturação e M4:

Inundação contínua durante todo o ciclo.

Mendes et al. (2012) observaram correlação positiva dos teores de carbono

orgânico com a atividade da fosfatase ácida em condições naturais de cerrado, cuja

atividade é aumentada em áreas preservadas, isso porque a fosfatase é responsável pela

ciclagem de fósforo orgânico (Po), transformando-o em fósforo inorgânico (Pi). O

aumento do nível de Pi no solo provoca redução da atividade da fosfatase (Cordeiro et al.,

2004).

O maior teor de COS presente na testemunha, assim como maior biomassa

microbiana, são os fatores que explicam este resultado, visto que a atividade da urease é

influenciada pela presença de microrganismos e composição do material vegetal (Reynolds

et al., 1987; Lanna et al., 2010). Aumento nos teores de matéria orgânica e de nitrogênio

tem apresentando correlação positiva com a atividade enzimática (Nayak et al., 2007).

Conclusão

Maiores teores de COS proporcionam melhores condições para atividade dos

microrganismos em área de cultivo de arroz em várzea, denotada por maiores teores de C-

BMS e maior atividade enzimática.

293

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295


Sorbicilinoide de Penicillium chrysogenum isolado de Gustavia sp.

Sousa A.S.1, Almeida M.F.O.

2, Souza A.Q.L. de

3, Souza A.D.L

4

1PG Química, Universidade Federal do Amazonas,

2Pesquisador, Instituto Federal de Ciências e

Tecnologia do Amazonas, 3Pesquisador, Universidade Federal do Amazonas,

4Pesquisador,

Universidade Federal do Amazonas. Email: [email protected], [email protected],

[email protected]; [email protected]

Resumo

O Penicillium chrysogenum é um fungo filamentoso, encontrado em diversos habitat,

inclusive no interior de vegetais, como endófito. Esta espécie é bastante conhecida pela

produção de antibióticos β-lactâmicos, além de crisogina, roquerfortina e sorbicilinoides.

Os sorbicilinoides são encontrados, dentre outros, na forma de dímeros, denominados

bisorbicilinoides. Membros pertencentes a essa família de compostos são considerados

como uma nova classe de substâncias com propriedades bioativas como: citotóxica,

antiviral, antimicrobiana e antioxidante, entre outras. O fracionamento do extrato MeOH

do meio de cultura líquido de P. chrysogenum, resultou no isolamento e identificação de

2’,3’-dihidrosorbicilina, um monômero da classe dos policetídios, pertencente à família

dos sorbicilinoides. Além disso, na análise por espectrometria de massas, foram

observadas várias frações ricas em substâncias dessa família. Estes são os primeiros

resultados dos estudos das frações do extrato MeOH de P. chrysogenum indicando a

presença de substâncias da família dos sorbicilinoides, justificando a continuidade dos

estudos químicos desse fungo.

Palavras-chave: Metabólito secundário, 2’,3’-diidrosorbicilina, espectrometria de massas,

policetídeos.

Introdução

Estudos têm demonstrado a grande variedade e potencial dos microrganismos

endofíticos de regiões tropicais, como a Amazônia, registrados nos trabalhos de Souza et

al. (2004), Souza et al. (2008), Koolen et al. (2012), Banhos et al. (2014). Segundo Chapla

et al. (2013), os microrganismos endofíticos ou endófitos são um grupo diversificado de

micróbios que colonizam os tecidos internos das plantas sem causar prejuízos aparentes ao

hospedeiro.

Espécies do gênero Penicillium são grandes produtoras de estruturas policetídicas

complexas com atividades biológicas bastante promissoras. Uma espécie em destaque é o

P. chrysogenum, que desde a descoberta da penicilina, vem sendo usada como fonte

296

importante de metabólitos antibacterianos, antifúngicos e citotóxicos (Meng et al., 2011;

Lopes et al., 2012; Guo et al., 2013).

No acervo de substâncias bioativas oriundas de P. chrysogenum destacam-se os

sorbicilinóides que são metabólitos policetídicos, também isolados de Trichoderma sp.,

Phialocephala sp., entre outros (Li et al., 2007; Neumann et al., 2007; Haned e Volp,

2011). Segundo Balde et al. (2010), essas substâncias representam uma nova classe de

compostos com potenciais bioativos contra células cancerígenas, fungos, vírus e bactérias

(Cabrera et al., 2006; Peng et al., 2014; El-elimat et al., 2015).

Em estudo anterior do extrato metanólico do meio líquido de uma linhagem de P.

chrysogenum isolado de Gustavia sp. foram observadas frações ricas em substâncias da

família do sorbicilinoides, como os bisorbicilinoides trichodimerol, diidrotrichodimerol e

tetraidrotrichodimerol (Almeida, 2014). Essas frações são alvo deste estudo, que visa

identificar e quantificar as substâncias dessa família de compostos.

Material e Métodos

A linhagem 401 de P. chrysogenum, mantida na coleção de estudos do Laboratório

de Microrganismos da Amazônia – LabMicrA, foi cultivada em 30 L do meio de cultura

BDL (batata, dextrose e 2% de Levedura), distribuídos em 100 frascos erlenmeyers de 1 L.

Em cada frasco foram inoculados 50 µL da suspensão de esporos da linhagem e o cultivo

prosseguiu no modo estático, a 36°C, por 20 dias. Após o período de cultivo, o líquido

fermentado foi separado da massa micelial, filtrado em papel de filtro sob vácuo e, após o

acréscimo de 3% de metanol, foi armazenado em garrafas de vidro âmbar até posterior

filtração em membrana de 0,45 micra (Figura 1).

Para a obtenção dos extratos, o líquido fermentado filtrado do cultivo foi extraído

sob vácuo em cartucho de extração em fase sólida – SPE, composto por 10 g de sílica C18,

previamente condicionado com MeOH. A cada litro do líquido fermentado, os analitos

retidos foram extraídos por duas porções consecutivas de 30 mL de MeOH. Os extratos

foram reunidos, concentrados, identificados e armazenados em dessecador (Figura 1).

O extrato metanólico do meio líquido cultivado (EMML) foi inicialmente analisado

por Cromatografia em Camada Delgada - CCD (cromatoplacas de sílica gel com indicador

de fluorescência F254 da Sorbent Techonologies), reveladas por irradiação com lâmpada

ultravioleta (UV) (264 e 365 nm) e reagente vanilina acidificada. As placas foram eluídas

em diferentes combinações de hexano/acetato de etila/ metanol.

297

Figura 6. Esquema do cultivo do fungo e obtenção dos extratos.

Após as análises por CCD, 8,17 g do extrato bruto seco foram submetidos à

cromatografia em coluna com 250 g de sílica gel (SiliCycle SiliaFlash F60) eluída com

misturas de solventes: Hex:AcOEt (1:1) - fração F1 (0,8 g); AcOEt:MeOH (9:1) - fração

F2 (2,18 g) e MeOH (100%) - fração F3 (3,84 g).

Após análise por cromatografia de camada delgada, a fração F2 (2 g) foi submetida

a um novo fracionamento em coluna cromatográfica aberta, empacotada com 30 g de sílica

gel (SiliCycle SiliaFlash F60) e eluída com mistura de solventes em gradiente crescente de

polaridade (Figura 2).

Figura 2. Esquema do fracionamento da fração F2.

Todas as frações, desde o extrato bruto, foram diluídas a 10 ppm em metanol grau

HPLC e analisadas na faixa de m/z 100-1000 por inserção direta em espectrômetro de

massas do tipo ion trap (modelo LCQ Fleet da Thermo Scientific), equipado com fonte de

ionização a pressão atmosférica – APCI, operando em modo positivo e negativo de

aquisição, na busca de substâncias da família do sorbicilinoides. A fração F2A (6,5 mg) foi

P. Chrysogenum

401

Resíduo

Micelial

Filtrado

Meio Líquido

Extrato 1

(EMML)

17,96 g

- Cultivo no modo estático em 100 frascos de 1 L com 300

mL/frasco, por 20 dias, pH: 6,5;

- Meio BDL;

- Filtração em funil de Buchner e membrana Millipore;

- Extração em fase sólida (SPE)

com MeOH;

- Extração por maceração

com MeOH;

Extrato 2

(EMM)

21,53 g

AcOEt/MeOH (9:1)

F2

2,0 g

MeOH

(100%)

Hex/AcOEt

(8:2)

Hex/AcOEt

(6:4)/(1:1)

- Cromatográfica em coluna;

- Sílica Gel fase normal: 29,47 g;

- Pastilha 4,6 g de sílica;

- Hex/AcOEt/MeOH;

F2A

6,5 mg

F2B

4,0 mg

F2C

6,7 mg

F2D

46,0 mg

F2E

250,0 mg

F2F(f,g,h)

450,0 mg

F2I

160,0 mg

F2J

480,0 mg

F2K

210,0 mg

Hex/AcOEt

(7:3)

Hex/AcOEt

(7:3)/(6:4)

Hex/AcOEt

(1:1)/(3:7)

Hex/AcOEt/MeOH

(2:7:1)

298

fracionada em CCD (5 x 10 cm), eluída com Hex/AcOEt (8:2) e revelada com lâmpada

ultravioleta (UV-264nm), resultando em quatro novas frações (Figura 3).

As frações F2A1 e F2A2 foram diluídas a 10 ppm em metanol grau HPLC e

analisadas, na faixa de m/z 100-1000, por inserção direta em espectrômetro de massas,

conforme ao descrito anteriormente.

Figura 3. Esquema do fracionamento por CCD da fração F2A.

As frações foram analisadas e encaminhadas, para análises de RMN 1D e 2D em

um espectrômetro de RMN Bruker AVANCE III HD, operando a 11,75 tesla, equipado

com uma sonda multinuclear de 5 mm (BBFO Plus SmartProbeTM

), com gradiente de

campo na direção z, observando-se os núcleos de 1H e

13C a 500,13 e 125,76 MHz,

respectivamente, utilizando metanol deuterado (MeOH-d), como solvente.


No espectro de íons totais do EMML e F2 de P. chrysogenum, registrado na região

de m/z 100-1000 ([M-H]-), foram observados três grupos distintos de possíveis

sobicilinoides, grupo 1: monômeros, grupo 2: os dímeros e grupo 3: os trímeros (Figura 4).

Figura 4. Espectro de íons totais (full scan) do EMML de P. chrysogenum.

Hex/AcOEt

(8:2)

F2A

6,5 mg

F2A1

1,5 mg

F2A2

1,0 mg

F2A3

1,0 mg

F2A4

1,8 mg

3 placas de CCD

(10 cm x 5 cm)

Hex/AcOEt (8:2)

EMML_EMM_FRACOES_APCI_negat_12_07_16 #144-173 RT: 2,91-3,48 AV: 30 NL: 5,80E1T: ITMS - c APCI corona Full ms [100,00-1000,00]

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rela

tive

Abun

danc

e

495,34

247,32

511,33453,43

263,30529,34352,31

657,37395,38283,43205,33 743,44

671,38651,50 759,38179,29

807,49907,53 989,20

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

299

A amostra F2A1 (Figura 3), apresentou característica de um sólido amarelo pálido,

totalmente solúvel em MeOH. A análise de massas, no modo negativo, evidenciou a

presença de um íon base com m/z 233 u, correspondendo à molécula desprotonada de

massa 234 u (Figura 5).

Figura 5. Espectro de massa de íons totais (full scan) da amostra F2A1.

Na região aromática do espectro de RMN de 1H de F2A1 (Figura 6) foi possível

observar um sinal de hidrogênio em δ 7,46 (1H, s) correlacionado com um carbono em δ

128,9 (HSQC, Figura 7) e coerente com um anel aromático pentassubstituído. Na região

alifática do espectro observaram-se: sinais de hidrogênios vinílicos sobrepostos em δ 5,50

(2H, m), correlacionados conforme experimento de HSQC a dois carbonos em δ 125,3 e

129,6; dois sinais metilênicos em δ 2,96 (2H, t, 7,45 Hz), correlacionado a um carbono em

δ 37,21 (HSQC), e em δ 2,36 (2H, m), correlacionado a um carbono em δ 27,53; três sinais

de metilas em δ 2,17 (3H, d, 0,7 Hz), 2,06 (3H, s) e 1,63 (3H, m), correlacionados aos

carbonos em δ 14,8, 6,5 e 16,6, respectivamente (HSQC).

O hidrogênio aromático em δ 7,46 apresenta correlação com o hidrogênio metílico

em δ 2,17 (COSY, Figura 8), correlações fortes com os carbonos em δ 14,8, 160,6 (C-OH),

161,2 (C-OH) e 204,4 (C=O) e correlações fracas com os carbonos quaternários em δ

110,4, 111,8 e 115,7 (HMBC, Figura 9). O hidrogênio em δ 2,17 está correlacionado a

longa distância com os carbonos em δ 115,7, 128,9 e 160,6. O hidrogênio metílico em δ

2,06 está correlacionado com os carbonos em δ 110,4, 160,6 e 161,2. O hidrogênio

metílico em δ 1,63 está correlacionado a um dos hidrogênios em δ 5,50 (COSY) e aos

carbonos em δ 129,5 e 125,3 (HMBC).

fracao_fat_a1_apci_pos_14_07_16 #544-550 RT: 10,70-10,81 AV: 7 NL: 2,42E3T: ITMS - c APCI corona Full ms [100,00-1000,00]

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

233,24

178,28

459,48 699,53283,41 939,63621,43 779,50502,59 821,53331,20

300

Figura 6 - Espectro de RMN de 1H da amostra F2A1(500 MHz, CD3OD).

Figura 7. Mapa de correlação HSQC da amostra F2A1 (J

1,

13C-

1H, 500 MHz, CD3OD).

O hidrogênio em δ 2,36 também está correlacionado a um dos hidrogênios em δ

5,50 e com o hidrogênio em δ 2,96 (COSY) e apresenta correlações fortes com os carbonos

em δ 125,3 e 129,5 e correlações fracas com os carbonos em δ 37,2 e 204,4. Finalmente o

hidrogênio em δ 2,96 correlaciona-se com os carbonos em δ 27,5, 129,5 e 204,4 (HMBC).

Comparando esses dados acima com os da literatura (Maskey et al., 2005; Tabela 1) foi

possível identificar a amostra F2A1 como sendo o sorbicilinóide 2’,3’-dihidrosorbicilina

2,3-dihidrosorbicillin_H1.esp

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Chemical Shift (ppm)

0

0.25

0.50

0.75

1.00

Norm

alize

d Inte

nsity

3.003.083.172.142.251.451.02

TMS

METHANOL-d4

Methanol

1.624

21.6

262

1.631

11.6

355

2.059

92.1

650

2.346

42.3

513

2.357

22.3

625

2.367

42.3

704

2.942

42.9

576

2.972

2

5.489

35.4

937

5.499

15.5

035

5.508

85.5

128

7.457

3


7.55 7.50 7.45 7.40 7.35 7.30


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.02

7.45

73


5.55 5.50 5.45 5.40 5.35 5.30


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Nor

mal

ized

Inte

nsity

1.45

5.48

935.49

375.

4991

5.50

355.

5088

5.51

28

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150F

1 C

hem

ical S

hift (p

pm

)

δ 7,46

δ 128,9

δ 5,50

δ 125,31

δ 129,51

δ 2,96

δ 37,2

δ 1,63δ 2,06δ 2,16δ 2,36

δ 27,5

δ 14,8

δ 6,50

δ 16,5

301

(Figura 10). Esta substância foi isolada anteriormente de espécies do gênero Verticillium,

Trichoderma e Penicillium e apresentou atividade citotóxica moderada contra várias

linhagens de células cancerígenas e fraca atividade contra bactérias Staphylococcus aureus

e Bacillus subtilis (Trifonov et al., 1983; Maskey et al., 2005; Lan et al., 2012).

Figura 8. Mapa de correlação COSY (

1H-

1H) (500 MHz, CD3OD) da amostra F2A1.

Figura 9 - Mapa de contorno HMBC (J

2-J

4,

1H-

13C, 500 MHz, CD3OD) da amostra F2A1.

O

CH3

OH

OH

CH3

CH3

H H

H

H

H

H

H

110,4

161,2

111,8

160,6

115,7

128,9

204,4

37,2

27,5

129,5

125,3

16,5

1,63

5,50

5,50

2,36

2,96

7,46

2,17

14,8

6,502,06

O

CH3

OH

OH

CH3

CH3

12

3

45

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

COSY

HMBC-correlações fortes

HMBC-correlações fracas

Figura 10 - 2',3'-dihydrosorbicilina e as correlações observadas para a amostra F2A1.

302

Tabela 1. Comparação dos dados de RMN da amostra F2A1 e da substância 2’,3’-

dihidrosorbicilina. Substância F2A1

1 2′,3′-Dihidrosorbicilina2

nº 1H δ (mult.; J

em Hz)

COSY

(1H-

1H)

HSQC

(1H-

13C)

HMBC (1H-

13C)

3 1

H δ (mult.; J em

Hz)

HSQC

(1H-

13C)

1' 204,4 207,3

2' 2,96 (2H; t; 7,5) 2,36 37,2 27,5; 129,5; 204,4 3,02 (2H; t; 7,2) 39,2

3' 2,36 (2H; m) 2,96; 5,50 27,5 125,3; 129,5;

37,2; 204,4

2,37 (2H; m) 28,5

4', 5' 5,5 (2H; m) 2,26; 1,63 129,5;

125,3

27,5 5,49 (2H; m) 130,8;

127,0

6' 1,63 (3H; m) 5,5 16,5 125,3; 129,5 1,63 (3H; m) 18,0

1 111,8 117,3

2-OH 161,2 161,4

3 110,4 122,8

3-CH3 2,06 (3H; s) 6,5 110,4; 160,6;

161,2

2,24 (3H; s) 10,3

4-OH 160,6 156,6

5 115,7 124,6

5-CH3 2,17 (3H; d;

0,7)

7,46 14,8 115,7; 128,9;

160,6

2,35 (3H; d; 0,8) 17,2

6 7,46 (1H; s) 2,17 128,9 14,8; 160,6;

161,2; 204,4;

110,4; 111,8;

115,7

7,56 (1H; s) 130,0

1 Espectrômetro BRUKER AVANCE III HD (500 MHz em MeOD); 2 Espectrômetro AMX 300 (300.135 MHz em MeOD), (Maskey et al., 2005); 3 Valores em negrito indicam correlações fortes;

Conclusões

As análises do perfil químico indicaram a presença de monômeros, dímeros e

trímeros de substâncias da família dos sorbicilinoides na composição dos extratos e frações

de P. chrysogenum.

Na segunda fração foi encontrada a substância 2’,3’-dihidrosorbicilina, um dos

monômeros do perfil químico, justificando a continuidade do estudo dos sorbicilinoides

produzidos pela linhagem de P. chrysogenum.

Agradecimentos

À CAPES pela bolsa e pelo financiamento através do projeto Pró-Amazônia; FINEP;

Central Analítica da UFAM.

303

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305


Diferenciação genética entre as formas homotálicas e heterotálicas de

Fusarium decemcellulare por meio de marcadores moleculares

Sousa T.F.1, Queiroz C.A.de.

2, Sousa S.B.de

2, Silva G.F.

4

1Universidade do Estado do Amazonas – UEA;

2Universidade Federal do Amazonas –UFAM;

3Embrapa Amazônia Ocidental, Laboratório de Biologia Molecular. [email protected]

Resumo

Fusarium decemcellulare já foi reportado em mais de 80 diferentes espécies

vegetais em regiões tropicais e subtropicais, sendo identificadas quanto à reprodução

sexuada em: homotálico (autofértil) e heterotálico. As diferenças filogenéticas e no número

de ascósporos formados entre homotálicos e heterotálicos indicam a possível ocorrência de

um complexo de espécies. Contudo, até o momento as principais formas de diferenciação

estão relacionadas a uma laboriosa caracterização do número de ascósporos ou

identificação molecular de sistema de mating type. Deste modo, este trabalho teve como

objetivo avaliar a habilidade dos marcadores moleculares ISSR e ERIC-PCR em

diferenciar as formas homotálicas e heterotálicas. Foram analisados 20 isolados, sendo 10

heterotálicos e 10 homotálicos com base em três marcadores ISSR que geraram 109 loci

polimórficos e ERIC-PCR com 41. Quando comparados com ambos marcadores, a análise

de variância molecular (AMOVA) indica que a maior variação ocorre dentro (75%) do que

entre os grupos (25%). Embora os dois marcadores apresentem elevado grau de

polimorfismo, o marcador ERIC-PCR foi mais eficaz em separar essas duas populações.

Palavras chave: Diferenciação genética, mating-type, ISSR, ERIC-PCR.

Introdução

De ocorrência em regiões tropicais e subtropicais, F. decemcellulare já foi

reportado em espécies de importância econômica como Mangifera indica (manga),

Theobroma cacao (cacau) e Piper nigrum (pimenta-do-reino). Em Paullinia cupana var.

sorbilis (Mart.) Ducke (guaranazeiro) é o agente causal do superbrotamento que pode

provocar perdas de até 100% da produção de guaraná. A crescente incidência da doença no

estado do Amazonas vem se tornando um sério problema, contribuindo para a baixa

produtividade da cultura (Leslie, Summerell, 2006; Araújo et al., 2007).

O sistema de mating-type em F. decemcellulare consiste de um locus MAT e dois

idiomorfos, MAT-1 e MAT-2, sequências não relacionadas presentes na mesma posição do

cromossomo. Os indivíduos que apresentam somente MAT-1 ou MAT-2 são chamados de

heterotálicos, já os que apresentam os dois no mesmo genoma são denominados de


306

homotálicos. A existência desses idiomorfos sugere que a reprodução de F. decemcellulare

pode ser mista (sexuada e assexuada). No que concerne à reprodução sexuada, a forma

homotálica é capaz de fazer autofecundação, enquanto que na forma heterotálica o

cruzamento é feito somente por meio de encontro entre isolados que possuem mating-types

distintos, tendo como consequência o aumento da diversidade genética da população

(Alexander, Carmichael, 1973; Ferreira, 2005; Leslie, Summerell, 2006, Guimarães, 2013).

A diferença na patogenicidade entre os isolados homotálicos e heterotálicos foi

relatada por Ford et al. (1967) e Thomas e Snyder (1970), que usando isolados de

cacaueiro, observaram que a forma homotálica não causa doença, diferentemente da

heterotálica.

Guimarães (2013), com base em sequências parciais dos genes tef-1α, rpb2, acl1 e

da região ITS-LSU de isolados obtidos de sintomas como galha-floral e superbrotamento

de mangueira, cacaueiro, espatódea, pimenta-do-reino, guaranazeiro e de substratos como

serapilheira e solo, mostrou a ocorrência de duas espécies filogenéticas uma homotálica e

outra heterotálica, indicando a existência de um complexo de espécies em F.

decemcellulare.

Este trabalho utilizou os marcadores ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) e ERIC-

PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), caracterizado como pequenas

unidades repetitivas de 127 pb contendo região central altamente conservada com

repetições invertidas de 40 pb (Hulto et al., 1991). O uso de ambas as técnicas em F.

decemcellulare permitiu identificar variações dentro e entre as formas homotálicas e

heterotálicas, contribuindo assim para um maior entendimento da genética e evolução entre

os dois grupos.

Material e Métodos

Foram utilizados 20 isolados de F. decemcellulare, sendo 10 homotálicos e 10

heterotálicos oriundos de diferentes locais de coleta e hospedeiros (Tabela 1).

Os isolados monospóricos foram repicados e colocados em frascos com 50 mL de

meio de cultura BD (batata, dextrose) sob agitação 125 rpm e temperatura de 25 °C por

quatro dias para obtenção de massa micelial, que foi filtrada e seca para posterior extração

de ácido nucléico. A extração do DNA foi realizada usando protocolo de extração com o

detergente catiônico CTAB 2% (Doyle e Doyle, 1987).

Foram utilizados dois marcadores moleculares para analisar a variação genética

entre isolados homotálicos e heterotálicos de F. decemcellulare. Para o marcador

307

molecular ERIC-PCR foram utilizados os primers ERIC 1R e ERIC2 conforme descrito

por Queiroz et al (2016) e para o marcador ISSR os primers utilizados foram UBC836,

UBC 840 e UBC 842 (Tabela 2). As reações de PCR foram realizadas com volume de

20µL, utilizando 50 ng de DNA; tampão 1X com 1,5 mM de MgCl2; 0,5mM de dNTPs;

1U de Taq DNA Polimerase e 0,25 µM de primer. As condições para amplificação foram:

desnaturação inicial a 94 ºC por 3 min, 40 ciclos de 94 ºC por 30 seg.; a temperatura de

anelamento variou de acordo com o primer utilizado (Tabela 2), extensão de 72 ºC por 2

min, seguido pela extensão final de 72ºC por 10 minutos.

Tabela 1. Lista de isolados de Fusarium decemcellulare de acordo com mating-type, local

de coleta e hospedeiro ou substrato

CML: Coleção Micológica de Lavras, NRRL: National Center for Agricultural Utilization Reseach

(USDA), FDC: Coleção de Fusarium decemcellulare da Embrapa Amazônia Ocidental, Ho: homotálicos, Mat 1: mating 1 e Mat 2: mating 2

Os dados foram analisados usando uma matriz binária, onde (1) indica a presença e

(0) a ausência do produto da amplificação para ambos marcadores aqui chamados de loci

ou bandas. A percentagem de loci polimórficos foi calculada de acordo com a fórmula: %

de bandas polimórficas = número de bandas polimórficas/ número total de bandas x 100%.

A estrutura genética dos isolados de F. decemcellulare foi avaliada por análises da

dispersão e agrupamentos dos acessos. A Análise de Coordenadas Principais (PCoA) foi

realizada usando o GenAlex 6.5 (Peakall e Smouse, 2012). Para a análise da

ISOLADO MATING-TYPE LOCALIDADE SUBSTRATO

CML 0038

CML 0800

CML 2241

CML 2245

CML 2246

CML 2248

CML 2249

CML 2250

CML 2370

NRRL 13412

FDC 200

FDC 193

FDC 307

FDC 272

CML 2251

CML 2271

CML 2255

CML 2332

CML 2409

FDC 356

Ho Ho

Ho

Ho Ho

Ho

Ho

Ho Ho

Ho

Mat 2 Mat 2

Mat 1

Mat 1

Mat 1 Mat 1

Mat 2

Mat 2 Mat 1

Mat 2

Belém/PA Marrocos

Uruçuca/Bahia

Lavras/MG Lavras/MG

Santo Amaro/BA

Bahia

Bahia Igrapiúma/BA

República Dominicana

Maués/AM Maués/AM

Urucará/AM

Itapiranga/AM

Ponta Grossa/AM Tecoman, México

Uricurituba/AM

Ilhéus/BA Manaus/AM

Rio Preto da Eva

Solo Nd

Galha floral/Cacaueiro

Spathodea campanulata/ Espatódea Spathodea campanulata/ Espatódea

Theobroma cacao

Piper nigrum/ Pimenta-do-reino

Piper nigrum/ Pimenta-do-reino Serra pilheira

Cafeeiro

Paullinia cupana Paullinia cupana

Paullinia cupana

Paullinia cupana

Theobroma cacao Mangifera indica

Mangifera indica

Theobroma cacao Paullinia cupana

Paullinia cupana

308

dissimilaridade foi utilizado o programa DARwin 6 (Perrier e Jacquemoud-Collet, 2006)

utilizando o coeficiente de similaridade de jaccard pelo método Neighbor-joining.


Dos 20 isolados de F. decemcellulare analisados com base em ERIC-PCR, foram

obtidas um total de 41 loci sendo todos polimórficos (Tabela 2). No entanto, quando

analisada a porcentagem de loci polimórficos entre heterotálicos e homotálicos foi obtido

uma porcentagem de 85,37 e 75,61%, respectivamente.

Tabela 2. Lista dos primers de ERIC-PCR e ISSR utilizados para avaliar a diversidade de

isolados homotálicos e heterotálicos de Fusarium decemcellulare.

PRIMER SEQUÊNCIA TM N° %

ERIC 1R

ERIC 2

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG

48°C 41 100

UBC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 55°C 52 100

UBC 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 49°C 28 100

UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 53°C 29 96,5

TM: temperatura de anelamento; N°: Número de bandas; % polimorfismo

O marcador ERIC-PCR foi eficaz em separar os isolados homotálicos dos

heterotálicos (Figura 1), onde a relação entre os isolados das formas homotálicas tiveram

resultado similar ao da análise filogenética realizada por Guimarães (2013). A relação

entre os 20 isolados foi comparado pela análise das coordenadas principais (PCoA) (Figura

2) onde foi possível notar que a dispersão dos isolados corroborou com os grupos

identificados pelo dendrograma utilizando o algoritmo de Neighbor-joining.

A diferenciação genética entre as populações foi analisada pela AMOVA e a

variância dentro de cada grupo apresentou 75% da variação total, enquanto que 25% da

variação foi observada entre homotálicos e heterotálicos.

309

Figura 1. Dendrograma com base na técnica de ERIC-PCR obtido por meio do algoritmo

Neighbor-joining dos isolados de Fusarium decemcellulare, homotálicos em azul

e heterotálicos em vermelho.

Figura 2. Análise de coordenadas principais (PCoA) mostrando a distribuição com base na

variação genética de 41 loci obtidos com o marcador ERIC-PCR em F. decemcellulare. As cores dos pontos correspondem às linhagens P1= homotálicas (azul) e P2= heterotálicas (vermelho).

PC

oA

2

PCoA 1

PCoA

P1P2

310

Com base nos três marcadores ISSR foram obtidos 109 loci. O primer UBC 842 foi

o único com 1 lócus monomórfico dos 29 gerados e apresentou 96,5% de polimorfismo,

enquanto que os demais 100% dos loci foram polimórficos (Tabela 2).

Assim como o marcador ERIC-PCR, a análise da AMOVA, com base no marcador

ISSR, mostrou maior variação dentro dos grupos (88%) que entre as formas homotálicas e

heterotálicas (12%).

Os isolados heterotálicos mostram uma porcentagem de loci polimórficos de

87,16% em relação aos homotálicos 80,73%. Apesar dessa alta porcentagem de

polimorfismos, quando comparadas pela análise das coordenadas principais (PCoA) não

foi possível notar um agrupamento formado apenas por homotálicos ou heterotálicos, da

mesma forma que não foi possível observar no dendrograma separação entre os dois

grupos (Figura 3).

A separação das duas populações pelo marcador molecular ERIC-PCR em

contraposição ao marcador ISSR pode ter ocorrido pelo fato de que as regiões entre os

microssatélites onde os marcadores ISSR amplificam, são regiões que apresentam alto grau

de evolução genética, sendo menos conservadas entre as formas homotálicas e

heterotálicas. Já as regiões amplificadas pelo marcador ERIC, caracterizado como

pequenas unidades repetitivas de 127 pb com repetições invertidas de 40 pb (Hulton et al.,

1991) são regiões mais conservadas, e permitiu uma melhor análise evolutiva entre dos

dois grupos.

Figura 3. Dendrograma obtido com base no marcador molecular ISSR usando o algoritmo de

Neighbor-joining em Fusarium decemcellulare. Em vermelho isolados heterotálicos e em

azul homotálicos.

311

Conclusão

Com base nos resultados é possível sugerir que apesar dos dois marcadores

apresentarem alto grau de polimorfismo em F. decemcellulare, o marcador ERIC-PCR foi

mais eficaz em separar os isolados homotálicos e heterotálicos.

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312



Avaliação de consórcios de fungos amazônicos (Trametes lactinea e

Hexagonia glabra) contra as bactérias Escherichia coli, Staphylococcus

aureus e Proteus vulgaris

Carvalho W.O.

1, Fonseca N.F.

2 , Silva J.R

3.

1

Especializando em Micorobiologia Geral, Escola Superior Batista do Amazonas,2Graduada em

Licenciatura em Ciências Biológicas, Universidade do Estado do Amazonas, 3Especializando em

Biologia Celular e Molecular, Universidade Cândido Mendes. Emails: [email protected], [email protected] , [email protected]

Resumo

A Região Amazônica abriga numerosas formas de vida com grande potencial

biotecnológico, dentre estes, estão os fungos que são produtores de metabólitos de

interesse industrial. Portanto dentre estes cabe conhecer a atividade antimicrobiana do

Trametes lactineae e Hexagonia glabra e sua possível interação sinergética, possibilitando

assim alternativas viáveis na busca de novas substâncias antimicrobianas. A Coleta foi

realizada no município de Tefé-AM. Os basidiocarpos foram desidratados á 350C por 24

horas, utilizou-se 0,4 µg do extrato bruto, diluiu-se em 20µl de DMSO, posteriormente

acrescido 1,96 mL de água destilada. As cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus

e Proteus vulgaris foram semeadas nas placas de Petri contendo meio Mueller Hinton. O

experimento foi realizado em triplicata, utilizou-se a técnica de difusão de discos de ± 0,5

cm sendo usado 4 discos por placa. De modo geral, todos microrganismos foram sensíveis

aos metabólitos produzidos pelos fungos Trametes lactinea e hexagonia glabra. Cabe

ressaltar que houve interação sinergética entre os extratos avaliados, potencializado em

mais de 100% de atividade contra o microrganismo Proteus vulgaris.

Palavras–chave: Fungos, microrganismos, metabólitos , Antimicrobiano.

Introdução

A Região Amazônica abriga numerosas formas de vida com grande potencial

biotecnológico, em grande parte ainda desconhecido pela ciência. Tal fato mostra a

extrema relevância do estudo da aplicabilidade das espécies encontradas na região a fim de

desenvolver produtos com a finalidade de satisfazer as necessidades presente, sem

comprometer a capacidade das gerações futuras (Petrini, 1991).

Dentre essas formas de vida encontram-se os fungos, que tem um papel essencial

nos ecossistemas terrestres na decomposição de matérias orgânicas, na liberação de

313

nutrientes e dando suporte à vida da planta através da associação simbiótica com as raízes

de aproximadamente 80% de todas as espécies de plantas terrestres (Vander Heijdenv et

al., 1998).

Muitos fungos secretam enzimas no substrato onde se encontram e absorvem as

moléculas resultantes da ação dessas enzimas (Putzke e Putzke, 2002). Devido a esta

grande versatilidade, os fungos vêm sendo estudados, principalmente quanto à sua

aplicabilidade biotecnológica (Esposito e Azevedo, 2004; Azevedo et al., 2009).

Muitos dos antibióticos utilizados para o tratamento de doenças foram extraídos a

partir de fungos, como exemplo da Penicilina, substância produzida pelo fungo Penicilium

notatum, descoberta por Alexander Fleming em 1928 (Alexopoulos, 1996).

A descoberta dos antibióticos revolucionou a medicina, permitindo o tratamento de

infecções que até então eram fatais. A sua disponibilidade tem criado segurança para a

população em relação a doenças infecciosas adquiridas na comunidade (Pereira, 2004).

Apesar da redução na mortalidade pelas doenças infecciosas e da diminuição

significativa na morbidade por um conjunto importante dessas doenças, ao mesmo tempo,

em outra direção, configura-se, no Brasil, um quadro que, além de expor as frágeis

estruturas ambientais urbanas, que tornam as populações vulneráveis a doenças que

pareciam superadas, amplia a alta carga de doenças da população (Brasil, 2010).

Muitos estudos têm mostrado que a frequência de isolados multi-resistentes está

aumentando no mundo, com a resistência desenvolvendo-se para quase todas as classes de

antibióticos, tanto naturais como sintéticos (Walsh, 2003; Projan e Shlaes, 2004).

A Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa considerada a principal

representante dos patógenos termotolerantes, sendo isolado do sistema gastrointestinal dos

seres humanos e animais. Esta espécie pode causar diarréias, infecções urinárias,

septicemias e meningites (Analytica, 2012).

A espécie Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo que apresenta arranjos

em cachos e é isolada principalmente nas narinas, pele de aproximadamente 15% dos seres

humanos e de animais, estando envolvida em lesões de pele, formação de abscessos e

septicemias (Analytica, 2012).

A Proteus vulgaris é uma bactéria Gram negativa sendo um dos agentes envolvidos

em infecções urinárias. A infecção sintomática do trato urinário (ITU) situa-se entre as

mais freqüentes infecções bacterianas do ser humano, figurando como a segunda infecção

mais comum na população em geral (Avilla, 2005).

314

Um fato preocupante sobre esses microrganismos consiste na prevalência de

Staphyloccocus aureus resistente a meticilina permanecer extremamente elevada em

muitos países (Bax et al., 2000; Bush, 2004; Butler e Buss, 2006). Entretanto, um fato que

têm recebido pouca atenção, porém não menos importante, é o aumento destas bactérias na

comunidade, que acaba tornando-se um importante reservatório para a resistência a

antimicrobianos (Furuya e Lowy, 2006).

Portanto, dada a relevância e a busca por antimicrobianos novos é que foi avaliada

a atividade antimicrobiana dos extratos oriundos das cepas amazônicas dos fungos

Trametes lactinea e Hexagonia glabra e seu possível efeito sinergético entre frações 1:1

dos extratos e quantificados contra a Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus

vulgaris, por serem estes microrganismos, dentre vários outros, frequentemente isolados

em infecções que apresentam elevada resistência aos antimicrobianos.

Material e Métodos

A presente pesquisa foi desenvolvida no Município de Tefé no estado do Amazonas

no perímetro rural do município de Tefé-AM, na estrada da EMADE. Durante o período da

pesquisa, o município de Tefé segundo os dados do IBGE de 2010 contava com 61.453

habitantes.

As coletas dos basidiocarpos foram realizadas durante o período de verão nos

meses de julho a agosto de 2012, tendo duração de 7 dias, sendo levados para o laboratório

de Biologia no Centro de Estudos Superiores de Tefé (CEST/UEA), onde foram

preparados os extratos e o bioensaio para verificar seu efeito contra os microrganismos

(Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris) .

Foi utilizado como solvente, álcool 70 % para a retirada dos componentes bioativos

presente nos basidiocarpos. Após a coleta, o material foi selecionado e desidratado à

temperatura de 350

C na estufa por 24 horas, sendo posteriormente triturado em

liquidificador industrial e passado em peneira de 60 mesh.

Para cada 30 gramas do material biológico triturado foram acrescidos 250 mL do

solvente e deixado em repouso por um período de 72 h em um recipiente âmbar, para

evitar possíveis reações com a luz. Os extratos obtidos foram concentrados em fluxo

forçado em capela de exaustão em temperatura de 28 – 30º C, até se obter um concentrado.

Essa metodologia foi descrita pela primeira vez por Smânia (2003).

315

Para avaliar o possível efeito sinergético entre os extratos, foi associada uma fração

de 1:1, ou seja, 1 mL do extrato obtido a partir dos basidiocarpos de Trametes lactineae e

1 mL do extrato da Hexagonia glabra, ambos obtidos a partir da técnica de extração a frio .

As diluições dos extratos foram de 0,4 µg para ambos e diluídos em 20 µL de

Dimetil Sulfóxido (DMSO), posteriormente acrescentando 1,96 mL de água destilada.

As cepas bacteriológicas foram cedidas pelo laboratório de microbiologia da UEA-

MBT (Universidade do Estado do Amazonas – MBT- Mestrado em Biotecnologia) e pelo

LACEA Laboratório de Análises Clinica Especialista do Amazonas .

Os microrganismos foram semeados em tubos de ensaios contendo meio nutriente

(NA) (glicose, peptona e caldo de carne), para o crescimento e mantidas em estufa a 37 0C

por 24 h. Após o crescimento das bactérias, o inóculo foi ajustado a partir da escala de

Mac Farland, utilizando-se o tubo 0,5 da mesma concentração padrão, o que equivale a

1,5x108 bactérias/mL.

As cepas de Escherichia colli, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris, foram

semeadas nas placas de Petri contendo meio nutriente Mueller Hinton.

Os testes dos bioensaios produzidos a partir dos extratos das cepas amazônicas e de

seus consórcios foram realizados em triplicatas contra os microrganismos patogênicos

semeados nas placas de petri, sendo que para cada placa de petri utilizou-se um grupo

controle para a detecção da sensibilidade dos microrganismos frente ao potencial

antimicrobiano dos bioensaios.


As bactérias foram sensíveis ao extrato de Trametes lactinea na concentração

testada. Para as cepas de Proteus vulgaris (Tabela 1), foram observados halos de inibição

com uma média de 3,3 mm, resultado este semelhante ao obtido por Felício (2011).

Contra S. aureus (Tabela 1) observou-se uma inibição média de 7,2 mm. Valor

semelhante foi também obtido por Felício (2011) para o mesmo microrganismo, que

visualizou um halo inibição de 14 mm.

A maior sensibilidade ocorreu com a bactéria Gram-negativa Escherichia coli, cujo

halo de inibição foi de 13,5 mm. Felício (2011) obteve resultado semelhante para uma cepa

de E. coli, observando um halo de 16mm de inibição.

316

Ao se analisar o extrato da Hexagonia glabra (Tabela 1), observou-se resultados

menores daqueles obtidos com T. lactinea. Seu extrato mostrou um halo de inibição de 3,8

mm contra S. aureus, 4,5 mm contra E. coli e 3,8 mm contra P. vulgaris.

A atividade de inibição observada no presente trabalho provavelmente se deve à

presença de substâncias fenólicas que possuem capacidade de complexar-se a proteínas

extracelulares da membrana bacteriana, provocando sua morte (Cowan, 1999). Estudos

anteriores demonstraram que várias bactérias são sensíveis a taninos, dentre elas,

Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracise, Shigella

adysenteriae (Monteiro et al., 2005).

Tabela 1. Halos de inibição de diferentes extratos a frio de cepas Amazônicas contra as

bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coll, e Proteus vulgaris.

Amostras S. aureus E.coli P. vulgaris

----------------------- mm ---------------------------

Trametes lactinea 7,2 ± 2,5 13,5 ± 1,9 3,3 ± 0,9

Hexagonia glabra 3,8 ± 1,1 4,5 ± 0,9 2,8 ± 0,3

Consórcio das duas amostras 7,8 ± 1,7 11,8 ± 2,1 9,2 ± 2,4

Obs.: Os valores representam a média e o desvio-padrão de triplicatas dos halos de inibição.

O consórcio das cepas Trametes lactinea e Hexagonia glabra não foi tão eficiente

para Escherichia coli (Tabela 1) quando comparado com o extrato apenas de T. lactinea.

Essa resistência pode ter ocorrido devido microrganismos Gram-negativos como a

Escherichia coli possuírem duas membranas, uma na face externa da parede celular e outra

na face interna. Assim drogas com baixa lipossolubilidade têm maior dificuldade em agir

sobre as bactérias Gram-negativas por causa da membrana externa (Hashimoto et al., 1997;

Ferreira, 2010).

O consórcio das cepas Trametes lactinea e hexagonia glabra mostrou-se mais

eficiente contra a Staphylococcus aureus e P. vulgaris pois os halos de inibição foram

maiores do que quando usados os extratos dos dois microrganismos separadamente (Tabela

1). O efeito foi mais significativo contra P. vulgaris, mas discreto contra S. aureus.

Este discreto aumento no halo de inibição pode estar relacionado com uma possível

interação dos metabólitos produzidos pelos fungos Trametes lactinea e Hexagonia glabra

317

e até mesmo pela Staphylococcus aureus ser uma bactéria Gram-positiva, o que dificulta a

ação do bioensaio testado frente a membrana celular (Tabela 1). Da mesma maneira, pode

ter ocorrido uma interação entre alguns dos metabólitos dos fungos o que proporcionou

uma sensibilidade maior da cepa de Proteus vulgaris (Tabela 1) observada pelo aumento

do halo de inibição em 100% em relação ao extrato individual dos fungos Trametes

lactinea e Hexagonia glabra. Efeito sinergético também foi observado por Coutinho et al.

(2010) entre o extrato alcoólico de Eugenia uniflora e o antibiótico gentamicina contra

duas linhagens de Escherichia coli (EC 27 e ATCC 8539) numa concentração inibitória ≥

1.02µg/mL.

Para o grupo controle dos extratos analisados individualmente e de seus consórcios,

as cepas de microrganismos cresceram normalmente não ocorrendo formação de halo de

inibição, evidenciando o potencial antimicrobiano dos extratos de ambos os fungos e de

seus consórcios no crescimento das bactérias testadas (Figura 01).

Figura 1. Atividade antimicrobiana do extrato a frio do

consorcio das cepas de fungos amazônicos Trametes lactinea e

hexagonia glabra contra a bactéria Proteus vulgaris.

Apesar dos resultados favoráveis, a presente pesquisa mostrou algumas lacunas que

devem ser contempladas para o entendimento melhor do processo de consórcios, como por

exemplo o fracionamento dos extratos, para determinar quais metabólitos estão sendo

eficientes na sensibilidade dos microrganismos e a determinação da concentração mínima

inibitória (CIM). Cabe ainda avaliar sua possível ação sinergética entre os consórcios para

então otimizar de maneira mais eficiente sua ação. Outro ponto a ser contemplado é o uso

de solventes de diferentes gradientes de polaridades e diferentes técnicas de extração destes

metabólitos. Isso na possibilidade futura de se formular um produto final.

Grupo controle

318

Conclusões

As bactérias testadas foram sensíveis aos metabólitos produzidos pelos fungos

Trametes lactinea e Hexagonia glabra;

O extrato obtido da cepa Amazônica Trametes lactinea, apresentou melhor

resultado de inibição para Escherichia coli;

O extrato do consorcio dos fungos potencializou o efeito antimicrobiano contra a

Proteus vulgaris.

Referências

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320



Avaliação de métodos de extração de DNA genômico para fungos

dermatófitos

Grisolia M.E.

1, Alves, G. S. B.

2, Cruz, K. S.

3, Jackisch-Matsuura, A. B.

4

1Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Condições de Vida e Situações de Saúde na

Amazônia - ILMD/Fiocruz. 2Bolsista DCTA no Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz).

3Pesquisadora em Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-

HVD). 4Pesquisadora no Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz). E-mails:

[email protected],

[email protected].

Resumo

Desde o advento da Biologia Molecular, cada vez mais métodos estão sendo empregados

nas diversas áreas de estudos em dermatofitose, os quais se mostram cada vez mais

necessários para um diagnóstico preciso nos estudos de epidemiologia molecular e

biodiversidade de dermatófitos. Para que as técnicas em biologia molecular sejam

empregadas com êxito, é necessário uma obtenção eficiente de ácidos nucleicos, onde o

presente estudo objetivou uma investigação sobre qual o melhor e quais modificações

deveriam ser feitas para se alcançar um método de extração eficiente, em quantificação,

pureza e amplificação da região ITS em PCR para dermatófitos. Utilizando três métodos de

extração de DNA genômico, Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado, Blood & Tissue kit

Qiagen e Mini Kit Qiagen Dneasy Plant, e analisando concentração e a relação A260/280,

foi possível concluir que a modificação na quebra e lise celular do micélio proporcionou

um melhor resultado quanto à concentração de DNA obtido. E, o método de Ferreira e

Grattapaglia (1998) com modificações se mostrou o melhor para extração de ácidos

nucleicos dos dermatófitos testados.

Palavras-chave: Extração de ácidos nucleicos, Reação da polimerase em cadeia,

Dermatófito.

Introdução

Os dermatófitos são fungos com a capacidade de invadir os tecidos queratinizados,

principalmente de mamíferos, causando uma infecção cutânea chamada dermatofitose, que

é comum por todo o mundo, e com grande importância para a saúde pública e veterinária

(Cafarchia et al., 2013; De Baere et al., 2010).

Dentre os parâmetros de diagnóstico aplicados aos dermatófitos, os principais

foram características clínicas de culturas e morfologia de conídios, ainda utilizados, apesar

das variações conhecidas e pleomorfismo (culturas podem mudar drasticamente após

321

algumas transferências em meio de cultura em laboratório). No entanto, a identificação por

técnicas moleculares (de fingerprinting e tecnologias de sequenciamento) mostraram-se

essenciais para o diagnóstico, além de contribuírem significativamente para a compreensão

da biodiversidade de dermatófitos (Cafarchia et al., 2013; Gräser et al., 1999).

Um método eficiente de extração de DNA genômico é necessário para dar

prosseguimento às técnicas moleculares a serem empregadas. A extração de DNA em

métodos convencionais consiste nas etapas de lise celular, purificação e precipitação. Os

kits comerciais se baseiam nessas etapas, mas com diferenças nas etapas de purificação e

precipitação do DNA, utilizando em sua maioria, colunas de sílica (Caldart et al., 2011).

Nosso grupo de pesquisa do ILMD/FIOCRUZ, que trabalha com fungos

patogênicos na Amazônia, utiliza o método de extração em kit da Qiagen (Blood & Tissue)

para as espécies de Candida e Cryptococcus. No entanto, para dermatófitos o método não

se mostrava eficiente e foi feita uma investigação sobre qual o melhor e quais modificações

deveriam ser feitas para se alcançar um método de extração eficiente, em quantificação,

pureza e amplificação da região ITS em PCR (região utilizada para estudos de

identificação) para dermatófitos.

Material e Métodos

Foram utilizadas nove amostras de dermatófitos, três da espécie Microsporum canis,

um Microsporum gypseum e cinco Trichophyton rubrum, para a análise de três protocolos

de extração, Ferreira & Grattapaglia (1998) modificado, kit Qiagen Blood & Tissue e Mini

kit Qiagen Dneasy Plant.

Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado

Na etapa de trituração do micélio foram utilizadas nove culturas puras de dermatófitos

com tempo de crescimento entre sete e 14 dias em meio de cultura Agar Sabouraud. As

culturas foram removidas do meio de cultura e acondicionadas em papel filtro a -80

ºC/30min. Após o congelamento, o micélio foi transferido para um microtubo de 2mL

junto de beads de aço inox e congelado em Nitrogênio líquido (N2) por um tempo de

exposição de 15 segundos. Em seguida foi mantido sob agitação vigorosa em Tissuelyser

programado com 50 oscilações/min durante cinco minutos. Ao se obter um pó fino do

micélio, seguiu-se para a etapa de obtenção e purificação do DNA. Na etapa de obtenção e

purificação do DNA, foram utilizados 200mg do micélio em pó e 800µL de Tampão de

lise (NaCl 1,4M; Tris-HCl 100mM, pH8,0; CTAB 4%; β-mercaptoetanol 1,5%). Após a

322

homogeneização em vórtex, adicionou-se 20µL de Proteinase K, e foi incubado a -56

ºC/overnight. Depois do tempo de incubação, foi adicionado CIA (Clorofómio-álcool

isoamílico, 24:1) misturado por inversão 20 vezes, seguindo com uma centrifugação a

12000 rpm por cinco minutos. A fase aquosa foi transferida para um microtubo de 1,5 mL,

onde adicionou-se Isopropanol gelado e misturou-se por inversões suaves, e o DNA foi

precipitado durante a incubação a -20ºC/1h. Após a precipitação do DNA, centrifugou-se a

14000rpm por cinco minutos, descartou-se o sobrenadante e o pellet foi lavado com 500

µL de Etanol 70 % gelado. Após uma centrifugação a 14000 rpm por cinco minutos, o

sobrenadante foi descartado e o pellet foi seco à temperatura ambiente, quando foram

adicionados 100 µL de Tampão de eluição (Tris-HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 1mM, pH 8,0)

e incubou-se a 37ºC por 30min.

Kit Qiagen Blood & Tissue e Mini Kit Qiagen Dneasy Plant

Foram utilizados os protocolos descritos nos respectivos Manuais de cada kit. Mas foi

feita uma modificação no início do protocolo, utilizando os mesmos passos de quebra e lise

celular do micélio utilizado no protocolo de Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado,

onde foram usados 200 µL do micélio em solução com tampão de lise (NaCl 1,4M; Tris-

HCl 100mM, pH8,0; CTAB 4%; β-mercaptoetanol 1,5%) e proteinase K. Seguiu-se com as

instruções recomendadas nos Manuais da Qiagen do kit Blood & Tissue e Dneasy Mini Kit

Plant, partindo da adição de 200 µL de Etanol (96%-100%) e do Tampão P3 (130μL)

respectivamente.

Reação da polimerase em cadeia (PCR) da região ITS

Para a reação de amplificação da região ITS, as concentrações de DNA foram diluídas

em tampão de eluição de DNA (Tris-HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 1mM, pH 8,0) para uma

concentração de 7,5 ng/μL, massa total de DNA de 15 ng em 25 μL de volume de PCR. As

condições utilizadas foram de 95ºC por dois minutos, 95ºC por 30 segundos, 35 ciclos em

55ºC por 40 segundos e 72ºC por 45 segundos, com uma extensão de 10 minutos em 72ºC.


Com o auxílio do BioDrop™, pode-se estimar a concentração de DNA obtido em 100

μL de Tampão de Eluição (em cada método de extração foi utilizado seu próprio tampão de

323

eluição), e também o grau de pureza do DNA obtido, utilizando os parâmetros de relação

de A260/280 entre 1,8 e 2,0 (Wilfinger et al., 1997).

Com base na concentração e pureza estimados, o método de extração de DNA do kit

Qiagen Blood & Tissue apresentou uma média de 19,9 ng/μL de DNA em 100 μL de

tampão de eluição, e média de pureza em 2,0 de absorbância na relação 260/280. O método

Mini Kit Qiagen Dneasy Plant apresentou média de concentração 5,1 ng/μL e pureza em

1,9 na relação 260/280, e o método Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado apresentou

média de concentração 39,1 ng/μL e pureza em 1,9 na relação 260/280 (Tabela 1).

Tabela 6 - Resultados de concentração, pureza e amplificação de DNA obtidos para cada

amostra relacionado com o método de extração de DNA utilizado.

Legenda: (a) Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado; (b) método kit Qiagen Blood &Tissue; e (c) método

Mini kit Qiagen Dneasy Plant.

EspécieMétodo de

extração

Pureza

(A260/A280)[DNA] ng/µl

Amplificação ITS

em PCR

(a) 1,5 149,6 Sim

(b) 1,9 41,4 Não

(c) 2 8,7 Não

(a) 2 28 Não

(b) 2,1 37,5 Sim

(c) 1,9 7,2 Sim

(a) 1,8 3,8 Sim

(b) 2 5,3 Não

(c) 1,9 1,3 Não

(a) 2 16 Não

(b) 2 23,6 Não

(c) 1,9 6,8 Sim

(a) 2 46,1 Sim

(b) 2 15 Não

(c) 2 6,8 Não

(a) 2 93,7 Não

(b) 2 17 Não

(c) 1,9 5,3 Sim

(a) 1,8 5,6 Sim

(b) 2 15,9 Não

(c) 1,9 6,7 Não

(a) 1,8 4,4 Sim

(b) 2 15,1 Não

(c) 1,7 1,5 Não

(a) 1,8 4,4 Não

(b) 2 8,1 Não

(c) 1,8 1,3 Não

Trichophyton rubrum

(1714 M)

Trichophyton rubrum

(179 S)

Trichophyton rubrum

(325 S)

Microsporum gypseum

(107 M)

Microsporum canis

(1080 M)

Microsporum canis

(126 M)

Microsporum canis

(1409)

Trichophyton rubrum

(1197 S)

Trichophyton rubrum

(1523 M)

324

Apesar da maior média de concentração de DNA extraído não ser pelo método de

extração kit Qiagen Blood&Tissue, ele apresentou dados bem reproduzidos em todas as

amostras (Tabela 1).

Houve concentração de DNA excelente para quase todas as amostras pelo método de

extração do Kit Qiagen Blood &Tissue, porém com pureza estimada em 2,0 (260/280), o

que pode indicar a presença de RNA (Wilfinger et al., 1997), podendo ser um fator de

interferência na PCR, dentre outros (Lee et al., 2010), visto que somente a amostra 1080M

apresentou amplificação na PCR (amostra de numeração 27 na Figura 1) quando utilizado

esse método.

Figura 1- As amostras foram aplicadas de acordo com os métodos de extração de DNA realizados

anteriormente à PCR: 1 a 9 - Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado; 10 a 18 - Mini kit Qiagen

Dneasy Plant; e, 19 a 27 - Kit Qiagen Blood & Tissue. Amplificações consideradas bem-sucedidas a partir de 200pb, sendo desconsideradas as bandas 14, 23, 24, 25 e 26. Dermatófitos: 107M (1, 10,

19), 1714M (2, 11, 20), 126M (3, 12, 21), 179S (4, 13, 22), 1197S (5, 14, 23), 1523 (6, 15, 24),

325S (7, 16, 25), 1409 (8, 17, 26), 1080M (9, 18, 27).

O método que mostrou melhores resultados foi o de Ferreira e Grattapaglia (1998)

modificado, apesar de não ter apresentado uma boa reprodução em todas as amostras, e

indicado graus de proteínas encontradas em pelo menos uma amostra (valor da relação

260/280 menor que 1,8 na amostra 107M), e presença de RNA em outras quatro (valores

na relação 260/280 maior que 2,0), este método se mostrou mais eficiente na PCR, onde

obtivemos amplificações das amostras 107M, 1714M, 126M, 179S e 1197S, coforme

observado na Figura 1, como as amostras 1, 2, 3, 4, e 5 respectivamente.

O método de extração Mini Kit Qiagen Dneasy Plant não foi eficiente para uma

concentração ideal de DNA, mas para a concentração obtida estimou-se um grau de pureza

dentro do padrão preconizado na biologia molecular, com apenas duas amostras

apresentando 2,0 na relação 260/280, e apresentando amplificações que podem ser vistas

nas amostras 325S, 1409, 1080M, na Figura 1 como 16, 17 e 18.

325

Conclusão

A pulverização do micélio no início do protocolo de extração de DNA permite uma

eficiência do método, no entanto, quando se leva em conta a purificação do DNA, seja por

precipitação ou por afinidade em coluna de sílica, ambos proporcionam um resultado

eficiente para dar sequência às análises em Biologia Molecular necessárias. Mas, o método

de Ferreira e Grattapaglia (1998) com modificações se mostrou o melhor para extração de

ácidos nucleicos dos dermatófitos testados.

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326



Detecção de Micobactérias de Crescimento Rápido em aparelhos

videoscópicos na cidade de Manaus - AM.

Silva, T.G1., Teles, A.L.M

1., Souza, L.C.A

2., Araujo, K.S

3., Cordeiro, A.T.D

3., Santos,

J.G4., Cruz Filho, R.F

4.

1Graduada em Medicina pela Universidade Federal do Amazonas,

2Graduanda em Ciências

Naturais pela Universidade Federal do Amazonas, 3Graduanda em Ciências Biológicas pela

Universidade Federal do Amazonas, 4Professor da Universidade Federal do Amazonas. Email:

[email protected], [email protected].

Resumo

Micobactérias de crescimento rápido (MCR) são bacilos álcool-ácido resistentes que vêm

assumindo destaque nos casos de infecções hospitalares no Brasil. As MCR são

patógenos oportunistas geralmente associados a infecções pós-operatórias. Em 2007,

pacientes submetidos a procedimentos médicos que utilizaram aparelhos videoscópicos

desenvolveram quadros ainda não vistos no país. Estava-se à frente de um surto de

micobacteriose. Ao contrário das metodologias utilizadas em estudos vigentes, este não

fez uso de amostras orgânicas como fonte de pesquisa. As coletas foram feitas a partir de

aparelhos de vídeo previamente reprocessados, utilizados em clínicas e hospitais públicos

e privados de Manaus – AM durante o período de agosto/2009 a julho/2011, visando

verificar se estes são as fontes condutoras da infecção. Coletaram-se amostras de pontos

específicos com swabs estéris dos videoscópios antes de serem utilizados. Utilizaram-se

2 (dois) métodos de análise: baciloscopia com coloração de Ziehl-Neelsen, para verificar

a positividade ou não para bacilo álcool ácido resistente (BAAR), e a cultura a partir do

meio Löwenstein Jensen (LJ). Do total de 175 amostras, 3 (1,71%) apresentaram BAAR

positivo, o que se torna relevante frente a análise de aparelhos que deveriam estar estéreis

antes dos procedimentos médicos.

Palavras-chave: Micobactérias de Crescimento Rápido, Aparelhos Videoscópicos,

Reprocessamento de Materiais, Infecções Hospitalares.

Introdução

Surtos e infecções associados a micobactérias de crescimento rápido (MCR) vêm

sendo relatados desde 1938, quando o primeiro caso foi citado mundialmente. Em

praticamente todas as infecções hospitalares causadas por este grupo de microrganismos,

houve falhas nos processos de esterilização de instrumentos e dispositivos médicos, e

com soluções cirúrgicas (Duarte et al., 2009; Fontana, 2008).

Recentemente tem-se observado um aumento do número dessas infecções após

implantes mamários e, cirurgias/processos vídeo-assistidos. A resistência desses



327

organismos ao gluteraldeído, a baixa suscetibilidade a desinfetantes de alto nível, a

exposição do instrumental à água contaminada com um grande número de micobactérias,

e a cloração inadequada são hipóteses levantadas como causas (Lorena et al., 2009).

As MCR são ambientais, sendo encontradas no solo e na água. Não são

consideradas nocivas ao homem, mas em condições favoráveis, como em pacientes

imunossuprimidos, tornam-se patogênicas (Murillo et al., 2000; Tortoli, 2004; Kanai,

2006).

Infelizmente, a detecção desta bactéria no organismo humano só é feita depois de

instalado o quadro infeccioso. O diagnóstico é realizado a partir de baciloscopia e cultura

do líquido orgânico e/ou da biópsia da ferida cirúrgica (Brasil, 2008; Barreto e Campos,

2000).

A ausência de dados sobre as infecções pós-cirúrgicas causadas pelas micobactérias na

literatura científica de Manaus – AM e a prevalência delas nas demais cidades brasileiras

impulsionam uma investigação minuciosa dos materiais cirúrgicos e de seus

procedimentos de limpeza, visto que são tidos, inclusive pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA, 2004 a,b,c), como ambientes de proliferação – formação

de biofilmes - e causas de infecção por MCR (Macedo e Henriques, 2009;

DVE/DVS/CEVS/SES/ERGS. NT nº1, 2007; Pitombo et al., 2009).

Este trabalho teve como objetivo, verificar se o instrumental é uma fonte da

infecção hospitalar. Embora muito se especule, não há na literatura científica, pesquisa

ou metodologia específica em tal âmbito, o que torna o projeto inédito. Em 2009, não

havia relatos de surtos de micobacterioses na cidade de Manaus – Am. Entretanto em

2010, Manaus passou a fazer parte dessa estatística (Dantas, 2010; Freire, 2010).

Material e Métodos

A coleta das amostras foi realizada em clínicas e hospitais, públicos e privados de

Manaus – AM de acordo com a autorização destes e dos médicos responsáveis pelos

aparelhos videoscópicos, perante carta de informação à instituição e termo de

consentimento, respectivamente

As amostras foram analisadas no laboratório de Microbiologia do Departamento de

Parasitologia do Mini-Campus da Universidade Federal do Amazonas (UFAM),

conforme Normativas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2004

a,b,c).

328

As coletas ocorreram a partir de videoscópios previamente reprocessados. Eles

foram divididos, didaticamente, em críticos, aqueles que são introduzidos diretamente na

corrente sanguínea ou em outras partes do corpo, sendo, portanto, invasivos, devendo ser

obrigatoriamente esterilizados; e semi-críticos, cujo contato é restrito a mucosas íntegras,

devendo no mínimo ser submetidos à desinfecção de alto nível.

Foram excluídos aparelhos termossensíveis, descartáveis e não reprocessados.

As coletas foram realizadas através de swab estéril, com certificação da ANVISA.

No aparelho videolaparoscópico coletaram-se em três áreas distintas: pinça Meriland,

ponta da ótica e trocater. No endoscópico, em três locais: ponta da ótica, pinça de biópsia

e guia (trocater). A semeadura em ziguezague foi feita no sítio cirúrgico em tubos de

ensaio com 5 mL do meio sólido Löwenstein Jensen (LJ), não tendo sido necessário o

uso de meios de transporte (Barrow e Feltham, 1999).

Os tubos de ensaio ficaram na estufa a 37 ºC, sendo realizadas análises diárias até 7

dias após a semeadura. Quando houve colonização bacteriana, realizou-se a coloração de

Ziehl-Neelsen, verificando-se a positividade ou não para BAAR (ANVISA, 2004 a,b,c).

Quando nas primeiras análises não se observava crescimento de colônias, os tubos

passavam a ser analisados uma vez por semana até a 8ª semana, para não descartar a

possibilidade de encontrar micobactérias de crescimento lento (MCL) (Della-Latta e

Weitzman, 1998; Barrow e Feltham, 1999; Cabral e Andrade, 2011;

MBT/MS/SVS/CRHF/DVE/ CLSP, 2005).

A coleta em um mesmo aparelho foi, na sua maioria, realizada cinco vezes,

entretanto em dias alternados e/ou durante o intervalo de um procedimento e outro,

quando possível, buscando-se a fidedignidade das amostras.


Entre agosto/2009 e julho/2011 foram realizadas coletas em clínicas e hospitais

públicos e privados de Manaus – AM, em 10 aparelhos de vídeo previamente

reprocessados, sendo 3 críticos e 7 semi-críticos. Do total de 175 amostras, 44 (25%)

correspondem aos aparelhos críticos (videolaparocopias) e 131 (75%) aos semi-críticos

(endoscopias) (Figura 1)

329

25%

75%

Figura 1: Amostras por Aparelhos Videoscópicos : críticos e semi-críticos.

Das amostras adquiridas nos aparelhos críticos, todas (44 amostras) foram

coletadas a partir de procedimentos de cirurgia geral. As dos aparelhos semi-críticos

correspondem às endoscopias, sendo 91(69%) de endoscopias digestivas altas, 14 (11%)

de cistoscopias, 7 (5%) de laringoscopias, 17 (13%) de broncoscopias e 2 (2%) de

colonoscopias (Figura 2).

Figura 2: Amostras por prodecimentos de aparelhos videoscópicos semi-críticos.

De todas as amostras, 3 (1,71%) apresentaram baciloscopia positiva para BAAR.

Conforme análise do tempo de crescimento, pode-se dizer que foram encontradas duas

amostras com MCR e uma com MCL (Tabela 1).

330

Tabela1: Amostras com coloração de Ziehl-Neelsen positivas. (MCR: Micobactéria de

Crescimento Rápido; MCL: Micobactéria de Crescimento Lento)

Amostras Procedimentos BAAR Tempo de

crescimento

Micobacterias

A4 – Ótica Cistoscopia + 4 semanas MCL

A4– Guia

(Trocater)

Cistoscopia + 1 semana MCR

G2 – Ótica Cirurgia Geral + 48 horas MCR

Não foi possível identificar as subespécies das colônias de micobactérias

encontradas, pois não dispúnhamos de instrumentos para a realização de análise

molecular, o método mais indicado.

A preocupação com o reprocessamento de aparelhos de vídeo deve ser maior, uma

vez que a biossegurança do paciente durante a realização de procedimentos médicos não

está sendo respeitada totalmente e as consequências estão surgindo com o passar do

tempo.

O aparecimento de colônias de microrganismos em aparelhos que estariam

devidamente reprocessados é um dado significante para este trabalho, visto que coloca o

videoscópio como a fonte da infecção. E levanta outro questionamento: onde estaria o

erro? Segundo Cabral e Andrade (2011), fatores como a formação de biofilme, as

complexas estruturas dos videoscópios e o não cumprimento do tempo de

reprocessamento estão entre as possíveis respostas.

Conclusões

A detecção de microrganismos em aparelhos que passaram pelas etapas de

reprocessamento servem de alerta. Maior importância deve ser dada aos procedimentos

básicos de limpeza dos videoscópios.

Faz-se necessário um controle mais rigoroso nas etapas de reprocessamento e nas

inspeções das Centrais de Materiais e Esterilizações (CMEs), dos videoscópios assim como

do instrumental médico.

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333


Avaliação da patogenicidade de fungos filamentosos: Aldeia Fronteira –

Mundurukú, Borba–AM.

Souza I. S. ¹, Silva D. M.², Fernandes O.C.C. ¹, Rodrigues J. C.¹

¹Instituto Leônidas e Maria Deane/Fiocruz-Amazônia, ²Universidade Federal do Amazonas, E-

mails: [email protected], [email protected],

[email protected], [email protected].

Resumo

Os fungos são agentes causadores de processos infecciosos ou micoses de grande

relevância, por apresentar quadros que podem passar de benignos sintomáticos a

assintomáticos. Sua rápida evolução pode causar uma hipersensibilidade imediata ou

tardia, promovendo quadros alérgicos, ou intoxicações pela eliminação de toxinas, ou por

ingestão de fungos macroscópicos toxígenos. Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar

o potencial de patogenicidade de fungos filamentosos isolados da nasofaringe de índios da

aldeia fronteira, Borba – AM. Neste estudo foram utilizados 39 fungos, coletados da aldeia

de contato frequente do Mundurukú, Borba–AM, isolados e purificados em Ágar Saboroud

com cloranfenicol para verificar a viabilidade celular e pureza das culturas para posterior

realização dos ensaios biológicos e identificação em nível de gênero. Três parâmetros

patogênicos foram testados: Crescimento a 37 ºC, produção de urease e teste de

micotoxina. Observou-se que das 39 amostras, 30 foram capazes de crescer a 37 ºC, 34

produzem ureases e 10 são produtoras de micotoxina. Das 39 culturas fúngicas testadas, 10

apresentarem resultados positivos para todos os parâmetros investigados.

Palavras chave: Fungos, patogenicidade, micotoxina.

Introdução

Fungos são seres dispersos no meio ambiente que apresentam uma capacidade de

adaptação em diversos tipos de substratos naturais, tais como, em vegetais, ar atmosférico,

solo e água e, embora sejam estimados em 250 mil espécies, menos de 150 foram descritos

como patógenos aos seres humanos (Bressan, 2005). Muitos fungos também apresentam

característica patogênica, ou seja, capacidade de infectar o homem e animais, causando-lhe

micoses do tipo: superficiais, cutâneas, subcutâneas, sistêmicas e oportunistas. A principal




334

razão para a patogenicidade dos fungos pode ser expressa pela habilidade do fungo crescer

a temperaturas de 35 – 37 ºC e possuir um sistema enzimático que possibilita o parasitismo

em tecidos animais e circunstâncias que exponham o hospedeiro aos esporos fúngicos

(Oliveira, 2005).

No entanto, essa habilidade dos fungos em causar doenças em humanos parece ser

um fenômeno acidental, diagnosticado como infecções oportunistas, com raríssimas

exceções, e estaria associada ao estado imunitário do indivíduo e a sua exposição ao

ambiente (Wanke et al., 2000). Muitos gêneros são oportunistas, podendo tornar-se

potencialmente patogênicos ao homem que se encontra com sua imunidade comprometida,

ou seja, imunodeprimidos e crescem rapidamente formando colônias maduras em poucos

dias, tornando-se patógenos oportunistas causando graves doenças (Andraus, 2003).

O conhecimento dos fungos como agentes causadores de processos infecciosos ou

micoses é de grande relevância, pois os quadros podem passar de benignos sintomáticos

para assintomáticos, graves e de rápida evolução, bem como os causadores de

hipersensibilidade imediata ou tardia, promovendo quadros alérgicos, ou intoxicações pela

eliminação de toxinas, ou por ingestão de fungos macroscópicos toxígenos (Lima, 2012).

Diante deste contexto torna-se importante avaliar o potencial de patogenicidade de fungos

filamentosos isolados da nasofaringe de índios da aldeia fronteira, Borba – AM.

Material e Métodos

Neste estudo foram utilizados 39 fungos filamentosos isolados em Ágar Saboroud

com Cloranfenicol, da nasofaringe de índios da aldeia de contato frequente do Mundurukú,

Borba – Amazonas, para avaliação do potencial de patogenicidade e identificação em nível

de gênero (Tabela 1).

Três parâmetros patogênicos foram testados: Crescimento a 37 ºC, produção de

urease, e teste de micotoxina.

As amostras purificadas foram semeadas em meio Ágar Malte e incubadas em

estufa de crescimento do tipo B.O.D. à temperatura de 37 °C com observações diárias

durante sete dias (Da Silva, 1999; Silva-Neves, 2006). As culturas que apresentaram

crescimento após o período de incubação foram consideradas para os testes de urease e

micotoxinas (Figura 1).

335

Tabela 1. Fungos isolados da nasofaringe de índios da Aldeia do Mundurukú.

Para o teste de urease as culturas purificadas foram semeadas em tubos de ensaios

com meio Ágar Christensen e incubadas à temperatura de 24 °C - 28 °C com observações

diárias durante sete dias (Da Silva, 1999; Silva-Neves, 2006). Após esse período um

padrão de coloração vermelho – fuccina do meio indicava resultado positivo (Figura 2).

Código Gênero Código Gênero Código Gênero Código Gênero

AFM 20 Aspergillus sp. AFM 49 Aspergillus sp. AFM 68 Penicillium sp. AFM 90 Aspergillus sp.

AFM 64 Penicillium sp. AFM 31 Aspergillus sp. AFM 91 Aspergillus sp. AFM 55 Penicillium sp.

AFM 60 Aspergillus sp. AFM 38 Penicillium sp. AFM 66 Penicillium sp. AFM 69 Penicillium sp.

AFM 34 Penicillium sp. AFM 62 Penicillium sp. AFM 70 Penicillium sp. AFM 65 Penicillium sp.

AFM 11 Penicillium sp. AFM 32 Aspergillus sp. AFM 28 Penicillium sp. AFM 61 Aspergillus sp.

AFM 27 Penicillium sp. AFM 52 Aspergillus sp. AFM 63 Penicillium sp. AFM 30 Aspergillus sp.

AFM 01 Penicillium sp. AFM 48 Aspergillus sp. AFM 35 Penicillium sp. AFM 59 Penicillium sp.

AFM 57 Penicillium sp. AFM 71 Penicillium sp. AFM 45 Penicillium sp. AFM 33 Penicillium sp.

AFM 92 Aspergillus sp. AFM 94 Aspergillus sp. AFM 67 Penicillium sp. AFM 50 Aspergillus sp.

AFM 42 Penicillium sp. AFM 53 Penicillium sp. AFM 93 Aspergillus sp.

Figura 1. Crescimento em 37 °C

Figura 2. Teste para a produção de urease

336

As culturas foram semeadas em meio específico Ágar Coco e incubadas em estufa

de crescimento do tipo B.O.D à temperatura ambiente de 26 °C – 28°C com observações

diárias durante sete dias (Lin e Dianese, 1976). Para a leitura dos resultados, as colônias

foram examinadas visualmente e sob luz UV de comprimento onda longa de 365 nm

(Figura 3).


Com base nos resultados obtidos, observou-se que das 39 amostras, 76,9 % (30)

foram capazes de crescer a 37 ºC; 84,6 (33) para o teste de ureases e 25,6% (10) foram

positivas quanto à produção de micotoxina (Tabela 2). Das 39 culturas fúngicas testadas,

10 culturas apresentaram resultados positivos para todos os parâmetros investigados.

Verificou-se que todos os 15 Aspergillus cresceram a 37 ºC e que 33 das 39

culturas analisadas produziram urease. Apesar da importância da atividade ureásica na

patogenicidade do fungo encontrar-se em debate, vários estudos já vem mostrando o papel

dessa enzima como facilitadora de infestação no sistema nervoso central (Olszewski et al.,

2002; Varma et al., 2006;) e também mostra correlação positiva com a patogenicidade de

outros fungos patogênicos para humanos, como o Paracoccidioides

brasiliensis (Rappleye., et al., 2006) e as leveduras Cryptococcus neoformans e C. gattii

(Cox et al., 2000).

Quanto ao teste de micotoxinas, dez culturas (25,6%) apresentaram alteração na

coloração no meio indicando sua produção. As micotoxinas são metabolitos tóxicos

secundários produzidos por uma variedade de fungos que surgem de forma natural em

Figura 3. Teste para a produção de micotoxina

337

produtos agroalimentares em todo o Mundo, principalmente os gêneros Aspergillus,

Penicillium e Fusarium, sendo tóxicas para humanos e animais, quando ingeridas em

pequenas quantidades (Freire, 2007).

Tabela 2. Fungos capazes de crescer em 37 °C, produzir ureases e micotoxinas. Código/ Gênero Crescimento em 37 °C Produção de ureases Produção de micotoxina

AFM 01 Penicillium sp. + + +

AFM 20 Aspergillus sp. + + +



AFM 30 Aspergillus sp. + - -

AFM 31 Aspergillus sp. + + -

AFM 32 Penicillium sp. + + -



AFM 38 Penicillium sp. - + -






AFM 52 Aspergillus sp. + - -




AFM 59 Aspergillus sp. - + -
















338

Os principais efeitos tóxicos destas micotoxinas são: hemorragias intestinais e

renais, tumores no fígado e hepatite aguda, edema cerebral e pulmonar, convulsões,

náuseas temporárias e vômitos, dor de cabeça, tontura, febre e anorexia e dentre outras

doenças. A severidade dos efeitos tóxicos depende grandemente das quantidades ingeridas,

(se ingeridas em grandes quantidades, podem causar a morte - micotoxicoses), do tempo de

exposição e das possíveis sinergias toxicológicas que podem advir da ingestão de diversas

micotoxinas simultaneamente (Soares, 2013).

Conclusões

Das 39 amostras, 30 foram capazes de crescer a 37º C;

Trinta e três produzem ureases;

Dez são produtoras de micotoxina, sendo quatro Aspergillus sp. (AFM 20, AFM 60

e AFM 93 e AFM 94) e seis Penicillium sp. (AFM 01, AFM 27, AFM 28, AFM 42, AFM

57, AFM 67).

Agradecimentos

Ao Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/ Fiocruz – AM.

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340



Microbiota bacteriana da mucosa oral de cães (Canis lupus familiaris)

atendidos em clínica veterinária na cidade de Manaus, AM.

Xavier M.S.1, Lisbôa R.S.

2, Guedes V.T.M.

3, Souza F.S.

2

1Graduação em Medicina Veterinária, Escola Superior Batista do Amazonas,

2Doutor(a) em

Ciências Veterinárias, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,3Mestre em Ciências de

Alimentos, Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],


Resumo

A microbiota oral é semelhante entre os animais domésticos, sendo a superfície

bucal, a língua e os dentes. habitados por microrganismos aeróbios facultativos e

obrigatórios. As bactérias na mucosa oral podem penetrar na corrente sanguínea, se

acumular e causar lesões em outros órgãos. O presente trabalho objetivou analisar a

microbiota bacteriana da mucosa oral de cães comparando-a com o tipo de alimentação e

presença de doença periodontal de animais atendidos por uma clínica veterinária da cidade

escola de Manaus, AM. Foram coletadas amostras da cavidade oral de 30 cães sem

distinção de raça, sexo ou idade, utilizando swabs estéreis de três sítios anatômicos

distintos. Após a coleta, foram confeccionados esfregaços diretos, fixados na chama de

uma vela e posteriormente corados pela técnica de Gram e analisados. Os microrganismos

detectados foram classificados de acordo com suas características morfológicas. A

incidência de Simonsiella spp. foi de 100% nas amostras de mucosa oral analisadas. Em

sua maioria, os microrganismos encontrados eram Gram-positivos, com os cocos (86,7%)

em maior proporção de ocorrências seguidos pelos bacilos (66,7%), estreptobacilos

(56,7%) e diplococos (53,3%). Independentemente do tipo de alimentação recebida, os

animais estudados apresentaram, em sua maioria, os mesmos grupos de microrganismos. A

presença de doença periodontal não influenciou na diversidade de microrganismos

encontrados, assim como a alimentação.

Palavras-chave: Canídeos, Microrganismos, Placa bacteriana. Animais de companhia.

Introdução

A microbiota oral é semelhante entre os animais domésticos sendo a superfície

bucal, a língua e os dentes habitados por microrganismos aeróbios facultativos e

obrigatórios. Estes incluem estafilococos, estreptococos α e β hemolíticos, Pasteurella

spp., Actinomyces spp. (A. viscosus e A. hordeovulveris), Proteus spp., Bacteroides spp.,

Micrococcus spp., Lactobacillus spp., Mycoplasma spp., bacilos fusiformes, coliformes,

Neisseria spp., EF-4 (“fermentador eugônico”), Simonsiella spp., espiroquetas, leveduras e

hemófilos (Hirsh e Zee, 2009; Rocco, 2009).

341

Braga et al. (2005) realizaram coletas da microbiota periodontal de cães da raça

pastor alemão provenientes do canil da Polícia Militar de Belo Horizonte, MG e

encontraram 49 espécies diferentes com predomínio dos gêneros Pasteurella,

Staphylococcus, Porphyromonas e Fusobacterium. Já Fonseca et al. (2011), em Brasília,

relataram que das 20 amostras que coletaram de cães da raça Labrador Retriever, os

gêneros mais frequentemente isolados foram Staphylococcus e Pasteurella, sendo que

Staphylococcus é compositor da microbiota oral de cães saudáveis e, por isso, não indica

necessariamente doença por possuir baixo potencial periodontopatogênico. Portanto, a

boca é rica em microbiota, sendo comum encontrar agentes microbianos com ou sem

significado patogênico. A sua importância depende do tipo de agente e das lesões

causadas. Por exemplo, as bactérias do gênero Simonsiella, apesar de se apresentarem em

grande número na cavidade oral, não são patogênicas (Peleteiro et al., 2011).

Porém, as bactérias existentes na mucosa oral do animal podem, através de lesões,

penetrar na corrente sanguínea, se acumular e causar lesões em outros órgãos como rins,

fígado, coração e articulações, podendo assim a boca atuar como foco de infecção

(Rezende et al., 2004; Pieri e Moreira, 2010). Um exemplo desencadeador deste processo

pode ser a partir da doença periodontal que é causada pelo acúmulo de bactérias, formando

uma placa, sobre a superfície dental. Estas bactérias interagem com os componentes da

resposta imune celular e humoral do hospedeiro, levando a uma inflamação gengival e

destruição dos tecidos podendo levar à perda do elemento dental envolvido podem migrar

pela corrente sanguínea e colonizar órgãos vitais causando doenças diversas (Rezende et

al., 2004; Roza, 2004; Pieri e Moreira, 2010).

O canal alimentar é o único local contaminado em que o esfregaço direto pode

ajudar a determinar se há uma doença bacteriana infecciosa, tendo a técnica de coloração

de Gram como uma das determinações mais importantes na identificação presuntiva dos

microrganismos, sendo um recurso auxiliar no diagnóstico de doenças bacterianas (Freitas

e Picoli, 2007; Koneman et al., 2001). A morfologia das células bacterianas, sua disposição

e suas características na coloração são suficientemente diferentes para permitir a

identificação presuntiva em um esfregaço (Koneman et al., 2001).

O aumento da expectativa de vida dos animais de estimação tem gerado uma

preocupação maior com a saúde bucal já que as doenças orais podem interferir na saúde

geral do cão, portanto é necessário identificar microrganismos patogênicos existentes na

cavidade oral de cães para facilitar a escolha do tratamento em casos de mordeduras ou até

342

lambeduras, já que a intimidade tem sido maior entre animal e proprietário, aumentando o

risco de transmissão de doenças.

Visando contribuir com a escassa pesquisa na região amazônica, o presente trabalho

objetivou analisar a microbiota bacteriana da mucosa oral de cães, comparando-a com o

tipo de alimentação e presença de doença periodontal de animais atendidos por uma clínica

veterinária da cidade escola de Manaus, AM.

Material e Métodos

O presente trabalho usou um delineamento observacional descritivo do tipo

transversal.

Foram utilizados 30 cães sem distinção de raça, sexo ou idade, do atendimento da

clínica veterinária escola da cidade de Manaus, Amazonas. Os animais foram oriundos do

atendimento clínico, sendo 21 levados à clínica e nove atendidos na comunidade ribeirinha

Tupé, na qual a clínica veterinária escola participou de um projeto social e os médicos

veterinários realizaram atendimentos a domicílio.

As amostras foram coletadas com swabs estéreis girados sobre a superfície de três

sítios anatômicos distintos, como mucosa gengival, biofilme dental do canino superior

direito ou esquerdo e quarto pré-molar inferior dos cães. Todas as coletas foram realizadas

com as mãos calçadas com luvas de procedimento .

Os cães utilizados no estudo foram colocados sobre a mesa de atendimento e

contidos de forma manual pelos estagiários ou pelo próprio dono, sem a colocação de

focinheira. Apenas um cão, anestesiado para procedimento cirúrgico, a contenção não foi

necessária.

Após as coletas, foram feitas perguntas aos tutores dos animais para um inquérito

epidemiológico de dados sobre o animal (nome, sexo, raça, idade), tipo de alimentação

(ração, comida ou ambos), outras informações relacionadas à saúde bucal do animal e

regime de criação, sendo considerados domiciliados (animais com dono, supervisionados

ou controlados, que não saem na rua sem acompanhamento), semidomiciliados (dependem

do dono para sua alimentação e seu abrigo, mas têm livre acesso à rua) e errantes (ninguém

se responsabiliza por eles, vivem nas ruas) (WHO e WSPA, 1992).

Os tutores dos animais assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE) existente na clínica veterinária escola para a realização de diferentes

procedimentos.

343

O projeto foi aprovado pelo comitê de ética de uso animal sob o número CEUA

ESBAM Nº 16, sendo todos os procedimentos executados de acordo com os critérios

éticos aplicados ao uso animal no ensino e nas pesquisas regulamentados pela Lei Federal

11.794, de 08 de outubro de 2008 e pela Resolução do CFMV nº 879 de 15 de fevereiro de

2008.

Imediatamente após as coletas, os swabs foram levados ao laboratório da clínica

veterinária escola para a confecção de esfregaços diretos realizados por rolamento do swab

em lâmina. Estes foram fixados na chama de uma vela, posteriormente corados pela

técnica de Gram e deixados secar. Depois as lâminas foram observadas em microscópio

óptico (ZEISS®) em objetiva de imersão (1.000x).

Após a coloração, a microbiota da mucosa oral dos cães foi classificada de acordo

com suas características morfológicas (reação tintorial, morfologia e arranjo).


Das amostras coletadas de um total de 30 animais, 70% (21/30) foram de animais

levados à clínica e 30% (9/30) de animais atendidos na comunidade ribeirinha Tupé.

Quanto à raça, um exemplar das raças Sharpei, Dálmata, Dachshund, Chow Chow,

Yorkshire, Bulldog Inglês, Pastor Alemão, Shitzu, dois exemplares das raças Labrador, Pit

Bull, Poodle e 16 animais sem raça definida (SRD), com idade entre dois meses e 13 anos,

sendo nove filhotes, 13 adultos, dois idosos e seis animais os proprietários não souberam

informar a idade. Quanto ao sexo, 46,7% (14/30) eram machos e 53,3% (16/30) eram

fêmeas (Tabela 1).

Apenas 30% (9/30) dos animais avaliados apresentaram halitose. Quanto à

alimentação, 53,3% (16/30) comiam ração, 26,7% (8/30) comida caseira, 16,7% (5/30)

ambas e 3,3% (1/30), o proprietário não soube informar, pois havia retirado o animal da

rua recentemente. Quanto ao domicílio, 66,7% (20/30) eram domiciliados, 30% (9/30)

semi-domiciliados e 3,3% (1/30) eram errantes. Apenas dois animais, da raça Poodle, já

haviam feito tratamento odontológico e os mesmos apresentavam perda de dentes. Todas

as informações coletadas resumiram-se na Tabela 1.

Quanto à coloração dentária, os animais foram classificados em três categorias:

normal (dentes hígidos, brancos e sem acúmulo de placa bacteriana visível), amarelada

(dentes já apresentando placa bacteriana) e escurecida (dentes que já se apresentavam

344

cobertos por placa bacteriana deixando-os com aspecto marrom a preto). Nesta

classificação, 70% (21/30) dos animais apresentaram dentes de coloração normal, 23,3%

(7/30) amarelada e 6,7% (2/30) escurecida. Nenhum dos animais analisados apresentou

sinais de gengivite ou sangramento.

Tabela 1. Distribuição da frequência das variáveis raça, idade, sexo, alimentação e tipo de

criação dos 30 animais avaliados durante a pesquisa.

Cães Raça Idade Sexo Alimentação Tipo de Criação

1 Dachshound 2 meses M R D

2 SRD 3 meses F R D

3 Pit Bull 4 meses F R D

4 SRD - F - E

5 Dálmata 2 meses F R D

6 Labrador 2 anos F A D

7 Labrador 1 ano M A D

8 Sharpei 1 ano F A D

9 Chow Chow 5 meses M R D

10 SRD - F R D

11 SRD - M R D

12 SRD - M R D

13 Yorkshire 4 meses M R D

14 SRD - M R D

15 SRD 6 anos F R D

16 Poodle 13 anos M A D

17 Podlee 12 anos M R D

18 Bulldog Inglês 2 meses F R D

19 Pit Bull 7 anos F R D

20 Pastor Alemão 2 anos M R D

21 SRD 3 anos F CC SD


23 SRD 8 anos M CC SD

24 SRD 1 ano M CC SD


26 SRD - M CC SD

27 SRD 8 anos M CC SD

28 SRD 8 anos F A SD

29 SRD 6 meses F CC SD

30 Shitzu 7 meses F R D SRD = Sem Raça Definida, M = Macho, F = Fêmea, R = Ração, CC = Comida caseira, A = Ambas, D =

Domiciliado, SD = Semi-domiciliado, E = Errante.

Os microrganismos bacterianos encontrados foram classificados segundo sua

reação tintorial como Gram-positivos ou Gram-negativos, segundo sua morfologia como

345

cocos, bacilos, cocobacilos, diplococos, bacilos em ou filamentosos, e segundo seu arranjo

como estafilococos, estreptococos, estreptobacilos ou sarcinas (Tabela 2).

Devido à sua morfologia característica, bacilos grandes com estriação transversal, a

bactéria Simonsiella spp. foi a única classificada em nível de gênero.

Tabela 2. Classificação morfológica da microbiota encontrada nos 30 animais avaliados

durante a pesquisa.

Microrganismos Quantidade

de animais

%

Cocos Gram-positivos 26 86,7

Cocos Gram-negativos 14 46,7

Cocos Gram-positivos semelhantes a Estreptococos 8 26,7

Cocos Gram-positivos semelhantes a Estafilococos 8 26,7

Cocos Gram-negativos semelhantes a Estafilococos 1 3,3

Diplococos Gram-positivos 16 53,3

Cocobacilos Gram-positivos 4 13,3

Cocos semelhantes a Sarcinas Gram-positivas 2 6,7

Bacilos Gram-positivos 20 66,7

Bacilos Gram-negativos 3 10

Bacilos em espiral Gram-positivos 3 10

Simonsiella Gram-negativas 30 100

Estreptobacilos Gram-positivos 17 56,7

A presença de Simonsiella spp. foi observada em 100% dos animais, semelhante a

Nyby et al. (1977), que observaram esta mesma bactéria em 99% de suas amostras na

Califórnia. No presente estudo, destacou-se que em um animal (amostra 02) Simonsiella

spp., foi a única bactéria encontrada, ressaltando a conclusão desses autores que a

consideraram uma bactéria residente comum da cavidade oral de cães.

No presente estudo, as formas bacterianas encontradas foram em sua maioria Gram-

positivas, como encontrado por Domingues et al. (1999) e citado por Roza (2004).

Os microrganismos observados, quanto a sua morfologia e arranjo, foram

predominantemente cocos isolados, diplococos, agrupados (estafilococos) ou em cadeia

(estreptococos). De acordo com Koneman et al. (2001), nos esfregaços diretos, os pares e

as cadeias curtas de microrganismos não podem ser diferenciados dos estreptococos,

micrococos ou peptoestreptococos, embora os estreptococos frequentemente apareçam

como cadeias de diplococos, em lugar de cadeias de células individuais, como observado

na amostra 23.

346

Dos animais analisados, 53,3% (16/30) eram alimentados com ração e apresentaram

os seguintes microrganismos: cocos Gram-positivos, cocos Gram-negativos, bacilos Gram-

positivos, bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos, cocobacilos Gram-

positivos, cocos Gram-positivos semelhantes a estreptococos, cocos Gram-positivos

semelhantes a estafilococos, estreptobacilos Gram-positivos, bacilos em espiral e

Simonsiella spp.

Os alimentados com comida caseira eram 26,7% (8/30) e apresentaram todos os

microrganismos acima, com exceção de cocobacilos Gram-positivos. Duas dessas amostras

apresentaram microrganismos com morfologia semelhante a sarcinas Gram-positivas.

Os animais alimentados com ração e comida caseira foram 16,7% (5/30) e

apresentaram os seguintes microrganismos: cocos Gram-positivos, cocos Gram-negativos,

bacilos Gram-positivos, cocos Gram-positivos semelhantes a estreptococos, cocos Gram-

positivos semelhantes a estafilococos, estreptobacilos Gram-positivos, bacilos em espiral e

Simonsiella spp.

O animal que o tutor não soube informar o tipo de alimentação (3,3% - 1/30)

apresentou cocos Gram-positivos, cocos Gram-negativos, bacilos Gram-positivos,

diplococos Gram-positivos, cocos Gram-positivos semelhantes a estreptococos,

estreptobacilos Gram-positivos e Simonsiella spp.

Na literatura consultada não foram encontrados dados para comparar com os

resultados quanto ao tipo de alimentação. Embora a alimentação inadequada, como rações

úmidas enlatadas ou dieta caseira que não proporcionam abrasão necessária, seja um fator

predisponente ao acúmulo de placa e de cálculo (Engelkirk e Duben-Engelkirk, 2012).

Nenhum dos tutores realizava a escovação ou limpeza dentária dos animais

avaliados nesse estudo, concordando com Miller e Harvey (1994), que relataram que

menos de 10% dos tutores de cães escovam os dentes de seus animais, sendo a escovação

um dos métodos mais eficaz de interromper a formação da placa bacteriana (Santos et al.,

2012).

Dentre os animais estudados, oito tinham idade acima de quatro anos, mas apenas

dois apresentaram acúmulo excessivo de placa bacteriana, tendo os dentes escurecidos

(amostras 16 e 17). Outros dois apresentaram pouco acúmulo de placa e tinham dentes

amarelados (amostras 15 e 19), e os outros quatro apresentaram dentes sem placa visível

(amostras 22, 23, 26 e 27), embora a literatura relate que a prevalência de doença

periodontal alcance 85% dos animais com idade acima de quatro anos de idade.

347

Os animais com maior acúmulo de cálculo dentário eram animais idosos, que já

haviam feito tratamento dentário anteriormente; ambos apresentaram perda de dentes e um

se alimentava apenas de ração e o outro de ração e comida caseira. Nas amostras desses

animais foram observados em comum, cocos Gram-positivos, bacilos Gram-positivos e

Simonsiella spp. Além desses microrganismos, um animal (amostra 16) apresentou cocos

Gram-positivos semelhantes a estafilococos e bacilos Gram-positivos em espiral, enquanto

o outro (amostra 17) apresentou bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos e

estreptobacilos Gram-positivos.

Conclusões

A incidência de Simonsiella spp. foi de 100% nas amostras de mucosa oral

analisadas.

Em sua maioria, os microrganismos encontrados eram Gram-positivos, com os

cocos (86,7%) em maior proporção de ocorrências seguidos pelos bacilos (66,7%),

estreptobacilos (56,7%) e diplococos (53,3%).

Independentemente do tipo de alimentação recebida, os animais estudados

apresentaram, em sua maioria, os mesmos grupos de microrganismos.

A presença de doença periodontal não influenciou na diversidade de

microrganismos encontrados, assim como a alimentação.

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