Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014

7/23/2019 Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

LAÍS CRISTINA DA SILVA

Desenvolv imento e validação de um novo modelo depermeabilidade intestinal ex vivo em segmentos de jejuno de

ratos para screening de novas moléculas

Goiânia2014



LAÍS CRISTINA DA SILVA

Desenvolv imento e validação de um novo modelo de

permeabilidade intestinal ex vivo em segmentos de jejuno de

ratos para screening de novas moléculas

Dissertação de mestradoapresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúdeda Universidade Federal de Goiáspara obtenção do Título de Mestreem Ciências da Saúde.

Orientadora: Dra. Kênnia RochaRezende

Goiânia2014



ii

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúdeda Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno(a): Laís Crist ina da Silva

Orientador(a): Dra. Kênnia Rocha Rezende

Membros:

1. Kênnia Rocha Rezende - UFG

2. Francisco de Assis Rocha Neves - UNB

3. Leonardo de Souza Teixeira - Instituto de Ciências Farmacêuticas

OU

4. Stephânia Fleury Taveira - UFG

5.

Data: 29/ 09/ 2014



iii

Dedico este trabalho...

Á minha mãe Waldivina Maria da Silva e ao meu pai João Batista Silva (in

memoriam) que, sem dúvidas, mesmo tão distante está olhando por mim e me

guiando pelos melhores caminhos da vida.



iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pelo dom da vida.

À minha orientadora Kênnia Rocha Rezende pela oportunidade, confiança,

amizade, paciência e incomparável dedicação na minha formação acadêmica,

como profissional e como pessoa, proporcionando o desenvolvimento deste

trabalho.

À minha família pelo apoio incondicional, principalmente à minha mãe pelo

amor e apoio, sem dúvidas a melhor do mundo.

Aos meus amigos pelo imenso apoio e pelas palavras de motivação.

Aos queridos alunos de Iniciação Científica Alisson e Taynara, sem vocês

com certeza não seria possível. A todos do grupo de pesquisa BioPK, ao Instituto

de Ciências Farmacêuticas - ICF.

A todos os professores e servidores da Universidade Federal de Goiás, o

meu sincero muito obrigada!



v

Tabelas, figuras e anexos

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades físico-químicas, valores de dose e concentração dos

fármacos permeados ................................................................................... 30

Tabela 2. Condições cromatográficas transferidas a partir de métodos

farmacopeicos.............................................................................................. 32

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Montagem dos segmentos intestinais de ratos no sistema MTS-

Snapwell. ....................................................................................................... 3

Figura 2. Fluxo/movimento de moléculas através de uma determinada área

(A) em um dado período de tempo (t). ........................................................... 4

Figura 3. Esquema das etapas de transferência do fármaco a partir de uma

forma farmacêutica sólida para o TGI, descrevendo os três maiores

processos (Fa, Fg e F H) que afetam a absorção do local de administração até

a circulação sistêmica, processo conhecido como biodisponibilidade. .......... 7

Figura 4. Morfologia de alguns tipos básicos de epitélio. Suas diferentes

morfologias são encontradas em diferentes partes corpo, podendo

desempenhar funções de absorção e excreção........................................... 11

Figura 5. Células epiteliais absortivas. As junções intercelulares definem a

fronteira entre as membranas apical e basal e permitem expressão de

proteínas polarizadas................................................................................... 12

Figura 6. Rotas pelas quais o fármaco pode ser absorvido. ....................... 14Figura 7. Principais estruturas que promovem a coesão entre as células. As

zônulas de oclusão (em destaque) costumam ser as junções mais apicais e

o termo "zônula" refere-se à formação de uma faixa pela junção e o termo

"oclusão" à fusão das membranas nessas junções promovendo um tipo de

vedação no espaço intercelular.................................................................... 15

Figura 8.Esquema do eletrodo EndOhm-24 snap. ..................................... 16

Figura 9. Classificação de fármacos segundo o BCS baseado nasolubilidade e permeabilidade...................................................................... 17



vi


Figura 10. Requisitos para aplicação da bioisenção à fármacos e produtos.

..................................................................................................................... 18

Figura 11. Modelo in vitro de cultura de células Caco-2 utilizado em estudos

de permeabilidade........................................................................................ 19

Figura 12. Modelo in vitro com membrana artificial PAMPA utilizado em

estudos de permeabilidade. ......................................................................... 20

Figura 13. Correlação de (A) permeabilidade PAMPA e (B) permeabilidade

celular Caco-2 com grau de absorção em humanos para medicamentos

comercializados. Esses fármacos são conhecidos por serem absorvidas

principalmente via difusão passiva. Cada ponto é a média de 3 ou mais

repetições..................................................................................................... 21

Figura 14. Aparato de permeação: Câmaras de Ussing. ............................ 22

Figura 15. Correlação entre a fração da dose absorvida em humanos (Fa%)

com a permeabilidade em humanos (in vivo) e a permeabilidade através de

jejuno de ratos (in vitro). Os números representam os seguintes compostos:

1 – inogatran, 2 – enalaprilato, 3 – atenolol, 4 – terbutalina, 5- creatinina, 6 –

metoprolol, 7 – propranolol, 8 – antipirina e 9 – naproxeno. Os compostos

10, 11 e 12 não foram informados nesta figura............................................ 24

Figura 16. Destacamento da camada seromuscular do tubo intestinal

animal. ......................................................................................................... 27

Figura 17. Monitoramento da resistência elétrica transepitelial utilizando

EVOM2. ........................................................................................................ 28

Figura 18. Representação esquemática do sistema MTS-SNAPWELL. ..... 29

Figura 19. Estruturas químicas dos fármacos em estudo. .......................... 31

LISTA DE ANEXOS

Anexo A –Parecer do Comitê de Ética ...................................................... 56

Anexo B – Confirmação de submissão do artigo ....................................... 57

Anexo C – Normas de publicação do artigo ............................................... 58

Anexo D – Cromatogramas dos fármacos testados a partir da revalidação

das metodologias farmacopeicas conforme seção 3.8. .............................. 72



vii


Anexo E – Gráficos da linearidade para os fármacos testados conformeseção 3.8 ..................................................................................................... 74 Anexo F – Gráficos da precisão e exatidão para os fármacos testadosconforme seção 3.8...................................................................................... 75



viii

Símbolos, siglas e abreviaturas

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BCS - Biopharmaceutical Classification System

DMSO - Dimetilsulfóxido

Fa (%) - Fração do fármaco absorvida.

FDA - Food and Drug Administration

LQ – Limite de Quantificação

PAMPA - Parallel artificial membrane permeability assayPapp - Permeabilidade aparente (cm/s)

Peff - Effective permeability

P-gp – P-glicoproteína

Peff - Permeabilidade efetiva (cm/s)

TEER- Resistência Elétrica Transepitelial

USP- United States Pharmacopeia

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS



ix

Resumo

RESUMO

Os principais modelos preditivos da absorção de potenciais novos fármacos

na etapa pré-clinica são focados na mucosa gastrointestinal, haja vista apredominância desta via na administração medicamentosa. Frequentemente,

a fração absorvida (Fa) pode ser predita em modelos ex vivo em câmaras de

Ussing, in vitro em monocamadas de células Caco-2, perfusão intestinal in

situ e estudos de absorção in vivo. No presente estudo, a partir de uma

adaptação do aparato Snapwell™, um novo modelo ex vivo de avaliação da

permeabilidade para substâncias absorvidas por difusão passiva é proposto.

Substâncias de alta (metoprolol, cafeína e teofilina) e baixa (atenolol,ranitidina e cimetidina) permeabilidade, foram mantidos em incubadora à

37OC, sob agitação constante (60 rpm) e atmosfera carbogênica (5% CO2). A

viabilidade da membrana jejunal (52 ± 8,0 Ω.cm2) foi observada mantendo-

se acima de 20 Ω.cm2 por até 120 min de incubação, sob todas condições

avaliadas incluindo a adição de co-solventes (DMSO 1% e EtOH 1%). Os

valores de coeficientes de permeabilidade aparente obtidos (Papp)

mostraram-se característicos de estudos ex vivo de permeação (3,8 – 12,6

x10-6 cm/s). Forte correlação foi observada entre os dados aqui obtidos

versus dados de perfusão intestinal in vivo (r = 0,89), assim como da fração

absorvida em humanos (r = 0,85), relatados na literatura. Adicionalmente, o

modelo apresenta elevada sensibilidade e precisão frente aos demais

modelos comumente utilizados na classificação da permeabilidade de

substâncias. Em consonância, pode-se inferir que o modelo MTS-

SNAPWELL demonstra, até o momento, potencial aplicação em estudos de

screening para seleção de moléculas de baixo peso molecular, tais como

potenciais fitofármacos, assim como seus análogos sintéticos avaliados com

baixa quantidade de amostra (c.a. 10 mg).

Palavras- chave: modelo ex vivo , integridade da membrana; permeabilidade

aparente,TEER.



x

Abstract

ABSTRACT

The main predictive models of absorption of potential new drugs in preclinical

stage are focused on the gastrointestinal mucosa, given the predominance of

this pathway in drug administration. Often, the fraction absorbed (Fa) can be

predicted in ex vivo models (p.e. Ussing chambers), in vitro (p.e. Caco-2 cells

monolayers), intestinal perfusion studies in situ and in vivo absorption. In the

present study, from an adaptation of Snapwell ™ inserts, a new ex vivo

model to evaluate the permeability of substances passively absorbed is

proposed. High permeable drugs (metoprolol, caffeine and theophylline) and

low permeable drugs (atenolol, ranitidine and cimetidine) were maintained in

an incubator at 37 ° C under constant stirring (60 rpm) and carbogenic

atmosphere (5% CO2). The viability of the jejunal membrane (52 .cm2 ± 8.0)

was observed remaining above 20 .cm2 for 120 min incubation, under all

conditions evaluated, including the addition of co-solvents (1% DMSO and

1% EtOH). Values of apparent permeability coefficients obtained (Papp) were

characteristic of ex vivo permeation studies (3.8 to 12.6 x10-6 cm / s). Strong

correlation was observed between the data obtained here versus data

intestinal perfusion in vivo (r = 0.89), as well as the fraction absorbed in

humans (r = 0.85), reported in the literature. Additionally, the model features

high sensitivity and accuracy compared to other commonly used models in

classification permeability of substances. In line, we can infer that the MTS-

SNAPWELL model demonstrates, yet, potential application in studies of

screening for selection of low molecular weight, such as potential

phytochemicals, as well as their synthetic analogues evaluated with lowamount of sample (ca 10 mg).

Keywords: apparent permeability; ex vivo model, membrane integrity;

TEER.



xi

Sumário

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 1

1.1. Fundamentos da permeabilidade ............................................................. 3

1.4.1. Condições sink..................................................................................... 6

1.2. Absorção de fármacos pelo trato gastrointestinal..................................... 6

1.1.1. Propriedades físico-químicas dos fármacos......................................... 9

1.1.2. Aspectos morfofisiológicos do tecido epitelial .................................... 11

1.3. Mecanismos de permeabilidade de fármacos através da membrana

intestinal............................................................................................................ 13

1.4. Resistência elétrica transepitelial (TEER)............................................... 151.5. Permeabilidade segundo o BCS............................................................. 16

1.6. Métodos alternativos para determinação da permeabilidade ................. 19

2. OBJETIVOS ................................................................................................. 25

2.1. Objetivo geral ......................................................................................... 25

2.2. Objetivos específicos.............................................................................. 25

3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 26

3.1. Materiais, solventes e reagentes utilizados ............................................ 263.2. Equipamentos utilizados......................................................................... 26

3.3. Obtenção e preparo da membrana biológica.......................................... 27

3.4. Avaliação da viabilidade tecidual na presença de vermelho de fenol e

cafeína .............................................................................................................. 27

3.5. Avaliação da viabilidade tecidual na presença de co-solventes ............. 28

3.6. ensaio de permeabilidade ex vivoHTS-SNAPWELL.............................. 28

3.7. calculos do coeficiente de permeacao................................................... 303.8. Revalidacao dos métodos analíticos em hplc-pda.................................. 31

4. RESULTADOS ............................................................................................. 33

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................... 49

6. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 50

ANEXOS ........................................................................................................... 56

6.1. Anexo A – Parecer do Comitê de Ética .................................................. 56

6.2. Anexo B – Confirmação de submissão do artigo.................................... 57

6.3. Anexo C – Normas de publicação do artigo ........................................... 58



xii

Sumário

6.4. Anexo D – Cromatogramas dos fármacos testados a partir da

revalidação das metodologias farmacopeicas conforme seção 3.8. ................. 72

6.5. Anexo E – Gráficos da linearidade para os fármacos testados conforme

seção 3.8. ......................................................................................................... 74

6.6. Anexo F – Gráficos da precisão e exatidão para os fármacos testados

conforme seção 3.8........................................................................................... 75



1

Introdução

1. INTRODUÇÃO

As abordagens atuais para avaliação da absorção de potenciais novosfármacos em diferentes fases de seu descobrimento e desenvolvimento abrangem

vários modelos. Dentre os modelos preditivos da absorção têm-se métodos in silico

e com membranas artificiais, além de modelos ex vivo como câmaras de Ussing, in

vitro com monocamadas de células Caco-2, perfusão intestinal in situ e estudos de

absorção in vivo. Em comum, todos estes modelos visam predizer a fração do

fármaco absorvida (Fa) em humanos (CARVALHO et al., 2007).

Tradicionalmente, as plantas representam uma inesgotável fonte recursos nabusca por potenciais novos fármacos. Com cerca de um terço da flora mundial, o

Brasil encontra-se numa posição pouco expressiva diante do mercado fitoterápico

mundial. Sua parcela contabilizava, aproximadamente, 4% do total do segmento

global de U$14 bilhões de dólares em 2007. Como muitos pesquisadores acreditam

que o país deveria ser líder nesta área, pois apresenta a maior biodiversidade do

planeta, acredita-se que o Brasil deixe de gerar cerca de 5 bilhões/ano, por não

conseguir transformar sua flora em medicamentos. Explicita-se assim, sua carência

em estratégias eficazes de descobrimento e exploração racional de potenciais novos

fármacos (CARVALHO et al., 2007; MIOTO, 2010).

Para se priorizar o estudo das espécies vegetais (cerrado e pantanal), a

seleção de potenciais moléculas pode ser baseada na predição da absorção de

substâncias oriundas do metabolismo secundário das plantas. Para moléculas cujo

perfil de absorção for favorecido, a biodisponibilidade prevista é virtualmente maior,

assim como seu potencial de sucesso em estudos clínicos posteriores.

Neste contexto, há modelos de investigação da Fa, que podem viabilizar a

seleção de moléculas dentre um grupo de substâncias presentes em p.e. amostras

de extratos vegetais, baseada na classificação de sua permeabilidade (alta ou

baixa). Nas maiores empresas farmacêuticas mundiais, o uso de membranas

artificiais biomiméticas (PAMPA) representa uma estratégia consolidada. Estas

abordagens são de alta capacidade de análise (high-throughput) e apresentam boa

correlação com estudos em humanos (KANSY et al., 1998).

Experimentos de permeabilidade podem ainda ser associados a métodos in

silico (ex.: iDEA TM) gerando predições mais exatas. Softwares podem ser



2

Introdução

alimentados com dados de permeabilidade em Caco-2 e de solubilidade obtidos em

vários pHs. Posteriormente, as substâncias de alta permeabilidade, resultantes da

pré-seleção, podem ser avaliadas em Caco-2, uma vez que as membranas artificiais

não possuem sistemas de transporte ativo e mecanismos de efluxo como as P-

glicoproteínas (PgP). Outra linhagem de células, a MDCK permite ainda

investigações mecanísticas e avaliações de interações farmacológicas quanto a

participação das PgP no processo de absorção (REZNIK et al., 1983; BOHETS et al,

2001).

Técnicas de permeação como o modelo de saco invertido e câmaras de

Ussing são priorizadas quando há necessidade de se obter informações adicionais

com respeito ao metabolismo. Já o modelo in situ de perfusão intestinal em ratos, éuma técnica confiável na investigação do potencial de absorção combinado ao

metabolismo intestinal. Entretanto, é uma técnica morosa e, portanto, não apropriada

ao screening de grande número de candidatos. Finalmente, a absorção pode ainda

ser estimada in vivo a partir de estudos de biodisponibilidade (razão entre AUC após

administração oral comparada à intravascular) (WILSON & WISEMAN, 1954;

BOHETS et al, 2001).

Mediante o emprego destas técnicas busca-se a integração entre parâmetrosfarmacocinéticos àqueles farmacodinâmicos gerados em estudos farmacológicos

não clínicos. Estes representam aspectos chave no processo de busca de potenciais

fármacos baseados na eficácia e segurança dos mesmos, em particular, no

processo de transposição dos estudos não clínicos aos clínicos. Como amplamente

divulgado, observa-se elevada taxa de fracassos durante o desenvolvimento de

novos fármacos, sendo que a causa mais frequentemente relacionada é o mau

desempenho farmacocinético dos candidatos. Prentis e colaboradores (1988),relatam que dentre 319 candidatos a novos fármacos investigados em humanos, 198

foram retirados, sendo que 77 destes (aproximadamente 40%) devido ao perfil

farmacocinético inadequado de tempo de meia-vida, pobre absorção ou extensivo

metabolismo pré-sistêmico.

Estes fatos apontam a bioprospecção farmacocinética nos estágios iniciais de

desenvolvimento de novos fitofármacos como uma ferramenta fundamental para

fornecer informações decisivas já no início do processo de desenvolvimento de

candidatos a novos fármacos.



3

Introdução

Neste contexto, o modelo MTS-SNAPWELL foi desenvolvido a partir de uma

adaptação do aparato de permeação Snapwell™ (Corning® Costar®, New Yor,

USA), comumente utilizado em culturas celulares, onde foram montados segmentos

de intestino de ratos (Figura 1), para avaliação da permeabilidade de substâncias.

Figura 1. Montagem dos segmentos intestinais de ratos no sistema MTS-Snapwell.

Fonte: Center of Mucosal Biology – University of Maryland/USA, Maio 2010.

Assim, este trabalho tem por objetivo desenvolver e validar o modelo ex vivo

de permeação MTS-SNAPWELL para posterior aplicação na seleção de potenciais

espécies vegetais e/ou sintéticas.

1.1. FUNDAMENTOS DA PERMEABILIDADE

A permeabilidade baseia-se na medida indireta da extensão da absorção(fração da dose absorvida) do fármaco em humanos e diretamente sobre a medida

da taxa de transferência de massa através da membrana intestinal. O transporte de

moléculas de uma solução através de uma barreira é geralmente medida pelo fluxo.

O fluxo de um soluto é definido como a massa ou número de moléculas movendo

através de uma determinada área em um determinado tempo (Equação 1)

(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010):

Onde J é o fluxo da massa de uma substância m, movendo através de uma

determinada área A em um tempo t. O fluxo é expresso em mol cm-2min-1 ou

alternativamente em µg cm-2h-1.

(Equação 1)



4

Introdução

Figura 2. Fluxo/movimento de moléculas através de uma determinada área (A) em um dado períodode tempo (t).

Fonte: STEFFANSEN et al., 2010.

Este transporte de moléculas através de uma barreira pode ocorrer por

difusão ou migração, sendo que a migração de moléculas é causada por uma força

que atua em cada uma das moléculas do soluto, enquanto que a difusão é um

movimento térmico aleatório, que só ocorre mediante um transporte líquido das

moléculas na presença de um gradiente de concentração (STEFFANSEN &

NIELSEN, 2010).

A velocidade de difusão está relacionada ao coeficiente de difusão de um

soluto, uma constante relacionada às propriedades de uma dada molécula em um

dado solvente. Este coeficiente de difusão diminui à medida que o tamanho da

molécula aumenta, assim como pelo aumento da viscosidade do solvente.

O fluxo de difusão pode ser descrito pela relação conhecida como Lei de Fick,

sugerida pelo fisiologista Adolf Fick (Equação 2):

A lei de Fick descreve um fluxo (J), por um gradiente de concentração (δC),

em um plano ao longo do tempo (t) para um soluto (x) com um coeficiente de difusão

D.

O fluxo é comumente usado na área biofarmacêutica em estudos de

transporte de potenciais candidatos a fármacos e pró-fármacos através de uma

barreira, como em modelo de cultura de células ou modelos utilizando tecidos

intestinais. Para avaliação do fluxo nestes experimentos, os mesmos devem ser

conduzidos sob condições específicas como, um compartimento doador contendo

uma quantidade inicial de um fármaco em um volume definido, uma barreira com

(Equação 2)



5

Introdução

área e espessura definidas, por fim um compartimento receptor com concentração

inicial e volume definidos (JAMBHEKAR & BREEN, 2009; STEFFANSEN &

NIELSEN, 2010).

A agitação é um fator importante nos experimentos de permeação, devendo

esta ser completa nos compartimentos doador e receptor, garantindo que não haja

gradiente de concentração dentro de ambos os compartimentos, uma vez que o

único gradiente presente é através da barreira que separa os dois compartimentos.

Este fluxo, de forma simplificada, é medido por meio de coletas de amostras do

compartimento receptor em tempos pré-determinados, após a adição do fármaco no

compartimento doador (INGELS & AUGUSTIJNS, 2003; STEFFANSEN & NIELSEN,

2010).

Uma vez estabelecido o fluxo, é possível calcular o coeficiente de

permeabilidade (P), ocasionalmente denominado como Papp (aparente) ou Peff

(efetiva). Neste contexto, assumindo que o gradiente de concentração através da

barreira seja linear e constante, o coeficiente de permeabilidade pode ser calculado

simplificando a lei de Fick (Equação 3), onde assume-se que a concentração do

fármaco no compartimento doador é constante, enquanto que no compartimento

receptor, comparada com o doador, essa concentração é virtualmente zero(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

Como pode ser observado na Equação 3, o fluxo é proporcional ao gradiente

de concentração e a permeabilidade é uma constante que relaciona ambos.

Portanto, a permeabilidade de fármacos através de uma barreira pode ser estimada

por meio de um simples experimento de fluxo num determinado gradiente de

concentração. Os valores de permeabilidade obtidos podem ser comparados com

valores obtidos por meio de diferentes técnicas, caracterizando assim, os fármacos

em termos de permeabilidade (STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

(Equação 3)



6

Introdução

1.4.1. Condições sink

Farmacologicamente, após a absorção através do epitélio intestinal, o

fármaco é rapidamente removido pelo sangue, do sistema porta. Desta forma, é

mantido um gradiente de concentração, o qual funciona como uma força motriz para

o seu transporte, esta condição é denominada condição sink (BUCKLEY et al,

2012).

De forma semelhante em modelos in vitro, as condições sink podem ser

mantidas ao longo do experimento. Para tal, deve-se garantir que o fármaco

permeado para a câmara receptora não retorne ao compartimento doador por

difusão (back difusion). Em estudos de permeabilidade, a ocorrência deste processoreverso é tida como desfavorecida quando a concentração do fármaco no

compartimento receptor não excede a 10% da concentração do inicial do mesmo, no

compartimento doador (BUCKLEY et al, 2012).

Assim, o estabelecimento das condições sink é de fundamental importância

para garantir a confiabilidade dos resultados experimentais, uma vez que as

mesmas garantem que não haja acúmulo de substância na câmara receptora

promovendo saturação do meio, o que provoca o processo de difusão de retornopara o compartimento doador. Para tal, é fundamental o desenvolvimento de

condições adequadas de agitação e meios fisiologicamente relevantes (INGELS &

AUGUSTIJNS, 2003; BUCKLEY et al., 2012).

1.2. ABSORÇÃO DE FARMACOS PELO TRATO GASTROINTESTINAL

A absorção pode ser entendida como um conjunto de processos que

conduzem ao aparecimento do fármaco na circulação sistêmica, enquanto que a

permeabilidade baseia-se indiretamente na extensão da absorção (fração da dose

absorvida e não sistêmica) do fármaco em humanos e diretamente sobre a medida

da taxa de transferência de massa através da membrana intestinal (FORSYTH et al.,

2011; CARDOT et al., 1997).

Devido à sua complexidade, o processo de absorção de fármacos pelo trato

gastrointestinal (TGI) (Figura 3) pode ser afetado por diversos fatores. Dentre estes

fatores, estão as propriedades físico-químicas das moléculas, tais como: pKa,

solubilidade, lipofilicidade, massa molecular, presença de ligações de hidrogênio,



7

Introdução

área superficial polar-apolar, dentre outros. Dentre os moduladores do processo de

absorção temos os fatores fisiológicos, que correspondem ao pH do TGI, trânsito

intestinal, fluxo sangüíneo, esvaziamento gástrico, dentre outros mecanismos de

absorção (AMIDON et al., 2009).

Portanto, para serem absorvidos, os fármacos devem possuir adequada

solubilidade aquosa e permeabilidade, visto que estes são os parâmetros chave que

governam o processo de absorção, pois enquanto o fármaco não se encontra em

solução, o mesmo não consegue atravessar o epitélio intestinal e, diante de uma

permeabilidade limitada, a absorção também o será (AMIDON et al., 1995;

TAVELIN, 2002).

Figura 3. Esquema das etapas de transferência do fármaco a partir de uma forma farmacêutica sólidapara o TGI, descrevendo os três maiores processos (Fa, Fg e F H) que afetam a absorção do local deadministração até a circulação sistêmica, processo conhecido como biodisponibilidade.

Fonte: GRIFFIN & DRISCOLL, 2008.



8

Introdução

Neste contexto, a biodisponibilidade (F) pode ser definida como a fração ou

porcentagem do fármaco que atinge a circulação geral após sua administração

(LABAUNE, 1993). Segundo o FDA (2003), a biodisponibilidade indica a velocidade

e a extensão pelas quais um fármaco é absorvido, a partir de um produto

farmacêutico e torna-se disponível no local de ação. Esta depende principalmente de

três processos bastante complexos: fração absorvida (Fa), extensão da extração de

primeira passagem do fármaco pelas enzimas da parede intestinal (Eg) e extensão

do metabolismo de primeira passagem do fármaco no fígado (EH) (Equação 1)

(AMIDON et al., 1995).

F = Fa * (1 – Eg) * (1 – EH) (Equação 1)

A porcentagem do fármaco absorvido (Fa%) é o principal parâmetro

relacionado à biodisponibilidade i.e. a medida da extensão da absorção, ou seja, da

exposição do organismo ao fármaco após sua administração. A permeabilidade e a

fração dissolvida e concentração livre do fármaco no lúmen intestinal são as

variáveis chave que controlam a Fa% (AMIDON et al., 1995; STORPIRTIS et al.,

2009).

Desta forma, vários modelos não envolvendo humanos são atualmenteutilizados a fim de avaliar a permeabilidade, que é comumente apresentada como

sendo efetiva (Peff ) e/ou aparente (Papp), se diferenciando de acordo com o tipo de

modelo envolvido na sua determinação (in vitro, ex vivo, in situ e in vivo). A Peff é

determinada por meio de métodos in situ/in vivo, e pode ser calculada por meio da

equação abaixo (Equação 2) (LENNERÑAS, 2014; VOLPE, 2010):

Peff = (Cin – C out / Cout) * (Q in / 2 πrL) (Equação 2)

Onde Cin e Cout são as concentrações de entrada e saída do fármaco pelo segmento

intestinal, Qin a taxa de fluxo de perfusão e 2 πrL a área do cilindro.

Já a Papp é determinada por meio de métodos in vitro e ex vivo, podendo ser

calculada pela equação abaixo (VOLPE, 2010):

Papp = (dQ/ dt) * (C0 A) (Equação 3)



9

Introdução

Onde dQ/ dt é a taxa de fluxo constante, C0 é a concentração inicial do fármaco no

compartimento doador e A a área superficial efetiva.

1.1.1. Propriedades físico-químicas dos fármacos

Segundo Amidon e colaboradores (2009), as propriedades físico-químicas de

um fármaco são consideradas um dos fatores que afetam a permeabilidade e

consequentemente sua absorção, para tanto é imprescindível o conhecimento das

mesmas.

Em um trabalho publicado por Lipinski e colaboradores (2001), foi

apresentado um mnemônico chamado ‘Regra dos 5’, que é baseado em 4

parâmetros físico-químicos que são globalmente associados à solubilidade e

permeabilidade. Segundo a ‘regra dos 5’, os problemas de baixa absorção ou

permeabilidade, na sua maioria acontecem quando os compostos apresentam:

Mais de 5 doadores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma de OHs e

NHs);

Massa molecular maior que 500 Da;

Log P maior que 5 (ou MLog P maior que 4,15);

Mais de 10 aceitadores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma dos Ns

e Os).

Portanto, se o composto apresentar dois parâmetros fora da ‘regra dos 5’,

existe a possibilidade deste apresentar baixa permeabilidade e consequentemente

baixa absorção (LIPINSKI et al., 2001).

1.2.1.1 Coeficiente de part ição

Fundamentalmente, a lipossolubilidade de um fármaco é determinada pelo

seu coeficiente de partição entre duas fases imiscíveis, sendo um a água ou tampão

aquoso e a outra um solvente orgânico (JAMBHEKAR & BREEN, 2009).

Após sua administração por via oral, alguns fármacos podem apresentar

baixa absorção, mesmo estes se apresentando amplamente na sua forma não

ionizada, o que muitas vezes pode estar relacionado à baixa lipossolubilidade destasespécies não ionizadas, tornando assim, de grande importância o conhecimento



10

Introdução

coeficiente de partição de uma molécula, uma vez que este é diretamente

proporcional à taxa de fluxo de difusão através da membrana biológica podendo

influenciar diretamente na sua absorção pelo trato gastrointestinal (JAMBHEKAR &

BREEN, 2009).

1.2.1.2 Massa molecular e o processo de absorção

Muitos fármacos que possuem elevada massa molecular podem apresentar

baixa absorção. A massa molecular influencia diretamente na habilidade dos

fármacos em atravessar as membranas biológicas, i.e., quanto maior sua massa

molecular, mais difícil se torna sua passagem através da membrana, uma vez que o

transporte mais comum neste processo é a difusão passiva (KESTER et al., 2012;FLORENCE & ATTWOOD, 2006).

Em uma pesquisa realizada por Lipinski e colaboradores (2001), observaram

que, em universo de 2000 fármacos, cerca de 11% possuíam massa molecular

acima de 500 Da e 8% acima de 600 Da e o restante estando abaixo de 500 Da,o

que reflete que, moléculas de massa molecular elevada são menos susceptíveis de

serem absorvidas por via oral do que moléculas de massa molecular moderada

(FLORENCE & ATTWOOD, 2006).

1.2.1.3 Número de aceptores e doadores de ligação de hidrogênio

Outro fator que pode afetar a absorção de moléculas são as pontes de

hidrogênio, ao passo que, a grande quantidade destas nas moléculas, pode

prejudicar sua penetração através da membrana. Este fato pode estar relacionado à

alta dessolvatação da água, assim como interações desfavoráveis do hidrogênio

polarizado com cadeias alifáticas laterais de ácidos graxos presentes no interior da

membrana (ALEX et al., 2011).

As ligações de hidrogênio além de afetar o transporte de moléculas através

da membrana, também afeta a distribuição dos fármacos para dentro do sistema

biológico, muitas vezes reduzindo a solubilidade aquosa de tal forma a resultar em

propriedades farmacocinéticas desfavoráveis (KUBINYI, 2001).



11

Introdução

1.1.2. Aspectos morfofisiológicos do tecido epitelial

O epitélio pode ser classificado morfologicamente por três aspectos: quanto

ao número de camadas celulares, forma das células e presença de especializações

de superfície apical, como queratina e cílios (Quadro 1) (STEFFANSEN & NIELSEN,

2010).

Quadro 1. Classificações do epitélio. Este pode ser classificado quanto ao número de camadas, forma ouespecializações celulares. Frequentemente um epitélio será descrito com uma combinação destes termos.

Número de camadas

celularesFormas celulares Especializações

Plano e irregular: epitélio

escamoso

Cubóide: epitélio cubóide1: epitélio simples

> 1: epitélio estratificadoColunar alto: epitélio

colunar

Cílio apical: epitélio ciliado

Queratina na camada

apical: epitélio

queratinizado

*Fonte: Adaptado de STEFFANSEN et al., 2010.

De uma maneira geral, o epitélio simples, normalmente desempenha funçõesde absorção e excreção, enquanto que o epitélio estratificado possui função de

proteção. Suas diferentes morfologias são encontradas em diferentes partes do

corpo (Figura 4). O epitélio escamoso simples é frequentemente encontrado nas

vias aéreas, nas cavidades do corpo e vasos sanguíneos, permitindo o transporte

passivo de líquidos e gases entre os diferentes compartimentos. Já epitélio cubóide

é geralmente encontrado nos canais e tubos dos rins e glândulas. Por fim, o epitélio

colunar é encontrado em locais de alta absorção, como no intestino delgado(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

Figura 4. Morfologia de alguns tipos básicos de epitélio. Suas diferentes morfologias são encontradasem diferentes partes corpo, podendo desempenhar funções de absorção e excreção.

Fonte: Adaptado de STEFFANSEN et al., 2010.



12

Introdução

Com base na resistência do fluxo paracelular de água e soluto, o epitélio

possui junções que podem ser classificadas funcionalmente como estreitas ou

frouxas. O cólon e os canais de coleta dos rins, tipicamente possuem junções

estreitas onde a absorção de água e sais são transcelulares. Já o intestino delgado

e o tubo proximal dos rins são exemplos de junções frouxas em que o transporte de

substâncias é paracelular (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN &

NIELSEN, 2010).

Tanto as junções estreitas quanto as frouxas, são junções intercelulares,

diferenciando apenas quanto à sua permeabilidade. Essa diferença é o que

determina sua resistência elétrica, sendo que as junções frouxas apresentam valores

de resistência elétrica transepitelial abaixo de 200.cm2, enquanto que as junçõesapertadas apresentam valores de resistência acima deste (MARRERO et al., 1998).

1.1.2.1. Células epiteliais e junções celulares

As células epiteliais promovem uma barreira entre o corpo e seu ambiente

externo. As junções estreitas e a expressão de proteínas polarizadas contribuem

para que as células sejam capazes de permitir uma passagem controlada de água,

nutrientes e produtos residuais, mantendo assim o ambiente intracelular estável

(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010). As células

epiteliais absortivas estão representadas a seguir na Figura 5.

Figura 5. Células epiteliais absortivas. As junções intercelulares definem a fronteira entre asmembranas apical e basal e permitem expressão de proteínas polarizadas.

Fonte: http://www.sobiologia.com.br



13

Introdução

As células epiteliais estão conectadas por junções intercelulares pela

extremidade apical, podendo ser classificadas funcionalmente como junções de

comunicação, desmossomos, integrinas, dentre outros. Existem três diferentes tipos

de domínios de membrana: membrana plasmática apical, lateral e basal. As duas

últimas são normalmente classificadas em conjunto, denominada membrana

basolateral (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

As células epiteliais mantêm-se na membrana basal, por uma rede de

proteínas/polissacarídeos filamentosos e pelo tecido conectivo subjacente. A

permeabilidade passiva das junções estreitas e células epiteliais são os fatores que

determinam a função barreira do epitélio, assim como as propriedades da barreira

seletiva das células, a qual é determinada pela extensão do transporte de proteínas(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

As junções estreitas constituem uma barreira para a difusão de moléculas,

assim como uma barreira para difusão lateral das proteínas da membrana para

dentro da mesma. Um padrão de expressão de proteínas de membrana polarizada

é mantido pelas células epiteliais, possibilitando o transporte vetorial de água e

nutrientes. Adicionalmente, o tecido epitelial apresenta algumas importantes

especializações denominadas microvilosidades, que são pequenas projeções damembrana plasmática, que aumentam significativamente a superfície da área de

absorção (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

1.3. MECANISMOS DE PERMEABILIDADE DE FARMACOS ATRAVES DA MEMBRANA

INTESTINAL

O intestino delgado é dividido em três partes: duodeno, o jejuno e íleo. Seu

epitélio é bastante complexo e devido à presença de vilosidades e microvilosidades,cerca de 90% de toda absorção gastrointestinal ocorre no intestino delgado,

principalmente no duodeno e jejuno (CARDOT, 1997; BALIMANE et al., 2000).

O processo de absorção dos fármacos pela membrana intestinal ocorre por

um ou vários dos seguintes mecanismos (Figura 6), sendo que os mais comuns são

transporte passivo (transcelular/ paracelular) e ativo (TAVELIN, 2002).



14

Introdução

Figura 6. Rotas pelas quais o fármaco pode ser absorvido.

Fonte: Adaptado de SUGANO et al., 2010.

O transporte passivo ocorre a favor de um gradiente de concentração e não

requer energia, e pode ocorrer de duas formas: transcelular e paracelular. Oprocesso transcelular, ocorre com fármacos que possuem massa molecular

moderada (200-500 Da) e possuem certa lipofilicidade, assim a maior parte dos

fármacos que possuem rápida e completa absorção, são absorvidos via difusão

passiva transcelular. Já o processo paracelular, ocorre com fármacos que possuem

massa molecular relativamente baixa (em torno de 200-270 Da), relativa

hidrofilicidade, e desta forma, possuem maior afinidade pelo meio extracelular.

Geralmente, esta via resulta em absorção incompleta (TAVELIN, 2003;

LENNERÑAS & DRESSMAN, 2000).

Em oposição, o transporte ativo ocorre contrariamente ao gradiente de

concentração, o qual requer energia. Para um fármaco ser transportado por essa via,

o mesmo deve apresentar similaridade estrutural com o substrato. Porém,

encontram-se em número limitado estando frequentemente restritos às classes

terapêutica dos: antibióticos cefalosporínicos, citotásticos e inibidores da enzima

conversora de angiotensina, substratos para transportadores oligopeptídeos

(TAVELIN, 2002; LEE, 2000).



15

Introdução

A determinação da permeabilidade de uma substância através da membrana

gastrointestinal contribui na predição de sua biodisponibilidade. Atualmente existe

uma variedade de modelos experimentais para avaliar a permeabilidade intestinal de

candidatos a fármacos (SOUZA et al., 2007; BALIMANE et al., 2006).

1.4. RESISTENCIA ELETRICA TRANSEPITELIAL (TEER)

O epitélio apresenta duas características que distinguem as células epiteliais

de outros tecidos: polaridade e coesão. A polaridade é gerada pela distribuição

assimétrica das proteínas tanto no lado apical quanto basal da membrana celular. A

ligação das proteínas chamada “junções oclusivas ou zônulas de oclusão” (Figura 7),

separa ambos os lados da membrana enquanto sela as células adjacentes. Assim, oque determina a viabilidade e integridade do tecido é a formação e a permeabilidade

das junções oclusivas (LI et al., 2004).

Figura 7. Principais estruturas que promovem a coesão entre as células. As zônulas de oclusão (emdestaque) costumam ser as junções mais apicais e o termo "zônula" refere-se à formação de umafaixa pela junção e o termo "oclusão" à fusão das membranas nessas junções promovendo um tipode vedação no espaço intercelular.

Fonte: JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004.

Uma forma de avaliar a integridade e viabilidade do tecido é a medição doTEER. Atualmente existem aparelhos capazes de medir essa resistência, como o



16

Introdução

EVOM2 que foi o primeiro aparelho criado para realizar a análise de rotina do TEER

em culturas de tecido. A convergência da camada celular é determinada pelo

aumento do TEER, observado pelo eletrodo (STX2). O EVOM2 é movido à bateria,

produzindo uma corrente alternada (que evita os efeitos adversos sobre o tecido) e

uma corrente contínua, onde as leituras são alteradas pela capacitância bem como

pela tensão da membrana (WPI Inc., 2009).

Dentre as câmaras que podem ser usadas para a análise do TEER, está a

EndOhm-24 (Figura 8), compatível com o aparato HTS-SNAPWELL. A série

EndOhm de câmaras, é projetada para fornecer medições de resistência

reprodutíveis e precisas do tecido endotelial. Os valores de resistência obtidos

quando usado o EndOhm são compatíveis com aqueles obtidos com uso da câmarade Ussing (WPI Inc., 2009).

Figura 8. Esquema do eletrodo EndOhm-24 snap.

Fonte: Instruction Manual EndOhm-24-snap, WPI Inc. 2009.

1.5. PERMEABILIDADE SEGUNDO O BCS

O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (BCS, Biopharmaceutical

Classification System) criado por Amidon e colaboradores (1995), fundamentou as

bases científicas para o lançamento de um guia do FDA (Food and Drug

Administration, 2000) com os métodos recomendados para classificação de

fármacos. Este se consolidou como uma ferramenta útil na bioisenção (AMIDON etal., 1995; VOLPE, 2010). Baseado nestes três fatores, principalmente na



17

Introdução

solubilidade e permeabilidade, o BCS divide os fármacos em quatro classes (Figura

9).

Figura 9. Classificação de fármacos segundo o BCS baseado na solubilidade e permeabilidade.

Fonte: Adaptado de RAUTIO, et al., 2008.

Segundo o BCS, a classificação da permeabilidade é baseada diretamente na

extensão da absorção intestinal do fármaco em humanos determinada pelo balanço

de massas ou comparando-se a uma dose de referência, administrada por via

intravenosa, ou ainda, indiretamente pela medida da velocidade de transferência de

massa através da membrana intestinal humana (AMIDON et al., 2009).

No entanto, a principal finalidade deste guia foi estabelecer requisitos (Figura

10) para aplicação da bioisenção a novos produtos dos estudos de bioequivalência,

nos casos de mudanças na formulação, processos de fabricação, comercialização

de novas formulações, etc., desde que os fármacos apresentem alta permeabilidade

e solubilidade (VOLPE, 2010).

Ressalta-se que os modelos classificatórios de permeabilidade sugeridos poreste guia visam classificar ativos farmacêuticos (API´s) com vistas a uma possível

caracterização como substâncias da classe BCS I e, consequente, bioisenção de

produtos farmacêuticos finais em humanos, portanto, estudos de fase clínica.



18

Introdução

Figura 10. Requisitos para aplicação da bioisenção à fármacos e produtos.

Fonte: Adaptado de VOLPE, 2008.

Conforme descrito previamente, diversos métodos não envolvendo humanos,

podem ser utilizados a fim de classificar o fármaco quanto à permeabilidade.

A alternativa metodológica certamente inclui os modelos animais, em especial

em ratos, pois é o modelo que melhor reflete a condição humana com respeito ao

espaço paracelular e metabolismo (LE FERREC et al., 2001). Além disso, a principal

vantagem do organismo in vivo é a integração dos componentes dinâmicos da

circulação sanguínea mesentérica, a camada de muco e todos os demais fatores

que influenciam a dissolução do fármaco. Dentre estas, as propriedades físico-

químicas dos fármacos contribuem significativamente para obter informações sobre

sua permeabilidade característica (FDA, 2000).

Estudos farmacocinéticos de balanço de massas utilizando isótopos estáveis

e fármacos radiomarcados, podem ser utilizados a fim de comprovar a extensão deabsorção do fármaco no organismo. Porém, devido às estimativas altamente

variáveis encontradas por este método, outros métodos descritos a seguir são

preferíveis (FDA, 2000). Dentre os diversos métodos de avaliação da

permeabilidade, os métodos in vitro e ex vivo são os mais utilizados, uma vez que

apresentam baixo custo e tempo reduzido, além de favorecer a prática dos 3Rs

(replace, reduce, refine) dos princípios éticos no uso de animais (BALIMANE et al.,

2000; RUSSEL & BURCH, 1959).



19

Introdução

1.6. METODOS ALTERNATIVOS PARA DETERMINAÇÃO DA PERMEABILIDADE

1.6.1. Métodos in vitro

Dentre os modelos in vitro, aqueles mais comumente empregados incluem a

membrana lipídica artificial, tais como os ensaios de permeação por membrana

paralela artificial (PAMPA, sigla do inglês Parallel Artificial Membrane Permeation

Assay) e sistemas baseados em cultura de células de adenocarcinoma humano

Caco-2 e rim canino Mardin-Darby (MDCK sigla do inglês Mardin-Darby canine

kidney) (BALIMANE et al, 2006).

Das técnicas in vitro mais utilizadas para avaliação da permeação intestinal,está o uso de linhagens de células Caco-2 e ensaios de permeação por membrana

artificial paralela (PAMPA), sendo estas amplamente empregadas no screening de

potenciais substâncias, auxiliando no desenvolvimento de novos fármacos (DINIZ,

2007).

Nos ensaios com Caco-2, as células intestinais humanas são cultivadas in

vitro e utilizadas como uma membrana que mimetiza a barreira intestinal. Neste

modelo é avaliada a capacidade de transporte e a direção que ele ocorre, sentido

apical-basal e basal-apical, como pode ser observado na Figura 11 (DINIZ, 2007).

Também é possível avaliar a permeabilidade aparente (Papp) na membrana para

correlacioná-la à dados de absorção de fármacos in vivo (P eff e Fa).

Figura 11. Modelo in vitro de cultura de células Caco-2 utilizado em estudos de permeabilidade.

Fonte: http://www.itqb.unl.pt/ (Acesso em: setembro, 2014).

Apesar dos estudos com Caco-2 serem eficazes na previsão da taxa de

absorção de fármacos, comparadas às demais técnicas in vitro, o mesmo apresenta

desvantagens como falta de agitação no meio de permeação, a limitação dasconcentrações empregadas que não simulam a dose administrada in vivo e



20

Introdução

inexatidão dos valores de permeabilidade preditos além de grande variabilidade inter

laboratorial (BALIMANE et al, 2006).

Já o modelo PAMPA (Figura 12), introduzido pela vez em 1998, têm sido de

grande aplicabilidade como uma ferramenta de triagem de moléculas com alta taxa

de permeabilidade (UNGELL, 2004). O modelo consiste em um material de filtro

hidrofóbico revestido com uma mistura de lecitina/ fosfolipídios dissolvidos em um

solvente orgânico inerte (como o dodecano) criando uma barreira de membrana

lipídica artificial que mimetiza o epitélio intestinal. A taxa de permeação através da

barreira de membrana pode ser correlacionada ao grau de absorção de fármacos em

humanos (Figura 12). O uso de placas com 96 poços de microtitulação juntamente

com rápida análise utilizando um leitor de placas espectrofotométrico, torna estemodelo um sistema muito atraente para screening de permeação. Este modelo

PAMPA dispende menor carga de trabalho comparativamente aos métodos de

cultura de células, com previsibilidade similar (Figura 12). Uma de suas principais

limitações é que o modelo subestima a absorção de fármacos que são ativamente

absorvidos através de transportadores de fármacos (BALIMANE et al., 2006).

Figura 12. Modelo in vitro com membrana artificial PAMPA utilizado em estudos de permeabilidade.

Fonte: http://www.itqb.unl.pt/ (Acesso em: setembro, 2014).



21

Introdução

Figura 13. Correlação de (A) permeabilidade PAMPA e (B) permeabilidade celular Caco-2 com graude absorção em humanos para medicamentos comercializados. Esses fármacos são conhecidos porserem absorvidas principalmente via difusão passiva. Cada ponto é a média de 3 ou mais repetições.

Fonte: Adaptado de BALIMANE, 2006.

O modelo de célula MDCK, inicialmente descrito em 1989, é uma linhagem

bem caracterizada quanto à morfologia, resistência elétrica e a respectiva

composição das membranas celular apical e basolateral, dentre outros fatores. Este

fato proporciona uma excelente base para seu uso como modelo in vitro

padronizado para transporte de fármacos e estudos de interação entre fármacos e

excipientes (RUTISHAUSER et al, 1998). Estas células se diferenciam em epiteliais

colunares quando cultivadas em membranas semipermeáveis, com junções

semelhantes às células Caco-2. Em estudos realizados com este modelo, foi

possível determinar a permeabilidade efetiva nos sentidos apical para basolateral e



22

Introdução

basolateral para apical obtendo-se resultados semelhantes ao modelo Caco-2

(SOUZA et al, 2007). Sua maior desvantagem está relacionada ao fato de sua

origem “não-humana” e “não intestinal”, pois existe baixa expressão de proteínas

transportadoras e baixa atividade metabólica (DEFERME et al., 2008).

1.6.2. Métodos ex vivo

Tecidos intestinais animais são frequentemente utilizados em modelos ex

vivo, pois apresentam características similares às células endoteliais humanas e os

tecidos humanos viáveis serem relativamente difíceis de obter de forma rotineira. A

viabilidade desses tecidos deve ser mantida mediante suprimento sanguíneo eoxigenação constante, (BALIMANE et al, 2006).

A câmara de Ussing (Figura 14), criada por Hans Ussing em 1950, tem sido

conhecida como uma potencial ferramenta científica para estudar o transporte

vetorial de íons através da pele de rã. Com o passar do tempo foi sendo utilizada

para vários outros estudos, como o estudo da integridade de camadas celulares e

das propriedades das células cancerosas invasivas (BALIMANE et al, 2000).

A câmara consiste em duas metades funcionais que são presas junto aoepitélio, preenchidas com soluções fisiológicas para manutenção do mesmo (Figura

14). Uma das propriedades importantes de muitos epitélios é o desenvolvimento de

uma diferença de potencial elétrico, ou seja, uma voltagem entre o lado seroso e o

lado mucoso (DIENER, 2008), desta forma a permeabilidade é medida pelo

aparecimento da substância do lado seroso e desaparecimento do lado mucoso

(BALIMANE et al, 2000).

Figura 14. Aparato de permeação: Câmaras de Ussing.

Fonte: www.warneronline.com, maio 2011.



23

Introdução

Hans H. Ussing desenvolveu este método para entender o fenômeno do

transporte ativo do cloreto de sódio e de eletrólitos, nutrientes e transporte de

fármacos que ocorrem através do tecido epitelial intestinal (LE FERREC et al, 2001).

A pele de sapo foi utilizada por Ussing e colaboradores como modelo devido sua

capacidade de mover o cloreto de sódio da superfície da pele para o interstício em

mais de 100 concentrações diferentes. Entretanto, a maior dificuldade era distinguir

o movimento dos íons ativamente transportados pelo epitélio daqueles passivamente

transportados.

Ussing resolveu o problema desenvolvendo um sistema onde a pele de sapo

era dessecada e colocada para separar duas câmaras, cada qual preenchida com o

mesmo volume de uma solução eletrolítica. Desta forma, o transporte paracelular deíons dirigido por forças passivas como a concentração transepitelial e os gradientes

osmóticos e hidrostáticos era eliminado. O transporte passivo criado pelo potencial

elétrico espontâneo através do epitélio era totalmente eliminado promovendo um

potencial de valor zero com um pequeno circuito externo que promovia corrente

elétrica no epitélio. A corrente na qual o potencial determinado é diferente de zero,

equivalente ao movimento de íons similar ao transporte ativo. Neste método a

permeabilidade é medida pelo aparecimento da substância do lado seroso edesaparecimento do lado mucoso da membrana biológica (BALIMANE et al, 2000).

Dados de permeabilidade em humanos foram comparados a Peff (permeação

efetiva) em segmentos intestinais de jejuno de ratos montados em câmara de Ussing

tanto para compostos transportados passivamente quanto para aquelas substancias

cujos mecanismos são mediados por carreadores. Os valores de permeabilidade

observados foram semelhantes aos encontrados em humanos, para compostos de

transporte passivo (Figura 15), obtendo-se um coeficiente de determinação de 0,95(LENNERNAS, 2007).

Assim como as demais técnicas, a Câmara de Ussing também apresenta

algumas desvantagens, pois apesar desta utilizar tecidos de ratos, tornando-se o

modelo que apresenta mais proximidade com o organismo humano, existe uma

grande dificuldade em manter a viabilidade e integridade dos segmentos de tecidos

utilizados, em que edema intestinal e rompimento das vilosidades foram descritos

logo após 20 min de incubação. Outros problemas também são apresentados, como

subestimação do transporte de fármacos através do tecido intestinal, devido à



24

Introdução

retenção na membrana, ocorrendo principalmente em fármacos lipofílicos

(DEFERME et al., 2008).

Figura 15. Correlação entre a fração da dose absorvida em humanos (Fa%) com a permeabilidadeem humanos (in vivo) e a permeabilidade através de jejuno de ratos ( in vitro). Os númerosrepresentam os seguintes compostos: 1 – inogatran, 2 – enalaprilato, 3 – atenolol, 4 – terbutalina, 5-creatinina, 6 – metoprolol, 7 – propranolol, 8 – antipirina e 9 – naproxeno. Os compostos 10, 11 e 12não foram informados nesta figura.

Fonte: Adaptado de LENNERÑAS 2007.

Diante do exposto previamente, é premente a busca por modelos preditivos

da absorção de fármacos pelo trato gastrointestinal em humanos, fornecendo dados

essenciais logo no início do processo de desenvolvimento de novos fármacos.

Neste sentido, o modelo ex vivo MTS-SNAPWELL, apresentado pioneiramente

neste trabalho, é proposto como um modelo alternativo de avaliação depermeabilidade ex vivo , empregando segmentos intestinais de ratos montados em

placas Snapwell™, sob agitação e condição sink. Propõe-se, sobretudo, atingir

elevada capacidade preditiva associada à rápida execução, baixo custo e alto

rendimento para posterior aplicação à seleção de potencias fitofármacos dos biomas

brasileiros, em especial do Cerrado e Pantanal, sob grave ameaça de extinção.



25

Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Validar o método MTS-SNAPWELL como modelo ex vivo de predição

da permeabilidade aplicado a potenciais novos fármacos, empregando seis

fármacos modelo.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Adequação das condições de preparo da membrana biológica a partir do

segmento jejunal de ratos Wistar e avaliação das possíveis variáveis

experimentais como temperatura, pH, agitação e oxigenação do meio e,

consequentemente, o tempo de viabilidade tecidual;

Avaliação e monitoramento da integridade da membrana biológica na

presença de co-solventes de amostras fracamente hidrofílicas, por meio da

resistência elétrica transepitelial (TEER);

Revalidação de metodologias analíticas farmacopeicas por HPLC-DAD

para quantificação das amostras permeadas; Obtenção de dados de permeabilidade aparente (Papp) de seis

fármacos hidrossolúveis representativos de alta e baixa permeabilidade

(BCS I e III), descritos no “Guidance for Industry: Waiver of in vivo

Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral

Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System” (FDA,

Agosto de 2000);

Correlação entre dados de Papp obtidos em MTS-SNAPWELL parafármacos (BCS I e III), relativamente aos dados de Papp e Peff em diferentes

modelos (CACO-2, Ussing e perfusão intestinal), previamente descritos na

literatura.



26

Métodos

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. M ATERIAIS, SOLVENTES E REAGENTES UTILIZADOS

• Membranas de Policarbonato Isopore, Millipore™;

• Placa de permeação Transwell, Corning®;

• Tartarato de metoprolol, cafeína, teofilina, ranitidina, atenolol e cimetidina,

grau farmacêutico, Sigma Aldrich™;

• Acetonitrila grau HPLC, Merck;

• Metanol grau HPLC, Merck;

•

Água ultrapura Option-Q, Elga;• Fosfato de sódio dibásico anidro P.A., J. T. Baker®;

• Acetato de sódio anidro P.A., Sigma Aldrich™;

• Ácido 1-pentanossulfonato de sódio monohidratado P.A., Sigma Aldrich™;

• Ácido acético gracial P.A., Vetec;

• Ácido ortofosfórico P.A., Scharlau;

• Hidróxido de sódio P.A., J. T. Baker®;

•

Cloreto de sódio P.A., Sigma Aldrich™;• Cloreto de potássio P.A., Sigma Aldrich™;

• Fosfato de sódio monobásico P.A., Sigma Aldrich™;

• Sulfato de magnésio heptahidratado P.A., Sigma Aldrich™;

• Cloreto de cálcio dihidratado P.A., Sigma Aldrich™;

• Bicarbonato de sódio P.A., Sigma Aldrich™.

3.2. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

• Voltímetro transepitelial EVOM 2, World Precision Instruments;

• Eletrodo EndOhm-24-snap, World Precision Instruments;

• Incubadora de CO2 MCO 18-AC, Sanyo;

• Agitador orbital Orbit 1000, Labnet;

• Cromatográfo a líquido de alta eficiência modelo Infinity 1260, composto

por sistema de bomba quaternário, injetor automático, detectores DAD e

FLD, Agilent Technologies;Balança analítica AUW220D, Shimadzu.



27

Métodos

3.3. OBTENÇÃO E PREPARO DA MEMBRANA BIOLOGICA

A membrana mucosa foi preparada a partir de segmentos (2-3 cm) da

porção jejunal do intestino delgado obtidos de ratas Wistar (200 ± 25g; 12

semanas), após jejum por um período de aproximadamente 12 h antes do

experimento. Após sedação dos animais com ketamina/xilazina (90,0 / 7,5

mg/Kg), o intestino delgado foi removido e imediatamente mantido em banho

de gelo com solução de Krebs-Ringer Bicarbonato (KRB).

Na seqüência, realizou-se o procedimento de retirada da camada

seromuscular (Figura 16) e abertura dos segmentos intestinais junto à borda

mesentérica do tecido, seguida pela limpeza do conteúdo intestinal com

solução de KRB refrigerada (LENNERÑAS et al., 1997).

Figura 16. Destacamento da camada seromuscular do tubo intestinal animal.

Fonte: Center of Mucosal Biology – University of Maryland/USA e Laboratório deBiofarmácia e farmacocinética- UFG.

Após o experimento, o animal foi eutanasiado por punção cardíaca de

acordo com as normas de conduta da Comissão de Ética no Uso de Animais

da UFG, protocolo CEUA UFG nº 013/11 (Anexo A).

3.4. AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE TECIDUAL NA PRESENÇA DE VERMELHO DE

FENOL E CAFEINA

A viabilidade e integridade da membrana foram avaliadas pela adição

do marcador não absorvível vermelho de fenol e cafeína como marcador de

alta permeabilidade. Leituras da resistência elétrica transepitelial (TEER)



28

Métodos

foram realizadas ao longo do experimento, em intervalos regulares (15/15

min) utilizando o aparelho EVOM2 (Figura 17).

Figura 17. Monitoramento da resistência elétrica transepitelial utilizando EVOM 2.

Fonte: Laboratório de Biofarmácia e farmacocinética- UFG.

3.5. AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE TECIDUAL NA PRESENÇA DE CO-SOLVENTES

A avaliação da integridade da membrana na presença dos co-solventes

mais utilizados na diluição de amostras de baixa solubilidade, foi realizada

adicionando-se DMSO 1% e EtOH 1% à câmara doadora. Leituras da

resistência elétrica transepitelial (TEER) foram realizadas ao longo do

experimento, em intervalos regulares (15/15 min) utilizando o aparelho

EVOM2 (Figura 17).

3.6. ENSAIO DE PERMEABILIDADE EX VIVO HTS-SNAPWELL

Os segmentos intestinais viáveis (2-3 cm), com leituras de TEER

superiores a 30 .cm2 (ZAKELJ et al., 2004; NARAI et al., 1997;

POLENTARUTTI et al,1999) foram selecionados e os demais, descartados.

Os primeiros foram montados no sistema MTS-SNAPWELL (Figura 18) no

sentido apical - basolateral, utilizando uma membrana filtrante de

policarbonato e discos de acrílico para fixação do mesmo.

Antes do início da permeação, foi realizada a estabilização dos

segmentos jejunais e, preenchimento das câmaras doadoras e receptoras,



29

Métodos

com solução de KRB (400 µL e 2 mL, respectivamente). Em seguida as

placas de permeação foram levadas à incubadora de CO2, sob atmosfera

controlada de oxigênio (95%) e temperatura (37 ± 0,5°C), sob agitação (Orbit

1000, Labnet) constante a 60 rpm por 30 min. As condições de

experimentação foram estabelecidas visando mimetizar o sistema vivo

(STEFFANSEN & NIELSEN, 2010).

Figura 18. Representação esquemática do sistema MTS-SNAPWELL.

Após a estabilização dos segmentos, os fármacos em estudo (Figura

14) foram adicionados no compartimento doador (lado mucoso da

membrana) em concentrações de 0,30 - 12,68 mM, solubilizados em solução

de KRB. As amostras (1 mL) foram coletadas do compartimento receptor

(lado seroso da membrana) a intervalos constantes (20, 30, 40, 60, 80, 100 e

120 min) com reposição do mesmo volume de solução de KRB.

As concentrações das soluções contendo os fármacos foram definidas

com base na sua maior dose administrada, dissolvida em 250 mL conforme

descrito pelo guia do FDA, para definição de uma substância altamente

solúvel (FDA, 2000) (Tabela 1).



30

Métodos

Tabela 1. Propriedades físico-químicas, valores de dose e concentração dosfármacos permeados

*Drug Bank Open Data Drug & Drug Target Database: http://www.drugbank.ca/.

3.7. CALCULOS DO COEFICIENTE DE PERMEAÇÃO

Após análises das alíquotas de fármacos permeadas, calculou-se a

quantidade acumulada no lado receptor no decorrer do tempo. A seguir,

calculou-se o fluxo de permeação (J) em função da área (0,10 cm2) por meio

do coeficiente de inclinação angular, descrito pela equação da reta. O

coeficiente de permeabilidade (Papp) foi calculado segundo a Equação 4.

Papp =

Onde: é o fluxo, ou seja, quantidade de fármaco permeado através da

membrana no tempo t. A corresponde à área de exposição da membrana

(0,1 cm2) e C0 a concentração inicial do fármaco na câmara doadora. Os

valores de Papp obtidos foram comparados com os de Peff da literatura.

Para todos os experimentos, os dados foram resultantes de triplicatas

de amostras, representados como média ± DP. Quando aplicável comparou-

se as médias entre dois tratamentos distintos, segundo Teste-t de Student

(Microsoft Excel 2010; Action® 2.6) para variáveis independentes.

FármacoClasse

BCS

M. M.

(g/mol)*Log P* Dose (mg)

Concentração

(mM)

Tartarato de

metoprololI 684,81 1,88 100 0,58

Teofilina I 180,16 -0,77 300 6,66

Cafeína I 194,19 -0,55 50 0,30

Atenolol III 266,33 0,16 50 0,75

Ranitidina III 314,40 0,98 150 1,91

Cimetidina III 252,34 -0,11 800 12,68

(Equação 4)



31

Métodos

3.8. REVALIDACAO DOS METODOS ANALÍTICOS EM HPLC-PDA

As amostras permeadas foram quantificadas utilizando-se adaptações

de métodos cromatográficos das Farmacopéias Norte-Americana (USP 36) e

Brasileira FB 5ª ed. (Tabela 2).

Figura 19. Estruturas químicas dos fármacos em estudo.

A. tartarato de metoprolol; B. cafeína; C. teofilina; D. ranitidina; E. atenolol e F. cimetidina.

As revalidações parciais dos métodos de análise das amostras obtidos

em estudos de permeação foram conduzidas após adaptações dos métodos

compendiais enfatizando a sensibilidade e o menor tempo de análise,

resguardando os parâmetros de eficiência cromatográfica. Para tanto,

procedeu-se análise dos parâmetros de seletividade, curva de calibração,

limite de quantificação, precisão e exatidão dos métodos durante dois dias

distintos, segundo critérios da Resolução 899, 2003 (ANVISA).



32

Métodos

Tabela 2. Condições cromatográficas transferidas a partir de métodosfarmacopeicos.

Fármaco Condições cromatográficas

Atenolol *

ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm

Tp. Fosfato pH 3,0: MeOH (80:20)

0,6 mL/min; 226 nm; 10µL

Cafeína*

ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm

Tp. Fosfato pH 9,2: MeOH (55:45)

1,0 mL/min; 275 nm; 10µL

Cimetidina**

ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm

H3PO4 0,03%: MeOH (80:20)

1,0 mL/min; 220 nm; 20µL

Ranitidina*

ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm 35ºC

Tp. Fosfato pH 7,0: ACN (78: 22)

1,0 mL/min; 230 nm; 10µL

Tartarato de metoprolol*

ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm

Tp. Acetato pH 3,8: MeOH (58: 42)

1,0 mL/min; 275 nm; 10µL

Teofilina*

ACE 5 C18 100 x 4,6 mm 5µm

Tp. Acetato pH 4,0: ACN (93: 7)

1,0mL/min; 280 nm; 10µL

* United States Pharmacopeia (2013** Farmacopeia Brasileira 5ª ed. (2010)



33

Resultados

4. RESULTADOS

Ar tigo Científi co

A sensit ive medium-throughput method to pred ict in testinal absorpt ion

in humans using rat intestinal tissue segments

Laís Cristina da Silva, Taynara Lourenço da Silva, Alisson Henrique Antunes,

Kênnia Rocha Rezende*

Laboratory of Biopharmacy and Pharmacokinetics- School of Pharmacy-

Federal University of Goiás, Brazil

*Corresponding author

Kênnia Rocha Rezende

Laboratory of Biopharmacy and Pharmacokinetics- School of Pharmacy-

Federal University of Goiás, 74605220 Goiânia, Goiás, Brazil

Tel: +55 6232096181

E-mail Address: [email protected]



34

Resultados

Abstract

In recent years, several in vitro, ex vivo, and in vivo approaches are currently

used in drug development. Highly predictive human intestinal absorption

models remain lagging behind the times due to profusion of variables

concerning permeability through gastrointestinal tract in humans. However, it

is clear the need for drug permeability models early on new drugs

development process phases that do not represent compromise between

high throughput with low predictive potential and, low throughput with high

predictive potential. In the present study, the MTS-Snapwell ex vivo model is

showed as an alternative method in the permeability investigation. Rat small

intestine tissue segments were mounted in commercial Snapwell™ inserts.

Unidirectional drug transport (A-B) was measured by collecting samples from

receptor chamber at different time points. Viability of intestinal tissue

segments was measured by transport of phenol red and caffeine, in addition

to TEER measurement at three time points. The apparent permeability (Papp;

x10-6 cm/s) results were: metoprolol 12.6±0.7, caffeine 17.6±3.1, theophylline

15.3±1.6, atenolol 10.7±1.2, ranitidine 3.8±0.4, and cimetidine 6.9±0.1. All

drugs were classified in high/low permeability according to BCS, high

correlation with human data (r = 0.89) suggests potential predictive capacity

of the model here proposed for passively absorbed molecules (paracellular

and transcellular).

Keywords: intestinal permeability, rat intestine, ex vivo model, TEER,membrane integrity.



35

Resultados

1. Introduction

It is widely acknowledged that highly attrition rate in the drug discovery

process relates to toxicity and inefficacies as a result of poor pharmacokinetic

properties during ADME phases (Li, 2001).To circumvent this, the major

approach points towards assessment of drug permeability performance

during the less costly, earlier stages of DDD process to be conducted in

parallel with bioactivity assays. Although in recent years, several in silico, in

vitro, in vivo and ex vivo methods are currently used, highly predictive human

intestinal absorption models remain lagging behind the times due to

profusion of variables concerning permeability through gastrointestinal tract

in humans (Larregieu & Benet 2014).

Once to predict potential human intestinal absorption, great emphasis

is currently on excised tissue permeability models p.e Ussing chambers used

to measure drug transport along rat intestinal segments (Tukker, 2000).

Main advantages include original expression of influx and efflux

transporters found in vivo tissues (Tukker, 2000). In addition, there is the

interplay of many absorption mechanisms as passive and carried-mediated

diffusion (Lennernäs 2014) allowing for high correlation between both

process i.e. fraction of drug absorbed (Fa) in humans and apparent

permeability (Papp) in rat tissues models. Moreover, ex vivo permeability

systems on tissue segments can be a valuable tool regarding morphological

and physiological characteristics which closely mimics in vivo intestinal

epithelium features. It is also recognized by the FDA as most ideal one for

preclinical human intestinal permeability (FDA, 2000). For instance, it shows

a combination of metabolism capacity and expression of mucus layer on theluminal side working as protective cell damage coating from sample co-

solvents, often useful in DDD phases.

Despite this, maintenance of ex vivo integrity and viability of tissues

needs close attention on experimental conditions, mainly avoiding drug

transport misestimating, membrane retention and low-throughput (Deferme et

al., 2008;Yamashita et al., 1997; Westerhout et al., 2014). Shortly, tissue

segments should be continuously oxygenated with carbogen (95%O2, 5%



36

Resultados

CO2) and kept in physiologically buffer, at 37 oC, under stirring reducing the

unstirred water layer at high humidity incubations set sample evaporation.

In this context, it is clear the need for drug permeability models early on new

drugs development process phases that do not represent compromise

between high throughput with low predictive potential and, low throughput

with high predictive potential. Here, the MTS-Snapwell ex vivo model is

showed as a new alternative model in the permeability investigation, using

female rat small intestine tissue segments mounted in commercial

Snapwell™ inserts, under stirring and sink conditions.

2. Materials and methods

2.1. Chemicals and reagents

Metoprolol tartrate, caffeine, theophylline, atenolol, cimetidine,

ranitidine hydrochloride, sodium chloride, potassium chloride, monobasic

sodium phosphate, magnesium sulfate heptahydrate, calcium chloride

dihydrate and sodium bicarbonate were purchased from Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA). Sodium hydroxide and dibasic sodium phosphate

anhydrous were purchased from J.T. Baker (Mexico City, Mexico), glacial

acetic acid from Vetec (Rio de Janeiro, RJ, Brazil) and orthophosphoric acid

from Scharlau (Barcelona, Spain), while HPLC chromatographic grade

acetonitrile and methanol were from Merck (Darmstadt, Germany).

2.3. Rat excised tissue segments

The study protocol for using rat intestine tissues were approved by

Ethics Committee on Animal Use from Federal University of Goiás under

number 013/2011. Female Wistar rats (200 ± 25g) were housed under

controlled conditions including temperature (22°C), 12 h light/ dark cycle with

access to standard food and tap water ad libitum during one week minimum

period for acclimatization. Prior to each experiment, animals were fasted for

12h (Salphati et al. 2001; Kim et al. 2006)with free access to water.



37

Resultados

Female Wistar rats were anesthetized with ketamine/xilazine (90mg/kg

and 7.5mg/Kg, respectively). The small intestine was excised, washed and

kept in an ice-cold oxygen saturated Krebs-Ringer bicarbonate solution

(KRB).Proximal jejunal tissue (the first 12 cm from stomach) was excised and

put into beakers containing ice-cold KBR (10oC) which was continuously

gassed with a O2:CO2 (95:5) gas mixture. Next, serosal-muscular layer was

carefully stripped from the mucosal and cut into tissue segments (20 mm).

During such procedure, tissues were humidified with 10oC KBR solution.

After that, the intestinal segment was mounted with the basolateral side set

above polycarbonate filter membrane (Isopore™ 0.4 µm, 13 mm, Millipore,

Darmstadt, Germany). Using acrylic disks (02) with an internal diameter of 3

mm over and above filter membrane (Fig. 1) and mucosal membrane facing

upwards, the permeability apparatus was set-up. Next, it was mounted at

donor chamber (Snapwell™ device) and, checked for any leakage with 1 mL

KRB solution. MTS-Snapwell system was completed after filling receiver (2

mL) and donor (0,4 mL) compartments of KRB solution.

Viable intestinal segments (TEER > 30 cm 2), as described on item

2.4, were mounted on permeation apparatus and submitted to a pre-

incubation period (30 min)under controlled atmosphere(95% O2 and 5% CO 2)

inside of a humidified incubator (MCO-18AC, Sanyo, UK) at 37ºC and gentle

shaking (60 rpm) for equilibration. After, KRB blank solution was aspirated off

from donor compartment and replaced with dose solutions (400 µL) at

variable concentrations (0.30 -12.68 mM). Drug dose to be assayed was

defined as the highest human commercial one divided by 250 mL, as

described in FDA guide (FDA, 2000). After drug incubation, unidirectional

drug transport from apical to basolateral side was measured by collectingsamples from receptor chamber (1 mL) at different time points (0, 20, 30, 40,

60, 90 and 120 min). Replacement of the sampling volume was carried out

immediately with the same volume of fresh pre-warmed (37oC) KRB solution.

Samples were analyzed as described in section 2.5.

For each drug, the apparent permeability coefficient (Papp) was

calculated according to the following equation (Eq. 1) (Zur et al. 2014; Zakelj

et al. 2004; Sjöberg et al. 2013; Li et al. 2013):



38

Resultados

Eq. 1

Where dQ/dt is the rate is the appearance rate of the drug at receiver

compartment, C0 is the initial concentration of the drug at the donor

compartment and A is the surface area (0.1 cm2) of the tissue segment.

2.4. Viability and integrity barrier

Viability of intestinal tissue segments mounted in MTS-Snapwellsystem was measured by transport of marker molecules, e.g. phenol red and

mannitol besides transepithelial resistance (TEER) during incubation time

(120 min) at 37 oC95% O2 and 5% CO 2). TEER was measured at three

different time points (0, 30 and 120 min). Additionally, potential damage to

the barrier function were evaluated for commonly used co-solvents (DMSO

1% and EtOH 1%) of poorly water soluble drugs (Krishna et al. 2001;

Takahashi et al. 2002; Watanabe et al. 2004).

Integrity of intestinal barrier function was measured by linearity of

mucosal to serosal transport of permeability markers over 2h. Caffeine was

evaluated as a highly absorbed marker transported by passive transcellular

mechanism, in addition to phenol red as a non-absorbable one.

2.5. Analytical methods

Sample drug analysis was assessed by HPLC-DAD (Infinity 1260,

Agilent Technologies, USA) an ACE 5 C18 column (100 x 4.6 mm, 5µm)

using compendia transferred methods from United States and Brazilian

Pharmacopeia. The chromatographic conditions are described in Table 1.



39

Resultados

2.6. Data analysis

Comparison of TEER values in the presence and absence of co-

solvents was determined using Student's test for two independent samples at

the 5% significance level (Microsoft Excel 2010; Action®). Results were

shown as arithmetic mean ± SD.

Potential correlation of Papp values obtained from MTS-Snapwell model and

Papp values from literature data (Ussing chamber, rat perfusion or %Fa in

humans) were plotted. Linear regression were performed and expressed as a

measurement of goodness of fit (R2) on predicting human drug absorption.

3. Results and discussion

3.1. Viability and barrier integrity

In order to assess viability of tissues, reference TEER values were set

at 30 .cm2, as previously described in literature (30.cm2; 34±6.2.cm2;

20-50.cm2) (Zakelj et al., 2004; Narai et al., 1997; Polentarutti et al,1999).

In this protocol, the initial TEER value for rat jejunal tissue was found to

be53±8.0 .cm2 (n = 20) remaining above 20 .cm2 during incubation time

(120 min). Maximum acceptable value for TEER reduction was 61.9±9.5%,

consistently to literature (Borchard et al. 1996; Petersen et al. 2012).

Potential co-solvents damage was also evaluated for DMSO 1% and

EtOH 1% as per TEER values. Starting values found were of 48±9.2 .cm2

(n = 10) and 54±5.8 .cm2 (n = 10). After co-solvents addition, TEER values

showed no significant difference (P > 0.05) from blank samples, remainingabove 20 .cm2 during all incubation time (2h). While we did measure mucus

thickness, intestinal protective feature appear to be functional during

incubation time making this model closer to physiological tissue. Additionally,

integrity of intestinal barrier during incubation time was assessed for non-

absorbable (phenol red) and high permeability (caffeine) markers (Fig 2).

Phenol red showed no permeation at all, as expected. For caffeine, drug

transport remained linear during incubation time ensuring integrity of barrierfunction during 120 min (Dixit et al., 2012). Therefore, epithelium integrity



40

Resultados

was confirmed both by monitoring transepithelial resistance as well as by

drug markers, as recommended (Sjöberg et al., 2013). For that, standardized

experimental conditions for MTS-Snapwell model also includes maintaining

close control of room temperature (18°C±2) and KRB solution saturated(5%

CO2, 95% O2) and ice-cooled (10°C±2) as a tissue preservation bath, during

experimental procedure.

3.2. Permeability studies

The sampling interval and maximum time of exposure (120 min)

showed to be adequate, completing before the equilibrium concentration of

the system has reached. The lag times showed to be approximately 20-40

min, where in 60 min the steady concentration gradient was established

across the tissue segments. The agitation of 60 rpm, was adequate to

prevent the stagnant water layer, ensuring the sink conditions (Ingels &

Augustijns, 2003).

Apparent permeability coefficient (Papp) of six selected compounds of

BCS I and III, as recommended by FDA guidance (FDA, 2000), were

measured across rat jejunal tissue segments (AP-BL) mounted in MTS-

SNAPWELL system under sink conditions.

Papp values obtained ranged from 3.8±0.4 to 17.6±3.1cm/s pointing to

metoprolol as a low-high permeability class boundary marker as seen in

Table2. As a result, the same BCS classification was attained for all tested

drugs. Drug permeability classification was obtained when ratio between

Papptest/Pappmetoprolol was calculated, as reported by Kim et al. (2006). Drugs

showing Papp ratio greater than 1.0 were considered as highly permeable.Otherwise, they were classified as a low permeability drug (Table 2).

Regarding the high permeability marker (metoprolol), one should be aware of

its characteristic pH-dependent permeability. Zur et al. (2014),reported it can

be2-fold higher than pH 7.0. Herein, metoprolol showed good inter-assay

precision (RSD = 0.52%; n = 3) at pH 7.4. Additionally, MTS-SNAPWELL

Papp values displayed the same ranking order (ranitidine < atenolol

<metoprolol< theophylline < caffeine) as seen in Ussing chamber (Li et al.,2013)i.e. a classical ex vivo assay in rat intestinal tissues. Previously



41

Resultados

reported Papp and Peff data from often used techniques such as Caco-2,

intestinal perfusion and fraction of drug absorbed were compared assuming

linear regression. Overall, Papp values showed weaker linear goodness of fit

for in vivo (R2 = 0.76-0.79) when compared to ex vivo (R 2 = 0.83) (Fig. 3).

Our Papp results was also compared to oral fraction dose absorbed in human

(Fa) showing linear correlation suggesting potential predictive capacity for the

model herein proposed (Fig.4), as for passively transported molecules (both

paracellular and transcellular) (Corti et al. 2006). Accordingly, Pearson's

correlation (r) on MTS-SNAPWELL system showed strong values to human

data (r=0.89) as compared to in vivo rat perfusion model (r=0.84) previously

published (Kim et al., 2006; Salphati et al., 2001; Pratap et al., 2012).

Although, our dataset in too small to be able to predict human oral

bioavailability.

Moreover, analytical method sensitivity for MTS-SNAPWELL system

showed to be high (slope=19.68), as measured by the slope of linear

regression curve (IUPAC, 1997) as compared to slope from Caco-2 (5.22),

Ussing chambers (8.99) and rat perfusion model (3.55).Theoretically, it would

be able to give very different response to distinct compounds. About method

precision, it showed to be relatively low, as expressed by RSD, when Papp

measurement was performed with rat intestinal tissue for MTS-Snapwell

(0.52-17.61%) compared to Ussing chamber (24.79-42.24%) or perfusion in

rats (27.94-82.19%) described by (Li et al. 2013; Kim et al. 2006; Salphati et

al. 2001; Pratap et al. 2012).

As a final point, the validated conditions for MTS-SNAPWELL system

showed some advantages as high sensitivity and precision when at sink

conditions. Experimental settings was carefully adjusted to mimicsgastrointestinal tract physiology, highlighting its potential ability to suitable

measure drug permeability in excised rat tissue segments mounted in

Snapwell™ system. Taken together, our results point towards MTS-

SNAPWELL as a value tool in the screening of new molecular entities during

drug discovery and development process after expanding dataset of

molecules tested.



42

Resultados

4. Conclusions

Our results revealed that rat intestinal tissue mounted in Snapwell

system has potential to be an alternative method to classify drug substances

in high/low permeability. Moreover, our method can be seen as an

innovative, easy and fast way to measure ex vivo permeability. Once viability

and barrier integrity of the rat jejunal tissue segments were preserved along

120 min, at sink conditions, MTS-Snapwell system is ready to be challenged

for low solubility drugs.

5. Acknowledgments

We thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível

Superior (CAPES, Brazil), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

Goiás and Rede Pro Centro-Oeste for financial support.

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44

Resultados

22. Pratap SS, Wahajuddin, Raju KSR, Nafis A, Jain GK. 2012.Simultaneous determination of nine model compounds in permeabilitysamples using RP-HPLC : Application to prove the cassetteadministration principle in single pass intestinal perfusion study in rats.J Pharm Biom Anal, 68:71–76.

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45

Resultados

Figures

Fig. 1. Schematic representation of Snapwell™ adaptation using rat intestine tissuesegments.

Fig. 2. Barrier integrity assessment by means of permeability markers as phenol red (non-absorbable) and caffeine (high permeability) across rat jejunal tissue segments, expressed in% of drug dose versus incubation time (120 min). Data represented mean ± SD (n = 4).



46

Resultados

Fig. 3. Relationship between apparent permeability coefficients (Papp) in rat jejunal tissuemounted in MTS-SNAPWELL system and (A) Peff rat perfusion (Kim et al., 2006; Salphati et

al., 2001; Pratap et al., 2012); (B) Peff human perfusion (Kim et al., 2006); (C) Papp Ussingchamber (Li et al., 2013).

Fig. 4. Relationship between apparent permeability coefficients (Papp) in rat jejunal tissuemounted in MTS-SNAPWELL system and oral dose absorbed fraction in human (Fa %) (Kimet al. 2006).



47

Resultados

Tables

Table 1.Chromatographic conditions for quantification of tested drugs.

Compound LQ(µg/mL)

Chromatographic

conditions on ACE 5 C18 (100 x 4.6 mm,

5µm)

(nm)

Metoprolol1 1.0

Acetate buffer pH 3.8:

MeOH (58: 42)

1.0 mL/min; 10µL at 45°C

275

Caffeine1 0.05

Phosphate buffer pH 9.2:

MeOH (55:45);1.0 mL/min;

10µL

275

Theophylline1 1.2 Acetate buffer pH 4.0: ACN

(93: 7); 1.0mL/min; 10µL280

Atenolol1 0.3

Phosphate buffer pH 3.0:

MeOH (80:20);0.6 mL/min;

10µL

226

Ranitidine1 0.08

Phosphatebuffer pH 7,0:

ACN (78: 22)

1.0 mL/min; 10µL at 35ºC

230

Cimetidine2 0.5

Phosphoric acid 0.03%:

MeOH (80:20)

1.0 mL/min; 20µL

220

1

United States Pharmacopeia;2

Brazilian Pharmacopeia.



Table 2.Drug transport mechanism across intestinal barrier, Papp values measured in MTS-S

toreported Papp in Caco-2 andUssing Chamber. Reported Peff inrat and human perfusionsplusabso

also included. Data is showed as mean ± SD (N=3).

Papp x 10-6 cm/s Peff x 10-6 cm/

Compound Passive Transport

mechanisma

BCSbMTS-

SnapwellCaco-2c UssingChamber d Rat e Hum

Metoprolol transcellular I 12.6 ± 0.7 25.7 16.1 ± 6.859.0 ±

13.0 1

Caffeine transcellular I 17.6 ± 3.1 38.9 37.2 ± 3.2 54.0 ±17.0 2

Theophylline paracellular I 15.3 ± 1.6 44.7 27.7 ± 8.268.0 ±

19.0 2

Atenolol paracellular III 10.7 ± 1.2 0.32 10.7 ± 1.8 18.0 ± 9.0 2

Ranitidine paracellular III 3.8 ± 0.4 0.49 6.1 ± 1.5 7.3 ± 6.0 2

Cimetidine paracellular III 6.9 ± 0.1 1.29 N.A. 10.5 ± 6.0 2

N.A=notavailableaSmetanova et al., 2009; Mols et al., 2009; Gato-Peciña & Ponz, 1990; Zhou et al., 1999; Mummaneni & bBiopharmaceutical Classification System (http://tsrlinc.com). cCastillo-Garit et al., 2008. dLi et al., 2013; Lennernas,

2001; Pratap et al., 2012.



49

Considerações Finais

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

As condições experimentais padronizadas para o modelo HTS-

SNAPWELL foram satisfatórias, pois observou-se a preservação da função

de barreira do segmento da membrana jejunal em ambiente ex vivo ,

conforme evidenciado.

Adequada sensibilidade e seletividade (ANEXOS D-F) foi obtida na

quantificação das amostras de fármacos permeadas no modelo HTS-

SNAPWELL empregando-se métodos HPLC-PDA farmacopeicos (USP e

FB) revalidados segundo parâmetros do FDA, assegurando confiabilidade e

segurança aos dados.

Para o modelo HTS-SNAPWELL há evidências de sua potencial

aplicação na classificação de moléculas em alta e baixa permeabilidade,

empregando-se metoprolol como limite inferior de alta permeabilidade.



50

Referências

6. REFERÊNCIAS

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56

Anexos

ANEXOS

6.1. ANEXO A – P ARECER DO COMITE DE ÉTICA



57

Anexos

6.2. ANEXO B – CONFIRMAÇÃO DE SUBMISSÃO DO ARTIGO



58

Anexos

6.3. ANEXO C – NORMAS DE PUBLICAÇÃO DO ARTIGO

Journal of Pharmaceutical Sciences

Copyright © 2014 Wiley Periodicals Inc. and the American Pharmacists Association

Edited By: Dr. Ronald T. Borchardt

Impact Factor: 3.007

ISI Journal Citation Reports © Ranking: 2013: 20/58 (Chemistry Medicinal); 43/148

(Chemistry Multidisciplinary); 76/254 (Pharmacology & Pharmacy)

Online ISSN: 1520-6017

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FAQs and tips on article preparation, submission and more.

• Permission Request Form

• NIH Statement

Author Guidelines



59

Anexos

All submitted manuscripts should contain previously unpublished original

research. Submitted manuscripts should not be under consideration for

publication elsewhere.

1. Online Submission and Peer Review

Authors should ensure that papers conform to the scientific and style instructions

given below. In order to expedite the publication process the Journal requires that

manuscripts be submitted online at http://mc.manuscriptcentral.com/jpharmsci .

Journal of Pharmaceutical Sciences has a completely digital submission, review, and

production process. We therefore ask for production-quality files at the time of

submission of your manuscript. This will speed the production and distribution of

your work across a variety of print and electronic platforms. If you don’t follow the

simple guidelines given below, your submission will be returned to you for

additional revision. This will of course delay review and, in the event that your work

is accepted, would delay publication. Therefore we ask that you pay careful attentionat this time and we thank you for your cooperation.

If you have not already done so, create an account for yourself in the system at the

submission site, http://mc.manuscriptcentral.com/jpharmsci by clicking on the

"Create an Account" button (you may check the progress of your manuscript

throughout the review process by logging in and checking your Author Center).

Please follow on-screen instructions and the system will guide you through the

submission process. At the “File Manager” screen, you will be asked to upload

manuscript files. Please designate the Peer-Review Version of your manuscript

(incorporating all elements) as a “File For Review” (by selecting “Yes” in the drop-

down box). Production-ready files (separate elements) should be designated as “Files Not For Review” (by selecting “No” in the drop-down box).

Online help is available to you at all times during the process. You are also able to

exit/re-enter at any stage before finally "submitting" your work. All submissions are

kept strictly confidential. You may contact the Journal's Editorial Assistant, Tammy

Dunning, at [email protected], or at tel.785-864-5919, fax 785-864-5875.

TEXT

Submit your text in DOC format. Do not embed figures or tables in this document.

These should be submitted as separate files.

TABLES

Tables should be created with a word processor and saved in either DOC or RTF

format. Do not embed tables in your text. Tables should be on separate pages and

saved as one file in DOC format.

FIGURES

To ensure the highest print quality, your figures should be submitted in either TIF or

EPS format at 300 dpi. For more instructions on preparing high quality figures,

please see our Graphics FAQ.



60

Anexos

COLOR FIGURES

In addition to the above resolution guidelines, color figures must be submitted in a

CMYK color. Do not submit color figures as RGB.

2. Scope of the Journal of Pharmaceutical Sciences.

JPharmSci® focuses on two major questions of importance to pharmaceutical

scientists: (i) What are the physical and biological barriers that limit the access of

drugs to their therapeutic targets?; and (ii) How can drugs, excipients, traditional

formulations, novel drug delivery systems and drug products be designed to

maximize therapeutic efficacy? Answers to these questions have in the past and will

in the future be forthcoming from research in a variety of scientific disciplines

including but not limited to the following: physical pharmacy; pharmaceutics;

pharmaceutical technology; drug delivery; pharmaceutical engineering; materials

science; nanotechnology; animal, human, cellular and molecular biopharmaceutics;

animal and human pharmacokinetics, pharmacodynamics and pharmacogenomics;

drug metabolism and transport; biotechnology; medical chemistry, including drugdesign and prodrug strategies; biophysical chemistry; analytical and bioanalytical

chemistry; physical organic, organic, and computational chemistry; molecular

modeling; immunology; biochemistry; and cell and molecular biology. The scientific

content of manuscripts submitted to JPharmSci® should fit into one of the following

subject categories:

Drug Discovery-Development Interface: Manuscripts in this scientific category

should include descriptions of quantitative and mechanistic research in

pharmaceutics, biopharmaceutics, pharmacokinetics, pharmacodynamics and drug

metabolism and transport that are normally conducted during the discovery of

organic chemistry-based and biotechnology-based hits, leads and potential drugcandidates. Research results of particular interest to the readers of JPharmSci®

would include those that afford valuable, new information about how a molecule's in

vitro and in vivo behavior are influenced by its molecular and physico-chemical

properties, traditional formulations and novel delivery systems used in lead

optimization studies. This scientific category would also encompass manuscripts that

describe: (i) new and novel analytical methodologies and that would facilitate and/or

more accurately and completely characterize the physico-chemical and biological

properties of hits, leads and potential drug candidates; and (ii) new and novel

formulations strategies and drug delivery systems, including those built on bio-and

nanotechnologies, that would enhance the delivery of these molecules to their

pharmacological targets in animal models.

Pharmaceutical Biotechnology: Manuscripts in this scientific category should

include descriptions of quantitative and mechanistic research in pharmaceutics, drug

delivery and pharmaceutical technology that are normally conducted during the

preclinical and clinical drug development of biotechnology-based drug candidates

and drugs (e.g. peptides, proteins, antibodies, vaccines, DNA, RNA). Research

results of particular interest to the readers of JPharmSci® would include those that

afford valuable, new information about how a molecule's in vitro and in vivo

behavior is influenced by its molecular and physico-chemical properties, traditional

formulations and novel drug delivery systems used in preclinical and clinical studies

and the manufacturing processes that give rise to the final drug product. This

scientific category would also encompass manuscripts that describe: (i) new and



61

Anexos

novel analytical methodologies that would facilitate and/or more accurately and

completely characterize the physico-chemical and biological properties of

biotechnology-based drug candidates and drugs; and (ii) new and novel formulations

strategies and drug delivery systems, including those built on bio-and

nanotechnologies, that would enhance the delivery of these types of molecules to

their pharmacological targets in animals and humans.

Pharmaceutics, Drug Delivery and Pharmaceutical Technology:

Manuscripts in this scientific category should include descriptions of quantitative and

mechanistic research in pharmaceutics, drug delivery and pharmaceutical technology

that are normally conducted during the preclinical and clinical development of

organic chemistry-based drugs based drugs or drug candidates. Research results of

particular interest to the readers of JPharmSci® would include those that afford

valuable, new information about how the in vitro and in vivo behavior of a drug

molecule or formulation excipient is influenced by its molecular and physico-

chemical properties, traditional formulations and novel drug delivery systems used in pre-clinical and clinical studies and the manufacturing processes that give rise to the

final drug product. This scientific category also encompasses manuscripts that

describe: (i) new and novel analytical methodologies that facilitate and/or more

accurately and completely characterize physico-chemical and biological properties of

biotechnology-based drugs and drug candidates; (ii) new and novel pro-drug

strategies and formulation strategies and drug delivery systems, including those built

on bio- and nanotechnologies, that enhance the delivery of these types of molecules

to their pharmacological targets in animals and humans; and (iii) new and novel

developments in manufacturing of drugs and drug delivery systems, including

continuous manufacturing and the Quality by Design concept.

Pharmaceutical Nanotechnology:

Manuscripts in this scientific category should describe quantitative and mechanistic

experimental or theoretical research in nanoscale-based pharmaceuticals or

diagnostics in which the innovation resides specifically in the nanoscale aspects of

the work. Manuscripts reporting advances in pharmaceutical nanotechnology that are

being disclosed for the first time would be of particular interest. Suitable topics in

this category include advances in the fabrication of nanoscale materials with

demonstrably new or significant functionality potential for pharmaceutical

applications. Additional topics include improved quantitative methods ofcharacterization of nanoscale pharmaceutical materials and mechanistic studies that

contribute to an improved understanding of functionality of nanoscale-based

technologies with clear therapeutic implications. The manuscript's conclusions

should be supported by relevant in vitro and/or in vivo experimenal data and

appropriate statistical analysis. Notable exceptions to the requirement for appropriate

physical and biological characterization are : (i) comprehensive and complete

theoretical or computational studies; and (ii) meta-analyses of historical data or

reviews of the existing literature.

Pharmacokinetics, Pharmacodynamics and Drug Transport and Metabolism:



62

Anexos

Manuscripts in this scientific category should encompass quantitative and

mechanistic research normally conducted during the preclinical and clinical drug

development of organic chemistry-based or biotechnology-based drug candidates or

drugs that affords valuable, new information (e.g. drug-drug interactions) about the

molecule's in vitro metabolism and/or in vitro absorption, distribution, metabolism

and excretion (ADME) and how these properties relate to the molecule's in vivo pharmacological and toxicological properties. This scientific category would also

encompass manuscripts that describe new and novel analytical methodologies that

would facilitate and/or more accurately and completely characterize the

pharmacokinetics, pharmacodynamic and drug metabolism and transport properties

of these types of drug candidates and drugs in animals and humans.

Global Health: Manuscripts in this scientific category should encompass

descriptions of quantitative and mechanistic research in pharmaceutics,

biopharmaceutics, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and metabolism and

transport properties that are normally conducted during the discovery of organic

chemistry-based and biotechnology-based hits, leads and potential drug candidatesand the preclinical and clinical development of drug candidates and drugs targeting

diseases common in developing countries. Research results of particular interest to

the readers of JPharmSci® would include those that afford valuable, new information

about how a molecule's in vitro and in vivo behavior are influenced by its molecular

and physico-chemical properties, traditional formulations, novel drug delivery

systems and manufacturing processes. The scientific category would also encompass

manuscripts that describe new and novel analytical methodologies that would

facilitate and/or more accurately and completely characterize the pharmaceutics,

pharmacokinetics, pharmacodynamics, drug metabolism, drug delivery and

manufacturing properties of these types of drug candidates and drugs in animals and

humans.

3. Types of Manuscripts.

The Editor-in-Chief and one Editor, as well as members of the Journal's Editorial

Advisory Board and independant experts, will review most manuscripts submitted to

JPharmSci®. However, the Editor-in-Chief and the Editors reserve the right to reject

a manuscript without conducting an in-depth review if they feel that the manuscript

is "out of scope" or it does not meet the minimal acceptance criteria for publication

in JPharmSci®.

Rapid Communications are preliminary accounts of significant and originalexperimental and/or theoretical results that fit within the scope of JPharmSci®. The

results must be of sufficient significance, originality and general interest to justify

accelerated publication. Authors are asked to write their manuscripts in a clear and

concise manner and to include only data crucial to arriving at their final conclusions.

Preferably manuscripts should not exceed 2,000 words of text and a total of 4 figures

and/or tables. Extra experimental and/or theoretical data in the form of figures and

tables should be deposited under Supporting Information.

Research Articles are comprehensive accounts of significant and original

experimental and/or theoretical results that fit within the scope of JPharmSci®.

Authors are asked to write their manuscripts in a clear and concise manner and to

include only data crucial to arriving at their final conclusions. Preferably manuscripts



63

Anexos

should not exceed, 5,500 words of text and a total of 8 figures and/or tables. Extra

experimental and/or theoretical data in the form of figures and tables should be

deposited under Supporting Information.

Notes differ from Rapid Communications in that they are final reports and fromResearch Articles in that they are limited in scope. Authors are asked to write their

manuscripts in a clear and concise manner and to include only data crucial to arriving

at their final conclusions. Preferably manuscripts should not exceed 2,000 words of

text and a total of 4 figures and/or tables. Extra experimental and/or theoretical data

in the form of figures and tables should be deposited under Supporting Information.

Lessons Learned are short articles (600 words) which provide authors with a means

of informing other scientists about critical issues, experiences and observations, the

descriptions of which would not be appropriate for a typical Research Article,

Communication, Note, Commentary or Review. Examples include, but are not

limited to, key insights into an unanticipated manufacturing problem, knowledgeaccumulated over a career of "tricks of the trade" for a given analytical or

formulation method, how to avoid a mistake that is repeated over and over again by

scientists in industry and academia. Each article will be reviewed directly by an

Editor who has expertise in the relevant scientific area. Because each of these articles

represents the personal opinion, experience and/or insights of the author(s), data are

not required (but could be described) nor does the identity of a given drug need to be

divulged. Articles may contain up to three key references.

General Commentaries, Global Health Commentaries and Clinical Trials and

Translation Medicine Commentaries (by invitation only) present author’s

considered opinion on a scientific or technical subjects within the scope JPharm Sci ®.

If the Commentary criticizes an article published in the JPharmSci®, the authors of

the original article will be given an opportunity to reply in the same issue in which

the Commentary is published. An author interested in preparing a Commentary for

JPharmSci® should provide a brief outline to Professor John Carpenter (Editor in

charge of General Commentaries and Global Health Commentaries) or Professor

Rodney Ho(Editor in charge of Clinical Trials and Translational Medicine),

requesting an invitation to submit a manuscript in one one of these categories.

Perspectives (by invitation only) articles summarize the viewpoints of distinguished pharmaceutical scientists with regard to the current status and future direction of the

field. Perspectives are similar in length to Commentaries and Reviews, and may be

submitted only by invitation. An author interested in preparing a Prespective for

JPharmSci® should provide a brief outline to Professor John Carpenter requesting an

invitation to submit a manuscript in this category.

Reviews (by invitation only) provide a comprehensive summary of broadly-based

topics of general interest to pharmaceutical scientists. Reviews are not limited as to

the number of words, tables, figures and references that may be included. An author

interested in preparing a Review for JPharmSci®

should provide a brief outline to



64

Anexos

Professor John Carpenter requesting an invitation to submit a manuscript in this

category.

Minireviews (by invitation only) are well-focused, well-documented examinations

of timely issues in the pharmaceutical sciences. The issues may be of a controversialnature, or may address a more narrowly focused area than those typically covered in

a Review. Minireviews are limited to approximately 3,000-4,000 words, including

tables, figures and references. An author interested in preparing a Minireview for

JPharmSci® should provide a brief outline to Professor John Carpenter requesting an

invitation to submit a manuscript in this category.

4. Preparation of Manuscripts.

(a) General Considerations. In order to expedite peer review, authors are required

to submit their manuscripts online at http://mc.manuscriptcentral.com/jpharmsci .

(See Section 1 above for details about the on-line submission process.)

Authors should write manuscripts in clear, concise English. The responsibility for all

aspects of manuscript preparation rests with the authors. Authors should note that

extensive changes or rewriting of the manuscript will not be undertaken by the

editors.

There are no page charges for publication in the Journal of Pharmaceutical Sciences.

(b) Suggested Reviewers. The Journal requires that submitting authors suggest at

least four reviewers, up to a maximum of six reviewers, two of which must be

Editorial Advisory Board (EAB) members; one must be a Scientific Advisor. Pleaseinclude suggested reviewers' contact information. A list of Editorial Advisory Board

(EAB) members and a list of Scientific Advisors can be found by clicking on the

corresponding link.

http://mc.manuscriptcentral.com/societyimages/jpharmsci/List_of_EAB_Members_Keywor

ds.xlsx

http://mc.manuscriptcentral.com/societyimages/jpharmsci/List%20of%20Scientific%20Advi

sor%20Keyword%20List.xlsx

(c) Title. Titles are of great importance for current awareness and for informationretrieval. The wording of titles should be chosen carefully to provide information on

the contents and to function as "points of entry" for information retrieval. Symbols,

formulas, or arbitrary abbreviations should not be included in the title, except

chemical symbols to indicate the structure of isotopically labeled compounds.

(d) Abstract. The abstract should briefly (80-200 words) present, in one paragraph,

the problem and experimental approach and state the major findings and conclusions.

It should be self-explanatory and suitable for reproduction without rewriting.

Footnotes or undefined abbreviations may not be used. If a reference must be cited,

complete publication data must be given.



65

Anexos

(e) Keywords. Please provide up to 10 keywords that reflect the scientific content of

your manuscript. At least 5 of your selected keywords must come from the Journal's

official keyword list ( Official Keyword List (.pdf) ). In addition to facilitating

indexing of articles, our keyword system assists in the assignment of qualified

reviewers for your manuscript. In addition, each member of our Editorial Advisory

Board has selected keywords that are applicable to their own work.

(f) Abbreviations. Abbreviations are used without periods. Standard abbreviations

should be used throughout the manuscript. All nonstandard abbreviations should be

kept to a minimum and must be defined in the text following their first use and in a

footnote at the beginning of the manuscript.

(g) QSAR/QSPR. All manuscripts dealing with quantitative structure activity

relationships (QSAR) and quantitative structure property relationships (QSPR) must

identify individual chemical structures using Chemical Abstracts Service (CAS)

SciFinder. To aid authors in the use of CAS SciFinder for structure searching, please

click here for a Commentary written by Dr. Christopher Lipinski describing the procedure. This Commentary appears in Journal of Pharmaceutical Sciences 91(12):

2470-2472.

(h) Experimental Section. The experimental procedures should be described in

sufficient detail to enable others to repeat the experiments. Names of products and

manufacturers [with city, state, and country (if other than the U.S.)] should be

included only if alternate sources are deemed unsatisfactory. Brand names may be

used only once in the manuscript. For subsequent designation, use "formulation A",

product B", etc. Novel experimental procedures should be described in detail, but

published procedures should merely be referred to by literature citation of both the

original and any published modifications. The purity of key compounds and

descriptions(s) of the method(s) used to determine purity should be included in this

section. For buffers, use terminology such as "20 mM potassium phosphate buffer

(pH 7.7) containing...". Also, state w/v or v/v when appropriate.

Identification of and precautions for handling hazardous chemicals and dangerous

procedures should be placed at the beginning of the section. An example would be "

Caution: The following chemicals are hazardous and should be handled carefully;

(list of chemicals and handling procedures or references) ".

Manuscripts containing data generated from animal and/or human studies mustspecify the committee and the institution that approved the experimental protocols

used to generate these data.

(i) Results. The results should be presented concisely. Tables and figures should be

designed to maximize the presentation and comprehension of the experimental data.

Attention should be paid to the matter of significant figures (usually, no more than

three). The same data should not be presented in more than one figure or in both a

figure and a table. As a rule, interpretation of the results should be reserved for the

discussion section of a Research Article , but under some circumstances it may be

desirable to combine results and discussion in a single section.



66

Anexos

(j) Discussion. The purpose of the discussion is to interpret the results and to relate

them to existing knowledge in the field in as clear and brief a fashion as possible.

Information given elsewhere in the manuscript should not be repeated in the

discussion. Extensive reviews of the literature should be avoided.

(k) References and Notes. Literature references and notes must be numbered in oneconsecutive series by order of mention in the text, with numbers as unparenthesized

superscripts. The accuracy of the references is the responsibility of the author. The

complete list of references and notes should be typed double-spaced on separate

page(s) at the end of the manuscript and follow the format shown. All references

should include titles. For journals: Yoneto K, Li SK, Higuchi WI, Jiskoot W, Herron

JN 1996. Fluorescence probe studies of the interactions of 1-alkyl-2-pyrrolidones

with stratum corneum lipid liposomes. J Pharm Sci 85:511-517. For edited books:

Rall TW, Schleifer LS. 1985. Drugs effective in the therapy of the epilepsies. In

Gilman AG, Goodman LS, Rall TW, Murad F, editors. The pharmacological basis of

therapeutics, 7th ed., New York: Macmillan Publishing Co. p 446-472. List

submitted manuscripts as "in press" only if formally accepted for publication;otherwise, use "unpublished results" after the names of authors. Any footnotes to the

text should be incorporated in the correct numerical sequence with the references.

(l) Supporting Information. The Supporting Information format of this journal can

accommodate and make readily available almost any type of supplementary figures

or data (e.g., reproductions of spectra, experimental procedures, tabulated data,

expanded discussion of peripheral findings, etc.). The author should include a

Supporting Information Available statement that describes the material at the end of

the printed manuscript text. Consult a current issue of the Journal for the proper

wording of this statement. Supporting Information should be clear and of high

contrast (suitable for direct photoreproduction) and submitted in quadruplicate on

8.5- × 11-in. paper. All pages of Supporting Information must be consecutively

numbered. Captions or legends for figures, spectra, etc., must appear directly on the

figure. Supporting Information is available free of charge via the Internet

(www.wileyonlinelibrary.com).

(m) Acknowledgments. This section should acknowledge financial support,

technical assistance, advice from colleagues, gifts, etc. Permission must be received

from persons whose contribution to the work is acknowledged in the manuscript.

(n) Spectral Data. It may be desirable to include such data for representativecompounds in a series, for novel classes of compounds, and in structural

determinations. Usually, it is not desirable to include routine spectral data for every

compound in the manuscript. Papers where interpretations of spectra are critical to

structural elucidation and those in which band shape or fine structure needs to be

illustrated may be published with spectra included. When such presentations are

deemed essential, only pertinent sections should be reproduced.

(o) Experimental Data. Experimental methods must be referenced or described in

sufficient detail to permit the experiments to be repeated by others. Detailed

descriptions of experimental methods should be placed in the experimental

procedures section. Data may be presented as numerical expressions in tables or ingraphical form with no duplication of information in the text. If tables or figures



67

Anexos

include a minimal number of experimental values (< four), the data should be

presented in the text. Units should be abbreviated without punctuation and with no

distinction between singular and plural forms (e.g., 1 mg, 25 mg).If possible,

statistical significance of the experimental data should be provided. Statistical

probability ( p ) in tables, figures, figure legends and text should be expressed as * p

< 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001. For multiple comparisons within a table,footnotes italicized in lower case, superscript letters should be used and defined in

the table legend. References to statistical methods of calculation should be provided.

If statistical limits cannot be provided, the number of determinations and some

indication of the variability and reliability of the results should be provided. For

animal experimental data, doses and concentrations should be expressed as molar

quantities (e.g., mmol/kg, mM) when comparisons are made between compounds

having large differences in molecular weights. The routes of administration of test

compounds and vehicles used should be indicated. For animal and human studies,

authors must specify the committee and the institution that approved the

experimental protocols used to generate these data.

If experimental data on proprietary compounds (i.e. compounds whose chemical

structures are not available in the public domain) and/or using proprietary procedures

(i.e. experimantal procedures and/or components of procedures that are not described

in the public domain) are provided in a manuscript, authors should carefully read the

next two paragraphs.

Traditionally, scientific papers must reveal sufficient information for the work to be

repeated by others. That tradition led to the policy that JPharmSci™ has applied to

manuscripts that contain information on proprietary small molecules. This policy

essentially states that information pertaining to proprietary (small molecule)

compounds can be published providing that, in the opinion of the reviewers and

editors, the paper would be publishable based solely on the information derived from

studies of known compounds. Thus, information on proprietary compounds has been

considered to be supplemental while the decision to publish or not has relied on

compounds for which structures were disclosed.

Studies of proprietary proteins and other biologicals pose a difficult situation for

JPharmSci™. In some cases, complete structures may not have been determined or,

even if the structure is available, compounds having identical structures may be

difficult for others to generate (e.g., the amino acid sequences of immunoglobulin

hypervariable regions). Yet, interesting studies of proprietary biologicals cannevertheless be envisioned that may be deemed to have sufficient value that the

failure to reveal detailed structural information should not be a deterrent to

publication. Therefore, the journal will determine the acceptability of such papers on

an individual basis. Decisions of acceptability will be made using the following

criteria: (a) the structural information provided is adequate for the purpose of

evaluating the paper using rigorous scientific standards; (b) the structural information

provided is sufficient to enable others to verify the results by conducting essentially

the same experiments; and (c) the work is judged to be of sufficient importance that a

lack of complete structural information does not significantly detract from its

scientific contributions.



68

Anexos

(p) Tables. Tabulation of experimental results is encouraged when this leads to more

effective presentation or to more economical use of space. Tables should be

numbered consecutively with Arabic numerals. Provide a brief title with each table

and a brief heading for each column. Clearly indicate the units of measure

(preferably SI). Data should be rounded to the nearest significant figure. Explanatory

material referring to the whole table is to be included as a footnote to the title (a).Footnotes in tables should be given lower case letter designations and cited in the

tables as italicized superscripts. Tables that require special treatment, such as

insertion of arrows or other special symbols under or over alphanumeric characters,

or contain many structures should be submitted as camera-ready copy. All tables

should be cited in the text.

(q) Illustrations. The quality of the illustrations printed in your paper depends on the

quality of the originals you provide. Electronic submission of illustrations is

required. Preferred formats for graphics and artwork are TIFF (tagged image file

format) and EPS (Encapsulated PostScript). John Wiley & Sons, Inc. journal pages

are now produced completely electronically. Please see our Graphics FAQ for moreinformation.

In preparing illustrations, contrast is important. Use dark black ink on high quality,

smooth, opaque white paper. Ordinary white bond paper works well. Avoid tracing

paper or textured "artist" papers.

Illustrations must fit a one- or two-column format on the journal page: For efficient

use of journal space, single column illustrations are preferred.

Single (preferred) Double

Minimum Width

9 cm (3.5 in)

Maximum Width

8 cm (3.125 in) 16.5 cm (6.5 in)

Maximum Depth

23 cm (9 in) 23 cm (9 in)

For best results, submit illustrations in the actual size at which they should

appear in the journal. Original illustrations which do not need to be reduced to fit a

single or double column will yield the best quality. Lettering should be no smaller

than 6 points. (Helvetica type works well for lettering.) Lines should be no thinner

than 0.5 point. Lettering and lines should be of uniform density. If you must submit

artwork that must be reduced, use larger lettering and thicker lines so that, when

reduced, the artwork meets the above-mentioned parameters. Avoid using complextextures and shading to achieve a three-dimensional effect. To show a pattern, choose

a simple cross-hatch design.

Color . All color figures will be reproduced in full color in the online edition of the

journal at no cost to the authors. Authors are encouraged to submit color illustrations

that highlight the text and convey essential scientific information. For best

reproduction, bright, clear colors should be used. Dark colors against a dark

background do not reproduce well; please place your color images against a white

background whenever possible. Please email [email protected] for further

information.



69

Anexos

Chemical Structures . Structures should be produced with the use of a drawing

program such as ChemDraw. Authors using the current versions of ChemDraw,

ChemIntosh, and ChemWindows will find the necessary parameters incorporated

into these programs ("JOC Document" under the Windows menus for ChemDraw

and "Reduce 60% for JOC Style" under the Options menu for

ChemIntosh/ChemWindows). In ChemDraw version 4.5, files should be saved inTIFF format to allow use of electronic files in production (see journal home page

"Information for Authors" for further guidelines).

(r) Nomenclature. It is the responsibility of the authors to provide correct

nomenclature. All nomenclature must be consistent and unambiguous and should

conform with current American usage. Insofar as possible, authors should use

systematic names similar to those used by Chemical Abstracts Service, the

International Union of Pure and Applied Chemistry, and the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology.

The chemical names for drugs should be used. If the terminology is unwieldy,nonproprietary names of drugs may be used throughout the manuscript after the first

mention and identification. Formally adopted nonproprietary names listed in United

States Adopted Names(USAN) should be used. In cases in which a name has not

been assigned by USAN, the International Nonproprietary Names (INN) , approved

by the World Health Organization, should be used. Trade names and laboratory

codes should not be used except as additional information.

(s) Analyses. Adequate evidence to establish identity and purity should be provided

for new compounds. When possible, this should include elemental analysis. The

purity of compounds used for biological testing should be stated with a description of

the method used to evaluate it.

(t) Hazardous Materials. All hazardous chemicals should be clearly identified as

such. Precautions for handling dangerous materials or for performing hazardous

procedures should be explicitly stated and referenced.

5. Proofs and Reprints. Proofs are sent to the author who submitted the papers.

Authors are directed via email to download proofs from Wiley Author Services.

Proofs should be verified against the manuscript and appropriate corrections made.

Substantial changes in a manuscript after type has been set require editorial approval

and in some cases may be cause for re-reviewing. An order form for reprints will besent with the proofs. Please return the reprint order form, along with a purchase order

or check, to John Wiley & Sons, Inc. Reprints will be shipped within 2 weeks after

the printed journal date.

6. Publication Online. Articles accepted for publication in the Journal of

Pharmaceutical Sciences will be posted in Early View and then into the Online

version of the journal (www.wileyonlinelibrary.com) as soon as author corrections to

proofs are received and incorporated. This can occur anywhere from 2 to 6 weeks

well in advance of the cover date of the printed issue. Authors should take this into

account when planning their intellectual and patent activities related to an article.

The actual date on which the article is posted online is recorded in a separate line atthe bottom of the first page of the article in the printed issue.



70

Anexos

7. Corrections. If errors of consequence are found in the published paper, a

correction of the error should be sent by the author to the Editor-in-Chief for

publication in the journal’s Errata Section.

8. Copyright Transfer Agreements (CTA) are located in Wiley Author Services.

You will be notified by email after acceptance on how to access and submit yourCTA for the Journal.

9. Confirmation of manuscript content must accompany initial submission. Manuscripts submitted to the Journal of Pharmaceutical Sciences should contain

significant, unpublished and original data not being considered simultaneously for

publication elsewhere. All authors should be aware of and in agreement with the

submission of this manuscript and share responsibility for its content. The

manuscript should provide full and appropriate credit to those who contributed to the

underlying hypothesis and the generation and interpretation of the experimental data.

Related research in the field should be acknowledged in the manuscript through

appropriate literature citations. Manuscripts should be devoid of any forms of plagiarism with respect to ideas, data, words, graphic materials or other forms of

communication. All authors should be aware that this manuscript will be checked for

plagiarism using CrossCheck anti-plagiarism software.

10. Scientific Misconduct Issues. An alleged violation of any of these basic rules of

scientific ethics will be investigated confidentially in accord with the procedures set

forth in the American Medical Association Manual of Style: A guide for Authors and

Editors (10th Edition). If the violations are deemed to be sufficiently serious, the

Editor-in-Chief will request that the authors provide a written explanation. If the

authors do not provide an explanation or the explanation is unsatisfactory, such that

the Journal's Editorial Team believes that the evidence clearly shows that scientific

misconduct did occur, the Editor-in-Chief would promptly reject the manuscript or

proceed to retract a published manuscript. In addition, the Editor-in-Chief reserves

the right to notify the authors's institution for the violation of the Journal's scientific

ethics policy. The Editor-in-Chief also reserves the option to request the author's

institution initate a formal investigation into the alleged violation of scientific ethics

and to report back to the Journal in a timely manner. If the formal institutional

investigation confirms scientific misconduct, the Editor-in-Chief will promptly reject

a pending manuscript or proceed to retract a published manuscript. Further,

JPharmSciTMEditorial Team reserves the right to impose punitive actions (e.g. ban on

publishing in the Journal) on authors proven to have violated any of the basic rules ofscientific ethics.

11. Conflicts of Interest Guidelines: Authors. Authors should acknowledge all

sources of funding used to generate the research results described in a manuscript

submitted to the journal. This includes government, corporate, foundation, private or

institutional funding. Authors should also disclose in their submitted manuscript any

personal financial or non-financial interests that, based on their knowledge, might be

affected by the publication of the results contained in the authors' manuscript. If

authors have no financial or non-financial interests that represent conflicts of interest,

they should inform the Editor-in-Chief in writing in the manuscript submission letter.

If authors have financial or non-financial interests that represent potential conflicts ofinterest, they should disclose these conflicts in a footnote or in the acknowledgement



71

Anexos

section of the manuscript. In the process of selecting "preferred reviewers" for their

manuscripts, authors should avoid suggesting individuals with whom they have

personal or professional relationships that might bias their judgment of the

manuscript's scientific merits.

12. Conflicts of Interest Guidelines: Reviewers. Reviewers should not evaluate amanuscript authored or co-authored by a person with whom the reviewer has

personal or professional relationships that might bias their judgment of the

manuscript's scientific merits. Reviewers should be sensitive to the appearance of

potential conflicts of interest when the content of the manuscript relates directly to

the reviewer's published or unpublished research. If in doubt, the reviewer should

immediately notify the appropirate Editor and seek their advice on whether to

proceed with the review. Reviewers should also be sensitive to the appearance of

potential conflict of interest when the manuscript describes results from experiments

using patented technologies, which are competitive with patented technologies

invented by the reviewer or the reviewer's employer.



72

Anexos

6.4. ANEXO D – CROMATOGRAMAS DOS FARMACOS TESTADOS A PARTIR DA

REVALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS FARMACOPEICAS CONFORME SEÇÃO 3.8.



73

Anexos



74

Anexos

6.5. ANEXO E – GRÁFICOS DA LINEARIDADE PARA OS FÁRMACOS TESTADOS

CONFORME SEÇÃO 3.8.



75

6.6. ANEXO F – GRAFICOS DA PRECISÃO E EXATIDÃO PARA OS FARMACOS

TESTADOS CONFORME SEÇÃO 3.8.

Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014

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Transcript of Dissertação - Laís Cristina Da Silva - 2014