DIVERSIDADE GENÉTICA E FENOTÍPICA DE ACESSOS DE...
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCODEPARTAMENTO DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS
DIVERSIDADE GENÉTICA E FENOTÍPICA DE ACESSOS DE SABIÁ QUANTO À FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO
Mestrando: Paulo Geovani Silva MartinsOrientador: Prof. Dr. Mario de Andrade Lira Junior
Co-orientador: Prof. Dr. Márcio Vieira da CunhaCo-orientadora: Dra. Maria do Carmo Catanho P. de Lyra
ROTEIRO DA APRESENTAÇÃO
����Introdução
����Objetivo Geral
����Objetivos Específicos
����Metodologia����Metodologia
����Principias Contribuições
����Cronograma de Atividades
����Orçamento
INTRODUÇÃO
����Satisfaz necessidades humanas
����Melhoria ou manutenção da qualidade ambiental
Agropecuária sustentável
����Utilização eficiente dos recursos
����Viabilidade econômica
����Qualidade da vida
Aptidão Agroecológica
Pastagens Naturais30%
Aptidão Agroecológica brasileira
INTRODUÇÃO
Fonte: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
Pastagens Naturais
Florestas e bosques
Pastagens Cultivadas
Outras áreas
30%
22%18%
�Maior intensificação da pecuária
Mata Atlântica brasileira
INTRODUÇÃO
Fonte: Fundação SOS Mata Atlântica
�Áreas de pecuária agricultura
�Baixa fertilidade natural dos solos
� Declínio dos pastos ocasionado pela deficiências de Nitrogênio (N) eFósforo (P) (BODDEY et al, 2004)
�Perdas de N no sistema solo / planta / animal são elevadas
�Perdas de P podem ser consideradas pequenas
INTRODUÇÃO
�As leguminosas surge como uma alternativa devido à fixação de N2atmosférico
�Poucos casos de sucesso relatados em pastagens tropicais(SHELTON et al, 2005)
�Sucesso relatados no Acre - Arachis pintoi e Pueraria
phaseoloides (VALENTIM e ANDRADE, 2005)
�Espécies arbustivo-arbórea em sistema silvo-pastoril
Gado Pastagem
Árvores
INTRODUÇÃO
Árvores
Benefícios:
�Melhoria do ambiente para os animais
�Aumento da produtividade por área
�Diversificação da renda
Área
Sucesso = Escolha acertada das espécies
As melhores opções são:�Espécies do gênero Sesbania
�Leucena (Leucaena leucocephala)
�Gliricidia (Gliricidia sepium)
INTRODUÇÃO
�Gliricidia (Gliricidia sepium)
Sabiá (Mimosa caesalpiniifolia)
�Leguminosas arbustivas
�Distribuição geográfica: Maranhão até Pernambuco
�Nativa da região Nordeste
Divisão: Magnoliophyta (Angiospermae)Classe: Magnoliopsida (Dicotyledoneae)Ordem: FabalesFamília: Mimosaceae (Leguminosae:Mimosoideae)Gênero: Mimosa
Classificação Taxonômica
INTRODUÇÃO
Foto: Paulo E. R. Carvalho
Gênero: Mimosa
Espécie: Mimosa caesalpiniifolia Benth.
Fotos: Marcos Antônio Drumond
�Cerca viva;
�Proteção e delimitação de pomares;
�Alimentação para o gado (folhas);
�A madeira é usada na produção de estacas
�Utilização
INTRODUÇÃO
�A madeira é usada na produção de estacas
�Espécie pioneira
�Utilizada para recomposição de área degradada
Rápido crescimento - associação simbiótica com grupo dosrizóbios – enriquecimento do sistema em N
Fixação N - rizóbio/leguminosas
�A associação das bactérias com as raízes formam os nódulos
�Reconhecimento e adesão
�Resultado de complexas interações bioquímicas, metabólicas efísicas entre a planta hospedeira e o microssimbionte
INTRODUÇÃO
�Reconhecimento e adesão
�Enrugamento do pêlo
(“bastão de pastor”)
�Formação do nódulo
Fonte: Nitragin Argentina
Soja
INTRODUÇÃO
Foto: Portal do Agronegócio
Feijão-caupi
Foto: Stephen Temple (New Mexico State University)
�A eficiência da simbiose pode ser afetada
Variações genotípicas dos simbiontes
�Diferenças significativas entre estirpes de R. meliloti e cultivares dealfafa em sua capacidade de fixar N (GIBSON, 1962)
INTRODUÇÃO
alfafa em sua capacidade de fixar N2 (GIBSON, 1962)
�Seetin e Barnes (1977) – Descreveram diferenças na nodulaçãoentre alfafa e inoculantes, concluindo que a capacidade da simbiosepara fixar N2 foi afetada pelo genótipo da planta
�Incompatibilidades foram relatadas em ervilhas por Laguerre et al(2003) e em soja Hungria et al (2006)
Verificar se há efeito de local de origem nacompatibilidade entre acessos de sabiá e estirpes
OBJETIVO GERAL
compatibilidade entre acessos de sabiá e estirpesrizobianas
�Avaliar variabilidade genética e fenotípica de estirpes rizobianasisoladas de sabiá em cinco diferentes áreas de acesso;
�Avaliar variabilidade genética de acessos de sabiá de cincodiferentes áreas de acesso;
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
diferentes áreas de acesso;
�Avaliar a compatibilidade entre acessos de sabiá e isoladosrizobianos de diferentes áreas de origem;
�Avaliar a estabilidade da fixação biológica de nitrogênio deacessos de sabiá sob diferentes fontes de N
���� Coleta
Crato (CE)
Gravatá (PE)
METODOLOGIA
Matas nativas ou naturalizadasSementes
Serra Talhada (PE)
Itambé (PE)
Mossoró (RN)
Gravatá (PE)
�De cada área
�1kg de sementes
�Solo
�Nódulos
(Conservadas em sílica-gel – refrigerador)
(Caracterização físico-química)
(Conservados em tubos com sílica-gel e sob refrigeração)
METODOLOGIA
�Nódulos (Conservados em tubos com sílica-gel e sob refrigeração)
5 cinco estirpes
Caracterização morfológica
Caracterização genética
�Velocidade de aparecimento de colônias;
�Forma;
�Cor;
�Brilho;
METODOLOGIA
�Caracterização morfológica
�Brilho;
�Superfície;
�Borda e tamanho da colônia;
�Produção e consistência de muco;
�Absorção de corantes;
�Modificação do pH do meio de cultura
� Caracterização genética das estirpes
� Fingerprinting genético utilizando o espaço intergênico (ITS)
�primers fD1 e rD1
METODOLOGIA
�Os isolados com padrões diferentes serão considerados comoestirpes diferentes
� Análises dos amplicons (RASBAND 2008)
�Cada estirpe será submetida ao sequenciamento completo do 16S
� PCR (TAURIAN et al, 2006; XU, 2006)
���� Condição de PCR
METODOLOGIA
���� Condição de PCR
�95°C por 3 min, 30 ciclos (94 °C por 1 min, 54 °C por 45 s e 72°C por 2 minutos) e alongamento final por 7 min a 72°C
�Os amplicons serão analisados em gel de agarose
���� Análise das sequências
�Comparação - GenBank
METODOLOGIA
�Alinhamento – Mega4
Estirpes não identificadas a nível de espécies serão utilizadas emoutras pesquisas com grupos de trabalho mais especializados emtaxonomia rizobiana
���� Experimento em casa de vegetação
� Folhas jovens dos acessos de sabiá serão coletadas para estudosgenéticos
� Isolamento do DNA genômico
METODOLOGIA
� Isolamento do DNA genômico
� Genotipagem por marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
� Amplificação da região ITS (Espaçador Transcrito Interno) do rDNA
primers ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990)
� Sequenciamento Embrapa – CENARGEN
���� Experimento em casa de vegetação
� Avaliação do potencial de fixação de N dos acessos de sabiá
� Vasos de Leonard;
METODOLOGIA
�Os cinco acessos de sabiá de cada localidade serão testados com 30 fontes de N;
�As cinco estirpes obtidas nas coletas, duas estirpes atualmenterecomendadas, uma estirpe considerada promissora e doistratamentos não inoculados
� Será utilizada a solução nutritiva de Hoagland sem N
� Experimento em casa de vegetação
� Delineamento em blocos casualizados
� Composto por três repetições, por 60 dias
�
METODOLOGIA
�Matéria seca da parte aérea; �Matéria seca das raízes;�Matéria seca dos nódulos;�Número de nódulos;�Teor de N de toda a planta (método de Kjehdahl);�N total
�Ao final do experimento serão determinados:
� Análise de dados
�Análise de variância
METODOLOGIA
�Variância e teste de comparação de médias
�Análise de estabilidade para os acessos de sabiá, considerando as fontes de nitrogênio como os diferentes ambientes, através dos procedimentos de Eberhart - Russel e de análise multivariada.
� Científicas
� Identificar a eventual existência de diferenças entre acessos desabiá e estirpes rizobianas quanto à compatibilidade e eficiênciana fixação biológica de nitrogênio
PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES
� Tecnológicas
�Avaliação inicial da possibilidade de seleção de acessos desabiá com maior potencial para fixação biológica de nitrogênio;
�Avaliação do potencial de fixação biológica de nitrogênio deleguminosas forrageiras com potencial para uso no Trópico Úmido
FASE 2009 2010 2011
M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F
Disciplinas X X X X X X X X X X
Amostragem X X X X X X
Isolamento X X X X X X X X
CRONOGRAMA
Isolamento X X X X X X X X
Caracterização genotípica dos isolados X X X X X
Experimento de compatibilidade e fixação X X X X X X
Caracterização genotípica dos acessos de sabiá
X X X X X X X X
Análises dos dados X X X X X X
Previsão de defesa da dissertação X
Itens R$ Quantidade Total em R$
Sílica gel Azul 4-8 mm, frasco 500g 17,65 4 70,60
Kit de PCR 130,00 3 390,00
DNA Lader, 100 pbMarcador de ácidosNucleicos, 250ul 298,00 1 298,00
CHEF DNA Ladder, Marcador de ácidos Nucleicos, lambda ladder, 5Kb
623,00 1 623,00
dNTP Mix (25mM, 250uL) 198,38 1 198,38
ORÇAMENTO ESTIMADO
dNTP Mix (25mM, 250uL) 198,38 1 198,38
Ponteiras universal amarela 0 a 1000 UL 15,53 5 pct.c/1000 77,65
Ponteiras universal azul 200 a 1000 UL 28,22 5 pct.c/1000 141,10
Tubos para PCR 500 UL livre de DNAse e RNAse 92,66 Pct.c/1000 96,66
Tubos para PCR 0,2 ml incolor 213,00 cx.c/1000 213,00
Tubo Eppendorf 2,0 ml graduado e autoclavável 34,34 1 pct.c/500 34,34
Syber Green 60,00 1 60,00
Agarose (500 g) 1.200,00 1 1.200,00
Primers 90,00 21 1.890,00
Vasos de Leonard 3,00 500 1.500,00
Total: 6.792,73
Paulo Geovani Silva Martins
Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia - Melhoramento Genético de Plantas - UFRPE
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