UFOP - CETEC - UEMG

REDEMATREDE TEMÁTICA EM ENGENHARIA DE M ATERIAIS

UFOP – CETEC – UEMG

Dissertação de Mestrado

"Avaliação e Caracterização de Membranas de Celulose

Microcristalina Regenerada para uma Potencial Aplicação

em Cicatrização de Feridas Crônicas”

Autor: Elke Margareth Fernandes Lemos

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Gouvêa dos Santos

Co-orientador: Prof. Dr. Herman Sander Mansur

Março de 2008

UFOP - CETEC - UEMG

REDEMATREDE TEMÁTICA EM ENGENHARIA DE M ATERIAIS

UFOP – CETEC – UEMG

Elke Margareth Fernandes Lemos

Avaliação e Caracterização de Membranas de Celulose

Microcristalina Regenerada para uma Potencial Aplicação

em Cicatrização de Feridas Crônicas

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de

Materiais da REDEMAT, como requisito parcial para

a obtenção do título de Mestre em Ciência e

Engenharia de Materiais.

Área de concentração: Biomateriais

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Gouvêa dos Santos

Co-orientador: Prof. Dr. Herman Sander Mansur

Ouro Preto, Março de 2008

iii

DEDICATÓRIA

A Deus e ao cosmos, pelo fato do universo sempre ter conspirado a meu favor, me

dando fé e perseverança. “Eu e o Universo somos um.”

A minha “Yoga” e a minha meditação constante, por ter me oferecido equilíbrio e

sabedoria nas escolhas ao longo da vida. “Olhe para o seu coração e siga sua natureza“

(Buda).

Aos meus pais por terem me dado a vida e a oportunidade de estar aqui e evoluir mais

uma vez, nesta passagem pela existência humana.

Ao meu sobrinho Igor Gustavo de nove aninhos, que agüentou meu mau-humor e

ausência quando ele mais queria soltar pipa.

Ao meu querido gato “chuchu” por todo carinho e compreensão nos momentos de

desespero e ansiedade, que sempre, sempre ficou deitado ao lado do computador

olhando pra mim com seu meigo e doce semblante e que está comigo desde o início

desta jornada.

A Chico Xavier por ter me ensinado TUDO sobre Amor e Compaixão:

“A caridade é um exercício espiritual. Quem pratica o bem, põe em

movimento as forças da alma. “

“Tudo tem seu apogeu e seu declínio... É natural que seja assim;

todavia, quando tudo parece convergir para o que supomos o nada,

eis que a vida ressurge, triunfante e bela!... Novas folhas, novas

flores, na indefinida bênção do recomeço!...”

iv

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador e professor Cláudio Gouvêa dos Santos, que aceitou este desafio

de entrar comigo na área de Biomateriais, agradeço por toda a sua dedicação, força e fé

nos desígnios da vida. Nunca vi uma pessoa tão animada quanto ele!

Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), à Fundação de amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e à

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio

financeiro a este projeto, que sem esses recursos seria impossível atravessar mais esta

etapa.

Ao meu co-orientador Professor Herman Sander Mansur, por me aceitar na UFMG

com otimismo e grande entusiasmo e por sua constante disponibilidade em me atender

mesmo quando estava atarefado, agradeço sua eficiente postura profissional.

Ao meu professor Sidney, por ter me ensinado com exclusividade sobre ciência dos

biomateriais e por ter acreditado no meu trabalho.

Ao meu professor Antônio Vassalo, pela sua dedicação e interesse na minha

pesquisa, estando sempre disponível em me ensinar, quantas vezes fosse necessária.

Aos meus colegas de laboratório, Agda, Alexandra, Ezequiel, Fagner, Hermes,

Magda, Keila (Portugal), Viviane Bispo e todos aqueles que me ajudaram de alguma

forma no desenvolvimento desta pesquisa.

Aos funcionários dos laboratórios de Materiais Cerâmicos (FTIR), de Microscopia

Eletrônica (MEV/EDS) e ao laboratório de Raios-X (DRX) da UFMG e da UFOP.

A professora Edel Stancioli do Laboratório de Biologia de Microrganismos – ICB –

UFMG pela realização dos ensaios Biológicos.

A minha amiga Cíntia Ramaldes, por ter me incentivado e me apoiado muito para

fazer meu mestrado, sempre me direcionando na caminhada da vida.

E finalmente, a todos os meus amigos que torcem por mim Astemius, Carol, Dani,

Erlei, Fernando, Luís, Milton, Nivânia, Valéria e Viviane.

v

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ................................................................................................................iii

AGRADECIMENTOS...................................................................................................... iv

LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................vii

LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... ix

LISTA DE NOTAÇÕES E SÍMBOLOS............................................................................. x

RESUMO........................................................................................................................ xi

ABSTRACT ....................................................................................................................xii

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................1 1.1 Justificativa...........................................................................................................4 1.2 Biofilmes...............................................................................................................5 1.2.2 Uma Matriz Subcutânea Biodegradável ............................................................5 2. OBJETIVOS ................................................................................................................6 2.1 Objetivo Geral .....................................................................................................6 2.2 Objetivos Específicos ..........................................................................................6 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................7 3.1Estrutura e fisiologia da pele .................................................................................7 3.2 Úlceras de Pressão – UP .....................................................................................9 3.3 Processos de cicatrização e fatores bioquímicos ..............................................12 3.4 Os Biomateriais e a Engenharia de tecidos .......................................................15

3.4.1 Características dos Suportes de Crescimento de Tecidos.........................17 3.5 A Celulose..........................................................................................................20

3.5.1 Estrutura da Celulose ...............................................................................22 3.5.2 A Celulose Microcristalina – MCC..............................................................23

3.5.3 Processos de obtenção de uma celulose microcristalina...........................25 3.5.4 A membrana de Celulose Microcristalina Regenerada ..............................26

3.6 Caracterização da Celulose Microcristalina ......................................................27 3.6.1 Difração de Raios-X – DRX .......................................................................27 3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV .............................................30 3.6.3 Espectroscopia no Infravermelho – FTIR...................................................32 3.7 Ensaios da Celulose Microcristalina ..................................................................33 3.7.1 Ensaio de Biocompatibilidade (ensaio colorimétrico de MTT)....................33 3.7.2 Ensaios em SBF ........................................................................................35 3.8 Modificação na superfície dos Biopolímeros .....................................................36 4. METODOLOGIA........................................................................................................36 4.1 Materiais e Reagentes .......................................................................................36 4.2 Procedimentos Experimentais............................................................................37 4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ..............................................38 4.2.2 Espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ....38 4.2.3 Difratometria de Raios-X (DRX).................................................................39 4.3 Ensaios Biológicos ............................................................................................39 4.3.1 Teste de Biocompatibilidade......................................................................40

Preparo das amostras ..............................................................................40 Ensaio de contato - Citotoxicidade...........................................................40 Ensaio de MTT.........................................................................................41

vi

4.3.2 Ensaios de Biodegradação In vitro (PBS e SBF) .......................................42 Ensaios de Imersão .................................................................................42 Volume da Solução ..................................................................................42 Preparo da solução de PBS .....................................................................43 Preparo de amostras de MCCR (MEMBRA-CEL) para imersão em PBS 43 Imersão das amostras em Tampão Fosfato de Sódio (PBS) ...................43 Preparo da solução de SBF .....................................................................44 Imersão das amostras em Fluido Simulador do Corpo (SBF) ..................45 Índice de Degradação da MCCR no PBS ................................................46 Massa Intumescida ..................................................................................46

4.4 Modificação Química da celulose MCCR ..........................................................47 4.4.1 Ensaios de degradação In vitro (PBS e SBF) ............................................48 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ..............................................................................49

5.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho .....................................................49 5.2 Difratometria de Raios-X ...................................................................................50 5.3 Ensaios Biológicos ............................................................................................53

5.3.1 Ensaio de MTT da celulose Solucel® ........................................................53 5.3.2 Ensaio de MTT da celulose MCCR ou MEMBRA-CEL™ ..........................56 5.3.3 Índice de degradação da MCCR ou MEMBRA-CEL™ ..............................60

5.4 Modificação Química da Celulose .....................................................................64 6. CONCLUSÃO............................................................................................................65 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.........................................................66 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................67

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1: Camadas da pele (corte de pele da planta do pé)........................................ 7

Figura 3.2: Estrutura esquemática da pele ......................................................................8

Figura 3.3: Locais mais comuns que ocorrem úlceras de pressão..................................9

Figura 3.4: O grau de profundidade ou estágios das lesões: 1, 2, 3 e 4 da esquerda para

a direita .........................................................................................................................11

Figura 3.5: Fase proliferativa: (A) Migração de células epiteliais (B) Produção de

fibroblastos e fibras colágenas, (C) Angiogênese .........................................................14

Figura 3.6: Suportes para crescimento de tecidos ósseos ............................................18

Figura 3.7: Estrutura da celulose...................................................................................22

Figura 3.8: Diferentes microestruturas da celulose (A e B) ...........................................23

Figura 3.9: Celulose Microcristalina em pó prensada da marca Solucel®.....................24

Figura 3.10: Fluxograma do processo de manufatura da celulose Microcristalina Avicel®

......................................................................................................................................24

Figura 3.11: Reação envolvida no processo viscose.....................................................25

Figura 3.12: Difração de raios – X de pó de celulose de baixo índice de cristalinidade 27

Figura 3.13: Difração de raios – X de pó de celulose com alto índice de cristalinidade 27

Figura 3.14: Difração de raios – X de pó de celulose com um índice semicristalino .....28

Figura 3.15: Delimitação da área cristalina da área amorfa através da linha de base ..28

Figura 3.16: Micrografias de uma celulose de baixa cristalinidade (LCC) com um aspecto

liso (a), e de uma celulose Algiflor com vales e picos irregulares (b). ...........................30

Figura 3.17: Micrografias da celulose AMC com aspecto mais uniforme (a) e da celulose

Cladophora com muitos filamentos em sua morfologia (b)............................................30

Figura 3.18: Micrografia da celulose Microcristalina-MCC com um aspecto liso, plano 30

Figura 3.19: Viabilidade celular medida por MTT ..........................................................33

Figura 4.1: MEMBRA-CEL™ (Membrana e tubo para diálise). .....................................35

Figura 4.2: Fluxograma das ferramentas de caracterização para a MCCR...................37

Figura 4.3: Fluxograma dos novos tipos de MCCR .......................................................47 Figura 5.1: Espectros IR da membrana - MCCR ...........................................................49

Figura 5.2: Difratograma da MCCR identificando principais picos.................................51

Figura 5.3: Difratograma da MCCR, destacando as regiões: cristalina e amorfa ..........52

Figura 5.4: Estatística do ensaio de MTT da celulose Solucel®....................................53

viii

Figura 5.5: Histograma da viabilidade de células Vero com a Solucel®........................54

Figura 5.6: Microscopia por luz transmitida: (a) Imagens do crescimento das células

VERO (b) células sobre a hidroxiapatita em forma de agregados de pó, após os ensaios

MTT ...............................................................................................................................54

Figura 5.7: Células no controle positivo (Triton X-100 0,1%).........................................55

Figura 5.8: Imagens da Solucel, mostrando as células viáveis (a) cristais de

metilformazan e (b) aspecto fusiforme ..........................................................................55

Figura 5.9: Fotomicrografias de MEV da Solucel com cultura celular em ampliações

de 150, 1000, 3000 e 4000x ..........................................................................................56

Figura 5.10: Histograma da viabilidade de células Vero com a MEMBRA-CEL®..........57

Figura 5.11: Estatística do ensaio de MTT da celulose MEMBRA-CEL™.....................57

Figura 5.12: Microscopia ótica do controle celular (a) e da hidroxiapatita (b)................58

Figura 5.13: Microscopia ótica da MEMBRA-CEL™ com células viáveis......................59

Figura 5.14: Fotomicrografia por MEV da MCCR com cultura celular em

várias ampliações: 3000 e 4000x ..................................................................................59

Figura 5.15: Índice de degradação das amostras de MCCR no PBS e SBF.................60

Figura 5.16: Grau de Intumescimento das amostras de MCCR no PBS e SBF ............61

Figura 5.17: Índice de degradação das amostras de MCCR no PBS e SBF.................62

Figura 5.18: Grau de Intumescimento das amostras de MCCR no PBS e SBF ............63

ix

LISTA DE TABELAS Tabela 1.1: Dados estatísticos sobre UP.........................................................................4

Tabela 3.1: Fatores importantes na seleção de materiais para aplicação biomédica....16

Tabela 3.2: Bandas vibracionais de grupos típicos da celulose ....................................32

Tabela 3.3: Concentração de íons no plasma sanguíneo humano (SBF) ....................34

Tabela 4.1: Reagentes para a solução de PBS.............................................................42

Tabela 4.2: Reagentes para preparo de 1 litro de SBF .................................................44

Tabela 5.1: Principais bandas no espectro de infravermelho da MCCR .......................49

Tabela 5.2: Resultados dos percentuais das regiões amorfa e cristalina......................52

x

LISTA DE NOTAÇÕES OU SÍMBOLOS

ATR Reflexão Total Atenuada

DRX Difração de Raios-X

ECM Matriz Extracelular

EDS Espectrômetria de Energia Dispersiva

EtO Óxido de Etileno

FDA Food and Drug Administration (Agência norte-americana que regula produtos alimentícios e farmacêuticos)

FTIR Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier

GA Glutaraldeído

IV Infravermelho

MCCR Membrana de Celulose Microcristalina Regenerada

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

MI Massa intumescida

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

PBS Tampão de Fosfato de Sódio

RGD Arginina-Glicina-Aspartato

SBF Simulador de Fluido do Corpo

SEM Scanning Electron Microscopy

SFB Soro Bovino Fetal

SUS Sistema Único de Saúde

UP Úlcera de Pressão

xi

RESUMO

Este trabalho é parte de um estudo que pretende usar a celulose microcristalina

(MCCR) no processo de cicatrização de feridas crônica. Para avaliar sua

microestrutura, a MCCR foi caracterizada através de FTIR, DRX e MEV. A

caracterização biológica foi também realizada para verificar seu grau de citoxicidade e

além desses foram ainda avaliados o índice de degradação e o de intumescimento da

celulose imersa em tampão fosfato de sódio (PBS) e em simulador de fluido corpóreo

(SBF). Os resultados mostraram um significante percentual de degradação da MCCR

assim como uma importante tolerância no contato celular. A biocompatibilidade da

MCCR foi estabelecida através de testes de citotoxicidade e confirmada através de

análises do MEV. E foi verificado o comportamento da MCCR através de uma

modificação química, a qual não apresentou mudanças significativas na degradação e

manteve o mesmo comportamento de intumescimento em relação à MCCR original.

xii

ABSTRACT

This work is part of a study aiming at the use of regenerate microcrystalline

cellulose (MCCR) in the process of cicatrization of chronic wounds. In order to evaluate

its microstructure, MCCR was characterized by FTIR, DRX and SEM. Biological

characterization was also carried out with a view to verify its degree of citoxicity and

the index of degradation of cellulose in sodium phosphate buffer (SPB) and simulated

body fluid (SBF). The results show a significant percent of MCCR degradation as well

as an important tolerance towards cell contact. The biocompatibility of RMCC was

established by the citotoxicity tests and confirmed by SEM analysis. And was seeing

the performance of MCCR through of a chemistry change, which showing not alteration

amount in degradation and to keep the performance same of swelling compare with

MCCR strange.

1

1. Introdução

As úlceras por pressão (UP), ou úlceras da pele são lesões cutâneas

geradas em conseqüência de uma ausência de irrigação sanguínea e de uma

irritação do tecido que reveste uma saliência óssea, sobretudo nas zonas em

que esta foi pressionada contra qualquer objeto rígido durante um período

prolongado.

Esse é um problema real para pessoas com diminuição ou ausência de

sensibilidade e/ou limitação do movimento. Normalmente são usuários de

cadeiras de rodas ou idosos. O tratamento da úlcera de pressão é demorado e

dispendioso, podendo também ser agravado pelo histórico do paciente

(fumantes, diabéticos e hipertensos), muitas vezes privando o paciente do

exercício e ou de suas atividades educacionais, recreacionais e profissionais

(RIZO, 2003).

O impacto econômico do tratamento de uma úlcera de pressão é

elevado, devido à longa permanência dos pacientes nos hospitais e às

complicações decorrentes de infecções e também devido às intervenções

cirúrgicas.

Apesar dos avanços consideráveis no conhecimento do processo de

cicatrização das feridas, ainda hoje não existe um mecanismo que explique a

patofisiologia da não cicatrização das úlceras de pressão (AI et al, 2004).

Apesar da escassez de dados estatísticos precisos em nosso país,

sobre a quantidade de pacientes ou as seqüelas e conseqüências causadas

pelas lesões da pele (MANDELBAUM, 2003), alguns trabalhos demonstram

que o impacto psíquico, social e econômico da cronificação destas lesões, em

2

especial as úlceras de pés e pernas, representa a segunda causa de

afastamento do trabalho no Brasil (ERENO, 2003).

Já em 1945, no período pós-guerra existia relatos dos primeiros estudos

de desenvolvimento de tecidos ou biofilmes pra substituição de peles devido ao

grande número de pessoas portadoras de queimaduras com várias seqüelas,

as quais sobreviveram naquela época (MANDELBAUM, 2003).

Um dos objetivos da engenharia de tecidos é suprir os profissionais da

saúde com os biomateriais para substituições de alguns tecidos do corpo

humano, que muitas vezes se encontram escassos no paciente, por exemplo,

em caso de queimaduras onde o paciente perde parte substancial da pele ou

não possui áreas doadoras compatíveis para enxertar sua pele ou mesmo

doadores homologossíveis. Assim torna-se vital a existência de uma pele

artificial, pois seria quase inviável a busca de um doador imediato de pele.

Esse fato já não acontece em casos de doação de sangue, em que é possível

ter banco de doadores à disposição, (MANSUR et al., 2006).

A engenharia de tecidos tem por objeto a manipulação de células,

visando obter uma matriz artificial que estimulará a regeneração e substituição

tecidual. Podem ser utilizadas células do próprio corpo do paciente, quando

então o sistema se denomina de autólogo, mas pode também usar células

doadas por outros indivíduos da mesma espécie – nesse caso chamadas de

alogênicas (imunologicamente inativas). Em último caso, pode-se utilizar

células xenogênicas (de espécies diferentes), que por sua vez apresentam

muitas restrições, principalmente no Brasil devido aos impedimentos da

vigilância sanitária. Todos esses sistemas apresentam características que

substituem a perda de tecidos e fornecem novas opções de terapias para as

3

doenças assim como deficiências metabólicas (ORÉFICE et al., 2006 e

RATNER et al., 2004).

A ciência dos biomateriais apresenta um caráter interdisciplinar

envolvendo áreas da engenharia com áreas de ciência da saúde - medicina,

odontologia, química, entre várias outras. Através do desenvolvimento de

técnicas de manipulação específica em ambiente de laboratórios é possível o

crescimento de moléculas, células, tecidos ou órgãos visando restaurar manter,

ou melhorar a função do tecido e, fundamentalmente, compreender as relações

entre estruturas-funções em tecidos normais e patológicos (SILVA, 2006). Isso

pode ser alcançado, seja utilizando células vivas ou atraindo células

endogênicas para auxiliar a formação do tecido ou sua regeneração (RATNER

et al., 2004).

Dentre os materiais que podem ser utilizados no tratamento de feridas

crônicas, destacam-se os polímeros naturais à base de polissacarídeos, como

a celulose.

Uma das várias vantagens em se utilizar esse tipo de material é que ele

se degrada naturalmente e os produtos gerados (debris) são imunogênicos e

desta forma, possui uma íntima interface com o ambiente biológico e

metabólico. Quando a celulose é aplicada no corpo humano pode-se evitar o

efeito tóxico, uma reação inflamatória, o que normalmente acontece com um

material que não é bem tolerado no ambiente biológico, sendo percebido como

um corpo estranho gerando várias conseqüências até mesmo uma rejeição

(YANNAS, 2004).

A demanda por esse tipo de matriz reflete a necessidade de cicatrização

das úlceras de pressão, conhecidas também como feridas crônicas.

4

Normalmente quem apresenta este diagnóstico está debilitado e ou limitado de

exercer alguma locomoção, em geral idosos acima de 65 anos. A úlcera é um

sério problema para a população idosa, pois são responsáveis por um alto

índice de morbidade e mortalidade (THOMAS, 2001 e ALLMAN, 1989).

1.1 Justificativa

Apesar do nível de conhecimento já atingido sobre processo cicatricial e

dos recursos tecnológicos já desenvolvidos, as úlceras crônicas ainda

apresentam um alto grau de incidência e prevalência (tabela 1.1),

principalmente em países menos desenvolvidos.

Tabela 1.1: Dados estatísticos sobre UP.

Quadriplegia Prevalência de 60%Fraturas femorais Incidência de 66%

Tratamento Intensivo Incidência 33% Prevalência 41%

Fonte: IRION, 2005.

Sendo assim, a busca de materiais que facilitem a diminuição ou

controle desse problema é de grande importância. Além disso, o fato de se

explorar aplicações alternativas de matéria-prima de fácil acesso e rápida

obtenção é extremamente relevante, por causa do elevado custo dos

dispositivos ou recursos tecnológicos, que são, na maioria, importados. Outro

aspecto a ser considerado com a utilização de membranas de celulose é que

essas dispensam a utilização de um tecido doador de outro local do corpo,

evitando assim, procedimentos e mais gastos cirúrgicos.

5

1.2 Biofilmes

1.2.1 Uma Matriz de celulose Subcutânea Biodegradável

De acordo com os arquétipos das pesquisas da área da saúde, são

necessárias muitas alternativas com variadas substâncias (ou biomateriais) de

modo a garantir uma melhor aproximação do processo natural de cicatrização.

Apesar dos discretos avanços verificados nas últimas décadas com relação à

descoberta de novos recursos para a reparação tissular, muito há que ser

investigado ou pesquisado em especial em nosso país, em que ainda são

elevadas a incidência e a prevalência de lesões crônicas, particularmente as

úlceras dos pés e pernas em diabéticos que representa 10% da população

brasileira. Basta lembrar que são estimados cerca de quatro milhões de

pessoas portadoras de lesões crônicas na população brasileira o que

justificaria maiores investimentos em pesquisas, sobretudo em novos

dispositivos com custo final menor, tornando assim acessível à população

(MANDELBAUM et al.,2003) atendida pelo SUS.

6

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Caracterização e análise de membranas de celulose microcristalina

regenerada visando sua aplicação em matrizes cutâneas. Foram abordados

dois tipos de caracterização: biológica in vitro, química e alguns aspectos

físicos.

2.2 Objetivos Específicos

Na caracterização biológica buscou-se avaliar o grau de compatibilidade

das membranas de celulose com organismos vivos (ou no caso específico o

grau de citotoxicidade) e também avaliar o comportamento da cinética da

biodegradação através de ensaios in vitro.

Na caracterização físico-química buscou-se investigar ou evidenciar:

• O caráter microestrutural (morfologia) da membrana de celulose

microcristalina.

• O espectro cristalográfico revelado pela difração de raios X das

membranas de celulose microcristalina (fases presentes e grau de

cristalinidade).

• O perfil da espectroscopia de infravermelho por transformada de

Fourier (FTIR) das amostras para avaliar a composição química

da membrana de celulose microcristalina Regenerada (MCCR).

7

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Estrutura e fisiologia da pele

A pele é formada por três camadas (Figuras 3.1 e 3.2) que são

interdependentes, a epiderme, a derme, e a hipoderme. A epiderme é

constituída por epitélio estratificado pavimentoso e queratinizado (JUNQUEIRA

e CARNEIRO, 2004)

A epiderme se subdivide em cinco camadas, respectivamente do exterior

para o interior: camada córnea, lúcida, granulosa, espinhosa e basal, esta se

localiza no inicio da derme. Tanto a estrutura da pele quanto a espessura

variam de acordo com o local no corpo sendo mais espessa nas mãos e nos

pés (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).

Figura 3.1: Camadas da pele (corte de pele da planta do pé). Fonte: JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004.

8

A derme se localiza logo após a epiderme, é feita de tecido conjuntivo, e

é mais espessa, atingindo cerca de 3mm na planta dos pés. Ela subdivide-se

em duas camadas denominadas camada papilar (através da qual se prende a

epiderme) e camada reticular que permite a elasticidade da pele

(CABRAL,2006).

Figura 3.2: Estrutura esquemática da pele. Fonte: Adaptado de CABRAL, 2006.

9

Por último existe a camada hipodérmica que está na base inferior da

pele (camada mais profunda), também é feita de tecido conjuntivo frouxo, o

qual une de maneira pouco firme a derme aos órgãos subjacentes

(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Esta camada é rica em lipídeos tendo a

função de proteger e modelar o corpo humano.

3.2 Úlceras de Pressão – UP

A úlcera de pressão é uma ferida decorrente de isquemia tecidual que

ocorre pela alteração do reflexo de dor em pacientes com lesão medular ou

pacientes debilitados, idosos ou cronicamente doentes (RIZO, 2003). Úlcera de

pressão é qualquer lesão que ocorre na pele, gerada por pressão constante

sobre esse tecido causando danos ao tecido subjacente. Normalmente as

lesões ocorrem com uma maior freqüência em regiões que têm muitas

proeminências ósseas e aonde o corpo normalmente se apóia (Figura 3.3).

Figura 3.3: Locais mais comuns que ocorrem úlceras de pressão. Fonte: IRION, 2005.

A pele conta com uma rica irrigação sanguínea que leva o oxigênio a

todas as suas camadas. Se essa irrigação for interrompida durante mais de 2

Crista Ilíaca

Sacro Grande trocânter

Ísquio

Maléolo externo

Calcâneo

10

ou 3 horas, a pele morre, a começar pela sua camada externa (a epiderme). A

causa da freqüente redução de irrigação sanguínea na pele é gerada pela

pressão. Os movimentos normais que as pessoas realizam em seu cotidiano

fazem variar a pressão, para que a circulação sanguínea não fique obstruída

durante um longo período. A camada de gordura por baixo da pele,

especialmente sobre as saliências ósseas, atua como um acolchoamento e

evita que os vasos sanguíneos sejam obstruídos. Se a pressão interrompe o

fluxo sanguíneo, a zona de pele privada de oxigênio de início fica avermelhada,

inflamada e, depois, e depois produzindo ulcerações (IRION, 2005).

As úlceras de pressão também são denominadas como feridas crônicas,

úlceras de decúbito (termo mais antigo), escaras e alguns outros nomes

referenciados nas literaturas pertinentes à saúde.

As úlceras de pressão são classificadas em quatro estágios (Figura 3.4)

que classificam a profundidade das lesões, sendo observadas de forma física.

O fator tempo e pressão estão diretamente relacionados nas causas das

úlceras e o risco para que ocorra o seu desenvolvimento é mensurado como

uma média de pressão de 70 mmHg durante 2h para uma lesão irreversível. O

termo carga tissular é mais abrangente que o termo pressão, pois a carga

sobre os tecidos é causada por pressão, fricção e atrito e é exacerbada pela

umidade e pela temperatura sobre o local da ferida. (IRION, 2005). No estágio

1, (Figura 3.4) a úlcera não está realmente formada: a pele, intacta, está

simplesmente avermelhada. No estágio 2, a pele está avermelhada e inflamada

(muitas vezes com bolhas) e a sua destruição começa nas suas camadas mais

externas. No estágio 3, a úlcera abre-se para o exterior através da pele,

11

deixando expostas as camadas mais profundas. No estágio 4, a úlcera

estende-se profundamente através da pele e da gordura até ao músculo,

tendão e osso (RIZO, 2003).

Figura 3.4: O grau de profundidade ou estágios das lesões: 1, 2, 3 e 4 da esquerda para a direita. Fonte: IRION, 2005.

Normalmente as úlceras de pressão atingem pessoas que de alguma

forma perderam sua capacidade de movimento ou locomoção, estando

acamadas. ou portando algum tipo de paraplegia, tetraplegia, pessoas

portadoras de lesão cerebral, distrofia muscular (RIZO, 2003). Cerca de 70%

de todas as úlceras, acometem idosos acima de 65 anos com diagnóstico de

algum tipo de debilitação e ou déficit de movimento (WHITTINGTON et al.,

2000).

As úlceras de pressão são difíceis de tratar e alguns casos requerem o

transplante de pele sã para a zona danificada. Infelizmente, este tipo de

cirurgia nem sempre é possível, especialmente em pessoas idosas,

fisiologicamente frágeis, que manifestam alguma desnutrição (THOMAS, 2006).

A prevenção e o tratamento das úlceras de pressão geralmente

consistem em mudanças freqüentes de posição, inspeções regulares na pele,

cuidados com a pele, uso de dispositivos especializados em alívios da pressão

e também o tratamento da subnutrição e incontinência (HOPKINS et al., 2006).

Camadas:

• Epiderme

• Derme

• Hipodermee

12

3.3 Processos de cicatrização e fatores Bioquímicos

A cicatrização de feridas consiste em uma perfeita e coordenada

cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a

repavimentação e a reconstituição do tecido (ORTONNE, 1994).

Quando o organismo é agredido, quaisquer que sejam os agentes

agressores, a resposta dos tecidos é sempre de cunho inflamatório, com

ativação de mediadores ativos e conseqüente dilatação, aumento da

permeabilidade vascular e posterior exsudação de moléculas e de células

(ORÉFICE et al, 2006).

As feridas superficiais, que atingem a epiderme são causadas por

estiramento, fricção e queimaduras leves. A cicatrização ocorre por

regeneração das células epiteliais na superfície da ferida em decorrência da

perda da inibição de contato e da migração de células epidérmicas em direção

à superfície. Em muitos casos de lesão por pressão, pode-se encontrar tecido

necrótico subjacente a uma epiderme intacta. Habitualmente, as úlceras de

pressão provocam certa dor e comichão e nas pessoas com a sensibilidade

afetada podem, inclusive, desenvolverem-se úlceras graves e profundas sem

que se note dor (IRION, 2005).

Feridas que atingem parte da espessura da derme (derme incompleta)

cicatrizam-se de uma forma semelhante à das feridas superficiais

(convencionais). Normalmente pode ocorrer dano à derme, mas as estruturas

acessórias (ossos, tendões músculos) são preservadas (MANDELBAUM et al.,

2003) e as feridas de espessura total (derme completa ou estendida ao tecido

13

celular subcutâneo) necessitam da formação de um novo tecido, denominado

de tecido de granulação. Esse é um tecido brilhante, vermelho-vivo, com

ondulações granulosas (IRION, 2005).

O processo de cicatrização de feridas é classificado em cinco fases:

coagulação, inflamação, proliferação, contração da ferida e remodelação

(FAZIO et al., 2000).

Na fase da coagulação ocorre uma complexa liberação de produtos,

substâncias vasoativas, proteínas adesivas, fatores de crescimento e proteases

são liberadas e ditam o desencadeamento de outras fases (CLARK, 1985). A

formação do coágulo serve para oferecer uma matriz ou ponte provisória para

as células ingressarem na ferida (GRINNEL et al, 1981).

A fase da inflamação inicia-se com a ruptura de vasos sangüíneos e o

extravasamento de sangue, este fato é seguido rapidamente pela ativação da

agregação plaquetária e da cascata de coagulação, liberação dos fatores de

crescimento, síntese de DNA, deposição de colágeno e à retração cicatricial,

destruição de bactérias via fagocitose e a liberação de enzimas mais radicais

livres. Em geral nessa fase existe uma destruição e uma construção no local

lesionado (IRION, 2005).

A fase proliferativa (Figura 3.5) é responsável pelo “fechamento” da

lesão propriamente dita e ela possui três subfases: Reepitelização, Fibroplasia,

Angiogênese (MANDELBAUM et al, 2003).

14

Figura 3.5: Fase proliferativa: (A) Migração de células epiteliais (B) Produção de fibroblastos e fibras colágenas. (C) Angiogênese. Fonte: IRION, 2005.

Na reepitelização ocorre a formação de tecido de granulação e em

alguns casos a contração da ferida. Já na fibroplasia (VAN, 1967) ocorre

formação da matriz, que é extremamente importante na formação do tecido de

granulação (coleção de elementos celulares, incluindo fibroblastos, células

inflamatórias e componentes neovasculares e da matriz, como a fibronectina,

as glicosaminoglicanas e o colágeno). Somente ocorre formação do tecido de

granulação quando os níveis de bactérias são baixos na ferida, caso contrário

esta é inibida. A última fase da proliferação é a angiogênese, essencial para o

suprimento de oxigênio e nutrientes para a cicatrização (MANDELBAUM et al,

2003).

Na fase de contração da ferida ocorre o movimento radial da pele

intacta das bordas da ferida em direção ao centro. Também ocorre a migração

de células para o interior da ferida sendo auxiliadas pela proteína fibronectina

que faz um gancho de ligação (IRION 2005). Ela une diversos fibroblastos,

formando uma rede.

15

A última das fases, a fase de remodelação ocorre no colágeno e na

matriz, é responsável pelo aumento da força de tensão e pela diminuição do

tamanho da cicatriz e do eritema (DOILLON et al., 1985).

Muitas variáveis tanto de ordem geral como de ordem local influenciam

esse longo e complexo processo. É fundamental uma completa e minuciosa

anamnese, para avaliação de todos os fatores que podem interferir na

cicatrização: a idade, o estado nutricional do paciente, a existência de doenças

de base, como diabetes, alterações cardiocirculatórias e de coagulação,

aterosclerose, disfunção renal, quadros infecciosos sistêmicos e uso de drogas

sistêmicas. Dos fatores locais, interferem a técnica cirúrgica, formação de

hematomas, infecção, reação de corpo estranho, uso de drogas tópicas,

ressecamento durante a cicatrização (MANDELBAUM et al, 2003).

3.4 Os Biomateriais e a Engenharia de tecidos

Segundo RATNER (2004), a ciência dos biomateriais é um estudo físico

e biológico de materiais e suas interações com o ambiente biológico.

Na tabela 3.1 estão descritas as características mais importantes para a

aplicação e uso dos biomateriais no organismo (RAMAKRISHNA et al. 2001).

Outra definição complementar para entender o objetivo da ciência dos

biomateriais é o da “biocompatibilidade”: habilidade de desempenho entre um

material e uma resposta apropriada de um hospedeiro em uma aplicação

específica (WILLIAMS, 1987).

16

Tabela 3.1: Fatores importantes na seleção de materiais para aplicação biomédica.

Descrição dos Fatores Propriedades do Material

Características químicas/biológicas

Características físicas

Características mecânicas/estruturais

1º nível Composição química Densidade

Módulo de elasticidade. Razão de Poisson’s.

Limite de escoamento. Resistência tensiva e

compressiva.

2º nível Adesão Topologia da superfície (textura e rugosidade)

Dureza. Módulo de cisalhamento. Resistência de cisalhamento.

Módulo e resistência Flexural.

Requerimento funcional específico

Biofuncionalidade (não trombogênico, adesão

de células) Bioinerte (não tóxico, não carcinogênico).

Bioativo Bioestável (resistente à

corrosão, hidrólise, oxidação).

Biodegradável

Forma (sólido, poroso, filme, fibra, pó)

Geometria.Coeficiente de expansão

termal.Condutividade elétrica

Cor, estética Índice de refração.

Opacidade ou transluscência

Tensão ou rigidez,Resistência à fratura, Resistência à

fadiga,Creep resistência,Resistência ao desgaste e fricção

Resistência à adesão,Resistência ao

impacto Resistência abrasiva

Processamento e fabricação

Reprodutibilidade, qualidade,

esterilisabilidade, empacotamento

e processabilidade secundária.

Características do hospedeiro

Tecido, organismo, espécie, idade, sexo, raça, condições de saúde, atividade,

resposta sistêmica a procedimentos

médicos/cirúrgicos, período de

aplicação/uso.

Custo Avaliação do custo x benefício.

Fonte: Adaptado de RAMAKRISHNA et al. 2001, apud ROCHA, 2006.

A engenharia de tecidos representa uma nova e emergente área

interdisciplinar aplicada como ferramenta da interface biomédica e engenharia,

que usam de células vivas ou atraem células endogênicas para auxiliar a

17

formação do tecido ou a sua regeneração no sentido de restaurar, manter, ou

melhorar a função deste tecido (RATNER et al., 2004).

As células usadas na engenharia de tecidos podem originar-se de uma

variedade de fontes incluindo aplicações específicas com células diferenciadas

ou de células não diferenciadas compreendendo progenitor ou células-tronco.

3.4.1 Características dos Suportes de Crescimento de Tecidos

Os Suportes para Crescimento de Tecidos (figura 3.6) são sistemas

abertos de células transplantadas que ficam em contato direto com o substrato

ou matriz, objetivando fornecer uma solução permanente para a substituição de

um tecido vivo. A razão fundamental no uso de sistemas abertos está baseada

em observações empíricas: células dissociadas tem o cuidado em reformar

suas estruturas originais, quando às condições do ambiente são apropriadas

para a cultura de células, mas também possuem limitações em termos de

quantidade no qual o tecido não pode ser transplantado em grandes volumes

por causa de restritas interações e limitações de difusões com o ambiente

(substrato) de nutrientes, troca gasosa, e eliminação de excrementos (RATNER

et al., 2004).

Um Suporte para Crescimento de Tecidos que atenda a engenharia de

tecidos deve ter a função de estimulação celular: fatores bioativos sobre a

superfície do material, na forma de droga e genes adsorvidos no material e sua

principal função é atuar como uma matriz artificial extracelular mimetizando as

propriedades da matriz extracelular natural (ECM), material biodegradável e o

controle de degradação e remodelação do tecido. Algumas características para

18

o projeto de uma matriz ou suporte para crescimento de tecidos são:

biocompatibilidade, flexibilidade para possuir várias formas, propriedades

mecânicas e físicas convenientes, e biodegradabilidade (RATNER et al., 2004)

Figura 3.6: Suportes para crescimento de tecidos ósseos. Fonte: Notas de aula de SILVA, 2006.

Além do uso clínico da pele artificial, várias empresas têm explorado as

possibilidades de substitutos dérmicos com propósitos de diagnósticos.

No Brasil temos algumas pesquisas promissoras envolvendo recursos

naturais como o látex da seringueira com custo bem reduzido em relação à

tecnologia importada. Esse látex testado em pacientes com feridas crônicas,

portadores de diabetes, que apresentaram resultados positivos no processo de

granulação e epitelização, devido à propriedade do látex de estimular a

angiogênese (MANDELBAUM et al., 2003).

Existem muitas pesquisas em andamento e há perspectivas de

desenvolvimento de novas tecnologias que visam não só acelerar o processo

cicatricial, como reduzir as suas complicações (MANDELBAUM et al., 2003).

Alguns dos recursos tecnológicos mais importantes utilizados no processo de

cicatrização atualmente disponíveis no Brasil envolvem ácidos graxos

essenciais (AGE), filmes semipermeáveis, membranas permeáveis ao vapor,

hidropolímeros, hidrocolóides, enzimas proteolíticas, acetato de celulose entre

outros.

19

3.5 A Celulose

A celulose é o mais abundante biopolímero encontrado amplamente na

natureza para uso comercial (KONTTURI et al., 2005). É o principal

componente da biomassa presente na membrana celular (citoesqueleto) dos

vegetais.

O interesse crescente em fibras naturais como a celulose gerou intensas

pesquisas de modo a acontecer um refinamento em sua estrutura e

consequentemente em suas propriedades, portanto viabilizando sua aplicação

como um biomaterial (GIL e FERREIRA, 2006).

Um derivado da celulose foi sintetizado pela primeira vez em 1908 por

Jacques E. Brandenberger, na tentativa de desenvolver um material para

aplicações diversas que fosse impermeável à água. Disso resultou a

descoberta do filme denominado hoje de celofane (LEVY et al., 2004).

Os polímeros naturais a priori apresentam biocompatibilidade relativa,

tem baixo custo e podem ser modificados apresentando uma variedade de

propriedades químicas, físicas e biológicas (HUTCHENS et al., 2006).

A celulose é um polissacarídeo atualmente amplamente utilizado na área

da saúde para produzir membranas de diálise, recobrimento de drogas,

coagulantes sanguíneos, testes de gravidez e muitos outros produtos

(MIYAMOTO et al. 1989).

Os materiais biocompósitos (ou bioconjugados) de base celulósica têm

sido aplicados em várias áreas da medicina não só em hemodiálise,

nomeadamente como componentes de matrizes para regeneração óssea

20

(Surgicel ®), vasos sanguíneos artificiais (BASYC ®), substitutos temporários

de pele (Biofill ®), e sistemas de liberação controlada (LEVY et al. 2004).

Os polímeros naturais ou biopolímeros (seda, celulose, colágenos,

gelatina, queratina, e outros) oferecem a vantagem de serem muito parecidos à

matriz extracelular nos tecidos vivos, frequentemente sua degradação em

ambiente fisiológico geram debris (fragmentos moleculares) idênticos às

substâncias moleculares da matriz extracelular (ECM) natural, as quais o

ambiente biológico está preparado para reconhecê-los metabolicamente

(RATNER et al 2004). Além disso, a similaridade das substâncias que ocorrem

naturalmente introduz uma capacidade interessante de se projetar biomateriais

que funcionem biologicamente como o molecular. Os polímeros naturais são

bastante imunogênicos e uma intrigante característica desses polímeros é a

sua habilidade de ser degradado naturalmente por enzimas, que é uma

garantia que o implante será eventualmente metabolizado através de

mecanismos fisiológicos (YANNAS, 2004).

Um problema encontrado nos polímeros naturais é que eles possuem

pouca resistência às mudanças na temperatura, podendo se decompor quando

implantados no corpo (RATNER, 2004). Então é relevante o estudo da

degradação de forma que aconteça num ambiente controlado, simulando o

meio fisiológico e garantindo suas características como curativos das lesões.

O incremento no uso dos polissacarídeos como biomateriais deve-se ao

fato destes compostos apresentarem na sua estrutura grupos funcionais como

grupos hidroxílicos e grupos carboxílicos. Qualquer destes grupos pode ser

usado para promover a derivatização química das moléculas ou sua ligação a

determinados ligantes de proteínas (enzimas) específicas. Desta forma, a

21

molécula natural pode ser modificada, e as suas características químicas e

físicas específicas alteradas, portanto sua aplicabilidade melhorada. Outras

vantagens da aplicação dos polissacarídeos como biomateriais incluem entre

outras: a grande variedade de compostos, densidade próxima dos meios

biológicos e a sua funcionalidade (GIL e FERREIRA, 2006).

A celulose modificada com grupamentos diferentes é utilizada em

membranas e na imobilização de células e para isso ocorrer alguns métodos

são descritos, nos quais a maioria deles parte de uma superfície considerada

ativada para acoplamento, ou seja, a superfície do material deve possuir

grupos químicos reativos como hidroxilas (-OH), aminas (-NH2), ácidos

carboxílicos (-COOH) etc. Outra opção é a inserção nas superfícies do

polímero, de peptídeos contendo a seqüência de aminoácidos RGD (Arg-Gly-

Asp) que, quando expostos ao contato celular, vão propiciar a adesão

(ORÉFICE et al., 2006).

3.5.1 Estrutura da celulose

A celulose tem uma estrutura linear ou fibrosa, na qual se estabelecem

múltiplas ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxilas das distintas

cadeias juntapostas de glicose (figura 3.8), fazendo-as impenetráveis a água, e

originando fibras compactas que constituem a parede celular dos vegetais. É

um polissacarídeo linear constituído por unidades monoméricas de β (1-4)-D-

glucopiranose (GIL e FERREIRA, 2006).

A celulose possui uma cadeia longa de peso molecular variável, com

fórmula empírica (C6H1005)n, com um valor mínimo de n=200.

22

Figura 3.7: Estrutura da celulose.

3.5.2 A Celulose Microcristalina – MCC

A celulose microcristalina é um excipiente farmacêutico, que foi

introduzido no mercado com o nome comercial Avicel® em 1963, esta reúne

propriedades diluente-desintegrante (PASQUALOTO et al, 2005).

Derivados de celulose apresentam um importante potencial de aplicação

nas áreas farmacêuticas e biomédicas. Esses derivados são utilizados entre

outras aplicações em dispositivos com liberação controlada de fármacos e para

bioadesivos.

A Celulose Microcristalina (MCC) é uma fração da celulose presente nas

paredes celulares das fibras das plantas, constituída de lignina mais a celulose

(Figura 3.8) que foram fisicamente fragmentadas (não fibrosa). Após a hidrólise

ácida (tratamento com HCl 2,5 mol.L-1 por 15 min a 105 ºC) da polpa da

celulose, a celulose microcristalina permanece insolúvel e é separada,

submetida a atrito que faz com que se quebre em agregados cristalinos

coloidais, que são secos juntamente com carboximetilcelulose (CMC) e outros

ingredientes funcionais que garantem a redispersão dos cristais, sendo uma

forma muito pura de celulose (BEHRENS e NETTO-FERREIRA, 2006).

23

Figura 3.8: Diferentes microestruturas da celulose (A e B). Fonte: Site da FMC Corporation, 2007.

A MCC apresenta-se como pó branco (Figura 3.9), inodoro, livre de

contaminantes orgânicos e inorgânicos Ela é utilizada como excipiente de

drogas, pois tem elevada capilaridade possuindo grandes quantidades de

regiões amorfas, podendo ser facilmente desintegrada. Por ser um material

com propriedades inertes ao organismo e apresentar em sua estrutura grande

quantidade de poros, é possível que a MCC atue como um filme de proteção e

proliferação de células (Suporte para Crescimento de Tecido) em feridas

crônicas principalmente em lesões profundas (PASQUALOTO et al., 2005).

Existem no mercado alguns tipos de MCC e suas propriedades físico-

químicas variam segundo o tamanho médio de partículas, o conteúdo de

umidade e devido às técnicas de processamento do fabricante (PASQUALOTO

et al, 2005). Esta diferença de tamanhos seria obtida variando-se as condições

de hidrólise, cisalhamento e secagem durante o processamento da alfa-

celulose (DOELKER et al, 1995). Desta forma encontramos no mercado uma

gama de variações de produtos com nomes e aplicações de MCC distintos,

entre algumas delas destacam-se as marcas Avicel®, Solucel. Assim em

função da variação no tamanho médio das partículas da MCC, podemos

encontrar no mercado, por exemplo, alguns produtos comerciais assim

denominados de: Avicel® PH-101(50μm), Avicel® PH-102 (100μm), Avicel®

24

PH-105 (20μm) cuja aplicação é realizada de acordo com especificações do

fabricante (Fonte: Site da FMC Corporation, 2007).

Figura 3.9: Celulose Microcristalina em pó prensada da marca Solucel®.

Fonte: Site Bahiapulp, 2007.

3.5.3 Processos de obtenção de uma Celulose Microcristalina

Para a obtenção da celulose Microcristalina é necessário seguir as

seguintes etapas conforme o fluxograma da figura 3.10.

Figura 3.10: Fluxograma do processo de manufatura da celulose microcristalina Avicel®. Fonte: Adaptado do site da FMC Corporation, 2007.

Secagem

Pó de celulose (Avicel®)

α celulose

Hidrolise e purificação

Desintegração mecânica

Adição de hidrocolóides e outros componentes funcionais

Secagem

MCC Colóides: • Avicel® • Avicel Plus® • Novagel®

Fibras da planta

25

3.5.4 A Membrana de Celulose Microcristalina Regenerada – MCCR

Uma solução de um derivado de celulose pode ser processada

(usualmente por extrusão) para produzir o formato desejado (geralmente fibra

ou filme) e então ser tratada para remover os grupos modificadores para

reformar ou regenerar a celulose. Este material é conhecido como celulose

regenerada (GRACH, 2006).

A celulose usada na medicina é tipicamente regenerada, sendo utilizado

o processo viscose ou pode ser modificada com derivados como o acetato de

celulose ou carboximetilcelulose. Essas celuloses perdem resistência e quase

toda a sua cristalinidade e forma original (HUTCHENS et al., 2006).

Os primeiros métodos de produção de celulose regenerada remotam ao

final do século XIX. Descoberta em 1892 por Cross, Bevan e por Beandle, o

método consiste em solubilizar a celulose pela formação do xantato através do

tratamento da pasta com hidróxido de sódio e dissulfito de carbono e

posteriormente regenerada pela acidificação da solução de xantato. Este

processo é conhecido como o processo viscose. Ele é usado para a produção

de fibras têxteis e para a produção da película transparente conhecida como

celofane (GRACH, 2006). A figura 3.11 mostra a reação envolvida no processo

viscose.

Figura 3.11: Reação envolvida no processo viscose. Fonte GRACH, 2006.

26

Filmes de celulose com poros, já são produzidos e usados para a

separações, na indústria e diálise na medicina, graças as suas propriedades de

hidrofilia e biocompatibilidade (RISBUD e BHONDE, 2001).

3.6 Caracterização da Celulose Microcristalina

3.6.1 Difração de Raios-X - DRX

De acordo com MANSUR (2006) a técnica de difração de Raios-X é

utilizada para identificar as fases cristalinas presentes nos materiais, uma vez

que cada sólido cristalino possui padrão único de difração (lei de Bragg), que

pode ser usado como uma “impressão digital” para a sua identificação. É

possível ainda identificar e medir algumas propriedades estruturais destas

fases, tais como: estado de deformação, tamanho de grão, de partícula,

composição da fase, orientação preferencial e estrutura de defeitos, e é

utilizada no intuito de determinar a espessura de filmes finos e suas

multicamadas e os arranjos atômicos em materiais amorfos e em interfaces de

materiais conjugados.

As amostras de materiais que ocorrem na forma de particulado fino e

que sejam suaves ao tato não necessitam qualquer tipo de tratamento,

enquanto o particulado grosseiro deve ser triturado, visando evitar orientações

preferenciais. De modo geral, utilizam-se materiais passantes nas peneiras 200

mesh ou em malhas inferiores (MANSUR et al., 2006).

Segundo KONTTURI et al. (2005), recentemente se descobriu uma

celulose nativa que possui tanto a forma cristalina quanto a forma amorfa

27

(celulose Iα e Iβ). Desta forma em um mesmo material é possível encontrar

uma estrutura semicristalina.

As figuras 3.12 e 3.13 mostram difratogramas de raios-X típicos de pó de

celulose para várias formas de celulose com alto e baixo índice de

cristalinidade e conforme figura 3.14 é possível verificar a configuração do

espectro ou difratograma de uma celulose microcristalina - MCC, a qual

apresenta um índice semicristalino, devido à presença de um pico mais largo

junto com um pico mais alto e estreito.

10 15 20 25 30 35 40 45 10 15 20 25 30 35 40 45

2θ 2θ10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45 10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45

2θ 2θ Figura 3.12: Difração de raios-X de pó de celuloses com baixo índice de

cristalinidade. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.

Figura 3.13: Difração de raios-X de pó de celuloses com alto índice de cristalinidade. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.

10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45 10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 452θ 2θ

28

Figura 3.14: Difração de raios-X de pó de celulose Microcristalina com um índice semicristalino. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.

De acordo com OH et al. (2005), é necessário criar uma linha de base no

programa Origin® para delimitar a área cristalina da área amorfa. Desta forma

as medidas das porcentagens são calculadas pelo programa, conforme figura

3.15.

Figura 3.15: Delimitação da área cristalina da área amorfa através da linha de

base. Fonte: OH et al., 2005.

29

3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV

De acordo com PISCITELLI (2004), a técnica de MEV permite a

obtenção de imagem ampliada e tridimensional da amostra a partir da interação

de um feixe de elétrons com o material.

A técnica requer ambiente de vácuo para que os elétrons desloquem na

câmara. No caso de amostras de origem orgânica (biológica) é necessário que

elas sejam desidratadas e fixadas de modo a suportar ambientes de vácuo e

por se tratar de amostras não condutoras devem ser recobertas com um filme

fino (10-50 nm) de material condutor que de modo geral, utilizam-se duas

categorias de materiais: carbono ou metais preciosos, (MANSUR, 2006).

Em geral os microscópicos eletrônicos de varredura podem ser

acoplados a equipamento de micro-análise, o que permite à obtenção de

informações químicas em áreas da ordem de até alguns nanômetros.

Informações qualitativas e quantitativas a cerca dos elementos presentes são

obtidas pela captação dos raios-X característicos resultantes da interação do

feixe primário com a amostra. Essa análise é denominada de EDS,

espectroscopia de energia dispersiva, (MANSUR, 2006).

A morfologia da celulose com baixa cristalinidade – LCC - figura 3.16 (a)

apresenta um aspecto muito similar à celulose microcristalina – MCC, assim

como a AMC também apresenta uma forma bem homogênea conforme figura

3.17. Porém a celulose que apresenta alto índice de cristalinidade possui um

aspecto morfológico mais filamentoso e irregular.

30

(a) (b) Figura 3.16: Micrografias de uma celulose de baixa cristalinidade (LCC) com um aspecto liso (a), e de uma celulose Algiflor com vales e picos irregulares (b). Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.

(a) (b) Figura 3.17: Micrografias da celulose AMC com aspecto mais uniforme (a) e da celulose Cladophora com muitos filamentos em sua morfologia (b). Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.

Figura 3.18: Micrografias da celulose microcristalina - MCC com um aspecto liso, plano. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.

31

3.6.3 Espectroscopia no Infravermelho por transformada de Fourier- FTIR

A técnica de espectroscopia de infravermelho é indicada para análises

qualitativas e quantitativas de compostos orgânicos e inorgânicos (MANSUR,

2006).

A espectroscopia na região do infravermelho é uma técnica de

inestimável importância na análise qualitativa orgânica de compostos químicos,

sendo amplamente utilizada nas áreas de química de produtos naturais,

síntese e transformações orgânicas de acordo com LOPES e FASCIO, (2004).

A tabela 3.2 apresenta algumas atribuições de bandas características de

grupos funcionais presentes na estrutura da celulose (ver Figura 3.7).

Tabela 3.2: Bandas vibracionais de grupos típicos da celulose

REGIÃO

cm-1 µm Intensidade Atribuição

3575 – 3125 2,8 – 3,2 média estiramento OH

1750 – 1725 5,71 – 5,8 forte estiramento C=O

1635 –1600 6,12 – 6,25 média deformação OH

1480 – 1435 6,76 – 6,95 fraca deformação de CH2.

~ 1375 ~ 7,27 fraca deformação CH

~ 1340 ~ 7,46 fraca deformação OH

1320 – 1030 7,58 – 9,71 fraca várias bandas

~ 830 ~ 12,5 fraca deformação CH2

Fonte: Adaptado de SÓCRATES, 2001.

32

3.7 Ensaios da Celulose Microcristalina

3.7.1 Ensaio de Biocompatibilidade (ensaio colorimétrico de MTT)

Segundo MARQUES (2002), o ensaio com MTT permite fazer uma

análise qualitativa e, em alguns casos, quantitativa do material em relação à

linhagem celular escolhida. Em alguns procedimentos é possível até mesmo

verificar a quantidade de células que se fixaram na superfície do material.

A avaliação da citotoxicidade in vitro de um biomaterial é o primeiro

passo para o estudo de sua biocompatibilidade. Tanto com soluções que

simulam o meio fisiológico, quanto com células, o teste in vitro é normalmente

desempenhado com o uso de linhagem isoladas de células primárias ou

tumorais (IGNATIUS e CLAES, 1996).

Conforme descreve GÓES et al., (2006) o MTT é um ensaio que

proporciona um modelo simples e eficaz para detectar células vivas e ou em

fase de crescimento sem o uso de elementos radioativos. O princípio do

método é baseado na capacidade das enzimas desidrogenases localizadas nas

mitocôndrias de células viáveis em converter o reagente de coloração amarela

solúvel em água, isto é, o brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazólio (MTT) em um produto de coloração azul escuro (sais de

tetrazólio) o formazan, que é insolúvel em água (MOSMANN, 1983). A

quantidade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de

células viáveis presente no experimento.

De acordo com SANTOS et al., (2007) no ensaio de MTT o sal insolúvel

absorve um comprimento de onda de aproximadamente 570 nm, ele é

proporcional à quantidade de células viáveis, porque somente as células

33

viáveis podem metabolizar o MTT. Assim, somente células que são

metabolicamente normais podem transformar os sais de tetrazólio em cristais

azul escuro.

A vantagem do MTT é a de não utilizar elementos radioativos e sua

leitura ser muito rápida. Os resultados obtidos são consistentes com aqueles

obtidos nos ensaios de proliferação celular que usam a captação de H-timidina

(GÓES et al., 2006).

Após os procedimentos relatados é feita uma análise estatística

conforme figura 3.19.

Figura 3.19: Viabilidade celular medida por MTT.

Fonte: Costa Jr., 2007

3.7.2 Ensaios em SBF

A solução de SBF permite simular os íons contidos no plasma do sangue

humano conforme tabela 3.3 (OYANE et al. 1999), de modo a promover um

ambiente parecido com o organismo fisiológico, propiciando ao material (a

MCCR) um teste com condições próximas do real.

34

Tabela 3.3: Concentração de íons no plasma sanguíneo humano (SBF).

Íon Concentração/Mm Plasma do sangue SBF Na+ 142,0 142,0 K+ 5,0 5,0 Mg2+ 1,5 1,5 Ca2+ 2,5 2,5 Cl– 103,0 147,8

HCO3– 27,0 4,2

HPO42 –

1,0 1,0 SO4

2 – 0,5 0,5

Fonte: OYANE et al., 1999.

3.8 Modificação na Superfície dos Biopolímeros

As modificações de superfície dos biomateriais podem ser divididas em

duas categorias. Ocorrem para uma alteração física ou química de átomos ou

moléculas nas superfícies existentes ou para recobrir uma superfície natural

com um material de diferente composição ou estrutura (filmes, enxertos, etc.).

Alguns objetivos que motivam a modificação de superfícies são, (ORÉFICE,

2006):

• Modificar a hemocompatibilidade

• Afetar a adesão e crescimento celular

• Controlar a adsorção de proteínas

• Aumentar a lubrificação

• Melhorar a resistência à abrasão e corrosão

35

4. METODOLOGIA

4.1 Materiais e Reagentes

A celulose microcristalina usada neste trabalho consistiu de um produto

comercial fornecido pela VISKASE Inc. sob a forma de uma fita, referida como

MEMBRA-CEL™ MC 40×100 ou MCCR (figura 4.1).

Ela é um material hidrofílico fabricado a partir da celulose regenerada e

sua preparação utiliza o processo viscose. Tipicamente este produto é usado

em laboratórios para diálise. Este material é encontrado no mercado na forma

de tubo ou em lâminas.

Figura 4.1: MEMBRA-CEL™ (Membrana e tubo para diálise). Fonte: Viskase Companies, Inc.

Portanto, trata-se de uma celulose microcristalina regenerada e a seguir

são apresentadas as principais características desse produto fornecidas pelo

fabricante.

O peso molecular do material situa-se na faixa de 12.000-16.000 e a

medida do poro é cerca de 25 Å. O nível de contaminantes (enxofre e metais

36

pesados) é desprezível e o material apresenta excelente compatibilidade

química com materiais de uso corrente em biologia molecular e enzimologia,

tais como CaCl2, (NH4)2SO4 e solventes orgânicos aquosos isopropanol, etanol

e acetona. O material apresenta boa resistência a temperatura, podendo ser

fervido ou esterilizado em autoclave e um tubo do material contendo solução

aquosa pode ser congelado.

Quando mantida em água contendo benzoato, ácido benzóico,

formaldeído ou pentaclorofenol, a MEMBRA-CEL apresenta resistência

microbiológica de modo que o crescimento de microorganismos celulolíticos é

impedido. No estado seco, sua capacidade de absorção de proteínas é de

menos que 1,0 nanograma por grama de material. Dadas essas características,

a MEMBRA-CEL apresenta uma ampla variedade de aplicações em

enzimologia e biologia molecular tais como: dessalinização, modificação de

tampões, remoção de traços de inibidores e imobilização enzimática.

Além da MEMBRA-CEL, em alguns testes foi também utilizada uma

outra amostra de celulose microcristalina comercializada sob o nome de

Solucel®. O material foi doado pela empresa Bahia Pulp.

4.2 Procedimentos Experimentais

A Figura 4.2 apresenta um fluxograma destacando as principais técnicas

utilizadas na caracterização da celulose microcristalina. Cada um dos

procedimentos é detalhado a seguir.

37

Figura 4.2: Fluxograma das ferramentas de caracterização para a MCCR.

4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

As amostras foram preparadas utilizando-se cobertura com uma fina

camada de ouro por aspersão com uma baixa taxa de deposição, refrigeradas

e colocadas à máxima distância do alvo para evitar danos nas amostras da

celulose. As dimensões das amostras foram de 1×1cm.

A morfologia da membrana de MCCR foi analisada em um, microscópio

JSM 6360LV, JEOL/Noran acoplado a espectrômetro de energia dispersiva

(EDS). As imagens de elétrons secundários e elétrons retroespalhados foram

obtidas utilizando tensão de aceleração de 10kV e 20kV.

4.2.2 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier

(FTIR)

MEV FTIR DRX MTT

Técnicas de Caracterização de Materiais

MCCR

38

Para verificar os grupos químicos presentes na celulose microcristalina

regenerada foi realizada a análise de infravermelho (IV) utilizando modos de

transmitância e reflexão total atenuada (ATR). Os espectros foram obtidos na

faixa de 4400 a 600 cm-1 após 32 varreduras, com resolução de 2 cm-1 e

intervalo de 1 cm-1 (Paragon 1000 da Perkin Elmer, USA). Os espectros de IV

foram normalizados e as bandas de vibração foram associadas aos principais

grupos químicos. Para esta análise foram cortadas amostras nas dimensões de

1×1 cm.

4.2.3 Difratometria de Raios-X (DRX)

A caracterização da celulose MCCR através da difração de raio-X

(PHILIPS, PW1710) foi obtida a partir da radiação Kα do cobre com

comprimento de onda λ= 1,54056 Ǻ. A análise de DRX foi conduzida com 2θ

variando 3 a 90º com passo de 0,06º. As medidas das amostras foram cortadas

com as dimensões de 1 x 1 cm.

4.3 Ensaios Biológicos

Foram realizados testes biológicos para determinar parâmetros de

citotoxicidade e histocompatibilidade das membranas de MCCR in vitro. Além

desses, foram também realizados ensaios de biodegradação em condições que

simulam o meio fisiológico como a solução de PBS (tampão fosfato de sódio) e

a solução de SBF (Simulação de Fluido Corpóreo).

4.3.1 Teste de Biocompatibilidade

39

Preparo das Amostras

As amostras foram esterilizadas com óxido de etileno (EtO), processo

normalmente de difícil execução devido às inúmeras exigências de controle.

Deve haver uma relação correta entre a concentração de gás, umidade relativa,

tempo de exposição, pressão e temperatura. Qualquer alteração em uma

destas variáveis afetará as outras e implicará na redução da qualidade do

processo. Como o EtO é altamente tóxico, exige cuidados especiais na

manipulação, durante o processo e na remoção de seus resíduos (aeração),

para que se torne seguro para uso. As fases do processo de esterilização

podem ser resumidas da seguinte forma (Fonte: site SBRT, 2007):

• Carregamento da Câmara

• Aquecimento da Câmara

• Programação do Ciclo de Esterilização

• Remoção do Ar por Alto Vácuo

• Injeção do Gás Óxido de Etileno

• Tempo de Exposição

• Remoção do Gás

• Aeração (mecânica, forçada ou quarentena)

Ensaio de Contato - Citotoxicidade

Para os ensaios de biocompatibilidade foram utilizadas células VERO

(ATCC CCL-81 – fibroblastos de rim de macaco - Cercopithecus aethiops –

Macaco Verde Africano). Estas células foram expandidas em Meio Mínimo de

40

Eagle suplementado (2 mM L-glutamina, Sais de Earle - 1.5 g/L bicarbonato de

sódio , 0.1mmol.L-1 de aminoácidos não essenciais e 1.0 mmol.L-1 piruvato de

sódio; 10% de SFB – soro fetal bovino), com adição de antibióticos (10.000

U/ml de Penicilina, 10mg/ml de Estreptomicina, 1mg/ml de Fungizona).

Ensaio de MTT

Após ser transferida para uma placa de cultivo celular de 96 poços, seis

das oito amostras foram tratadas como se segue: 250 μL/poço de meio mínimo

de Eagle sem suplementação foram adicionados e o sistema foi mantido em

uma estufa de CO2 (5%) por 24 h a 37 °C. Em seguida cada poço foi semeado

com 50.000 células em 100 μL de meio mínimo de Eagle e a placa foi colocada

na estufa. Após 24 h, a placa foi tratada com 30 μL/poço de uma solução de

MTT e incubada em estufa por mais 4 h na ausência de luz. Após essa

incubação com MTT, 35 μL/poço de uma solução 10% de SDS em HCl foram

adicionados, a placa foi levemente homogeneizada e reincubada por 14-16h.

Subseqüentemente, os cristais intracitoplasmáticos foram solubilizados por

pipetagem exaustiva, tomando-se cuidado suficiente para impedir qualquer

espumação. As camadas sobrenadantes foram transferidas para outra placa de

ensaios (100 μL de cada poço) e submetida a análise espectrofométrica em

comprimento de onda de 595 nm.

Além dos poços contendo material sob investigação. Foram preparadas

algumas amostras de controle. Poços contendo apenas meio mínimo de Eagle

sem suplementação foram usados como branco; uma solução de 0,1% de

41

Triton X-100 (SIGMA) foi usada como controle positivo e a hidroxiapatita foi

usada como controle negativo.

Fixação celular

Para a microscopia eletrônica, as amostras foram fixadas com 2%

Glutaraldeído por 16 h e desidratada através de uma serie de álcoois (etanol),

mas antes elas foram secas com nitrogênio no reator for 4 h e no dessecador à

vácuo por 12 h.

4.3.2 Ensaios de Biodegradação In vitro (PBS e SBF)

Ensaios de Imersão

Este procedimento prescreve o método para ensaio de degradação da

membrana de celulose microcristalina regenerada (MCCR) nos seguintes

meios:

• Tampão de fosfato de Sódio - PBS

• Fluido de Simulação do Corpo – SBF

Desta forma, o ensaio verifica o percentual de variação de massa sofrida

pela celulose durante intervalos definidos de tempo.

Volume da solução

Para calcular o volume da solução em relação à área do material que foi

imerso ORÉFICE (2000) sugere que esse cálculo deve equivaler a 0,1cm-1,

42

desta forma o volume utilizado para o ensaio de imersão em PBS foi 90 ml de

solução para uma área de 3 x 3cm da amostra de MCCR. E uma área de 0,5 x

0,5 cm para 2,5 mL de solução.

Preparo da solução de PBS

Para o preparo de um litro de solução de PBS (Tampão de fosfato de

Sódio) foi necessário acrescentar 1000ml de água Milli-Q aos reagentes

descritos na tabela 4.1.

Tabela 4.1: Reagentes para a solução de PBS.

Reagentes Quantidade

NaCl 8,0g

KCl 0,2g

Na2HPO4 1,44g

KH2PO4 0,24g

Preparo das amostras de MCCR para imersão em PBS

As amostras foram cortadas em dimensões de 0,5 x 0,5 cm para o

primeiro ensaio e 3 x 3 cm para o segundo ensaio. Foram mantidas em estufa

com 40°C ± 1 por 24 h, de modo a verificar sua variação de massa. Não foi

identificada nenhuma variação de massa significante, desta forma, as amostras

foram pesadas para logo em seguida serem imersas em solução tampão de

Fosfato de Sódio (PBS).

Imersão das amostras em Tampão Fosfato de Sódio (PBS)

43

Os potes para armazenamento das membranas de MCCR foram lavados

e mergulhados durante 30 minutos em 20% de ácido nítrico. Após esse

procedimento, esses potes foram abundantemente lavados com água comum e

depois ambientados com água Milli-Q. Em seguida as amostras foram

mergulhadas em 90 ml de solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS) descrito na

tabela 4.1. A solução foi tamponada com o pH 7,4 a 37°C. Após esses

procedimentos, as amostras de MCCR foram colocadas e mantidas em banho-

maria com 37°C para simular a temperatura do corpo humano. A quantidade

das amostras foi de n=3 para os tempos de 1, 2, 4, 8, 24h na versão do

primeiro ensaio no segundo ensaio foi de n=5 para cada tempo de 4, 24, 96,

120h.

É importante também relatar que as amostras foram lavadas com água

corrente e secadas novamente sendo colocadas em estufa por vinte e quatro

horas com 40ºC.

Preparo da solução de SBF

O procedimento de preparo de SBF (simulador do fluido corpóreo) é feito

através da dissolução dos seguintes reagentes químicos em seqüência

previamente determinada (tabela 4.2 ) NaCl, KCl, K2HPO4.3H2O, MgCl26H2O,

CaCl2 e Na2SO4 junto com 500 mL de água Milli-Q e tampão com o pH 7,4 a

36,5°C com TRIS e um molar de solução de HCl.

Para realizar o preparo da solução de SBF foram seguidas as etapas que

estão relacionadas abaixo:

44

A - Agitar 500mL de água deionizada usando agitador magnético com

aquecimento, mantendo a mistura a 36±1°C. Dissolva os reagentes um a um na

ordem descrita conforme tabela 4.2, sempre depois que cada reagente for

adicionado e estiver completamente diluído (aproximadamente três minutos de

intervalo).

Tabela 4.2: Reagentes para preparo de 1 litro de SBF.

Ordem Reagentes Quantidade 1º NaCl 7,9960 g 2º NaHCO3 0,3500 g 3º KCl 0,2240 g 4º K2HPO4 0,1740 g 5º MgCl26H2O 0,3050 g 6º HCl 40 mL* 7º CaCl2 0,2780 g 8º Na2SO4 0,0710 g 9º TRIS 6,0570 g

*cerca de 90% deve ser adicionado e o restante, quando se ajustar o pH no item B (KOKUBO, 1993)

B - Ajuste a temperatura da solução no béquer para 36±1 °C em banho-

maria e ajuste o pH da solução para 7,4 com agitação, usando a solução de

HCl 1,0 mol.L-1.

C - Transfira a solução para um balão volumétrico de 1000 mL, complete

com água deionizada até a risca do balão volumétrico e agite o balão para

misturar a solução.

D - Transfira a solução do balão para uma garrafa de polipropileno ou

polietileno e guarde em geladeira na temperatura de 7±3oC

Imersão das amostras em Fluido Simulador do Corpo (SBF)

45

Os potes para armazenamento das membranas de MCCR foram lavados

e mergulhados durante 30 minutos em 20% de ácido nítrico. Após esse

procedimento, esses potes foram abundantemente lavados com água comum e

depois ambientados com água Milli-Q. Em seguida as amostras foram

mergulhadas em 90 ml de Fluido Simulador do Corpo (SBF) com concentração

de íons aproximadamente igual a aqueles encontrados no plasma do sangue

humano. Finalizada a solução, ela foi tamponada com pH 7,4 a 37°C com

solução aquosa de HCl 1,0 mol.L-1. Logo após esses procedimentos as

amostras de MCCR foram colocadas e mantidas em banho-maria com cerca de

37 °C, para simular a temperatura do corpo humano. A quantidade das

amostras foi de n=3 para os tempos de 1, 2, 4, 8, 24h na versão do primeiro

ensaio e no segundo ensaio foi de n=5 para cada tempo de 4, 24, 96, 120h.

Índices de degradação da Celulose Microcristalina Regenerada no PBS

Através da massa seca inicial (Msi) e da massa seca final (Msf) foram

verificadas as porcentagens de degradação da membrana de celulose no PBS.

O cálculo do índice de degradação foi feito conforme segue:

100% ×−

=si

sfsi

MMM

ID

Massa Intumescida

46

Através da massa Intumescida (MI) e da massa seca inicial foram

encontrados os graus de intumescimento da celulose MCCR e o cálculo foi

feito conforme equação abaixo (fonte: COSTA JR, 2007e CAVALCANTI et al,

2004)

100% ×−

=si

siI

MMM

Ii

4.4 Modificação Química da Celulose MCCR

A superfície da Celulose Microcristalina Regenerada foi modificada

quimicamente de modo a alterar suas características superficiais e foram

esperados resultados que propiciassem compatibilidade biológica ainda maior

dessa membrana. As substâncias utilizadas para a modificação da MCCR

estão descritas na figura 4.3.

Figura 4.3: Fluxograma dos novos tipos de MCCR.

A solução de Isocianato (denominada solução A) foi obtida adicionando-

se 2,0 mL de 3 (trietoxisilil)propil isocianato 95+% da Aldrich a 20 mL de uma

solução 50% v/v de etanol em água Milli-Q.

A solução de isocianato-arginina (denominada solução B) foi obtida

adicionando-se 250 mg de L-Arginina ≥98% a 250 mL de PBS e tratando-se 2,0

MCCR

MCCR - ISOCIANATO MCCR – ISOCIANATO COM ARGININA

47

mL dessa mistura com 2,0 mL de 3 (trietoxisilil) propil isocianato 95+% da

Aldrich e 20 mL da solução A.

Para efetuar a modificação química, a celulose microcristalina foi cortada

em pequenos quadrados de 1×1 cm e três amostras foram mergulhadas em

cerca de 2,5 mL das soluções de isocianato (A) e isocianato-arginina (B).

Essas misturas foram mantidas durante duas horas em banho-maria a 40ºC.

4.4.1 Ensaios de Degradação

Os estudos de degradação da MCCR foram feitos através da imersão

em SBF das amostras de celulose modificadas quimicamente. Essas amostras

foram imersas em SBF por 24, 72, e 216 horas, sendo mantidas em banho-

maria à temperatura de 37°C.

Os índices de degradação foram calculados por gravimetria, avaliando-

se a diferença entre a massa inicial da celulose modificada e a massa após ser

tratada com SBF, lavada com cerca de 20 mL de água destilada e seca a 40 °C

por 24 h.

48

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Espectroscopia na região do Infravermelho (FTIR)

Os principais grupos presentes na estrutura química da celulose

puderam ser identificados no espectro de FTIR da MCCR, obtido por

reflectância total atenuada (Figura 5.1).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0C-O

C-O-C

CH2C-H

H-O-HH-CO-H 894

1019

1652

1156

13131367

28893338

% A

bsor

banc

ia

Número de onda (cm-1)

Figura 5.1: Espectros IR da Membrana – MCCR.

As atribuições dessas bandas estão resumidas na Tabela 5.1. As

vibrações de estiramento das ligações O–H e C–H aparecem em 3388 e 2889

cm–1 (SUGIYAMA et al, 1991; KONDO, 1997), respectivamente. Ambos os

grupos dão origem a vibrações de dobramento a 1367 cm-1 (CH) e 1313 cm–1

(OH). A banda em 1652 cm–1 pode ser atribuída às vibrações de dobramento

de ligações H–O–H devido a água absorvida (ADEBAJO et al. 2004). A banda

49

de estiramento anti-simétrico de ligações C–O–C em ponte aparece em 1156

cm–1, enquanto outras bandas de estiramento C–O também aparecem em 1019

e 894 cm–1, que podem ser associadas a ligações α-glicosídicas. Os resultados

de FTIR permitiram confirmar que o material se trata de celulose.

Tabela 5.1: Principais bandas no espectro de infravermelho da MCCR

Freqüência (cm-1) Atribuição

3338 Estiramento O–H 2889 Estiramento C–H do grupo CH2 1652 Dobramento de H–O–H absorvida 1418 Dobramento OH e CH2 1367 Dobramento C–H 1332 Dobramento no plano de O–H 1313 Deformação O–H e/ou “abano” de CH2 1199 Dobramento no plano de O–H 1156 Estiramento anti-simétrico da ligação em ponte C–O–C da celulose 1019 Estiramento C–O da celulose 894 Ligações β-glicosídicas da celulose 700 Dobramento fora do plano de O–H 668 Dobramento fora do plano de O–H

5.2 Difratometria de Raios-X

De acordo com BORYSIAK e DOCZEKALSKA (2005) os planos das

moléculas da celulose são alinhados aproximadamente na direção 101 e essas

mudanças estão associadas com mudanças nas ligações do hidrogênio. A

geometria da celulose nativa é monoclínica e apresenta os seguintes

parâmetros a = 8,3 Å, b = 10,3 Å, c = 7,9 Å, β = 84°.

Segundo ABE e YAMAMOTO (2005) o pico máximo para (200) ocorreria

a menos de 22°. Dois tipos diferentes de posições cristalográficas têm sido

relatados para células unitárias monoclínicas da celulose nativa, segundo

SUGIYAMA et al. (1991) e MEYER e MISCH (1937). Dependendo da posição

50

da célula monoclínica e do entrelaçamento dos planos, por exemplo, a difração

dos picos 14.7°, 16.1° e 22.5° (2θ) da celulose nativa polimórfica pode ser

designada como (1–1 0), (110), (200) (MANSIKKAMÄKI, 2007).

0 20 40 60 80 100

100

200

300

400

500

600

21,80°

12,81°_

(200)

(101)

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

2 θ (graus)

Figura 5.2: Difratograma da MCCR identificando principais picos.

O difratograma de raios-X da MCCR (Figura 5.2) apresentou dois picos

proeminentes, um em 12,81° e outro em 21,80°, que podem ser associados

respectivamente aos planos (–1 01) e (200).

A partir do difratograma da MCCR, a área sob os picos correspondendo

tanto às regiões cristalinas (Figura 5.3) como às amorfas foi calculada

utilizando-se o programa Origin® v. 7.5, de modo que o grau de cristalinidade

pode ser estimado.

51

0 20 40 60 80 100

100

200

300

400

500

600

Inte

nsid

ade

(u.a

)

2 Theta (graus)

Figura 5.3: Difratograma da MCCR, destacando as regiões cristalina e amorfa.

Tabela 5.2: Resultados dos percentuais das regiões amorfa e cristalina

Região Cálculo % Resultado

% amorfa 10049,750.892,059.8

× 92%

% cristalina 10049,750.8

57,690× 8%

Conhecendo-se a área total sob curva fornecida pelo programa, assim

como a área sob a região amorfa (Tabela 5.2), o grau de cristalinidade foi

estimado relacionando-se as áreas cristalina e amorfa, em termos percentuais

resultando em aproximadamente 8%. O valor obtido indica que a celulose

microcristalina utilizada neste trabalho é essencialmente um material amorfo.

52

5.3 Ensaios Biológicos

5.3.1 Ensaio de MTT da celulose Solucel®

As Figuras 5.4 e 5.5 apresentam os resultados dos testes feitos com a

Solucel comparada a hidroxiapatita como controle negativo. Como controle

positivo foi utilizado o Triton X-100 0,1%. As amostras da Solucel apresentaram

um desempenho superior ao do controle celular (CC) e também apresentaram

uma grande diferença entre o controle positivo (Triton X-100 0,1%) que é

tóxico, desta forma temos um ótimo resultado quanto à viabilidade celular da

celulose da marca Solucel®.

Figura 5.4: Estatística do ensaio de MTT da celulose Solucel®.

53

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Solucel HA CC Triton

Abs

orbâ

ncia

595

nm.

Figura 5.5: Histograma da viabilidade de células Vero com a Solucel®.

A Figura 5.6 mostra fotografias tiradas em um microscópio ótico das

células VERO (a) e dessas mesmas células crescendo sobre o controle

hidroxiapatita (b), durante os ensaios MTT. Embora a hidroxiapatita apresente

agregados de pó, em ambas as imagens podem ser identificados cristais de

metilformazan no interior do citoplasma das células. Essas imagens

representam uma situação mais favorável ao crescimento celular.

(a) (b)

Figura 5.6: Microscopia por luz transmitida: (a) Imagens do crescimento das células VERO (b) células sobre a hidroxiapatita em forma de agregados de pó,

após os ensaios MTT.

54

Para efeito de comparação, a Figura 5.7 apresenta imagens do controle

efetuado com Triton X-100 0,1%, mostrando a morfologia das células mortas,

com um aspecto circular, sem nenhuma confluência.

Figura 5.7: Células no Controle positivo (Triton X-100 0,1%).

A Solucel apresenta um aspecto rugoso e não homogêneo, com pouco

ou nenhum poro em sua estrutura (Figura 5.8). O ensaio de MTT mostrou a

viabilidade desse material no contato celular, o que foi comprovado pela

presença de cristais de metilformazan no interior das células (Figura 5.8a).

Essas imagens mostram ainda uma confluência perfeita da monocamada

celular, demonstrada pela ausência de espaços e pela forma “esticada” das

células, com um aspecto fusiforme (Figura 5.8b).

(a) (b)

Figura 5.8: Imagens da Solucel, mostrando as células viáveis (a) cristais de metilformazan e (b) aspecto fusiforme.

55

A Figura 5.9 mostra uma série de micrografias da Solucel com cultura

celular em várias ampliações. As imagens demonstram claramente a estrutura

fibrosa do material, com fibras de 10 a 20 μm de diâmetro.

Figura 5.9: Fotomicrografias de MEV da Solucel com cultura celular viva (seta) em ampliações de 150, 1000, 3000 e 4000×.

5.3.2 Ensaio de MTT da celulose MCCR

Os ensaios de MTT forneceram resultados bastante significativos em

relação à viabilidade da celulose microcristalina (MCCR). A Figura 5.10 mostra

que o material analisado apresentou um desempenho aproximado ao do

controle HA e bem superior ao do controle positivo (Triton X-100 0,1%), nas

condições do ensaio de MTT. Esses resultados são bastante encorajadores e

56

comprovam a grande importância da celulose microcristalina como um

biomaterial.

Viabilidade Celular/ensaio de contato - Células VERO x MTT

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,65

Mic

rocr

ista

lina

Cce

lula

r

HA

Trito

nX10

0/0,

1%

Abs

orbâ

ncia

(595

nm)

Figura 5.10: Histograma da viabilidade de células Vero com a MEMBRA-CEL™.

Figura 5.11: Estatística do ensaio de MTT da celulose MEMBRA-CEL™.

Quando os dados são analisados em termos estatísticos, os resultados

são ainda melhores (Figura 5.11). Nessas análises o parâmetro p indica o

índice de confiança e não houve diferença significativa entre o comportamento

Viabilidade de células VERO em ensaio de contato com microcristalina

100

74

5

72,36

0102030405060708090

100

CC

HA

Trito

nX10

0/0,

1%

Mic

rocr

ista

lina

Viab

ilida

de (%

)

57

da celulose microcristalina e HA (p>0,05), porém, houve diferença entre HA /

microcristalina e o controle celular (p<0.05). A diferença estatística entre

microcristalina e Triton X 100/0,1% foi bem mais acentuada (p<0,001). A

hidroxiapatita é um dos biomateriais mais biocompatíveis, tanto que é utilizada

como controle celular. Pelos resultados estatísticos é possível perceber,

portanto, que o comportamento da celulose microcristalina é bem superior ao

controle positivo e muito similar ao da hidroxiapatita no contato celular, o que

confirma a sua viabilidade.

Essa viabilidade foi comprovada ainda pela análise do material no

microscópio ótico. A Figura 5.12 mostra células VERO do controle celular e do

controle hidroxiapatita vistas ao microscópio. Os pontos escuros correspondem

a cristais de metilformazan no interior do citoplasma de células viáveis (setas

vermelhas) e representam a situação ideal.

(a) (b)

Figura 5.12: Microscopia ótica do Controle Celular (a) e da hidroxiapatita (b).

As amostras da MEMBRA-CEL também mostraram a formação de

cristais de metilformazan no interior do citoplasma celular de células viáveis

conforme indicado pelas setas na figura 5.13.

58

Figura 5.13: Microscopia ótica da MEMBRA-CEL com células viáveis.

A Figura 5.14 mostra uma série de micrografias da MCCR com cultura

celular em várias ampliações, vistas ao microscópio eletrônico. Essas imagens

complementam os resultados apresentados para microscopia ótica, mostrando

agregados de células aderidas nas membranas de MCCR.

Figura 5.14: Fotomicrografia por MEV da MCCR com cultura celular em ampliações de 3000 e 4000x.

59

5.3.3 Índice de degradação da MCCR

O índice de degradação da MCCR foi determinado tanto em PBS

(tampão fosfato de sódio) como no SBF e os resultados são mostrados na Fig.

5.15. Em PBS o material apresentou um percentual de degradação de

aproximadamente 15% até 4 horas e de 25% no período de 24 horas, à

temperatura de 37°C. Já no SBF a média foi de 15 % até 4 horas e 9% no

período de 24 horas. Esses percentuais são bastante significativos, pois

indicam que a celulose microcristalina regenerada se degrada num período

muito curto.

0 2 4 240

5

10

15

20

25

30

PBS

Indi

ce d

e D

egra

daçã

o (%

)

Tempos individuais de degradação (h)

0 5 20 250

5

10

15

20

25

30

SBF

Índi

ce d

e de

grad

ação

no

SBF

(%)

Tempos individuais de degradação (h) Figura 5.15: Índice de degradação das amostras de MCCR no PBS e SBF.

60

Os índices de intumescimento da MCCR também foram determinados

tanto em PBS como em SBF, e os resultados são apresentados na Figura 5.16.

De modo geral, a membrana de celulose apresentou maior grau de

intumescimento no SBF em relação ao PBS.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28048

12162024283236404448525660

PBS

Gra

u de

intu

mes

cim

ento

no

PBS

%

Tempos individuais de intumescimento (h)

0 2 4 6 8 22 240

10

20

30

40

50

60

70 SBF

Gra

u de

Intu

mes

cim

ento

no

SB

F %

Tempos individuais de Intumescimento (h)

Figura 5.16: Grau de intumescimento de MCCR no PBS e no SBF.

Tanto nos ensaios de degradação como nos de intumescimento

apresentados, observou-se que as medidas possuíam um desvio padrão

considerável. Isso ocorreu principalmente por que as massas utilizadas

estavam muito próximas ao próprio erro da balança. A fim de se minimizar esse

61

problema, os ensaios foram repetidos e algumas modificações foram

introduzidas.

Nessa segunda bateria de ensaios foram utilizadas amostras com

dimensões maiores, bem como um número maior de amostras, que passaram

de n=3 para n=5. Além disso, o intervalo de tempo dos ensaios foi aumentado

para 120 horas.

0 20 80 100 1200

2

4

6

8

10

12

14

16PBS

índi

ce d

e de

grad

ação

no

PBS

%

Tempos individuais de degradação (h)

0 15 30 90 105 1200

2

4

6

8

10

12

14

16 SBF

índi

ce d

e de

grad

ação

no

SB

F %

Tempos individuais de degradação (h)

Figura 5.17: índice de degradação das amostras MCCR no PBS e no SBF.

62

Os resultados do ensaio de degradação da membrana em PBS e SBF

sob essas novas condições estão mostrados na Figura 5.17. Além dos erros

observados terem sido menores, observou-se que não houve uma variação

muito grande na média dos índices de degradação, que apresentaram um

percentual de aproximadamente 12 a 14% de perda de massa da membrana

de celulose no período de 4 a 120 horas na temperatura de 37°C. tanto em

PBS como em SBF.

Esses resultados forneceram um índice mais confiável e com

percentuais de degradação mais significativos, uma vez que os desvios

padrões foram menores em comparação aos da primeira bateria de ensaios.

0 15 30 90 105 1200

10

20

30

40

50

60

70 PBS

Gra

u de

Intu

mes

cim

ento

no

PBS

%

Tempos individuais de Intumescimento (h)

0 15 30 90 105 1200

10

20

30

40

50

60

70

SBF

Gra

u de

Intu

mes

cim

ento

no

SB

F %

Tempos individuais de Intumescimento (h)

Figura 5.18: Grau de intumescimento das amostras MCCR no PBS e no SBF.

63

Os resultados dos ensaios de intumescimento em PBS e SBF foram

ainda mais confiáveis, não só por causa dos desvios padrões menores, mas

também por que os valores foram praticamente idênticos nos dois casos

(Figura 5.18). Tanto no PBS como no SBF o grau de intumescimento ficou na

faixa entre 55 e 60%. É importante lembrar que após 120 h, cerca de 15% do

material já está degradado, de modo que faixa de grau de intumescimento

dever ser maior.

5.4 Modificação Química da celulose

Os ensaios de degradação em SBF das amostras de celulose MCCR

modificadas com 3 (trietoxisilil) propil isocianato 95+% da Aldrich e L- Arginina

≥98% da Sigma, não forneceram resultados que permitissem uma avaliação do

grau de degradação da mesma. Em algumas amostras, após 40 dias a 37 °C

ocorreu deposição de um sólido sobre a superfície da celulose, provavelmente

devido à precipitação dos sais que foram adicionados na solução do SBF. Isso

contribuiu para que se obtivessem valores maiores para a massa final,

produzindo valores negativos para o percentual de degradação.

Ao contrário dos ensaios de degradação, os resultados dos ensaios de

intumescimento foram mais coerentes. As amostras de celulose modificada

com isocianato apresentaram o grau de intumescimento de 54% em SBF

enquanto que para as modificadas com isocianato-arginina esse valor ficou em

torno de 49%.

Comparando-se esses resultados com aqueles obtidos para a celulose

não modificada, pode-se concluir que a modificação química não provocou

64

mudanças significativas no grau de intumescimento da MCCR. Entretanto o

comportamento frente à degradação foi bastante afetado, embora não tenha

permitido uma avaliação quantitativa desse efeito.

6. CONCLUSÃO

• As análises microscópicas mostraram diferenças morfológicas entre a

Solucel® e a membrana de celulose microcristalina regenerada, sendo esta

mais homogênea que a primeira.

• Através da espectroscopia de infravermelho (FTIR), pode-se constatar que

o material utilizado apresenta grupos funcionais típicos de compostos

celulósicos.

• Através de análise por difratometria de raios-X, foi possível constatar que o

material utilizado apresenta cerca de 8% de cristalinidade.

• Os ensaios biológicos de MTT indicaram que a MCCR apresenta

importantes características que são pertinentes a um biomaterial, com uma

significativa tolerância em meio fisiológico e uma baixa toxicidade. Foi

possível ver, através do microscópio, as células vivas no material, indicando

que se trata de substância inerte ao organismo.

• Os testes com PBS e SBF indicaram que houve uma degradação

significativa do material, o que tornaria possível sua aplicação na

cicatrização de feridas crônicas.

• Os resultados são bastante promissores na medida em que o índice de

degradação acompanhou o comportamento do meio fisiológico, abrindo a

65

possibilidade para o crescimento do tecido de granulação, que é o local

onde ocorre todo o processo de cicatrização.

• Os resultados atestam a potencialidade do material para estudos iniciais de

engenharia de tecido no sentido de auxiliar o processo de cicatrização.

• Os produtos da modificação química com isocianato e arginina, não

apresentaram índices significativos de degradação, porém o percentual de

intumescimento da celulose se manteve com cerca de 50% . Desta forma

podemos afirmar que a membrana de MCCR é um material com um bom

potencial na relação biológica com razoáveis características de absorção

líquida, apesar de ainda não ser possível garantir sua degradação na pele

humana de forma a mimetizar o processo cicatricial natural.

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Estudos in vivo (animais) visando avaliar as aplicações do material em

situações de cicatrização de feridas a fim de investigar sua capacidade de

mimetizar as funções da pele, de modo a monitorar ao longo do tempo os

mecanismos fisiológicos (8, 24, 72 e 144 horas).

66

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AI, S., KUZUYA, M., IGUCHI, A., “Neutrophil elastase in pressure ulcer fluid degrades fibronectin in the exudates”, Geriatrics and Gerontology International, 4: pp.141-145, feb. 2004.

ABE K., YAMAMOTO H. Mechanical interaction between cellulose microfibril and matrix substance in wood cell wall determined by X-ray diffraction. The Japan Wood Research Society 51, 334-338, 2005.

BEHRENS M. D., NETTO-FERREIRA J. C. Fotoquímica de α,α-dimetilvalerofenona adsorvida em celulose microcristalina Química Nova vol.29 nº1 São Paulo Jan./Feb., 2006.

BORYSIAK S. DOCZEKALSKA B. X-ray Diffraction study of pine wood treated with NaOH. Fibres & Textiles in Eastern Europe, vol. 13, n°5 – 53, 2005.

CABRAL R. H. Atlas do corpo Humano. Vol. 5, Sistema Nervoso – Os cinco sentidos, 2006.

CAVALCANTI O. A., ROSINA C. R., BARONI S. Avaliação das propriedades de intumescimento e permeabilidade de filmes isolados de polimetacrilato contendo polissacarídeo da raiz de lótus (Nelumbo nucifera) Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, vol.40, nº 3, 425-431, 2004.

CLARK, R.A.F. Cutaneous tissue repair. Basic biologic considerations. J Am Acad Dermatol;13:701, 1985.

COSTA JR. E. S., STANCIOLI E. F. B., MANSUR H. S. Degradação, citotoxicidade e viabilidade celular de Blendas de quitosana/poli(álcool vinílico) Reticuladas com glutaraldeído para aplicação em Engenharia de tecido. 2007.

DOELKER, E. Drug Dev. Industry Pharmacy. 19: 2399-2471, 1993.

DOILLON, C.J., DUNN M.G., BENDER E., et al. Collagen fiber formation in repair tissue. Development of strength and toughness Collagen Rel Res; (5):481, 1985.

ERENO D. Curativo de Borracha. Revista Pesquisa Fapesp, nº:88, junho de 2003, disponível no site: http://www.fapesp.org.br.

FAZIO M.J., ZITELLI J.A., GOSLEN J.B. Cicatrização de feridas. In: Coleman III WP, Hanke CW, Alt TH, Asken S. Cirurgia Cosmética - Princípios e Técnicas. 2.ed. Rio de Janeiro: Revinter, 18-23, 2000.

GIL, M.H., FERREIRA, P. Polissacarídeos como biomateriais. Química 100; 72-74, 2006.

67

GOES A. M., LOPES M. T. P., MARA R. M. M. T., SALAS C. E., Testes in vitro com biomateriais e citotecnia. Biomateriais - Fundamentos e aplicações, 1ª ed. Ed. Cultura Médica, Cap. 11. RJ, 2006.

GRACH F. C. Incorporação de resíduos de embalagens pós-consumo provenientes das agroindústrias na fabricação de bandejas de polpa moldada. Dissertação de mestrado do Curso de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Santa Catarina. 2006

GRINNEL, F., BILLINGHIAM R. E., BURGESS L. Distribution of fibronectin during wound healing in vivo. J Invest Dermatol;(76):181, 1981.

HOERSTRUP, S. P., VACANTI, J.P. Tissue Engeneering. In Biomaterials Science – An Introduction to Materials in Medicine, 2nd Edition. USA, pp. 712-717, 2004

HOPKINS A., DEALEY C., BALE S., DEFLOOR T. & WORBOYS FS. Journal of Advanced Nursing 56(4), 345–353, 2006.

HUTCHENS S. A., BENSON R.S., EVANS B. R., ONEIL H. O., RAWN C. J. Biomimetic synthesis of calcium-deficient hydroxyapatite in a natural hydrogel. Biomaterials 27, 4661-4670, 2006.

http:// www.fmc.com (Dezembro de 2007)

http:// www.bahiapulp.com.br (Dezembro de 2007)

http:// www.viskase.com (Setembro de 2007)

http:// www.sbrt.com.br (Janeiro de 2008)

IGNATIUS A. A., CLAES L. E. In vitro biocompatibility of bioresorbable polymers: poly(L, DL- lactide) and poly(L-lactide-co-glycolide). Biomaterials, 17 Pp: 831-839, 1996.

IRION, G. L., Feridas: novas abordagens, manejo clínico e atlas em cores. Tradução: João Clemente Dantas do Rego Barros, revisão técnica Sônia Regina de Souza, Guanabara Koogan, Rio de janeiro, 2005.

JUNQUEIRA L. C., CARNEIRO, J., Histologia Básica, 10ª ed. Rio de Janeiro, 2004.

KOKUBO T. A/W Glass-ceramic: processing and properties. In: Hench LL, Wilson J, editors. An introduction to bioceramics. Singapore: World Sci, 75-88, 1993.

KONTTURI E., THUNE P. C., ALEXEEVA., NIEMANTSVERDRIET. Introducing open films of nanosized cellulose-atomic force microscopy and quantification of morphology. Polymer 46, 3307-3317. 2005.

KONDO T. The assignment of IR absorption bands due to free hydroxyl groups in cellulose. Cellulose 4, 281-292, 1997.

68

LEVY I., PALDI, T., SHOSEYOV, O., Biomaterials 25, pp. 1841–1849, 2004. LOPES W. A., FACIO M. Esquema para interpretação de espectros de

substâncias orgânicas na região do infravermelho. Química nova vol. 27 n° 4, 670-673, 2004.

MANDELBAUM S. H., DI SANTIS, E. P., MANDELBAUM M. H. S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares – Parte II. Anais Brasileiros de Dermatologia, vol.80 nº.4 RJ July/Aug., 2003.

MANSIKKAMAKI P., LAHTINEN M., RISSANEN K. The conversion from cellulose I to cellulose II in Na OH mercerization performed in alcohol-water systems: An X-ray powder diffraction study. Carbohydrate Polymers 68, pp 35-43, 2007.

MANSUR H. S., OREFICE R. L., PEREIRA, M. M. Biomateriais - Fundamentos e aplicações, cap.07 – pp 187-235 - 1ª ed. Ed. Cultura Médica, RJ, 2006.

MARQUES A. P., REIS R.L., HUNT J.A. The biocompatibility of novel starch-based polymers and composites: in vitro studies. Biomaterials 23. Pp: 1471 – 1478, 2002.

MEYER K., MISCH L. Positions des atomes dans le nouveau modele spatial de la cellulose. Helvetica Chimica Acta, 20, 232-244, 1937.

MIYAMOTO T., TAKAHASHI S., ITO H., INAGAKI H. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. J. Biomed. Mater. Res. 23, 125-133,1989.

MIHRANYAN A., LIAGOSTERA A. P., KARMHAG R., STROMME M., EK R. Moisture sorption by cellulose powders of varying crystallinity. International journal of pharmaceutics 269, 433-442, 2004.

MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays J. Immunol. Methods. 65. Pp: 55-63, 1983.

OH, S. Y. YOO I. D., SHIN Y., KIM H. C., KIM H. Y., CHUNG Y. S., PARK W. H., YOUK J. H. Crystalline structure analysis of cellulose treated with sodium hydroxide and carbon dioxide by means of X-ray diffraction and FTIR spectroscopy. Carbohydrate RESEARCH 340, 2376-2391, 2005.

OREFICE R. L., PEREIRA, M. M., MANSUR, H. S. Biomateriais - Fundamentos e aplicações, 1ª ed. Ed. Cultura Médica, RJ, 2006.

OREFICE R. L., Hench L. L., Brennan A. B. In Vitro Bioactivity of Polymer Matrices Reinforced with a Bioactive Glass Phase. Jornal Brasileiro da Sociedade de Química, Vol. 11, No. 1, pp. 78-85, 2000.

ORTONNE, JP, CLÉVY JP. Physiologie de la cicatrisation cutanée. Ver Prat; 44(13): 1733-4, 1994.

69

OYANE A., NAKANISHIK., KIM H-M., MIYAJI F., KOKUBO T., SOGA N., NAKAMURA T. Sol-gel modification of silicone to induce apatite-forming ability . Biomaterials 20, pp. 79-84. Japan, 1999.

PASQUALOTO K. F.M., FUNCK J. A. B., SILVA F. E. B., KRATZ C. P. Revista Brasileira de Farmácia, 86(1): 31-34, 2005.

PISCITELLI, A. A. M. Mecanismos Físico-químicos da Interface Argamassa modificada com polímeros/Cerâmica de revestimentos. Proposta de doutorado do curso de pós-graduação em Engenharia Metalúrgica e de Minas. Belo Horizonte, 2004, pp. 97-133.

RABKIN E., HOERSTRUP S.P., AIKAWA M., MAYER J. E., JR., and SCHOEN, F.J. Evolution of cell phenotype and extracellular matrix in tissue-engineered heart valves during in-vitro maturation and in-vivo remodeling. J. Heart Valve Dis. 11:308-314; discussion 314, 2002.

RAMAKRISHNA S., MAYER J., WINTERMANTEL E., KAM W.L. Biomedical applications of polymer-composite materials: a review. Composites Science and technology, vol. 61, pp.1189-1224, 2001.

RATNER B. D., HOFFMAN A. S., SCHOENF. J., LEMONS J. E., Biomaterials Science – An Introduction to Materials in Medicine, 2nd Edition. USA, 2004.

RISBUD, M.V., BHONDE, R.R. Suitability of cellulose molecular dialysis membrane for bioartificial pancreas: In vitro biocompatibility studies. J. Biomed. Mater. Res. 54, 436–444, 2001.

RIZO, L. R., Sistema de mapeamento de pressão. In TEIXEIRA, E., Terapia Ocupacional na Reabilitação Física. São Paulo: Roca, 2003.

ROCHA M. F. G. Análise e caracterização do polietileno de ultra-elevado peso molecular para aplicação em prótese total de joelho. Dissertação de mestrado do CPGEM – UFMG - 2006.

SANTOS M. H., VALERIO P., GOES A.M., LEITE M.F., HENEINE L. G. D., MANSUR H. S. Biocompatibility evaluation of hydroxyapatite/collagen nanocomposites doped with Zn+2. Biomedical Materials 2. Pp: 135-141, 2007.

SILVA, S. N., Notas de aula da disciplina Engenharia de tecidos, 2006.

SOCRATES, G. Infrared and Raman characteristic Group Frequencies – Tables and Charts; John Wiley & Sons: Chippenha. England, 2001.

SUGIYAMA J., VUONG R., CHANZY H. Electron diffraction study on the two crystalline phases occurring in native cellulose from an algal cell wall. Macromoléculas, 24, 4168-4175, 1991.

THOMAS D. R. Are all pressure ulcers avoidable? J Am Med Dir Assoc.; 2, 297-301. 2001

70

THOMAS D. R. Prevention e treatment of Pressure Ulcers. J. Am. Med. Dir. Assoc.; 7, 46-59, 2006.

VAN, W. W. The fibroblast in wound healing. Surg Ginecol Obstet; (124):369, 1967.

WILLIAMS, D. F., Definitions in biomaterials. Proceedings of a consensus Conference of the European Society for biomaterials, Chester , England, march 3-5, 1986, vol. 4, Elsevier, NY, 1987.

WHITTINGTON K., PATRICK M., ROBERTS JL. A national study of pressure ulcer prevalence and incidence in acute care hospitals. J Wound Ostomy Continence Nurse; 27: 209-215, 2000.

YANNAS, I. V. Natural Materials. Classes of Materials Used in Medicine - In Biomaterials Science – An Introduction to Materials in Medicine, 2nd Edition. Cap. 02 - Pp. 127, USA, 2004.