Dissertação de Mestrado - Embrapa
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR CÁPSULA E SUPERÓXIDO DISMUTASE COMO FATORES DE VIRULÊNCIA EM Actinobacillus pleuropneumoniae CATIA SILENE KLEIN PORTO ALEGRE dezembro de 2000
Transcript of Dissertação de Mestrado - Embrapa
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CÁPSULA E SUPERÓXIDO DISMUTASE COMO FATORES DE VIRULÊNCIA EM Actinobacillus pleuropneumoniae
CATIA SILENE KLEIN
PORTO ALEGRE
dezembro de 2000
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CÁPSULA E SUPERÓXIDO DISMUTASE COMO FATORES DE VIRULÊNCIA EM Actinobacillus pleuropneumoniae
por
Catia Silene Klein
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Celular e Molecular da UFRGS como um dos requisitos para obtenção do
grau de Mestre.
Profª. Irene Silveira Schrank
Orientadora
PORTO ALEGRE, dezembro de 2000.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Cápsula e Superóxido Dismutase como Fatores de Virulência em Actinobacillus pleuropneumoniae
por
CATIA SILENE KLEIN
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre no
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, pela comissão formada pelos professores:
Profa.
Dra. Marisa Ribeiro de Itapema Cardoso
Membro da Comissão
Prof.
Dr. Itabajara da Silva Vaz Jr
Membro da Comissão
Dr. Itamar Antônio Piffer
Membro da Comissão
Profa. Dra. Irene Silveira Schrank
Orientadora e Presidente da Comissão
Porto Alegre, dezembro de 2000.
iii
Este trabalho foi realizado nos laboratórios do
Centro de Biotecnologia da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, sendo financiado pela
Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande
do Sul (FAPERGS) e Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
(CAPES).
iv
AGRADECIMENTOS
À Dra. Irene Silveira Schrank, pela orientação, ensinamentos, sugestões,
confiança em mim depositada durante a realização deste curso.
Ao Dr. Sérgio Ceroni da Silva pela atenção, auxílio, sugestões dadas e
amizade durante a minha permanência no laboratório 213.
Ao Dr. Itamar Piffer pessoa que admiro muito e tornou possível a realização
deste curso e também pelo apoio, atenção e sugestões dadas quando solicitei seus
conhecimentos.
Aos Profs. Dra. Marilene Vainstein e Dr. Arnaldo Zaha, pelas sugestões e
ensinamentos repassados através da comissão de acompanhamento.
Ao Prof. Dr. Augusto Schrank pela atenção dada sempre que solicitado.
Aos secretários do PPGBCM Sílvia e Luciano pela amizade, dedicação e
atenção profissional sempre que solicitados.
À todas as colegas do laboratório 213 pela convivência e amizade e em
especial à Raquel e à Clarissa pelo auxílio técnico em muitos momentos.
Aos colegas da Embrapa e dos laboratórios 107, 205 e 210 pela convivência,
amizade e auxílio quando necessário.
À amiga e colega Deise pela amizade, convivência, atenção e auxílio sempre
que solicitei seus conhecimentos teóricos e práticos.
As amigas Jalusa, Valéria, Virgínia, Suzana e Patrícia pelo incentivo e apoio
sempre em todos os momentos.
Ao Hermides pela amizade, auxílio, ensinamentos teóricos e práticos em
muitos momentos.
À minha família especialmente aos meus pais pelo amor e esforços para a
minha formação.
Ao meu marido Sérgio pelo incentivo, amor e compreensão na minha
ausência e pelo apoio em todos os momentos de dificuldades.
À todos os professores e funcionários do Centro de Biotecnologia.
À colega da Embrapa Maria Fávero pelo incentivo e ajuda laboratorial.
Aos colegas do curso, pela amizade e convivência.
v
SUMÁRIO Lista de abreviaturas, símbolos e unidades ..............................................................viii
Lista de tabelas .......................................................................................................... xi
Lista de figuras .......................................................................................................... xii
Resumo.................................................................................................................... xiv
Abstract .................................................................................................................... xvi
Capítulo 1 ....................................................................................................................1
1 Introdução ................................................................................................................2
1.1 Importância da suinocultura no Brasil ...................................................................2
1.2 Doenças respiratórias dos suínos .........................................................................3
1.3 Pleuropneumonia suína (PPS) ..............................................................................4
1.3.1 Agente etiológico da PPS...................................................................................7
1.3.2 Caracterização bioquímica .................................................................................8
1.3.3 Isolamento do A. pleuropneumoniaae ................................................................9
1.3.4 Sorotipos de A. pleuropneumoniae ..................................................................11
1.3.5 Epidemiologia...................................................................................................12
1.3.6 Fatores de virulência ........................................................................................13
1.3.6.1 Toxinas e LPS ...............................................................................................13
1.3.6.2 Cápsula. ........................................................................................................17
1.3.6.3 Superóxido dismutase (SOD)........................................................................23
1.3.7 Vacinas e resposta imune e celular..................................................................28
1.3.8 Técnicas utilizadas na identificação e detecção do A. pleuropneumoniae .......31
1.3.9 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .........................................................32
1.4 A espécie Actinobacillus suis ..............................................................................36
1.5 Objetivos .............................................................................................................38
Capítulo 2 ..................................................................................................................39
vi
Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR on field strains isolated from
healthy and diseased pigs.........................................................................................39
Capítulo 3 ..................................................................................................................40
3 Materiais e métodos ...............................................................................................41
3.1 Origem das amostras analisadas ........................................................................41
3.2 Meios de cultura e condições de cultivo das amostras .......................................43
3.3 Enzimas...............................................................................................................43
3.4 Caracterização do gene cpx de A. pleuropneumoniae ........................................43
3.4.1 Clivagem do produto amplificado por PCRcpx .................................................43
3.4.2 Clivagem do DNA genômico. ...........................................................................44
3.4.3 Detecção microbiológica de cápsula ................................................................44
3.5 PCR para genes sodC de A. pleuropneumoniae.................................................45
3.5.1 Desenvolvimento de primers específicos .........................................................45
3.5.2 Extração de DNA total ......................................................................................46
3.5.3 Aplicação da técnica de PCR para o gene sodC de
A. pleuropneumoniae ................................................................................................46
3.6 Otimização das condições de PCR para o gene sodC de
A. pleuropneumoniae ................................................................................................47
3.6.1Controles da técnica de PCR ............................................................................47
3.6.2 Clivagem do produto PPsodC ..........................................................................49
3.6.3 Eletroforese dos produtos de PCR em gel de agarose ....................................49
3.6.4 Southern blot ....................................................................................................49
3.6.4.1 Transferência de DNA para membrana de nylon ..........................................49
3.6.4.2 Preparo da sonda para hibridização..............................................................49
3.6.5 Seqüenciamento dos fragmentos de PCR .......................................................50
3.6.5.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante......................................50
3.6.5.1.1 Solução estoque de acrilamida a 42% .......................................................50
3.6.5.1.2 Montagem do gel, aplicação das amostras e corrida eletroforética............51
3.6.5.1.3 Secagem do gel, exposição e revelação em filme de radiografia...............51
3.7 Detecção da atividade de superóxido dismutases (SODs)..................................51
3.7.1 Preparo das amostras de A. pleuropneumoniae ..............................................51
3.7.2 Soluções utilizadas...........................................................................................52
3.7.2.1 Tampão de amostra ......................................................................................52
vii
3.7.2.2 Soluções para visualização de atividade das SODs .....................................52
3.7.2.2.1 Solução de NBT (Nitrobluetetrazolium) ......................................................52
3.7.2.2.2 Solução de inibição KCN/H2O2...................................................................52
3.7.2.2.3 Solução reveladora.....................................................................................52
3.7.2.3 Solução estoque de acrilamida-bisacrilamida ...............................................53
3.7.2.3.1 Solução separadora (Running)...................................................................53
3.7.2.3.2 Solução concentradora (Stacking)..............................................................53
3.7.2.4 Soluções aceleradoras da polimerização ......................................................53
3.7.2.4.1 Solução aceleradora separadora (Running)...............................................53
3.7.2.4.2 Solução aceleradora concentradora (Stacking)..........................................53
3.7.2.5 Tampão para corrida eletroforética (10X)......................................................53
3.7.3 Confecção dos géis nativos (não desnaturantes).............................................53
3.7.3.1 Gel separador (Running) ...............................................................................53
3.7.3.2 Gel concentrador (Stacking)..........................................................................54
3.7.4 Determinação do metal ligante.........................................................................54
Capítulo 4 ..................................................................................................................55
4 Resultados .............................................................................................................56
4.1 Caracterização do produto de amplificação relativo ao operon que
codifica as proteínas de transporte de cápsula .........................................................56
4.2 Padronização da técnica de PCR para amplificação do gene sodC ...................60
4.3 Aplicação da técnica de PCRsodC em isolados de campo.................................65
4.4 CuZnSOD em A. pleuropneumoniae ...................................................................70
Capítulo 5 ..................................................................................................................74
5. Discussão..............................................................................................................75
Capítulo 6 ..................................................................................................................87
6 Referências bibliográficas ......................................................................................88
viii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
AP-PCR arbitrarily primed polymerase chain reaction (reação em cadeia da
polimerase com primers arbitrários)
α-33P fósforo radioativo
Am Actinobacillus minor
App Actinobacillus pleuropneumoniae
aroA gene codificante - 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase
BHI brain heart infusion
ºC grau Celsius
CAMP Christie, Atkin, Munch-Peterson reaction
CNPSA Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves
CO2 dióxido de carbono
cm centímetros
CuZnSOD Cobre-Zinco superóxido dismutase
DNA ácido desoxirribonucléico
EDTA ácido etilenodiaminotetraacético; sal dissódico
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio imunoenzimático)
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
ETB extrato total bacteriano
FeSOD ferro superóxido dismutase
g força gravitacional
HCl ácido clorídrico
Hps Haemophilus parasuis
kb kilobase
KDA kilodalton
LB Lúria Bertani
LPS-CL lipopolissacarídeos de cadeia longa
MnSOD Manganês superóxido dismutase
mg miligrama
Mg magnésio
MgCl2 cloreto de magnésio
ml mililitro
mM milimolar
ix
NAD nicotimamida-adenina-dinucleotídeo
NBT nitrobluetetrazoliun
NT não sorotipificáveis
omlA gene codificante - outer membrane lipoprotein (lipoproteína de
membrana externa)
ORF open reading frame (fase de leitura aberta)
PMOL picomolar
PB par de bases
PH potencial de hidrogênio
PFGE pulsed field gel electrophoresis (PFGE) (Eletroforese em gel de
campo pulsado)
PMSF fenilmetilsulfonil fluoreto
PPS pleuropneumonia suína
P/V peso por volume
PCR polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
PCRcpx reação em cadeia da polimerase para genes cpx de
A. pleuropneumoniae
PCRsodC reação em cadeia da polimerase para genes sodC de
A. pleuropneumoniae
PPcpx produto amplificado por PCRcpx utilizando os primers cpx
PPsodC produto amplificado por PCRsodC utilizando os primers sodC
PPMsod produto amplificado por PCRsodC utilizando os primers Msod
RFLP restriction fragment length polymorphism (polimorfismo para
tamanho de fragmentos de restrição)
rpm rotações por minuto
RTX repeat toxins (toxinas com repetições)
SDS dodecilsulfato de sódio
SOD superóxido dismutase
SPF specific patogen free (livre de patógeno específico)
SSC solução sódio citrato
ST sorotipificáveis
TEMED N,N,N’,N’-tetrametil etilenediametilamina
TLCK Nα-p-tosil-L-lisina clorometil cetona
TPCK N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona
x
Tris tris (hidroximetil) aminometano
U unidade
UFC unidade formadora de colônia
µg micrograma
µM micromolar
v/v volume por volume
10 X 10 vezes a concentração de uso
20 X 20 vezes a concentração de uso
xi
LISTA DE TABELAS TABELA 1. Isolados de A. pleuropneumoniae oriundos de casos clínicos no
Brasil .........................................................................................................................42
TABELA 2. Número de amostras NAD-dependentes isoladas de tonsilas de
leitões assintomáticos ...............................................................................................42
TABELA 3. Seqüências dos primers sodC e Msod ...................................................45
TABELA 4. Amostras bacterianas utilizadas na padronização dos testes de
PCRcpx e PCRsodC .................................................................................................48
TABELA 5. Análise microbiológica de presença de cápsula .....................................60
TABELA 6. Classificação bioquímica e resultados de PCR de isolados App
de casos clínicos .......................................................................................................65
TABELA 7. Classificação bioquímica e resultados de PCRsodC dos isolados
de rebanhos assintomáticos......................................................................................66
TABELA 8. Caracterização de isolados App originados de casos clínicos de
PPS ...........................................................................................................................67
TABELA 9. Caracterização de isolados App de rebanhos assintomáticos com
9 a 15 semanas de idade ..........................................................................................68
TABELA 10. Caracterização de amostras NT. ..........................................................86
xii
LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Operon dos genes cpx com a região de 715pb amplificada pelos
primers cpx................................................................................................................44
FIGURA 2. Região genômica de App ressaltando o gene sodC (573 pb).................45
FIGURA 3. Clivagem do produto de PCR PPcpx do sorotipo 5a de
A. pleuropneumoniae ................................................................................................56
FIGURA 4. Clivagem do produto de PPcpx do isolado de
A. pleuropneumoniae 6800 oriundo de campo..........................................................57
FIGURA 5. Esquema de clivagem do fragmento PPcpx com os sítios para
TaqI ...........................................................................................................................57
FIGURA 6. Seqüência de nucleotídeo do produto PPcpx de App.............................58
FIGURA 7. Clivagem dos DNAs genômicos e hibridização com PPcpx ...................59
FIGURA 8. Análise por PCR da presença do gene sodC em App ...........................61
FIGURA 9. Análise por PCR da presença do gene sodC .........................................62
FIGURA 10. Clivagem do fragmento PPsodC de App ..............................................63
FIGURA 11. Esquema de clivagem do fragmento PPsodC com o sítio para
BamHI .......................................................................................................................63
FIGURA 12. Seqüência de nucleotídeo do produto amplificado de PPMsod............64
FIGURA 13. Detecção de CuZnSOD em App sorotipo 5a ........................................71
FIGURA 14. Detecção de CuZnSOD em isolado de App ST ....................................71
xiii
FIGURA 15. Detecção de CuZnSOD em isolado de App NT....................................72
FIGURA 16. Detecção de CuZnSOD em isolado de A. minor...................................73
FIGURA 17. Detecção de CuZnSOD em A. suis.......................................................73
xiv
RESUMO
O Actinobacillus pleuropneumoniae causador da pleuropneumonia suína
apresenta vários fatores relacionados com sua patogenicidade como presença de
cápsula e de toxinas. As enzimas superóxido dismutase podem também estar
envolvidas no processo de patogenicidade por permitir o App resistir a ação tóxica
de espécies reativas de oxigênio produzido pelas células inflamatórias do
hospedeiro. O operon composto dos genes cpxDCBA, responsável pelo transporte
da cápsula, é altamente conservado nos diferentes sorotipos de App. A
padronização do método de PCR para os genes cpx (PCRcpx) de App resultou na
amplificação de um produto de 715pb a partir do DNA de todos os sorotipos com
exceção do sorotipo 4. Como não ocorreu também hibridização do fragmento de
PCR com DNA total do sorotipo 4 sugere-se que este deve apresentar um sistema
alternativo de transporte de polissacarídeos capsulares diferente dos demais
sorotipos. O desenvolvimento e aplicação do método de PCR para o gene sodC
(PCRsodC) de App, que codifica a proteína CuZnSOD, resultaram na amplificação
de um produto de 504pb em todos os sorotipos de App. Foram analisadas por
PCRcpx e PCRsodC um total de 120 isolados NAD-dependentes oriundos da
cavidade nasal ou de fragmento de pulmão de suínos. Entre estes isolados sessenta
e três foram obtidos de casos clínicos de PPS e os outros cinqüenta e sete foram
obtidos de diferentes rebanhos com aspectos clínicos e sanitário diversos.
Entre os isolados analisados para PCRsodC e PCRcpx cento e onze
isolados confirmaram os resultados da classificação prévia. Somente nove isolados
apresentaram resultados contraditórios sendo, todos eles, classificados como App
não sorotipificávies (NT). Destes App NT isolados, três apresentaram um perfil de
genes que codificam toxinas compatíveis com o sorotipo 4 e os demais isolados
apresentaram perfis de toxinas correspondente aos outros sorotipos. O resultado de
PCRcpx negativo pode sugerir que estes isolados devem possuir uma estrutura de
genes similares aos do sorotipo 4 que não pôde ser detectada pelos primers cpx ou
fazem parte de novos sorotipos que possuem estruturas diferente dos demais
sorotipos padrões. Estes resultados indicam que a metodologia de PCRcpx pode ser
aplicada na caracterização de isolados App diferenciando de outros isolados NAD-
dependentes. Resultados do PCRsodC demonstraram que este gene é comum em
todos os isolados App mesmo nos isolados de rebanhos sem sintomas de PPS.
xv
Provavelmente a presença de superóxido dismutase não deve ser considerada como
fator diretamente relacionado de virulência de App.
xvi
ABSTRACT
Actinobacillus pleuropneumoniae (App) is the etiological agent of porcine
pleuropneumoniae. Several factors have been proposed to be involved in virulence
as the presence of capsule and toxins. The role of superoxide dismutase as a
potential virulence determinant can be suggested by the protection of the bacterial
cell from the direct killing mechanisms used by the host immune system. The DNA
region involved in the exportation of capsular polysaccharides (cpxDCBA) is highly
conserved among the A. pleuropneumoniae serotypes. Using the specific PCR assay
(PCRcpx) it was possible to amplify a 715 bp fragment from the DNA of all App
serotypes with the exception of serotype 4. No hybridization product was visualized
when total DNA from serotype 4 was hybridized against the 715 bp PCR product
from serotype 5. We can suggest that serotype 4 has an alternative mechanism for
the exportation of capsular polysaccharides. We have developed a PCRsod system
that amplifies a 504 bp fragment from the sodC gene from al App serotypes. Using
both PCR tests, PCRcpx and PCRsod, we have characterized 120 NAD-dependent
isolates from tonsils of different herds. Among these, 63 were originated from herds
with clinical symptons of swine pleuropneumoniae and 57 from animals of apparently
healthy herds. The PCR assays (PCRcpx and PCRsod) have classified 111 isolates
as App and are in agreement with the biochemical analysis. Only 9 App
nonserotypeable (NT) showed conflicting results. Three of these isolates revealed a
pattern of toxin amplification product compatible to serotype 4. The other App NT
might represent a population of isolates that originally were serotypeable but lost the
ability to react with serotype-specific antisera or might belong to new serotypes not
yet described. The PCRcpx can be applied for detection of cpx genes from
serotypeable App strains and for nonserotypeable strains isolates from acute cases
of swine pleuropneumoniae. The PCRsod assay revealed that the sodC gene is
present in all App isolates from different herds. Therefore, it is possible to suggest
that the presence of CuZn-superoxide dismutase (sodC) is not directly related with
App virulence.
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
2
1 INTRODUÇÃO
1.1 Importância da suinocultura no Brasil.
A suinocultura no Brasil gera cerca de 2,5 milhões de empregos diretos ou
indiretos (GOMES, 1993). Com mão de obra tipicamente familiar, está presente em
quase metade das propriedades agrícolas e é praticada na maioria por pequenos
produtores, que participam de sistemas integrados coordenados pelas agroindústrias
(BOHRER, 1993) tendo importância fundamental na fixação do homem no campo.
VIOLA e BARTELS (1993) estimaram que 76% das propriedades rurais do Rio
Grande do Sul possuem suínos e destas, 16% comercializam os animais como fonte
de renda.
O rebanho de suínos no Brasil no ano de 1999 era de 36,5 milhões de
cabeças, sendo que 66% da produção foi dirigida ao consumo interno através de
produtos industrializados, 29% foi comercializada como carne congelada, salgada ou
gorduras e 5% foi exportada (MARTINS, 1999). Segundo dados do censo
agropecuário do IBGE no ano de 1996 o estado de Santa Catarina contava com um
rebanho de 4.535.571 suínos sendo que o rebanho da região oeste do estado era de
3.431.932 suínos. O estado do Rio Grande do Sul contava com um rebanho de
3.933.845 suínos e destes, 2.799.195 localizavam-se na região noroeste do estado.
No Brasil existem 118 indústrias frigoríficas, que são responsáveis pelo
abate de 22,4 milhões de suínos/ano, sendo 18,2 milhões com inspeção federal e
gerando produção de 1,62 milhões de toneladas (MARTINS, 1999). A região sul do
Brasil é responsável por 87% do abate inspecionado (GOMES, 1993) e detém mais
de 50% da produção nacional com média de abate de 11.245.927 cabeças /ano
(MARTINS, 1999).
A carne suína também é e continuará sendo a carne mais consumida
mundialmente, com 38,1% a mais que a carne de aves que vem em segundo lugar
(FAO/GIEWS, 2000). Na Alemanha, Holanda e Dinamarca o consumo chega a 50kg,
na China consomem 19kg per capita por ano (GOMES, 1993). Quanto à produção
mundial de carnes em 1998, a carne suína representou 45%, a de frango 29% e a
de bovino 26%. A exportação brasileira de suínos no ano de 1997 foi de 63.827
3
toneladas para 81.565 toneladas no ano de 1998. Os índices de produção e
produtividade foram comparáveis com os obtidos nos EUA, Canadá, Dinamarca,
Holanda e Reino Unido (MARTINS, 1999). Os números para o ano de 2000 no Brasil são de um rebanho de 38.300
milhões cabeças, com produção de 24.700 milhões de cabeças e 1.926 milhões de
toneladas. A quantia de carne abatida, com inspeção federal, é de 19.900 milhões
de cabeças, com um consumo interno de 1.807 milhões de toneladas e 10,9
kg/habitante. (ABIPECS/ABCS, 2000). A estimativa em milhões de toneladas para o
ano de 2000, será de 90,3 para a produção e de 3,210 para exportação da carne
suína (FAO/GIEWS, 2000). Até o mês de agosto deste ano, foram exportadas 72,4
mil toneladas, com receita de US$ 95,841 milhões, indicando um crescimento de
42% na quantidade e de 25% na receita obtida. No mês de agosto deste ano o
volume de exportação foi de 15,5 mil toneladas, gerando receita de US$ 20,954
milhões, 126% superior ao volume verificado no mesmo mês do ano de 1999
(ABIPECS/ABCS, 2000).
1.2 Doenças respiratórias dos suínos.
Devido à criação intensiva de suínos na região sul e sudeste do Brasil, a
ocorrência de doenças respiratórias está presente em quase todos os criatórios,
aumentando assim o custo da produção.
A prevalência de doenças respiratórias determinada para o ano de 1987
para o estado de Santa Catarina foi de 47% para rinite atrófica e de 55,3% para
pneumonias em animais oriundos de 133 rebanhos de sistema integrado de
produção. A estimativa de perda foi de 3,7% para redução no ganho de peso diário
causada por rinite atrófica e 2,4% por pneumonias, desde o nascimento até o abate
dos animais. As principais doenças respiratórias dos suínos são: pneumonia
micoplásmica (Mycoplasma hyopneumoniae), rinite atrófica (Bordetella
bronchiseptica e Pasteurella multocida) e pleuropneumonia (Actinobacillus
pleuropneumoniae) (SOBESTIANSKY et alii, 1987). As pneumonias são
responsáveis pela perda de 2,4 suínos com peso de 95kg para cada 100 animais
abatidos no sul do Brasil (PIFFER et alii, 1985b). PIFFER et alii (1985b) analisaram um conjunto de animais com diversos
graus de severidade de hepatização pulmonar e pleurisia observadas ao abate e
4
relacionaram com o desempenho produtivo no período de 128 e 169 dias de idade.
A hepatização pulmonar associada com pleurisia pode levar a uma redução de
14,7% no desenvolvimento dos animais e a hepatização superior a 10% da área
pulmonar pode reduzir em 9,3% o ganho de peso, quando comparados a animais
sem comprometimento pulmonar do mesmo grupo.
No ano de 1992, foram abatidos 4.061.479 suínos terminados no estado
de Santa Catarina e, do total, 6,07% foram condenados por pneumonia ou pleurisias
e tiveram aproveitamento condicional da carcaça (AINCADESC, 1993). Podem ser adotadas medidas estratégicas globais para o controle das
doenças respiratórias como, despopulação do rebanho, desmame precoce
medicado, produção em três sítios e sistema Zimmerman (PIFFER, 1997), porém é
necessário avaliar os custos e escolher o melhor método de acordo com cada
rebanho.
Em trabalho conjunto da Embrapa Suínos e Aves com o Centro de
Biotecnologia/UFRGS-Porto Alegre-RS, buscamos desenvolver métodos cada vez
mais precisos e seguros com a utilização de técnicas de biologia molecular para a
detecção do microrganismo causador da pleuropneumonia suína, evitando maiores
custos na produção.
1.3 Pleuropneumonia suína (PPS).
A PPS é uma doença infecto-contagiosa que se apresenta sob a forma
superaguda, aguda, subaguda e crônica. Na forma super-aguda, os animais
apresentam febre em torno de 41,5°C, apatia, anorexia e freqüentemente diarréia,
tosse e vômito. Usualmente envolve inflamação do pulmão, pleura e pericárdio. A
manifestação clínica da doença cursa com pneumonia fibrino-necrótica e
hemorrágica aguda. A taxa de morbidade é baixa, mas a mortalidade pode chegar a
100% se os animais não forem medicados. A forma super-aguda se manifesta por
um severo quadro respiratório, seguido de morte que pode ocorrer entre 24 e
36 horas após o surgimento clínico da enfermidade. Podem ser encontrados animais
mortos, sem sinais clínicos anteriores, apresentando secreção sanguinolenta nas
narinas e boca e na maioria das vezes, a infecção torna-se crônica. Na forma aguda,
os mesmos animais apresentam febre em torno de 40.5-41oC, severo quadro
respiratório com dispnéia, tosse, acompanhado de anorexia com morbidade alta e,
5
dependendo da virulência da amostra, a mortalidade pode variar sendo geralmente
alta. As formas subaguda e crônica se desenvolvem após desaparecerem os
sintomas agudos com pouca ou nenhuma febre e os sinais estão relacionados
principalmente com a diminuição no desenvolvimento dos animais e tosse
esporádica (NICOLET, 1992; SOBESTIANSKY et alii, 1999). Nos estágios agudos
da pleuropneumonia as lesões histológicas são caracterizadas por necrose
coagulativa, hemorragia, trombose vascular, edema, deposição de fibrina e
infiltração do parênquima pulmonar por neutrófilos, linfócitos e macrófagos
alveolares e pleurite fibrinosa (BERTRAM, 1985; LIGGET et alii, 1987; IDRIS et alii,
1993). Em lesões crônicas uma fina camada de tecido granuloso seqüestra a área
de necrose pulmonar (LIGGETT et alii, 1987). O mesmo quadro morfopatológico
pulmonar foi observado por MORES et alii (1984) através de experimentos com 16
suínos de 70 a 90 dias de idade inoculados com diferentes concentrações de
A. pleuropneumoniae e sacrificados nos dias 1, 3, 5, 14 e 21 pós infecção (PI).
Durante as primeiras 24 horas foi observada uma reação circulatória perivascular,
peribronquial, interlobular e intra-alveolar caracterizada por edema, hemorragia e
exudação fibrinosa. Até o quinto dia após a inoculação (PI) foi observada uma
reação celular mononuclear que envolvia o tecido conjuntivo, alvéolos, brônquios,
bronquíolos, vasos sangüíneos e linfáticos. Entre o quinto e vigésimo sétimo dia PI
foi observada necrose do parênquima pulmonar e reação fibrótica.
Após a recuperação do quadro agudo da doença, alguns animais
permanecem com lesões crônicas no pulmão, resultando numa redução no ganho
de peso. Os suínos que sobrevivem à infecção tornam-se carreadores e portadores
subclínicos do patógeno, podendo abrigar o App no trato respiratório, principalmente
nas tonsilas ou na cavidade nasal (KUME et alii, 1984; SIDIBÉ et alii, 1993). Uma
vez o rebanho tornando-se infectado, este permanece com a presença do agente
(FENWICK & HENRY, 1994).
O A. pleuropneumoniae é um patógeno do trato respiratório, sendo
específico de suínos (KUME et alii, 1984), entretanto, lesões de pleuropneumonia
observadas em 3 grupos de camundongos inoculados experimentalmente com
células de A. pleuropneumoniae intactas, lipopolissacarídeos (LPS) ou sobrenadante
de cultura livre de células (CFCSF) contendo hemolisinas, foram similares àquelas
encontradas em suínos (IDRIS et alii, 1993).
Os rebanhos que possuem PPS crônica, apresentam registro de
6
condenação de carcaças no abatedouro por aderência de pleura (pleurisia)
(NICOLET, 1992; SOBESTIANSKY et alii, 1999). Os sintomas podem ocorrer ou se
agravar quando a PPS está associada a outros problemas respiratórios. Lesões de
hepatização pulmonar características de pneumonia enzoótica foram observadas em
78% dos animais inoculados com A. pleuropneumoniae (PIFFER et alii, 1986).
Entretanto, o A. pleuropneumoniae é capaz de induzir sozinho, e sem a associação
de vírus, uma pneumonia fulminante acompanhada de pleurite com mortalidade em
torno de 50% (SHOPE, 1964). O A. pleuropneumoniae é altamente contagioso, espalhando-se
rapidamente para rebanhos não imunes e afeta suínos de todas as idades. Isso
muitas vezes ocorre como resultado da introdução de animais portadores do agente
em rebanhos livres da infecção (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983; INZANA, 1991;
CHATELLIER et alii, 1999). A severidade da doença depende do estado imune dos
animais (NIELSEN, 1979), do número de bactérias que atingem o pulmão (SHOPE,
1964; SEBUNYA et alii, 1983b) e da presença concomitante de fatores estressantes (PIFFER et alii, 1982). Os índices de morbidade e mortalidade são muito variáveis,
permanecendo entre 8,5% a 40% e 0,4% a 24%, respectivamente (SEBUNYA &
SAUNDERS, 1983).
O primeiro surto de PPS ocorreu na Inglaterra e foi registrado por
MATHEWS & PATTISON (1961), em seguida por ORLANDER (1963) nos EUA, por
SHOPE (1964) na Argentina, por SCHIEFER & GREENFIELD (1974) no Canadá,
por MYLREA et alii (1974) na Austrália, por HILBINK et alii (1992) na Nova Zelândia
e em muitos outros países (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983). LOCATELLI et alii
(1981), registraram pela primeira vez no Brasil a ocorrência de um surto agudo de
PPS no município de Chapecó – SC com morbidade de 70% e mortalidade entre 10
e 20%. Desde então, vários outros surtos foram observados na região sul do Brasil
(PIFFER et alii, 1983) e existem relatos da ocorrência da enfermidade em todos os
países onde a produção de suínos é intensiva (NICOLET, 1992; PIFFER et alii,
1987).
As perdas econômicas relacionadas à PPS recaem tanto sobre o
produtor, como sobre a indústria. O produtor sofre em conseqüência das perdas de
animais pela alta mortalidade, gastos com medicação, aumento do custo devido ao
maior tempo para engorda e pela redução no desenvolvimento corporal dos animais.
Na indústria, há muita condenação ou utilização condicional das carcaças devido a
7
sinais clínicos da doença (PIFFER et alii, 1982). As carcaças condenadas são
destinadas para graxaria e conservas (PIFFER et alii, 1985b).
PROTAS et alii (1985) avaliaram que os custos com morte de animais e
despesas com medicamentos nos três meses correspondentes à fase aguda da
doença foram equivalentes a 31.681kg (21.081 kg por mortes e 10.600 kg por gastos
com medicamentos) de suínos em condições de abate. ROHRBACH et alii (1993)
sugeriram que 5,64 dias adicionais são necessários para suínos com infecção
subclínica adquirirem peso para o abate quando comparados com suínos de
rebanhos não infectados.
A PPS é transmitida por via respiratória e a doença espalha-se
rapidamente de um animal doente para suínos sadios. O A. pleuropneumoniae pode
ser transmitido pelo ar, por aerossóis, numa distância de poucos metros entre as
baias adjacentes ou por contato direto suíno-suíno (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983;
SAVOYE et alii, 2000; JOBERT et alii, 2000). Cobaias (porquinhos-da-índia)
inoculados por via intratraqueal com dose elevada de sorotipo 1 de A.
pleuropneumoniae apresentaram morte em 24 horas com lesões pulmonares
hemorrágicas, enquanto que animais com dose mais baixa foram sacrificados 11
dias após inoculação e apresentaram apenas hiperplasia do tecido linfóide
peribronquial (PERFUMO et alii, 1999). Estes experimentos, sugerem que
camundongos e cobaias podem ser usados como modelo para o desenvolvimento
de experimentos de inoculação de A. pleuropneumoniae. Alguns fatores de risco predispõem os surtos de PPS, como, a introdução
e transporte de animais no rebanho, condições estressantes em decorrência do
afastamento da mãe, condições climáticas adversas, alta umidade do ar e ventilação
insuficiente, superlotação, mudança de regime alimentar, mistura com animais
estranhos e/ou oriundos de outros lotes (PIFFER, 1997; NICOLET, 1992). Formas
de manejo que causem estresse favorecem o surgimento da doença em rebanhos
cronicamente infectados (SANFORD & JOSEPHSON, 1981; ROSENDAL &
MITCHELL, 1983; NICOLET, 1992).
1.3.1 Agente etiológico da PPS.
A família Pasteurellaceae compreende organismos dos gêneros
Haemophilus, Actinobacillus e Pasteurella. São organismos pequenos, Gram-
8
negativos, imóveis, pleomórficos, cocobacilos, anaeróbicos facultativos com
metabolismo de forma respiratória ou fermentativa, com baixa taxa de G + C (38-
44%) e genoma relativamente pequeno (MACINNES & SMART, 1993). No trato
respiratório superior de suínos são encontrados sete membros fator V (Nicotinamida
Adenina Dinucleotídeo - NAD) dependentes da família Pasteurellaceae:
Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Haemophilus taxon minor
group, Haemophilus taxon C, D, E e F (PIFFER et alii, 1997). Através de análise de
hibridização DNA-DNA e comparação das seqüências dos genes que codificam
rDNA 16S, três novas espécies da família Pasteurellaceae foram propostas como
pertencentes a diferentes grupos filogenéticos. O Haemophilus taxon minor group foi
reclassificado para Actinobacillus minor, os taxa D e E foram classificados como
Actinobacillus porcinus e o taxon F classificado como Actinobacillus indolicus
(MØLLER et alii, 1996).
O A. pleuropneumoniae é capsulado, anaeróbico facultativo sendo o
agente etiológico causador da pleuropneumonia suína. Suas colônias produzem
zona β-hemolítica e as hemolisinas atuam sinérgicamente com a β-toxina de
Staphylococcus aureus em células sangüíneas produzindo o efeito CAMP
(SEBUNYA & SAUNDERS, 1983). O A. pleuropneumoniae foi classificado
primeiramente como Haemophilus parahaemolyticus (PITTMAN, 1953). KILLIAN et
alii (1978) recomendaram o uso do nome Haemophilus pleuropneumoniae para
substituir Haemophilus parahaemolyticus, conforme SHOPE (1964) havia proposto para diferenciar do agente que causa doença em humanos. POHL et alii (1983) com
o uso da técnica de hibridização do DNA reclassificou o agente como pertencente ao
gênero Actinobacillus e denominou-o como Actinobacillus pleuropneumoniae. O
A. pleuropneumoniae é diferenciado em 2 biotipos: biotipo 1, (β-NAD-dependente)
requer fator de crescimento e biotipo 2 (β-NAD-independente) (POHL et alii, 1983).
O biotipo 1 é distribuído em 12 sorotipos e é considerado mais virulento que o
biotipo 2 (NICOLET, 1992; DOM & HAESEBROUCK, 1992; JACOBSEN et alii,
1996).
1.3.2 Caracterização bioquímica.
O A. pleuropneumoniae é identificado através dos seguintes testes:
produção de hemólise, reação de CAMP, dependência do fator V, degradação da
9
uréia (BIBERSTEIN et alii, 1977), fermentação de manitol, D-galactose e ribose,
incapacidade de fermentar arabinose, inositol, melibiose, rafinose, sorbitol, trealose e
ausência de hidrólise pela α-fucosidase (GUTIERREZ et alii, 1993; MØLLER &
KILIAN, 1990). Diferencia-se dos outros grupos basicamente por três reações: falta
de produção de ácido da melibiose, hidrólise de leucina aminopeptidase e a falta de
hidrólise pela α-galactosidase (GUTIERREZ et alii,1993), esta última também foi
relatada por O`REILLY et alii (1984).
SIROIS & HIGGINS (1991) caracterizaram 67 amostras de A.
pleuropneumoniae como pertencentes a seis grupos fenotípicos. No Brasil, PIFFER
et alii (1997) caracterizaram 55 amostras de A. pleuropneumoniae isoladas de casos
clínicos de PPS e descreveram sete grupos fenotípicos pela variação bioquímica.
SIROIS & HIGGINS (1991) sugerem que as variações fenotípicas das amostras
podem representar sub-biovares de amostras dependentes do fator V.
As diferenças nos testes bioquímicos, resultados conflitantes e problemas
na sorotipificação das amostras de A. pleuropneumoniae com o surgimento de
muitas amostras não sorotipificáveis, levaram a aplicação de outras metodologias
objetivando a solução dos problemas de identificação e diferenciação das bactérias.
As metodologias de PCR (Técnica de Reação em Cadeia da Polimerase) e
Fingerprinting de DNA foram utilizadas como técnicas alternativas mais precisas na
tentativa de facilitar o diagnóstico e a diferenciação dos sorotipos (HENNESSY et
alii, 1993; RYCHLÍK et alii, 1994).
1.3.3 Isolamento do A. pleuropneumoniae.
O diagnóstico definitivo da pleuropneumonia é baseado nos sintomas
clínicos e nas lesões observadas no momento da necrópsia com isolamento
posterior do agente (MA et alii, 1990). O protocolo ideal sugerido para detecção do
A. pleuropneumoniae tem sido a cultura da bactéria a partir de amostras de animais
portadores assintomáticos (KUME et alii, 1984 e 1986; MITTAL et alii, 1983), pois
constituem a forma mais importante de manutenção da infecção no rebanho e de
transmissão da doença (ROSENDAL & MITTCHELL, 1983). Em torno de 30 a 60%
dos suínos de rebanhos convencionais carregam o App na cavidade nasal ou nas
tonsilas (KUME et alii, 1984, 1986; WILSON et alii, 1987; SIDIBÉ et alii, 1993;
JACOBSEN & NIELSEN, 1995; GRAM et alii, 1996; KICH et alii (2000).
10
O A. pleuropneumoniae pode ser isolado dos pulmões, tonsilas e de
secreções nasais dos leitões e de animais doentes com PPS de todas as idades,
assim como da cavidade nasal e tonsilas de suínos portadores assintomáticos
(KUME et alii, 1984; SIDIBÉ, 1993; MACHADO, 1996; KICH et alii, 2000). O
isolamento a partir de secreção pode ocorrer nos casos super-agudos, devido ao
grande número de bactéria, mas não de lesões crônicas, sendo necessário o
diagnóstico sorológico (FENWICK, 1990). O isolamento de App das tonsilas e
cavidade nasal é dificultado por inúmeras outras espécies de bactérias presentes,
necessitando, portanto, de meios seletivos (SIDIBÉ et alii, 1993; JACOBSEN &
NIELSEN, 1995). MØLLER et alii (1984) e SIDIBÉ et alii (1993) demonstraram que o
App foi preferencialmente isolado das tonsilas comparativamente ao isolamento da
cavidade nasal dos suínos. KICH et alii (2000) compararam três locais de coleta de
material em leitões portadores assintomáticos para isolamento sendo estes: swab
nasal; swab da superfície tonsilar e fragmento de tonsila. Estes materiais coletados
foram submetidos a cultivo em três diferentes meios: 1) semeadura direta em meio
sólido seletivo; 2) diluição em caldo BHI enriquecido e seletivo e 3) mesmas
diluições anteriores com semeadura em ágar sangue com estria de Staphylococcus
aureus. Este trabalho determinou que o melhor local de coleta é o fragmento de
tonsila cultivado em meio sólido seletivo. Amostras isoladas das tonsilas são
geneticamente mais divergentes do que as amostras isoladas de pulmão
(CHATELLIER et alii, 1999). A aderência do App às células do epitélio tonsilar,
constitui-se a primeira etapa no estabelecimento da bactéria no hospedeiro. Entretanto, os mecanismos pelos quais o App adere às células do epitélio tonsilar
não estão totalmente claros. É possível que o App eventualmente sobreviva nas
criptas tonsilares tornando o animal um portador (CHIERS et alii, 1999).
O A. pleuropneumoniae juntamente com P. multocida, foi isolado de otite
média e interna em suínos desmamados, provavelmente, causada por uma infecção
mista (DUFF et alii, 1996). Em suínos com osteomielite necrotizante e artrite
fibrinopurulenta foi registrado o isolamento de A. pleuropneumoniae sorotipo 2,
através da aplicação de hibridização in situ para RNA ribossomal 16S de
A. pleuropneumoniae (JENSEN et alii, 1999). A amostra K17 pertencente ao sorotipo
5a, isolada de artrite em cordeiro, quando inoculada em suínos, produz lesões
pneumônicas idênticas àquelas produzidas por isolados de suínos (BIBERSTEIN et
alii, 1977). Estes dados indicam uma nova patogenia para o A. pleuropneumoniae.
11
GUTIERREZ et alii (1992) estudaram a viabilidade do
A. pleuropneumoniae em amostras de pulmão, congeladas ou frescas, com
diferentes métodos de diagnósticos e verificaram que o isolamento de
A. pleuropneumoniae de amostras de pulmão fresco foi de 15,3% e de pulmão
congelado foi de 0,9%. Esta diferença demonstra que o A. pleuropneumoniae é
sensível ao congelamento e que quando pretende-se isolar o agente, amostras
frescas devem ser enviadas ao laboratório. O organismo sobrevive por curto período
de tempo no ambiente e quando protegido com muco ou matéria orgânica pode
sobreviver por poucos dias (NICOLET, 1992).
1.3.4 Sorotipos de A. pleuropneumoniae. O A. pleuropneumoniae é classificado em no mínimo 12 sorotipos
baseado na estrutura dos seus antígenos capsulares (NIELSEN, 1986; NICOLET,
1988; INZANA et alii, 1988).
Os sorotipos 1, 2 e 3 foram descritos por NICOLET (1971), os sorotipos 4,
5 e 6 por GUNNARSON et alii (1977), o sorotipo 7 por ROSENDAL & BOYD (1982),
o sorotipo 8 por NIELSEN & O’CONNOR (1983), os sorotipos 9 e 10 por NIELSEN
(1985a e b), e o sorotipo 12 por NIELSEN (1986a). O sorotipo 1 e o sorotipo 5 foram
divididos em dois subtipos a e b devido a diferenças antigênicas nos LPS e
polissacarídeos capsulares, respectivamente (JOLIE et alii, 1994; NIELSEN, 1986b).
Foram descritos sete antígenos somáticos (lipopolissacarídeos de cadeia longa-
LPS-CL), sendo que estes possuem reações cruzadas entre os diferentes sorotipos.
Os sorotipos capsulares 1, 9 e 11 apresentam o mesmo antígeno somático 1, os
sorotipos 3, 6 e 8 o antígeno somático 3 e os sorotipos 4 e 7 o antígeno somático 4.
Os demais sorotipos capsulares 2, 5, 10 e 12 apresentam um único antígeno
somático 2, 5, 6 e 7 respectivamente (NAKAI et alii, 1992). Devido à similaridade de
antígenos LPS, reações cruzadas podem ocorrer entre os sorotipos 1, 9 e 12; entre
os sorotipos 4 e 7; entre os sorotipos 3, 6 e 8 (NICOLET, 1988).
Diferenças significativas na virulência dos 12 sorotipos têm sido
observadas, sendo considerados os sorotipos 1, 5, 9 e 11 como os mais virulentos,
estando envolvidos em surtos graves da doença, com alta taxa de mortalidade e
graves lesões pulmonares. Os sorotipos 2, 3, 4, 6, 7, 8 e 12 se apresentam como os
menos virulentos, causando menores níveis de mortalidade (RAPP et alii, 1985;
12
INZANA, 1991; NICOLET, 1992). Entretanto, existem relatos de diferenças na
patogenicidade entre amostras do mesmo sorotipo, tendo sido isoladas amostras
pouco virulentas do sorotipo 5 e muito virulentas do sorotipo 3 e 7 (INZANA, 1991;
PIFFER & MORES, 1995).
Diferenças na seqüência de nucleotídeos na região média do gene omlA
do A. pleuropneumoniae, dividiu os sorotipos em 4 grupos com similaridades
variáveis. Um grupo contém os sorotipos 1, 9, 11 e 12 com 99-100% de similaridade,
outro grupo apresenta os sorotipos 3, 4, 6, 7 e 8 com 97 e 100% de similaridade e
um terceiro grupo com os sorotipos 5a, 5b e 10 com similaridade próxima de 100%.
Somente o sorotipo 2 constituiu um grupo separado (GRAM & AHRENS, 1998).
1.3.5 Epidemiologia.
O padrão de distribuição dos sorotipos no mundo varia de um país para
outro, sendo que poucos sorotipos predominam numa determinada região
geográfica e um mesmo rebanho pode ser contaminado por diferentes amostras do
mesmo sorotipo ou diversos sorotipos (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983; INZANA,
1991; CHATELLIER et alii, 1999).
A determinação do sorotipo é importante para o controle epidemiológico,
manutenção de rebanhos e monitoramento da dispersão ou introdução de novas
cepas (LO et alii, 1998). O conhecimento da distribuição dos sorotipos é importante
na aplicação de vacinas, pois as vacinas inativadas protegem apenas contra os
sorotipos que a constituem (NIELSEN et alii, 1976; NIELSEN, 1984).
Entre 1981 e 1984 foram identificados no Brasil os sorotipos 3 e 5
(PIFFER et alii, 1987). Posteriormente, os sorotipos 1, 3, 4 e 5 foram identificados no
período de 1986 e 1987 (SAITO et alii, 1988). No primeiro período, o sorotipo 5 foi o
mais prevalente e no segundo período o sorotipo 1 (PIFFER et alii, 1997). Durante o
desenvolvimento deste trabalho apenas os soros hiperimunes contra os sorotipos de
1 a 5 estavam disponíveis, portanto PIFFER et alii (1987) sorotipificaram apenas
19/33 (66%) das amostras estudadas. Em outro estudo, PIFFER et alii (1997) utilizando as técnicas de
imunodifusão (GUNNARSON, 1979) e hemaglutinação passiva (NIELSEN &
O`CONNOR, 1983), classificaram sorologicamente 55 isolados oriundos de pulmão
e da cavidade nasal de suínos com casos clínicos de PPS no sul e sudeste do Brasil
13
no período entre 1981 e 1993. Destes isolados, 54,5% pertenciam ao sorotipo 5,
27,3% ao sorotipo 3 e 13% ao sorotipo 7, dois isolados pertenceram ao sorotipo 1 e
um ao sorotipo 9. No estado do Rio Grande do Sul, foram isolados os sorotipos 3
(BOROWSKI et alii, 1995), 5 e 7, em Santa Catarina 3, 5 e 7, no Paraná e São
Paulo, o sorotipo 5 e em Minas Gerais os sorotipos 1, 3, 5, 7 e 9 (PIFFER, 1997).
Em um estudo da prevalência dos sorotipos na Austrália no período de
1988 à 1992 foi possível determinar que de 296 isolados de App, apenas 156
(52,7%) puderam ser sorotipificados como pertencente a apenas um dos 12
sorotipos como segue: sorotipo 1 (85 isolados), sorotipo 2 (4 isolados), sorotipo 3
(2 isolados), sorotipo 5 (10 isolados), sorotipo 7 (51 isolados), sorotipo 11
(2 isolados) e o sorotipo 12 (2 isolados). Dos 140 isolados restantes, 91 tiveram
reações cruzadas com os sorotipos 3 e 6, 1 com os sorotipos 9 e 10, 1 com os
sorotipos 9 e 11 e outros 47 permaneceram não sorotipificáveis (BLACKALL &
PAHOFF, 1995). Em outro estudo no período de 1993 à 1996, 91% (346/378) dos
isolados foram sorotipificados como pertencentes aos sorotipos 1 (104 isolados),
7 (83 isolados) e 12 (104 isolados), restaram ainda 3,4% dos isolados como não
sorotipificáveis e 5,1% como autoaglutinantes (BLACKALL et alii, 1999).
1.3.6 Fatores de virulência.
1.3.6.1 Toxinas e LPS.
Os padrões de virulência entre os sorotipos são bastante variáveis,
podendo existir diferenças entre amostras do mesmo sorotipo o que estaria
relacionado com a composição, estrutura e quantidade de cápsula (INZANA,
1991). Quando suínos saudáveis são expostos a sorotipos pouco virulentos ou um
baixo número de bactérias de sorotipos virulentos, apresentam títulos de anticorpos
séricos aumentados, embora não apresentem sinais clínicos característicos da PPS
(FENWICK & HENRY, 1994). MACHADO (1997) realizou um experimento inoculando três grupos de animais com os sorotipos 3, 5 e 7 de
A. pleuropneumoniae, mantendo outros não inoculados em contato. Os animais
inoculados com o sorotipo 5 apresentaram sinais de pleuropneumonia aguda com
lesões características observadas na necrópsia. Os animais inoculados com os
sorotipos 3 e 7 apresentaram alguma tosse, quando movimentados, sem sinais
clínicos de pleuropneumonia e na necrópsia não apresentaram lesões
14
macroscópicas. Este experimento demonstrou que a diferença na virulência entre os
sorotipos pode influenciar no desenvolvimento da doença.
Em relação aos outros sorotipos, alguns autores descrevem que nenhuma
diferença na virulência foi observada quando foram analisados os sorotipos 2, 3 e 9
de A. pleuropneumoniae NAD-dependente (DOM & HAESEBROUCK, 1992). No
entanto, outros autores descrevem o sorotipo 9 como mais virulento que o sorotipo 2
e muito mais virulento que o sorotipo 3 (DESROSTERS et alii, 1984). Similaridade
de virulência também foi encontrada entre os sorotipos 2, 5b e 6 do biotipo 1
(JACOBSEN et alii, 1996).
DOM & HAESEBROUCK (1992) inocularam leitões sem imunidade ativa e
passiva para comparar a virulência de uma amostra de A. pleuropneumoniae
sorotipo 2 NAD-dependente e uma amostra sorotipo 2 NAD-independente. Três de
seis animais inoculados com 500 UFC da amostra NAD-independente morreram 36
horas após a inoculação e outros 3 animais não apresentaram sintomas e foram
necropsiados 2 dias após a inoculação, apresentando poucas lesões com
quantidade de bactéria de 105-106 UFC por grama de tecido pulmonar. Entretanto, os
outros três suínos sem imunidade ativa e passiva inoculados com 50 UFC de
amostra NAD-independente desenvolveram doença super-aguda e morte em 36
horas. Outros 7 animais inoculados com a amostra NAD-dependente apresentaram
um perfil mais virulento em apenas 12 horas após a inoculação e exceto um, todos
os demais morreram 36 horas após a inoculação, apresentando pleuropneumonia
severa e uma quantidade de bactéria de 108-109 UFC por grama de tecido pulmonar
(DOM & HAESEBROUCK, 1992). Este experimento indicou que amostras NAD-
dependentes são mais virulentas que amostras NAD-independentes, porém
amostras NAD-independentes podem causar lesões similares tanto patológicas
quanto histologicamente, conforme já havia sido observado por FODOR et alii
(1989).
Alguns componentes celulares do A. pleuropneumoniae têm sido
relacionados com sua virulência e patogenicidade entre os quais: moléculas
receptoras de membrana responsáveis pela captação de ferro, um elemento
essencial para crescimento bacteriano (NIVEN et alii, 1989; GONZÁLES et alii,
1990); proteínas de membrana (GONZÁLEZ et alii, 1990); fímbrias que possibilitam
a adesão da bactéria nos tecidos (UTRERA & PIJOAN, 1991); cápsula que impede a
fagocitose da bactéria pelos macrófagos (INZANA et alii, 1988); proteases que
15
degradam IgA e hemoglobina suína mas não degradam IgG suína (NEGRETE-
ABASCAL et alii, 1994); lipopolissacarídeo (LPS) responsável pela inflamação
pulmonar aguda (UDEZE et alii, 1987; BÉLANGER et alii, 1995); citotoxinas que
inativam macrófagos, neutrófilos e outras células do sistema imune (DOM et alii,
1992b); hemolisinas que causam lise celular e necrose dos tecidos (BHATIA et alii,
1991; KAMP et alii, 1997) e a urease que catalisa a hidrólise da uréia para produzir
amônia e dióxido de carbono (BOSSÉ & MACINNES, 1997). No entanto, uma
amostra mutante que não produz urease mostrou-se virulenta e desenvolveu PPS
aguda indistingüível da produzida pela amostra tipo selvagem, indicando que o
A. pleuropneumoniae não necessita da atividade da urease para desenvolver
doença aguda (TASCÓN-CABRERO et alii, 1997).
Estudos de revisão sobre os fatores de virulência têm sido realizados por
INZANA (1991), TASCÓN et alii (1996) e HAESEBROUCK et alii (1997), onde
ressaltam como os principais fatores responsáveis pela virulência as toxinas Apx, a
cápsula, o LPS e as proteínas de membrana.
Os mecanismos pelos quais o A. pleuropneumoniae danifica os tecidos e
as células não são totalmente conhecidos (BHATIA et alii, 1991; IDRIS et alii, 1992; UDEZE & KADIS, 1992) e a variação na virulência entre os sorotipos é devida à
presença de diversos fatores (INZANA, 1991), podendo ser considerada multifatorial.
Os diferentes graus de virulência dos sorotipos de A. pleuropneumoniae
podem estar correlacionados com os padrões heterogêneos na produção de toxinas
Apx, sendo ApxI e ApxII relacionadas com as amostras mais virulentas (TASCÓN et
alii, 1994). O A. pleuropneumoniae produz quatro diferentes toxinas da família RTX
(Repeat ToXins), denominadas toxinas ApxI, ApxII, ApxIII (FREY et alii, 1993; FREY,
1995) e ApxIV (SCHALLER et alii, 1999). Em cultivo a maioria dos sorotipos produz
duas toxinas assim, os sorotipos 1, 5a, 5b, 9 e 11 produzem ApxI e ApxII, os
sorotipos 2, 3, 4, 6 e 8 produzem ApxII e ApxIII. Os demais sorotipos produzem
apenas uma toxina: ApxI pelo sorotipo 10 e ApxII pelos sorotipos 7 e 12 (FREY &
NICOLET, 1990; KAMP et alii, 1991). A ApxIA é uma proteína de 105 kDa fortemente hemolítica e citotóxica e
os sorotipos que a expressam são considerados os mais virulentos (KAMP et alii,
1991; BECK et alii, 1994). A biossíntese desta toxina é induzida por íons Ca+,
havendo indícios da necessidade de Ca+ para a sua atividade (FREY & NICOLET,
1988; FREY et alii, 1991a). A ApxIIA, é uma proteína de 103-105 kDa fracamente
16
hemolítica e moderadamente citotóxica (KAMP et alii, 1991, FREY et alii, 1992). A
sua biossíntese não é induzida por Ca+, mas este íon é um cofator para a atividade
hemolítica (FREY & NICOLET, 1990). A ApxIIIA é uma proteína de 120 kDa,
diferindo das outras por não possuir atividade hemolítica, mas é fortemente
citotóxica (KAMP et alii, 1991). A toxina Apx IV, recentemente clonada, seqüenciada,
expressada e caracterizada como uma proteína de 202 kDa, não é hemolítica sendo
expressada apenas in vivo por todos os sorotipos (SCHALLER et alii, 1999). As
toxinas RTX possuem atividades hemolíticas e citotóxicas independentes uma da
outra (TU et alii, 1994).
As toxinas Apx contém unidades repetidas de nanopeptídeos ricos em
glicina na região C-terminal onde liga Ca+ (cálcio) (SCHALLER et alii, 1999), que são
responsáveis pela fenótipo β-hemolítico do A. pleuropneumoniae (INZANA, 1991) e
pela reação de CAMP (CHRISTIE et alii, 1944) do A. pleuropneumoniae (FREY et
alii, 1994), teste muito importante para a caracterização da espécie (KRIEG & HOLT,
1984).
A virulência do A. pleuropneumoniae é fortemente relacionada com as
toxinas Apx (BECK et alii, 1994) responsáveis pela necrose observada nos casos
agudos de pleuropneumonia em camundongos e suínos (UDEZE, 1987). O
mecanismo de ação destas toxinas é a formação de poro na membrana da célula-
alvo (hemácias) e na membrana fosfolipídica (INZANA, 1991; BURROWS & LO,
1992). ApxI e ApxII estimulam em pequenas doses neutrófilos e macrófagos
alveolares sendo, em grandes doses, citotóxicas para eritrócitos, neutrófilos e
linfócitos pulmonares de suínos, células endoteliais e macrófagos (ROSENDAL et
alii, 1988; KAMP & VAN LEENGOED, 1989; FREY & NICOLET, 1990; IDRIS et alii,
1993; FENWICK & HENRY, 1994, CRUIJSEN et alii, 1996). O A. pleuropneumoniae
não produz sideróforos, mas é capaz de captar ferro do hospedeiro através da lise
celular causada pelas toxinas Apx, que faz a liberação da hemoglobina, de onde
retira ferro para seu crescimento (BÉLANGER et alii, 1995). As toxinas são os fatores bacterianos responsáveis pelo desenvolvimento
dos sintomas clínicos e das lesões nos pulmões típicas de PPS (KAMP et alii, 1997).
Estas lesões são em parte causadas pelos efeitos citotóxicos das toxinas Apx nas
células epiteliais alveolares. Células de A. pleuropneumoniae viáveis são capazes
de destruir as células epiteliais, entretanto, bactéria inativada e mutantes que não
secretam toxinas Apx não causam morte nestas mesmas células (VAN DE
17
KERKHOF et alii, 1996). Entretanto o biotipo 2 de A. pleuropneumoniae produz a
toxina ApxIIA tanto in vitro como in vivo e não produz as toxinas ApxIA e ApxIIIA
(DOM et alii, 1994). Esta diferença na expressão das toxinas entre os 2 biotipos de
App pode explicar a diferença no potencial de virulência entre os dois biotipos
(FREY, 1995).
Entre as outras espécies de Actinobacillus encontrados no trato
respiratório de suínos somente foi detectada a presença de toxinas homólogas a
ApxIA e ApxIIA de A. pleuropneumoniae em Actinobacillus suis (KAMP et alii, 1994;
BURROWS & LO, 1992; OSTAAIJEN et alii, 1997). No entanto, o A. suis não
expressa a toxina ApxIV indicando ser esta uma toxina espécie-específica
(SCHALLER et alii, 1999).
A atividade biológica do LPS de A. pleuropneumoniae induz pneumonia
multifocal ou intersticial em camundongos e suínos como infiltração de células
inflamatórias. É provável que o LPS atue em conjunto para intensificar as lesões
causadas pelas toxinas (UDEZE et alii, 1987). A estrutura das cadeias O do LPS são
específicas para alguns sorotipos, mas todas são compostas de derivados de
glicose, galactose, ramnose, N-acetilglucosamina e N-acetilgalactosamina (INZANA,
1991). BÉLANGER et alii (1990) descreveram que 83% dos sorotipos que possuem
cadeias lisas de LPS aderem fortemente aos anéis da traquéia, enquanto que 80%
dos sorotipos de cadeia parcialmente lisa aderem fracamente. Isto indica que o LPS
está associado com a aderência e pode ser um fator específico da colonização do
trato respiratório atuando como a principal adesina do A. pleuropneumoniae. Os
mesmos autores relataram que a aderência do A. pleuropneumoniae na cavidade
nasal do suíno está associada com a ligação do lipídio A do LPS às cadeias α e β da
hemoglobina.
1.3.6.2 Cápsula.
Os polissacarídeos capsulares (ou cápsula) são reconhecidos como
importantes fatores de virulência. Estes são responsáveis, na ausência de anticorpos
específicos, pelo aumento da resistência e da invasividade da bactéria pela
capacidade de evadir da fagocitose (INZANA & MATHISON, 1987; BEYNON et alii,
1991). Também inibem a atividade bactericida do soro protegendo a bactéria das
defesas do hospedeiro. A cápsula confere hidrofilicidade à superfície da bactéria
18
sendo uma característica importante para que não ocorra a fagocitose (BOROWSKI,
1991). A resistência à fagocitose nas bactérias Gram-negativas, mediada pela
cápsula, atua como uma barreira protetiva podendo ocorrer através da inibição da
ativação do complemento e sendo influenciada pela composição e massa molecular
capsular (INZANA et alii, 1988; WARD & INZANA, 1997).
Estudos analisando a toxicidade da cápsula purificada demonstraram que
esta não é capaz de ativar a cascata do complemento, que não demonstra atividade
tóxica para a reação dermal de Shwartzman, atividade pirogênica em cobaios,
mortalidade de embrião de galinha ou blatogênese dos linfócitos periféricos do
sangue dos suínos (INZANA, 1991). O A. pleuropneumoniae é resistente à lise pelo complemento na presença
de anticorpos para antígenos capsulares ou somáticos. A resistência do
A. pleuropneumoniae para anticorpos somáticos ocorre pela inacessibilidade dos
antígenos somáticos devida à interferência esteárica da cápsula, enquanto que a
resistência para anticorpos capsulares pode ser pelo fato que a cápsula impede a
fixação do complemento na membrana da bactéria (INZANA et alii, 1988). Os
sorotipos 1, 2, 3, 5 e 7 capsulados são resistentes à lise por anticorpo e
complemento, quando utilizado soro hiperimune de coelho ou de suíno. Entretanto já
existem relatos de amostras do sorotipo 2 e 3 lisadas quando utilizado soro normal
de humano. Mutantes acapsulados do sorotipo 5 são efetivamente lisados em
presença de soro normal de suíno, humano, coelho ou cobaia (INZANA, 1991).
INZANA (1991) sugere que a presença e o tipo da cápsula são importantes na
resistência à lise mediada por complemento na presença ou ausência de anticorpo
específico. No soro normal o A. pleuropneumoniae é resistente à fagocitose por
leucócitos polimorfonucleares, entretanto é opsonizado em presença de anticorpos
para cápsula. A fagocitose de amostras mutantes acapsuladas também necessita de
opsonização com anticorpos (INZANA, 1991). Também no soro normal, na ausência
de anticorpos específicos, a cápsula limita a quantidade de anticorpos e deposição
do componente C9 do complemento na superfície bacteriana, mas não previne a
ativação do complemento ou a ligação do componente C3 do complemento na
superfície da bactéria. No entanto, não estão totalmente esclarecidos todos os
mecanismos responsáveis pela resistência do A. pleuropneumoniae à lise ou
fagocitose. Provavelmente, o LPS e o polissacarídeo capsular atuam em conjunto ou
19
em diferentes estágios da infecção para limitar a habilidade do complemento na
eliminação do A. pleuropneumoniae (WARD & INZANA, 1994).
BERTRAM (1985) determinou experimentalmente que uma dose de
5 X 106 UFC/ml da amostra isolada de A. pleuropneumoniae sorotipo 5, denominada
I200, é capaz de desenvolver severa pneumonia necro-hemorrágica três horas após
a infecção, enquanto que a mesma dose da amostra isolada de
A. pleuropneumoniae sorotipo 5, denominada B8, foi incapaz de causar lesões no
mesmo período. Estes resultados demonstram que isolados do mesmo sorotipo
podem apresentar diferença na virulência. JENSEN & BERTRAM (1986)
compararam estas amostras, a de alta virulência (I200) e a de baixa virulência (B8),
quanto às características morfológicas e bioquímicas. A amostra virulenta tem uma
cápsula diferente, maior e aderente, enquanto que a amostra avirulenta, tem uma
cápsula menor, frágil e facilmente removível. Os autores demonstraram diferenças
na estrutura capsular, composição bioquímica e LPS, sugerindo que a maior
quantidade e aderência da cápsula da amostra de alta virulência, somada à maior
quantidade de LPS, acentuam as lesões causadas pelo A. pleuropneumoniae.
O polissacarídeo capsular é um importante componente sendo utilizado
como alvo para estudos patogênicos, epidemiológicos e diagnóstico. Amostras de
A. pleuropneumoniae mutantes acapsulados sorotipo 1 e 5a (acapsuladas por
deleções dos genes cpsABC envolvidos na biossíntese dos polissacarídeos
capsulares) foram isolados após mutagênese por ácido ethil-ester-metano-sulfônico
e mostraram-se avirulentas. Estes mutantes não causaram sinais clínicos ou lesões
em suínos após inoculação intratraqueal com uma dose 10 vezes maior que a DL50
da amostra não mutante. Amostras acapsuladas que produzem toxinas induzem
resposta imune e podem ser usadas como vacinas vivas (INZANA et alii, 1993).
Outra amostra de A. pleuropneumoniae mutante acapsular foi obtida por
RIOUX et alii (2000) usando o sistema de mutagênese por inserção com o
transposon Tn10. Este mutante não reagiu com o anticorpo monoclonal contra o
antígeno capsular do sorotipo 1, nem apresentou vestígios de cápsula por
microscopia eletrônica e citometria de fluxo, confirmando a incapacidade de
transportar os polissacarídeos capsulares para a membrana externa da bactéria. O
sítio de inserção do mini-Tn10 foi determinado e sendo posicionado no gene cpxC
de transporte dos polissacarídeos capsulares. Este mutante foi inoculado em suínos
SPF e apresentou um padrão menos virulento sem mortalidade, comparado com a
20
amostra bacteriana original que apresentou-se mais virulenta com 100% de
mortalidade.
PIJOAN et alii (1983) relataram que a proteção de suínos vacinados com
cultura de seis horas de A. pleuropneumoniae é devida a anticorpos capsulares, pois
essas culturas contém grande quantidade de material capsular, mas pouca toxina no
sobrenadante. Formularam a hipótese de que o material capsular pode proteger os
suínos contra uma inoculação homóloga, mas não heteróloga. Sugeriram também
que anticorpos protetores não são somente induzidos pelas toxinas. Devido a isso, a
imunidade celular anticapsular é descrita como sendo muito importante nessa
doença. NIELSEN et alii (1976) haviam determinado que antígeno capsular de
culturas mais velhas (24 horas), extraído pelo calor, não conferem proteção aos
suínos. Enquanto que NIELSEN & O´CONNOR (1984) determinaram que antígenos
de culturas jovens (6 horas) sorotipo específicos extraídos da mesma maneira
podem proteger os suínos, demonstrando que a cápsula é componente importante e
confere proteção.
INZANA et alii (1988) estudaram as propriedades de virulência do
polissacarídeo capsular do A. pleuropneumoniae sorotipo 5 e sua capacidade de
proteger suínos e camundongos da agressão experimental. A bactéria viva
capsulada foi resistente à morte por complemento e anticorpos para antígenos
somáticos, enquanto que a amostra acapsulada foi sensível à morte pela via
alternativa do complemento. Camundongos foram protegidos da morte devido à
inoculação intranasal com sorotipos homólogos ou heterólogos, após imunização
com bactéria viva capsulada ou acapsulada. Entretanto, os animais não foram
protegidos quando imunizados tanto com a bactéria morta, ou com
lipopolissacarídeos ou mesmo com a vacina conjugada de proteína e cápsula.
Imunização passiva com soro de suíno monoespecífico para cápsula protegeu os
suínos contra infecção letal, mas não impediu o desenvolvimento de lesões
hemorrágicas nos pulmões. Já os suínos imunizados passivamente com anti-soro
para bactéria viva ou quando a bactéria foi pré-opsonizada por anticorpos anti-
cápsula produzidos em coelhos, antes da agressão em suínos, não desenvolveram
lesões respiratórias severas.
JACQUES et alii (1992) estudaram a correlação entre a quantidade de
material capsular dos isolados de A. pleuropneumoniae e a afinidade pelo muco do
trato respiratório do suíno. Estes pesquisadores observaram que isolados com uma
21
camada capsular maior ou igual a 100 nm apresenta baixa afinidade pelo muco,
enquanto isolados com uma fina camada de material capsular mostram vários graus
de afinidade pelo muco do trato respiratório suíno. Por outro lado, RIOUX et alii
(2000) avaliaram a capacidade de aderência de uma amostra de
A. pleuropneumoniae sorotipo 1 mutante acapsular e determinaram que esta
apresentou 20 vezes maior quantidade de células aderidas em cortes congelados de
traquéia de leitões do que a amostra original. Estes estudos confirmam que a
cápsula não é responsável pela aderência, ao contrário, impede a aderência do
A. pleuropneumoniae ao tecido do hospedeiro.
Amostras de A. pleuropneumoniae, pertencentes aos sorotipos de 1 a 10,
foram examinadas por microscopia eletrônica para analisar a camada de material
capsular. Foi verificado que todas apresentaram uma camada variável dependendo
do sorotipo. A quantidade de cápsula também variou de acordo com o tempo de
crescimento e o meio de cultura. Quando crescidos em meio líquido, por 6 horas,
apresentaram entre 210-230 nm de camada de cápsula, enquanto que com 18 horas
de crescimento a camada foi de 130-140 nm. Entretanto, quando o
A. pleuropneumoniae foi crescido em meio sólido a camada visualizada foi muito
menor e variou de 70-100 nm. Utilizando esta metodologia, estes pesquisadores
ainda visualizaram A. pleuropneumoniae em pulmões de animais infectados e
estimaram a quantidade de material capsular. Os resultados indicam que existem
diferenças na estrutura capsular entre os diferentes sorotipos de
A. pleuropneumoniae e isso pode explicar a diferença na virulência entre os
sorotipos, já que os sorotipos mais virulentos apresentaram maior quantidade de
cápsula (JACQUES et alii, 1988).
A estrutura capsular de todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae já foi
identificada por métodos de ressonância magnética nuclear e química (PERRY et
alii, 1990). A cápsula bacteriana é carregada negativamente por polímeros de
carboidratos altamente hidratados (INZANA, 1987) que são responsáveis pela
especificidade dos sorotipos (INZANA & MATHISON, 1987). A estrutura capsular
dos diferentes sorotipos pode ser classificada como segue: uma seqüência normal
de unidades de açúcar ligadas glicosidicamente, que constituem as cápsulas dos
sorotipos 5a, 5b e 10; polímeros tipo ácido teicóico, onde unidades de glicosil-glicitol
são ligadas através de ligações fosfato- diéster, como as cápsulas dos sorotipos 2,
3, 6, 7, 8, 9, e 11 e polímeros repetidos de oligossacarídeos, também ligadas através
22
de fosfato, como encontrado na cápsula dos sorotipos 1, 4 e 12. As últimas são
relativamente instáveis, pois ligações fosfato sofrem hidrólise levando a um produto
de baixo peso molecular com subseqüente degradação (PERRY et alii, 1990). INZANA (1987), após a purificação da cápsula do A. pleuropneumoniae sorotipo 5,
analisou a composição química do polímero capsular por radioimunoensaio e
observou que a quantidade máxima de cápsula é obtida na fase estacionária
(48 horas) de cultura em meio líquido e não de meio sólido. A composição química
da cápsula foi de 85% de hexosamina, 12% de hexose, 3% de fosfato, 0,17% de
proteína, 0,20% de ácido nucléico e 0,01% de endotoxina.
Para um melhor entendimento do papel da cápsula como fator de
virulência em A. pleuropneumoniae, WARD & INZANA (1997) identificaram,
clonaram e seqüenciaram uma região do DNA envolvida na exportação dos
polímeros capsulares de A. pleuropneumoniae sorotipo 5a. Esta região é constituída
de um operon, designado cpxDCBA, que codifica quatro proteínas envolvidas na
exportação dos polissacarídeos através da membrana citoplasmática. CpxD é uma
lipoproteína da membrana externa de 42.1 kDa envolvida no transporte do
polissacarídeo capsular através da membrana. CpxC é uma proteína de 43.4 kDa,
relativamente hidrofílica, periplasmática, com domínio hidrofóbico próximo ao N e C-
terminal que serve como âncora e está envolvida no transporte dos polissacarídeos
capsulares através da membrana citoplasmática. CpxB é uma proteína de 29.9 kDa,
muito hidrofóbica com no mínimo 6 domínios α-hélice, sugerindo que pode ser uma
proteína de membrana integral. CpxA é uma proteína hidrofílica de 24.6 kDa,
contendo uma seqüência consenso característica de ligação de ATP. Um fragmento
de 1.5 kb, correspondente a parte dos genes cpxCB, foi utilizado como sonda contra
DNA total de A. pleuropneumoniae clivado com BglII. Esta sonda hibridizou com
DNA dos sorotipos 1, 2, 5, 7 e 9 de A. pleuropneumoniae indicando que esta região
do DNA é bastante conservada.
WARD et alii (1998) identificaram, clonaram e seqüenciaram os genes
envolvidos na biossíntese da cápsula (cps) do sorotipo 5. Quatro open reading frame
(ORFs) constituem os genes cps denominados cpsD, cpsC, cpsB e cpsA. Este
operon apresenta a característica de ser sorotipo-específico e está localizado
adjacente (upstream) ao gene cpxD do operon cpxDCBA que codifica as proteínas
responsáveis pelo transporte dos polissacarídeos capsulares. Entretanto, a função
de cada gene não foi determinada. Um mutante incapaz de produzir polissacarídeo
23
capsular intracelular ou extracelular, foi construído por recombinação homóloga com
deleções nos genes cpsABC na amostra de A. pleuropneumoniae J45, sendo
denominado J45-100. Quando inoculada esta bactéria mutante em uma dose três
vezes a DL50 da amostra J45 em suínos não imunes, aquela mostrou-se avirulenta.
Uma dose seis vezes a DL50 da amostra J45, causou de média a moderadas lesões
nos pulmões, mas não causou morte nos animais. A biossíntese de
lipopolissacarídeos, das toxinas Apx e das proteínas de membrana não foram
afetadas. O mutante acapsular foi capaz de crescer mais rápido que a amostra não
mutante, indicando que a expressão é um processo metabolicamente custoso e que
células que não produzem cápsula podem usar a energia para seu crescimento.
LO et alii (1998) desenvolveram e padronizaram um método de PCR
Multiplex com primers específicos para as regiões dos genes cpx e cps do sorotipo 5
com a finalidade de identificar amostras de A. pleuropneumoniae. Esses primers
amplificam fragmentos de DNA de 0,7 kb (715 pb) para os genes cpx e 1,1 kb
(1.114 pb) para os genes cps. Os autores aplicaram esta metodologia em DNA de
A. pleuropneumoniae extraídos de fragmentos de pulmões de animais infectados
que estiveram congelados por 6 anos. Foi possível amplificar fragmentos de
tamanhos esperados para os genes cpx em todas as amostras. No entanto, nem
todas as amostras apresentaram produto de amplificação para os genes cps. Os
resultados apresentados por LO et alii (1998) confirmaram que a região cps é
sorotipo específica, sendo possível distinguir especificamente A. pleuropneumoniae
sorotipo 5 de outros sorotipos e que a região cpx com exceção do sorotipo 4, é
comum a todos os sorotipos. Este foi o primeiro desenvolvimento de PCR espécie-
específico capaz de identificar pelo menos 11 dos 12 sorotipos de
A. pleuropneumoniae.
1.3.6.3 Superóxido dismutase (SOD).
O ambiente aeróbico é potencialmente tóxico para a vida devido à alta
reatividade do oxigênio que, quando torna-se parcialmente reduzido, freqüentemente
gera espécies de oxigênio reativas (FRIDOVICH, 1978).
Superóxido dismutases são enzimas que catalisam a dismutação das
espécies reativas do radical ânion superóxido (O2−) altamente reativo para peróxido
de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2). As SODs assim como a catalase e a glutationa
24
peroxidase agem evitando a formação de espécies de oxigênio deletérios para a
célula (BOWLER et alii, 1990; BITTENCOURT, 1998). Esta é a primeira etapa de
uma série de reações que previnem o acúmulo de radicais livres de oxigênio tóxico
gerados pela redução do oxigênio molecular (FRIDOVICH, 1989 e 1995). A remoção
dos radicais superóxidos bloqueia reações secundárias que podem levar a formação
do radical hidroxil (•OH) altamente reativo responsável por maiores danos em todas
as classes de macromoléculas biológicas (ácidos nucléicos, proteínas e lipídios) (IMLAY & LINN, 1988; WILKIS et alii, 1998). Tem sido sugerido que enzimas
antioxidantes que removem O2− ou H2O2 in vitro desempenham papel importante na
proteção da viabilidade da bactéria in vivo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1984;
FRIDOVICH, 1989).
As superóxido dismutases, da família das metaloproteínas, são
classificadas de acordo com o metal ligante no seu sítio ativo como: cobre-zinco
superóxido dismutase (CuZnSOD), manganês superóxido dismutase (MnSOD) e
ferro superóxido dismutase (FeSOD). Outras duas formas de SODs, níquel
superóxido dismutase (NiSOD) e ferro-zinco superóxido dismutase (FeZnSOD),
foram descritas em Streptomyces coelicolor Muller (KIM et alii, 1998). CuZnSOD e
provavelmente NiSOD não possuem similaridade e são estruturalmente distintas de
Fe e MnSOD (MEIER et alii, 1998) que possuem alta similaridade de seqüência
primária, assim como de estruturas secundária e terciária (BOWLER et alii, 1990;
WU et alii, 1998). Uma outra enzima a FeZnSOD apresenta uma região C-terminal
conservada com as Fe e MnSODs (KIM et alii, 1998).
As SODs são encontradas em uma grande variedade de organismos e
dentro de diferentes organelas e compartimentos celulares. MnSODs são
principalmente encontradas em mitocôndria de eucariotos e em procariotos. FeSODs
são encontradas principalmente em procariotos e em cloroplastos das plantas. As
CuZnSODs são encontradas na maioria de eucariotos e em algumas bactérias
(GRACE, 1990; GILLE & SINGLER, 1995; BITTENCOURT, 1998; FRIDOVICH,
1995). Em bactérias a FeSOD e MnSOD têm localização citoplasmática e estão
envolvidas na remoção dos radicais ânions superóxidos gerados durante a
respiração aeróbica (FRIDOVICH, 1995). A CuZn SOD é tipicamente encontrada em
células eucarióticas, onde está presente no citosol, porém atualmente existem
muitos estudos relatando a sua presença no periplasma de células procarióticas
(FRIDOVICH, 1995; WU et alii, 1998).
25
Em E.coli o gene sodA, que codifica MnSOD, têm expressão regulada
pelo nível de ferro (Fe) presente no meio de cultura, enquanto que o gene sodB, que
codifica FeSOD, têm expressão constitutiva (NIEDERHOFFER et alii, 1990). A
expressão de CuZnSOD é induzida durante a fase exponencial de crescimento e
expressada em altos níveis somente na fase estacionária (BENOV & FRIDOVICH,
1994; IMLAY & IMLAY, 1996).
A presença de CuZnSOD tem sido relatada em muitos organismos
patogênicos como: Escherichia coli (HASSAN & FRIDOVICH, 1979; BENOV &
FRIDOVICH, 1994), Brucella abortus (BECK et alii, 1989), Haemophilus influenzae e
Haemophilus parainfluenzae (KROLL et alii, 1991), Salmonella typhimurium (DE
GROOTE et alii, 1997), Neisseria meningitidis (WILKS et alii, 1998), Mycobacterium
tuberculosis (WU et alii, 1998) e Haemophilus pleuropneumoniae (LANGFORD et
alii, 1996; SCHEEHAN et alii, 2000).
KROLL et alii (1995) utilizaram a técnica de PCR para detectar genes
sodC que codificam CuZnSOD em organismos patogênicos de humanos e de
animais como os membros dos grupos Haemophilus, Actinobacillus, Pasteurella e
Neisseria meningitidis. Os autores confirmaram estudos prévios que a CuZnSOD
procariótica é completamente separada evolucionariamente da CuZnSOD
eucariótica.
Existem evidências do papel das CuZnSOD na virulência de bactérias
patogênicas pela capacidade da enzima de dismutar radicais superóxidos gerados
fora da célula bacteriana. Desta forma a localização de CuZnSOD no periplasma
estaria protegendo a bactéria dos efeitos tóxicos dos radicais superóxidos
produzidos fora da célula (LANGFORD et alii, 1996; WILKS et alii, 1998). Mutantes
de S. typhimurium, N. meningitidis, H. ducreyi que não expressam CuZnSOD são
mais sensíveis à atividade bactericida dos radicais superóxidos. Também
apresentam efeito letal reduzido, quando inoculados por via oral ou intraperitonial em
camundongo, demonstrando que são significantemente menos virulentos do que o
tipo não mutante (DE GROOTE et alii, 1997; FARRANT et alii, 1997; WILKS et alii,
1998; SAN MATEO et alii, 1998). Também foi sugerido que Bacteroides gingivalis,
um patógeno de infecções periodontais, possui capacidade de sobrevivência devida
a presença deste tipo de SOD (AMANO et alii, 1990). No entanto, existem relatos
conflitantes como em B. abortus onde mutantes para CuZnSOD continuam virulentos
em camundongos (LATIMER et alii, 1992; TATUM et alii, 1992).
26
Possivelmente a CuZnSOD permite que o A. pleuropneumoniae resista a
ação tóxica de espécies de oxigênio ativado produzido por células inflamatórias do
hospedeiro pois, o produto da dismutação do radical superóxido, o peróxido de
hidrogênio (H2O2), pode interferir no mecanismo mucociliar da bactéria do trato
respiratório superior, favorecendo a colonização e permitindo o estabelecimento do
A. pleuropneumoniae no organismo (LANGFORD et alii, 1996). Estudos demonstram
que a excessiva produção de radical oxigênio pelos macrófagos e neutrófilos
pulmonares, estimulados pelas toxinas Apx, é um fator importante nas lesões
pulmonares que ocorrem em animais com PPS. As toxinas Apx provocam uma
explosão oxidativa nos neutrófilos, que resulta numa produção excessiva de radicais
de oxigênio provocando efeitos deletérios nas células do hospedeiro (DOM et alii,
1992a e b). LANGFORD et alii (1992) clonaram os genes sodC de H. influenzae tipo b
e de H. parainfluenzae e determinaram a presença de CuZnSOD pela visualização
da atividade da proteína em gel de poliacrilamida não desnaturante. A presença de
CuZnSOD também foi demonstrada em outras espécies de Haemophilus tais como:
H. aphrophilus, H. paraphrophilus, H. haemolyticus, H. paraphrohaemolyticus,
H. haemoglobinophilus, H. influenzae não tipável e H. parasuis. Também analisaram
por hibridização Southern blot do DNA de H. influenzae não tipável, H. aphrophilus,
H. paraphrophilus e H. haemolyticus com uma sonda de DNA de H. influenzae tipo b,
indicando a existência de uma região homóloga entre estas espécies. Os mesmos
autores clonaram e caracterizaram o gene sodC que codifica CuZnSOD de
A. pleuropneumoniae. Analisaram também a vantagem da presença deste gene em
App quanto à sobrevivência deste microrganismo no hospedeiro por aceleração na
dismutação do superóxido derivado de neutrófilos durante a resposta à infecção em
suínos.
O A. pleuropneumoniae apresenta evidências de possuir duas SODs, uma
contendo o íon Mn e outra contendo os íons Cu/Zn. O gene sodC de
A. pleuropneumoniae não é regulado por variações das fases de crescimento da
bactéria. Análises de atividade em gel não desnaturante por separação eletroforética
sugere que ambas, MnSOD (sodA) e CuZnSOD (sodC), são expressadas durante as
fases de crescimento exponencial e estacionário. A expressão de sodA é regulada
por O2 e concentrações variadas de Fe2+. Trabalhos demonstraram que a enzima
MnSOD de A. pleuropneumoniae foi funcionalmente ativa em condições de
27
crescimento aeróbico na presença ou ausência de ferro, e em condições de
crescimento anaeróbico apenas na presença de ferro. Nenhum efeito regulatório ou
variação da expressão em relação à fase de crescimento pôde ser detectada para o
gene sodC de A. pleuropneumoniae. Analisando a atividade de SOD de diferentes
compartimentos celulares foi demonstrado que a CuZnSOD é uma enzima
extracitoplasmática, mais precisamente presente no periplasma. A presença de uma
banda correspondente à CuZnSOD foi detectada por hibridização Western blot com
soros de suínos inoculados com o sorotipo 3 de A. pleuropneumoniae, indicando que
a enzima pode ser expressada durante a infecção (LANGFORD et alii, 1996). A
existência de CuZnSOD extracelular reforça a hipótese sobre o efeito de proteção da
bactéria contra a mortalidade fagocítica. Somente alguns organismos intracelulares
como a Brucella abortus sobrevivem à fagocitose (BECK et alii, 1989). Outro
exemplo, é a identificação de CuZnSOD em H. influenzae e H. parainfluenzae, que
pode estar determinando a sobrevivência do agente no hospedeiro devido à rápida
eliminação dos radicais superóxidos produzidos (KROLL et alii, 1991).
A seqüência de aminoácidos deduzida a partir do gene sodC de
A. pleuropneumoniae foi comparada com as seqüências de CuZnSOD presente em
outras bactérias. A porção N-terminal apresenta os aminoácidos característicos de
peptídeo sinal, sugerindo que a proteína é exportada (LANGFORD et alii, 1996),
como outras diversas CuZnSODs (JAMES, 1994). A região C-terminal possui uma
seqüência de aminoácidos com nível de homologia de 75% com CuZnSOD de
H. parainfluenzae (LANGFORD et alii, 1996). Com o objetivo de avaliar se a
CuZnSOD é importante na proteção da bactéria contra radicais superóxidos um
experimento foi desenvolvido com Neisseria meningitidis onde, foram inoculados
camundongos com amostras sodC mutantes e tipo selvagem. Os resultados
demonstraram que os animais que receberam inoculações com a amostra sodC
mutante apresentaram menor índice de doença quando comparados com animais
que receberam inoculações com o tipo selvagem, onde a maioria deles
apresentaram a doença. Desta forma os autores sugerem que CuZnSOD está
associada com fatores de virulência neste modelo experimental (WILKS et alii,
1998). Recentemente, SCHEEHAN et alii (2000) desenvolveram um mutante de
sodC por troca alélica do sorotipo 1 de A. pleuropneumoniae e investigaram o papel
da proteína CuZnSOD na infecção causada por A. pleuropneumoniae. Também
28
analisaram a possibilidade do uso deste mutante, que não expressa CuZnSOD,
como vacina viva. Nenhuma diferença foi observada em animais inoculados com o
mutante comparado com animais inoculados com a amostra não mutante. Ambos
desenvolveram lesões pulmonares hemorrágicas e pleurisia fibrinosa típica de
infecção por A. pleuropneumoniae, sendo indistinguível a patologia das lesões de
ambos os grupos.
1.3.7 Vacinas e resposta imune e celular.
Poucos programas de controle da PPS sem depopulação total do rebanho
tem tido sucesso. A maioria das estratégias que combina medicação e depopulação
parcial falham na eliminação do A. pleuropneumoniae, mas reduzem a doença
clínica, lesões e morte com o passar do tempo (PLOMGAARD, 1999). Um dos
principais interesses, em programas de controle da PPS, é a prevenção da entrada
do organismo em rebanhos livres através da introdução de animais portadores
assintomáticos (SIDIBÉ et alii, 1993).
A pleuropneumonia pode ser controlada por vacinação ou programas
baseados em diagnósticos sorológicos evitando circulação de suínos entre rebanhos
(ROSENDAL & BOYD, 1982). A determinação do perfil sorológico através do tempo
auxilia na identificação da duração da imunidade materna, na entrada de sorotipos
novos e pode detectar o início da infecção (PIJOAN, 1993). Rebanhos soropositivos
podem desenvolver pleuropneumonia ou transmitir A. pleuropneumoniae para outros
animais saudáveis e para outros rebanhos soronegativos (KUME, 1984). Os suínos
são protegidos da infecção apenas pelos sorotipos que possuem antígenos
homólogos, podendo ser reinfectados com sorotipos que possuem antígenos
heterólogos (NIELSEN, 1976; CRUIJSEN et alii, 1995b). Na Austrália, por exemplo,
ocorreu uma explosão de resultados positivos para o sorotipo 12, que pode ter sido
devido ao fato deste sorotipo não estar incluído na vacina utilizada. Desta forma a
introdução de animais de outras regiões disseminou este sorotipo nos rebanhos e
evidenciou a importância de se determinar a prevalência dos sorotipos isolados na
região (BLACKALL et alii, 1999).
Diversas vacinas para controle da pleuropneumonia têm sido
desenvolvidas e a maioria consistem de bactérias mortas (bacterinas). Estas vacinas
apresentam alguma eficácia, prevenindo ou reduzindo a mortalidade, diminuindo os
29
sinais clínicos e a prevalência de lesões. No entanto, a infecção crônica e
propagação do A. pleuropneumoniae para animais não imunes são os principais
problemas na indústria suinícola (INZANA et alii, 1988; PLOMGAARD, 1999).
A falta de proteção das bacterinas pode ser atribuída à desnaturação
química do antígeno pela formalina, fazendo com que o anticorpo produzido não
reconheça a forma nativa da proteína durante a infecção natural (FEDORKA-CRAY
et alii, 1993; FURESZ et alii, 1997). Em camundongos, anticorpos protetivos contra
dose letal podem ser produzidos por imunização com bactérias vivas capsuladas ou
acapsuladas, mas não com bactérias mortas por formalina ou por aquecimento
(100°C por 1 hora). As bactérias vivas são conhecidas por induzir maior imunidade
celular do que as mortas, devido à prolongada estimulação do tecido linfóide local
(INZANA et alii, 1988).
Para uma bacterina ou vacina ser considerada eficaz, não pode ser
observada reação tecidual no sítio de vacinação e precisa haver redução
significativa ou eliminação da morbidade e mortalidade (FEDORKA-CRAY et alii,
1993). Uma preparação de cultura de A. pleuropneumoniae concentrada, livre de
bactérias, contendo os fatores de virulência como carboidrato, endotoxinas e
proteínas com atividade hemolítica e citotóxica, protegeu suínos SPF completamente
da mortalidade, reduzindo a morbidade para inoculação homóloga, quando
comparada com uma bacterina comercial. Nenhuma reação tecidual no sítio foi
observada na musculatura cervical. Entretanto, é provável que vacinação contra um
ou diversos fatores de virulência não seja suficiente para induzir imunidade completa
(FEDORKA-CRAY et alii, 1993) e que outros componentes secretados, como
componentes da superfície bacteriana incluindo LPS e proteínas não secretadas,
podem ter efeito citotóxico (HUANG et alii, 1998). Anticorpos para
lipopolissacarídeos, lipoproteínas da membrana externa reguladas por ferro e
proteínas da membrana externa, contribuem apenas parcialmente para prevenir a
pleuropneumonia (CRUIJSEN et alii, 1995a e b).
Toxinas Apx são consideradas importantes para a indução da resposta
imune protetiva, pois vacinas de bactéria mortas que não possuem toxinas Apx em
sua formulação, não protegem adequadamente (INZANA et alii, 1991). As vacinas
que utilizam toxinas em sua formulação protegem parcialmente, porém, outros
componentes são necessários para induzir imunidade, além de altos títulos de
anticorpos. Anticorpos para toxinas Apx diminuem a severidade da doença e
30
permitem que o animal se recupere mais rápido, mas não previnem a infecção
(CHIERS et alii, 1998). Suínos que não desenvolvem anticorpos anti-toxinas Apx são
mais suscetíveis à pleuropneumonia sendo que anticorpos para toxinas ApxII são
capazes de contribuir para proteção cruzada (CRUIJSEN et alii, 1995b).
GOTTSCHALK (1999) relatou que algumas vacinas para
pleuropneumonia suína disponíveis no mercado induzem níveis de anticorpos
elevados, outras muito baixo, indicando que nenhuma vacina é 100% protetiva.
Vacinas que possuem toxinas ApxI, ApxII e ApxIII purificadas e outras, que têm
proteínas de membrana externa incluídas, representam uma nova categoria. Estas
vacinas, possuem vantagem sobre as demais porque, teoricamente, protegem os
suínos contra todos os sorotipos. Também os animais vacinados não apresentam
anticorpos contra cápsula ou LPS, podendo ser diferenciados de infectados com
testes que utilizam estes componentes como antígeno.
PRIDEAUX et alii (1999) desenvolveram uma vacina utilizando
mutagênese sítio-específica no gene ativador apxIIC do sorotipo 7 de
A. pleuropneumoniae. Este sorotipo mutante secreta uma toxina ApxIIA inativa e
suínos vacinados por via intranasal com esta amostra mutante viva foram protegidos
contra inoculação de sorotipo 1 virulento. Normalmente, o sorotipo 7 e 1 apresentam
reações cruzadas.
A aplicação de polissacarídeo capsular como imunógeno resulta em
anticorpos que protegem os suínos da pleuropneumonia fatal, mas não previnem o
desenvolvimento das lesões (ROSENDAL et alii, 1986; INZANA et alii, 1988).
Amostras bacterianas que apresentam pouca cápsula, naturalmente encontradas,
parecem proteger apenas parcialmente (ROSENDAL & MACINNES, 1990) enquanto
que amostras mutantes acapsuladas foram mais eficientes (INZANA et alii, 1993).
Anticorpos para cápsula são opsônicos mas não protegem completamente (INZANA
et alii, 1988), pois a cápsula purificada é pouco imunogênica em coelhos e suínos
(INZANA, 1987). Amostras de A. pleuropneumoniae mutantes acapsuladas, avirulentas,
com atividade hemolítica e perfil de LPS-CL idêntica aos tipos não mutante do
sorotipo 1 e 5 foram capazes de sobreviver subcutâneamente por mais de uma
semana após inoculação, permitindo uma forte resposta imune para células totais e
toxinas ApxI e II. Vacinas mutantes possuem vantagens sobre as vacinas inativadas
sendo altamente eficazes e ainda induzem proteção similar contra sorotipo
31
homólogo e heterólogo; não causam infecção nos pulmões; são extremamente
estáveis e não revertem para o fenótipo capsulado; não induzem anticorpos para
cápsula, portanto, suínos imunizados podem ser diferenciados de suínos infectados;
podem ser administradas por via subcutânea sem adjuvantes, evitando lesões e
gastos maiores com imunização e ainda são economicamente viáveis (INZANA et
alii, 1993).
1.3.8 Técnicas sorológicas para o diagnóstico da pleuropneumonia causada pelo A. pleuropneumoniae.
A detecção da infecção prévia ou crônica em animais vivos é realizada
principalmente através de testes sorológicos. Entretanto, com a variabilidade
antigênica existente entre os sorotipos de App, determinaram a necessidade de
produzir testes de diagnósticos espécie-específicos que incluem todos os sorotipos
(MA et alii, 1990; GRAM & AHRENS, 1998). Vários testes sorológicos para
diagnóstico tem sido descritos para detecção de anticorpos produzidos por
A. pleuropneumoniae como: fixação de complemento (NICOLET et alii, 1971; GUNNARSSON, 1979), soroaglutinação em macrotitulação com 2-mercaptoetanol,
(MITTAL et alii, 1984), soroaglutinação em microtitulação com 2-mercaptoetanol
(PIFFER et alii, 1985a), inibição da citolisina (HUTRERA & PIJOAN, 1992;
FENWICK, 1992), imunodifusão (NICOLET, 1971), aglutinação (GUNNARSSON et
alii, 1977), imunofluorescência (ROSENDAL et alii, 1983), aglutinação em látex
(MITUI et alii, 1981), soroaglutinação rápida, hemaglutinação passiva (MITTAL et alii,
1983), ensaio imunoenzimático ELISA (NICOLET et alii, 1981; BOSSÉ et alii, 1992b)
e método de separação imunomagnética (SIM) (GAGNÉ et alii, 1998).
A avaliação sorológica da exposição a agentes infecciosos é limitada por
problemas com a especificidade devido a reações cruzadas entre as espécies e a
dependência na habilidade individual para desenvolver resposta imune. A resposta
imune de uma infecção aguda em um hospedeiro imunologicamente competente,
está associada com um retardo de dias a meses entre o momento da infecção e a
soroconversão (EHRLICH & GREENBERG, 1994). Suínos infectados podem ser
sorologicamente negativos (SIDIBÉ et alii, 1993) e resultados sorológicos positivos
podem ser observados na ausência de sinais clínicos e patológicos, deste modo o
isolamento do agente é importante para confirmar a presença da infecção (GAGNÉ
et alii, 1998).
32
Foram desenvolvidos na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), testes de
ELISA baseados em antígenos capsulares, LPS-CL (lipopolissacarídeo cadeia
longa) e FAF (fase aquosa da extração fenólica) mono e polivalente para os
sorotipos 3, 5 e 7 de App. Em animais experimentalmente infectados, os ELISAs
baseados em antígenos FAF e LPS-CL apresentaram para os três sorotipos,
especificidade de 100% e sensibilidade variando entre 88,3 (LPS-CL) e 98,3% (FAF)
(MACHADO, 1997). Os testes de ELISAs com antígenos capsulares apresentaram
especificidade de 100% para os três sorotipos e sensibilidade de 92, 88 e 90% para
os sorotipos 3, 5 e 7, respectivamente (DUTRA et alii, 2000).
Os testes para diagnóstico de doenças infectocontagiosas podem ser
caracterizados como definitivos ou presuntivos. O teste definitivo é aquele que
envolve o isolamento do agente, enquanto que o teste presuntivo mede a resposta à
presença do agente. Os testes presuntivos podem levar a um diagnóstico errôneo
devido a reações cruzadas com outros agentes microbianos (falsos positivos) ou não
detectar animais recentemente infectados. Todos os testes sorológicos devem ser
considerados presuntivos, sendo que este teste é baseado na capacidade de
diferenciar animais infectados, não necessariamente doentes, de animais não
infectados (PIFFER & GUIDONI, 1997).
FENWICK (1992) comparou alguns testes sorológicos para diagnosticar a
PPS e determinou que os testes de ELISA e de neutralização da citolisina foram os
que deram melhores resultados.
Testes sorológicos possuem alguns problemas que limitam sua utilização
como método imediato de detecção do agente, pois não diferenciam animais
infectados de animais vacinados ou imunes e não detectam animais com menos de
15 dias de infecção. Outro ponto importante é que o teste precisa ter sensibilidade e
especificidade confiáveis, pois normalmente, a relação é inversa e não existe prova
100% sensível e 100% específica (PIJOAN, 1993).
1.3.9 Reação em cadeia da polimerase (PCR).
A PCR é um método que consiste na síntese enzimática in vitro de
seqüências de DNA através de primers que hibridizam na fita complementar do DNA
do gene alvo. Uma série de ciclos repetidos que consistem de desnaturação da fita
template, anelamento de primer e extensão dos primers anelados pela DNA
33
polimerase termoestável, resulta em acúmulo exponencial do fragmento de
interesse. A amplificação da reação de PCR não é infinita. Após certo número de
ciclos, a amplificação do fragmento desejado acumulando exponencialmente
termina, entrando na fase linear ou estacionária. Este segundo estágio da reação é
denominado plateau. O ponto no qual a PCR atinge o plateau depende do número
de cópias da fita original de DNA presente na amostra e da quantidade total de DNA
sintetizado (ERLICH, 1989).
Atualmente tem sido muito usada a técnica de Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), tanto em medicina humana como veterinária, para detectar
isolados clínicos de vírus e outros microrganismos (EHRLICH & GREENBERG,
1994). A PCR possui uma capacidade de amplificar seqüências específicas de DNA
de um microrganismo em até 1012 vezes (LI et alii, 1988) com um limite de detecção
na maioria das vezes de 102 UFC por tubo. Esta metodologia aplicada à detecção do
agente da pleuropneumonia apresenta vantagens com relação a outras técnicas, por
ser capaz de identificar a infecção antes que a doença esteja presente no plantel.
Desta forma pode-se evitar maiores perdas e também a disseminação da doença
pela venda de animais a plantéis livres de PPS.
Teoricamente, gêneros ou espécies de organismos infecciosos podem
apresentar uma seqüência única de DNA, possibilitando a escolha judiciosa de
oligonucleotídeos que servem como primers para a síntese de DNA (EHRLICH &
GREENBERG, 1994). Estes primers específicos para genes de cada microrganismo,
permite alta especificidade da PCR para detectar seqüências alvos de DNA
elevando a probabilidade de detectar seqüências raras. Alguns fatores podem afetar
a especificidade da reação de amplificação como: temperatura de anelamento,
tempo de incubação durante o anelamento, concentração de primers e de enzima e
a concentração de íons de magnésio, necessário para a atividade enzimática da
polimerase (ERLICH, 1989). A PCR detecta a presença do material genético do
microrganismo, ao contrário da resposta imune do hospedeiro, sendo a medida
direta da infecção. Entretanto, esta característica pode levar à detecção de
organismos não viáveis, podendo conduzir a resultado positivo clinicamente
irrelevante, como no caso de DNA de bactéria morta após tratamento com antibiótico
(EHRLICH & GREENBERG, 1994).
Uma outra grande vantagem do sistema de PCR é a capacidade de
detectar um único microrganismo, produzindo um fragmento de DNA específico, a
34
partir de uma mistura de microrganismos sem o isolamento individual da bactéria
(HANCE et alii, 1989; OLIVE, 1989). Quantidades muito grande de células
bacterianas (maior que 106 /ml) podem inibir a reação de PCR devido à presença de
inibidores; tendo este cuidado, resultados falsos-negativos encontrados em
amplificações de DNA de extrato cru podem ser evitados (SIROIS et alii, 1991).
Substâncias inibidoras presentes em amostras clínicas constituem-se no principal
obstáculo para a utilização de PCR na detecção e identificação destes organismos
(STONE et alii, 1994).
A PCR possui muitas vantagens como especificidade, sensibilidade e
rapidez. No entanto, a presença ou ausência de um produto de amplificação de um
tamanho esperado, não necessariamente reflete a presença ou ausência de um
agente patogênico, sendo que para o projeto de primers, é importante escolher uma
região codificante, pois isto minimizaria o risco de mutações pontuais que podem
impedir a amplificação (GRAM & AHRENS, 1998).
A capacidade da PCR para detectar seqüências genéticas de quantidades
muito pequena de DNA é uma vantagem comparada com outras formas sorológicas
de detecção por duas razões principais: reações cruzadas entre antígeno e
anticorpo são evitadas e amostras que tenham sido classificadas anteriormente
como não tipificáveis, devido à autoaglutinação, poderiam ser tipificáveis por PCR. A
amplificação de DNA por PCR é extremamente sensível, podendo ser aplicado
diretamente na amostra sem a espera do cultivo da bactéria (LO et alii, 1998).
A técnica de PCR, pode ser uma alternativa para o diagnóstico etiológico
da PPS, principalmente em animais cronicamente infectados e sem sinais clínicos
aparentes pois, o isolamento do agente é dificultado pelo pouco número de células
de A. pleuropneumoniae presentes e pela interferência da flora normal do trato
respiratório (SIROIS et alii, 1991). Também o App é raramente isolado de animais
saudáveis ou subclinicamente infectados (FENWICK & HENRY, 1994). A detecção
do A. pleuropneumoniae de animais vivos por um método sensível, diferenciando-o
dos outros microrganismos da flora do trato respiratório superior pode ser feita
através de swab nasal ou de tonsila (SIROIS et alii, 1991). Quando comparado com métodos convencionais de isolamento de App, o
método de PCR aplicado direto na amostra clínica mostrou ser três vezes mais
sensível para detecção de App, pois uma das dificuldades encontradas no
isolamento da bactéria deve-se à dificuldade na identificação visual do
35
A. pleuropneumoniae da flora microbiana abundante da tonsila durante o subcultivo
(GRAM et alii, 1996; GRAM & AHRENS, 1998).
SIROIS et alii (1991) iniciaram o desenvolvimento de testes baseados em
PCR para detectar amostras de A. pleuropneumoniae e projetaram três primers a
partir de um fragmento comum a todos os sorotipos isolado de um banco do DNA
genômico de App. Estes primers foram capazes de reconhecer os 12 sorotipos de
App pertencentes ao biotipo 1 e também amostras do biotipo 2. Outras amostras de
H. influenzae, A. equlii, E. coli, A. suis, A. rossii e P. haemolytica não apresentaram
produtos de amplificação.
PCR baseado na seqüência do gene omlA, que codifica uma proteína de
membrana externa de A. pleuropneumoniae, revelou que este gene está presente
em quatro diferentes grupos de sorotipos denominados grupo específicos,
semelhantes aos grupos sorotipo-específico das toxinas Apx presentes em App:
grupo 1: sorotipos 1, 9, 11 e 12; grupo 2: sorotipos 2 e 8; grupo 3: sorotipos 3, 4, 6 e
7 e grupo 4: sorotipos 5a, 5b e 10 (GRAM & AHRENS, 1998). Mais tarde, foi
verificado que uma diferença na região média do gene omlA possibilitou diferenciar
os sorotipos como pertencentes a cinco grupos: grupo 1 (omlAI) sorotipos 1, 9, 11 e
12; grupo 2 (omlAII) sorotipos 2 e 8; grupo 3 (omlAIII), sorotipos 3, 6 e 7; grupo 4
(omlAIV) sorotipo 4 e grupo 5 (omlAV) sorotipos 5a, 5b e 10. Quando comparados as
reações de PCR para genes das toxinas apx e omlA foi possível identificar o mesmo
padrão de sorotipo específico encontrado na maioria das amostras, possibilitando
ainda a tipificação de amostras não classificadas por sorotipificação (GRAM et alii,
2000).
HENNESSY et alii (1993) utilizaram Arbitralily Primed Polimerase Chain
Reaction (AP-PCR) e identificaram um padrão de bandas para cada um dos 12
sorotipos de A. pleuropneumoniae, possibilitando a tipificação de amostras que não
puderam ser tipificadas por outros métodos como a soroaglutinação rápida (SAR).
AP-PCR amplifica segmentos do DNA genômico que podem ou não codificar
determinantes antigênicos ou relacionados com a virulência. Os demais organismos
relacionados às doenças de suínos, puderam ser diferenciados do
A. pleuropneumoniae pelo padrão de amplificação das bandas. Entretanto, este
método requer cuidado especial, pois necessita de cultura pura da bactéria e é
altamente suscetível a contaminações.
36
Outros trabalhos aplicaram a técnica de PCR com primers baseados na
seqüência do gene aroA combinando com Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP) e permitiram a divisão dos sorotipos de App em três grupos:
grupo 1: sorotipos 1, 4, 5, 9, 11 e 12; grupo 2: sorotipos 2, 3, 6, 7 e 8 e grupo 3:
sorotipo 10 (HERNANZ MORAL et alii, 1999).
Com a finalidade de avaliar a diversidade genética, CHATELLIER et alii
(1999) caracterizaram quarenta e quatro isolados de A. pleuropneumoniae
pertencentes aos sorotipos 1 (19 isolados) e 5 (23 isolados), oriundos de animais
saudáveis e com sintomas de PPS de 35 rebanhos da região de Quebec (Canadá),
através da utilização das técnicas de Random Amplified Polimorphic DNA Analisis
(RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) e tipagem por Polimerase Chain
Reaction (PCR) para genes de toxinas. Diferentes perfis foram encontrados entre os
suínos doentes e os portadores sadios, indicando que a diversidade entre as
amostras isoladas de suínos saudáveis deve ser maior que a de animais portadores
doentes e que existem diferenças que discriminam os sorotipos 1 do 5. Entretanto,
foi observado que as amostras do sorotipo 1 isoladas de tonsilas de suínos
portadores sadios apresentaram tipo de RAPD diferentes das amostras isoladas de
pulmão de animais doentes. Desta forma a técnica de RAPD pode ser usada para
identificar os diferentes isolados pertencentes ao sorotipo 1, enquanto que para o
sorotipo 5, não foram observadas diferenças dos isolados, sendo necessário uma
combinação de técnicas para a tipagem deste sorotipo. A metodologia de PFGE
apresentou resultados compatíveis aos das técnicas de RAPD e PCR para genes de
toxinas, permitindo a identificação do padrão de toxinas de trinta e nove isolados de
acordo com a sorotipificação.
1.4 A espécie Actinobacillus suis.
O A. suis é um cocobacilo Gram-negativo, aeróbico e anaeróbico
facultativo, NAD-independente, causador da actinobacilose. As colônias são
cinzentas, aderentes, circulares, translúcidas e β-hemolíticas. Esta espécie, hidrolisa
esculina, produz catalase, oxidase e urease, produz ácido da celobiose, dextrose,
lactose, melibiose, arabinose, sacarose, salicina e trealose mas não produz ácido de
manitol e sorbitol (BURROWS & LO, 1992; SANFORD, 1995; OSTAAIJEN et alii,
1997).
37
O A. suis foi descrito pela primeira vez por Terpstra e Akkermans, em
1955 (BURROWS & LO, 1992), como uma bactéria oportunista em suínos, mais
freqüentemente encontrada em rebanhos de alto status sanitário. Pode afetar suínos
de todas as idades, porém é mais grave em animais jovens. Em leitões com menos
de duas semanas de idade pode ser observada necrose da pele, petéquias nos rins
e excesso de líquido na cavidade toráxica com a presença de hemorragia nos
pulmões. Em leitões de 1 a 6 meses de idade, causa pleurisia, pericardite fibrinosa,
endocardite vegetante, artrite, pneumonia, abscessos nos pulmões, fígado, rins e
articulações. A infecção por A. suis também causa septicemia aguda, rápida e fatal
num período de 15 horas a três dias (SOBESTIANSKY et alii, 1999), anorexia,
hemorragia, febre acima de 40oC, sinais de cianose, aflição respiratória, distúrbios
neurológicos ou artrite (SANFORD, 1995). Em animais adultos, a doença é menos
severa e os animais apresentam febre, letargia, aborto, anorexia, pneumonia
necrótica focal, abscessos na pele, nefrite, metrite, meningite e tosse. As lesões de
pneumonia fibrino-necrótica e hemorrágica nos pulmões, são facilmente confundidas
com pleuropneumonia. Os animais podem também apresentar lesões na pele que
são confundidas com lesões da erisipela (MACINNES & SMART, 1993; SANFORD,
1995; OSTAAIJEN et alii, 1997; SOBESTIANSKY et alii, 1999).
O A. suis reside nas tonsilas e cavidade nasal de suínos sadios de
qualquer idade e na vagina de porcas sadias (SANFORD, 1995). A transmissão
ocorre por aerossol, contato direto ou cortes na pele (OSTAAIJEN et alii, 1997).
A patogenicidade do A. suis é provavelmente mediada por toxinas da
família RTX que têm reação cruzada com A. pleuropneumoniae (SANFORD, 1995).
No entanto, esta bactéria deve apresentar outros fatores de virulência como cápsula
e lipopolissacarídeos (OSTAAIJEN et alii, 1997). Outros autores têm relatado
reações cruzadas entre A. pleuropneumoniae e A. suis (DEVENISH et alii, 1989;
KAMP et alii, 1994), sugerindo que os fatores de virulência devem ser os mesmos
(MACINNES & SMART, 1993). BURROWS & LO (1992) clonaram e seqüenciaram
genes que codificam as toxinas de A. suis apresentando alta similaridade com os
genes apxIIC e apxIIA de A. pleuropneumoniae. OSTAAIJEN et alii (1997)
denominaram as toxinas Apx de A. suis como apxICABDvar.suis e apxIICAvar.suis. Estes
autores sugerem que devem existir diferenças na seqüência de nucleotídeos dos
genes apxBD de A. suis, pois não foi possível obter produtos de amplificação a partir
da utilização de primers específicos para os genes apxIBD de A. pleuropneumoniae.
38
1.5 Objetivos
A caracterização por testes bioquímicos e sorológicos da espécie
A. pleuropneumoniae e de amostras NAD-dependentes isoladas de rebanhos sem
sintomas de PPS apresenta muitas dificuldades de interpretação de resultados e de
reações cruzadas com outras espécies relacionadas do gênero e da Família
Pasteurellaceae, principalmente entre A. pleuropneumoniae e A. suis. Devido a
estes problemas, torna-se necessário o desenvolvimento de testes mais específicos
e sensíveis, que possam ser utilizados como rotina de laboratório.
O A. pleuropneumoniae apresenta vários fatores de virulência que são
pouco conhecidos, dificultando o controle da PPS e o desenvolvimento de testes
utilizando alvos específicos. No entanto, a cápsula é sugerida como um destes
principais fatores e é sugerido que a superóxido dismutase apresente alguma
vantagem na sobrevivência do App no organismo do hospedeiro. Portanto,
buscamos estudar e analisar estes fatores de virulência do A. pleuropneumoniae.
Como objetivos específicos foram apresentados:
o desenvolvimento de primers para amplificar o gene sodC e
padronização de primers para amplificação dos genes cpx
responsáveis pela síntese de proteínas envolvidas no transporte da
cápsula de A. pleuropneumoniae;
aplicação dos primers cpx e sodC para caracterização de amostras
NAD-dependentes isoladas de campo;
caracterização das superóxidos dismutases (SOD) de
A. pleuropneumoniae;
análise da presença de cápsula nas amostras de
A. pleuropneumoniae.
CAPÍTULO 2
Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR on field strains isolated
from healthy and diseased pigs
Artigo submetido à Revista: Journal of Clinical Microbiology
1
Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR on field strains isolated from healthy
and diseased pigs.
Running title: Detection of A. pleuropneumoniae by PCR
C. S. Klein1,4, I. A. Piffer4, S. C. Silva1,3, A. Schrank1,2, M. B. B. Fávero4 and I. S. Schrank*1,2
Address of institution where the work was performed:
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves,
9500, Prédio 43421, C.P. 15005, Porto Alegre, RS, Brazil.
Catia Silene Klein1,4, Itamar Antônio Piffer4, Sérgio Ceroni da Silva1,3, Augusto Schrank1,2,
Maria Bernardete Burin Fávero4 and Irene Silveira Schrank*1,2
Footnote:
1Centro de Biotecnologia – UFRGS
2Depto. de Biologia Molecular e Biotecnologia - UFRGS
3Depto. de Patologia Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária - UFRGS
4Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves, EMBRAPA
Irene Silveira Schrank*: Fax: 55 (51) 319 10 79
Telephone: 55 (51) 316 60 55
Correspondig author:
Irene Silveira Schrank
2
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves,
9500, Prédio 43421, C.P. 15005, CEP 91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil.
E-mail:[email protected]
3
Abstract
We investigated whether primers that specifically amplify a 0.7 kb DNA
fragment from the conserved cpx genes could be applied to characterize A. pleuropneumoniae
field isolates. The specific cpx primers were applied on 120 strains of A. pleuropneumoniae
and other NAD-dependent field isolates from healthy and diseased animals to characterize A.
pleuropneumoniae isolates from herds in Brazil. The PCR and hybridization experiments
were applicable to discriminate between isolates of A. pleuropneumoniae and isolates of other
microorganisms. The 0.7 kb cpx DNA bands were amplified from all 63 A. pleuropneumoniae
isolates from herds with clinical symptoms and isolated from lesions of acute cases of swine
pleuropneumonia whether serotypeable or nonserotypeable. The method was also applied to
fifty-seven field isolates obtained from animals of apparently healthy herds and the amplified
cpx product was present in 4 serotypeable and only in 2 out of 11 A. pleuropneumoniae
nonserotypeable isolates. All nonserotypeable A. pleuropneumoniae isolates revealed the
apxA amplification pattern compatible to previously known serotypes. Our results suggest that
some nonserotypeable isolates might represent a population of isolates that originally were
serotypeable but lost the ability to react with serotype-specific antisera or might belong to
novel serotypes. The PCR method applied is highly sensitive for serotypeable A.
pleuropneumoniae strains and for nonserotypeable strains isolated from acute cases of swine
pleuropneumoniae in Brazil.
4
Introduction
Porcine pleuropneumonia, distributed worldwide, is a major contagious respiratory
disease in pigs and causes high mortality with severe economic losses to the swine industry
(31). The disease is characterized by fibrinous pleuritis with hemorrhagic and necrotic lesions
in the lungs, and pleural adhesions (22). The etiological agent of porcine pleuropneumonia,
Actinobacillus pleuropneumoniae can be differentiated in two biovars; biovar 1, NAD
dependent and biovar 2 NAD independent (28). At least 12 serotypes with significant
differences in virulence have been identified (4). Serotyping is mainly based on capsular
antigens. In addition, the serotypes have different lipopolisaccharide (LPS) composition,
except serotypes 1, 9 and 11; serotypes 3, 6 and 8; and serotypes 4 and 7 that show common
epitopes. Several putative factors have been proposed to be involved in virulence of this
agent: capsule, endotoxin, exotoxins (Apx toxins), adhesins, transferrin binding protein, outer
membrane proteins and secreted proteases (12).
Animals that survive an A. pleuropneumoniae infection generally suffer from chronic
lesions and became subclinical carriers of the pathogen (3). In diseased animals the clinical
symptoms and pathological lesions are very characteristic, allowing the isolation of the agent
followed by serotyping and drug susceptibility determination.
In cases of subclinical infection, without the presence of symptoms and lesions, the
diagnosis is normally based on serology. Several techniques were developed for serologic
diagnosis of A. pleuropneumoniae including tube agglutination test, agglutination in the
presence of 2- mercapto-ethanol, complement fixation test and enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Among these tests, the ELISA shows the best sensitivity and specificity and
can been run in a totally automated form. Amongst the ELISA tests, the most utilized are
those based on long chain LPS (5, 6, 7).
5
In spite of the ELISA tests sensitivity there are situations of subclinical infections in which
the animals are in excellent clinical state, but with few seropositive animals. In this situation
the interpretation is very difficult, considering that any ELISA-test is 100% specific. In these
situations it is necessary to make the diagnosis based on the isolation of the agent from tonsil
(16, 32). However this method is not sensitive enough. In addition, there are several resident
Actinobacillus-like species in swine tonsils that are very difficult to differentiate
biochemically from A. pleuropneumoniae (16). The technique of A. pleuropneumoniae
immunomagnetic isolation is promising, but is limited to the serotypes to which the test was
standardized. Moreover, several studies have shown the incidence of isolates from clinical
cases that could not be serotyped (1, 11, 21). Therefore, the detection of A. pleuropneumoniae
from live animals by a specific and sensitive method would be helpful for identification of
this pathogen within the normal flora of the upper respiratory tract.
The polymerase chain reaction (PCR) is a method of gene amplification that can be
used for highly sensitive and specific detection of microorganisms in a wide range of samples.
Problems with non-typeable and cross-reactive A. pleuropneumoniae isolates can be solved
by PCR amplification and easily identified (13). Recently, Ward and Inzana (33) have
characterized a DNA region involved in the exportation of capsular polysaccharides (cpx) by
A. pleuropneumoniae serotype 5a. Based on the conserved nature of cpx genes a PCR assay
was developed for detection of A. pleuropneumoniae to improve the sensitivity and specificity
of identification of serotypes 5 isolates and for early detection (18).
We have used primers that specifically amplify a 0.7 kb DNA fragment present in
serotype 5a from the conserved cpx genes to characterize the other serotypes. We have also
applied the specific cpx primers on NAD-dependent field isolates from healthy and diseased
animals to further characterize A. pleuropneumoniae isolates from herds in Brazil.
6
Materials and methods
Bacterial strains and culture conditions
The 12 reference strains for the recognized A. pleuropneumoniae serotypes and other
bacteria used in this work are listed on Tables 1 and 2. The two A. pleuropneumoniae field
isolates (6796 and 7260), a capsule-deficient mutant of strain K17 (K17-C) and a hemolysis-
deficient mutant mIT4-H were also utilized for comparative analysis.
All strains were streaked on blood agar with a nursery strain of Staphylococcus aureus
and incubated at 37oC during an 18 hours period in a humid atmosphere with 5-10% CO2. A
characteristic NAD-dependent colony was picked up and streaked on Columbia agar (Oxoid,
Basingstoke, UK) supplemented with 5% bovine serum, 50 µg of NAD (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) and incubated at same conditions. Microbiological presence of capsule on
A pleuropneumoniae strains was determined by visualization of an iridescent colony on
Columbia agar supplemented with NAD as previously described (14).
Source of the isolates
The 120 field isolates of A. pleuropneumoniae and other NAD-dependent strains
(Table 3) were from Centro Nacional de Pesquisa em Suínos e Aves (CNPSA), EMBRAPA,
Brazil and were previously characterized (16, 26, 27). All field isolates were characterized
using methods and tables previously described (10, 17, 19). Serotyping was performed by
immunodiffusion test (ID) as described by Nielsen and O’Connor (23) but using a phenol –
water extracted antigen as described by Gunnarsson et al. (9). Strains which resulted in
unknown serotypes according to the ID test were subsequently serotyped by the passive
hemaglutination test described by Mittal et al. (20). Sixty three field isolates were originated
7
from herds with clinical symptoms and isolated from lesions of acute cases of swine
pleuropneumonia (ASPP). Among them, forty-nine were assigned to serotypes 3, 5 or 7 and
fourteen were nontypeable (27).
The other fifty seven field isolates were from animals of apparently healthy herds.
These herds were classified into three different groups as follows: group A; contains twenty
five field isolates from tonsils of asymptomatic 9-15 weeks old piglets provinient from three
chronically infected herds with previous history of pleuropneumonia outbreaks (CSPP).
Groups B and C herds, containing, respectively, 20 and 12 field strains isolated from tonsils
of asymptomatic piglets from three herds where never had been observed symptom nor
lesions characteristic of swine pleuropneumoniae and with no record of A . pleuropneumoniae
isolation (NSPP) (Table 3). Additionally, these herds were under constant veterinary
surveillance (16). Antibodies detected by an ELISA based in LPS-LC polyvalent for serotypes
3, 5 and 7 were present in all CSPP (ELISA+) and in Group B NSPP herds (16).
DNA isolation and PCR conditions
Total DNA was purified as previously described (24). Briefly, a loopful of colonies
from Columbia agar plates were washed in distilled water, resuspended in water with 1.7%
SDS, 50mg/ml of proteinase K and incubated at 65oC for 1 h. Total DNA was purified by
repeated phenol-chloroform extractions and precipitation from the aqueous phase by adding
0.1 volumes of 3 M sodium acetate and 0.6 volumes of isopropanol. The precipitated DNA
was dried and resuspended in distilled water.
The PCR assays were performed in a DNA thermal cycler (MJ Research PTC 200).
PCR mixture contained the reaction buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl pH 8.3, 2 mM
MgCl2), 30 pmol of each primer, 1U of Taq polymerase (CenBiot Enzymes, Centro de
8
Biotecnologia, UFRGS), 200 µM of each dNTP, template DNA and distilled water for a final
volume of 25 µl. The reaction mixture was subjected to PCR under conditions described by
Lo et al. (18). Primers cpx-up and cpx-do (18) were purchased from Oligo ETC & Oligo
Therapeutics Inc. (Wilsonville, USA).
DNA manipulation, sequencing and Southern blotting
DNA manipulations were performed using standard techniques (29) and instructions
provided by suppliers of kits, enzymes and reagents. Southern blot analysis was performed
using the ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection Systems (Amersham Pharmacia
Biotech). The nucleotide sequence determination was performed by the chain-termination
method (30) using 33P-dNTPs and ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle
sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech).
Results
Using the cpx specific PCR assay it was possible to amplify a 0.7 kb (715 bp) product
from the DNA of all A. pleuropneumoniae reference serotypes but the serotype 4 (Figure 1).
DNA from all other Actinobacillus, Haemophilus and Pasteurella species, as well as other
bacterial strains resulted in no amplification (Figure 1C). These results are in agreement with
previously published work showing that even within a highly conserved region there may be
areas of nonhomology among different serotypes (18). To evaluate the specificity of the PCR
assay the amplified PCR product from serotype 5a was sequenced and used as a probe against
the PCR fragments amplified from the other serotypes. The 0.7 kb fragment from serotype 5a
showed total homology with the previously published cpx DNA sequence (33). Southern
9
blotting revealed a similar hybridization pattern for all PCR positive serotypes (Figure 1B)
indicating that the amplified product has identical sequence as published for serotype 5a.
Sixty three bacterial strains isolated from clinical infections in pigs (ASPP) were
tested using the cpx primers in PCR reactions in order to establish the specificity of the
primers for different field strains. A PCR product of 0.7 kb, specifically hybridizing to
serotype 5a cpx probe was obtained for all strains considered to be A. pleuropneumoniae by
microbiological and biochemistry methods (27).
The 57 NAD-dependent field isolates obtained from apparently healthy herds (CSPP
and NSPP) were also analyzed by PCR for the presence of cpx genes. Based on a previous
characterization these field isolates were assigned to three distinct biochemical profiles. The
first group with 15 field isolates identified as A. pleuropneumoniae. The second group, with
27 strains corresponded to A. minor and the third group with 15 strains corresponded to other
NAD-dependent field isolates.
Among the 15 field isolates of A. pleuropneumoniae only four were serotyped and all
of then were isolated from CSPP herds (Group A). All remaining 11 A. pleuropneumoniae
strains were nontypeable. Serotypes 7 and 12 were identified amongst the four
A. pleuropneumoniae typeable strains (16). The serotype 7 isolated have been previously
isolated from the same herds while the serotype 12 was isolated from herds chronically
infected with serotype 3. These results together with the PCR / hybridization analysis are
summarized on Table 3. Amplification of field isolates total DNA using cpx primers resulted
in a single 0.7 kb DNA band in all A. pleuropneumoniae serotypeable and only in 2 out of 11
A. pleuropneumoniae nontypeable isolates. All A. minor and other NAD-dependent field
isolates showed negative results for the PCR/hybridization analysis confirming the specificity
of the assigned primers. The 0.7 kb PCR fragment from two field isolates was also sequenced
revealing total homology with the previously characterized sequence from serotype 5a DNA.
10
Discussion
Rapid and accurate identification of A. pleuropneumoniae strains potentially virulent
in subclinically infected herds is relevant both for limiting the severity of outbreaks and for
determining the source of the bacteria entry into specific herds. A PCR assay with primers
specific for the transport region of the capsular polysaccharide of serotype 5 has been recently
proposed (18). The present study was conducted to evaluate the feasibility of applying the cpx
primers to differentiate A. pleuropneumoniae from the other NAD-dependent strains. The
results of the PCR and hybridization experiments for the cpx gene revealed that all A.
pleuropneumoniae serotypes, with exception of serotype 4, could be detected by the PCR
assay (Figure 1). Moreover, no amplification of DNA under conditions tested was observed
from any of the other swine respiratory pathogens analyzed, indicating that the PCR assay is
very specific.
The PCR assay was also applied to testing NAD-dependent isolates provinient from
different herds. The test was able to discriminate between isolates of A. pleuropneumoniae
and isolates of other microorganisms (Table 3). The 0.7 kb cpx DNA bands were amplified
from all 63 A. pleuropneumoniae isolates from ASPP herds whether serotypeable or
nonserotypeable as well from the 4 serotypeable isolates from CSPP or NSPP herds.
However, the amplification of the cpx product was positive only from 2 out of 11 A.
pleuropneumoniae nonserotypeable isolates provinient from CSPP or NSPP herds.
All the strains isolated from ASPP were isolated from lesions and thus can be
considered pathogenic, in contrast to strains isolated from tonsil of healthy piglets from NSPP
herds never reported to have swine pleuropneumoniae outbreaks, neither characteristic lesions
observed at abattoir nor isolation of the A. pleuropneumoniae (16). This fact indicates that
these strains might be not pathogenic at all or are less pathogenic than those isolated from
11
field cases. All the strains belonging to the pathogenic groups of A. pleuropneumoniae gave
positive results in the cpx PCR even if they were nonserotypeable, while among the less
pathogenic or not pathogenic (NSPP isolates) only 1/8 was positive and all were
nonserotypeable. This fact suggests that the PCR test is more prone to detect pathogenic
strains than nonpathogenic ones. Based on this observation and taking in consideration that
serotype 4 is not detected by this PCR test, the application of cpxPCR directly to tonsil
secretions might be a good alternative for defining the status of a herd in regard to the
occurrence of pathogenic strains of A. pleuropneumoniae, specially in Brazil where there are
few records of serotype 4 isolation from field cases of swine pleuropneumoniae.
The present study describes the use of primers to amplify conserved capsular gene
regions that identify all A. pleuropneumoniae serotypes with exception of serotype 4.
Therefore, these 9 A. pleuropneumoniae nonserotypeable isolates could represent the
previously known serotype 4 or possiby the existence of a novel serotype(s). Serotypes of A.
pleuropneumoniae are distinguished by their unique capsular polysaccharide that is related
with the virulence of the A. pleuropneumoniae strains (15). The 9 isolates discussed above
could also have differences on the virulence pattern related with the presence of capsule.
However, the presence of capsule was demonstrated in all 9 nonserotypeable isolates by the
visualization of characteristic iridescent colonies on Columbia agar (data not shown).
A. pleuropneumoniae isolates that do not react with any of the serotype-specific
antisera have been detected and normally are not further characterized. Genotypic
characterization of nonserotypeable A. actinomycetemcomitans isolates suggest that the
isolates are serotype antigen variants originating from isolates of known serotype (25).
Additionally, primers specific to amplify a region of the apxA genes from A.
pleuropneumoniae were constructed (2) and applied to characterize all nonserotypeable
isolates. The amplification products related to apxIA, apxIIA and apxIIIA genes could be
visualized and are shown on Table 4. All nonserotypeable A. pleuropneumoniae isolates
12
revealed the apxA pattern compatible to previously known serotypes. However, only 3 out of
9 nonserotypeable isolates could be assigned to serotype 4 based on the apxA pattern (apxII
and apxIIIA). Our results suggest that some nonserotypeable isolates might represent a
population of isolates that originally were serotypeable but lost the ability to react with
serotype-specific antisera or might belong to novel serotypes not yet described.
In conclusion, the PCR for detection of cpx genes was 100% sensitive for serotypeable
A. pleuropneumoniae strains and for nonserotypeable strains isolated from acute cases of
swine pleuropneumoniae in Brazil.
Acknowledgments
This work was supported by grants from FAPERGS (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul). C.S.K is a receiver of a scholarship from CAPES
(Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior).
References
1. Blackall, P. J., R. Bowles, J. L. Pahoff, and B. N. Smith. 1999. Serological
characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from pigs in 1993 to
1996. Aust. Vet. J. 77:39-43.
2. Collares, R. M. 2000. Ms.C. thesis. Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, RS, Análise molecular dos genes para toxinas de Actinobacillus
pleuropneumoniae em isolados de campo.
13
3. Fenwick, B., and S. Henry. 1994. Porcine pleuropneumonia. J. Am. Vet. Med.
Assoc. 204:1334-1340.
4. Frey, J. and Nicolet, J. 1990. Hemolysin patterns of Actinobacillus
pleuropneumoniae. J. Clin. Microbiol. 28:232-236.
5. Gottschalk, M., E. Altman, N. Charland, F. De Lasalle, and J. D. Dubreuil. 1994a.
Evaluation of a saline boiled extract, capsular polysaccharides and long-chain
lipopolysaccharides of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 as antigens for the
serodiagnosis of swine pleuropneumonia. Vet. Microbiol. 42:91-104.
6. Gottschalk, M., F. De Lasalle, S. Radacovici, and J. D. Dubreuil. 1994b.
Evaluation of long chain lipopolysaccharides (LC-LPS) of Actinobacillus
pleuropneumoniae serotype 5 for the serodiagnosis of swine pleuropneumonia. Vet.
Microbiol. 38:315-327.
7. Gottschalk, M., E. Altman, S. Lacouture, F. De Lasalle, and J. D. Dubreuil. 1997.
Serodiagnosis of swine pleuropneumonia due to Actinobacillus pleuropneumoniae
serotypes 7 and 4 using long-chain lipopolysaccharides. Can. J. Vet. Res. 61:62-65.
8. Gram, T., P. Ahrens, M. Andreasen, J. P. Nielsen. 2000. An Actinobacillus
pleuropneumoniae PCR typing system based on the apx and omlA genes – evaluation
of isolates from lungs and tonsils of pigs. Vet. Microbiol. 75:43-57.
9. Gunnarsson, A. 1979. Evaluation of different antigens in the complement - fixation
test for diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae (parahaemolyticus) infections in
swine. Am. J. Vet. Res. 40:1564-1567.
10. Gutierrez, C. B., R. I. Tascon, J. I. R. Barbosa, O. R. Gonzalez, J. A. Vasquez,
and E. F. R. Ferri. 1993. Characterization of V Factor-dependent organisms of the
Family Pasteurellaceae isolated from porcine pneumonic lungs in Spain. Comp.
Immun. Microbiol. 6:123-130.
14
11. Hampson, D. J., P. J. Blackall, J. M. Woodward, and A. J. Lymbery. 1993.
Genetic analysis of Actinobacillus pleuropneumoniae, and comparison with
Haemophilus spp taxon "Minor group"and taxon C. Zbl. Bakt 279:83-91.
12. Haesebrouck, F., K. Chiers, I. van Overbeke, and R. Ducatelle. 1997.
Actinobacillus pleuropneumoniae infections in pigs: the role of virulence factors in
pathogenesis and protection. Vet. Microbiol. 58:239-249.
13. Hennessy, K. J., J. J. Iandolo, and B. W. Fenwick. 1993. Serotype identification of
Actinobacillus pleuropneumoniae by arbitrarily primed polymerase chain reaction. J.
Clin. Microbiol. 31:1155-1159, 1993.
14. Inzana, T. J. 1990. Capsules and virulence in the HAP group of bacteria. Can. J. Vet.
Res. 54S: S22-7.
15. Inzana, T. J. 1991. Virulence properties of Actinobacillus pleuropneumoniae.
Microb. Pathogen. 11: 305-316.
16. Kich, J. D., I. A. Piffer, D. E. S. N. Barcellos, A. L. Guidoni, C. S. Klein, M. B. B.
F. Fávero, and R. Vizzotto. 2000. Methods to isolate NAd-dependent bacteria from
the upper respiratory tract of health pigs. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 52:1-6.
17. Killian, M., and W. Frederiksen. 1981. Identification tables for the Haemophilus-
Pasteurella-Actinobacillus group, p.281-290. In Lillian M.; Frederiksen W &
Biberstein E.E. (ed.), Academic Press, London.
18. Lo, T.M., C. K. Ward, and T. J. Inzana. 1998. Detection and identification of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5 by Multiplex PCR. J. Clin. Microbiol.
36:1704-1710.
19. Møller, K., and M. Kilian. 1990. V Factor-dependent Members of the Family
Pasteurellaceae in the porcine upper respiratory tract. J. Clin. Microbiol. 28:2711-
2716.
15
20. Mittal, K. R., R. Higgins, and S. Lariviére. 1983. Detection of Type-Specific
Antigens in the Lungs of Haemophilus pleuropneumoniae - Infected Pigs by
Coaglutination Test. J. Clin. Microbiol. 18:1355-1357.
21. Musser, J. M., V. J. Rapp, and R. K. Selander. 1987. Clonal diversity in
Haemophilus pleuropneumoniae. Infect. Immun. 55:1207-1215.
22. Nicolet, J. 1992. Haemophilus infections, p. 426-436. In A. D. Leman, B. E. Straw,
W. L. Mengeling, S. D’Allaire, and D. J. Taylor (ed.), Diseases of swine. Iowa State
University Press, Ames.
23. Nielsen, R., and P. J. O´Connor. 1984. Serological characterization of 8
Haemophilus pleuropneumoniae strains and proposal of a new serotype 8. Acta Vet.
Scand. 25: 96-106.
24. Ostaaijen, J. V., J. Frey, S. Rosendal, and J. I. MacInnes. 1997. Actinobacillus suis
isolated from healthy and diseased swine are clonal and carry apxICABDvar. suis and
apxIICAvar.suis toxin genes. J. Clin. Microbiol. 35:1131-1137.
25. Paju, S., M. Saarela, S. Alaluusua, P. Fives-Taylor and S. Asikainen. 1998.
Characterization of serologically nontypeable Actinobacillus actinomycetemcomitans
isolates. J. Clin. Microbiol. 36:2019-2022.
26. Piffer, I. A., M. A. V. P. Brito, J. R. F. Brito, and D. E. Barcellos. 1987. Serotypes
of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae isolated from swine in Brazil.
Pesq. Vet. Bras. 7:79-83.
27. Piffer, I. A., C. Klein, M. Fávero, and J. O. Figueredo. 1997. Biochemical and
serological characterization of strains of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated in
Brazil. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 49:123-129.
28. Pohl, S., H. U. Bertschinger, W. Frederiksen, and W. Mannheim. 1983. Transfer
of Haemophilus pleuropneumoniae and Pasteurella haemolytica-like organism causing
16
porcine necrotic pleuropneumonia to the genus Actinobacillus (Actinobacillus
pleuropneumoniae comb. Nov.) on the basis of phenotypic and deoxyribonucleic acid
relatedness. Int. J. Syst. Bact. 33:510-514.
29. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprig Harbor, N. Y.
30. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain
terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 5467.
31. Sebunya, T. N. H. K., and J. R. Saunders. 1983. Haemophilus pleuropneumoniae
infection in swine: a review. J. Am. Vet. Med. Assoc. 182:1331-1337.
32. Sidibé, M., S. Messier, S. Lariviere, M. Gottschalk, and K. R. Mittal. 1993.
Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in the porcine upper respiratory tract as
a complement to serological tests. Can. J. Vet. Res. 57:204-208.
33. Ward, C. K., and T. J. Inzana. 1997. Identification and characterization of a DNA
region involved in the export of capsular polysaccharide by Actinobacillus
pleuropneumoniae serotype 5a. Infec. Immun. 65:2491-2496.
17
Figure legend
Figure 1
Specificity of PCR-hybridization assay for amplification of the cpx genes of different
A. pleuropneumoniae serotypes.
In panels A and C the amplified PCR products were electrophoresed in 1.5% agarose gels and
visualized by UV transillumination after ethidium bromide staining. Bacterial strains and
serotypes are indicated over the gel. Lane M contains pUC DNA digested with AluI . The
negative control lane contains no template DNA in the reaction mixture. Panels B and D show
the Southern blot and correponding hybridization with 33P-dNTP labeled 0.7 kb cpx DNA
fragment amplified from serotype 5a DNA.
18
TABLE 1. Source of Actinobacillus pleuropneumoniae strains. Serotype Strain Source or reference 1 4074 Dr. R. Ross 2 1536 Dr. R. Ross 3 1421 Dr. R. Ross 4 M62 ATCC 33378 5a K17 ATCC 33377 5b L20 Dr. R. Ross 6 Femø SCI-A Dr. R. Petersen 7 WF83 SCI-A Dr. R. Petersen 8 F384 Dr. R. Petersen 9 F60 Dr. R. Petersen 10 13039 Dr. R. Ross 11 56153 Dr. R. Ross 12 1096 Dr. R. Ross 5a mIT4-H* Dr. T. Inzana 5a K17-C* Dr. T. Inzana 5b 6796** CNPSA-EMBRAPA NT 7260** CNPSA-EMBRAPA
Dr. Richard Ross, Iowa University, USA.
Dr. Ruth Petersen, Intervet, Denmark.
Dr. Thomas Inzana, Virginia University, USA.
*Strains K17-C and mIT4-H are nonencapsulated and nonhaemolytic mutants of
A. pleuropneumoniae, respectively. **Strains 6796 and 7260 were isolated from clinical
infections in pigs.
19
TABLE 2. Source of bacterial strains. Species Strain Source or reference Actinobacillus suis 110UK Dr. D. Barcellos Actinobacillus minor Field strain CNPSA-EMBRAPA Bordetella bronchiseptica Field strain CNPSA-EMBRAPA Pasteurella multocida Field strain CNPSA-EMBRAPA Haemophilus parasuis Field strain CNPSA-EMBRAPA Staphilococcus aureus Field strain CNPSA-EMBRAPA Streptococcus suis Field strain CNPSA-EMBRAPA
Dr. David Barcellos, UFRGS, Brazil.
20
TABLE 3: Number of cpx PCR positive bacterial strains among field isolates previously
characterized biochemically.
NAD-dependent field isolates from tonsils of apparently healthy animals on farms in Brazil,
isolated in the period 1995-1996.
App ST NT Am Other* Totals
Herds P B P B P B P B P B
4 1 0 0 5 Group A (CSPP, ELISApos) 4 3 11 7 25
0 1 0 0 1 Group B (NSPP, ELISApos) 0 3 13 4 20
0 0 0 0 0 Group C (NSPP, ELISAneg) 0 5 3 4 12
4 2 0 0 6 Totals 4 11 27 15 57 App: Actinobacillus pleuropneumoniae
ST: serotypeable
NT: nonserotypeable
Am: Actinobacillus minor
*NAD-dependent bacteria other than A. pleuropneumoniae or A. minor.
P: no. of field isolates with positive PCR results for cpx gene.
B: no. of field isolates characterized by microbiological and biochemical methods.
21
TABLE 4: Characterization of nonserotypable (NT) field isolates of A. pleuropneumoniae.
PCR for apxA genes PCR for
cpx gene No. of
isolates I II III Compatible serotypes* Herds
3 + + - 1, 5, 9 ASPP 11 - + + 2, 3, 4, 6, 8 ASPP 1 - + - 7, 12 group A
cpx positive
1 - + + 2, 3, 4, 6, 8 group B
1 + - - 10 group A 1 - + - 7, 12 group A 2 + + - 1, 5, 9 group B 2 - + - 7, 12 group C
cpx negative
3 - + + 2, 3, 4, 6, 8 group C ASPP: animals from herds with clinical simptoms of acute swine pleuropneumonia. Groups
A, B and C are the same as presented in Table 3. *This column lists the A. pleuropneumoniae
reference serotypes whose toxin genes profile are compatible with the profile determined
from the field isolates.
CAPÍTULO 3
MATERIAIS E MÉTODOS
41
3 MATERIAIS E MÉTODOS.
3.1 Origem das amostras analisadas.
Um grupo de amostras foi constituído de sessenta e três isolados de
lesões de casos agudos de PPS de várias regiões do Brasil no período de 1981-
2000, pertencentes à bacterioteca do Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e
Aves e classificados por testes bioquímicos como A. pleuropneumoniae (Tabela 1).
O segundo grupo de amostras foi constituído de cinqüenta e sete isolados
de tonsilas de leitões assintomáticos com idade de 9-15 semanas de rebanhos.
Estas amostras foram distribuídas em 3 grupos. O grupo A continha vinte e cinco
isolados NAD-dependentes oriundas de rebanhos com registro, no passado, de
ocorrência de surto agudo de pleuropneumonia com isolamento de
A. pleuropneumoniae e sem repopulação do plantel. Também apresentaram
resultados sorológicos positivos por ELISA-LPS. O grupo B continha vinte isolados
oriundos de rebanhos que nunca apresentaram sintomas ou lesões de
pleuropneumonia e sem isolamento de amostras de A. pleuropneumoniae, porém
apresentaram resultados sorológicos positivos por ELISA-LPS e tinham assistência
médica veterinária permanente. O quarto grupo (grupo C) continha doze amostras
oriundas de um rebanho com aspecto sanitário idêntico ao grupo B, porém com
resultado sorológico negativo por ELISA-LPS (Tabela 2). Estas amostras foram
caracterizadas previamente por KICH et alii (2000).
Todos os isolados dos três grupos bem como os isolados de casos
clínicos de PPS e as amostras controles positivos e negativos utilizadas neste
experimento foram mantidas em leite desnatado à –70oC e foram cedidas pelo
Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC). As amostras mutantes
foram doadas à Embrapa Suínos e Aves pelo Dr. T. J. Inzana da Universidade de
Virgínia (Tabela 4).
42
TABELA 1. Isolados de A. pleuropneumoniae oriundos de casos clínicos no Brasil.
No de amostras (n=63) Sorotipo
1 1
17 3
1 5
1 5a
23 5b
5 7
1 11
14 NT
NT: Não sorotipável
TABELA 2. Número de isolados NAD-dependentes oriundos de tonsilas de leitões assintomáticos.
Rebanhos App
ST NT Am
Hps Taxon NAD-dependentes
Grupo A: Infecção crônica com ELISA* positivo
1 (S12); 3 (S7) 3 11 2 1 4
Grupo B: Sem registro de infecção/doença e ELISA* positivo
0 4 13 1 2 1
Grupo C: Sem registro de infecção/doença e ELISA * negativo
0 5 3 0 2 2
Total de amostras (n=57) 4 11 27 3 5 7 Am: A. minor Hps: H. parasuis ST: sorotipificável NT: Não sorotipificável *Antígeno LPS-CL S7: App classificado como pertencente ao sorotipo 7. S12: App classificado como pertencente ao sorotipo 12.
43
3.2 Meios de cultura e condições de cultivo das amostras.
As amostras, ao serem removidas dos estoques foram semeadas em
placa com meio de ágar sangue com semeadura perpendicular de S. aureus. Uma
colônia representativa foi repicada para o meio de ágar Colúmbia (Oxoid,
Basingstoke, Inglaterra) suplementado com 50 µg /ml de NAD (Sigma Chemical Co.)
(modificado de FREY, 1992) e 5% de soro bovino. Este meio foi utilizado para
observação da presença de iridiscência da colônia como indicativo de presença de
cápsula (INZANA, 1991). Quando utilizado cultivo em meio líquido, o meio utilizado
foi LB (Lúria Bertani, Sigma Chemical Co.) suplementado com soro e NAD nas
mesmas concentrações anteriores. Todos os cultivos foram incubados a 37oC, por
18 horas, numa atmosfera entre 5 e 10% de CO2 conforme uso de rotina no
laboratório de microbiologia da Embrapa Suínos e Aves.
3.3 Enzimas.
A enzima Proteinase K (Sigma Chemical Co.) foi utilizada na
concentração de 50 µg/ml. Para as reações de clivagens foram utilizadas as enzimas de restrição
HindIII, HaeIII, TaqI e BamHI (Amersham Pharmacia Biotech).
Como controle da inibição da atividade de SOD em gel de poliacrilamida
não desnaturante foi utilizada CuZnSOD bovina purificada (Sigma Chemical Co.).
3.4 Caracterização do gene cpx de A. pleuropneumoniae.
Um esquema representando o operon cpxDCBA com destaque para a
região amplificada pelos primers cpx é mostrado na Figura 1.
3.4.1 Clivagem do produto amplificado por PCRcpx.
As reações de clivagem total dos produtos de PCR amplificados (PPcpx)
a partir de DNA do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae e do isolado 6800 oriundo
de caso clínico de PPS foram realizadas utilizando 2 U da enzima de restrição TaqI
(GibcoBRL-Life Tecnology, Inc.) para cada micrograma de DNA. Foi utilizado o
44
tampão para enzima REactTM Buffer Chart 2 (GibcoBRL- Life Tecnology, Inc.) e a
reação foi incubada em banho-maria por 1 hora a 37ºC.
3.4.2 Clivagem do DNA genômico.
Para a clivagem foram utilizados 2 µg de DNA genômico das amostras
padrões de App sorotipos 4, 5a e da amostra padrão de A. suis com 15 U da enzima
de restrição HindIII sendo incubados em banho-maria a 37oC por 2 horas. Após a
clivagem as amostras foram aplicadas em gel de agarose 0,8% e utilizado em
experimentos de hibridização com a sonda do fragmento PPcpx purificado conforme
item 3.6.4.2.
3.4.3 Detecção microbiológica de cápsula.
Foram analisados no total 120 amostras pertencentes aos grupos A, B, C
e de casos clínicos. Como controle foram utilizadas as amostras do sorotipo 5a
padrão de App, K17 contendo cápsula, mIT4−H mutante não hemolítica e a K17−C
mutante acapsulada.
Para a observação da cápsula nas amostras de A. pleuropneumoniae
foram utilizadas as colorações de Hiss (DOETSH, 1981) e a coloração negativa com
tinta da china (tinta nankin) através de microscopia ótica e também a observação
visual da iridiscência das colônias em meio claro ágar Colúmbia (3.2) segundo
INZANA (1990).
cpxD cpxC cpxB cpxA-35 / -10t
Actinobacillus pleuropneumoniaecpxDCBAoperon
4576pb do up
cpxD cpxC cpxB cpxA-35 / -10t
Actinobacillus pleuropneumoniaecpxDCBAoperon
4576pb4576pb do up715pb
Figura 1. Operon dos genes cpx com a região de 715pb amplificada pelos primers cpx.
45
3.5 PCR para genes sodC de A. pleuropneumoniae.
3.5.1 Desenvolvimento de primers específicos.
Foram desenvolvidos dois pares de primers, um denominado sodC-UP e
sodC-DO e outro denominado Msod-UP e Msod-DO. Ambos primers correspondem
à seqüência do gene sodC de A. pleuropneumoniae que têm o total de 573 pb e
codifica a proteína CuZnSOD (cobre-zinco-superóxido dismutase). Foi utilizado o
programa Vector NTI version 4.0 (InforMax, Inc.) para projetar estes primers que
possibilitavam a amplificação de um produto de 447 pb com os primers sodC-UP e
sodC-DO, denominado PPsodC. Os primers Msod-UP e Msod-DO foram projetados
para amplificar toda a região codificante do gene com exceção do peptídeo sinal,
amplificando assim um produto de 504 pb, denominado PPMsod (Tabela 3).
Um esquema mostrando em destaque o cluster sodC é apresentado na
Figura 2.
TABELA 3. Seqüências dos primers sodC e Msod.
Primers Seqüências
sodC-UP 5’ AAGCGGATAACAGCTCAG 3’
sodC-DO 5’ CTAATGGAGCCGGGTGAT 3’
Msod-UP 5’ AACATATGGATCATGATCATAAA 3’
Msod-DO 5’ AAGAATTCTTATTTGATGACGCC 3’
sodCasd
BamH1 EcoR1
recF
573 pb
Actinobacillus pleuropneumoniaesodC cluster
updo
Figura 2. Região genômica de App ressaltando o gene sodC (573 pb).
46
3.5.2 Extração de DNA total.
Para a extração de DNA total foi utilizada a técnica descrita por
OSTAAIJEN et alii (1997) contendo algumas modificações. As colônias de
A. pleuropneumoniae foram raspadas da placa de cultivo em ágar Colúmbia,
ressuspendidas em 1 ml de água MilliQ (Millipore), centrifugadas a 12000 x g por
5 minutos e novamente ressuspendidas em 700 µl de água MilliQ. As células foram
lisadas com SDS (1,7%), tratadas com proteinase K (50 µg/ml) e incubadas a 65ºC
por 1 hora. O lisado foi purificado por extração com volumes iguais de fenol-
clorofórmio (SAMBROOK et alii, 1989) e o DNA foi precipitado com acetato de sódio
3 M (1/10 volumes) e etanol absoluto (2 volumes) ou isopropanol (0,6 volumes),
permanecendo por 16 horas a –20oC. Após a centrifugação a 12000 x g por 10
minutos o sobrenadante foi desprezado e o pellet lavado com etanol (70%) e
ressuspendido em 500 µl de água MilliQ.
3.5.3 Aplicação da técnica de PCR para o gene sodC de
A. pleuropneumoniae.
Foram analisadas, através da técnica de PCR com os primers Msod,
quarenta e nove isolados provenientes de casos clínicos de PPS, previamente
sorotipificadas como pertencentes aos sorotipos 1, 3, 5, 7 e 11 (PIFFER et alii, 1997)
e quatorze não sorotipificáveis (NT) (Tabela 1). Também foram analisados outros
cinqüenta e sete isolados oriundos de 8 rebanhos classificados nos grupos A, B e C,
com diferentes aspectos clínicos, previamente caracterizados como NAD-
dependentes (KICH et alii, 2000). Estes rebanhos estão localizados na região oeste
de Santa Catarina e região do planalto do Rio Grande do Sul (Tabela 2). Do total de cinqüenta e sete isolados de rebanhos, vinte e sete foram
classificados por testes bioquímicos como A. minor, três como H. parasuis, cinco
como pertencentes ao grupo Taxon, quinze como A. pleuropneumoniae e outros
sete isolados foram apenas classificadas como NAD-dependentes, uma vez que
apresentaram uma caracterização bioquímica conflitante com aquela descrita para
as espécies NAD-dependentes da Família Pasteurellaceae. Dos isolados de
A. pleuropneumoniae quatro foram sorotipificáveis sendo três pertencentes ao
sorotipo 7 e uma ao sorotipo 12. As onze amostras restantes não puderam ser
sorotipificadas.
47
3.6 Otimização das condições de PCR para o gene sodC de A. pleuropneumoniae.
Foram padronizadas a temperatura e concentração de íons de Mg para
otimizar a reação de PCR. As temperaturas testadas variaram de 50oC e 55oC sendo
utilizado para amplificação o DNA do sorotipo 9 de App. Para a padronização da
concentração de MgCl2 foram testadas as concentrações de 1,5 mM, 2 mM e
2,5 mM.
A reação para um volume final de 25 µl foi padronizada para conter: 5 µl do
DNA total de App; 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3); 2,5 mM MgCl2; 50 mM KCl; 200 µM
de cada desoxinucleotídeo trifosfatado (dNTP's); 30 pmol de cada primer e 1 U de
Taq DNA polimerase.
As reações de PCR foram realizadas em termociclador (MJ Research, Inc.)
sendo o DNA desnaturado com uma etapa a 94°C por 5 minutos e amplificado por
35 ciclos consistindo de desnaturação a 94oC por 45 segundos; anelamento dos
primers a 50oC por 45 segundos; polimerização a 72oC por 45 segundos. Após
completados os 35 ciclos uma etapa adicional consistia de anelamento a 50oC por 2
minutos com uma etapa de polimerização a 72 oC por 5 minutos.
3.6.1 Controles da técnica de PCR.
Como controles positivos foram utilizadas amostras de referência dos
doze sorotipos padrões de A. pleuropneumoniae, um isolado altamente virulento
oriundo de pulmão de caso clínico agudo de PPS (6796), um isolado não
sorotipificável oriundo de pulmão com sinais clínicos de PPS (7260), uma amostra
padrão sorotipo 5a de App mutante não hemolítica (mIT4-H) e uma amostra padrão
sorotipo 5a de App mutante não capsulada (K17-C) (Tabela 4).
Como controles negativos foram utilizadas amostras de referência de
A. suis e S. aureus, isolados de campo com características bioquímicas de amostras
padrões de H. parasuis, P. multocida, A. minor, B. anthracis, B. bronchiseptica e
S. suis (Tabela 4). Com exceção de S. aureus e de B. anthracis as demais são
freqüentemente encontradas no trato respiratório dos suínos.
48
TABELA 4. Amostras bacterianas utilizadas na padronização dos testes de PCRcpx e PCRsodC.
Espécie Sorotipo Amostra Referência
Actinobacillus pleuropneumoniae
1 Shope 4074 ATCC 27088 – Dr. R. Ross
2 1536 Dr. R. Ross
3 1421 Dr. R. Ross
4 M62 ATCC 33378
5a K17 ATCC 33377
5b L20 Dr. R. Ross
6 Femø SCI-A Dra. R. Petersen
7 WF83 SCI-A Dra. R. Petersen
8 F384 Dra. R. Petersen
9 F60 Dra. R. Petersen
10 13039 Dr. R. Ross
11 56153 Dr. R. Ross
12 1096 Dr. R. Ross
5a mIT4-H Dr. T. Inzana
5a K17-C Dr. T. Inzana
5b 6796 CNPSA-EMBRAPA
NT 7260 CNPSA-EMBRAPA
Actinobacillus suis 110UK Dr. David Barcellos
Pasteurella multocida Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA
Haemophilus parasuis Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Actinobacillus minor Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA
Streptococcus suis Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA
Bacillus anthracis Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA
ATCC: American Type Culture Collection Dr. Richard Ross, Iowa University, USA Dra. Ruth Petersen, Intervet, Denmark Dr. Thomas Inzana, Virginiae University, USA Dr. David Barcellos, UFRGS, Brasil
49
3.6.2 Clivagem do produto PPsodC.
A reação de clivagem total do produto de PCR amplificado a partir de
DNA da amostra padrão sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae, foi realizada utilizando
2 U da enzima de restrição BamHI (GibcoBRL-Life Tecnology, Inc.) para cada
micrograma de DNA. Foi utilizado o tampão para enzima REactTM Buffer Chart 3
(GibcoBRL- Life Tecnology, Inc.) e a reação foi incubada em banho-maria por 1 hora
a 37ºC.
3.6.3 Eletroforese dos produtos de PCR em gel de agarose.
Na verificação do resultado de PCR, cerca de 25% (10 µl) do volume da
reação foi separado por eletroforese em gel de agarose na concentração de 1,5%,
com 0,5 µg de brometo de etídio/ml (TAYLOR, 1993) e visualizadas em um
transiluminador de luz ultravioleta. O tampão utilizado para a corrida eletroforética foi
TEB 1X (SAMBROOK et alii, 1989).
3.6.4 Southern blot.
3.6.4.1 Transferência de DNA para membrana de nylon.
Após separação por eletroforese em gel de agarose os produtos de PCR
foram transferidos para uma membrana de nylon positivamente carregada
(HibondTM-N+, Amershan Pharmacia Biotech) com a utilização do sistema de
transferência VacuGeneTM XL Pump (Amersham Pharmacia Biotech). O protocolo
utilizado seguiu a orientação do fabricante do sistema. As soluções de
desnaturação, neutralização e SSC, foram preparadas segundo SAMBROOK et alii
(1989).
3.6.4.2 Preparo da sonda para hibridização.
Foi utilizado como sonda o produto amplificado por PCR a partir de DNA
do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae. Para purificação do fragmento de DNA
amplificado foi utilizado o GFXTM PCR DNA and Gel band purification Kit (Amershan
Pharmacia Biotech). O produto de 504pb foi separado por eletroforese em gel de
50
agarose na concentração de 1,5% e a etapa de purificação seguiu o protocolo
fornecido pelo fabricante do kit.
O produto de PCR do sorotipo 5a de App utilizado como sonda foi
marcado de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do kit ECLTM Direct
Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (Amershan Pharmacia Biotech). Para
a hibridização e revelação dos produtos de PCR foi utilizado o kit ECLTM Direct
Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (Amershan Pharmacia Biotech). Após
esta etapa, a membrana foi exposta em um filme de radiografia (XK-1 - Kodak) por
períodos de 10 a 30 segundos para visualização.
3.6.5 Seqüenciamento dos fragmentos de PCR
Para o seqüenciamento de parte do gene que codifica para a proteína
CuZnSOD de A. suis e do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae pela técnica de
Sanger (SANGER et alii, 1977) foi utilizado o Thermosequenase radiolabeled
terminator cycle sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech). Foram realizadas
duas reações de seqüenciamento, uma utilizando o primer Msod-UP e a outra
reação utilizando o primer Msod-DO.
Os fragmentos amplificados relativos aos genes cpx foram seqüenciados
também utilizando os dois primers cpx-UP e cpx-DO com as amostras do sorotipo 5a
padrão de A. pleuropneumoniae e dos isolados 7047 e 7011 oriundos de rebanhos.
3.6.5.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante.
3.6.5.1.1 Solução estoque de acrilamida a 42%.
Acrilamida 42% (p/v) e N’, N’-metilenebisacrilamida 1,8% (p/v) dissolvidos
em água destilada sob agitação com 5% (p/v) de resina monobeb Amberlite (Sigma
Chemical Co.) por 1 hora. A solução foi filtrada e armazenada a 4°C protegida da luz
até o momento do uso.
51
3.6.5.1.2 Montagem do gel, aplicação das amostras e corrida
eletroforética.
Foram aplicados 5 µl de cada amostra contendo dideoxinucleotídeos
marcados com α-33P. O DNA foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida
(3.5.5.1.1) com a concentração de 8% contendo 8 M de uréia. A eletroforese foi
realizada em uma cuba de eletroforese vertical com tampão TEB 1X por 2:30 horas
com uma corrida eletroforética de 80 W constante com temperatura de 55°C.
3.6.5.1.3 Secagem do gel, exposição e revelação em filme de
radiografia.
Após a corrida, o gel foi colocado em um secador de gel (Bio Rad gel
Dryer model 583) por aproximadamente 2 horas e exposto a um filme de radiografia
(Kodak) por 2 ou 3 dias, revelado por 30 segundos e fixado por 10 minutos (Kodak).
3.7 Detecção da atividade de superóxido dismutases (SODs).
A atividade das proteínas SODs foi observada por eletroforese em gel não
desnaturante (nativo) de acordo BEUCHAMP & FRIDOVICH (1971).
3.7.1 Preparo das amostras de A. pleuropneumoniae.
A bactéria foi cultivada por 18 horas em 25 ml de caldo LB conforme
descrito no item 3.2 a 37 oC sob agitação de 180 rpm. A cultura foi centrifugada a
4.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante desprezado. O pellet de bactéria foi
ressuspendido em 5 ml de Tris pH 7,8 e novamente centrifugado para remoção de
resíduos de meio de cultura. Após a etapa de lavagem, o pellet foi ressuspendido
em 2 ml de Tris 50 mM, pH 8,0 e sulfato de cobre 1 mM (LANGFORD et alii, 1996).
Posteriormente foram realizadas 5 etapas de congelamento em nitrogênio líquido e
posterior descongelamento em temperatura de 4 oC e sonicação com 4 pulsos de 20
segundos cada com intervalo de 2 minutos entre os pulsos. Após a etapa de lise
celular a suspensão foi centrifugada a 13.500 x g em microcentrífuga por 10 minutos
e o sobrenadante foi armazenado, originando o ETB (extrato total bacteriano).
52
Também foram testados ETBs contendo inibidores de proteases (Iodoacetamida
5 mM; PMSF 1 mM; TLCK 50 µM; TPCK 50 µM) (SPIEGELHALDER et alii, 1993).
Os ETBs contendo SOD foram mantidos sob congelamento em freezer a –20oC até
o momento do uso.
3.7.2 Soluções utilizadas.
3.7.2.1 Tampão de amostra.
Tris.HCl 50 mM, pH 7,8; glicerol 30% (v/v); azul de bromofenol 0,5% (p/v)
utilizado na proporção de 10% do volume da amostra.
3.7.2.2 Soluções para visualização de atividade das SODs.
3.7.2.2.1 Solução de NBT (Nitrobluetetrazolium).
NBT (Sigma Chemical Co.) 2,45 mM em água destilada, preparado no
momento de uso.
3.7.2.2.2 Solução de inibição KCN/H2O2.
Na2EDTA 0,1 mM; KCN 1 mM; H2O2 20 mM e K2HPO4 50 mM
adicionados na solução reveladora (3.7.2.2.3), modificada de PRIVALLE &
FRIDOVICH (1987). Esta solução permite a inibição de CuZnSOD e FeSOD
simultaneamente.
Para a visualização apenas da atividade de CuZnSOD, foi adicionado
10mM de KCN à solução reveladora (3.7.2.2.3) (SCHRANK, 1988).
3.7.2.2.3 Solução reveladora.
K2HPO4 36 mM, pH 7,8; riboflavina (vitamina B2 - Sigma Chemical Co.)
2,8 µM; TEMED 28 mM em água destilada, pH 8,0.
53
3.7.2.3 Solução estoque de acrilamida-bisacrilamida.
3.7.2.3.1 Solução separadora (Running).
Acrilamida 30%; N’, N’-metilenebisacrilamida 0,8% em água destilada.
3.7.2.3.2 Solução concentradora (Stacking).
Acrilamida 10%; N’, N’-metilenebisacrilamida 2,5% em água destilada.
As soluções foram filtradas em 0,45 µm e conservadas em geladeira.
3.7.2.4 Soluções aceleradoras da polimerização.
3.7.2.4.1 Solução aceleradora separadora (Running).
24 ml 1N HCl; 15,85 g Tris base; 320 µl TEMED e água destilada para
100ml.
3.7.2.4.2 Solução aceleradora concentradora (Stacking).
24 ml 1N HCl; 2,72 g Tris base; 320 µl TEMED e água destilada para
100ml.
3.7.2.5 Tampão para corrida eletroforética (10X).
Glicina 3,53%; Tris.base 0,47% pH 8,5.
3.7.3 Confecção dos géis nativos (não desnaturantes).
3.7.3.1 Gel separador (Running).
Foram adicionados volumes iguais das soluções aceleradora separadora
(3.7.2.4.1) e da solução estoque de acrilamida-bisacrilamida 30:0,8% (3.7.2.3.1). A
quantidade de água foi igual ao volume das duas soluções juntas e foi acrescentado
0,30% de persulfato de amônio.
54
3.7.3.2 Gel concentrador (Stacking).
Foram adicionados volumes iguais das soluções aceleradora
concentradora (3.7.2.4.2) e da solução estoque de acrilamida-bisacrilamida 10:2,5%
(3.7.2.3.2). A quantidade de água foi igual ao volume das duas soluções juntas e foi
acrescentado 0,28% de persulfato de amônio.A corrida foi feita em cuba vertical
(Bio-Rad) com tampão de corrida eletroforética (3.7.2.5) 1 X na câmara superior e
inferior e corrida constante de 150 Volts por 2:30 horas.
Os géis foram confeccionados em cuba vertical (Bio-Rad) com tamanho
de 73 mm de altura por 83 mm de largura.
As amostras foram descongeladas e mantidas em gelo, misturadas com
10% de tampão de amostra (3.7.2.1) e aplicadas em gel nativo (3.7.3).
3.7.4 Determinação do metal ligante.
Após a corrida eletroforética, o gel foi submergido em solução de NBT
(3.7.2.2.1) por 20 minutos em câmara escura. Em seguida foi lavado em água
destilada. A atividade enzimática das amostras foi inibida com diferentes inibidores e
o gel revelado com a solução reveladora (3.7.2.2.3) sob luz intensa por
aproximadamente 15 minutos com suave agitação até a obtenção uniforme da cor
azul, exceto nas posições das bandas da proteína SOD que formava regiões
acromáticas.
A determinação do metal ligante foi realizada por inibição da atividade da
proteína com a solução inibidora KCN/H2O2 (3.7.2.2.2). Esta solução inibe a
presença de CuZnSOD e FeSOD, mas não inibe a presença de MnSOD.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
56
4 RESULTADOS
4.1 Caracterização do produto de amplificação relativo ao operon que codifica as proteínas de transporte de cápsula.
Com o objetivo de caracterizar o fragmento de 715 pb amplificado por
PCR para os genes cpx foi realizada uma clivagem com enzima de restrição. Os
produtos amplificados por PCR, denominados PPcpx, a partir do DNA da amostra
padrão do sorotipo 5a de App (Figura 3) e do isolado 6800 de casos clínicos de PPS
(Figura 4) foram clivados com a enzima de restrição TaqI. Esta enzima cliva o
produto PPcpx em duas regiões originando três fragmentos de 333 pb, 220 pb e
160 pb. Um esquema demonstrando os tamanhos dos fragmentos com o sítio para
TaqI está apresentado na Figura 5.
Com o objetivo de confirmar que os fragmentos de PPcpx amplificados
por PCR fazem parte da seqüência do gene cpxCB de A. pleuropneumoniae,
depositada no GenBank, os produtos de PCR (PPcpx) obtidos de App padrão
sorotipo 5a, utilizado como sonda para Southern blot, e dos isolados 7047 e 7011
dos rebanhos foram seqüenciados pelas extremidades utilizando os dois primers da
reação. O resultado do seqüenciamento foi comparado com a seqüência disponível
no GenBank apresentando 99% de similaridade. A Figura 6 apresenta a seqüência
de nucleotídeos do fragmento amplificado do isolado 7011 comparativamente a
FIGURA 3. Clivagem do produto dePCR PPcpx do sorotipo 5a deA. pleuropneumoniae. Eletroforese emgel de agarose 1,5% do produto PPcpx ea clivagem com TaqI. (1) Marcador depeso molecular (100 pb ladderAmersham Pharmacia); (2) PPcpx daamostra padrão de App sorotipo 5aclivado e (3) não clivado.
1 2 3 pb pb
715
335 220 160
800
200
57
seqüência presente no GenBank. Estes resultados demonstram que os produtos
obtidos na reação de PCR são relativos àqueles originados do operon cpxDCBA.
Taq I
160 pb 220 pb715 pb
335 pb
Taq I
FIGURA 5. Esquema de clivagem do fragmento PPcpx com os sítios para TaqI.
FIGURA 4. Clivagem do produto de PPcpxdo isolado de A. pleuropneumoniae 6800oriundo de campo. Eletroforese em gel deagarose 1,5% do produto de PCR e a clivagemcom TaqI. (1) Marcador de peso molecular(100 pb ladder Amersham Pharmacia); (2)PPcpx do isolado 6800 clivado e (3) nãoclivado.
715
335 220 160
800
200
1 2 3 pb pb
58
1 50 cpxCB AGCGAAAGGC TATGGTATGG GTATGGATGT ACCGACGGTT TATCGTGTGA 7011 .......... .......... ......ATGT ACCGACGGTT TATCGTGTGA 51 100 cpxCB ATTTACTTGA GCCGCAATCA CTGTTTTTAT TACAACGCTT CCCGATGCAA 7011 ACTTACTTGA GCCGCAATCA CTGTTTTTAT TACAACGCTT CCCGATGCAA 101 150 cpxCB GATAAAGATA TTGTCTATGT ATCAAATGCA CCGTTGTCCG AATTCCAAAA 7011 GATAAAGATA TTGTCTATGT ATCAAATGCA CCGTTGTCCG AATTCCAAAA 151 200 cpxCB ATTCTTGAGA ATGATTTTCT CGATTACTTC GCCGGTTACA AGTACGACTA 7011 ATTCTTGAGA ATGATTTTCT CGATTACTTC GCCGGTTACA AGTA...... 201 250 cpxCB ATGCTATTCG TGCCTATTAA TATATTGAAT TTATAAGGAT AAAATATGGA 7011 .......... .......... .......... .......... .......... 251 300 cpxCB AACAACTATT ACGGCAAGTC CGACAGAAAA ACTACAAAAA CCGGTTAAAC 7011 .......... .......... .......... .......... .......... 301 350 cpxCB AGAAAAAAAG TTGGTTAAAA AAGCTTAATC CGTTATTTTG GGTAACTGTA 7011 .......... .......... .......... .......... .......... 351 400 cpxCB GCGATTCCTA CGGTATTATC AGCCTTTTAT TTCGGTTCTG TTGCTTCCGA 7011 .......... .......... .......... .......... .......... 401 450 cpxCB TATTTATATT TCGGAATCAA GCTTCGTTGT AAGATCTCCT CAAAATCAGA 7011 .......... .......... .......... .......... .......... 451 500 cpxCB CCGCTTTAAC CGGTGTCGGT GCCTTATTAC AAGGTTCCGG ATTTTCTCGA 7011 .......... .......... .......... .......... .......... 501 550 cpxCB GCTCAAGATG ATACTTATAC CGTACAAGAA TATATGCATT CTCGTACGGC 7011 .......... .......... .......GAA TATATGCATT CTCGTACGGC 551 600 cpxCB ACTAGAACAG TTAATGAAAG ACTTGCCAAT ACGTGAATAC TATGAGAATC 7011 ACTAGAACAG TTAATGAAAG ACTTGCCAAT ACGTGAATAC TATGAGAATC 601 650 cpxCB AAGGCGATAT TATCGCTCGC TTTAATGGAT TTGGTTTAAA TAATAGTAAA 7011 AAGGCGATAT TATCGCTCGC TTTAATGGAT TTGGTTTAAA TAATAGTAAA 651 700 cpxCB GAAGCGTTTT ATAAATATTT CCGAGATCGC TTAAGTGTGG ACTTTGACTC 7011 GAAGCGTTTT ATAAATATTT CCGAGATCGC TTAAGTGTGG ATTTC..... 701 717 cpxCB TGTTTCCGGT ATCGCCA 7011 .......... .......
FIGURA 6. Seqüência de nucleotídeo do produto PPcpx de App. Alinhamento de parte da seqüência de nucleotídeos dos genes cpxCB do operoncpx (GenBank nº U36397) que codifica proteínas de transporte da cápsula deA. pleuropneumoniae com a seqüência de nucleotídeos amplificada do isolado7011. Os nucleotídeos idênticos estão em azul e a seqüência dos primers emvermelho.
59
Os resultados obtidos neste trabalho, assim como os previamente
descritos por LO et alii (1998), demonstram que o App sorotipo 4 apresenta
diferenças na região genômica utilizada para amplificar o produto PPcpx. Com o
objetivo de caracterizar esta região do sorotipo 4 foi realizada uma hibridização entre
o DNA total deste sorotipo com a sonda heteróloga de PPcpx. O operon cpx do
sorotipo 5 apresenta 4 sítios para a enzima de restrição HindIII originando 5
fragmentos de aproximadamente 50 pb, 480 pb, 1100 pb, 1300 pb e 1600 pb. O
fragmento PPcpx do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae foi também clivado com a
enzima de restrição HindIII para ser usado como controle de hibridização. A enzima
HindIII cliva o fragmento PPcpx em duas regiões originando um fragmento de
aproximadamente 50pb e dois fragmentos de aproximadamente 300pb. Nenhuma
banda de hibridização foi verificada com os fragmentos gerados pela clivagem
genômica do DNA do sorotipo 4 de App. Entretanto, a amostra do DNA de A. suis
apresentou três bandas de hibridização de aproximadamente 1100 pb, 900 pb e
800 pb com a sonda PPcpx (Figura 7). O DNA do isolado 6951 utilizado,
previamente caracterizado como App não sorotipificável, não apresentou homologia
com a sonda utilizada (Figura 7, canaleta 3). Estes resultados sugerem que existem
FIGURA 7. Clivagem dos DNAs genômicos e hibridização com PPcpx. Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos DNAs totais clivados com HindIII (A)e autoradiografia da hibridização com a sonda (B). (1) Marcador de pesomolecular pUC18 clivado com AluI; (2) sorotipo 4 de App; (3) isolado App NT6951 (rebanho 20); (4) amostra padrão de A. suis; (5) fragmento dePPcpx/ HindIII e (6) λ/ HindIII.
23,1
6,5 9,4
4,3
2,3 2,0
0,3
Kb pb
690 521
286
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
60
regiões similares aos genes cpx de App em A.suis e que o isolado de campo pode
não ser App.
A análise microbiológica de presença de cápsula apresentou resultados
de difícil conclusão. Não foi possível observar a presença de cápsula utilizando as
colorações de Hiss e a coloração negativa com tinta da china. A observação visual
da iridiscência das colônias em meio claro foi utilizada, porém, sua interpretação
depende do observador. Os resultados da observação visual são apresentados na
Tabela 5 e a correlação com os resultados da técnica de PCR (PCRcpx) estão
apresentados nas Tabelas 8 e 9.
4.2 Padronização da técnica de PCR para amplificação do gene sodC.
A técnica de PCR foi previamente padronizada estabelecendo como a
temperatura ideal 50oC para anelamento de ambos os primers MSod ou SodC e a
concentração de 2,5 mM de MgCl2 para a amplificação do gene que codifica a
enzima CuZnSOD de A. pleuropneumoniae sem apresentar amplificações
inespecíficas (dados não mostrados).
O teste de PCR apresentou a amplificação de um produto de 504pb,
denominado PPMsod à partir do DNA de todos os sorotipos padrões de App e das
amostras de App utilizadas como controles positivos do teste (Figura 8A).
TABELA 5. Análise microbiológica de presença de cápsula. A tabela apresenta o número de amostras com resultado positivo ou negativo para presença de cápsula.
App NAD-dep Origem das
amostras Positivos Negativos Positivos Negativos
Casos clínicos 27 - - -
Grupos A, B, C de
Rebanhos
15 - 28 14
Controles* 02 01 - -
Total (n=88) 44 02 28 14 * os controles utilizados foram às amostras de App mutante acapasulada sorotipo 5a (K17-C), a amostra padrão do sorotipo 5a normal e o isolado de B. anthracis.
61
Para verificação da homologia entre os produtos de PCR amplificados a
partir do DNA de todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae e das outras bactérias
utilizadas como controles do teste, foi utilizada a técnica de Southern blot. Um
produto de PPMsod de 504 pb do sorotipo 5a foi purificado e utilizado como sonda
frente a todas as amostras controles positivas e negativas. Todas as amostras de
A. pleuropneumoniae controles positivos hibridizaram para a sonda de 504 pb
(Figura 8B).
Quando esta metodologia foi aplicada a amostras controles negativos
somente foram visualizados um produto de amplificação de 504 pb na amostra
padrão de A. suis, um produto de amplificação de aproximadamente 530 pb na
amostra de P. multocida e um produto de amplificação de alto peso molecular na
amostra de B. bronchiseptica. Nenhum outro fragmento de amplificação foi
observado nas outras amostras (Figura 9A). Hibridização com a sonda foi observada
somente com o produto de 530 pb da amostra de P. multocida e do produto de
504 pb da amostra de A. suis. Nenhuma outra banda de hibridização foi observada
nas demais amostras controles negativos (Figura 9B).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
pb
504 587
pb
504
FIGURA 8. Análise por PCR da presença do gene sodC em App Eletroforese em gel de agarose 1,5% do produto PPMsod amplificado (A) eresultado da hibridização dos produtos amplificados em (A) com a sondaPPMsod isolada do sorotipo 5a (B). (M) marcador de peso molecular pUC18clivado com HaeIII; (1 a 13) amostras dos sorotipos padrões 1, 2, 3, 4, 5a, 5b,6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 de App; (14) amostra de App mutante mIT4-H; (15)amostra de App mutante K17-C; (16) isolado de App não sorotipificável 7260;(17) isolado de App altamente virulenta 6796 e (18) controle negativo dareação de PCR.
A
B
62
Com o objetivo de caracterizar o produto amplificado, foi realizada a
clivagem com a enzima de restrição BamHI do produto de 447 pb amplificado por
PCR utilizando os primers sodC-UP e sodC-DO denominado PPsodC a partir da
amostra padrão do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae. Esta enzima apresenta um
único sítio de clivagem no gene sodC de A. pleuropneumoniae originando 2
fragmentos, um de 200 pb e outro de 227 pb (Figura 10). O esquema de restrição do
produto PPsodC é mostrado na Figura 11.
Para confirmar a similaridade dos fragmentos amplificados de PPMsod
com a seqüência depositada no GenBank, o produto de App padrão sorotipo 5a
utilizado como sonda para Sothern blot foi seqüenciado pelas extremidades
utilizando os dois primers da reação. O resultado do seqüenciamento foi comparado
com a seqüência disponível no GenBank apresentando 96% de similaridade (Figura
12). O produto amplificado a partir da amostra padrão de A. suis também foi
seqüenciado e apresentou 96% de identidade com a seqüência de nucleotídeos do
gene sodC de A. pleuropneumoniae (dados não mostrados).
FIGURA 9. Análise por PCR da presença do gene sodC. Eletroforese em gel de agarose 1,5% das amostras utilizadas como controlesnegativos (A) e hibridização com a sonda PPMsod isolada do sorotipo 5a (B).(M) marcador de peso molecular pUC18 clivado com HaeIII; amostras de:(1) B. anthracis; (2) P. multocida; (3) S. aureus; (4) A. minor; (5) S. suis; (6)B. bronchiseptica; (7) H. parasuis; (8) A. suis; (9) controle negativo da reaçãoe (10) App sorotipo 5.
M 1 2 3 4 5 6 7 108 9
pb pb
504587
504
A
B
63
1 2 3 pb pb
447 247 200
800
200
FIGURA 10. Clivagem do fragmentoPPsodC de App. Eletroforese em gel de agarose 1,5% doproduto amplificado. (1) marcador de pesomolecular (100 pb ladder AmershamPharmacia); (2) produto de PCR não clivadoda amostra de App sorotipo 5a e (3) produtode PCR clivado com BamHI.
Bam HI
247 pb 200 pb 447 pb
FIGURA 11. Esquema de clivagem do fragmento PPsodC com o sítio para BamHI.
64
1 50 sodC GATCATGATC ATAAAAAAGC GGATAACAGC TCAGTGGAAA AACTTGTCGT S5a .......... .......... ........GC TCAGTGGAAA AACTTGTCGT 51 100 sodC ACAAGTACAA CAACTTGATC CTGTAAAAGG AAACAAGGAT GTCGGTACGG S5a ACAAGTACAA CAACTTGATC CTGTAAAAGG AAACAAGGAT GTCGGTACGG 101 150 sodC TAGAAATTAC CGAATCTGCA TACGGTTTAG TGTTTACTCC GCACTTACAC s S5a TAGAAATTAC CGAATCTGCA TACGGTTTAG TGTTTACTCC GCACTTACAC 151 200 sodC GGTTTAGCTC AAGGTTTACA CGGCTTCCAT ATTCACCAAA ACCCAAGCTG S5a GGTTTAGCTC AAGGTTTACA CGGCTTCCAT ATTCACCAAA ACCCAAGCTG 201 250 sodC TGAACCGAAA GAAAAAGACG GTAAACTGGT TGCCGGTTTA GGCGCGGGCG S5a TGAGCCGAAA GAAAAAGACG GTAAACTGGT TGCCGGTTTA GGCGCGGGCG 251 300 sodC GGCACTGGGA TCCGAAAGAT ACCAAGCAAC ACGGCTATCC GTGGTCGGAC S5a GTCACTGGGA TCCGAAAGAG ACCAAGCAAC ACGGTTATCC GTGGTCGGAT 301 350 sodC GATGCGCACT TAGGTGATTT ACCGGCATTA ACCATCGCAC ACGACGGTTC S5a TACGCACACT TAGGCGATTT ACCGGCATTA TTCGTAGAGC ATGACGGTTC 351 400 sodC TGCAACCAAT CCGGTTCTTG CTCCGCGTTT GAAAAAACTT GATGAAGTTA S5a TGCAACTAAC CCTGTTCTTG CTCCGCGTTT GAAAAAACTG GATGAAGTTA 401 450 sodC AAGGTCACTC TTTAATGATT CACGAAGGCG GCGATAACCA CTCTGATCAC S5a AAGGTCACTC TTTAATGATT CACGAAGGCG GCGATAACCA CTCTGATCAC 451 500 sodC CCGGCTCCAT TAGGCGGTGG CGGTCCGCGT ATGGCTTGCG GCGTCATCAA S5a CCGGCTCCAT TAGGCGGTGG CG........ .......... .......... ......... 501 sodC ATAA S5a ....
FIGURA 12. Seqüência de nucleotídeo do produto amplificado de PPMsod.Alinhamento da seqüência do gene sodC (GenBank n° X99396) que codificaCuZnSOD de A. pleuropneumoniae com a seqüência de nucleotídeos amplificadado sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae (S5a) Os nucleotídeos idênticos estão emazul e a seqüência dos primers em vermelho.
65
4.3 Aplicação da técnica de PCRsodC em isolados de campo.
A metodologia de PCR padronizada para o gene sodC foi utilizada para
analisar isolados de App a partir de diferentes rebanhos. As sessenta e três amostras isoladas de casos agudos de PPS foram submetidas à reação de PCR e
todas apresentaram produto de amplificação correspondente ao produto PPMsod do
gene sodC (Tabela 6 e ver Tabela 8).
Também foram analisados cinqüenta e sete isolados NAD-dependentes
classificados nos grupos A, B e C através do teste de PCR para o gene sodC. Deste
total somente dois isolados, classificados por testes bioquímicos como
A. pleuropneumoniae, não apresentaram produto de amplificação para o gene sodC.
Entre os outros isolados classificados por testes bioquímicos como A. minor,
H. parasuis e como NAD-dependentes somente 07 apresentaram produto de
amplificação correspondente ao gene sodC de A. pleuropneumoniae (Tabela 7 e ver
Tabela 9).
TABELA 6. Classificação bioquímica e resultados de PCR de
isolados App de casos clínicos.
ST - amostras de App sorotipificáveis NT - amostras de App não sorotipificáveis
BIOQUÍMICA NÚMERO DE AMOSTRAS COM PCRsodC POSITIVO
App ST (n = 49)
App NT (n = 14) 49
14
Total das amostras 63
66
TABELA 7. Classificação bioquímica e resultados de PCRsodC dos isolados de rebanhos assintomáticos
BIOQUÍMICA NÚMERO TOTAL DE
ISOLADOS PCR Positivo
PCR Negativo
App ST 04 04 -
App NT 11 09 02
Actinobacillus minor 27 03 24
Haemophilus parasuis 03 01 02
NAD-dependentes 12 03 09
Total de amostras 57 23 37 ST - amostras de App sorotipificáveis NT - amostras de App não sorotipificáveis
67
TABELA 8. Caracterização de isolados App originados de casos clínicos de PPS.
Análise Microbiológica Análise
Molecular
Am
ostr
a
Hem
ólis
e*
Cáp
sula
**
Soro
tipo*
**
PCR
sodC
Cáp
sula
PC
Rcp
x 6634 + S3 + + 6635 + S3 + + 6636 + S3 + + 6654 + S3 + + 6735 + + NT + + 6740 + + S5B + + 6742 + S3 + + 6743 + S5B + + 6744 + S5B + + 6745 + S5B + + 6746 + S5B + + 6747 + S7 + + 6751 + S5B + + 6752 + S7 + + 6754 + + S5B + + 6778 + + S5B + + 6789 + S5B + + 6790 + S5B + + 6791 + S3 + + 6792 + S5B + + 6796 + S5B + + 6800 + + S5B + + 6801 + S5B + + 6802 + + S5B + + 6803 + + S7 + + 6804 + + S7 + + 6805 + + S5B + + 6806 + + S5B + + 6824 + S3 + + 6825 + + S11 + + 6826 + S5B + + 6807 + S5B + +
Análise Microbiológica
Análise Molecular
Am
ostr
a
Hem
ólis
e*
Cáp
sula
**
Soro
tipo*
**
PCR
sodC
Cáp
sula
PC
Rcp
x
6813 + S5B + + 6815 + S5B + + 6816 + S7 + + 6822 + + S5B + + 6823 + S3 + + 6827 + + S5 + + 6829 + S3 + + 6830 + S3 + + 6834 + S5B + + 6835 + + S3 + + 6850 + + S3 + + 6857 + + S5A + + 7058 + + NT + + 7114 + + S3 + + 7164 + + S3 + + 7180 + S3 + + 7222 + + NT + + 7258 + + S1 + + 7260 + + NT + + 7276 + + NT + + 7277 + + NT + + 7278 + + NT + + 7300 + + NT + + 7301 + NT + + 7305 + + NT + +
*Hemólise em hemácia de carneiro. **Presença de cápsula determinada pela iridiscência da colônia em meio agar colúmbia. ***Sorotipo determinado pela técnica de imunodifusão em gel de agarose.
TABELA 9. Caracterização de isolados App de rebanhos assintomáticos com 9 asemanas de idade.
Análise Microbiológica Análise Molecul
Amostras
Urea
se
CAMP
te
st #
Hem
ólise
*
Cáps
ula*
*
Soro
tipo*
**
Classificação Bioquímica
PCRs
odC
Hibr
idiz.
cp
x
mIT 4 H + - - + 5a App + + +K17 C + + + - 5a App + + + A. suis + + + - -A. minor - - - -B.anthracis + + - - -B. bronchiseptica + - - -H. parasuis - - - - -S. suis + - - -P. multocida - - - -S. aureus + - - - 6894 (rebanho 4) - - - - Taxon - - -6905 (rebanho 4) + - - - A. minor - - -6961 (rebanho 4) - - - + H. parasuis + - -7001 (rebanho 4) - - - + ND**** - - -7007 (rebanho 4) + - - + A. minor - - -7008 (rebanho 4) - - - + ND**** - - -7009 (rebanho 4) - - - - ND**** + - -7010 (rebanho 4) + - - - A. minor - - -7011 (rebanho 4) + + + + 12 App + + +7012 (rebanho 4) + - - - A. minor + - -7017 (rebanho 4) - - - - A. minor - - -7023 (rebanho 4) + - - + A. minor - - -7027 (rebanho 4) - - - + ND**** + - -7073 (rebanho 4) + - - - A. minor - - -7077 (rebanho 4) + - - + A. minor - - - 6895 (rebanho 5) + - - + A. minor - - - 6986 (rebanho 6) + + + + NT App - - - 6876 (rebanho 7) + + + 7 App + + +6963 (rebanho 7) + - - + A. minor - - -6964 (rebanho 7) + + + + NT App + - -6974 (rebanho 7) + + + + 7 App + + +6975 (rebanho 7) + + + + 7 App + + +6976 (rebanho 7) - - - + H. parasuis - - -
Continua na página
6815
ar
PCRc
px
69
69
Continuação da Tabela 9
Amostras
Urea
se
CAMP
test
#
Hem
ólise
*
Cáps
ula*
*
Soro
tipo*
**
Classificação Bioquímica
PCRs
odC
Hibr
idiz.
cp
x
PCRc
px
6980 (rebanho 7) + + + + NT App + + - 6998 (rebanho 8) + - - + A. minor + - - 7019 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7022 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7024 (rebanho 11) + - - + NT App + - - 7025 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7038 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7039 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7041 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7042 (rebanho 11) - - - + H. parasuis - - - 7043 (rebanho 11) + - - + A. minor - - - 7044 (rebanho 11) + - - - A. minor - - - 7045 (rebanho 11) + - - + NT App + - - 7046 (rebanho 11) + - - - A. minor - - - 7047 (rebanho 11) + - + + NT App + + + 7050 (rebanho 11) - - - - Taxon - - - 7082 (rebanho 11) - - - + A. minor - - - 6896 (rebanho 12) + - - + A. minor - - - 6897 (rebanho 12) + - - + A. minor - - - 6904 (rebanho 12) - - - + ND**** + - - 6906 (rebanho 12) - - - + A. minor + - - 6907 (rebanho 12) - - - + Taxon - - - 6951 (rebanho 20) + - + + NT App - - - 6953 (rebanho 20) + - + + NT App + - - 6954 (rebanho 20) - - - - ND**** - - - 6955 (rebanho 20) + - - - A.minor - - - 6956 (rebanho 20) + - - + A.minor - - - 6957 (rebanho 20) + - + + NT App + - - 6977 (rebanho 20) - - - + A. minor - - - 6978 (rebanho 20) - - - - Taxon - - - 6979 (rebanho 20) + - + + NT App + - - 6981 (rebanho 20) - - - + ND**** - - - 6982 (rebanho 20) - - - - Taxon - - - 6983 (rebanho 20) - - + + NT App + - -
NT: amostra de App não sorotipificável. ND****: amostras classificadas apenas como NAD-dependentes. Grupos dos rebanhos: (A) rebanhos 4, 5, 6, 7 e 8; (B) rebanhos 11 e 12; (C) rebanho 20. # Teste que determina a presença de hemólise sinérgica com a β-hemolisina de S. aureus em hemácia de carneiro. *Hemólise em hemácia de carneiro. **Presença de cápsula determinada pela iridiscência da colônia em meio agar colúmbia. ***Sorotipo determinado pela técnica de imunodifusão em gel de agarose.
70
4.4 CuZnSOD em A. pleuropneumoniae.
A atividade das superóxido dismutases (SODs) foi visualizada em géis de
poliacrilamida, de acordo com a redução do NBT, pela geração de radicais
superóxidos através da foto-oxidação da riboflavina, formando um complexo de cor
azul denominado formazan com bandas acromáticas que determinam a presença de
SOD (BEUCHAMP & FRIDOVICH, 1971). Foram analisadas amostras padrões do
sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae, de A. suis, os isolados 7011 (sorotipo 12),
6951 (não sorotipificável), 6974 (sorotipo 7) de A. pleuropneumoniae e o isolado
6897 de A. minor. Todas as amostras foram analisadas em gel nativo corado com
NBT, sem inibição, para visualização de SODs. As amostras de
A. pleuropneumoniae sorotipificáveis e A. suis apresentaram uma banda de
migração intermediária (MI) enquanto que os isolados de App (NT) e A. minor
apresentaram uma banda de migração lenta (ML) (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17).
As SODs foram caracterizadas de acordo com o metal ligante no seu sítio
ativo através da inibição da atividade das enzimas utilizando soluções de inibição
contendo: cianeto (CN−), que inibe a atividade de CuZnSOD, mas não inibe MnSOD
e FeSOD; H2O2, que inibe a atividade de CuZnSOD e FeSOD, mas não inibe
MnSOD (ASADA et alii, 1975; HASSAN, 1989; MISRA & FRIDOVICH, 1978;
BASSANESI, 1992).
A presença da enzima CuZnSOD foi observada na amostra padrão de
A. pleuropneumoniae sorotipo 5a. Esta amostra apresentou uma banda de migração
intermediária (MI) e foi submetida ao ensaio de inibição da atividade de SOD. A
banda de migração intermediária (MI) foi totalmente inibida com a solução de
inibição indicando a presença de CuZnSOD (Figura 13).
Para investigar a presença da enzima CuZnSOD em
A. pleuropneumoniae sorotipificáveis (ST) e não sorotipificáveis (NT) isolados de
campo, foram selecionadas e analisadas duas amostras ST que apresentavam
amplificação do gene sodC e uma amostra NT 6951 que não apresentava
amplificação para o gene sodC por PCR. Os isolados ST 6974 (sorotipo 7) e 7011
(sorotipo 12), apresentaram uma banda de migração intermediária (MI), similar à
amostra padrão de App sorotipo 5a, enquanto que o isolado NT 6951 apresentou
uma banda de migração lenta (ML). Todos os isolados foram submetidos ao ensaio
de inibição da atividade de SOD. A banda de migração intermediária (MI) foi
71
totalmente inibida com a solução de inibição KCN/H2O2 indicando a presença de
CuZnSOD (Figura 14). A banda de migração lenta (ML) também foi totalmente
inibida com a solução de inibição KCN/H2O2 indicando a presença de CuZnSOD
(Figura 15).
Estes resultados indicam que possivelmente este isolado NT pode não ser
MnSOD MnSOD
CuZnSODe MI
FeSOD
1 2 3 1 2 3 A B
FIGURA 14. Detecção de CuZnSOD em isolado de App ST. Gel de poliacrilamida 7,5% não desnaturante em presença de NBT e reveladopara detecção de SODs (A) e com adição de inibidor da atividade de CuZnSOD(B). Canaleta 1: extrato proteico total do isolado de App 6974; canaleta 2:CuZnSOD purificada e canaleta 3: extrato proteico total de E. coli revelandoFeSOD e MnSOD.
MnSOD MnSOD
CuZnSODe MI
FeSOD
1 2 3 1 2 3 A B
FIGURA 13. Detecção de CuZnSOD em App sorotipo 5a. Gel de poliacrilamida 7,5% não desnaturante em presença de NBT e reveladopara detecção de SODs (A) e com adição de inibidor da atividade deCuZnSOD (B). Canaleta 1: extrato proteico total do sorotipo 5a padrão de App;canaleta 2: CuZnSOD purificada e canaleta 3: extrato proteico total de E. colirevelando FeSOD e MnSOD.
72
App, pois apresenta um perfil de migração de CuZnSOD diferente dos App padrões
e também não apresenta amplificação com os primers para o gene sodC.
A presença da enzima SOD em amostras de A. minor foi analisada
utilizando um isolado que não apresentava amplificação do gene sodC com os
primers utilizados. Este isolado apresentou uma banda de migração lenta e foi
submetido ao ensaio de inibição da atividade de SOD. A banda de migração lenta
(ML) foi totalmente inibida com a solução de inibição KCN/H2O2 indicando a
presença de CuZnSOD (Figura 16).
A amostra de A. suis padrão apresenta um fragmento de amplificação por
PCRsodC idêntico ao de App. Sendo assim, a amostra padrão de A. suis foi
analisada para a presença de CuZnSOD. Esta amostra apresentou uma banda de
migração intermediária (MI) similar à amostra padrão de App sorotipo 5a e foi
submetida ao ensaio de inibição da atividade de SOD sendo totalmente inibida com
a solução de inibição KCN/H2O2 indicando a presença de CuZnSOD (Figura 17).
FIGURA 15. Detecção de CuZnSOD em isolado de App NT. Gel de poliacrilamida 7,5% não desnaturante em presença de NBT e reveladopara detecção de SODs (A) e com adição de inibidor da atividade de CuZnSOD(B). Canaleta 1: extrato proteico total do isolado de App NT 6951; canaleta 2:CuZnSOD purificada e canaleta 3: extrato proteico total de E. coli revelandoFeSOD e MnSOD.
MnSOD MnSOD
ML
CuZnSOD
FeSOD
1 2 3 1 2 3 A B
73
FIGURA 16. Detecção de CuZnSOD em isolado de A. minor. Gel de poliacrilamida 7,5% não desnaturante em presença de NBT e reveladopara detecção de SODs (A) e com adição de inibidor da atividade de CuZnSOD(B). Canaleta 1: extrato proteico total do isolado de A. minor; canaleta 2:CuZnSOD purificada e canaleta 3: extrato proteico total de E. coli revelandoFeSOD e MnSOD.
FeSOD
CuZnSOD
MnSOD ML
MnSOD
1 2 3 1 2 3 A B
FIGURA 17. Detecção de CuZnSOD em A. suis. Gel de poliacrilamida 7,5% não desnaturante em presença de NBT e reveladopara detecção de SODs (A) e com adição de inibidor da atividade de CuZnSOD(B). Canaleta 1: extrato proteico total do isolado de A. suis; canaleta 2:CuZnSOD purificada e canaleta 3: extrato proteico total de E. coli revelandoFeSOD e MnSOD.
A B 1 2 3
MnSOD MnSOD
1 2 3
CuZnSODe MI
FeSOD
CAPÍTULO 5
DISCUSSÃO
75
5 DISCUSSÃO.
O controle da PPS através da detecção do agente é fundamental para
evitar a transmissão e disseminação do A. pleuropneumoniae entre rebanhos,
principalmente daqueles que visam o melhoramento genético e multiplicação de
animais. A infecção de um rebanho de reprodutores, principalmente por animais
denominados portadores assintomáticos, constitui uma fonte de infecção
permanente devido à distribuição e comércio destes animais, podendo disseminar a
doença para todo o País.
O App possui diversos fatores de virulência ainda pouco entendidos que
podem estar associados ao desenvolvimento da doença clínica. No entanto, muitas
amostras são isoladas do trato respiratório de animais portadores assintomáticos
que não apresentam lesões características de PPS. Estas amostras necessitam uma
caracterização mais precisa tendo um potencial de utilização como vacinas vivas. O
App apresenta similaridades antigênicas entre os 12 sorotipos, que apesar da
desvantagem por apresentar reações cruzadas, auxilia no desenvolvimento de
testes espécie-específicos para triagem de rebanhos. No entanto, após esta análise
inicial dos rebanhos, havendo resultados positivos, existe a necessidade da
aplicação de um teste sorotipo-específico que auxilie na identificação do sorotipo
presente no rebanho em questão.
No Brasil os testes sorológicos são os mais utilizados na determinação da
presença de infecção. No entanto, estes testes possuem algumas desvantagens
devido a presença de reações cruzadas existente entre os sorotipos, o que dificulta
a identificação do sorotipo presente num rebanho. Outra desvantagem é que os
testes sorológicos não diferenciam animais infectados de animais vacinados, uma
vez que é detectada a resposta imunológica que tanto pode ser por via vacinação ou
por infecção. Segundo BLACKALL et alii (1999) nenhuma técnica sorológica é capaz
de reconhecer os 12 sorotipos, porém a utilização conjunta das técnicas de
hemaglutinação indireta (IHA) e gel de difusão quantitativa (QGD) permite diferenciar
no mínimo 10 dos 12 sorotipos. Estes mesmos autores registraram ainda problemas
de sorotipificação errônea de amostras ao utilizar anti-soros homólogos com títulos
baixos, consistindo um erro laboratorial, o que levou à caracterização de isolados
76
como não sorotipificáveis. Estes resultados demonstram os problemas que a
utilização de técnicas sorológicas podem causar na caracterização dos sorotipos,
principalmente porque os animais utilizados para a produção de anti-soros
apresentam variações quanto a produção de anticorpo e a técnica precisa estar bem
validada.
O teste de ELISA é o método de diagnóstico sorológico mais utilizado
atualmente, pois permite que um grande número de amostras possa ser analisado.
Apesar da aparente facilidade da utilização deste teste, que normalmente apresenta
boa sensibilidade, sua especificidade é menor quando comparada às técnicas de
biologia molecular.
De acordo com levantamentos epidemiológicos é possível identificar e
monitorar a prevalência dos sorotipos de uma região e assim desenvolver um teste
específico para estes sorotipos. Desta forma, os rebanhos utilizados neste estudo
foram classificados utilizando o teste de ELISA baseado nos antígenos LPS-CL dos
sorotipos 3, 5 e 7 desenvolvido por MACHADO (1997). Este teste, por apresentar
reações cruzadas, possibilita a detecção dos sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e 8, não
diferenciando o sorotipo infectante. JENSEN & BERTRAN (1986) relataram que as
reações cruzadas entre sorotipos são devidas à similaridade de antígenos dentro
dos componentes do lipopolissacarídeo (LPS). Foi desenvolvido por DUTRA et alii
(2000) outro teste de ELISA baseado na especificidade dos antígenos capsulares
dos sorotipos 3, 5 e 7, que são os mais prevalentes no Brasil, para a utilização na
caracterização dos sorotipos em amostras positivas ao ELISA LPS-CL.
O App apresenta diversos fatores de virulência como LPS, cápsula,
toxinas e proteínas da membrana externa (INZANA, 1991; HAESEBROUCK et alii,
1997). O conhecimento destes fatores pode auxiliar no controle da PPS, podendo
ser utilizados como alvo para o desenvolvimento de vacinas ou mesmo testes para
diagnóstico (KAMP et alii, 1994).
Um problema encontrado no diagnóstico da PPS é a dificuldade de
isolamento do App, que depende de meios enriquecidos ou seletivos. A classificação
de App por testes microbiológicos e bioquímicos também pode apresentar resultados
de difícil interpretação durante a caracterização dos isolados. Segundo GRAM et alii
(1996) e SAVOYE et alii (2000) o teste de PCR aplicado diretamente em amostras
de biópsia de tonsila e de fluido de lavado broncoalveolar de suínos apresenta 2,5 a
3 vezes mais sensibilidade comparado ao isolamento convencional de App.
77
Para o diagnóstico preciso da PPS se faz necessário o conhecimento dos
fatores de virulência envolvidos, uma vez que os testes podem ser dirigidos a estes
fatores ao invés de enfocar somente a identificação do sorotipo. Também é
necessário o desenvolvimento de métodos de diagnóstico rápidos, de fácil manuseio
apresentando alta sensibilidade e especificidade para a detecção do agente em
trabalhos de rotina no laboratório que visam monitoramento do rebanho.
Neste trabalho foram padronizados dois testes de PCR, um para genes
cpx (PCRcpx) e outro para genes sodC (PCRsodC) de A. pleuropneumoniae. Os
testes de PCRcpx e PCRsodC foram padronizados, utilizando amostras dos
sorotipos padrões de App assim como bactérias isoladas normalmente de suínos
para avaliar a especificidade dos primers. Os resultados de padronização
apresentados para PCRcpx foram similares aos descritos por LO et alii (1998) sendo
somente observado um produto de amplificação nas amostras classificadas como
App. Com exceção do sorotipo 4, todos os demais amplificaram um fragmento de
715 pb demonstrando assim a conservação desta região em A. pleuropneumoniae
com os primers utilizados. Foi observado que o DNA total de A. suis clivado com
HindIII e hibridização com a sonda PPcpx apresenta três bandas de hibridização
(Figura 7), indicando que existe similaridade entre os genes cpx de App com regiões
genômicas de A. suis. No entanto, nenhum produto de amplificação foi observado
por PCRcpx na amostra de A. suis utilizada na padronização do teste. Podemos,
portanto concluir que o A.suis apresenta genes similares aos genes cpx de App com
diferenças significantes nas regiões utilizadas para sintetizar os primers. Nossos
resultados indicaram que, mesmo em presença de outras bactérias encontradas no
trato respiratório dos suínos, o App pode ser identificado devida a alta especificidade
do teste. Resultado similar foi obtido por SAVOYE et alii (2000) com a utilização de
PCR para genes omlA de App.
A padronização da técnica de PCRsodC revelou amplificações para todos
os sorotipos de App (Figura 8A) além de outras espécies da família Pasteurellaceae
como A. suis e P. multocida (Figura 9A). Entretanto este PCR não foi padronizado
com o objetivo de ser utilizado na diferenciação da espécie App de outras bactérias
e sim para determinar a presença de genes sodC e avaliar o grau de importância
das SODs como fator de virulência. A amplificação de um fragmento a partir do DNA
de A.suis utilizando os primers para sodC confirma resultados anteriores que
demonstraram alta similaridade entre seqüências de DNA desta bactéria com
78
seqüências de DNA de App. Os genes para toxinas de A. suis apresentam alta
similaridade com os genes de toxinas de A. pleuropneumoniae (BURROWS & LO,
1992; KAMP et alii, 1994; OSTAAIJEN et alii, 1997 e SCHALLER et alii, 1999).
Entretanto, até o momento não existem registros sobre o isolamento ou
caracterização de genes para superóxido dismutase em A. suis. Entretanto o gene
que codifica CuZnSOD de P. multocida já foi caracterizado (no de acesso X83124)
existindo similaridade dos genes sodC com App (dados não publicados).
O seqüenciamento dos fragmentos PPcpx (Figura 6) e PPMsod (Figura
12) indicaram que os fragmentos amplificados correspondem à seqüência de genes
cpxCB e sodC de A. pleuropneumoniae depositadas no GenBank. O
seqüenciamento do fragmento de PPMsod de A. suis apresentou 96% de
similaridade com a seqüência de App depositada no GenBank, indicando que o
A. suis deve possuir gene para superóxido dismutase e que este tem alta
similaridade com o gene sodC de A. pleuropneumoniae. A presença de genes para
superóxido dismutase em A. suis ainda não havia sido relatada. Os fragmentos
PPcpx e PPMsod foram também analisados frente à clivagem com enzimas de
restrição. Existem, em cada um dos fragmentos, sítios para enzimas de restrição que
caracterizam o produto amplificado (Figuras 3, 4 e 10). A clivagem dos produtos
amplificados demonstrou que estes correspondem à região dos genes cpx e sodC
do genoma.
A partir destes resultados podemos concluir que a técnica de PCR,
utilizada para os genes cpx, apresenta alta especificidade podendo ser aplicada na
caracterização da espécie em isolados de casos clínicos de PPS considerando que,
quando negativo, deve ser utilizado outro teste capaz de identificar o sorotipo 4.
Com o objetivo de caracterizar a região dos genes que codificam as proteínas
envolvidas no transporte de cápsula do sorotipo 4 realizamos hibridização do DNA
total com a sonda heteróloga PPcpx do sorotipo 5a. No entanto, não se observou
região de homologia demonstrando que o sorotipo 4 apresenta diferenças na
seqüência de nucleotídeos desta região gênica que não está localizada somente nas
regiões dos primers. Podemos, portanto, sugerir que o sorotipo 4 apresenta um
sistema alternativo de transporte de cápsula diferente dos outros sorotipos. No
entanto, não existem evidências mais conclusivas, até o momento, da presença de
outro sistema de transporte dos polissacarídeos capsulares para o sorotipo 4 ou
para a espécie App. A ausência de um produto de amplificação a partir do sorotipo 4
79
deve ser considerada uma limitação do teste PCRcpx devendo ser buscada uma
solução através do projeto de primers que sejam capazes de identificar amostras
pertencentes a este sorotipo.
Os genes cpx utilizados como alvos de amplificação pelo PCRcpx são
espécie-específicos e responsáveis pelo transporte dos polissacarídeos capsulares,
os quais são codificados pelos genes cps que possivelmente determinam a
especificidade dos sorotipos de App (WARD & INZANA, 1997). Sendo assim, era
esperado que com exceção do sorotipo 4, todas as amostras sorotipificadas
apresentassem resultados de amplificação de acordo com os resultados de LO et alii
(1998). Neste estudo buscamos utilizar a técnica de PCR com primers cpx espécie-
específicos para validar o teste com amostras isoladas de lesões pulmonares de
animais com sintomas agudos de pleuropneumonia, podendo assim identificar
amostras patogênicas e para caracterizar amostras NAD-dependentes isoladas de
tonsilas de leitões assintomáticos oriundos de rebanhos com diferentes aspectos
clínicos.
Os resultados de validação do teste obtidos na caracterização dos
isolados de casos clínicos agudos de PPS, portanto isolados patogênicos,
apresentaram produto de amplificação em todos as amostras bacterianas, mesmo
naqueles onde a sorotipificação não foi possível. Assim sendo podemos concluir que
com excessão do sorotipo 4 o teste é 100% sensível em amostras capazes de
induzir a doença. Entretanto, quando o teste de PCRcpx foi aplicado em amostras
de A. pleuropneumoniae não sorotipificáveis caracterizadas por testes bioquímicos e
isoladas de tonsilas de animais oriundos de leitões com infecção subclínica
pertencentes aos grupos A, B e C, estas amostras foram de difícil caracterização
pelo teste. Todas as amostras de App sorotipificadas apresentaram fragmento de
amplificação correspondente aos genes cpx, porém os resultados dos isolados de
App não sorotipificáveis (NT) apresentaram variações significativas relativas à
amplificação do produto. Do total de 11 isolados NT dos grupos A, B e C apenas 02
isolados apresentaram resultados positivos para PCRcpx. Quando o teste foi
aplicado em isolados NAD-dependentes não App pertencentes aos mesmos grupos,
todas apresentaram resultados negativos, sendo possível diferenciar 100% das
amostras de A. pleuropneumoniae das amostras de A. minor, H. parasuis e outras
NAD-dependentes não App. Estes resultados indicam que a caracterização de
amostras patogênicas pode ser realizada de forma mais precisa, tanto através de
80
técnicas bioquímicas ou pelo método de PCR, do que as amostras não patogênicas.
A caracterização prévia considerava que dos 57 isolados, obtidos de 8
rebanhos assintomáticos, 42 isolados eram NAD-dependentes não App, sendo que
a maioria (27 isolados) eram A. minor (KICH et alii, 2000) (Tabela 2). De acordo com
resultados obtidos por NICOLET (1986) e RAPP et alii (1985) o A. minor representa
20% da flora residente do trato respiratório dos suínos. BLACKALL et alii (1991)
descrevem o isolamento de A. minor de pulmão de suínos com e sem lesões ou
sintomas de PPS.
O papel do A. minor como patógeno não está muito claro, pois existem
poucos estudos até o momento, sendo importante à utilização de testes que facilitem
a sua diferenciação e caracterização. De acordo com BIBERSTEIN et alii (1977) e
M∅LLER & KILLIAN (1990) o A. minor apresenta semelhanças bioquímicas com o
App sendo porém negativo para o teste CAMP e não hemolítico. Os resultados
indicam que há uma diversidade muito grande de amostras NAD-dependentes
residentes na cavidade nasal e nas tonsilas dos suínos sem causar problemas ao
portador. Esta diversidade pode prejudicar o isolamento de App por cultivo
bacteriológico e as variações observadas nos testes bioquímicos têm dificultado a
caracterização do agente da PPS.
Ao analisarmos os resultados da caracterização bioquímica dos diferentes
isolados foi observado que App NT isolados de tonsilas dos rebanhos dos grupos A,
B e C, apresentaram variabilidade quanto a presença de hemólise observada em
hemácia de carneiro (Tabela 9). A ausência da atividade hemolítica em conjunto com
as variações nos testes bioquímicos podem ocasionar uma caracterização errônea
da espécie. Segundo NICOLET (1970) e KILLIAN (1976) a atividade hemolítica é
uma característica da espécie A. pleuropneumoniae e a intensidade varia de acordo
com a hemácia utilizada e o sorotipo da amostra. Ainda foram observadas nos testes
bioquímicos dos isolados das tonsilas de animais de rebanhos assintomáticos,
variações na reação de CAMP, ausência de hidrólise de α-galactosidase, lactose, D-
xilose e rafinose que dificultaram a caracterização (dados não mostrados). Resultados similares já foram relatados por KILLIAN et alii (1978); O`REILLY et alii
(1984); M∅LLER & KILLIAN (1990); GUTIERREZ et alii (1993); BLANCHARD et alii
(1993); PIFFER et alii (1997).
Uma amostra isolada do rebanho 20 (isolado 6983) caracterizada como
App NT também não apresentou produção de urease (Tabela 9). No Brasil foram
81
isoladas amostras urease negativas do sorotipo 1 e 5 por PIFFER et alii (1997)
sendo também relatado por BLANCHARD et alii (1993).
O rebanho 20, pertencente ao grupo C (Tabela 9) classificado como
negativo para ELISA LPS-CL, foi o único que apresentou isolados App NT que após
análise dos resultados do PCRcpx podem ser consideradas pertencentes ao sorotipo
4. O sorotipo 4 apresenta o mesmo LPS do sorotipo 7 (NAKAI et alii, 1992) presente
no antígeno do ELISA utilizado para triagem do rebanho. No entanto, o teste de
ELISA não foi capaz de detectar a presença deste sorotipo. Portanto estes isolados
App NT devem apresentar diferenças na estrutura de LPS relativas ao sorotipo 4
padrão. Ainda segundo KUME et alii (1984 e 1986) e SIDIBÉ et alii (1993) o App
pode colonizar o trato respiratório sem induzir uma soroconversão, explicando assim
o resultado negativo de sorologia. SAITO et alii (1988) registraram o isolamento de
App sorotipo 4 da cavidade nasal de animais pertencentes a rebanhos com
diferentes aspectos clínicos no estado de São Paulo e Minas Gerais. No entanto,
não houve isolamento de amostras de App sorotipo 4 sorotipificáveis nos rebanhos
analisados (KICH et alii, 2000).
Todos os demais rebanhos apresentaram sorologia positiva (Tabela 2), e
isolamento de amostras de A. pleuropneumoniae não sorotipificáveis, sugerindo que
estes isolados podem apresentar epítopos comuns com o LPS-CL dos sorotipos
detectados pelo ELISA (1, 9 e 11; 3, 6 e 8; 4 e 7 segundo NAKAI et alii, 1992). Esta
hipótese precisa ser averiguada. Ainda, segundo LEVONEN et alii (1996), as
reações cruzadas no teste de ELISA podem ser devido à infecção por mais de um
sorotipo presente no rebanho.
No experimento com PCRcpx, a comparação dos resultados, obtidos dos
isolados App de rebanhos de animais assintomáticos com os isolados de animais
portadores de PPS, revelou grande diversidade. As bactérias isoladas de rebanhos
assintomáticos classificadas bioquimicamente como App eram NT e apresentaram
resultados negativos para genes cpx. Estes isolados de App NT devem apresentar
diferenças na estrutura capsular tornando-os menos virulentos do que os isolados de
casos clínicos, uma vez que a cápsula é determinante a virulência (Inzana et alii,
1988).
Com o objetivo de caracterizar a presença de cápsula nos isolados
analisados por PCRcpx e relacionar com a virulência dos mesmos, várias tentativas
de coloração para a visualização microscópica de cápsula foram realizadas, porém
82
nenhuma foi conclusiva. Resultado similar foi observado por BOROWSKI (1992).
Segundo INZANA (1990) a presença de cápsula pode ser visualizada pela
iridiscência da colônia em meio claro. Assim, optamos para a realização desta
análise visual, ressaltando que não é um teste conclusivo, pois depende do
treinamento visual do observador, além de a cápsula não poder ser visualizada
quando presente em pequena quantidade. Do total de quarenta e dois isolados de
App analisados, entre eles 27 isolados de casos clínicos e 15 isolados dos rebanhos
A, B e C, todos apresentaram cápsula determinada pela observação da iridiscência
das colônias, inclusive os nove isolados que apresentaram teste de PCR negativo
para os genes cpx. Podemos supor que estes isolados devem possuir um sistema
de transporte diferente do operon cpxDCBA já caracterizado.
Todas as amostras de App, sorotipificáveis e não sorotipificáveis, isoladas
de casos clínicos apresentaram por PCRsodC amplificação correspondente (Tabela
8). No entanto, entre as quinze amostras de App isoladas de leitões assintomáticos
dos grupos A, B e C esta homogeneidade não ocorreu, apenas dois isolados App NT
(6986 e 6951) apresentaram resultados negativos para PCRsodC (Tabela 9). Porém,
ambos isolados apresentaram hemólise e presença de genes apxII (Collares, 2000)
e o isolado 6985 foi positivo ao teste CAMP enquanto que o 6951 foi negativo. Até o
momento, não há registro de amostra NAD-dependente, além de App, que
apresente hemólise e CAMP teste positivo em isolados de suínos. Entre as outras
quarenta e duas amostras NAD-dependentes não App isoladas de leitões
assintomáticos, sete apresentaram amplificação de um fragmento correspondente ao
gene sodC de App (Tabela 9), indicando que este PCR não é específico o suficiente
para ser utilizado na caracterização da espécie A. pleuropneumoniae. De acordo
com os resultados obtidos ocorreu isolamento de App (ST e NT) com resultado
positivo para PCRsodC em todos os grupos de animais, independente do isolado ser
de casos clínicos de PPS ou de rebanhos negativos. Estes resultados sugerem que
a presença de sodC pode não ser um forte determinante de virulência, não se
descartando a hipótese de que a CuZnSOD possa junto com outros fatores de
virulência como cápsula e toxinas Apx ser um fator agravante de patogenicidade.
Das cinco amostras (03 de App, 01 de A. minor e 01 de A.suis) que foram
analisadas quanto à presença de CuZnSOD todas apresentaram banda de atividade
em gel nativo (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17). O isolado NT (6951) analisado para
presença de genes homólogos a cpx por hibridização apresentou PCRsodC
83
negativo. No entanto demonstrou uma banda de atividade correspondente a
CuZnSOD, mas com perfil de migração diferente do perfil encontrado em App
(Figura 15). Nossos resultados indicam que CuZnSOD pode auxiliar no processo de
patogenicidade de App , mas não deve ser um fator essencial de virulência. Estudos
realizados por SCHEEHAN et alii (2000) comparando experimentalmente amostras
de App mutante e não mutante para sodC demonstraram que a amostra mutante
desenvolveu sinais clínicos de PPS e foi igualmente virulenta quando inoculada em
suínos.
Observamos ainda que as amostras de A. minor e de A. suis também
apresentam a presença de CuZnSOD (Figuras 16 e 17). Até o momento não há
registro da presença de SOD nestes organismos. A CuZnSOD de A. suis além de
apresentar alta similaridade quanto à região do DNA amplificada e seqüenciada,
também apresenta um perfil de migração em gel nativo similar a CuZnSOD de App.
A presença de MnSOD não foi observada em nenhuma das amostras
analisadas (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17). Estes dados são contraditórios aos de
LANGFORD et alii (1996) e SCHEEHAN et alii (2000). Nosso cultivo foi aeróbico e
segundo HASSAN & FRIDOVICH (1977b e 1979) MnSOD, codificada pelo gene
sodA de E.coli, não é sintetizada anaerobicamente e é induzida por exposição ao O2
ou por O2−. Entretanto, NIEDERHOFFER et alii (1990) concluíram que nem O2 e
nem O2− estão envolvidos na regulação de sodA em E. coli e que a sua expressão
depende da natureza da fonte de carbono e o modo de crescimento, fermentativo ou
respiratório. MOODY & HASSAN (1984) demonstraram que a atividade de MnSOD
em E. coli foi aumentada quando foi fortemente diminuída a concentração de Fe no
meio de cultura. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que a
superóxido dismutase ou a presença do gene sodC não deve ser considerada como
um fator relevante de virulência para App.
Todos os isolados de App NT de casos clínicos e de rebanhos
assintomáticos foram analisados por PCR (COLLARES, 2000) para verificar o perfil
de genes que codificam as toxinas e relacionar com um provável grupo de sorotipos.
Os isolados de casos clínicos apresentaram um perfil dos genes apxI, apxII ou
apxIII, que codificam as diferentes toxinas, similares aos sorotipos conhecidos de
App (Tabela 10). Portanto a impossibilidade de sorotipificar estes isolados sugere
que estes podem ter perdido a habilidade de reagir com o anti-soro ou fazem parte
de novos sorotipos que possuem o mesmo perfil de genes apx que alguns sorotipos
84
padrões. Estes resultados indicam que estas amostras de App NT, por terem sido
isoladas de animais com sintomas clínicos de PPS, são patogênicas e, portanto
devem apresentar fatores de virulência similares aos já descritos para os sorotipos
padrões.
Dos nove isolados App NT oriundos dos rebanhos que apresentaram
resultados negativos para PCRcpx, três isolados pertencentes ao grupo C,
apresentaram amplificação para genes apxII e apxIII, indicando que podem fazer
parte do sorotipo 4. Os demais isolados App NT negativos por PCRcpx
apresentaram amplificações para os genes apxI, apxII ou ainda apxI e II. Estes
resultados indicam que com exceção de um isolado (6951) que apresentou genes
apxII, os demais devem ser App possuindo um sistema alternativo de transporte dos
polissacarídeos capsulares similar ao do sorotipo 4 (Tabela 10) ou sofreram
mutações ou deleções na região do DNA alvo para os primers cpx. GRAM et alii
(2000) encontraram isolados App NT de tonsilas que foram tipificados por PCR e
sugeriram que estes isolados NT podem constituir novos variantes dos sorotipos de
A. pleuropneumoniae. O isolamento de A. pleuropneumoniae NT já foi descrito por
MUSSER et alii (1987), HENNESSY et alii (1993); HAMPSON et alii (1993) e GRAM
et alii (2000). Segundo PAJU et alii (1998) as amostras NT representam uma
população de amostras que originalmente eram sorotipificáveis mas perderam a
habilidade de reagir com o anti-soro sorotipo específico. HAMPSON et alii (1993)
classificaram vinte e três isolados App NT como pertencentes a 7 grupos de acordo
com o perfil de bandas utilizando multilocus enzyme electrophoresis (MEE).
Considerando que um grande número de isolados App NT analisados
neste trabalho faziam parte de rebanhos com sintomas de casos clínicos de
pleuropneumonia, estudos mais detalhados sobre a patogenicidade e caracterização
destes isolados se fazem necessários. Com o objetivo de tentar uma caracterização
melhor dos isolados foi selecionado o isolado 6951 (Tabela 9) caracterizado como
App NT para os experimentos de hibridização. Assim como o DNA do sorotipo 4,
DNA total deste isolado não apresentou banda de hibridização com a sonda PPcpx
(Figura 7). Esta amostra apresentou resultados de difícil interpretação pois
apresentou genes apxII por PCR e foi hemolítica, características exclusivas de App
entre as NAD-dependentes. Estas observações indicam claramente que em certas
situações a definição quanto a que espécie estas amostras pertencem fica muito
difícil, necessitando de outras ferramentas para a correta caracterização.
85
Nossos resultados sugerem que isolados de tonsilas de animais de
rebanhos subclinicamente infectados devem apresentar maior variabilidade genética
do que isolados de pulmão de animais com sinais clínicos de PPS. Esta observação
foi relatada por CHATELLIER et alii (1999) utilizando PFGE, RAPD e tipagem por
PCR para genes de toxinas em isolados de pulmão e de tonsilas de animais
subclinicamente infectados. Os autores encontraram 8 diferentes perfis de RAPD e 7
padrões de PFGE entre amostras pertencentes ao sorotipo 1 e para o sorotipo 5
todas as amostras apresentaram o mesmo perfil de RAPD mas encontraram 7
padrões de PFGE. Sugeriram ainda que um mesmo rebanho pode ser infectado por
cepas diferentes pertencentes ao mesmo sorotipo ou ainda, que os isolados
sofreram mutações ou deleções nas seqüências de DNA analisadas pelo PFGE e
RAPD.
GRAM et alii (2000) desenvolveram um sistema de tipificação através do
uso de PCR para genes apx em conjunto com genes omlA possibilitando a
identificação de 9 grupos de sorotipos, indicando que através de técnicas de biologia
molecular é possível identificar as diferenças existentes entre os isolados e
comparar com sorotipos padrões.
Nossos resultados sugerem que os isolados App NT oriundos de casos
clínicos podem pertencer a um dos sorotipos conhecidos, já que os perfis de toxinas
observados nos isolados App NT podem indicar a presença de todos os sorotipos,
ou de novos sorotipos , indicando uma limitação no uso do PCR para genes apx
para caracterizar sorotipos de App.
Os isolados 7024 e 7045 (Tabela 9) apresentaram resultados negativos
para PCRcpx, não apresentaram hemólise nem reação de CAMP, porém
apresentaram a presença de genes apxI e II (Tabela 10), que segundo FREY et alii
(1989) são responsáveis pela atividade hemolítica e atuam sinergísticamente com a
hemólise de S. aureus para produzir a reação de CAMP. Segundo FENWICK &
HENRY (1994) amostras de A. pleuropneumoniae quando subcultivadas em
laboratório várias vezes, podem perder a dependência ao fator V e a capacidade de
produzir hemólise pode aumentar ou diminuir substancialmente, explicando o fato
observado. Cinco amostras (6951, 6953, 6957, 6979, 6983 e 7047) apresentaram
hemólise, mas não apresentaram reação de CAMP e todas apresentaram a
presença de genes apxII ou apxII e III. Com exceção da amostra 6951, todas as
demais apresentaram genes sodC, indicando que as amostras devem ser App.
86
Os resultados contraditórios encontrados para muitos dos isolados
indicam a necessidade do desenvolvimento de outros métodos de análise na
tentativa da caracterização destes isolados. Além de buscar outras técnicas que
possam ser utilizadas na tentativa de identificar amostras de App pertencentes ao
sorotipo 4 utilizando como alvo outros fatores de virulência.
Tabela 10: Caracterização de amostras NT.
PCR para
genes apxA
PCRcpx No. de
isolados I II III Sorotipo compatível* Rebanho
3 + + - 1, 5, 9 CC 11 - + + 2, 3, 6, 8 CC 1 - + - 7, 12 grupo A
cpx positivo
1 - + + 2, 3, 6, 8 grupo B
1 + - - 10 grupo A 1 - + - 7, 12 grupo A 2 + + - 1, 5, 9 grupo B 2 - + - 7, 12 grupo C
cpx negativo
3 - + + 2, 3, 4, 6, 8 grupo C
CC: amostras isoladas de animais de rebanhos apresentando sintomas clínicos de casos agudos de pleuropneumonia apresentados na Tabela 9. Grupos A, B e C são os mesmos apresentados na Tabela 9. *Perfil dos genes de toxinas para os sorotipos padrões.
CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
88
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
ABIPECS/ABCS - Associação Brasileira da Indústria Produtora e Exportadora de
Carne Suína/ Associação Brasileira de Criadores de Suínos. EXPORTAÇÕES BRASILEIRA DE CARNE SUÍNA. Disponível por www.suíno.com.br
(29.09.2000).
AINCADESC - ASSOCIAÇÃO DA INDÚSTRIA DE CARNES DO ESTADO DE
SANTA CATARINA. Comunicação pessoal, 1993.
AMANO, A.; SHIZUKUISHI, S.; TAMAGAWA, H.; IWAKURA, K.; TSUNASAWA, S.
AND TSUNEMITSU, A. Characterization of superoxide dismutases purified from
either anaerobically maintained or aerated Bacteroides gingivalis. The Journal of Bacteriology, v.172, n.3, p.1457-1463, 1990.
ASADA, K.; YOSHIKAWA, K.; TAKAHASHI, M.; MAEDA, Y.; EMANJI, K. Superoxide
dismutase from a blue green alga, Plectonema boryanum. Journal of Biological Chemistry, v.250, p.2801-2807, 1975.
BASSANESI, M. C. Superóxido dismutase em Metharizium anisophliae. Porto
Alegre, Instituto de Biociências, 137p. Dissertação de Mestrado, Curso de pós-
graduação em Ciências Biológicas-Bioquímica, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, 1992.
BECK, B. L.; TABATAIA, L. B.; MAYFIELD, J. E. A protein isolated from Brucella
abortus is a Cu-Zn superoxide dismutase. American Chemical Society, v.29,
p.372-376, 1989.
BECK, M.; VAN DEN BOSCH, J.F.; JONGENELEN, I.M.C.A.; LOEFFEN, P.L.W.;
NIELSEN, R.; NICOLET, J.; FREY, J. RTX toxin genotypes and phenotypes in
Actinobacillus pleuropneumoniae field strains. Journal of Clinical Microbiology,
v.32, p.2749-2754, 1994.
89
BÉLANGER, M.; DUBREUIL, D.; HAREL, J.; GIRARD, C.; JACQUES, M. Role of
lipopolysaccharides in adherence of Actinobacillus pleuropneumoniae to porcine
tracheal rings. Infection and Immunity, v.58, n.11, p.3523-3530, 1990.
BÉLANGER, M.; BÉGIN, C.; JACQUES, M. Lipopolysaccharides of Actinobacillus
pleuropneumoniae bind pig hemoglobin. Infection and Immunity, v.63, n.2,
p.656-662, 1995.
BENOV, L. T.; FRIDOVICH, I. Escherichia coli expresses a copper-and zinc-
containing superoxide dismutase. Journal of Biology and Chemistry, v.269,
p.25310-25314, 1994.
BERTRAM, T. A. Quantitative morphology of peracute pulmonary lesions in swine
induced by Haemophilus pleuropneumoniae. Veterinary Pathology, v.22, p.598-
609, 1985.
BEUCHAMP, C.; FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase: Improved assays and an
assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry, v.44, p.274-287,
1971.
BEYNON, L. M.; RICHARDS, J. C.; PERRY, M. B. Structure of the capsular
polysaccharide from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 10.
Carbohydrate Research, v.220, p.185-193, 1991.
BHATIA, B.; MITTAL, K. R.; FREY, J. Factors involved in immunity against
Actinobacillus pleuropneumoniae in mice. Veterinary Microbiology, v.29, p.147-
158, 1991.
BIBERSTEIN, E.L.; GUNNARSSON, A.; HURVELL, B. Cultural and biochemical
criteria for the identification of Haemophilus spp from swine. American Journal of Veterinary Research, v.38, p.7-11, 1977.
BITTENCOURT, S. E. T. Purificação, caracterização parcial e localização de cobre
zinco superóxido dismutase (CuZnSOD) do fungo entomopatogênico Metarhirium
anisopliae. Brasília, 1998. 80p. Dissertação de Mestrado, apresentada ao Curso
de Pós-graduação em Biologia Molecular, da Universidade de Brasília (DF),
1998.
BLACKALL, P. J.;MERCY, A. R.; BULLER, N.; DICKSON, J.; FOGARTY, R.;
JAMESON, D. Isolation of Haemophilus Taxon “minor group” from pigs.
Australian Veterinary Journal, v.68, n.3, p.119-120, 1991.
90
BLACKALL, P. J.; PAHOFF, J. L. Characterization of porcine haemophili isolated
from Australian pigs between 1988 and 1992. Australian Veterinary Journal, v.72, n.1, p.18-21, 1995.
BLACKALL, P. J.; BOWLES, R.; PAHOFF, J. L.; SMITH, B. N. Serological
characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from pigs in 1993 to
1996. Australian Veterinary Journal, v.77, n.1, p.39-43, 1999.
BLANCHARD, P. C.; WALKER, R. L.; GARDNER, I. Pleuropneumonia in swine
associated with a urease-negative variant of Actinobacillus pleuropneumoniae
Serotype 1. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.5, n.2, p.279-
282, 1993.
BOHER, P. B. Perspectivas da suinocultura no centro-oeste brasileiro. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, 6., 1993, Goiânia. Anais... Goiânia: Associação Brasileira de
Veterinários Especialistas em Suínos, 1993. p.29-32.
BOROWSKI, S.M. Dinâmica da síntese de cápsula de Actinobacillus
pleuropneumoniae cultivado em fermentador. Pelotas, Faculdade de Medicina
Veterinária, 1991, 74p. Dissertação de Mestrado, Curso de Pós-graduação em
Sanidade Animal, Universidade Federal de Pelotas, 1991.
BOROWSKI, S. M.; BARCELLOS, D. E. S. N.; PIFFER, I. A.; OLIVEIRA, S. J.
Pleuropneumonia suína: Isolamento de Actinobacillus pleuropneumoniae Sorotipo
3 no Rio Grande do Sul. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 7., 1995, Blumenau. Anais... Blumenau:
Associação Brasileira de Veterinários Especialistas em Suínos, 1995. p.80.
BOSSÉ, J. T.; FRIENDSHIP, R.; ROSENDAL, S. Evaluation of a Pooled-Antigen
ELISA for Serodiagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae Serotypes 1, 5 and
7 Infections. In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY, 12., 1992, The
Hague. Proceedings... The Hague: International pig Veterinary Society, 1992b.
p.220
BOSSÉ, J. T.; MACINNES, J. I. Genetic and biochemical analyses of Actinobacillus
pleuropneumoniae urease. Infection and Immunity, v.65, n.11, p.4389-4394,
1997.
91
BOWLER, C.; VAN KAER, L.; VAN CAMP, W.; VAN MONTAGU, M.; INZÉ, D.;
DHAESE, P. Characterization of Bacillus stearothermophilus manganese
superoxide dismutase gene and its ability to complement copper/zinc superoxide
dismutase deficiency in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Clinical Microbiology, v.172, n.3, p.1539-1546, 1990.
BURROWS, L. L.; LO, R. Y. C. Molecular characterization of an RTX toxin
determinant from Actinobacillus suis. Infection and Immunity, v.60, p.2166-
2173, 1992.
CHATELLIER, S.; HAREL, J.; DUGOURD, D.; CHEVALLIER, B.; KOBISCH, M.;
GOTTSCHALK, M. Genomic relatedness among Actinobacillus
pleuropneumoniae field strains of serotypes 1 and 5 isolated from healthy and
deseased pigs. Canadian Journal Veterinary Research, v.63, p.170-176, 1999.
CHIERS, K.; VAN OVERBEKE, I.; DE LAENDER, P.; DUCATELLE, R.; CAREL, S.;
HAESEBROUCK, F. Effects of endobronchial challenge with Actinobacillus
pleuropneumoniae serotype 9 of pigs vaccinated with inactivated vaccines
containing the Apx toxins. The Veterinary Quarterly, v.20, n.2, p.65-69, 1998.
CHIERS, K.; HAESEBROUCK, F.; VAN OVERBEKE, I.; CHARLIER, G.;
DUCATELLE, R. Early in vivo interatios of Actinobacillus pleuropneumoniae with
tonsils of pigs. Veterinary Microbiology, v.68, p.301-306, 1999.
CHRISTIE, R.; ATKINS, N. E.; MUNCH-PETERSEN, E. A note on a lytic
phenomenon shown by group B Streptococci. Australian Journal of Experimental, v.22, p.197-200, 1944.
COLLARES, R. Anáilse molecular dos genes para toxinas de Actinobacillus
pleuropneumoniae em isolados de campo. Porto Alegre, 2000. p.84. Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2000.
CRUIJSEN, A. L. M.; VAN LEENGOED, L. A. M. G.; KAMP, E. M.; BARTELSE, A.;
KOREVAAR, A.; VERHEIJDEN, J. H. M. Susceptibility to Actinobacillus
pleuropneumoniae infection in pigs from an endemically infected herd is related to
the presence of toxin-neutralizing antibodies. Veterinary Microbiology, v.47,
p.219-228, 1995a.
92
CRUIJSEN, T.; VAN LEEGOED, L.A. M. G.; HAM-HOFFIES, M.; VERHEIJDEN, J.
H. M. Convalescent pigs are protected completely against infection with a
homologous Actinobacillus pleuropneumoniae strain but incompletely against a
heterologous-serotype strain. Infection and Immunity, v.63, n.6, 1995b.
CRUIJSEN, A. L. M.; LEENGOED, V. L. A. M. G.; ZURWIEDEN, S. N.; KAMP, E. M.;
WIDJAJA, A.; BROEKHUYSEN, P.; HAM, M.; VERHEIJDEN, J. H. M.
Pathogenicty of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 9 depends upon toxin
production. In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY, 14., 1996,
Bologna. Proceedings... Bologna: International Pig Veterinary Society, 1996.
p.216.
DE GROOTE, M. A.; OCHSNER, U. A.; SHILOH, M. U.; NATHAN, C.; MCCORD, J.
M.; DINAUER, M. C.; LIBBY, S. J.; VAZQUEZ-TORRES, A.; XU, Y.; FANG, F. C.
Periplasmic superoxide dismutase protects Salmonella from products of
phagocyte NADPH-oxidase and nitric oxide synthase. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America, v.94, p.13997-
14001, 1997.
DESROSTERS, R.; MITTAL, K. R.; MALO, R. Porcine pleuropneumoniae associated
with Haemophillus pleuropneumoniae serotype 3 in Quebec. Veterinary Research, v.115, p.628, 1984.
DEVENISH, J.; ROSENDAL, S. Identification of the heat-labile hemolysin of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. Canadian Journal of Veterinary Research, v.53, p.251-254, 1989.
DOETSH, R. N. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology. Ed. P. Gerhardt, American Society for Microbiology,
Washington, 1981. p.29.
DOM, P.; HAESEBROUCK, F. Comparative virulence of NAD-dependente and NAD-
independente Actinobacillus pleuropneumoniae strain. Journal of Veterinary Medicine B, v.39, p.303-306, 1992.
DOM, P.; HAESEBROUCK, F.; KAMP, E. M.; SMITS, M. A. Influence of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 and its cytolysins on porcine
neutrophil chemiluminescence. Infection and Immunity, v.60, p.4328-4334,
1992a.
93
DOM, P.; HAESEBROUCK, F.; DE BOETSELIER, P. Stimulation and suppression of
the oxygenation activity of porcine pulmonary alveolar macrophages by
Actinobacillus pleuropneumoniae and its metabolites. American Journal of Veterinary Research, v.53, p.1113-1118, 1992b.
DOM, P.; HAESEBROUCK, F.; KAMP, E. M.; SMITS, M.A. NAD-independent
Actinobacillus pleuropneumoniae strains: production of RTX toxins and
interactions with porcine phagocytes. Veterinary Microbiology, v.39, p.205-218,
1994.
DUFF, J. P.; SCOTT, W. A.; WILKES, M. K.; HUNT, B. Otitis in a weaned pig: a new
pathological role for Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae. The The The Veterinary Record, v.139, p.561-563, 1996.
DUTRA, V.; PIFFER, I.; CASTAGNA DE VARGAS, A.; GUIDONI, A.; KLEIN, C.
Padronização de teste de ELISA baseado em antígeno capsular purificado dos
sorotipos 3, 5 e 7 de Actinobacillus pleuropneumoniae. Ciência Rural, v.30, n.2,
p.281-286, 2000.
ERLICH, H. A. PCR Technology: Principles and applications for DNA amplifications. New York: Oxford Press, 1989. 246p.
EHRLICH, G. D.; GREENBERG, S. J. PCR-based diagnostics in infectious diseases. Blackwell Scientific Publications, 1994. 698p.
FAO/GIEWS – Órgão das Nações Unidas (ONU) para Agricultura e Alimentação.
Food Outlook. PRODUÇÃO MUNDIAL DE CARNES. Disponível por
www.suíno.com.br (29.09.2000).
FARRANT, J. L.; SANSONE, A.; CANVIN, J. R.; PALLEN, M. J.; LANGFORD, P. R.;
WALLIS, T. S.; DOUGAN, G.; KROLL, J. S. Bacterial copper and zinc-cofactored
superoxide dismutase contributes to tha pathogenesis of systemic salmonellosis.
Molecular Microbiology, v.25, p.785-796, 1997.
FEDORKA-CRAY, P. J.; STINE, D. L.; GREEWALD, J. M.; GRAY, J. T.; HUETHER,
M. J.; ANDERSON, G. A. The importance of secreted virulence factors in
Actinobacillus pleuropneumoniae bacterin preparation: a comparison. Veterinary Microbiology, v.37, p.85-100, 1993.
94
FENWICK, B. Diagnóstico de pleuropneumonía porcina en laboratório. In:
Compendio sobre Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae. AMVEC,
p.17, 1990.
FENWICK, B. Critical comparison of the serologic tests used to diagnose porcine
pleuropneumoniae. In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY, 12, 1992,
The Hague. Proceedings... The Hague: International Pig Veterinary Society,
1992. p.226.
FENWICK, B.; HENRY, S. Porcine Pleuropneumonia. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.204, n. 9, p.1334-1340, 1994.
FODOR, L.; VARGA, J.; MOLNÁR, E.; HAJTÓS, I. Biochemical and serological
properties of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 strains isolated from
swine. Veterinary Microbiology, v.20, p.173-180, 1989.
FREY, J.; NICOLET, J. Regulation of hemolysin expression in Actinobacillus
pleuropneumoniae serotype 1 by Ca2+. Infection and Immunity, v.56, p.2570-
2575, 1988.
FREY, J.; PERRIN, J.; NICOLET, J. Cloning and expression of a cohemolysin, the
CAMP factor of Actinobacillus pleuropneumoniae. Infection and Immunity, v.57,
p.2050-2056, 1989.
FREY, J.; NICOLET, J. Hemolysin patterns of Actinobacillus pleuropneumoniae.
Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.232-236, 1990.
FREY, J.; MEIER, R.; GYGI, D.; NICOLET, J. Nucleotide sequence of the hemolysin
I gene from Actinobacillus pleuropneumoniae. Infection and Immunity, v.59,
p.3026-3032, 1991a.
FREY, J.; VAN DEN BOSCH, H.; SERGERS, R.; NICOLET, J. Identification of a
second hemolysin (HlyII) in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 and
expression of the gene in Escherichia coli. Infection and Immunity, v.60, n.4,
p.1671-1676, 1992.
FREY, J.; BONE, J. T.; CHANG, Y. F.; CULLEN, J. M.; FENWICK, B.; GERLACH, G.
F.; GYGI, D. Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxins: uniform designation of
haemolysins, cytolysins, pleurotoxins and their genes. Journal of General Microbiology, v.139 (pt8), p.1723-1728, 1993.
95
FREY, J.; BECK, M.; NICOLET, J. RTX-toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae.
In: FREER, J., AITKEN, R., ALOUF, J. E., BOULNOIS, G., FALMAGNE P.,
FEHRENBACH, F., MOUNTECUCCO, C., PIEMONT, Y., RAPPUOLI, R.,
WADSTRÖM, T., AND WITHOLT, B. In: Bacterial Protein Toxins. Stuttgart:
Gustav Fischer Verlag, 1994. p.322-332.
FREY, J. Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins. Trends in Microbiology, v.3, n.7, p.257-260, 1995.
FRIDOVICH, I. The biology of oxygen radicals. Science, v.201, p.875-880, 1978.
FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase. Journal of Biology and Chemistry v.264, p.
7761-7764, 1989.
FRIDOVICH, I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annual Review of Biochemistry, v.64, p.97-112, 1995.
FURESZ, S. E.; MALLARD, B. A.; BOSSÉ, J. T.; ROSENDAL, S.; WILKIE, B. N.;
MACINNES, J. I. Antibody-and cell-mediated immune responses of Actinobacillus
pleuropneumoniae-infected and bacterin-vaccinated pigs. Infection and Immunity, v.65, n.2, p.358-365, 1997.
GAGNÉ, A.; LACOUTURE, S.; BROES, A.; D'ALLAIRE, S.; GOTTSCHALK, M.
Development of an immunomagnetic method for selective isolation of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 from tonsils. Journal of Clinical Microbiology, v.36, p.251-254, 1998.
GILLE, G.; SINGLER, K. Oxidative stress and living cells. Folia Microbiologica,
v.40, n.2, p.131-152, 1995.
GOMES, M. F. M. Análise prospectiva do complexo agroindustrial de suínos no
Brasil. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS
EM SUÍNOS, 6., 1993, Goiânia. Anais... Goiânia: Associação Brasileira de
Veterinários Especialistas em Suínos, 1993. p.3-10.
GONZÁLES, G. C.; CAAMANO, D. L.; SCHRYVERS, A. B. Identification and
characterization of a porcine-specific transferrin receptor in Actinobacillus
pleuropneumoniae. Molecular Microbiology, v.4, p.1173-1179, 1990.
GOTTSCHALK, M. Avances recientes en el diagnostico, tipificacion y control de
Streptococcus suis y Actinobacillus pleuropneumoniae. In: SIMPÓSIO SOBRE
96
MENINGITE ESTREPTOCÓCICA SUÍNA E PLEUROPNEUMONIA SUÍNA, 1999,
Lages. Anais... Lages: Associação Brasileira de Veterinários Especialistas em
Suínos, 1999. p.9-20.
GRACE, S. C. Philogenetic distribution of superoxide dismutases supports an
endosymbiotic rigin for chloroplasts and mitochondria. Life Sciences, v.47,
p.1875-1886, 1990.
GRAM, T.; AHRENS, P. Improved diagnostic PCR assay for Actinobacillus
pleuropneumoniae based on the nucleotide sequence of an outer membrane
lipoprotein. Journal of Clinical Microbiology, v.36, n.2, p.443-448, 1998.
GRAM, T.; AHRENS, P.; NIELSEN, J.P. Evaluation of a PCR for detection of
Actinobacillus pleuropneumoniae in mixed bacterial cultures from tonsils.
Veterinary Microbiology, v.51, p.95-104, 1996.
GRAM, T.; AHRENS, P.; ANDREASEN, M.; NIELSEN, J. P. An Actinobacillus
pleuropneumoniae PCR typing system based on the apx and omlA genes –
evaluation of isolates from lungs and tonsils of pigs. Veterinary Microbiology,
v.75, p. 43-57, 2000.
GUNNARSSON, A.; BIBERSTEIN, E. L.; HURVELL, B. Serologic studies on porcine
strains of Haemophilus parahaemolyticus (pleuropneumoniae): Agglutination
Reactions. American Journal of Veterinary Research, v.38, p.1111-1114, 1977.
GUNNARSSON, A. Evaluation of different antigens in the complement - fixation test
for diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae (parahaemolyticus) infections in
swine. American Journal of Veterinary Research, v.40, n.11, p.1564-1567,
1979.
GUTIERREZ, C. B.; RODRIGUEZ BARBOSA, J. I.; GONZALEZ, O. R.; TASCON, R.
I.; RODRIGUEZ FERRI, E. F. Viability of Actinobacillus pleuropneumoniae in
frozen pig lung samples and comparison of diferent methods of direct diagnosis in
fresh samples. Comparative Immunology, Microbiology and Infection Diseases, v.15, n.2, p.89-95, 1992.
GUTIERREZ, C. B; TASCON, R. I.; BARBOSA, J. I. R.; GONZALEZ, O. R.;
VASQUEZ, J. A.; FERRI, E. F. R. Characterization of V factor-dependent
organisms of the Family Pasteurellaceae isolated from porcine pneumonic lungs
97
in Spain. Comparative Immunology, Microbiology and Infection Diseases,
v.6, p.123-130, 1993.
HAESEBROUCK , F.; CHIERS, K.; VAN OVERBEKE, I.; DUCATELLE, R.
Actinobacillus pleuropneumoniae infections in pigs: the role of virulence factors in
pathogenesis and protection. Veterinary Microbiology, v.58, p.239-249, 1997.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition
metals and disease. Journal of Biochemistry, v.219, p.1-14, 1984.
HAMPSON, D. J.; BLACKALL, P. J.; WOODWARD, J. M. AND LYMBERY, A. J.
Genetic analysis of comparison with Haemophilus spp. taxon "minor group" and
taxon C. International Journal of Medical Microbiology, Virology, Parasitology and Infections Deseases, v.279, p.83-91, 1993.
HANCE, A. J.; GRANDCHAMP, B.; LÉVY-FRÉBAULT, V.; LECOSSIER, D.
RAUZIER, J.; BOCART, D.; GICQUEL, B. Detection and identification of
mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. Molecular Microbiology,
v.3, p.843-849, 1989.
HASSAN, H. M.; FRIDOVICH, I. Physiologycal functions of superoxide dismutasein
glucose-limited chemostat cultures of Escherichia coli. The Journal of Bacteriology, v.130, p.805-811, 1977b.
HASSAN, H. M.; FRIDOVICH, I. Paraquat and Escherichia coli. Journal of Biology and Chemistry, v.254, p. 10846-10852, 1979.
HASSAN, H. M. Microbial superoxide dismutase. Advances in Genetics, v.26, p.65-
97, 1989.
HENNESSY, K. J.; IANDOLO, J. J.; FENWICK, B. W. Serotype identification of
Actinobacillus pleuropneumoniae by arbitrarily primed polymerase chain reaction.
Journal of Clinical Microbiology, v.31, p.1155-1159, 1993.
HERNAZ MORAL, C.; CASCÓN SORIANO, A.; SÁNCHEZ SALAZAR, M.;
YUGUEROS MARCOS, J.; SUÁREZ RAMOS, S.; NAHARRO CARRASCO, G.
Molecular cloning and sequencing of the aroA gene from Actinobacillus
pleuropneumoniae and its use in a PCR assay for rapid identification. Journal of Clinical Microbiology, v.37, n.5, p.1575-1578, 1999.
98
HILBINK, F.; LISLE, G. W.; PENROSE, M.; ALDERSLEY, B.; CARMAN, M.
Actinobacillus pleuropneumoniae in New Zealand Pigs. New Zealand Veterinary Journal, v.40, p.173-175, 1992.
HUANG, H.; POTTER, A. A.; CAMPOS, M.; LEIGHTON, F. A.; WILSON, P. J.;
YATES, W. D. G. Pathogenesis of porcine Actinobacillus pleuropneumoniae in
vitro and in vivo. Canadian Journal of Veterinary Research, v.62, p.93-101,
1998.
HUTRERA, V.; PIJOAN, C. Agar hemolisis inhibition assay for detection of antibodies
to Actinobacillus pleuropneumoniae in pig serum. In: INTERNATIONAL PIG
VETERINARY SOCIETY, 12., 1992, The Hague. Proceedings... The Hague:
International Pig Veterinary Society, 1992. p.218.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. CENSO AGROPECUÁRIO DE 1996. Disponível por www.ibge.net (20/09/2000).
IDRIS, U. A.; STEFFENS, W. L.; UDEZE, F. A.; KADIS, S. Effect of Actinobacillus
pleuropneumoniae hemolysin and lipopolysaccharide cultured porcine neutrophils.
Current Microbiology, v.60, p.1558-1567, 1992.
IDRIS, U. E. A.; HARMON, B. G.; UDEZE F. A.; KADIS, S. Pulmonary lesions in mice
inoculates with Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin and
lipopolysaccharide. Veterinary Pathology, v.30, p.234-241, 1993.
IMLAY, J. A.; LINN, S. DNA damage and oxygen radical toxicity. Science, v.240,
p.1302-1309, 1988.
IMLAY, K. R. C.; IMLAY, J. A. Cloning and analysis of sodC encoding the copper-
zinc superoxide dismutase of Escherichia coli. The Journal of Bacteriology, v.178, p.2561-2571, 1996.
INZANA,T. J. Purification and partial characterization of the capsular polymer of
Haemophilus pleuropneumoniae serotype 5. Infection and Immunity, v.55, n.7,
p.1573-1587, 1987.
INZANA, T. J.; MATHISON, B. Serotype specificity and immunogenicity of the
capsular polymer of Haemophilus pleuropneumoniae serotype 5. Infection and Immunity, v.55, n.7, p.1580-1587, 1987.
99
INZANA, T. J.; MA, J.; WORKMAN, T. GOGOLEWSKI, R. P.; ANDERSON, P.
Virulence properties and protective efficacy of capsular polymer of Haemophilus
(Actinobacillus) pleuropneumoniae serotype 5. Infection and Immunity, v.56,
n.8, p.1880-1889, 1988.
INZANA, T. J. Capsules and virulence in the HAP group of bacteria. Canadian Journal of Veterinary Research, v.54, p.22-27, 1990.
INZANA, T. J. Virulence properties of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbial Pathogenesis, v.11, p.305-316, 1991.
INZANA, T. J.; TODD, J.; VEIT, H. P. Safety, stability, and efficacy of noncapsulated
mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae for use in live vaccines. Infection and Immunity, v.61, p.1682-1686, 1993.
JACOBSEN, M. J.; NIELSEN, J. P. Development and evaluation of a selective and
indicative medium for isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae. Veterinary Microbiology, v.47, p.191-197, 1995.
JACOBSEN, M. J.; NIELSEN, J. P.; NIELSEN, R. Comparison of virulence of
different Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes and biotypes using an
aerosol infection model. Veterinary Microbiology, v.49, p.159-168, 1996.
JACQUES, M.; FOIRY, B.; HIGGINS, R.; MITTAL, K. R. Electron microscopic
examination of capsular material from various serotypesof Actinobacillus
pleuropneumoniae. The Journal of Bacteriology, v.170, n.7, p.3314-3318,
1988.
JACQUES, M.; RIOUX, S.; FOIRY, B.; BÉLANGER, M. Affinity for porcine respiratory
tract mucus is found in some isolates of Actinobacillus pleuropneumoniae. In:
INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY, 12., 1992, The Hague.
Proceedings... The Hague: International Pig Veterinary Society, 1992. p.207.
JAMES, E. R. Superoxide dismutase. Parasitology Today, v.10, n.12, p.481-484,
1994.
JENSEN, A. E.; BERTRAM, T. A. Morphological comparison of virulent and avirulent
isolates of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5. Infection and Immunity,
v.51, n.2, p.419-424, 1986.
100
JENSEN, T. K.; BOYE, M.; HAGEDORN-OLSEN, T.; RIISING, H. J.; ANGEN, O.
Actinobacillus pleuropneumoniae osteomyelitis in pigs demonstrated by
fluorescent in situ hybridization. Veterinary Pathology, v.36, p.258-261, 1999.
JOBERT, J. L.; SAVOYE, C.; CARIOLET, R.; KOBISCH, M.; MADEC, F.
Experimental aerosol transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae to pigs.
Canadian Journal Veterinary Research, v.64, p.21-26, 2000.
JOLIE, R. A. V.; MULKS, M. H.; THACKER, B. J. Antigenic differences within
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. Veterinary Microbiology, v.38,
p.329-349, 1994.
KAMP, E. M.; VAN LEENGOED, L. A. M. G. Serotype-related differences in
production and type of heat-labile hemolysin and heat-labile cytotoxin of
Actinobacillus pleuropneumoniae. Journal of Clinical Microbiology, v.27,
p.1187-1191, 1989.
KAMP, E. M.; POPMA, J. K.; ANAKOTTA, J.; SMITS, M. A. Identification of hemolytic
and cytotoxic proteins of Actinobacillus pleuropneumoniae by use of monoclonal
antibodies. Infection and Immunity, v.59, p.3079-3085, 1991.
KAMP, E. M.; VERMEULEN, T. M. M.; SMITS, M. A.; HAAGSMA, J. Production of
apx toxins by field strains of Actinobacillus pleuropneumoniae and Actinobacillus
suis. Infection and Immunity, v.62, p.4063-4065, 1994.
KAMP, E.; STOCKHOFE-ZURVIEDEN, N.; VAN LEENGOED, L. A.; SMITS, M. A.
Endobronchial inoculation with Apx toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae
leads to pleuropneumonia in pigs. Infection and Immunity, v.65, p.4350-4354,
1997.
KICH, J.D. Validação à campo e determinação de amostragem para o teste de
ELISA polivalente para Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipos 3, 5 e 7.
Avaliação de métodos, locais de isolamento e classificação de amostras NAD-
dependentes do trato respiratório superior de suínos portadores sadios. Porto
Alegre, 1996. p.60. Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, 1996.
KICH, J. D.; PIFFER, I. A.; BARCELLOS, D. E. S. N.; GUIDONI, A. L.; KLEIN, C. S.;
FÁVERO, M. B. B. F.; VIZZOTTO, R. Comparação de métodos de isolamento de
101
bactérias NAD-dependentes do trato respiratório superior de suínos sadios.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.52, n.1, p.1-6, 2000.
KRIEG N. R. AND HOLT J. G. Bergey`s manual of systematic bacteriology, 9.ed.
Baltimore, Williams & Wilkins, 1984.
KILLIAN, M. A taxonomic study of the genus Haemophilus, with the proposal of a
new species. Journal of General Microbiology, v.93, p.9-11, 1976.
KILLIAN, M.; NICOLET, J.; BIBERSTEIN, L. Biochemical and serological
characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Matthews and Pattison,
1961) Shope 1964 and proposal of a Neotype Strain. International Journal of Systematic Bacteriology, v.28, p.20-26, 1978.
KILLIAN, M.; BIBERSTEIN, E. L. Genus II. Haemophilus. In: KRIEG N. R. AND
HOLT J. G. Bergey`s manual of systematic bacteriology, 9.ed. Baltimore,
Williams & Wilkins, 1984. v.1, p.558-569.
KIM, E. J.; CHUNG, H. J.; SUH, B.; HAH, Y. C.; ROE, J. H. Transcriptional and post-
transcriptional regulation by nickel of sodN gene encoding nickel-containing
superoxide dismutases from Streptomyces coelicolor Muller. Molecular Microbiology, v.27, p.187-195, 1998.
KROLL, J. S.; LANGFORD, P. R.; LOYNDS, B. M. Cooper-zinc superoxide
dismutase of Haemophillus influenzae and H. parainfluenzae. The Journal of Bacteriology, v.173, p.7449-7457, 1991.
KROLL, J. S.; LANGFORD, P. R.; WILKS, K. E.; KEIL, A. D. Bacterial [Cu,Zn]-
superoxide dismutase: phylogenetically distinct from the eukaryotic enzyme, and
not so rare after all! Microbiology, v.141, p.2271-2279, 1995.
KUME, K.; NAKAI, T.; SAWATA, A. Isolation of Haemophilus pleuropneumoniae from
the cavities of healthy pigs. Japanese Journal of Veterinary Science, v.46, n.5,
p.641-647, 1984.
KUME, K.; NAGANO, I.; NAKAI, T. Bacterial, serological, and pathological
examination of Haemophilus pleuropneumoniae infection in 200 slaughtered pigs.
Japanese Journal of Veterinary Science, v.48, p.865-970, 1986.
102
LANGFORD, P. R.; LOYNDS, B. M.; KROLL, J. S. Copper-zinc superoxide
dismutase in Haemophilus species. Journal of General Microbiology, v.138,
p.517-522, 1992.
LANGFORD, P. R.; LOYNDS, B. M.; KROLL, J. S. Cloning and molecular
caracterization of Cu, Zn superóxido dismutase from Actinobacillus
pleuropneumoniae. Infection and Immunity, v.64, n.12, p.5035-5041, 1996.
LATIMER, E.; SIMERS, J.; SRIRANGANATHAN, N.; ROOP II, R. M.; SCHURIG, G.
G.; BOYLE, S. M. Brucella abortus deficient in copper/zinc superoxide dismutase
is virulent in BALBc mice. Microbial Pathogenesis, v.12, p.105-113, 1992.
LEBRUN, A.; LACOUTURE, S.; CÔTÉ, D.; MITTAL, K. R.; GOTTSCHALK, M.
Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae strains of serotypes 7 and 4
using monoclonal antibodies: demonstration of commun LPS O-chain epitopes
with Actinobacillus lignieresii. Veterinary Microbiology, v.65, p.271-282, 1999.
LEVONEN, K.; SEPPÄNEN, J.; VEIJALAINEN, P. Antibodies against 12 serotypes
of Actinobacillus pleuropneumoniae in finnish slaughter sows. Journal of Veterinary Medicine B, v.43, p.489-495, 1996.
LI, H.; GYLLENSTEN, U. B.; CUI, X.; SAIKI, R. K.; ERLICH, H. A.; ARNHEIM, N.
Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid
cells. Nature, v.335, p.414-417, 1988.
LIGGETT, A. D.; HARRISON, L. R.; FARREL, R. L. Sequencial study of lesion
development in experimental Haemophilus pleuropneumonia. Research Veterinary Science, v.42, p.204-221, 1987.
LO, T. M.; WARD, C. K.; INZANA, T. J. Detection and identification of Actinobacillus
pleuropneumoniae serotype 5 by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, v.36, p.1704-1710, 1998.
LOCATELLI, J. C.; MACHADO, A.; SÁ e SILVA A.; BARCELLOS, D. E. S. N.
Ocorrência da pleuropneumonia suína causada pelo Haemophilus
pleuropneumoniae In: CONGRESSO ESTADUAL DE MEDICINA VETERINÁRIA,
6., 1981, Gramado. Anais... Gramado: Sociedade Veterinária do Rio Grande do
Sul e Associação de Clínicos Veterinários de Pequenos Animais, 1981. p.36-37.
103
MA, J.; INZANA, T.J. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detection of
antibody to a 110.000-molecular-weight hemolysin of Actinobacillus
pleuropneumoniae. Journal of Clinical Microbiology, v.28, p.1356-1361, 1990.
MACHADO, H. P. Avaliação de testes ELISA para o diagnóstico de infecções
provocadas pelos sorotipos 3, 5 e 7 de Actinobacillus pleuropneumoniae em
suínos. Pelotas, 1997. p.90. Dissertação de Mestrado, apresentada ao Curso de
Pós-graduação em Sanidade Animal. Universidade Federal de Pelotas (RS),
1997.
MACINNES, J. I.; SMART, N. L. Actinobacillus and Haemophillus. In: GYLES, C. L.
& THOEN, C. O. Pathogenis of bacterial infections in animal. 2.ed. Ames:
Iowa State University Press, 1993. p.188-200.
MARTINS, C. Fatores e perspectivas mundiais na oferta e demanda da carne suína.
In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, 9., 1999, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte: Associação Brasileira
de Veterinários Especialistas em Suínos, 1999. p.53-61.
MATHEWS, P. R. J.; PATTISON, I. H. The identification of a Haemophilus-like
organism associated with pneumonia and pleurisy in the pig. Journal of Comparative Pathology, v.51, p.44-52, 1961.
MEIER, B.; SCHERK, C.; SCHMIDT, M.; PARAK, F. pH-dependent inhibition by
azide and fluoride of the iron superoxide dismutase from Propionibacterium
shemanii. Biochemical Journal, v.331, p.403-407, 1998.
MISRA, H. P.; FRIDOVICH, I. Inhibition of superoxide dismutase by azide. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.189, p.317-322, 1978.
MITTAL, K. R.; HIGGINS, R.; LARIVIÉRE, S. Detection of type-specific antigens in
the lungs of Haemophilus pleuropneumoniae - infected pigs by coaglutination test.
Journal of Clinical Microbiology, v.18, n.6, p.1355-1357, 1983.
MITTAL, K. R.; HIGGINS, R.; LARIVIÉRE, S.; LEBLANC, D. A 2-mercaptoethanol
tube agglutination test for diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae infection
in pigs. American Journal Veterinary Research, v.45, n.4, p.715-719, 1984.
MITUI, T.; ONAGA, H.; NAGASAWA, Y.; NOMURA, Y.; KURAMASU, S. Studies on
Haemophilus infection in swine. I. Application of the látex agglutination test to the
104
diagnosis of Haemophilus pleuropneumoniae (H. parahaemolyticus) infection.
Veterinary Microbiology, v.6, p.339-349, 1981.
MØLLER, K.; NAKAI, T.; SAWATA, A. Isolation of Haemophilus pleuropneumoniae
from the nasal cavities of healthy pigs. Japanese Journal of Veterinary Science, v.46, p.641-647, 1984.
MØLLER, K.; KILIAN, M. V Factor-dependent members of the family Pasteurellaceae
in the porcine upper respiratory tract. Journal of Clinical Microbiology, v.28,
p.2711-2716, 1990.
MØLLER, K.; FUSSING, V.; GRIMONT, P. A. D.; PASTER, B. J.; DEWHIRST, E. E.;
KILLIAN, M. Actinobacillus minor sp. nov., Actinobacillus porcinus sp. nov., and
Actinobacillus indolicus sp. nov., three new V factor-dependent species from the
respiratory tract of pigs. International Journal of Sistematic Bacteriology, v.46,
n.4, p.951-956, 1996.
MOODY, C. S.; HASSAN, H. M. Anaerobic biosynthesis of the manganese-
containing superoxide dismutase in E. coli. Journal of Biological Chemistry,
v.259, p.12821-12825, 1984.
MORAL, C. H.; SORIONO, C. A.; SALAZAR, M. S.; MARCOS, J. Y.; RAMOS, S. S.;
CARRASCO, G. N. Molecular cloning and sequencing of the aroA gene from
Actinobacillus pleuropneumoniae and its use in a PCR assay for rapid
identification. Journal of Clinical Microbiology, v.37, n.5, p.1575-1578, 1999.
MORES, N.; SOUZA, J. C. A.; NOGUEIRA, R. H. G. Estudo experimental da
pleuropneumonia suína causada por Haemophilus pleuropneumoniae (Hpp).
Patogenicidade e evolução das lesões anatomo-patológicas. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.36, n.6, p.679-693, 1984.
MUSSER, J. M.; RAPP, V. J.; SELANDER, R. K. Clonal diversity in Haemophilus
pleuropneumoniae. Infection and Immunity, v.55, p.1207-1215, 1987.
MYLREA, P. J.; FRASER, G.; MacQUEEN, P.; LAMBOURNE, D. A.
Pleuropneumonia in pigs caused by Haemophilus parahaemolyticus. Australian Veterinary Journal, v.70, p.255-259, 1974.
NAKAI, T.; ONO, K.; IKE, K.; KUME, K. Serotyping of Actinobacillus
pleuropneumoniae strains by use of purified capsular polysaccharide or
lipopolysaccharide In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY, 12., 1992.
105
The Hague. Proceedings... The Hague: International Pig Veterinary Society,
1992. p.186.
NEGRETE-ABASCAL, E.; TENORIO, V. R.; SERRANO, J. J.; GARCIA, C. & DE LA
GARZA, M. Secreted proteases from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1
degraded porcine gelatin, hemoglobin and immunoglobulin A. Canadian Journal of Veterinary Research, v.58, n.2, p.83-86, 1994.
NICOLET, J. Sur l’hemophilose du porc. III. Différenciation Sérologique de
Haemophilus parahaemolyticus. Zentralblatt fuer Bakteriologie (A), v.216,
p.487-495, 1971.
NICOLET, J.; PAROZ, P.; KRAWINKLER, M.; BAUMGARTNER, A. An Enzyme-
linked immunosorbent assay, using an EDTA - extracted antigen for the serology
of Haemophilus pleuropneumoniae. American Journal Veterinary Research,
v.42, p.2139-2142, 1981.
NICOLET, J. Haemophilus infections. In: A. D. LEMAN, B. STRAW, R. D. GLOCK,
W. L. MENGELING, R. H. C. PENNY, AND E. SCHOLL. Diseases of swine, 5
ed. Ames: Iowa State University Press, 1986. p.426-436.
NICOLET, J. Taxonomy and serological identification of Actinobacillus
pleuropneumoniae. Canadian Veterinary Journal, v.29, p.578-579, 1988.
NICOLET, J. Actinobacillus pleuropneumoniae In: LEMAN, A. D. Diseases of Swine.
Iowa, Iowa State Universit Press, 1992, p.401-413.
NIEDERHOFFER, E. C.; NARANJO, C. M.; BRADLEY, K. L.; FEE, J. Control of
Escherichia coli superoxide dismutase (sodA and sodB) genes by the ferric
uptake regulation (fur) locus. The Journal of Bacteriology, v.172, n.4, p.1930-
1938, 1990.
NIELSEN, R.; THOMSEN A. D.; DUEDAHL VESTERLUNG, S. Pleuropneumonia
caused by Haemophilus parahaemolyticus. An attempt to control disease at two
progeny testing station by serological blood testing followed by removal of the
seropositive animals and their litter mates. Nordisk Veterinaer Medicin, v.28,
p.349-352, 1976.
NIELSEN, R. Haemophilus parahaemolyticus serotypes pathogenicity and cross
immunity. Nordisk Veterinaer Medicin, v.31, p.407-417, 1979.
106
NIELSEN, R. Haemophilus pleuropneumoniae serotypes. Cross protection
experiments. Nordisk Veterinaer Medicin, v.36, p.221-234, 1984.
NIELSEN, R. Serological characterization of Haemophilus pleuropneumoniae
(Actinobacillus pleuropneumoniae) strains and proposal of a new serotype:
serotype 9. Acta Veterinaria Scandinavica, v.26, p.501-512, 1985a.
NIELSEN, R. Serological characterization of Haemophilus pleuropneomoniae
(Actinobacillus pleuropneumoniae) strains and proposal of a new serotype:
serotype 10. Acta Veterinaria Scandinavica, v. 26, p.581-585, 1985b.
NIELSEN, R. Serological charaterization of Actinobacillus pleuropneumoniae strains
and proposal of a new serotype: serotype 12. Acta Veterinaria Scandinavica,
v.27, p.453-455, 1986a.
NIELSEN, R. Serology of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae serotype
5 strais: stablishment of subtypes A and B. Acta Veterinaria Scandinavica, v.27,
p.49-58, 1986b.
NIELSEN R.; O´CONNOR, P. J. Serological characterization of 8 Haemophilus
pleuropneumoniae strains and proposal of a new serotype 8. Acta Veterinaria Scandinavica, v.25, p.96-106, 1984.
NIVEN, D. F.; DONGA, J.; ARCHIBALD, F. S. Responses of Haemophilus
pleuropneumoniae to iron restriction: changes in the outer membrane protein
profile and removal of iron from porcine transferring. Molecular Microbiology,
v.3, n.8, p.1083-1089, 1989.
OLIVE, D. M. Detecção of enterotoxigênic Escherichia coli after polimerase chain
reaction amplification with a thermo-stable DNA polimerase. Journal of Clinical Microbiology, v. 18, p.261-265, 1989.
O`REILLY, T.; ROSENDAL, R.; NIVEN, D. F. Porcine haemophili and actinobacilli:
Characterization by means of API test strips and possible taxonomic implications.
Canadian Journal Microbiology, v.30, p.1229-1238, 1984.
ORLANDER, H. J. A septicemic disease of swine and its causative agent,
Haemophilus parahaemolyticus. Ph.D. Thesis, University of California, Davis,
1963.
OSTAAIJEN, J. V.; FREY, J.; ROSENDAL, S.; MACINNES, J. I. Actinobacillus suis
isolated from healthy and diseased swine are clonal and carry apxICABDvar. suis
107
and apxIICAvar.suis toxin genes. Journal of Clinical Microbiology, v.35,
p.1131-1137, 1997.
PAJU, S.; SAARELA, M.; ALALUUSUA, S.; FIVES-TAYLOR P.; ASIKAINEN S.
Characterization of serologically nontypeable Actinobacillus
actinomycetemcomitans isolates. Journal of Clinical Microbiology, v.36,
p.2019-2022, 1998.
PERFUMO, C. J.; PETRUCCELLI, M. A.; ITAGAKI, S. Pulmonary lesions in guinea
pigs experimentally infected with Actinobacillus pleuropneumoniae (A. p.) serovar
1. Journal of Veterinary Medical Science, v.61, p.163-165, 1999.
PERRY, M. B.; ALTMAN, E.; BRISSON, J. R.; BEYNON, L. M.; RICHARDS, J. C.
Structural characteristics of the antigenic capsular polysaccharides and
lipopolysaccharides involved in the serological classification of Actinobacillus
pleuropneumoniae strains. Serodiagnosis and Immunotherapy in Infection Disease, n.4, p.299-308, 1990.
PIFFER, I. A.; BRITO, M. A. V. P.; SOBESTIANSKY, J.; WENTZ, I. Pleuropneumonia
suína. I. Alguns aspectos epidemiológicos da doença em nosso meio. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 18., Balneário
Camboriú, 1982. Anais... Balneário Camboriú, 18o Congresso Brasileiro de
Medicina Veterinária, 1982. p.45.
PIFFER, I. A.; Sorotipos de Haemophilus pleuropneumoniae isolados de suínos em
Santa Catarina e Rio Grande do Sul. In: SIMPÓSIO DO CENTRO NACIONAL DE
PESQUISA DE SUÍNOS E AVES, 3., Concórdia, 1983. Anais... Concórdia, III
Simpósio do Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves, 1983. p.335-338.
PIFFER, I. A.; BOTOVCHENCO, A.; MORES, N. Teste de Soroaglutinação em
Microtitulação com 2-mercaptoetanol para o diagnóstico de infecção por
Haemophilus pleuropneumoniae. In: CONGRESSO LATINO DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 2., 1985, Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro:
Associação Brasileira de Veterinários Especialistas em Suínos, 1985a. p.99-100.
PIFFER, I; FREITAS, A. R.; MUNARO, M.N.; SONCINI, R.A. Efeito das afeccões
pulmonares, observadas no abate, sobre o desenvolvimento dos suínos In:
CONGRESSO LATINO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 2.,
108
1985, Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro: Associação Brasileira de
Veterinários Especialistas em Suínos, 1985b. p.105-106.
PIFFER, I. A.; SONCINI, R. A.; BRITO, M. A. V. P.; BRITO, J. R. F.;
SOBESTIANSKY, J. Imunoprofilaxia da pleuropneumonia suína com vacina
inativada de Haemophilus pleuropneumoniae. Pesquisa Veterinária Brasileira,
v.6, n.3, p.67-72, 1986.
PIFFER, I. A.; BRITO, M. A. V. P.; BRITO, J. R. F.; BARCELLOS, D. E.S.N.
Sorotipos de Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae Isolados de Suínos
no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.7, p.79-83, 1987.
PIFFER, I. A.; MORES, N. Caracterização bioquímica, patológica e da resposta
humoral de uma amostra de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 3, isolada
no Brasil. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.47, n.3,
p.283-296, 1995.
PIFFER, I.; GUIDONI, A. L. Diagnóstico sorológico: Títulos, testes e verdades – uma
interpretação racional. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 8., 1997, Foz do Iguaçu. Anais... Foz do Iguaçu:
Associação Brasileira de Veterinários Especialistas em Suínos, 1997. p.95-102.
PIFFER, I. A. Doenças respiratórias: aspectos clínicos e controle. In: SIMPÓSIO
GOIANO DE SUINOCULTURA, 1997, Goiânia. Anais... Goiânia: Associação
Gioânia de Suinocultores, 1997. p.70-85.
PIFFER, I. A.; KLEIN, C.; FÁVERO, M.; FIGUEREDO J. O. Caracterização
bioquímica e sorológica de amostras de A. pleuropneumoniae isoladas no Brasil.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.49, n.1, p.123-129,
1997.
PIJOAN, C.; MORRISON, R. B.; HILLEY, H. D. Dilution technique for isolation of
Haemophilus from swine lungs collected at slaughter. Journal of Clinical Microbiology, v.18, n.1, p.143-145, 1983.
PIJOAN, C. La serologia como factor de decision estrategica en sanidad porcina. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, 6., 1993, Goiânia. Anais... Goiânia: Associação Brasileira de
Veterinários Especialistas em Suínos, 1993. p.28.
109
PITTMAN, M. A Classification of the Hemolytic Bacteria of the Genus Haemophilus
haemolyticus: Haemophilus haemolyticus Bergey et al. and Haemophilus
parahaemolyticus Nov Spec. The Journal of Bacteriology, v.65, n.6, p. 750-551,
1953.
PLOMGAARD, J. Eradication of respiratory diseases from the swine herd without
depopulation. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 9., 1999, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte:
Associação Brasileira de Veterinários Especialistas em Suínos, 1999. p.113-118.
POHL, S.; BERTOCHINGER, H. V.; FREDERIKSEN, W.; MANNHEIN, W. Transfer
of Haemophilus pleuropneumoniae and the Pasteurella Haemolytica-like
organism causing porcine necrotic pleuropneumonia to genus Actinobacillus
(Actinobacillus pleuropneumoniae comb. nov.) on the basis of phenotypic and
deoxyribonucleic acid relateness. International Journal of Systematic Bacteriology, v.33, p.510-514, 1983.
PRIDEAUX, C. T.; LENGHAUS, J.; KRYWULT, J.; HODGSON, L. M. Vaccination
and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain of
Actinobacillus pleuropneumoniae produced by site-specific mutagenesis of the
ApxII operon. Infection and Immunity, v.67, n.4, 1999.
PRIVALLE, C. T.; FRIDOVICH, I. Induction of superoxide dismutase in Escherichiae
coli by heat shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.84, p.2723-2726, 1987.
PROTAS, J. F. S.; SOBESTIANSKY, J.; WENTZ, I.; PIFFER, I. A. Custo de um surto
de pleuropneumonia suína. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.20, p.241-244,
1985.
RAPP, V. J.; ROSS, R. F.; ERICKSON, B. Z. Serotyping of Haemophilus
pleuropneumoniae by rapid slide agglutination and indirect fluorescent antibody
tests in swine. American Journal of Veterinary Research, v.46, n.1, p.185-192,
1985.
RIOUX, S.; GALARNEAU, C.; HAREL, J.; KOBISCH, M.; FREY, J. GOTTSCHALK
AND JACQUES. Isolation and characterization of a capsule-deficient mutant of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotupe 1. Microbial Pathogenesis, v.28,
p.279-289, 2000.
110
ROHRBACH, B. W.; HALL, R. F.; HITCHCOCK, J. P. Effect of subclinical infection
with Actinobacillus pleuropneumoniae in commingled feeder swine. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.202, n.7, p.1095-1098, 1993.
ROSENDAL, S.; BOYD, D. A. Haemophilus pleuropneumoniae serotyping. Journal of Clinical Microbiology, v.16, n.5, p.840-843, 1982.
ROSENDAL, S.; LOMBIN, L.; DEMOOR, J. Serotyping and detection of Haemophilus
pleuropneumoniae by indirect fluorescent antibody technique. Canadian Journal Comparative Medicine, v.45, p.271-274, 1981.
ROSENDAL, S.; MITCHELL, W. R. Epidemiology of Haemophilus pleuropneumoniae
in pigs: A Survey of Ontario Pork Producers, 1981. Canadian Journal Comparative Medicine, v.47, p.1-5, 1983.
ROSENDAL, S.; MINIATS, O.; SINCLAIR, P. Protective efficacy of capsule extracts
of Haemophilus pleuropneumoniae in pigs and mice. Veterinary Microbiology,
v.12, p.229-240, 1986.
ROSENDAL, S.; DEVENISH, J.; MacINNES, J. I.; LUMSDEN, J. H.; WATSON, S.;
XUN, H. Evaluation of heat-sensitive, neutophil-toxic, and hemolytic activity of
Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae. American Journal of Veterinary Research, v.49, p.1053-1058, 1988.
ROSENDAL, S.; MacINNES, J. I. Characterization of attenuated strain of
Actinibacillus pleuropneumoniae, serotipe 1. American Journal of Veterinary Research, v.51, p.711-717, 1990.
RYCHLÍK, I.; BARTOS, M.; SESTÁK, K. Use of DNA for accurate typing of
Actinobacillus pleuropneumoniae Veterinární Medicina, v.39, n.4, p.164-167,
1994.
SAITO, A.; LIMA, R. A. T.; APOLLARO, R.; MORO, L. P.; OLIVEIRA, A. F. O.
Isolation and serotyping of Haemophilus pleuropneumoniae (HPN) from nasal
cavities or lungs of pigs In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY,
10.,1988, Rio de Janeiro. Proceedings... Rio de Janeiro, International Pig
Veterinary Society, 1988. p.73.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, v.3, p.545, 1989.
111
SANFORD, S. E.; JOSEPHSON G. K. A. Porcine Haemophilus pleuropneumonia
epizootic in southwestern Ontario: clinical, microbiological, pathological, and some
epidemiological findings. Canadian Journal Comparative Medicine, v.45, p.2-7,
1981.
SANFORD, S. E. Actinobacillus suis: An Overview of an emerging disease. American Association of Swine Practitioners, p.425-427, 1995.
SANGER, F.; NICKLEN, S.; COULSON, A.R. DNA sequencing with chain terminating
inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.74, p.5463, 1977.
SAN MATEO, L. R.; HOBBS, M. M.; KAWULA, T. H. Periplasmic copper-zinc
superoxide dismutase protects Haemophilus ducreyi from exogenous superoxide.
Molecular Microbiology, v.27, p.391-404, 1998.
SAVOYE, C.; JOBERT, J. L.; BERTHELOT-HÉRAULT, F.; KERIBIN, A. M.;
CARIOLET, R.; MORVAN, H.; MADEC, F.; KOBISCH, M. A PCR assay used to
study aerosol transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae from samples of
live pigs under experimental conditions. Veterinary Microbiology, v.73, p.337-
347, 2000.
SCHALLER, A.; KUHN, R.; KUHNERT, P.; NICOLET, J.; ANDERSON, T. J.;
MacINNES, J. I.; SEGERS, R. P.; FREY, J. Characterization of ApxIVA, a new
RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology, v.145,
p.2105-2116, 1999.
SCHEEHAN, B. J.; LANGFORD, P. R.; RYCROFT, A. N.; KROLL, J. S. [Cu,Zn]-
superoxide dismutase mutants of the swine pathogen Actinobacillus
pleuropneumoniae are unattenuated in infections of the natural host. Infection and Immunity, v.68, n.8, p.4778-4781, 2000.
SCHIEFER, B.; GREENFIELD, J. Porcine Haemophilus parahaemolyticus
pneumonia in Saskatchevan. II. Bacteriological and experimental studies
Canadian Journal Comparative Medicine, v.38, p.105-110, 1974.
SCHRANK, I. S. An in vitro mutagenesis study of a metalloenzyme gene. Ph. D.
thesis, UMIST, England, 1988.
112
SEBUNYA, T. N. H. K.; SAUNDERS, J. R. Haemophilus pleuropneumoniae infection
in swine: a review. Journal of the American Veterinary Medical Association,
v.182, n.12, p.357-368, 1983.
SEBUNYA, T. N. K.; SAUNDERS, J. R. AND OSBORNE, A. D. Dose response
relationship of Haemophilus pleuropneumoniae aerosols in pigs. Canadian Journal Comparative Medicine, v.47, p.47-56, 1983b.
SHOPE, R. E. Porcine contagious pleuropneumonia. I. Experimental transmission,
etiology and pathology. Journal of Experimental Medicine, v.119. p.357-368,
1964.
SIDIBÉ, M.; MESSIER, S.; LARIVIERE, S.; GOTTSCHALK, M.; MITTAL, K. R.
Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in the porcine upper respiratory
tract as a complement to serological test. Canadian Journal of Veterinary Research, v.57, p.204-208, 1993.
SIROIS, M.; HIGGINS, R. Biochemical typing of Actinobacillus pleuropneumoniae.
Veterinary Microbiology, v.27, p.397-401, 1991.
SIROIS, M.; LEMIRE, E. G.; LEVESQUE, R. C. Construction of a DNA probe and
detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by using polymerase chain reaction.
Journal of Clinical Microbiology, v.29, p.1183-1187, 1991.
SOBESTIANKY, J.; BARCELLOS, D.; MORES, N.; CARVALHO, L. F.; OLIVEIRA, S.
Clínica e Patologia Suína, 2.ed. Goiânia, Art 3 Impressos Especiais, 1999.
p.353-358.
SOBESTIANSKY, J.; PIFFER, I. A.; FREITAS, A. R. Impacto das doenças
respiratórias dos suínos nos sistemas de produção do Estado de Santa Catarina.
Concórdia: EMBRAPA-CNPSA. Comunicado Técnico, n.123, p.5, 1987.
SPIEGELHALDER, C.; GERSTENECKER, B.; KERSTEN, A.; SCHILTS, E.; KIST, M.
purification of Helicobacter pylori SOD and cloning and sequencing of the gene.
Infection and Immunity, v.61, n.12, p.5315-5325, 1993.
STONE, G. G.; OBERST, R. D.; HAYS, M. P.; MCVEY, S.; CHENGAPPA, M. M.
Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth
cultivation - PCR procedure. Journal of Clinical Microbiology, v.32, n.7,
p.1742–1749, 1994.
113
TASCÓN, R. I.; VASQUEZ-BOLAND, J. A.; GUTIÉRREZ-MARTIN, C. B.;
RODRIGUEZ-BARBOSA, I.; RODRIGUEZ-FERRI, E. F. The RTX haemolysins
apxI and apxII are major virulence factors of the swine pathogen Actinobacillus
pleuropneumoniae: evidence from mutational analysis. Molecular Biology, v.14,
p.207-216, 1994.
TASCÓN, R.; VÁZQUEZ-BOLAND, J. A.; GUTIÉRREZ-MARTÍN, C. B.;
RODRÍGUEZ-BARBOSA, J. I.; RODRÍGUEZ-FERRI, E. F. Virulence factors of
the swine pathogen Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiología SEM, v.12,
p.171-184, 1996.
TASCÓN-CABRERO, R. I.; VASQUEZ-BOLAND, J. A.; GUTIERREZ, C. B.;
RODRIGUEZ-BARBOSA, J. I., RODRIGUEZ-FERRI, E. F. Actinobacillus
pleuropneumoniae does not require urease activity to produce acute swine
pleuropneumonia. FEMS Microbiology Letters, v.148, p.53-57, 1997.
TATUM, F. M.; DETILLEUX, P. G.; SACKS, J. M.; HALLING, S. M. Construction of
Cu-Zn superoxide dismutase deletion mutants of Brucella abortus: analysis of
survival in vitro in epithelial and phagocytic cells and in vivo in mice. Infection and Immunity, v.60, p.2863-2869, 1992.
TAYLOR, G.R. Polymerase Chain Reaction: basic principles and automation. In:
MCPHERSON, M. J.; QUIRKE, P.; TAYLOR G. R. PCR: a practical approach.
New York: Oxford University Press, p.15–16, 1993.
TU, A. H. T.; HAUSLER, C.; YOUNG, R.; STRUCK, D. K. Differential expression of
the cytotoxic and hemolytic activities of the ApxIIA toxin from Actinobacillus
pleuropneumoniae. Infection and Immunity, v.62, p.2119-2121, 1994.
UDEZE, F. A ; LATIMER, K. S.; KADIS, S. Role of Haemophilus endotoxin in the
pathogenisis of porcine Haemophilus. American Journal of Veterinary Research, n.48, p.768-773, 1987.
UDEZE, F. A.; KADIS, S. Effects of Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin on
porcine neutrophil function. Infection and Immunity, v.60, p.1558-1567, 1992.
UTRERA, V.; PIJOAN, C. Fimbriae in Actinobacillus pleuropneumoniae strains
isolated from pig respiratory tracts. The Veterinary Record, v.128, p.357, 1991.
VAN DE KERKHOF, A.; HAESEBROUCK, F.; CHIERS, K.; DUCATELLE, R.; KAMP,
E. M.; SMITS, M. A. Influence of Actinobacillus pleuropneumoniae and its
114
metabolites on porcine alveolar epithelial cells. Infection and Immunity, v.64,
n.9, p.3905-3907, 1996.
VIOLA, E. A.; BARTELS, H. Perspectivas da assistência técnica na suinocultura
(Assistência oficial). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 6., 1993, Goiânia. Anais... Goiânia: Associação
Brasileira de Veterinários Especialistas em Suínos, 1993. p.39-42.
WARD, C. K.; INZANA, T. J. Resistance of Actinobacillus pleuropneumoniae to
bacterial antibody and complement is mediated by capsular polysaccharide and
blocking antibody specific for lipopolysaccharide. The Journal of Immunology,
v.153, p.2110-2121, 1994.
WARD, C. K.; INZANA, T. J. Identification and characterization of a DNA region
involved in the export of capsular polysaccharide by Actinobacillus
pleuropneumoniae serotype 5a. Infection and Immunity, v.65, n.6, p.2491-2496,
1997.
WARD, C. K.; LAWRENCE, M. L.; VEIT, H. P.; INZANA, T. J. Cloning and
mutagenesis of a serotype-specific DNA region involved in encapsulation and
virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5a: concomitant
expression of serotype 5a and 1 capsular polysaccharides in recombinant A.
pleuropneumoniae serotype 1. Infection and Immunity, v.66, n.7, p.3326-3336,
1998.
WILKS, K. E.; DUNN, K. L. R.; FARRANT, J. L.; REDDIN, K. M.; GORRINGE, A. R.;
LANGFORD, P. R.; KROLL, J. S. Periplasmic superoxide dismutase in
meningococcal pathogenicity. Infection and Immunity, v.66, n.1, p.213-217,
1998.
WILLSON, P.J.; FALK, G.; KLASHINSKI, S. Detection of Actinobacillus
pleuropneumoniae Infection in Pigs. Canadian Veterinary Journal, v.28, n.3, p.
111-116, 1987.
WU, C. H. H.; WU, J. J. T.; HUANG, Y. T.; LIN, C.Y.; LIOUA, G. G.; LEE, F. J. S.
Identification and subcellular localization of a novel Cu,Zn superoxide dismutase
of Mycobacterium tuberculosis. FEBS Letters, v.439, p.192-196, 1998.
