Dissertacao UFMG Mel

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE VETERINÁRIA Colegiado dos Programas de Pós-Graduação DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM MEL DE ABELHAS (Apis sp) POR CROMATOGRAFIA DE FASE GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS Carla Martins Pittella Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG 2009

Transcript of Dissertacao UFMG Mel

  • UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

    ESCOLA DE VETERINRIA

    Colegiado dos Programas de Ps-Graduao

    DETERMINAO DE RESDUOS DE PESTICIDAS EM MEL DE

    ABELHAS (Apis sp) POR CROMATOGRAFIA DE FASE GASOSA

    ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS

    Carla Martins Pittella

    Belo Horizonte

    Escola de Veterinria - UFMG

    2009

  • Carla Martins Pittella

    DETERMINAO DE RESDUOS DE AGROTXICOS EM MEL DE ABELHAS (Apis sp) POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS

    Dissertao apresentada Escola de Veterinria da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincia Animal. rea de concentrao: Tecnologia e Inspeo de Produtos de Origem Animal Orientador: Prof. Dr. Leorges Moraes da Fonseca Co-orientador: Prof. Dr. Robson Jos de Cassia Franco Afonso

    Belo Horizonte

    Escola de Veterinria UFMG 2009

  • 2

    P688d Pittella, Carla Martins, 1963-

    Determinao de resduos de agrotxicos em mel de abelhas (Apis sp) por cromatografia

    gasosa acoplada espectrometria de massas / Carla Martins Pittella. 2009.

    117 p. : il. Orientador: Leorges Moraes da Fonseca

    Co-orientador: Robson Jos de Cassia Franco Afonso

    Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinria

    Inclui bibliografia

    1. Mel Anlise Teses. 2. Alimentos Contaminao Teses. 3. Agrotxicos

    Teses. 4. Anlise cromatogrfica Teses. 5. Espectrometria de massa Teses. I. Fonseca,

    Leorges Moraes da. II. Afonso, Robson Jos de Cssia Franco. III. Universidade Federal de

    Minas Gerais. Escola de Veterinria. IV. Ttulo.

    CDD 641.38

  • Dissertao defendida e aprovada em 28/05/2009 pela Banca Examinadora constituda por:

    __________________________________________________ Prof. Dr. Leorges Moraes da Fonseca

    Orientador

    __________________________________________________ Prof. Dr. Renaldo Travassos Martins

    __________________________________________________ Profa. Dra Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiroz

    __________________________________________________ Profa. Dra Marlia Martins Melo

  • Ao meu marido Robson

  • Agradecimentos

    Ao Prof. Dr. Leorges Moraes da Fonseca pela orientao e por disponibilizar os recursos para a realizao deste trabalho. Ao Prof. Dr. Renaldo Travassos Martins pela orientao e pela confiana depositada durante o curso. Ao meu querido co-orientador, Prof. Dr. Robson de Cassia Franco Afonso, agradeo com particular referncia, pelo incentivo, pela orientao, pelo apoio irrestrito e, principalmente, pela tica na conduo do trabalho sem a qual no seria possvel a sua realizao. Ao Jlio Csar Cardoso da Silva pela preciosa contribuio, pela pacincia e pelos longos fins de semana de trabalho no Laboratrio de Caracterizao Molecular. Um agradecimento especial futura Dra. Karyne Mourth de Miranda pelo grande incentivo para o comeo deste trabalho. s amigas Christiane Contigli,. Ins Tristo, Patrcia Pimentel e Mrcia Helena dos Santos pelas correes e sugestes da parte escrita e pelo carinho nas horas mais difceis. Aos colegas do Setor de Biotecnologia e Tecnologia Qumica do Cetec, Maria Emlia, Darci, Graa, Luciene, Ilton, Paulo Gilberto, Anali, Iolanda e Eliseu pela colaborao nas atividades no Cetec. Aos colegas do Setor de Medies Ambientais do Cetec, Vagner Fernandes Knnup e Gleidiane, pela disposio em ajudar sempre. Coordenadora do Colegiado de Ps-Graduao da Escola de Veterinria Profa. Dra. Marlia Martins Melo pelo apoio. todas as Cooperativas, as Associaes e aos produtores pela colaborao no envio das amostras de mel para esta pesquisa. Eliane Hooper do Instituto Mineiro de Agropecuria (IMA) e Jorge Ghelli da SOUZA CRUZ/RS pelo cesso dos padres de agrotxicos utilizados neste trabalho. Fundao Centro Tecnolgico de Minas Gerais/CETEC pelo apoio para a execuo de grande parte dos trabalhos experimentais.

  • Ao Laboratrio de Caracterizao Molecular/Espectrometria de Massas da UFOP que disponibilizou muitos dos recursos humanos, materiais e equipamentos necessrios a execuo do projeto. Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPEMIG pela Bolsa de Mestrado do Programa de Capacitao de Recursos Humanos concedida. Shimadzu do Brasil pelo apoio. Aos meus pais, Carlos e Marise, pelo carinho, pela dedicao e pelo apoio para que eu pudesse conciliar todas as minhas tarefas. Aos meus filhotes Marcelo, Guilherme, Pedro e Lucas, pelo amor e pela compreenso nos momentos de ausncia. A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contriburam para a execuo dessa Dissertao de Mestrado.

  • SUMRIO

    RESUMO.......................................................................................................................15

    ABSTRACT...................................................................................................................16

    1 INTRODUO ............................................................................................................17

    2 REVISO BIBLIOGRFICA SOBRE ASPECTOS RELACIONADOS

    QUALIDADE DO MEL DE ABELHAS E TCNICAS APLICADAS NAS

    DETERMINAES DA AUTENTICIDADE E DE CONTAMINANTES............18

    2.1 DEFINIO E CLASSIFICAO DO MEL...............................................................18

    2.2 PRODUO E EXPORTAO DE MEL NO BRASIL E NO MUNDO ...................19

    2.3 LEGISLAO................................................................................................................21

    2.4 COMPOSIO E CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS DO MEL ..................21

    2.5 PRINCIPAIS FONTES DE ADULTERAO .............................................................24

    2.5.1 Adulterao com xaropes ...............................................................................................24

    2.5.2 Certificao da origem botnica .....................................................................................24

    2.5.3 Compostos volteis..........................................................................................................25

    2.6 CONTAMINAO DO MEL POR ANTIBITICOS..................................................25

    2.7 CONTAMINAO DO MEL POR AGROTXICOS.................................................27

    2.7.1 Histrico e definio........................................................................................................27

    2.7.2 Classificao....................................................................................................................27

    2.7.3 Toxicidade ......................................................................................................................29

    2.7.4 Resduos de agrotxicos em mel ....................................................................................29

    2.7.5 Limites Mximos de Resduos (LMRs) ........................................................................32

    2.7.6 Anlises multirresduo para deteco de agrotxicos.....................................................33

    2.7.7 Tcnicas de extrao e concentrao ..............................................................................34

    2.7.8 Tcnicas para determinao de resduos de agrotxicos ................................................35

    2.7.9 Efeito matriz ...................................................................................................................46

    2.8 VALIDAO DA METODOLOGIA ...........................................................................46

    2.8.1 Linearidade e curva analtica ..........................................................................................46

    2.8.2 Exatido ..........................................................................................................................47

    2.8.3 Preciso...........................................................................................................................47

    2.8.4 Limite de deteco e limite de quantificao..................................................................47

    2.9 SNTESE DA REVISO DA LITERATURA ..............................................................47

    9

  • 3 MATERIAL E MTODOS .........................................................................................48

    3.1 REAGENTES..................................................................................................................48

    3.2 AMOSTRAS ..................................................................................................................49

    3.3 AGROTXICOS SELECIONADOS ............................................................................49

    3.4 TESTE DE SOLVENTES PARA PREPARO DE SOLUES ANALTICAS DE

    AGROTXICOS ...........................................................................................................50

    3.5 PREPARO DAS SOLUES ANALTICAS EM SOLVENTE ..................................50

    3.6 PREPARO DAS SOLUES ANALTICAS EM EXTRATOS DA MATRIZ

    COMPOSTA ..................................................................................................................51

    3.7 ESTABELECIMENTO DAS CONDIES CROMATOGRFICAS.........................51

    3.8 AVALIAO DOS PROCEDIMENTOS DE EXTRAO.........................................53

    3.8.1 Extrao em fase slida com cartucho C18 (SPE C18)...............................................53

    3.8.2 Extrao QuEChERS modificado:...............................................................................53

    3.8.3 Extrao lquido-lquido:.................................................................................................53

    3.9 AVALIAO PRELIMINAR DOS RENDIMENTOS DOS

    PROCEDIMENTOS DE EXTRAO..........................................................................54

    3.10 ESTABELECIMENTO DE CURVAS ANALTICAS NA MATRIZ...........................54

    3.11 VALIDAO DA METODOLOGIA ...........................................................................55

    3.11.1 Testes de ndice de recuperao .....................................................................................55

    3.12 DETERMINAO DE RESDUOS DE AGROTXICOS EM AMOSTRAS............55

    4 RESULTADOS E DISCUSSO..................................................................................55

    4.1 CARACTERIZAO DAS AMOSTRAS.....................................................................55

    4.2 TESTE DE SOLVENTES PARA OS PADRES DE AGROTXICOS .....................57

    4.3 OBTENO DOS TEMPOS DE RETENO DOS COMPOSTOS

    ANALISADOS...............................................................................................................59

    4.4 OBTENO DAS CURVAS ANALTICAS EM ACETATO DE ETILA..................62

    4.5 AVALIAO PRELIMINAR DOS RENDIMENTOS DOS

    PROCEDIMENTOS DE EXTRAO..........................................................................63

    4.6 AVALIAO DO EFEITO DA MATRIZ NAS RESPOSTAS DOS

    AGROTXICOS............................................................................................................67

    4.7 VALIDAO DA METODOLOGIA ...........................................................................68

    4.7.1 Especificidade..................................................................................................................68

    4.7.2 Linearidade .....................................................................................................................68

    10

  • 4.7.3 Estudos dos ndices de recuperao................................................................................70

    4.7.4 Preciso...........................................................................................................................71

    4.7.5 Estimativa dos limites de deteco e quantificao........................................................73

    4.8 DETERMINAO DE RESDUOS DE AGROTXICOS EM AMOSTRAS ...........74

    5 CONCLUSES.............................................................................................................75

    6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................76

    LISTA DE TABELAS

    Tabela 1. Produo mundial de mel em toneladas no ano de 2005..............................................20

    Tabela 2. Exportao da produo brasileira de mel 2000 a 2006 (em US$ e kg.)...................21

    Tabela 3. Parmetros e valores mximos e mnimos para mis permitidos pela

    Instruo Normativa no 11, de 20 de outubro de 2000 ................................................22

    Tabela 4. Caracterizao e composio do mel............................................................................23

    Tabela 5. Variao entre resultados para algumas caractersticas fsico-qumicas em

    mel de abelhas .............................................................................................................23

    Tabela 6. Limites mximos de resduos de antibiticos permitidos para mel no Brasil..............26

    Tabela 7. Programa de controle de resduos e contaminantes em mel PNCR/2007.

    Plano de Controle .........................................................................................................33

    Tabela 8. Concentrao das solues estoque de padres de agrotxicos preparadas

    no IMA e na Souza Cruz/RS .......................................................................................49

    Tabela 9. Agrotxicos analisados por GC-MS; ons monitorados; valores de tempo

    de reteno (tr), ons monitorados/intensidade relativa, segmento e janela

    de tempo de aquisio..................................................................................................60

    Tabela 10. Parmetros das curvas analticas obtidos para os agrotxicos analisados

    por GC-MS modo SIM, a partir das solues 10 ng mL-1, 50 ng mL-1, 100

    ng mL-1, 200 ng mL-1, 350 ng mL-1e 500 ng mL-1em acetato de etila.........................62

    Tabela 11. Parmetros das curvas analticas, obtidos para os agrotxicos analisados

    por GC-MS modo SIM, a partir das solues 10 ng mL-1; 20 ng mL-1; 50 ng

    mL-1; 75 ng mL-1; 100 ng mL-1; 150 ng mL-1 e 300 ng mL-1 no extrato da

    matriz. ..........................................................................................................................69

    11

  • Tabela 12. ndice de recuperao (%) de agrotxicos obtidos pela curva analtica em

    extrato da matriz, on monitorado, mdia e DPR de mel fortificado em

    diferentes nveis de concentrao ...............................................................................70

    Tabela 13. Mdia das concentraes de 7 injees e DPR (%,) de soluo de 10,0 g

    kg-1 de agrotxicos preparada em extrato da matriz analisados por GC-MS

    no modo SIM...............................................................................................................71

    Tabela 14. Relao sinal/rudo calculado para solues padro de agrotxicos (10 ng mL-1)

    e limites de deteco e limite de quantificao estimados..........................................73

    Tabela 15. Resduos dos agrotxicos estudados (g kg-1) encontrados em amostras de

    mel de diferentes regies brasileiras............................................................................74

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1. Estrutura molecular de agrotxicos organoclorados.....................................................28

    Figura 2. Estrutura molecular de agrotxicos organofosforados .................................................29

    Figura 3. Estrutura molecular dos carbamatos.............................................................................29

    Figura 4. Estrutura molecular dos piretrides .............................................................................29

    Figura 5. Abelhas mortas em apirio Foto enviada por colaborador. ......................................30

    Figura 6. Processo de contaminao com agrotxicos.................................................................31

    Figura 7. Representao esquemtica de cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) .......36

    Figura 8 Estrutura de clordimeforme e de seus dois produtos de degradao ............................37

    Figura 9. Esquema do detector de captura de eltrons.................................................................38

    Figura 10. Esquema do detector de ionizao de chama..............................................................38

    Figura 11. Esquema de um espectrmetro de massas tpico .......................................................39

    Figura 12. Caracterizao das amostras de mel analisadas por estado e origem botnica...........56

    Figura 13. Cromatograma obtido por GC-MS no modo scan para os ons 164, 58 e 110

    correspondentes ao isopropoxifenol, carbofurano deg e propomocarb,

    quando solubilizado em acetonitrila na concentrao de 100 ng mL-1. .......................58

    Figura 14. Cromatograma obtido por GC-MS no modo scan para os ons 164, 58 e 110

    correspondentes ao isopropoxifenol, carbofurano deg e propomocarb,

    quando solubilizado em acetona na concentrao de 100 ng mL-1.............................58

    Figura 15. Cromatograma obtido por GC-MS no modo scan para os ons 164, 58 e 110

    correspondentes ao isopropoxifenol, carbofurano deg e propomocarb,

    12

  • quando solubilizado em acetato de etila na concentrao de 100 ng mL-1. .................59

    Figura 16. Disperso dos resultados dos rendimentos de extrao para compostos

    organoclorados usando curva analtica em acetato de etila.........................64

    Figura 17. Disperso dos resultados dos rendimentos de extrao para carbamatos e

    fenpropatrina (piretride) usando curva analtica em acetato de etila.................65

    Figura 18. Disperso dos resultados dos rendimentos de extrao para clorotiazinas e

    dicarboximidas usando curva analtica em acetato de etila.........................................65

    Figura 19. Cromatogramas de ons (m/z 263) para Endrin em diferentes extratos......................67

    LISTA DE QUADROS

    Quadro 1. Mtodos de anlise de acordo com Instruo Normativa no 11. MAPA ....................22

    Quadro 2. Compilao de pesquisas relacionadas aos mtodos cromatogrficos para

    anlise de agrotxicos em mel......................................................................................41

    Quadro 3. Condies de anlise de agrotxicos por GC-MS ......................................................52

    Quadro 4. Agrotxicos permitidos pelo MAPA e culturas no entorno dos apirios

    fornecedores de amostras de mel de abelha para determinao de resduos

    de agrotxicos...............................................................................................................56

    LISTA DE ANEXOS

    ANEXO A. Formulrio de instrues para coleta de amostras....................................................83

    ANEXO B. Caracterizao da amostras reais segundo informao dos colaboradores...............87

    ANEXO C. Agrotxicos selecionados.........................................................................................93

    ANEXO D. Curvas analticas em acetato de etila........................................................................99

    ANEXO E. Curvas analticas no extrato da matriz....................................................................108

    13

  • ABREVIATURAS AAS - espectrometria de absoro atmica. AED - detector de emisso atmica. AFB - American Foulbrood APACAME - Associao Paulista de Apicultores Criadores de Abelhas Melferas Europias. APCI - ionizao qumica em presso atmosfrica. CA - anlise de cluster. CAP - cloranfenicol. CC - limite de deciso. CC - capacidade de deteco. DAD - detector com arranjo de dados. EC - detector amperomtrico. ECD - detector de captura de eltrons. ESI/MS - ionizao por eltron spray-espectrometria de massas. FPD - detector de fotometria de chama. GC-MS - cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas. GC-MS-EI-SIM - Cromatografia gasosa detector de espectrometria de massas ionizao por eltrons modo de monitoramento de ons especficos. GC-MS-NCI-SIM - Cromatografia gasosa detector de espectrometria de massas ionizao qumica de ons negativos modo de monitoramento de ons especficos. GC-ECD - Cromatografia gasosa detector de captura de eltrons HMF - hidroximetilfurfural. HPLC - cromatografia lquida de alta eficincia. HPLC-MS-MS - cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas seqencial tandem. LMR - limite mximo de resduo. MAPA - Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento do Brasil. MS - espectrometria de massas. NIR - infravermelho prximo. NMR - ressonncia nuclear magntica. NPD - detector de nitrognio fsforo. PCA - anlise de componente principal. RP-HPLC - cromatografia lquida de alta eficincia em fase reversa. SCIRA/MS - anlises por espectrometria de massas utilizando a relao isotpica entre 13C/12C com padro interno. SE - extrao com solvente. SFE - extrao com fluido supercrtico. SNIF-NMR - ressonncia nuclear magntica do deutrio em stios especficos. SPE - extrao em fase slida. SPME - microextrao em fase slida. TLC - cromatografia de camada fina. UE - Unio Europia. UV - detector ultravioleta. VOCs - compostos volteis orgnicos.

  • RESUMO

    Entre as questes relativas a qualidade do mel de abelhas, esto as caractersticas fsico-qumicas, a identificao da origem floral e geogrfica, a ocorrncia de adulteraes e as contaminaes, principalmente, com antibiticos e agrotxicos. A adequao dessas caractersticas s legislaes vigentes no pas torna o produto mais competitivo para o mercado de exportao. O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de metodologia multirresduo para a determinao de agrotxicos em mel de abelhas por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas, modo de aquisio SIM usando ionizao por eltrons (EI) a 70 eV.como contribuio para o aprimoramento das metodologias de anlise de contaminantes descritos na Instruo Normativa no 9, de 30 de maro de 2007 do MAPA e sua aplicao em amostras de mel de diferentes regies do Brasil. Foram avaliadas trs tcnicas de extrao extrao lquido-lquido, SPE - C18 e fase slida dispersiva QuEChERS modificado. Os resultados dos procedimentos de extrao indicaram a interferncia da matriz nas respostas cromatogrficas, quando comparadas com a curva analtica obtida apenas em acetato de etila. Maiores respostas para os analitos foram obtidas para a extrao liquido-lquido em acetato de etila. A metodologia utilizando extrao lquido-lquido e curvas analticas obtidas no extrato da matriz ressuspendida em acetato de etila foi desenvolvida e validada para 20 agrotxicos das classes dos organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretrides. Neste trabalho, foram avaliados alguns parmetros de validao do mtodo. A linearidade das curvas analticas (sete nveis de concentrao e seis injees cada). Foram obtidas curvas analticas com ajuste para regresso quadrtica e coeficientes de determinao superiores a 0,989. Os limites de deteco calculados variaram de 0,4 a 13,4 ng mL-1 e os limite de quantificao apresentaram resultados entre 1,4 e 60,8 ng mL-1. A preciso pelo estudo de repetibilibidade (DPR entre 3,4 a 32,9%) e a exatido pelo estudo dos ndices de recuperao (92% a 115%). As fortificaes das amostras foram realizadas em trs nveis de concentrao (1,0 g kg-1, 5,0 g kg-1, 10,0 g kg-1). A metodologia foi aplicada em 46 amostras de mel oriundas de diferentes regies do Brasil. Foi detectada a presena de agrotxicos em oito amostras. Em trs delas, os compostos encontrados podem estar relacionados com o uso dos agrotxicos nas culturas no entorno dos apirios. Palavras-chave: mel, agrotxicos, multirresduo, cromatografia gasosa, espectrometria de massas.

  • ASBTRACT

    Among the problems concerning the quality of honey, are the physical and chemical characteristics, the identification of the floral and geographical origin, the occurrence of adulteration and contamination, especially with antibiotics and pesticides. The adequacy of these features to existing laws in the country makes the product more competitive for the export market. This work aims the development of a multi residue methodology for the determination of pesticides in honey, as a contribution to the improvement of methodologies for the analysis of contaminants described in Normative Instruction No 9, March 30, 2007 to MAPA and its application in samples of honey from different regions of Brazil. The technique used was gas chromatography coupled to mass spectrometry, using SIM acquisition mode, electron ionization (EI) at 70 eV. Three techniques of extraction - liquid-liquid extraction, solid phase extraction (C18) and dispersive solid phase extraction modified "QuEChERS" was evaluated. The results of the extraction procedures indicated the interference of the matrix in the chromatographic responses when compared with the analytical curve obtained only in ethyl acetate. Best analyte responses were obtained for the liquid-liquid extraction with ethyl acetate. A method using liquid-liquid extraction and analytical curves obtained in the matrix extract resuspended in ethyl acetate was developed and validated for the 20 pesticides from the classes of organochlorine pesticides, organophosphates, carbamates and pyrethroids. In this work the following parameters were assessed for validation of the method. Linearity of analytical curves (7 concentration levels and six injections each). Analytical curves were obtained to adjustment for quadratic regression and determination coefficients higher than 0.989. Limit of detection (LOD) calculated ranged from 0,4 to 13,4 ng mL-1 and limit of quantification (LOQ) performed between 1,4 and 60,8 ng mL-1. The precision for the study of repetibilibidade (% RSD between 3,4 and 32,9%) and accuracy (recovery rate - 92% a 115%). The fortifications of the samples were taken at three concentration levels (1,0 g kg-1, 5,0 g kg-1, 10,0 g kg-1). The methodology was applied to the analysis of 46 honey samples from different regions of Brazil. It was detected the presence of pesticides in 8 samples. In three of them, the compounds found may be related to the use of pesticides on crops in the neighborhood of apiaries. Keywords: honey, pesticides, multiresidue, gas chromatography, mass spectrometry.

  • 1 INTRODUO A mudana de hbitos da populao, no sentido de manter uma vida mais saudvel, faz crescer a procura por produtos genuinamente naturais. Dentre os produtos naturais, o mel um alimento apreciado por seu sabor caracterstico e considervel valor nutritivo, sendo por isso cada vez mais consumido. O mel um produto muito valorizado no mercado externo e seu preo oscila em nveis altos se comparado a outros produtos. Por isso, a busca por rigorosos padres de qualidade se torna necessria para atender a um mercado consumidor cada vez mais exigente. Problemas sanitrios ocorridos em 2003 nos apirios da China e da Argentina, principais pases exportadores de mel levaram falta do produto no mercado internacional, aumentando a demanda pelo produto brasileiro. Em decorrncia desse fato, houve um estmulo para que produtores brasileiros aprimorassem suas tcnicas no trato com as abelhas, no processo produtivo e no controle de qualidade do mel, com a finalidade de aumentar o volume de produo e, conseqentemente, o volume das exportaes. Entre as questes relativas qualidade do mel, esto a identificao da origem floral e geogrfica, a ocorrncia de adulteraes e as contaminaes, principalmente com antibiticos e agrotxicos. Em maro de 2006, a Unio Europia (UE) suspendeu a compra do mel brasileiro. A medida foi baseada em uma deciso da Federao Europia de Comrcio de Produtos do Agronegcio, que teria constatado a persistncia de falhas no sistema de monitoramento de resduos no mel brasileiro, apontadas anteriormente por outra misso tcnica em 2003 (IEA, 2006). Para o fim do embargo europeu ao mel brasileiro, ocorrido em maro de 2008,

    houve a necessidade de se implantar Boas Prticas e o Sistema de Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (HACCP/APPCC) nos entrepostos e casas de mel no pas. Alm disso, o cumprimento da exigncia de registro junto ao Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Vrios estudos tm sido realizados para o desenvolvimento de novas metodologias que sejam mais efetivas no controle da qualidade do mel. Muitos desses estudos tm como objetivo principal o desenvolvimento e a validao de mtodos que sejam capazes de determinar a presena de resduos de contaminantes em alimentos de uma maneira rpida, simples e economicamente vivel. Os resduos de agrotxicos esto entre os compostos de interesse devido aos riscos sade humana e sade das abelhas. Apesar da discordncia entre produtores de defensivos e cientistas, acredita-se que os agrotxicos podem ser responsveis pela perda de grande nmero de abelhas em algumas reas estudadas. A mortalidade das abelhas est diretamente relacionada presena de agrotxicos no plen, no favo, nas prprias abelhas e no mel (Rial-Otero et al., 2007). Diante desta perspectiva, este trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento de metodologia multirresduo para a determinao de agrotxicos em mel de abelhas (Apis sp) como contribuio para o aprimoramento das metodologias de anlise de contaminantes descritos na Instruo Normativa no 9, de 30 de maro de 2007 do MAPA e sua aplicao em amostras de mel de diferentes regies do Brasil. Como objetivos especficos a avaliao de diferentes metodologias para preparao de amostras (extrao e concentrao de analitos), a execuo de estudos para validao de metodologia, a avaliao da presena de resduos de agrotxicos das classes dos organoclorados, dos

  • organofosforados, de carbamatos e de piretrides em mis produzidos em Estados brasileiros e o estabelecimento de correlaes entre a contaminao por agrotxicos e as culturas no entorno dos apirios. 2 REVISO BIBLIOGRFICA SOBRE ASPECTOS RELACIONADOS QUALIDADE DO MEL DE ABELHAS E TCNICAS APLICADAS NAS DETERMINAES DA AUTENTICIDADE E DE CONTAMINANTES

    2.1 DEFINIO E CLASSIFICAO DO MEL

    O mel um alimento apreciado por seu sabor caracterstico e pelo seu considervel valor nutritivo. De acordo com a legislao vigente no Brasil, entende-se por mel o produto alimentcio produzido pelas abelhas melferas, a partir do nctar das flores ou das secrees procedentes de partes vivas das plantas ou de excrees de insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam, combinam com substncias especficas prprias, armazenam e deixam maturar nos favos da colmia (Brasil, 2000). O mel conhecido desde a antiguidade. Estudos mostram que as abelhas j produziam mel h 50 milhes de anos, muito antes de o homem aparecer sobre a Terra. Os homens primitivos caavam mel, assim como caavam outros alimentos. Essa prtica se desenvolveu e deu incio apicultura que permaneceu inalterada durante milhares de anos at que, na segunda metade do sculo XX, houve um maior desenvolvimento da tcnica abrindo

    caminho para o estabelecimento do mel como produto comercial. No Egito Antigo, o mel era ofertado em cerimnias religiosas, usado para conservar corpos mumificados e como medicamento. Na Idade Mdia, o mel era considerado to importante que h registros de testamentos destinando colmias para pessoas da famlia ou para a igreja (Crane, 1998). O mel classificado de acordo com sua origem em mel floral quando as abelhas utilizam nctar das plantas e mel de melato quando esse obtido de secrees de lquidos aucarados, procurados e colhidos pelas abelhas como se fossem nctar (Anklam, 1998). Os dois tipos de mis passam por processos enzimticos semelhantes, porm, suas caractersticas fsico-qumicas so diferentes quando se tornam o produto final. O mel floral chamado monofloral, quando o nctar coletado predominantemente de uma espcie floral e multifloral ou silvestre, quando obtido a partir de diferentes origens florais (Campos, 1998). O nctar apanhado pelas abelhas operrias coletoras e carregado na vescula nectarfera para a colnia, repassado a outra operria ou depositado diretamente no favo. Durante o transporte, diludo por saliva onde so adicionadas enzimas (invertase, diastase e glicoseoxidase) provenientes das glndulas hipofaringeanas das abelhas. As enzimas atuam no processamento do nctar para transform-lo em mel (Arauco, 2005). De acordo com Crane (1998), o mel o resultado da desidratao e da transformao desse nctar, portanto, a quantidade da substncia elaborada a partir de uma determinada planta varia de acordo com os fatores que influenciam a produo e a concentrao de nctar, com a concentrao e as propores de seus carboidratos, com a quantidade de flores da

  • rea e at com o nmero de dias que as flores esto secretando nctar. Sendo assim, a composio do nctar de uma espcie produtora, que foi coletado pelas abelhas, contribui diretamente na composio do mel elaborado, conferindo-lhe caractersticas especficas. De acordo com Marchini e colaboradores (2004) as condies climticas e o manejo do apicultor tm menos influncia sobre essas caractersticas. O mel de melato difere do mel floral em sua composio qumica; eles so mais escuros, tem pH mais alto, menor teor de glicose, razo pela qual usualmente no cristaliza e maior acidez (Campos, 1998; Castro-Vazquez et al., 2006). Existem vrios tipos de mis no mundo, no que se refere espcie de abelha coletora. As abelhas do gnero Apis chamadas africanizadas so as principais: Apis melfera, Apis cerana, Apis dorsata, Apis florea. No Brasil, existem outras espcies, como as abelhas sem ferro (melipondeos) do gnero Melipona, conhecidas popularmente como uruu (Melipona scutellaris), tiba (Melipona compressipes), jandara (Melipona subnitida), mandaaia (Melipona quadrifasciata) (Vargas, 2006). De maneira geral, o mel das espcies de melipondeos tem como principal caracterstica a diferenciao nos teores da sua composio, destacando-se o teor de gua (umidade), que o torna menos denso que o mel das abelhas africanizadas (Campos, 1998).

    2.2 PRODUO E EXPORTAO DE MEL NO BRASIL E NO MUNDO

    A produo mundial de mel teve uma tendncia crescente nos ltimos 20 anos. O consumo tambm aumentou, sendo

    atribudo ao aumento geral nos padres de vida e tambm a um interesse maior da populao por produtos naturais e saudveis. Restries impostas ao produto dos dois maiores exportadores mundiais, China e Argentina, proporcionaram uma abrupta demanda pelo produto brasileiro nos ltimos anos (Relatrio Adeca, 2005). De acordo com FAOSTAT (2006), o Brasil representa 2,5 % da produo mundial em 2005, como apresentado na tabela 1. A procura por produtos naturais sem contaminaes de qualquer espcie coloca o Brasil como potencial fornecedor de mel para o mercado internacional. A biodiversividade de flora, a rusticidade das abelhas e as caractersticas do clima so condies favorveis produo de mel de qualidade. Uma outra caracterstica que coloca o Brasil em vantagem a possibilidade de produo de mel durante todo o ano, enquanto que em outros pases as condies climticas so limitantes. No Brasil, o avano das tcnicas de apicultura e a melhoria na qualidade do produto se tornaram necessrias diante das exigncias do mercado de exportao. Em maro de 2006, a Unio Europia (UE) suspendeu a compra do mel brasileiro. A medida foi baseada em deciso da Federao Europia de Comrcio de Produtos do Agronegcio, que teria constatado a persistncia de falhas no sistema de monitoramento de resduos no mel brasileiro que j tinham sido apontadas por outra misso tcnica em 2003 (IEA, 2006).

  • Tabela 1. Produo mundial de mel em toneladas no ano de 2005

    Pas 2005

    China 300.000

    Estados Unidos 82.000

    Argentina 80.000

    Turquia 73.929

    Ucrnia 60.502

    Mxico 53.000

    Rssia 53.000

    ndia 52.000

    Etipia 39.000

    Espanha 37.000

    Ir 36.000

    Brasil (120) 33.749

    Canad 33.000

    Coria 29.000

    Tanznia 27.000

    Angola 23.000

    Qunia 21.500

    Alemanha 17.000

    Austrlia 16.000

    Outros 301.485

    Total 1.368.165

    Fonte: Adaptado de FAOSTAT (2006). Avalia-se, no mercado, a possibilidade de o mel brasileiro ser reexportado para a Europa, via Estados Unidos, contrariando as previses decorrentes do embargo europeu. Isto justificaria o aumento de 37% das exportaes brasileiras para os Estados Unidos em 2006. Assim, o embargo por

    parte da EU no teria acontecido pelo fato de o mel brasileiro ter apresentado traos de antibiticos, herbicidas ou agrotxicos, mas sim por problemas no cumprimento do cronograma de anlises, acertado entre europeus e brasileiros (IEA, 2007; Bhlke, 2006). Para reverter essa situao, o governo brasileiro props, alm do monitoramento do produto, o aumento no nmero de amostras a serem examinadas e mais empenho na fiscalizao e controle dos resduos. Segundo o presidente da Associao Paulista de Apicultores Criadores de Abelhas Melferas Europias (APACAME), a deciso da UE foi de carter burocrtico, pois no tinha sido constatada qualquer contaminao no mel, tendo em vista que o apicultor brasileiro no usa medicamentos no manejo apcola (IEA, 2006). Os dados sobre produo e exportao de mel no Brasil variam com as fontes consultadas. De acordo com MDIC / SECEX, os Estados Unidos foi o principal destino das exportaes brasileiras em 2008. O pas respondeu por 73,1% do total comercializado, com uma receita de US$ 31,84 milhes, ao preo de US$ 2,32/kg de mel. Com a Alemanha, o Brasil comercializou 16,5% das exportaes. O terceiro mercado comprador do mel brasileiro foi o Canad, que respondeu por 5,3% das vendas. A tabela 2 apresenta os dados de exportao da produo brasileira de mel entre os anos de 200 e 2006.

  • Tabela 2. Exportao da produo brasileira de mel 2000 a 2006 (em US$ e kg.)

    Exportao Ano

    US$ kg 2000 331.060 268.904 2001 2.809.353 2.488.671 2002 23.141.221 12.640.487 2003 45.521.098 19.272.782 2004 42.303.289 21.029.045 2005 18.940.333 14.442.090 2006 23.358.927 14.599.908

    Fonte: Adaptado de MDIC/SECEX Aliceweb (2006).

    2.3 LEGISLAO Os parmetros fsico-qumicos para mis brasileiros esto bem definidos pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA). A Instruo Normativa no 11, de 20 de outubro de 2000, aprova o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade do Mel, revoga a Portaria no 367 de 04/09/1997. O regulamento estabelece a definio, a classificao, a designao, a composio, e os requisitos quanto s caractersticas fsico-qumicas, sensoriais, condies de acondicionamento, aditivos, contaminantes, condies higinicas - critrios macroscpicos e microscpicos - pesos e medidas, rotulagem, amostragem e definio de mtodos de anlises que devero ser seguidos (Brasil, 2000). A Resoluo RDC no 360, de 23 de dezembro de 2003, aprova o Regulamento Tcnico sobre Rotulagem Nutricional de Alimentos Embalados, tornando a rotulagem nutricional obrigatria, inclusive para o mel (Brasil, 2003). A Portaria no 50 de 20 de fevereiro de 2006 do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA) aprova os

    programas de controle de resduos em vrios produtos. O programa inclui o monitoramento de resduos de vrios antibiticos no mel (Brasil, 2006). A Instruo Normativa no 9, de 30 de maro de 2007 do MAPA aprova os programas para o ano de 2007 e prev a execuo de anlises e, alm dos antibiticos, determina o limite mximo de resduos (LMR) para vrios tipos de agrotxicos como compostos halogenados, organoclorados, carbamatos, piretrides e organofosforados (Brasil, 2007). A composio e o beneficiamento do mel na EU so regulamentados pela Diretiva 2001/110/EC de 20 de Dezembro de 2001. A Diretiva estabelece os tipos de mis que podem ser comercializados na UE e d informaes sobre os nveis de umidade, hidroximetilfurfural, atividade enzimtica e agrotxico. Ainda exige que a origem floral e geogrfica do mel seja indicada na sua embalagem (Nozal et al., 2005).

    2.4 COMPOSIO E CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS DO MEL

    Os parmetros fsico-qumicos de amostras de mis so importantes para a sua caracterizao e so primordiais para garantir a qualidade desse produto. Alm disso, a caracterizao regional de mis de fundamental importncia levando-se em considerao a grande diversidade botnica e variao do solo e do clima das diversas regies. As anlises fsico-qumicas e polnicas contribuem na fiscalizao de mis importados e no controle da qualidade do mel produzido no pas. Seus resultados devem ser comparveis aos padres estabelecidos por organismos internacionais protegendo o consumidor de adquirir um produto adulterado (Marchini et al, 2004).

  • Anlises quantitativas dos componentes do mel que aparecem em menores teores vm ganhando maior importncia recentemente, dado que, variaes nos teores desses componentes so mais apropriadas para diferenciar tipos de mis, quando comparado com as variaes nos principais componentes (Nozal et al., 2005). Os mtodos de anlises para os parmetros correspondentes s caractersticas fsico-qumicas do produto so determinados pela

    legislao vigente, conforme indicado no quadro abaixo. A legislao vigente (Instruo Normativa no 11, de 20 de outubro de 2000) estabelece como parmetros mnimos de qualidade fsico-qumica a determinao de indicativos de maturidade (acares redutores, sacarose aparente e umidade), de pureza (slidos insolveis em gua e minerais) e de deteriorao (acidez, atividade diastsica e hidroximetilfurfural) (Brasil, 2000).

    Quadro 1. Mtodos de anlise de acordo com Instruo Normativa no 11. MAPA

    Determinao Referncia

    Acares redutores CAC/VOL. III, Supl. 2, 1990, 7.1 Umidade (mtodo refratomtrico) A.O.A.C. 16th Edition, Rev. 4th, 1998 - 969.38 B Sacarose aparente CAC/Vol. III, Supl. 2, 1990, 7.2 Slidos insolveis em gua CAC/Vol. III, Supl. 2, 1990, 7.4. Minerais (cinzas) CAC/Vol. III, Supl. 2, 1990, 7.5 Acidez A.O.A.C. 16th Edition, Rev. 4th, 1998 - 962.19 Atividade diastsica CAC/Vol. III, Supl. 2, 1990, 7.7 Hidroximetilfurfural (HMF) A.O.A.C. 16th Edition, Rev. 4th, 1998 - 980.23

    (a) Codex Alimentarius Commission CAC. Programa Conjunto da Organizao das Naes Unidas para a Agricultura e a Alimentao - FAO e da Organizao Mundial da Sade OMS (b) A.O.A.C - Association of Official Analytical Chemists Fonte: Adaptado da Instruo Normativa no 11. MAPA Tabela 3. Parmetros e valores mximos e mnimos para mis permitidos pela Instruo Normativa no 11, de 20 de outubro de 2000

    Parmetro Mel floral Mel de melato

    Maturidade

    Acares redutores Mnimo 65 g/100 g Mnimo 60 g/100 g

    Umidade Mximo 20 g/100 g

    Sacarose aparente Mximo 6 g/100 g Mximo 15 g/100 g

    Pureza

    Slidos insolveis em gua Mximo 0,1 g/100 g

    Cinzas Mximo 0,6 g/100 g Mximo 1,2 g/100 g

    Plen presena

  • Parmetro Mel floral Mel de melato

    Deteriorao

    Acidez Mxima 50 meq/g

    Atividade diastsica (escala Gothe) Mnimo 8

    Hidroximetilfurfural Mximo 60 mg/kg

    Fonte: Adaptado da Instruo Normativa no 11, MAPA. A tabela 4 mostra os valores caractersticos para a composio do mel. Tabela 4. Caracterizao e composio do mel

    Nutrientes Mdia em 100 g

    gua 17,1 g Total de carboidratos 82,4 g

    Frutose 38,5 g Sacarose 1,5 g

    Protenas e aminocidos 0,5 g

    Minerais Mdia em 100 g

    Clcio 4,8 mg Ferro 0,25 mg

    Potssio 50,0 mg Fsforo 5,0 mg

    Magnsio 2,0 mg Cobre 0,05 mg

    pH 3,9

    Cor Branco gua (114 mm escala Pfund) Fonte: Adaptado de Arvanitoyannis (2005). Em seu trabalho, Almeida (2002) mostra a grande variao entre os resultados encontrados por vrios autores para

    algumas caractersticas fsico-qumicas do mel (Tabela 5).

    Tabela 5. Variao entre resultados para algumas caractersticas fsico-qumicas em mel de abelhas

    Parmetro ndices (unidades)

    Acares redutores 56,2 a 95 (%) Sacarose aparente 0,4 a 11 (%)

    Umidade 13 e 30,5 (%)

  • Parmetro ndices (unidades) Cinzas 0,02 a 0,09 (% ) Acidez 8,2 a 50,0 (meq/kg )

    Hidroximetilfurfural 0,5 a 241 (mg/kg) Protenas e aminocidos 0,2 a 2,8 (% ) Condutividade eltrica 90 e 2112 (uS)

    Fonte: Adaptado de Almeida (2002).

    2.5 PRINCIPAIS FONTES DE ADULTERAO

    A grande valorizao do mel no mercado internacional tem suscitado um maior controle da sua qualidade, principalmente no que se refere ao produto que ser importado ou exportado. Em igual proporo, crescem os mecanismos utilizados por produtores para burlar as legislaes onde esto fixados os padres de identidade e qualidade do mel. As adulteraes podem ser explicadas pelo valor econmico envolvido, j que o custo de um produto sinttico mais baixo que o de produtos naturais. Alm de prejudicarem economicamente os produtores que seguem a legislao, as adulteraes podem ter efeitos catastrficos para a sade pblica se forem adicionados ao produto elementos que podem ser txicos. Vrios estudos tm sido realizados para o desenvolvimento de novas metodologias que sejam mais efetivas no controle de qualidade do mel. Muitos desses estudos tm como objetivo principal apontar mecanismos que possam, efetivamente, inibir a prtica das adulteraes. Mtodos mais novos, rpidos e precisos como espectrometria de absoro atmica (AAS), cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (GC-MS), ionizao por eletronspray-espectrometria de massas (ESI/MS), cromatografia de camada fina (TCL), ressonncia nuclear magntica (NMR),

    transformada de Fourier-Raman (FT-Raman) e infravermelho prximo (NIR) tm enriquecido as ferramentas do qumico analtico para a soluo de fraudes (Arvanitoyannis et al., 2005; Karoui et al., 2007).

    2.5.1 Adulterao com xaropes

    Adoantes e xaropes disponveis no comrcio so um potencial meio de adulterao em mis. Os mais amplamente usados so xarope com alto teor de frutose e acar invertido. Uma prtica comum de adulterao a adio de xarope ao mel depois da colheita ou a alimentao das abelhas com lquidos aucarados que so dispostos em locais estratgicos prximos s colmias.

    2.5.2 Certificao da origem botnica

    Os trabalhos executados para atestar autenticidade pela certificao da origem botnica e geogrfica e sua relao com a composio fsico-qumica do mel de abelhas utilizam tcnicas que exploram componentes que esto presentes no produto em diminutas concentraes. Esses componentes parecem ser mais apropriados para se evidenciar diferenas significativas entre os vrios tipos de mis que so produzidos pelas abelhas (Anklam, 1998; Crane, 1998; Bastos, 2002; Arruda, 2003; Arvanitoyannis et al., 2005; Vargas, 2006; Karoui et al., 2007). Vrios autores estudaram a presena de aminocidos e protenas e sua relao com a origem

  • botnica e geogrfica (Pirini et al., 1992; Conte et al., 1998; Hermosin et al., 2003; Bernal et al., 2005; Patzold et al., 2006; Perez et al., 2007). As protenas so os componentes que aparecem em menores teores no mel, sendo assim, elas podem ser usadas como padro interno para avaliao de adulterao pela relao isotpica do carbono. Considerando que as protenas das abelhas devam ser comuns a todos os tipos de mis, Baroni et al. (2002) verificaram a utilidade das protenas de plen como marcadores da origem floral. Azeredo (2003) determinou o contedo de protenas em amostras de mis de diferentes origens florais, alm de outros parmetros fsico-qumicos e anlise do espectro polnico, com o objetivo de fazer uma correlao entre a origem botnica das espcies e o contedo de protenas. Seus resultados indicam que a determinao pelo mtodo colorimtrico para contedo de protenas foi eficiente e permitiu a deteco de altos valores em duas amostras de Borreria verticillata, conhecida como vassourinha no Estado do Piau.

    2.5.3 Compostos volteis

    Os compostos volteis orgnicos (VOCs) contribuem significativamente para o flavor do mel e para suas variaes em relao sua origem. A identificao dos compostos volteis importante para o entendimento das diferenas de flavor que podem existir entre os tipos de mis. A presena de alguns compostos como lcoois, aldedos e furanos reflete a ausncia de microrganismos e as condies de processamento e estocagem do mel. Alguns compostos volteis esto presentes no nctar ou no melato coletados pelas abelhas e podem estar relacionados com as plantas, outros se originam durante o

    processamento e estocagem do mel (Anklam, 1998; Castro-Vazquez et al., 2006). Mis monoflorais tm muitas caractersticas aromticas, presumidamente derivadas do nctar, indicando a presena de compostos volteis responsveis pelas suas fragrncias caractersticas. Em razo do grande nmero de compostos volteis, estes perfis representam uma impresso digital dos produtos, a qual pode ser usada para determinar a origem do mel (Baroni et al., 2006). O flavor do mel deve estar diretamente correlacionado com o processamento, com a estocagem e com a fonte botnica. Uma cuidadosa anlise dos componentes volteis em mel pode ser uma ferramenta til para a caracterizao da origem botnica. Porm, compostos tpicos podem ser identificados para mis de alguma fonte floral se essas anlises forem sempre combinadas com mtodos de determinao de outros constituintes (Anklam, 1998).

    2.6 CONTAMINAO DO MEL POR ANTIBITICOS

    A avaliao de alguns contaminantes do mel de extrema importncia devido aos riscos para sade humana e das abelhas. Os resduos de antibiticos esto entre os compostos de interesse, pois, quando presentes no mel, podem levar seleo de microorganismos patognicos resistentes. Os antibiticos, como fonte de contaminao em mel, tiveram maior ateno quando foram encontrados em produtos da sia, maior exportador de mel para os Estados Unidos, Alemanha e outros pases da UE. A deteco de cloranfenicol (CAP) foi evidenciada no produto da China e as importaes de mel daquele pas foram suspensas. Essas substncias podem ser encontradas em mis por causa da sua

  • aplicao nas colmias com objetivo de combater o crescimento de microrganismos aerbios e anaerbios reduzindo a incidncia de doenas nas colnias (US-FDA, 2002). Sua deteco importante porque esses medicamentos podem causar reaes adversas severas em humanos, principalmente a anemia plasmtica - diminuio dos glbulos vermelhos por toxicidade aguda da medula ssea. O CAP um composto lipossolvel que se difunde atravs da membrana celular e atua na inibio da sntese de protenas (Jnior, 2006). A UE incluiu o CAP como substncia de tolerncia zero, no aceitando sua presena

    mesmo que residual em tecido animal. A Comisso de Deciso 2003/181/EC estabeleceu o limite mximo de deteco requerido para um mtodo analtico na determinao de CAP de 0,30 g kg-1. No Brasil, apesar de proibido, o CAP tem sido usado na produo de mel por aumentarem a produtividade a baixo custo. A Portaria no 50, de 06 de fevereiro de 1986 do MAPA, instituiu o Plano de Controle de Resduos Biolgicos em Produtos de Origem Animal. Na Instruo Normativa No 9, de 30 de maro de 2007 do MAPA so estabelecidos o mtodo de anlise e novos limites de quantificao para antibiticos (Brasil, 2007).

    Tabela 6. Limites mximos de resduos de antibiticos permitidos para mel no Brasil

    Grupo Analito Tcnica LQ (gkg/L) LMR/NA* (g/kg/L)

    N de Itens de ensaio

    Clortetraciclina (a) Oxitetraciclina (a)

    Tetraciclina (a) HPLC

    UV 25 200 60

    Sulfatiazol (b) Sulfametazina (b)

    Sulfadimetoxina (b) Sulfadiazina Sulfaquinoxalina

    Sulfaclorpiridazina

    HPLC UV 25 100 60

    Nitrofurazona Furazolidona Furaltadona Nitrofurantoina

    LC/MS-MS 0,5 1(1)*

    30

    Antimicrobianos

    Tilosina LC/MS-MS 0,5 10 10

    (a) O LMR refere-se ao somatrio de todas as Tetraciclinas. (b) O LMR refere-se ao somatrio de todas as Sulfonamidas. (*) NA - Nvel de Ao HPLC UV Cromatografia lquida de alta eficincia e detector ultravioleta visvel LC/MS-MS Cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas tandem Fonte: Instruo Normativa no 9 de 30 de maro de 2007. MAPA

  • Os estudos para separao, determinao e confirmao de resduos de CAP so executados com os mtodos de cromatografia lquida de alta eficincia e detector ultravioleta visvel (HPLC-UVD), cromatografia gasosa com detector de captura de eltrons (GC-ECD) e cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (GC-MS) com ionizao por eltrons (EI), ionizao qumica de ons negativos (NCI) e monitoramento de ons selecionados (SIM). Em muitos casos, HPLC, GC e GC-MS podem ser aplicados para determinar e confirmar concentrao de resduo de CAP dependendo do nvel de resduos em amostras suspeitas. HPLC quantifica nveis de resduos acima de 10 g kg-1, GC-ECD ou GC/MS-EI-SIM nveis entre 1-10 g kg-1. GC/MS-NCI-SIM podem ser usados para detectar resduos de CAP at 0,1 g kg-1 (Shen et al., 2005). Vrios antibiticos tm sido usados no controle da American Foulbrood (AFB) ou cria ptrida americana uma doena grave que afeta as colmias, causada pela bactria Paenibacillus larvae. Os antibiticos usados no controle da AFB foram sulfatiazol (desde 1946) e depois oxitetraciclina (OTC), e tetraciclina (TCA), (desde 1950). Recentemente, foram evidenciadas resistncia ao tratamento com estes antibiticos (Benetti et al., 2006). Moeller et al. (2007) descreveram o desenvolvimento de teste baseado num biossensor especfico para tetraciclinas em produtos animais, dentre eles o mel.

    2.7 CONTAMINAO DO MEL POR AGROTXICOS

    Uma outra classe de compostos de interesse so resduos de agrotxicos, que alm de danos populao das abelhas, podem acarretar danos sade humana. Outro enfoque para a importncia do estudo dos resduos de agrotxicos o monitoramento

    ambiental (Rissato, 2006; Balayiannis, 2007).

    2.7.1 Histrico e definio

    Desde a antiguidade quando o homem iniciou as primeiras atividades agrcolas cultivando plantas de uma mesma espcie ao seu redor deu-se o incio, tambm, do desenvolvimento das pragas e das doenas. A preocupao com o seu controle , portanto, um problema to antigo quanto a prpria agricultura. Segundo Newman (1979), os primeiros esforos para controlar quimicamente as pestes se deram pelo uso de substncias txicas de ocorrncia natural como mercrio, enxofre e extratos de plantas como nicotina e piretro. Os agrotxicos tm uma utilizao bastante ampla, incluindo herbicidas, inseticidas, acaricidas, nematicidas, raticidas, fungicidas e bactericidas (Newman, 1979 citado por Vaz, 1996). O Decreto n 4.074, regulamenta a Lei n 7802/1989 do Ministrio da Agricultura e Pecuria, e estabelece que os agrotxicos so produtos e agentes de processos fsicos, qumicos ou biolgicos, destinados ao uso nos setores de produo, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas pastagens, na proteo de florestas nativas, de culturas florestais e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composio da flora ou da fauna, a fim de preserv-las da ao danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (Brasil, 2002).

    2.7.2 Classificao

  • Existem muitas formas de classificar os agrotxicos, entre elas a finalidade, o modo de ao, a persistncia no ambiente, tipo de deslocamento, a durao do efeito do tratamento, a origem, a natureza qumica e a toxicidade. 2.7.2.1 Natureza qumica

    Os agrotxicos so classificados como compostos inorgnicos ou orgnicos. Os inorgnicos, base de brio, boro, flor, antimnio, tlio, chumbo, cdmio, mercrio, alm da calda sulfoclcica e os leos minerais tm como desvantagens sua acumulao nos tecidos orgnicos, estabilidade e longa persistncia no ambiente por serem base de metais. Sua importncia reduziu-se bastante com o aparecimento dos agrotxicos orgnicos; hoje no totalizam 10% dos produtos em uso. Os orgnicos (denominados assim devido presena do tomo de carbono na frmula) constituem o grupo de maior importncia. So divididos em sintticos (compostos produzidos pelo homem) e naturais. O desenvolvimento dos compostos orgnicos sintticos possibilitou a gerao de imensa gama de produtos orgnicos, classificados como organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretrides (Sucen, 1990).

    Os agrotxicos organoclorados so, relativamente inertes, e sua alta estabilidade est relacionada s ligaes carbono-cloro. Seu uso est proibido em muitos pases devido resistncia e efeito acumulativo que causam ao meio ambiente e na cadeia alimentar Os agrotxicos classificados como organofosforados so steres, amidas ou derivados tiol dos cidos de fsforo (cido fosfrico, cido tiofosfrico, cido ditiofosfrico e outros), contendo vrias combinaes de carbono, hidrognio, oxignio, fsforo, enxofre e nitrognio. Os organofosforados possuem vrios grupos segundo sua estrutura, estando entre os mais numerosos os fosfatos, fosforotioatos e fosforoditioatos (Sucen, 2000) Os carbamatos so derivados do cido carbmico e podem ser inseticidas, herbicidas e fungicidas. Os piretrides foram descobertos a partir da modificao de piretrinas naturais e so muito utilizados devido a sua alta eficincia, sendo necessrias menores quantidades de produto ativo, resultando em menor contaminao nas aplicaes. So compostos sintticos anlogos aos componentes obtidos a partir dos piretros, extrados do crisntemo.

    Endossulfan DDT Endrin Figura 1. Estrutura molecular de agrotxicos organoclorados Fonte: ANVISA

  • Paration Malation Clorpirifs

    Figura 2. Estrutura molecular de agrotxicos organofosforados Fonte: ANVISA

    Carbofurano Carbaril

    Figura 3. Estrutura molecular dos carbamatos Fonte: Anvisa

    Deltametrina Ciflutrina Fenpropatrina

    Fonte: Anvisa Figura 4. Estrutura molecular dos piretrides 2.7.3 Toxicidade

    Basicamente, os agrotxicos so usados na agricultura com trs objetivos: (i) obteno de cultivos com alta produtividade, (ii) obteno de produtos com boa qualidade e (iii) reduo do trabalho e gastos com energia. Sem dvida, esses objetivos tm sido alcanados nessas ltimas dcadas. No entanto, o uso indiscriminado, sem critrios e sem conhecimento aprofundado de sua ao e efeitos, trouxe problemas muito srios ao meio ambiente e, conseqentemente, qualidade de vida do ser humano (Vaz, 1996).

    No Brasil, as formulaes de agrotxicos so obrigadas a apresentar, no rtulo, a cor correspondente classe de sua toxicidade. Os agrotxicos esto divididos em quatro classes toxicolgicas onde I= rtulo vermelho (extremamente txico), II= rtulo amarelo (altamente txico), III= rtulo azul (medianamente txico) e IV= rtulo verde (pouco txicos) (ANVISA, 2006).

    2.7.4 Resduos de agrotxicos em mel

    Apesar dos benefcios dos agrotxicos, o problema de intoxicaes por defensivos agrcolas preocupa as autoridades, especialmente pelo fato de que essas

  • intoxicaes acontecem pela ingesto gradativa destes produtos que contaminam a gua, o solo e uma variedade de alimentos. A crescente preocupao da populao sobre os riscos dos resduos de agrotxicos para a dieta tem modificado, profundamente, a estratgia para proteo da colheita, com nfase na qualidade e segurana alimentar (Rissato, 2004b). Ao longo das duas ltimas dcadas, o monitoramento de resduos de agrotxicos em alimentos no Brasil foi marcado por uma srie de esforos isolados de rgos estaduais de sade, agricultura e instituies de pesquisas. Esse fato sempre impediu que o Pas tivesse uma noo clara dos nveis de agrotxicos encontrados em seus produtos agrcolas (Anvisa, 2006). O uso de agrotxicos na agricultura aplicado em reas muito extensas. A contaminao por resduos de agrotxicos pode ocorrer acidentalmente, devido a manejo inadequado de agrotxicos utilizados na agricultura em geral. Por esse motivo, esta prtica pode causar poluio e sua presena pode ser mascarada pela disperso em diferentes locais no ambiente (Fernndez, 2001). Em alguns casos, os produtos qumicos utilizados no controle das pragas permanecem nas plantas e afetam outros insetos, diferentes daqueles para os quais os produtos qumicos foram desenvolvidos. Assim, diferentes agrotxicos podem ser introduzidos na cadeia alimentar pelas abelhas produtoras de mel, afetando a sade humana (Rial-Otero, 2007). O uso de agrotxicos a principal estratgia utilizada no campo para a preveno e o controle de pragas. Estes compostos, porm, so potencialmente txicos ao homem e s abelhas, alm de serem uma importante fonte de contaminao em alimentos.

    O controle de agrotxicos em mel importante devido as suas implicaes para a sade humana. Apesar da discordncia entre produtores de defensivos e cientistas, acredita-se que os agrotxicos so responsveis pela perda de abelhas em algumas reas. A mortalidade das abelhas est diretamente relacionada com a presena de agrotxicos no plen, no favo, nas prprias abelhas e no mel (Rial-Otero et al., 2007).

    Figura 5. Abelhas mortas em apirio Foto enviada por colaborador. A produo de mel oriundo de florada silvestre est se tornando cada vez mais escassa no Brasil e no mundo. Por esse motivo, atualmente o desenvolvimento da apicultura est cada vez mais dependente das culturas agrcolas e florestais nas quais, em alguns casos, so utilizados agrotxicos de maneira inadequada (Rissato, 2006). Em seu vo, as abelhas percorrem aproximadamente 7 km2 para o recolhimento de nctar e do plen. Durante este processo, diversos microorganismos, produtos qumicos e partculas suspensas no ar so interceptados ficando retidos nos pelos superficiais de seu corpo ou so inalados e unidos em seu aparelho respiratrio. Devido a estes fatores, as abelhas podem ser usadas como bioindicadores para monitoramento de impacto ambiental causado por fatores biolgicos, qumicos e fsicos, tais como,

  • parasitas, contaminaes industriais ou agrotxicos (Rissato, 2006). Os resduos de agrotxicos podem ser encontrados no mel preferencialmente por duas rotas de contaminao, indireta e direta. De maneira indireta, quando as abelhas entram em contato com o nctar e com o plen de flores provenientes de terras previamente pulverizadas. Se a abelha morrer e no retornar colmia, a rainha e

    as outras abelhas no estaro contaminadas e a colmia sobreviver. Por outro lado, quando as abelhas entram em contato com o agrotxico e o transportam para a colmia no seu prprio corpo ou em forma de nctar e plen contaminados, pode ocorrer a contaminao do mel. De forma direta, por tratamento das colmias para controlar pestes e doenas que elas sofrem (Albero, 2004; Rissato, 2004a).

    Figura 6. Processo de contaminao com agrotxicos Fonte: Rial-Otero (2007). As principais doenas que afetam as larvas das abelhas so American foulbrood (Paenibacillus larvae), European foulbrood (Melissococcus plutonius) e Chalkbrood (Ascosphaera apis) ou podem ser infestaes por parasitas como nosema (Nosema apis), amoeba (Malpighamoeba mellifica), varroa mites (Varroa jacobsoni), e tracheal mites (Acarapis woodi). Essas doenas tm forado os apicultores a usar tratamentos teraputicos diretamente nas colmias. (Rial-Otero, 2007). O uso de acaricidas implica em risco de poluio direta no mel e nos outros produtos das colmias. Vrios mtodos tm sido desenvolvidos para determinao de resduos de acaricidas em amostras de mel.

    Os nveis de concentrao de resduos so influenciados pelo seu uso em condies e quantidades adequadas, pela estao do ano e pela polaridade e estabilidade das substncias qumicas (Martel, 2002). Muitos trabalhos para determinao de resduos dos agrotxicos no mel so concentrados na determinao de substncias que so usadas como tratamento de apirios para controlar o Varroa jacobsoni, um caro parastico que afeta as colnias da abelha domstica (Bernal, 2000; Jimenez, 2000, Korta, 2001; 2002; Martel, 2002). Outros estudos foram focalizados nos agrotxicos usados para a proteo de

  • plantaes e introduzidos em colmias pelas abelhas e por cera contaminada (Albero, 2004; Blasco, 2003, 2004a, 2004b; Rissato, 2006; Campilo, 2006; Pirard, 2007). Pelos resultados obtidos por Rissato e colaboradores (2006), foi possvel constatar que a contaminao das reas vizinhas ao apirio, as quais distavam cerca de 3 km, determinaram o tipo e a concentrao de agrotxicos encontrados nas amostras do mel estudado. O trabalho mostra o potencial do mel como bioindicador, podendo ser aplicado a qualquer outra regio e fontes de poluio. A determinao de resduos para monitoramento de mel concentrada na determinao dos resduos de algumas classes de agrotxicos tais como piretrides, organoalogenados, organonitrogenados e organofosforados (Albero, 2004).

    2.7.5 Limites Mximos de Resduos (LMRs)

    Devido ao risco em potencial desses resduos para a sade humana, a determinao de um limite mximo de resduos (LMR) tornou-se necessria a fim de garantir a segurana alimentar. De acordo com a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), LMR a quantidade mxima de agrotxico

    legalmente aceita no alimento, em decorrncia da aplicao adequada numa fase especfica, desde sua produo at o consumo. expressa em miligramas de resduos por quilograma de alimento (mg kg-1). A concentrao mxima de resduos de agrotxicos permitida legalmente no mel, LMR, foi estabelecida por regulamentos de diferentes pases. Alemanha, Itlia, e Sua ajustaram o LMR para amitraz, bromopropilato, coumafs, ciamizol, flumetrina e fluvalinato, que oscilaram entre 0,01 e 0,1 mg kg-1 na Alemanha, 5 e 500 mg kg-1 na Sua, e 10 mg kg-1 na Itlia. A legislao da unio europia (EU) regulou o LMR para trs acaricidas, amitraz, coumafs e ciamizol, em 0,2, 0,1, e 1 mg kg-1, respectivamente, e a Agncia de Proteo Ambiental dos EUA estabeleceu LMR para amitraz (1 mg kg-1), coumafs (0,1 mg kg-1) e fluvalinato (0,05 mg kg-1). At agora, os limites mximos de resduos de agrotxicos no mel no foram includos no Codex Alimentarius (Rissato, 2006). No Brasil, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), incluiu o mel no Programa de controle de resduos e contaminantes (PNCR) no ano de 2007. O programa, que foi regulamentado pela Instruo Normativa no 9 de 30 de maro de 2007, prev a execuo de anlises e determina o LMR para vrios tipos de compostos halogenados, organoclorados, carbamatos, piretrides e organofosforados (Brasil, 2007).

  • Tabela 7. Programa de controle de resduos e contaminantes em mel PNCR/2007. Plano de Controle

    LQ Limite de quantificao LMR Limite mximo de resduo (*) NA - Nvel de Ao CG-EM Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas Fonte: Instruo Normativa no 9, de 30 de maro de 2007. MAPA.

  • 2.7.6 Anlises multirresduo para deteco de agrotxicos

    O uso de agrotxicos na agricultura tem resultado na ocorrncia destes compostos em produtos agrcolas. O monitoramento destes produtos quanto presena de contaminantes se torna indispensvel devido aos riscos sade do consumidor. Contudo, para um determinado nmero de produtos como o mel, h uma limitao no nmero de mtodos de anlise multirresduo de agrotxicos. Um dos fatores limitantes para que isso acontea, a grande diversidade de propriedades fsico-qumicas apresentada pelos agrotxicos, assim como a complexidade da matriz a ser analisada. Vrios mtodos para a anlise multirresduos j foram desenvolvidos, porm muitos destes apresentam etapas laboriosas que demandam tempo, dinheiro e acabam gerando uma grande quantidade de resduos txicos (Lehotay, 2004). Os extratos provenientes de alimentos so normalmente matrizes muito complexas por possurem um grande nmero de interferentes que resultam em problemas durante as anlises. Sendo assim, a etapa de preparao das amostras de vital importncia para o estabelecimento da metodologia. Etapas de pr-tratamento e clean up das amostras so laboriosas e exigem uma grande demanda de tempo, uso de grandes quantidades de solventes (Campilo, 2006; Rial-Otero, 2007).

    2.7.7 Tcnicas de extrao e concentrao

    A extrao e a concentrao dos analitos das amostras para as anlises cromatogrficas so de vital importncia para o desempenho dos mtodos, pois

    propiciam a concentrao dos analitos e a eliminao de possveis interferentes da matriz. RialOtero et al. (2007) descrevem, em uma reviso, o estado da arte para a determinao de agrotxicos em mel, focado no tratamento das amostras e na instrumentao usada. Para o tratamento das amostras, so descritas vrias tcnicas como o uso de extrao lquido-lquido (LLE), extrao em fase slida (SPE) entre outras. A extrao do tipo LLE tambm conhecida como extrao com solvente ou particionamento. um mtodo para separar compostos baseados na suas afinidades por dois diferentes lquidos imiscveis que so, normalmente, a gua e um solvente orgnico. O processo consiste na extrao de uma substncia de uma fase lquida para uma outra de maior semelhana fsico-qumica. A extrao LLE um procedimento bsico em laboratrios qumicos e realizada usando funis de separao. , tambm, usada em escala industrial para a separao de compostos derivados de reaes qumicas. Segundo Rial-Otero (2007), o procedimento de extrao em fase slida (SPE) um mtodo de separao que utiliza uma fase slida ou uma fase lquida sob um suporte slido para isolar um determinado analito de uma soluo. A SPE baseada na afinidade preferencial dos solutos desejveis e indesejveis por um material slido ou um slido revestido com um filme lquido ou que apresente cargas superficiais. A SPE pode ser usada nas etapas de concentrao e "clean up" de uma amostra antes da anlise cromatogrfica ou outros mtodos analticos para quantificar os analtos presentes. A fase slida adsorvente deve ser condicionada e ativada com um solvente apropriado para que os analitos sejam efetivamente separados da fase lquida. Para a extrao e concentrao

  • de compostos hidrofbicos, usam-se normalmente fases slidas revestidas com compostos contendo 8, 12 ou 18 tomos de carbono (cartuchos C-8, C-12 ou C-18). Alm destas, vrias outras fases slidas so disponveis, dentre elas as de resinas de troca inica para a separao de ctions e nions fracos e fortes. Fases slidas de slica gel ativada e alumina so usadas para a reteno de compostos polares na etapa de limpeza de extratos. Uma metodologia para extrao de resduos de agrotxicos usando fase slida dispersiva, denominado QuEChERS (do ingls, quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) foi desenvolvida entre 2000 e 2002 e foi introduzida recentemente por Anastassiades e colaboradores (2003). Embora seja um mtodo muito novo, j foi amplamente aceito pela comunidade internacional de analistas de resduos de agrotxicos e uma srie de publicaes j reportam este mtodo na sua forma original ou com modificaes (Lehotay, 2004). O procedimento envolve uma extrao inicial com acetonitrila seguido por uma extrao / separao aps a adio de uma mistura de sais sulfato de magnsio e cloreto de sdio. Uma alquota transferida para um novo tubo e o procedimento repetido. O extrato final em acetonitrila poder ser analisado por LC ou GC. O QuEChERS tem alcance amplo, incluindo agrotxicos altamente polares bem como altamente cidos e bsicos. Como vantagens, esto a baixa quantidade de solvente, vidraria, bancada e espao necessrios (Pay, 2007).

    2.7.8 Tcnicas para determinao de resduos de agrotxicos

    Vrias metodologias utilizadas para a determinao de resduos de agrotxicos so baseadas em mtodos cromatogrficos.

    Cromatografia uma tcnica utilizada para a separao dos componentes de uma mistura. A separao cromatogrfica baseada na distribuio dos componentes entre uma fase estacionria e uma fase mvel. Esta separao resulta das diferenas de velocidade dos componentes arrastados pela fase mvel devido s diferentes interaes com a fase estacionria (Peres, 2002). A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) e a cromatografia gasosa (GC) so tcnicas tradicionalmente empregadas nas anlises de resduos de agrotxicos. So utilizadas para separao e quantificao de substncias diversas, podendo tambm ser utilizadas como tcnica de identificao quando acopladas a um espectrmetro de massas ou outro detector qualitativo. Suas resolues so excelentes, sendo possvel analisar vrias substncias em uma mesma amostra (multirresduos). A sensibilidade da cromatografia bastante elevada. Dependendo do tipo de substncia analisada e detector empregado, podem-se obter resultados quantitativos em valores que variam de picogramas a miligramas (Collins, 1997). Os agrotxicos so agrupados por tcnicas de anlise e deteco sendo os organoclorados normalmente analisados por cromatografia gasosa e detector de captura de eltrons (GC-ECD), os organofosforados e nitrogenados por cromatografia gasosa com detector fotomtrico de chama (GC-FPD) ou nitrognio-fsforo (NPD) e para os carbamatos o uso de HPLC com detector no UV/Vis ou fluorescncia (Rial-Otero, 2007). 2.7.8.1 Cromatografia lquida A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) comumente empregada para anlise de componentes no volteis e foi

  • utilizada por alguns autores para anlise de resduos de agrotxicos. A separao por HPLC baseada na interao e na partio diferencial da amostra entre uma fase lquida mvel e uma fase estacionria. Os mtodos cromatogrficos comumente utilizados podem ser classificados como: quiral, troca inica, afinidade/on par, fase normal, fase reversa e excluso molecular (US-FDA, 1994).

    Figura 7. Representao esquemtica de cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) Fonte: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/lc - Hardy, J. K (2000). Para determinao de resduos de agrotxicos em mel so utilizadas tcnicas de HPLC em fase reversa usando colunas do tipo C18 ou octadecilsilano como Novapak-ODS (150mm x 3,9 mm) (Bernal, 1997); Hypersil (250mm x 4,6mm ) (Jimnez, 2000); C18 (150 mm x 3,9 mm., 4 m) (Korta, 2001); Li-Chrospher 100 RP-18, (250mm x 4,.0 mm, 5 m) (Martel, 2002); Luna C18 (250mm 4,6mm, partcula: 5m) coluna de guarda C18 (4mm 2mm.) (Blasco, 2003 e 2004a); Polaris C18-A (150 mm2,0 mm, 3m, 200 A) (Pirard, 2007); ODS (3,5 m, 150 x 2.1 mm) (Lopez, 2007). A cromatografia em fase reversa com detector ultravioleta-visvel (UV-Vis) a tcnica mais comum de deteco de analitos, em que a fase normal usa gua

    como solvente bsico. Normalmente, o componente mais polar elui mais depressa que o componente menos polar. A deteco por UV-Vis pode ser utilizada para todas as tcnicas cromatogrficas. No entanto, a sensibilidade depende da absortividade molar dos analitos. Bernal (1997) adaptou procedimentos utilizados para anlise de resduos em vegetais com extrao com solventes e clean up para anlises em produtos de apirios como mel, cera de abelha, larvas e plen. Dois tipos de detectores foram utilizados para determinar e confirmar a presena dos resduos de um tipo de fungicida nas amostras previamente contaminadas, detector de fluorescncia e espectrometria de massas. Outros tipos de detectores foram utilizados como detector de ultravioleta/visvel (UV/vis) na faixa de 210 nm. (Jimnez, 2000) e 210 a 250nm (Korta, 2001), arranjo de diodos (Martel, 2002), espectrometria de massas com ionizao qumica em presso atmosfrica (APCI-MS) (Blasco, 2003, Blasco, 2004a). Para o estudo de estabilidade de alguns tipos de acaricidas, Korta (2001) utilizou amostras contaminadas com solues em concentraes de 10 a 25 g g-1 que ficaram estocadas em temperatura ambiente por nove meses sem exposio direta ao sol. O HPLC/UV-vis foi utilizado no estudo da cintica para mensurar a diminuio da rea do pico dos acaricidas em funo do tempo. De acordo com Martel (2002), o HPLC em fase reversa mostrou ser uma alternativa rpida, econmica e simples se comparada ao GC para separao e determinao de acaricidas. Com o uso da coluna C18 e detector de arranjo de diodos, o autor obteve limites de deteco comparados aos obtidos por GC com detectores de captura de eltrons, nitrognio-fsforo ou ionizao de chama. Os sistemas de anlise de multirresduos, baseados no uso de HPLC com detectores

  • especficos tm a grande vantagem de proporcionarem evidncias de identidade e meios de medir um ou mais agrotxicos de uma ampla gama de resduos. Pirard (2007) utilizou a tcnica de extrao lquido-lquido em coluna de terra diatomcea seguida da anlise por HPLC e espectrometria de massas/massas. A tcnica foi desenvolvida e validada segundo os critrios da ISO 17025 para a identificao e quantificao de 17 diferentes inseticidas em mis da Blgica. 2.7.8.2 Cromatografia gasosa A cromatografia gasosa utilizada por vrios autores para anlise de resduos de agrotxicos em mel. O nitrognio e o hlio so usados como gs de arraste e as rampas de temperatura variaram de acordo com a coluna escolhida. As colunas comumente utilizadas para determinao dos resduos so de mdia e baixa polaridade. Apesar das variaes em comprimento, dimetro interno e espessura dos filmes os autores utilizam colunas capilares com fases estacionrias com 5% fenilmetilpolisiloxano ou 50% fenilmetilpolisiloxano na maioria dos trabalhos (Bernal, 1996; Lanas,1997; Jimenez, 1998a, 1998b; Bernal, 2000; Russo, 2002; Blasco, 2003; Albero, 2004; Blasco, 2004b; Campillo, 2006; Rissato, 2006). Os detectores de captura de eltrons ECD (Bernal, 1996; Lanas,1997; Jimenez, 1998a; Jimenez, 1998b; Russo, 2002; Blasco, 2004b; Rissato, 2004), nitrognio-fsforo NPD (Jimenez, 1998b), ionizao de chama (Bernal, 2000), emisso atmica AED (Jimenez, 2002) e a espectrometria de massas - MS(Jimenez, 2002; Russo, 2002; Blasco, 2003; Albero, 2004; Blasco, 2004b; Rissato, 2004; Rissato, 2006) podem ser utilizados para anlise de vrios tipos de resduos de agrotxicos.

    Em seu trabalho, Jimenez (2002) concluiu que a combinao de GC-MS e GC-AED facilitou a procura e a identificao de produtos de degradao de clordimeforme em mel.

    Figura 8. Estrutura de clordimeforme e de seus dois produtos de degradao (I) 4-chloro-o-toluidine (II) Clordimeforme (III) N-formyl-4-chloro-o-toluidine Fonte: Jimenez, 2002. De acordo com Blasco (2004b) a cromatografia gasosa com detector de captura de eltrons tem sido aplicada como tcnica preferencial para identificao e quantificao de agrotxicos organoclorados devido a sua alta sensibilidade por molculas que contm tomos eletronegativos, entretanto, a tcnica requer subseqente confirmao por um detector de espectrometria de massas. A utilizao de detector de captura de eltrons requer ateno na etapa de extrao e concentrao das amostras. A etapa de clean-up ou limpeza das amostras para analises de resduos de agrotxicos muito importante devido presena de compostos com alto peso molecular que podem contaminar os sistemas cromatogrficos quando utilizado esse tipo de detector. Os interferentes tornam a interpretao dos cromatogramas difcil por causa dos picos sobrepostos (Rissato, 2004).

  • Figura 9. Esquema do detector de captura de eltrons Fonte: www.chemistry.adelaide.edu.au Bernal (2000) estudou a presena de resduos do piretride acrinatrina e o principal produto de sua degradao em amostras de mel previamente contaminadas. Este tipo de agrotxico utilizado para o tratamento de colmias infestadas por Varroa jacobsoni como tratamento alternativo ao acaricida flavulinato. As anlises foram executadas com equipamento de cromatografia gasosa e detector de ionizao de chama. Foram comparados trs tipos de extrao para os analitos. Os ndices de recuperao para os analitos com extrao em florisil foram superiores s extraes com cartuchos de ODS e a extrao com solvente.

    Figura 10. Esquema do detector de ionizao de chama Fonte: www.chemistry.adelaide.edu.au

    2.7.8.3 Deteco por espectrometria de massas

    A espectrometria de massas pode ser considerada como uma das tcnicas analticas de maior importncia por permitir a elucidao estrutural de compostos desconhecidos pelos espectros de massas caractersticos e a quantificao de molculas conhecidas pelas intensidades dos ons produzidos. Os detectores por espectrometria de massas so usados para a produo de ons (positivos ou negativos) e a subseqente separao dos ons de acordo com a relao entre suas massas/cargas (m/z). Os espectrmetros de massas podem ser usados em combinao com as tcnicas de separao do tipo cromatografia gasosa e lquida (GC e HPLC). Estes instrumentos combinados so chamados de instrumentos acoplados (hyphenates); por exemplo, cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC/MS) ou cromatografia em fase lquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS). Os espectrmetros de massas consistem de uma interface para a introduo dos analitos, uma regio de produo de ons (ionizao), uma regio de separao dos ons analisador (m/z) e um detector. As regies do analisador e do detector trabalham sobre presses reduzidas (vcuo). Em alguns casos, a interface e a regio de ionizao so localizadas no mesmo espao, isto particularmente verdadeiro para as tcnicas acopladas cromatografia lquida - electrospray, Atmosferic Pressure Chemical Ionization (APCI) . Atualmente, os equipamentos apresentam, mesmo com variaes, uma configurao bsica como mostrado na Figura 11. A fonte de ionizao mais comum em espectrometria de massas a ionizao por eltrons (EI - electrons ionization), a qual emprega um filamento aquecido para gerar

  • eltrons com energia suficiente para provocar ionizao nos analitos de interesse. Os ons formados so direcionados para o analisador, cuja funo separ-los de acordo com sua relao massa/carga (m/z). Os analisadores de

    massas mais utilizados no presente so os quadrupolos e os ons trap, sendo que analisadores do tipo time-of-flight comearam a se tornar mais popular (Lanas, 2004).

    Figura 11. Esquema de um espectrmetro de massas tpico Fonte: www.chemistry.adelaide.edu.au Em equipamentos de cromatografia em fase lquida acoplada espectrometria de massas, utilizam-se como interfaces e fonte de ionizao tcnicas de ionizao em presso atmosfrica (API) Dentre elas, a ionizao por eletrospray, onde para a formao dos ons em fase gasosa, uma soluo contendo os analitos bombeada por um capilar muito fino e, na sua extremidade, uma alta voltagem (em torno de 4000 V) aplicada. H a formao de gotas (spray eletroltico), contendo um excesso de cargas positivas (analito ionizado). As gotas so atradas para o contra eletrodo e diminuem de tamanho, devido evaporao do solvente pela passagem de um gs inerte aquecido como o nitrognio. As molculas ionizadas, protonadas ou deprotondas, so introduzidas no analisador de massas e suas razes m/z determinadas. Podero ser analisados ons positivos ou negativos. Espectros de massas obtidos nos modos positivo e negativo so representados pelas siglas ESI(+)-MS e ESI(-)-MS, respectivamente. Rissato (2006) desenvolveu um mtodo multirresduo para determinao e confirmao de 48 agrotxicos de

    diferentes classes (organoalogenados, organofosforados, piretrides e organonitrogenados) em mel utilizando cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas, operando em modo de on seletivo (GC-MS-SIM) para monitoramento da contaminao regional usando o mel como bioindicador. As amostras foram coletadas na regio de Baur no Estado de So Paulo entre 1999 e 2004. Pang, (2006) desenvolveu e utilizou um mtodo multirresduo empregando SPE, seguida de GC-MS e LC-MS-MS para a determinao de 450 agrotxicos em mel, sucos de fruta e vinhos. O limite de deteco do mtodo apresentou uma faixa entre 1,0 300 ng g-1 dependendo do agrotxico analisado. Avaliou-se trs nveis de fortificao entre 2,0 3000 ng g-1 e os 450 compostos analisados apresentaram recuperaes mdias entre 59 123%, sendo que 97% do total de compostos analisados apresentaram desvio padro relativo (DPR) abaixo de 25%, os outros 3% apresentaram DPR entre 25,0 30,4% . Na literatura so descritas vrias metodologias baseadas em anlises

  • cromatogrficas objetivando a determinao de teores de agrotxicos em mel e que foram resumidos no quadro 2.

  • Quadro 2. Compilao de pesquisas relacionadas aos mtodos cromatogrficos para anlise de agrotxicos em mel

    Autor/ano Extrao TIPO Detector Coluna classe composto

    Fernndez, 1995

    Lquido-lquido GC ECD 25 m x 0,22 mm x 0,25 m organoclorados multirresduo

    Lquido-lquido

    SPE/ ODS MS 50% fenilmetilpolisiloxano 30 m x 0,25 mm x 0,25 m,

    Bernal, 1996 Limpeza:

    Florisil/ODS

    GC Captura de

    eltrons 50% fenilmetilpolisiloxano 60

    m x 0,25 mm x 0,25 m

    dicarboximida vinclozolina

    Detector de fluorscencia

    Novapak-ods 150 mm x 3,9 mm Bernal, 1997

    Lquido-lquido

    HPLC

    MS spherisorb ODS-2 2502 mm

    fungicidas benomil, carbendazina

    organofosforado dimetoato, malationa, metidationa, pirazofs, parationa Lanas,1997 Sistema "home-made" GC Captura de

    eltrons

    5% fenilmetilpolisiloxano 28 m x 0,25 mm x 0,4 m

    piretride, trans-permetrina

    Jimenez, 1998a SPME GC Captura de eltrons 50% fenilmetilpolisiloxano 60

    m x 0,25 mm x 0,25 m organoclorado

    organofosforado multirresduo

    Jimenez, 1998b Florisil GC Captura de

    eltrons NPD

    50% fenilmetilpolisiloxano 60 m x 0,.25 mm 0,25 m multirresduo

  • Autor/ano Extrao TIPO Detector Coluna classe composto

    Tsipi, 1999 SPE - C18 GC ECD HP-coluna capilar 30 m0,25 mm x 0,25 m organoclorado multirresduo

    Bernal, 2000

    Lquido-lquido SPE/

    ODS/florisil

    GC Ionizao de chama

    Fenilmetilpolisiloxano 25m x 25 mm x 0,25mm

    piretride acaricida inseticida

    acrinatrina 3-fenixi-

    benzaldeido (pba)

    Jimenez, 2000

    Lquido-lquido SPE/

    ODS/florisil

    HPLC UV Hypersil

    250 x 4,6mm

    inseticida rotenona

    Volante, 2001 SPME GC MS

    Restek RTX5MS 5% difenil 95% dimetil

    polisiloxano) 30 m x 0,25 mm x 0,25 m

    acaricida amitraz, coumaphos, cimiazole, bromopropylate and fluvahnate,

    acaricida amitraz clordimeforme,cymiazole, flumetrina organoalogenado bromopropilato

    organofosforado coumafs, Korta, 2001

    Lquido-lquido

    HPLC UV C18 15 cm x 3,9 mm x 4 m

    piretride tau-fluvalinato

    MS Jimenez, 2002

    Lquido-lquido

    GC

    Emisso atmica

    Db-17 50% fenilmetilpolisiloxano 30

    m x 0,25 mm, 0,25 m acaricida produtos da degradao de clordimeforme

    Piasenzotto, 2002 SPME GC

    Ionizao de chama

    Hp-innowax 30 m 0,32 mm x 0,5 m acaricida thimol

    Fernndez, 2002 SPE - C18 LC MS Spherisorb CLS organofosforado multirresduo

  • Autor/ano Extrao TIPO Detector Coluna classe composto

    Martel, 2002 Lquido-lquido HPLC Photodiode

    array detector

    Li-chrospher 100 rp- 18,5 m, 250 mm x 4.0 mm acaricida

    coumafs; bromopropilato amitraz; fluvalinato

    Captura de eltrons Russo, 2002

    Lquido-lquido

    SPE - C18 GC

    MS

    Se-54 5% fenil 1% vinil Metilpoliciloxano

    12m x 0,2 mm x 0,3 m

    piretride flavulinato

    SPE/ODS GC MS Db-5 fase ligada

    5% fenilmetilpolisiloxano 30 m x 0,25 mm x 0,25 m

    organoclorado multirresduo

    Blasco, 2003

    HPLC APCI-MS Luna c18

    250mm x 4.6 mm x 5 m C18 (4 x 2 mm i.d)

    organofosforado carbamato multirresduo

    Albero, 2004 SPE - C18 Slica bondesil GC

    MS

    Zb-5MS 5% fenilmetilpolisiloxano

    30 m x 0,25 mm x 0,25 m multirresduo

    Blasco, 2004a SPME SBSE HPLC APCI-MS

    Luna C18 250 mm 4.6 mm x 5 m

    coluna de guarda C18 (4mm 2mm i.d.)

    organofosforado clorpirifs-metil, diazinona, fonofs,

    phenthoate, phosalone, e pirimifs-etil

    Captura de eltrons Blasco, 2004b Lquido-lquido GC

    MS

    Db-5 5% fenilmetilpolisiloxano 30

    m 0,2 5mm 0,25 m organoclorado hexaclorociclohexano, hexaclorobenzeno, aldrin

    Captura de eltrons 30 m 25 mm 0,25 m

    Rissato, 2004 Fluido super crtico GC

    MS Lm-55% fenil 95%

    metilpolisiloxano 35 m 0,25 mm x 0,25 m.

    organoclorado, organofosforado,

    organonitrogenado piretride

    multirresduo

  • Autor/ano Extrao TIPO Detector Coluna classe composto

    Herrera, 2005 SPE GC ECD NPD

    007-2 Coluna capilar

    50 mx 0,25 mm x 0,25 m organoclorado multirresduo

    Sanchez-Brunete, 2005 SPE - C18 GC MS

    organoclorado, organofosforado

    piretride multirresduos

    Campillo, 2006 SPME GC Emisso atmica

    Hp-5 5% Fenilmetilpolisiloxano 30 m 0,32 mm 0,25 m

    organoclorado, organofosforado,

    organonitrogenado piretride

    multirresduos