Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS ESTUDO DE HERANÇA DA RESISTÊNCIA À BRUSONE (Magnaporthe oryzae) EM CULTIVARES DE ARROZ E IDENTITICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES THIAGO MARTINS PINHEIRO Orientadora: Profª. Larissa Leandro Pires GOIÂNIA 2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE AGRONOMIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ESTUDO DE HERANÇA DA RESISTÊNCIA À BRUSONE

(Magnaporthe oryzae) EM CULTIVARES DE ARROZ E

IDENTITICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES

THIAGO MARTINS PINHEIRO

Orientadora:Profª. Larissa Leandro Pires

GOIÂNIA

2011

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THIAGO MARTINS PINHEIRO

ESTUDO DE HERANÇA DA RESISTÊNCIA À BRUSONE

(Magnaporthe oryzae) EM CULTIVARES DE ARROZ E

IDENTITICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Agronomia, área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientadora:Profª. Drª. Larissa Leandro Pires

Co-orientadora: Dra. Marta Cristina Filippi

GOIÂNIA, GO – Brasil2011

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Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na

Biblioteca Digital da UFGNa qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a disponibilizar

gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1 1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese1 2. Identificação da Tese ou Dissertação:

Autor(a): Thiago Martins PinheiroCPF: 884.016.932-68 E-mail: [email protected] e-mail pode ser disponibilizado na página? [X] Sim [ ] Não

Vínculo Empregatício do(a) Autor(a):Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior Sigla: CAPESPaís: Brasil UF: GO CNPJ:Título: Estudo de herança da resistência à brusone (Magnaporthe oryzae) em cultivares de arroz e

identificação de marcadores moleculares

Palavras-chave: Resistência vertical, Resistência específica, Seleção assistida, Proteínas relacionadas à patogênese (PRP)

Título em outra língua: Inheritance study of resistance to rice blast (Magnaporthe oryzae) in rice cultivars and identification of molecular markers

Palavras-chave em outra língua: Vertical resistance, Specific resistance, Assisted selection, Proteins related to pathogenesis (PRP)

Área de concentração: Genética e Melhoramento de PlantasData defesa: 28/02/2011Programa de Pós-Graduação: Agronomia – Genética e Melhoramento de PlantasOrientador(a): Profª. Drª. Larissa Leandro PiresCPF: 862.728.961-15. E-mail: [email protected](a): Drª. Marta Cristina Corsi de FilippiCPF: 051.829.609.32 E-mail: [email protected](a):CPF: E-mail:

3. Informações de acesso ao documento:Liberação para disponibilização?1 [X] total [ ] parcialEm caso de disponibilização parcial, assinale as permissões:[ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________[ ] Outras restrições: ______________________________________________________Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF não-criptográfico da tese ou dissertação.O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

____________________________ Data: 23/02/2012 Assinatura do(a) autor(a)

1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.

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Aos meus pais, Roberto e Estela.À minha irmã, Michele.

Aos meus irmãos em amizade, Higor e Otávio.

DEDICOE

OFEREÇO

“Depois de algum tempo você aprende a diferença, a sutil diferença entre dar a mão e acorrentar uma alma. E você aprende que amar não significa apoiar-se. E que companhia nem sempre significa segurança. Começa a aprender que beijos não são contratos e que presentes não são promessas.

Começa a aceitar suas derrotas com a cabeça erguida e olhos adiante, com a graça de um adulto e não com a tristeza de uma criança.

E aprende que, não importa o quanto você se importe, algumas pessoas simplesmente não se importam… E aceita que não importa quão boa seja uma pessoa, ela vai feri-lo de vez em quando e você precisa perdoá-la por isso.

Descobre que se leva anos para construir confiança e apenas segundos para destruí-la… E que você pode fazer coisas em um instante das quais se arrependerá pelo resto da vida.

Aprende que, ou você controla seus atos, ou eles o controlarão… e que ser flexível não significa ser fraco, ou não ter personalidade, pois não importa quão delicada e frágil seja uma situação, sempre existem, pelo menos, dois lados. Aprende que heróis são pessoas que fizeram o que era necessário fazer, enfrentando as conseqüências.

Aprende que quando está com raiva tem o direito de estar com raiva, mas isso não te dá o direito de ser cruel. Descobre que só porque alguém não o ama do jeito que você quer que ame não significa que esse alguém não o ama com tudo o que pode, pois existem pessoas que nos amam, mas simplesmente não sabem como demonstrar ou viver isso.

Aprende que nem sempre é suficiente ser perdoado por alguém… Algumas vezes você tem de aprender a perdoar a si mesmo. Aprende que com a mesma severidade com que julga, você será em algum momento condenado.

Aprende que não importa em quantos pedaços seu coração foi partido, o mundo não pára para que você o conserte. Portanto, plante seu jardim e decore sua alma, em vez de esperar que alguém lhe traga flores.

E você aprende que realmente pode suportar… que realmente é forte, e que pode ir muito mais longe depois de pensar que não se pode mais. E que realmente a vida tem valor e que você tem valor diante da vida! Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o bem que poderíamos conquistar se não fosse o medo de tentar.”

Adaptado de O Menestrel – W. Shakespeare

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AGRADECIMENTOS

À Deus, pela saúde, serenidade e força para a realização deste trabalho;

Aos meus pais e irmã, pelo amor e apoio;

À Nara Rodrigues, pela amizade e ajuda na formatação deste trabalho;

À Bruna Fernandes, por todo seu significado em minha vida;

Ao M. Sc. Fábio Gonçalves, pelos ensinamentos e companheirismo;

À Dr.ª Marta Cristina Corsi de Filippi, pela orientação, dedicação, paciência,

confiança e valiosas lições profissionais e de vida;

À Prof.ª Dr.ª Larissa Leandro Pires, pela orientação, confiança e apoio;

À Prof.ª Dr.ª Leila Garcês de Araújo, pela orientação no estágio de docência,

sugestões de melhoria e incentivo;

À UFG, pela concessão da vaga de mestrado;

À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo;

À Embrapa Arroz e Feijão, pela oportunidade de realização dos experimentos;

Ao Dr. Rafael Moysés Alves, pelos ensinamentos e amizade;

Ao Dr. Anne Sitarama Prabhu, pelas sugestões e empréstimo de materiais de

pesquisa;

À Drª. Tereza Borba, pelo auxílio com os marcadores microssatélites;

À Drª. Raquel de Mello, pelo incentivo;

Aos professores da Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da

Universidade Federal de Goiás, pelos ensinamentos;

Ao M. Sc. Márcio Vinícius Cortês, pelo treinamento e auxílio com o

experimento de atividade enzimática e por sua quase infindável paciência e compreensão;

Às funcionárias da Embrapa Arroz e Feijão, Paula Arielle Valdisser, Gesimária

Costa e Fernanda Magalhães, pelo auxílio no Laboratório de Biotecnologia;

Aos funcionários da Embrapa Arroz e Feijão, Edmar (Nenê) Ribeiro e

Wanderlei (Delei) Cardoso, pelo treinamento e auxílio com os cruzamentos e obtenção das

populações de arroz utilizadas neste trabalho;

Aos funcionários da Embrapa Arroz e Feijão, Celsinho e Vando, pelo apoio na

condução dos experimentos em casa de vegetação;

Ao secretário da pós-graduação, Wellinton Motta, pela eficiência e disposição

em ajudar;

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Aos colegas e ex-colegas dos laboratórios da Embrapa Arroz e Feijão de

Fitopatologia: Mariana, Bruna Rengel, Maythsulene, Rafael Abud, Lucas Curado, Lidiane,

Eugênio, e de Biotecnologia: Nara, Bruna Sanchez, Cristóvão, Ricardo, Jorge, Ivan e

Thássio, pelo convívio e bom-humor;

Aos colegas de mestrado Bruna Carla Fagundes, Giselle Davi, Rodrigo

Branquinho, Jarênio, Neucy, João Antônio, Jackeline e Carolina Fagundes, pela

companhia, amizade e estímulo.

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SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS...........................................................................................................5LISTA DE FIGURAS............................................................................................................6ABSTRACT.........................................................................................................................101INTRODUÇÃO..................................................................................................................112REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................142.1A DOMESTICAÇÃO DO GÊNERO ORYZA...............................................................142.2MELHORAMENTO GENÉTICO DO ARROZ.............................................................162.3BRUSONE DO ARROZ.................................................................................................172.4RESISTÊNCIA GENÉTICA A BRUSONE...................................................................212.5MARCADORES MOLECULARES...............................................................................242.6ESTRUTURA DAS POPULAÇÕES DE BRUSONE....................................................262.7EXPRESSÃO DA RESISTÊNCIA E MECANISMOS DE DEFESA DA PLANTA....273MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................293.1ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA À BRUSONE

(Magnaporthe oryzae) NAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1...................................................................................................................29

3.1.1Obtenção das populações segregantes.........................................................................293.1.2Identificação do número de alelos de resistência ........................................................313.1.4Identificação dos indivíduos resistentes.......................................................................343.1.5Validação experimental................................................................................................353.2MÉTODOS MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA HERANÇA DE

GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO. 373.2.1Extração de DNA genômico........................................................................................373.2.2Marcadores microssatélites .........................................................................................383.2.3 Análise de ligação.......................................................................................................403.3CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES DE

RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO......................413.3.1Plantio da população de estudo....................................................................................413.3.2Inoculação....................................................................................................................413.3.3Coleta das amostras......................................................................................................413.3.4Identificação dos indivíduos resistentes.......................................................................423.3.5Construção dos bulks e extração protéica....................................................................423.3.6Quantificação de proteínas totais e determinação de curva de calibração...................423.3.7Ensaio de atividade de β-1,3-glucanase.......................................................................433.3.8Ensaio de atividade de peroxidase...............................................................................444RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................454.1ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA NAS CULTIVARES DE

ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1..............................................................454.1.1Cruzamento: Metica-1 (S) x Cica-8 (R).......................................................................454.1.2Cruzamento Cica-8 (S) x Metica-1 (R)........................................................................484.2MARCADORES MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA HERANÇA DE

GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO. 534.3CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES DE

RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO......................584.3.1Atividade de β-1,3-glucanase.......................................................................................624.3.2Atividade de Peroxidase...............................................................................................645CONCLUSÕES..................................................................................................................66

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6REFERÊNCIAS.................................................................................................................67ANEXOS..............................................................................................................................79

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Relação dos primers microssatélites selecionados. ............................. 24

Tabela 2. Reações de PCR para cada marcador microssatélite utilizado. .......... 25

Tabela 3.Programações dos termocicladores para cada primer microssatélite utilizado. .............................................................................................. 26

Tabela 4.Frequências esperadas e obtidas das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1:1 e RC1:2, inoculadas com isolado 1049. .............. 31

Tabela 5.Frequências esperadas e obtidas das populações inoculadas com isolado 435. ......................................................................................... 34

Tabela 6.Teste de χ2 e significância para as frequências esperadas para as populações inoculadas com isolado 1049 e 435. ................................ 37

Tabela 7.Análise de variância da atividade enzimática de β-1,3-glucanase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ............................................................. 43

Tabela 8.Análise de variância da atividade enzimática de β-1,3-glucanase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ............................................................... 43

Tabela 9.Análise de variância da atividade enzimática de peroxidase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ............................................................. 44

Tabela 10.Análise de variância da atividade enzimática de peroxidase das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ............................................................... 44

Tabela 11.Atividade enzimática de β-1,3-glucanase (U.mg-1) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ....................................................................................... 44

Tabela 12.Atividade enzimática de β-1,3-glucanase (U.mg-1) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ......................................................................................... 45

Tabela 13.Atividade enzimática de peroxidase (U.mg-1) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049. ...................................................................................... 45

Tabela 14.Atividade enzimática de peroxidase (U.mg-1) das populações segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435. ......................................................................................... 46

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Plantio das cultivares Metica-1 e Cica-8 para obtenção das populações F1, F2, RC1 e RC2. ..................................................... 18

Figura 2. Sementes de arroz da população F1 obtidas por meio do cruzamento entre as cultivares Metica-1 e Cica-8. ...................... 19

Figura 3. Semeio das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2. .............................................................................................. 20

Figura 4. Inoculação das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2 em casa de vegetação. A e B: Disposição das bandejas na casa de vegetação; C: Compressor e D: Atomizador DeVillbis. ..................................................................................... 22

Figura 5. Tipos de lesões de brusone em arroz. A: Lesão tipo 0; B: Lesão tipo 1; C: Lesão tipo 3; D: Lesão tipo 5; E: Lesão tipo 7 e F: Lesão tipo 9. ................................................................................. 23

Figura 6. Incubação em banho-maria a 100ºC para ensaio de atividade de β-1,3-glucanase. ........................................................................... 29

Figura 7. Frequência de plantas da população Metica-1 para o isolado 1049. ............................................................................................ 32

Figura 8. Frequência de plantas da população Cica-8 para o isolado 1049. 32

Figura 9. Frequência de plantas da população F1 para o isolado 1049. ...... 32

Figura 10. Frequência de plantas da população F2 para o isolado 1049. ...... 33

Figura 11. Frequência da população RC1:1 para o isolado 1049. .................. 33

Figura 12. Frequência da população RC1:2 para o isolado 1049. .................. 34

Figura 13. Frequência da população Cica-8 para o isolado 435. .................. 35

Figura 14. Frequência da população Metica-1 para o isolado 435. ............... 35

Figura 15. Frequência da população F1 para o isolado 435. ......................... 35

Figura 16. Frequência da população F2 para o isolado 435. ......................... 36

Figura 17. Frequência da população RC1:1 para o isolado 435. .................... 36

Figura 18. Frequência da população RC1:2 para o isolado 435. .................... 37

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Figura 19. Padrão de amplificação nos genitores Metica-1 e Cica-8, apresentado por onze marcadores em gel de poliacrilamida desnaturante (6%). Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 1049 (Cica-8). Marcadores microssatélites: 9871.T7E2b, RM224, RM7102, OSR32, RM144, RM6836, RM1261, JJ817, yca72, pBA14 e RM28130. .................................................................................... 39

Figura 20. Padrão de amplificação observada em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) para os primers RM224, RM7102, RM1261 e yca72 nos bulks das populações F1 e F2 resistente e susceptível. Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 1049 (Cica-8); BH: Bulk da população F1; BFR: Bulk da população F2 resistente; BFS: Bulk da população susceptível. .................................................... 40

Figura 21. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) nos indivíduos das populações F1, F2 resistente e F2 susceptível pelo marcador RM7102. M: Ladder 10 bp; números 1 a 7: indivíduos do bulk F1; números 8 a 14: indivíduos do bulk F2 resistente; números 15 a 21: indivíduos do bulk F2 susceptível. ................................................................ 41

Figura 22. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%) nos genitores Metica-1, Cica-8 e bulks das populações F1 e F2 resistente e susceptível. M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 435 (Cica-8); P2: Genitor doador de resistência ao isolado 435 (Metica-1); BH: Bulk da população F1; BFR: Bulk da população F2 resistente; BFS: Bulk da população susceptível. .................................................... 42

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RESUMO

PINHEIRO, T. M. Estudo de herança da resistência à brusone (Magnaporthe oryzae) em cultivares de arroz e identificação de marcadores moleculares. 2011. 80 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Genética e Melhoramento de Plantas)–Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011.1

A brusone (Magnaporthe oryzae) é considerada a doença mais importante dos arrozais. Devido à alta variabilidade da população do patógeno, cultivares de arroz rapidamente tem sua resistência à brusone sucumbida. A identificação e incorporação de diferentes genes de resistência em cultivares melhoradas e adaptadas, com o auxílio de técnicas moleculares, constitui-se em uma das estratégias na busca de resistência estável a serem adotadas. Tendo em vista o desafio acima colocado, este trabalho teve como objetivo determinar o número de alelos envolvidos na expressão de resistência do arroz a brusone, identificar marcadores microssatélites ligados a estes alelos e caracterizar a ação de duas enzimas relacionadas à patogênese. Os experimentos foram conduzidos sob condições controladas de casa de vegetação e laboratório. As gerações F1, F2, RC1:1 e RC1:2

foram semeadas em bandejas plásticas. Cada bandeja continha oito linhas, sendo dez plantas por linha. Cada patótipo de M. oryzae foi inoculado em trinta plantas do genitor resistente, trinta plantas do genitor suscetível, duzentas plantas da população F2, cem plantas da população RC1:1 e cem plantas da população RC1:2. Os isolados 1049, patótipo IB-1 e 435, patótipo IB-9, foram cultivados em meio de cultura aveia-dextrose-ágar para produção de solução de inóculo, à concentração de 3.105 conídios.mL-1. As plantas inoculadas foram mantidas sob alta condição de umidade e temperatura média de 28ºC, durante sete dias. As avaliações foram feitas identificando a proporção de plantas resistentes e suscetíveis. Para testar onze marcadores microssatélites selecionados, foram feitas extrações de DNA de cada genitor e das populações F1 e F2. As reações de PCR assim como os ciclos de amplificação foram montadas de acordo com a característica de cada microssatélite. As reações foram submetidas a gel poliacrilamida desnaturante (6%) para identificação de polimorfismo entre os genitores e as populações F1 e F2. A caracterização enzimática foi estudada através da extração de proteínas, antes e depois da inoculação, durante cinco dias consecutivos para a determinação da atividade enzimática de β-1,3-glucanase (PR1) e peroxidase. A segregação em ambas as populações F2

apresentou proporção de três plantas resistentes para uma planta suscetível. Foi identificado um marcador microssatélite, RM7102, ligado ao alelo de resistência da cultivar Cica-8 ao patótipo IB-1. Não foi possível detectar diferenças entre as populações F2 resistentes e F2 suscetível quanto atividade de peroxidase. A população F2 suscetível, para ambos os patótipos, apresentou alta atividade de β-1,3-glucanase, enquanto a atividade da mesma enzima nos genitores e população F2 resistente não mostrou aumento significativo.

Palavras-chave: resistência vertical, resistência específica, seleção assistida, proteínas relacionadas à patogênese (PRP)

______________1 Orientadora: Profª. Drª. Larissa Leandro Pires. EA-UFG.

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Co-orientadora: Drª. Marta Cristina Corsi de Filippi. Embrapa Arroz e Feijão.

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ABSTRACT

PINHEIRO, T. M. Inheritance study of resistance to rice blast (Magnaporthe oryzae) in rice cultivars and identification of molecular markers. 2011. 80 f. Dissertation (Master in Agronomy: Genetic and Plant Breeding)–Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011.1

Blast (Magnaporthe oryzae) is considered the most important disease of rice fields. Due to the high variability of the pathogen's population, rice cultivars quickly have its race-specific resistance to blast broken. The identification for incorporating different resistance genes in improved and adapted cultivars, utilizing molecular tools, is one breeding strategy to find stable resistance in short period. The goal of this research was to identify the number of resistance genes and SRR molecular markers to the pathotypes IB-1 and IB-9 of M. oryzae, and characterize some enzymes related to the expression of resistance. The experiments were conducted under controlled conditions of green house and laboratories. After crossing cultivar Cica-8 and cultivar Metica-1, the populations F1, F2, BC1:1 and BC2:2 were sown in plastic trays containing five kg of soil fertilized. Each tray contained eight lines with ten plants per row. Each pathotype of M. oryzae inoculated thirty plants of resistant parents, thirty plants of susceptible parents, two hundred plants of F2

population, one hundred plants of BC1:1 population and one hundred plants of BC1:2

population. The isolates 1049 (IB-1) and 435 (IB-9) were cultivated on oat medium to produce the inoculum solution (3.105 conidia.mL-1). The inoculated plants were kept under high humidity condition at 28°C, during seven days. Evaluations were made identifying the number of resistant and susceptible plants. Eleven microsatellite markers were tested by PCR strategies, utilizing DNA of each parent (resistance and susceptible), F1 and F2

populations. PCR reactions were assembled according to the characteristic of each SSR prime. The fragments were separated by denature polyacrylamide (6%) gel to identify polymorphism. Linkage analysis of the RM7102 microssatelite marker was estimated using the MAP MAKER III software. The enzymatic characterization was studied through the extraction of proteins, before and after inoculation, during five consecutive days for the determination of the activity of β-1,3-glucanase (PR1) and peroxidase. Segregation in populations F2 resistant and susceptible presented ratio of 3 plants resistant to 1 plant susceptible. An SSR marker has been identified, RM7102, and linked to the resistance gene of cultivar Cica-8 to the pathotype IB-1. Peroxidase had little activity in all populations. The F2 populations, susceptible to both isolates, presented high β-1,3-glucanase activity. Key words: vertical resistance, specific resistance, assisted selection, proteins related to pathogenesis (PRP)

_______________1 Adviser: Profª. Drª. Larissa Leandro Pires. EA-UFG.

Co-adviser: Drª. Marta Cristina Corsi de Filippi. Embrapa Arroz e Feijão.

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1 INTRODUÇÃO

Para a metade da população global, cerca de quatro bilhões de pessoas, o arroz

possui importância social por constituir-se cultura de subsistência e alimentar, fornecendo

20% do suprimento energético da dieta mundial, enquanto o trigo fornece 19% e o milho

5%. Contém alta concentração de amido além de fornecer também proteínas, vitaminas e

minerais, acompanhados de baixo teor de lipídios (Anexo A) (Walter et al. 2008). Nos

países em desenvolvimento o arroz pode fornecer, em média, 715 kcal per capita por dia,

27% dos carboidratos, 20% das proteínas e 3% dos lipídios da alimentação. No Brasil, o

consumo per capita é de 108 g por dia, fornecendo 14% dos carboidratos, 10% das

proteínas e 0,8% dos lipídios da dieta (Kennedy et al., 2002). Portanto, a quantidade e

qualidade nutricional da produção deste cereal afetam diretamente a saúde da população

mundial (Walter et al. 2008).

A produção de arroz está geograficamente concentrada na Ásia, com mais de

90% da produção mundial. China e Índia, que representam mais de um terço da população

mundial (52,3% no período de 1999-2003), abastecem mais da metade do mercado

mundial de arroz (UNIDO, 2008). Para 2010/2011 estava prevista uma produção de 452,5

milhões de toneladas, com estoque final global de 94,3 milhões de toneladas (WAOB,

2010). Em contrapartida, o consumo mundial, para a mesma safra, está estimado em

454,37 milhões de toneladas.

Na Ásia também concentra-se a maior área em extensão produtora de arroz,

acompanhada de uma demanda permanente e crescente do consumo deste cereal, atribuído

ao ritmo de crescimento da população. Destacam-se ainda a Indonésia, Bangladesh,

Vietnam, Tailândia, Mianmar, Filipinas e Japão. O Brasil é o produtor de arroz mais

importante fora do continente asiático, e representou, em media, 1,8% da produção

mundial durante o período de 1999 a 2003 (UNIDO, 2008).

Mundialmente, grandes aumentos na produção de arroz ocorreram durante as

últimas quatro décadas, refletindo a adoção de tecnologia da revolução verde. Entretanto,

atualmente, a taxa de crescimento dessa produção diminuiu. Enquanto essa produção

aumentou em uma taxa de 2,49% ao ano de 1970 a 1990, a taxa de crescimento anual

durante 1900 a 2000 foi de 1,70% e apenas 1,21% no período de 2000 a 2006.

No Brasil, de acordo com dados do IBGE em setembro de 2010 estimou-se um

total de 2.755.187 ha de área plantada, sendo estimado 2.702.263 ha de área a ser colhida

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com a cultura do arroz (representando 5,8% da produção nacional de cereais, leguminosas

e oleaginosas), sendo a região Sul a que apresenta maior área plantada, com 1.235.791 ha,

seguida das regiões Nordeste, Norte, Centro-Oeste e Sudeste, com 659.295 ha, 381.138 ha,

354.841 ha e 71.198 ha, respectivamente. A produção nacional esperada para o mesmo

período foi estimada em 11.280.501 t (7,6% da produção nacional de cereais, leguminosas

e oleaginosas), com rendimento médio esperado de 4.174 kg.ha-1. A região Sul apresentou

produção de 8.130.796 t, a região Centro-Oeste produziu 1.061.058 t, a região Norte com

produção de 1.026.185 toneladas, a região Nordeste: com 872.775 t e região Sudeste com

186.687 t. O Anexo B contém os dados de área plantada, produção e participação nacional

de cada estado brasileiro.

Os sistemas de produção de arroz podem ser implantados em dois grandes

ecossistemas: ecossistema de várzeas, irrigado por inundação controlada, e de terras altas,

podendo ser feito sem irrigação e com irrigação suplementar por aspersão (Guimarães et

al., 2006).

No ecossistema de várzeas, a cultura do arroz pode ser cultivada de forma

sistematizada, havendo controle da lâmina de água quando é conveniente ao cultivo.

Também pode ser cultivada em áreas com nivelamento inadequado, que impede o controle

da lâmina de água e a má drenagem não permite o manejo eficiente do sistema (várzeas

úmidas, não sistematizadas), sendo irrigadas pela água da chuva ou elevação do lençol

freático (Guimarães et al., 2006).

No ecossistema de terras altas, o arroz pode ser cultivado com irrigação

suplementar por aspersão ou sem irrigação, ficando dependente da precipitação pluvial. O

cultivo com uso de irrigação por aspersão é um sistema que requer alto investimento e

caracteriza-se pelo uso intenso do solo, necessitando de rotação de culturas e elevada

aplicação de tecnologia (Guimarães et al., 2006). Todos os três sistemas são submetidos a

estresses bióticos e abióticos. Entre os estresses bióticos que afetam o arroz destacam-se as

doenças, e entre elas a brusone (Pyricularia oryzae (Cooke) Saccardo teleomorfo

Magnaporthe oryzae (T. T. Herbert) Yaegashi & Udagawa). O arroz apresenta potencial

produtivo de dez toneladas por hectare, entretanto, pequenos e médios agricultores colhem

cerca de cinco toneladas por hectare de arroz irrigado devido às perdas ocasionadas por

insetos pragas e doenças (Khush & Jena, 2009). Além da perda na produtividade, a

ocorrência de doenças implica em perda na qualidade do produto final.

Page 18: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

13

De acordo com diversas estimativas, para garantir segurança alimentar nos

países consumidores de arroz do mundo, será necessário incremento de 30% na produção

de arroz até 2030 (Khush & Jena, 2009). Para superar esse desafio, são necessárias

cultivares com maior potencial produtivo e estabilidade, adaptadas a menores volumes de

água, terra, mão de obra e produtos químicos, como fertilizantes e defensivos (Zeng et al.,

2004).

Tendo em vista o desafio acima colocado, este trabalho teve como objetivo

determinar o número de alelos envolvidos na expressão de resistência do arroz à brusone,

identificar marcadores microssatélites ligados a estes alelos e caracterizar a ação de duas

enzimas relacionadas à patogênese.

Page 19: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

2 REVISÃO DE LITERATURA

O arroz é uma Liliopsida (Monocotiledônea) da família Poacea (Graminea),

subfamília Pooideae, tribo Oryzae e gênero Oryza. O gênero Oryza apresenta 22 espécies,

entre as quais se destacam O. sativa L. (arroz asiático) e O. glaberrima Steud (arroz

africano), pertencentes a um grupo de espécies chamado complexo Oryza sativa, junto com

cinco outras silvestres, O. rufipogon, O. longistaminata, O. barthii, O. glumaepatula e O.

meridionalis. Este complexo foi primeiramente definido como espécies diplóides, tendo o

genoma A em comum. Destas, somente O. rufipogon produz híbridos F1 férteis com O.

sativa e, portanto, são consideradas como pertencentes a uma única espécie biológica.

Evidências sugerem que O. rufipogon é o ancestral de O. sativa, e O. barthii é o ancestral

de O. glaberrima (Morishima, 2001). O. sativa, O. glaberrima e seus aparentados são

diplóides (2n = 24), constituídos pelo genoma AA, enquanto sete espécies silvestres são

tetraplóides (2n = 48) (Chang, 1996).

Goff et al. (2002) relatam que os genomas das espécies pertencentes à família

Poaceae variam consideravelmente em tamanho, mas apresentam alta sintenia e

similaridade nas sequências dos genes. Os genomas de sorgo, milho, centeio e trigo, por

exemplo, possuem tamanho estimado em 1000 Mb, 3000 Mb, 5000 Mb e 16000 Mb,

respectivamente. Em razão da sintenia com os demais cereais e por possuir um genoma

comparativamente pequeno (430 Mb; 12 cromossomos), o arroz é considerado como

modelo genético para todos os cereais (Lannes et al., 2004) e um alvo atrativo para

descoberta de genes em cereais e análise genômica.

2.1 A DOMESTICAÇÃO DO GÊNERO ORYZA

Fuller et al. (2009) indicam que a domesticação do arroz culminou após,

aproximadamente, 6500 anos antes da era paleolítica. Estes dados são consistentes com os

resultados de uma reanálise recente de mudanças no tamanho de grãos e fitólitos (Fuller et

Page 20: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

al., 2008). Ross-Ibarra et al. (2007) explicam que determinados eventos, denominados de

fundadores podem reduzir a diversidade genética, modificar frequências alélicas, aumentar

o desequilíbrio de ligação e eliminar alelos raros na população resultante. Zhu et al. (2000)

relatam que apenas 10% a 20% da diversidade genética dos parentes selvagens estão

presente no arroz cultivado, o que denota um severo gargalo genético durante a

domesticação. Um desses eventos mais importantes é a própria domesticação da espécie.

Vitte et al. (2004) e Tang et al. (2006) explicam que duas hipóteses

controversas entre si permeiam a origem do arroz. A hipótese de origem monofilética

sugere que o arroz selvagem comum (O. rufipogon) evoluiu para as subespécies indica e

japonica em diferentes locais e diferentes momentos. Por outro lado, a hipótese de origem

polifilética sugere que a diversificação das subespécies indica e japonica ocorreu antes de

serem domesticadas separadamente e, posteriormente, desenvolvidas em duas grandes

subespécies. O arroz asiático (Oryza sativa) teve sua origem no Sul e Sudeste da Ásia e

hoje é cultivado em todo o mundo. Já, o arroz africano (O. glaberrima) foi domesticado em

partes da África Ocidental, e continua a ser localmente importante em alguns sistemas

agrícolas nessas áreas.

Segundo Morishima (2001), o arroz tem dois pools gênicos primários

correspondentes a O. sativa e O. glaberrima, que contém as linhagens cultivadas e seus

aparentados silvestres e daninhos. Existem, ainda, três hipóteses relativas à origem da

diferenciação indica e japonica. Na primeira e mais aceita, o arroz da subespécie índica foi

desenvolvido do ancestral selvagem no sudoeste da China, e o da subespécie japônica se

diferenciou mais tarde a partir da subespécie indica (Ting, 1961, citado por Oka &

Morishima, 1997). A segunda hipótese assume que o arroz selvagem domesticado em

terras baixas tornou-se a subespécie indica, e aquele domesticado em terras altas tornou-se

a subespécie japonica (Wang et al., 1984, citados por Oka & Morishima, 1997). A terceira

hipótese e mais polêmica presume que as cultivares japonica se originaram na China a

partir de um arroz selvagem da subespécie japonica e as cultivares indica se originaram em

algum lugar fora da China, provavelmente na Índia (Chou, 1981, citado por Oka &

Morishima, 1997).

Page 21: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

2.2 MELHORAMENTO GENÉTICO DO ARROZ

A diversidade genética das culturas é a base para o nosso suprimento

alimentício e, portanto, a base para sobrevivência humana. Ela permite que agricultores e

fitomelhoristas adotem uma cultura em um meio heterogêneo e em constante mudança e

provê-la com resistência a insetos pragas e doenças. Grandes áreas plantadas com uma

única cultivar ou poucas cultivares com alta proximidade genética podem ser

especialmente vulneráveis a insetos pragas, doenças e intempéries (NRC, 1993).

O desenvolvimento de cultivares modernas de arroz depende da

disponibilidade contínua de variabilidade genética. A principal fonte dessa diversidade são

as cultivares tradicionais que vem sendo cultivadas e selecionadas a gerações por

rizicultores do mundo todo, em que todas as cultivares modernas podem ser rastreadas de

volta até as cultivares locais (landraces). Espécies selvagens também representam um pool

rico em diversidade, particularmente por sua habilidade em suportar insetos pragas e

doenças, tendo dado importante contribuição para o melhoramento de arroz (Soon et al.,

2008).

Além da diversidade de espécies que o homem cultiva, há também

variabilidade dentro de cada uma, seja de natureza genética ou ambiental. Durante o

processo de domesticação e cultivo, as espécies e os patógenos desenvolveram

mecanismos de sobrevivência mútua. A seleção natural, que favorece indivíduos com

genes de resistência e patógenos com genes de virulência, estabeleceu um processo de co-

evolução ocorrida em regiões geograficamente isoladas para o desenvolvimento de

cultivares resistentes, fornecendo material genético de importância para o melhoramento

de plantas (Borém & Miranda, 2005).

O aumento da produtividade do arroz foi possível graças ao melhoramento

genético de cultivares e práticas culturais intensivas, sendo que as metas básicas definidas

pelos melhoristas de arroz têm sido o potencial produtivo, alta qualidade de grãos e

tolerância a estresses bióticos e abióticos. No entanto, as prioridades de pesquisa têm

mudado e novos desafios surgiram para atender às necessidades dos agricultores e dos

Page 22: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

consumidores e para responder às mudanças socioeconômicas e culturais (Soon et al.,

2008).

Novas ferramentas biotecnológicas prometem aumentar a utilização de genes

de parentes selvagens para o melhoramento de arroz (Khush et al., 1994). A ampla adoção

de cultivares modernas de arroz, juntamente com insumos modernos, como fertilizantes,

pesticidas e desenvolvimento da irrigação contribuíram para um aumento do suprimento

alimentício (Hossain, 1995).

Todavia, essas mudanças também contribuíram para a perda de diversidade

genética, conhecida como erosão genética. Esta perda é reconhecida como um problema

desde a década de 60 e tem sido formalmente definida como a perda de genes de um pool

gênico, atribuída a perda de populações, causada por fatores como a adoção de cultivares

altamente produtivas, a maior integração do agricultor com o mercado e limpeza de terras,

urbanização e mudanças culturais. A redução da diversidade genética pode aumentar a

vulnerabilidade do arroz para surtos dos principais insetos pragas e doenças (Soon et al.,

2008).

Cada vez mais, busca-se no melhoramento genético de plantas, a manipulação

assistida por marcadores moleculares, a fim de se obter maior eficiência na transferência de

fatores genéticos. Para tanto, diversos marcadores moleculares ligados a características

agronômicas de interesse econômico têm sido desenvolvidos, permitindo uma seleção

indireta de características desejáveis em gerações segregantes precoces. Tal estratégia

reduz tempo e fontes de energia necessárias não só para desenvolver grandes populações

segregantes por várias gerações, mas também para estimar parâmetros usados na seleção

indireta (Caixeta et al., 2009).

2.3 BRUSONE DO ARROZ

O gênero Pyricularia foi estabelecido por Saccardo, baseado em

Trichothecium griseum Cooke e Digitaria sanguinalis L. Pyricularia grisea (Cooke)

Saccardo constituia uma espécie-tipo do gênero Pyricularia.

Page 23: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

O anamorfo do gênero Pyricularia pertence à classe dos Deuteromicetos e à

ordem Monoliales. O teleomorfo pertence à classe Ascomycetos, ordem Diaporthales, e

família Physoporellaceas. Os ascósporos são hialinos, fusiformes, com três septos e os

ascos unitunicados (Filippi & Prabhu, 2006).

Couch & Kohn (2002) reportam que Magnaporthe grisea contém duas

linhagens distintas, uma associada a Digitaria e outra a Oryza sativa e outras Poacea.

Apesar de não existirem diferenças morfológicas entre os isolados provenientes de

Digitaria e de O. sativa, puderam identificar esta diferenciação por meio do uso de

métodos moleculares. Assim, devido o nome M. grisea estar ligado a isolados de Digitaria,

o nome cientificamente correto para isolados de Oryza e outras Poáceas é M. oryzae.

O conceito de doenças de plantas é controverso, não havendo consenso quanto

à sua melhor definição, sendo, então, mais fácil partir do conceito de planta sadia

(Mizubuti & Maffia, 2009). Agrios (2005) caracteriza uma planta como saudável quando

esta pode exercer as suas funções fisiológicas com o melhor de seu potencial genético. A

planta se torna doente quando as células de toda a planta, ou de parte dela, apresentam

alguma interferência na capacidade de desenvolver suas funções, por ação de organismo

patogênico ou fator ambiental adverso.

A brusone pode ocorrer em todas as partes aéreas da planta, desde os estádios

iniciais de desenvolvimento até a fase final de produção de grãos. A disseminação do

inóculo inicial pode ocorrer através do vento, semente e restos culturais. Os sintomas

típicos iniciam-se por pequenos pontos de coloração castanha, que evoluem para manchas

elípticas, com extremidades agudas. Estas manchas crescem no sentido das nervuras,

apresentando centro cinza e bordos marrom-avermelhados, às vezes circundados por halo

amarelo. O centro é constituído por tecido necrosado sobre o qual são encontradas as

estruturas reprodutivas do patógeno. A dimensão do bordo está diretamente relacionada

com a resistência da cultivar e com as condições climáticas, sendo estreita ou inexistente

em cultivares muito susceptíveis. As manchas individualizadas podem coalescer e tomar

áreas significativas do limbo foliar; neste caso, aparecem grandes lesões necróticas, que se

estendem no sentido das nervuras. A redução na área foliar fotossintetizante tem reflexo

direto na produção de grãos (Bedendo & Prabhu, 2005).

Page 24: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Nas panículas, a doença pode atingir a raque, as ramificações e o nó basal. As

manchas encontradas na raque e nas ramificações são marrons e normalmente não

apresentam forma definida; os grãos originados destas ramificações são chochos. A

infecção do nó da base da panícula é conhecida como brusone do pescoço e tem papel

relevante na produção (Bedendo & Prabhu, 2005).

O ciclo infectivo da brusone inicia-se com a adesão do conídio em plantas de

arroz. O tubo germinativo, produzido pelos conídios, diferencia-se em uma estrutura

especializada de infecção, denominada apressório. O fungo utiliza a pressão gerada dentro

do apressório para penetrar a cutícula da planta e a parede celular. Após a penetração, o

peg de penetração diferencia-se em hifas infectivas primárias, não ramificadas que, por sua

vez, desenvolvem hifas invasivas lobadas e bulbosas, nas células da planta. Como um

patógeno hemibiotrófico, M. oryzae cresce inicialmente de forma biotrófica em tecidos

infectados (Kankanala et al., 2007). Eventualmente, desenvolvem-se lesões nas plantas de

arroz e o fungo produz mais conídios para reiniciar o ciclo de infecção (Ding et al., 2009).

As lesões nas folhas de arroz, visíveis 72 horas após a inoculação, crescem em tamanho e

número até coalescerem. Em 144 horas e sob condições de alta umidade, começa a

produzir conídios em abundância, os quais são liberados e dispersos pelo vento,

fornecendo o inóculo para um ciclo de infecção subseqüente (Filippi & Prabhu, 2006)

Todas as regiões em que se produz arroz são afetadas pela brusone (Khush &

Jena, 2009). Os prejuízos causados pela brusone são variáveis, dependendo do grau de

resistência da cultivar, da época de incidência, das práticas culturais e das condições

climáticas (Prabhu et al., 2003). As perdas causadas por brusone nas folhas são indiretas e

afetam a fotossíntese e a respiração. Nas panículas, os danos são diretos, em virtude de seu

efeito em diferentes componentes de produção (Bastiaans et al., 1994).

Durante os últimos 30 anos, ocorreram três surtos de brusone na China, nos

anos de 1982-1985, 1992-1994 e 2001-2005. A área média infestada por brusone foi

superior a 3,8 milhões de hectares em 1982-1985, com perdas de diversos milhões de

toneladas (Sun et al., 1999). Em 1993, as perdas de produção foram de 1,1 milhão de

tonelada apenas na parte sul da China. Nos anos recentes, 5,7 milhões de hectares de arroz

foram afetados pela doença (Khush & Jena, 2009).

Page 25: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

A brusone é uma grande restrição para o cultivo do arroz em certas regiões

agroecológicas da Índia. A região Oriental da Índia apresenta a maior ocorrência de

brusone, seguida pelas regiões norte e sul. As perdas podem chegar à 50% em condições

de sequeiro (Widawsky & O’Toole, 1990). Equipes multidisciplinares de cientistas

supervisionam a cultura nos 125 distritos do País. Cerca de 15% dos distritos

supervisionados durante 2001-2005 tiveram severa incidência da doença (Khush & Jena,

2009).

A temperatura amena do Japão, Coréia do Sul e Indonésia é altamente

favorável à multiplicação e disseminação da brusone durante a época de crescimento do

arroz. Apesar de um enfático melhoramento para resistência à doença no Japão, desde o

início do último século, e diversos genes de resistência terem sido introduzidos em

cultivares japonesas, frequentes suplantações da resistência resultam em perdas

significantes, variando de 20% a 100% (Khush & Jena, 2009). Na Coréia do Sul, a brusone

causa perdas significativas todo ano. Durante a epidemia de 1984-1985, quase 20% da área

de arroz foi seriamente danificada (Khush & Jena, 2009).

Na Indonésia, 1,1 milhão de hectare de arroz são plantados anualmente e

ameaçados pela ocorrência de brusone. Cultivares de arroz resistentes de terras altas

tornam-se susceptíveis dentro de um ou dois anos de cultivo, podendo atingir perdas de

100% em certos anos (Sobrizal et al., 2007).

O controle de doenças deve ser feito adotando-se medidas de manejo

combinando diversos métodos, como controle químico e práticas culturais e resistência

genética, sendo, porém, geralmente adotados de maneira isolada para o controle da

brusone. A resistência genética das cultivares é o principal componente do manejo

integrado da brusone. A adoção de práticas isoladas de controle de doenças tem se

mostrado ineficiente, como o uso indiscriminado de fungicidas, que pode reduzir a

atividade de antagonistas na filosfera, enquanto outros a aumentam (Prabhu & Filipi,

2006a).

O controle da brusone através de produtos químicos ou fungicidas é uma

alternativa que deve ser evitada sob risco de inviabilizar a produção devido a altos custos.

A obtenção da resistência genética que possa associar-se às técnicas de manejo integrado

Page 26: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

da cultura é um dos principais objetivos de programas de melhoramento do arroz, pois

visam à redução das perdas de produção provocadas pela doença. Estas técnicas de

manejo, por sua vez, são dependentes umas das outras e de grande importância no controle

de doenças, pois são medidas economicamente mais viáveis e ambientalmente mais

seguras, principalmente quando comparadas com o uso apenas do controle químico (Silva,

1993).

2.4 RESISTÊNCIA GENÉTICA A BRUSONE

De acordo com Bueno et al. (2006), a resistência aos agentes fitopatogênicos

assume papel muito importante ao se considerar que, geralmente, o número de cultivares

aprovadas e disponíveis aos agricultores é relativamente pequeno. Algumas doenças de

graves conseqüências somente podem ser controladas pelo uso de cultivares resistentes,

como por exemplo, as viroses da cana-de-açúcar, do feijão e de outras culturas, várias

doenças fúngicas e bacterioses.

É de grande importância o conhecimento das bases genéticas da reação de

resistência à brusone das cultivares de arroz, como herdabilidade, número de genes e do

tipo de ação gênica; para a seleção de genótipos resistentes, pois a identificação do número

e da combinação desses alelos está intimamente relacionada com a patogenicidade da

população de P. grisea obtida pela adaptação do fungo às novas cultivares. Além disso, o

conhecimento da ação gênica da reação de resistência à brusone possibilita um

planejamento rigoroso para a escolha do germoplasma e nos critérios para seleção,

estabelecendo rotatividade dos genes de resistência (Nunes et al., 2007). Um dos métodos

utilizados para a transferência dos genes de resistência para cultivares comerciais através

de etapas de retrocruzamentos e seleção, tendo como pai recorrente a cultivar comercial

(Bueno et al., 2006).

De forma geral, define-se resistência como sendo uma resposta do hospedeiro

ao patógeno, durante o processo de colonização intracelular, ocorrendo mecanismos de

defesa pré-penetração (preexistentes) e pós-penetração (induzidos). Russell (1978) define

resistência como sendo qualquer característica herdada do hospedeiro que reduz o efeito do

Page 27: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

patógeno. Esta é uma boa definição, pois não restringe o termo a um efeito inibitório direto

do hospedeiro no desenvolvimento ou na atividade do patógeno, indicando apenas a

redução da severidade da doença. Portanto, todas as alternativas capazes de diminuir a

probabilidade de determinada doença se manifestar na planta estão incluídas nesta

definição. Prabhu & Filipi, 2006b explicam que a distinção entre resistência e imunidade é

teoricamente válida, porém tem pouca significância no campo.

De acordo com a literatura existem diferentes tipos de resistência,

classificados de acordo com a sua natureza genética. Van der Plank (1963) distinguiu dois

tipos de resistência em termos epidemiológicos: vertical e horizontal. A resistência vertical

é, geralmente, monogênica, atuando no controle do inóculo inicial, na taxa de aumento da

doença ou em ambos. Também conhecida por resistência específica, qualitativa,

monogênica, resistência completa, entre outros, caracteriza-se por apresentar efetividade

contra alguns patótipos (raças fisiológicas) do patógeno, mas não contra todos. Seu efeito

epidemiológico consiste no atraso no início da epidemia, devido à quantidade de inóculo

inicial capaz de colonizar a planta ter sido reduzido. Todavia, a taxa de infecção de plantas

que apresentam essa resistência é rápida, logo após o início da doença na planta (Borém &

Miranda, 2005; Prabhu & Filippi, 2006b).

A resistência horizontal, por outro lado, é poligênica, na maioria dos casos,

reduzindo o aumento da doença. Existem outros tipos de resistência à brusone, como

resistência relacionada com órgãos e tecidos, resistências não-hospedeira, induzida e

fisiológica (Prabhu & Filippi, 2006b).

No binômio M. oryzae e O. sativa, a interação especializada entre o patótipo

(raça) e a cultivar de arroz é explicada pela teoria de Flor (1942), também conhecida como

teoria gene-a-gene. Esta teoria pressupõe uma relação um-a-um entre genes de ataque

(patógeno) e defesa (hospedeiro). Ou seja, para cada gene que condiciona uma reação de

resistência no hospedeiro existe um gene complementar no patógeno que condiciona a

avirulência. Portanto, o maior interesse é a busca por genótipos de arroz que apresentem

estes genes de resistências que sejam complementares ao maior número possível de genes

de avirulência, presentes no patógeno, resultando numa relação de resistência da planta ao

patógeno.

Page 28: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Quando o gene de resistência vertical está presente na população do

hospedeiro, impedindo que determinado patótipo colonize e cause doença em seu

hospedeiro, este determinado patótipo pode evoluir para um novo patótipo capaz de

superar o gene de resistência, mantendo sua sobrevivência através de seleção direcional.

Porém, quando o gene de resistência vertical está ausente no hospedeiro, uma pressão de

seleção negativa será exercida contra a porção não patogênica de população do patógeno, e

o gene de virulência correspondente no patógeno torna-se desnecessário (Van der Plank,

1963).

Estudos sobre herança da resistência a doenças foram primeiramente

reportados por Sasaki (1922). Até 1960, a herança foi estudada sem conhecimento

suficiente sobre a especialização patogênica do microorgansimo, dificultando o avanço no

conhecimento sobre o tema. Esta lacuna começou a ser preenchida quando estudos

sistemáticos foram conduzidos por Goto, que estabeleceu o sistema diferencial para raças

de brusone, no Japão (Kush & Jena, 2009). McCouch et al. (1994) reportam que a herança

da resistência à brusone pode ser conferida por um a três pares de genes independentes,

sendo que a resistência é dominante na maioria dos casos.

Kiyosawa e colaboradores utilizaram sete estirpes japonesas de brusone para

investigar a herança da resistência e identificaram 13 genes de resistência (Kiyosawa,

1981), designados inicialmente como Pi-a, Pi-i, Pi-ks, Pi-k, Pi-z, Pi-ta, Pi-ta2, Pi-zt, Pi-kp,

Pi-km, Pi-kn, Pi-b e Pi-t. (Kush & Jena, 2009).

Durante os últimos 25 anos grandes avanços têm sido feitos no estudo da

genética da resistência a brusone. Seguindo análises genéticas convencionais de doadores

de resistência identificados, disponibilidade de isolados puros do patógeno causador da

brusone e uso de avançadas técnicas de análise molecular, cerca de sessenta genes para

resistência foram identificados (Kush & Jena, 2009). Avanços em genética molecular e

conclusão da sequência do genoma do arroz pavimentaram o caminho para clonagem e

caracterização de sete grandes genes para resistência a brusone, entre eles: Pib (Wang et

al., 1999), Pita (Bryan et al., 2000), Pi9 (Qu et al., 2006). As características de importância

agronômica em interação com o ambiente se constituem em alguns dos maiores desafios

no melhoramento de plantas, limitando o progresso genético no desenvolvimento de novas

Page 29: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

cultivares. Estes desafios vêm sendo superados com as novas tecnologias desenvolvidas

com a biotecnologia, como por exemplo, a identificação e seleção baseada diretamente no

genótipo do indivíduo, resultando em maior progresso genético. Os marcadores

moleculares permitem a análise dos indivíduos com base em seu DNA. A biologia

molecular, em particular os marcadores moleculares, associados às informações de

seqüenciamento e de mapeamento de genomas geram informações importantes sobre o

genótipo dos indivíduos (Borém, 2009), reduzindo o tempo entre a geração de informação

e sua utilização em escala comercial.

2.5 MARCADORES MOLECULARES

Vários marcadores moleculares de DNA estão hoje disponíveis, diferenciando

entre si quanto à habilidade em detectar polimorfismo, ao custo de aplicação, à facilidade

de uso e à consistência de resultados. Eles podem ser aplicados nas fases de pré-

melhoramento, melhoramento e pós-melhoramento de plantas, sendo utilizados em estudos

de diversidade genética, fingerprinting, análises de pureza genética de sementes,

melhoramento assistido, mapeamento genético, isolamento de genes, etc. (Borém, 2009).

Os genomas eucariotos são densamente povoados por sequências simples

repetidas, as quais consistem de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem, sendo

denominadas de regiões microssatélites, ou SSR (Simple Sequence Repeats), ou ainda STR

(Short Tandem Repeats). Existem quatro possíveis repetições de microssatélites, sendo: (a)

repetições perfeitas, quando não apresentam nenhuma interrupção; (b) repetições

imperfeitas, quando são interrompidas por bases não repetidas; (c) repetições compostas,

quando duas ou mais repetições de microssatélites estão dispostas adjacentes; e (d)

repetições simples, quando é formado por apenas uma repetição, sendo que, as repetições

simples e compostas podem ser perfeitas ou imperfeitas (Caixeta et al., 2009).

Os marcadores microssatélites apresentam alta reprodutibilidade, simplicidade

técnica e apresentam co-dominância, permitindo diferenciar indivíduos heterozigotos de

homozigotos. Além disso, aparentam ter distribuição freqüente e aleatória, permitindo

ampla cobertura do genoma. Outro fator positivo é a possibilidade de alguns marcadores

Page 30: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

microssatélites desenvolvidos para uma espécie serem utilizados em outra espécie, como

diversos trabalhos na literatura demonstram, devido às regiões conservadas. Todavia, estes

marcadores necessitam serem isolados e desenvolvidos especificamente para cada espécie,

não sendo possível o desenho de primers universais. Além disso, o desenvolvimento destes

marcadores envolve um processo demorado, trabalhos e oneroso (Borém, 2009).

Com o advento dos marcadores moleculares vários genes de resistência a

brusone foram localizados em cromossomos específicos. Por exemplo, os genes Pi2 e Pi4

foram localizados no cromossomo 6 e 12, respectivamente, via ligação com marcadores

RFLP (Yu et al., 1991). Linhas quase isogênicas (NILs) foram utilizadas para mapeamento

genético pela dissecção de genótipos complexos e avaliação dos efeitos de genes

individuais em um background genético comum (Kush & Jena, 2009).

Uma população para mapeamento desenvolvida no IRRI, proveniente do

cruzamento entre IR64 e Azucena, tem sido utilizada ao redor do mundo para mapeamento

de genes para resistência a brusone. Linhagens recombinantes (RILs) têm sido utilizadas

para mapeamento de quatro grandes QTLs para a resistência a brusone, via ligação a

marcadores RFLP (Tabien et al., 2000). Marcadores microssatélites (SSR) têm sido

utilizados para mapeamento mais fino do gene Pikh, que confere resistência as raças de

brusone da região do Himalaia no Noroeste da Índia (Sharma et al., 2005). Marcadores de

polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP) têm sido empregados para mapeamento

fino do locus Piz (Hayashi et al., 2004).

Desde 1922, avanços consideráveis foram obtidos ao longo dos anos,

principalmente devido à ação conjunta entre fitopatologistas e melhoristas e com o

crescente aumento na utilização das ferramentas moleculares. Porém, o maior empecilho

existente para a obtenção de uma cultivar resistente e produtiva é a alta variabilidade do

patógeno. Nem mesmo com a utilização de técnicas como piramidação de genes,

introgressão de genes via retrocruzamento ou marcadores moleculares será possível a

obtenção de uma única cultivar que apresente resistência a todas as raças de M. oryzae. A

solução, talvez, seja determinar a população do patógeno existente em cada macro e/ou

região para assim obter e recomendar cultivar(es) que apresente(m) alta produtividade e

Page 31: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

resistência a todas, ou quase todas, as raças do patógeno existentes em cada região de

recomendação.

2.6 ESTRUTURA DAS POPULAÇÕES DE BRUSONE

Stackman et al. (1962) definiram raça fisiológica como um biótipo ou grupo de

bióticos dentro de uma espécie ou táxon, que podem ser diferenciados com razoável

facilidade de outros biótipos ou grupos de biótipos, por características fisiológicas,

inclusive patogenicidade. O termo patótipo é definido como uma população na qual todos

os indivíduos têm uma determinada característica comum em patossistema ou parasitismo.

Apesar do termo também ser correto e utilizado como sinônimo de raça, de acordo com

Van der Plank (1975), raça é o termo mais utilizado, e a mudança de termos cria confusão,

não sendo desejável. Todavia, é oportuna a utilização do termo raça patogênica em vez de

raça fisiológica, ao diferenciar raças geográficas ou climáticas (Prabhu & Filippi, 2006a).

A estrutura e diversidade das populações de Magnaporthe oryzae em arroz, que

por muito anos foi estudada baseando-se na frequência de patótipos, durante os últimos

vinte anos, vem sendo complementada com estudos baseados na utilização de marcadores

RFLP (Roumen et al., 1997), rep-PCR (George et al., 1998), RAPD (Ross et al., 1996) ou

AFLP. A estrutura genética de populações de M. oryzae patogênicas a arroz claramente

mostraram que reprodução clonal é a regra na maioria das áreas plantas com arroz (Viji et

al., 2000).

Diversas cultivares melhoradas e resistentes à doença são lançadas, porém,

dentro de poucos anos de utilização sua resistência é “quebrada”, devido à alta

adaptabilidade do patógeno. A suplantação da resistência é um dos aspectos mais

marcantes desta doença e tem sido bem documentada (Koizumi, 2007).

Um dos objetivos da análise genética é conhecer profundamente uma

determinada propriedade biológica (seja esta cor da flor, resistência a doença, etc.),

descobrindo o conjunto de genes isolados que a afetam. Um método importante para

identificar o número de genes envolvidos na característica é por meio das proporções

Page 32: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

fenotípicas de segregação, as quais são baseadas na segregação definida por Gregor

Mendel (Griffiths et al., 2008).

O estudo da herança genética é fundamental, também, para determinar se o

caráter é qualitativo ou quantitativo e o modo de ação predominante dos genes envolvidos

com a resistência. A determinação dos parâmetros genéticos que governam a resistência

permite direcionar os trabalhos de introdução de resistência, em germoplasmas suscetíveis,

e possibilita maiores ganhos com a seleção, nos métodos a serem utilizados. O estudo do

modo de herança de um caráter permite melhor direcionar e maximizar a exploração da

variabilidade genética (Silva et al., 2001).

2.7 EXPRESSÃO DA RESISTÊNCIA E MECANISMOS DE DEFESA

DA PLANTA

Agrios (2005) explica que os vários genes de resistência (R) de plantas

apresentam similaridades estruturais, independente do tipo de patógeno (bactéria, fungo ou

vírus) a que ele confere resistência. Aparentemente, a maioria, se não todos, os genes R

existem como aglomerados de famílias de genes e são subdivididos em cinco classes,

dependendo da sua estrutura e função.

Superar o mecanismo de defesa da planta é o atributo crucial para todos os

patógenos. Para tal, os microrganismos patogênicos produzem e secretam para o meio

extracelular polissacarídeos, toxinas e enzimas. Estas substâncias poderão atuar de forma

direta ou indireta, impedindo a função da membrana plasmática ou outras atividades

celulares. Por outro lado, as plantas resistentes produzem compostos tóxicos como fenóis,

glicosídeos e fitoalexinas e proteínas relacionadas a patogênese como mecanismos

químicos de defesa. A produção dos compostos citados acima envolve a percepção da

presença do microrganismo, a transmissão dessa informação para as células infectadas e

para os tecidos adjacentes e a indução de um grande número de alterações bioquímicas

intracelulares, que agem cooperativa e coordenadamente e que culminam com o acúmulo

desses metabólitos de defesa e com restrição da invasão do patógeno (Braga, 2008).

Page 33: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

(Prabhu & Filippi, 2006c). Esta é uma aplicação da teoria gene a gene de Flor (Leite &

Pascholati, 1995; Pascholati & Leite, 1995; Prabhu & Filippi, 2006c).

Proteínas relacionadas a patogênese, como β-1-3-glucanases e quitinases,

capazes de hidrolisar paredes celulares de fungos são expressas constitutivamente, mas

podem ter sua atividade aumentada durante o processo de infecção por patógenos e sua

ação, isoladamente ou em conjunto, têm sido associada a decréscimos da invasão por

fungos, devido à destruição das hifas invasoras (Braga, 2008).

Braga (2008) explica que a taxa de produção β-1-3-glucanases e quitinases

difere significativamente em plantas resistentes e susceptíveis a patógenos. Em soja, a ação

destas enzimas, além de deter o crescimento de patógenos, determina a liberação

simultânea de eliciadores de fitoalexinas. Em tecidos de arroz, existem evidências de que

quitinases têm papel similar ao das β-1-3-glucanases na liberação de fragmentos de

quitosano.

Page 34: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA À

BRUSONE (Magnaporthe oryzae) NAS CULTIVARES DE ARROZ

IRRIGADO CICA-8 E METICA-1

O experimento foi conduzido sob condições controladas de casa de vegetação e

laboratório, no Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão – CNPAF/Embrapa, em

Santo Antônio de Goiás, GO, no período de janeiro/2010 a dezembro/2010.

Foram utilizadas duas cultivares de arroz irrigado como genitores: Metica-1 e

Cica-8. Rangel et al. (1996) descrevem a genealogia destas cultivares. A seleção baseou-se

nos estudos anteriores realizados com indução de resistência (Filippi et al., 2007), no

histórico destas cultivares e na produtividade de arroz irrigado em condições tropicais.

Ambas as cultivares foram utilizadas ora como genitor masculino, ora como feminino, das

populações F1, F2 e retrocruzamentos com ambos os genitores.

3.1.1 Obtenção das populações segregantes

As cultivares Cica-8 e Metica-1 foram plantadas semanalmente, durante dois

meses, em vasos plásticos (Figura 1) contendo 8 kg de solo adubado com 5 g de NPK 5-

30-15, 2 g de sulfato de amônia, 1 g de sulfato de zinco e 3 g de sulfato de amônia, no 15º

dia pós-plantio. Os vasos foram mantidos em condições controladas de casa de vegetação

até o final do ciclo. No mesmo local foi conduzida a hibridização entre os genitores, a qual

se iniciou com emasculação seguido de polinização e amadurecimento.

Page 35: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 1. Plantio das cultivares Metica-1 e Cica-8 para obtenção das populações F1, F2,

RC1 e RC2.

Para a obtenção das sementes de população F1 (Figura 2), oitenta dias após o

plantio, retirou-se as anteras das espiguetas das panículas do genitor feminino, com o

auxílio de um emasculador a vácuo. Em seguida, as panículas emasculadas foram

protegidas com sacos de papel, para evitar contaminação por pólen indesejado. As

panículas do genitor masculino, e que já estivessem liberando pólen abundantemente,

foram destacadas e imersas em tubo suspenso ao lado dos vasos contendo as plantas

genitoras femininas para posterior polinização. As panículas recém polinizadas foram,

então, novamente cobertas por saco de papel, de acordo com metodologia descrita por

Coffman & Herrera (1980) e, posteriormente adaptada e descrita por Neves & Taillebois

(1990). Para obtenção da população F2 foram plantadas sementes da população F1, cujos

Page 36: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

indivíduos foram conduzidos até o final do ciclo, permitindo que ocorresse naturalmente a

autofecundação.

Figura 2. Sementes de arroz da população F1 obtidas por meio do cruzamento entre as

cultivares Metica-1 e Cica-8.

Para a obtenção das populações de RC1 e RC2, sementes de F1 foram

hibridizados ora com o genitor susceptível ao isolado utilizado (RC1:1), ora com o genitor

doador de resistência (RC1:2). Foram obtidas as populações: F1 – 600 sementes; F2 – 1400

sementes; RC1 – 400 sementes e RC2 – 400 sementes.

3.1.2 Identificação do número de alelos de resistência

As sementes foram expostas a uma temperatura de 45ºC por 72 horas em estufa

sem circulação forçada para superação de dormência. Posteriormente foram esterilizadas

utilizando-se álcool 70% (um minuto), solução de hipoclorito de sódio 2% (um minuto) e

Page 37: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

água destilada (um minuto) para eliminar qualquer contaminação que pudesse servir de

inóculo inicial.

O plantio foi realizado em 12 bandejas plásticas contendo 5 kg de solo adubado

com 5 g de NPK 5-30-15, 2 g de sulfato de amônia e 1 g de sulfato de zinco. A densidade

de semeadura foi de quinze sementes/linha, com posterior desbaste para dez plantas/linha,

totalizando trinta plantas do genitor Metica-1, trinta plantas do genitor Cica-8, vinte plantas

da geração F1, duzentas plantas da geração F2, cem plantas de cada retrocruzamento, para

cada isolado utilizado. Aos 21 dias após o plantio, as plantas foram pulverizadas com

solução de inóculo de P. oryzae (Figura 3).

Figura 3. Semeio das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2.

3.1.3 Inoculação

Foram utilizados os isolados 1049, obtido de cultura monospórica isolada de

lesões esporulativas da cultivar Metica-1, pertencente ao patótipo IB-1. De estudos

Page 38: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

anteriores, sabe-se que este isolado é compatível com a cultivar Metica-1 e incompatível

com a cultivar Cica-8; e 435, obtido de cultura monospórica isolada de lesões esporulativas

da cultivar Cica-8, pertencente ao patótipo IB-9. De estudos anteriores, sabe-se que este

isolado é compatível com a cultivar Cica-8 e incompatível com a cultivar Metica-1. Ambos

isolados são componentes da micoteca do Centro Nacional de Pesquisa Arroz e Feijão –

CNPAF/Embrapa.

Discos de micélio das colônias, previamente multiplicadas em meio de cultura

BDA (batata-dextrose-ágar), foram transferidos para placas de Petri contendo meio de

cultura Aveia (aveia-dextrose-ágar) e incubados em câmara de crescimento por dez dias, à

27ºC, sob regime de luz contínuo. No décimo dia, com o objetivo de estimular a

conidiogênese, o micélio aéreo de cada colônia foi removido utilizando-se bastão de vidro

estéril, em condições assépticas. As placas, contendo as colônias formando conídio,

permaneceram durante 48 horas sob altas condições de umidade e luz contínua.

Apenas foram selecionadas as placas que não apresentaram variação

morfológica para o preparo da solução de inóculo. A solução de inóculo foi obtida

adicionando-se água destilada esterilizada nas placas previamente selecionadas,

procedendo-se a remoção dos conídios, com auxílio de pincel estéril, e posterior filtragem

da solução. A suspensão obtida foi, então, ajustada para a concentração de 3.105

conídios.mL-1, com auxílio de câmara de Neubauer e microscópio óptico NIKON Eclipse

55i.

Em delineamento experimental inteiramente casualizado, as bandejas,

contendo plantas com 21 dias de idade (estádio de 3ª folha completamente formada), foram

dispostas em casa de vegetação, agrupadas três a três, aleatoriamente, em gaiolas. Com o

auxílio de um atomizador DeVillbis, conectado a um compressor com pressão ajustada

para 1,0 Lb.pol-2, cada gaiola foi pulverizada com 45 mL da suspensão conidial (15 mL por

bandeja) até o ponto de escorrimento. Posteriormente, foram incubadas em câmara de

orvalho por 24 horas, com temperatura entre 19ºC e 21ºC, seguidos de sete dias com

temperatura média de 28ºC e alta umidade (>80%) (Figura 4).

Page 39: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

3.1.4 Identificação dos indivíduos resistentes

Decorridos sete dias após a inoculação foi realizada a avaliação fenotípica

quanto a resistência à brusone nas folhas, utilizando-se escala visual de notas que varia de

zero a nove, em que, notas variando de zero a três indicam reações incompatíveis

(resistência específica ou vertical – R), e de cinco a nove reações compatíveis

(suscetibilidade – S) (IRRI, 1989). As plantas foram coletadas individualmente e

armazenadas em freezer (-20ºC) para posterior aplicação de métodos moleculares.

Os tipos de lesões são definidos baseados em uma escala de medição de

brusone nas folhas, em casa de vegetação, em que a nota 0 indica ausência de lesão; a nota

1 caracteriza-se por pequenas pontuações marrons, características da reação de

hipersensibilidade. As lesões tipo 3 são pequenas, redondas a ovais, necróticas, de cor

marrom. Lesões tipo 5 são elípticas, esporulativas, com margem marrom. As lesões do tipo

7 apresentam forma irregular, sem margens distintas. Lesões tipo 9 apresentam coloração

branca a azulada, sem margem distinta, coalescendo rapidamente (Figura 5).

A B

C D

Page 40: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 4. Inoculação das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1, F2, RC1 e RC2 em casa

de vegetação. A e B: Disposição das bandejas na casa de vegetação; C:

Compressor e D: Atomizador DeVillbis.

3.1.5 Validação experimental

A frequência de cada sintoma (R ou S) foi calculada e aplicado o teste de qui-

quadrado, como indicado por Snedecor (1970), feita a correção de Yates, como indicado

por Strickberger (1971). Os dados foram comparados com as segregações propostas por

Mendel e confrontadas com a hipótese do trabalho, sugerindo o número de alelos

envolvidos na expressão da resistência qualitativa de cada genótipo.

Page 41: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

A B

C D

E F

Page 42: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 5. Tipos de lesões de brusone em arroz. A: Lesão tipo 0; B: Lesão tipo 1; C: Lesão

tipo 3; D: Lesão tipo 5; E: Lesão tipo 7 e F: Lesão tipo 9.

3.2 MÉTODOS MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA

HERANÇA DE GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS

CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO

Para identificação de marcadores microssatélites ligados ao gene de resistência,

foram utilizados os genitores Metica-1 e Cica-8 e as populações F1, F2 resistente e

susceptível. Foi utilizado o método CTAB, descrito por Doyle & Doyle, (1987) para

extração do DNA (Deoxyribonucleic Acid) os produtos da PCR (Polymerase Chain

Reaction) foram separados em gel de poliacrilamida desnaturante (6%).

3.2.1 Extração de DNA genômico

Foram maceradas, em nitrogênio líquido, 200 mg de folhas de cada planta no

estádio de 3ª folha, previamente armazenadas em freezer a -20ºC, com auxílio de amofariz

e pistilo previamente esterilizados. O macerado foi acondicionado em microtubos de 1,5

mL e posterior adição de 700 µL de tampão de extração (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20

mM EDTA; 1,4 M NaCl; 2% CTAB; 1% polivinil e 2% de β-mercaptoetanol), seguido por

A B

Page 43: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

incubação em banho-maria a 65ºC por uma hora. As proteínas foram removidas utilizando-

se como solvente uma solução de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Os ácidos

nucléicos foram então precipitados com isopropanol gelado e lavados duas vezes com

etanol 70%, uma vez com etanol P.A. (98%), secados em temperatura ambiente e então

ressuspendidos em tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) contendo 10

mg/mL de RNAase e incubados em banho-maria a 37ºC por 30 minutos.

A concentração de DNA foi ajustada para 10 ng.µL-1, tendo sido estimada

visualmente utilizando-se como padrão DNA lambda, nas concentrações de 50 ng.µL-1,

100 ng.µL-1 e 200 ng.µL-1.

3.2.2 Marcadores microssatélites

Foram selecionados marcadores microssatélites descritos na literatura

relacionados à expressão da resistência de arroz a brusone, descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Relação dos primers microssatélites selecionados.

Marcador Tamanho esperado (bp) Gene Referência9871.T7E2b 642 Pi5 Suh et al. (2009)yca72 635 Pia Suh et al. (2009)RM224 122 Pi1 Jia & Moldenhauer (2010)OSR32 247 Pita Li et al. (2008)RM7102 170 Pi41 Yang et al. (2009)RM6836 178 Piz Fjellstrom et al. (2006)pBA14 480 Pi9 Liu et al. (2002)RM144 254 Piks Jia & Moldenhauer (2010)RM28130 176 Pi40 Yang et al. (2009)RM1261 167 Pi41 Yang et al. (2009)JJ817 1450 Pi5 Suh et al. (2009)

Cada reação continha DNA genômico, tampão de reação 10 X (100 mM Tris-

HCl, pH 8,8 e 500 mM KCl), MgCl2 (25 mM), dNTP (2 mM de cada dATP, dGTP, dCTP e

dTTP), primer, Taq DNA polimerase, água destilada autoclavada para completar o volume

Page 44: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

final de 40 µL da reação e sobreposição de uma gota de óleo mineral para prevenir

evaporação, como descrito na Tabela 2.

Tabela 2. Reações de PCR para cada marcador microssatélite utilizado.

MarcadorDNA (ng)

Tampão (µl)

MgCl2

(µl)dNTP (µl)

Primer Forward

(µM)

Primer Reverse

(µM)

Taq DNA Pol. (U)

9871.T7E2b 80 4 3 4 0,5 0,5 2yca72 80 4 3 4 0,5 0,5 2RM224 100 4 6 4 0,5 0,5 2OSR32 80 4 3 4 0,5 0,5 4RM7102 40 4 4 4 0,5 0,5 2RM6836 75 4 3 4 0,5 0,5 1pBA14 80 4 3 5 0,5 0,5 1RM144 100 4 3 4 0,5 0,5 2RM28130 80 4 3 4 0,5 0,5 2RM1261 80 4 3 4 0,5 0,5 2JJ817 80 4 3 4 0,5 0,5 2

A amplificação enzimática foi realizada em termociclador ESCO Swift

MaxPro, com programa de amplificação específico para cada marcador. Os programas

utilizados estão descritos na Tabela 3. Os produtos de amplificação foram separados em

gel de poliacrilamida desnaturante 6% As imagens foram obtidas utilizando-se aparelho de

escâner HP Scanjet 3770.

Para a identificação de marcadores ligados aos alelos de resistência ao isolado

1049, nas populações de estudo, procedeu-se três etapas de seleção/avaliação. Na primeira

etapa, 11 primers microssatélites, (Tabela 1) foram testados e apenas os que foram capazes

de detectar polimorfismo entre os genitores foram selecionados para a etapa seguinte.

Tabela 3. Programações dos termocicladores para cada primer microssatélite utilizado.

Marcador Programação

9871.T7E2b4 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC

e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC

yca724 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC

e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC

Page 45: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

RM2241 minuto a 94 ºC, 40 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC e

30 segundos a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC

OSR325 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 50 segundos a 55 ºC e 1

minuto a 72 ºC e 5 minutos a 72 ºC

RM71023 minutos a 95 ºC, 29 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC

e 30 segundos a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC

RM68363 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC

e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC

pBA144 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC

e 1 minuto a 72 ºC e 5 minutos a 72 ºC

RM1445 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 55 ºC e 2

minutos a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC

RM281303 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC

e 1 minuto a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC

RM12615 minutos a 94 ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 55 ºC e 2

minutos a 72 ºC e 7 minutos a 72 ºC

JJ8174 minutos a 95 ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC

e 1 minuto a 72 ºC e 10 minutos a 72 ºC

Na segunda etapa, testaram-se os bulks das populações F1, F2 resistente e F2

susceptível, os quais foram compostos de 10 ng de DNA de sete indivíduos de cada

população. Portanto, foram preparados bulks resistente e suscetível (Araújo, 2001). Apenas

os primers capazes de amplificar o mesmo padrão de polimorfismo nos genitores e nos

bulks foram selecionados para a terceira e última etapa.

Nesta última etapa de seleção, os primers selecionados acima foram utilizados

para amplificação em reações que continham o DNA com cada indivíduo componente dos

bulks descritos acima. Portanto, cada primer selecionado participou das seguintes reações

de amplificação: a) genitor resistente (1 reação); b) genitor suscetível (1 reação); c) sete

indivíduos da população F1 (sete reações); d) sete indivíduos da população F2 resistente e

e) sete indivíduos da população F2 suscetível (sete reações).

3.2.3 Análise de ligação

Para estimar a distância do marcador microssatélite foram avaliados 204

indivíduos da população F2. A distância foi estimada utilizando o software MAP-MAKER

Page 46: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

III, com um lod score mínimo de 3.0 e a função Kosambi de mapeamento (Lander et al.,

1987).

3.3 CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES

DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ

IRRIGADO

3.3.1 Plantio da população de estudo

Foi empregada a mesma metodologia descrita no item 3.1.2. Foram utilizados

nesse estudo os genitores Metica-1 e Cica-8 e populações F2. A densidade de semeadura

foi de oito sementes/linha, sendo feito posterior desbaste para cinco plantas/linha,

totalizando duzentas plantas para cada isolado utilizado.

3.3.2 Inoculação

Foi empregada a mesma metodologia descrita no item 3.1.3.

3.3.3 Coleta das amostras

Foram realizadas seis coletas durante uma semana, no mesmo horário, sendo

uma coleta/dia, composta de 24 plantas escolhidas ao acaso e identificadas. Uma folha de

cada planta selecionada, envolta em papel alumínio previamente identificado (mesmo

número de sua planta de origem) e mantida a 4ºC até posteriormente armazenagem em

freezer a -20ºC. As plantas foram identificadas, pois no momento em que se iniciou a

coleta não se conhecia a reação das mesmas. A coleta 1 foi realizada antes da inoculação;

as coletas 2, 3, 4, 5 e 6 foram realizadas com 24h, 48h, 72h, 96h e 120h após a inoculação,

respectivamente, tendo sido realizadas no final do período vespertino.

Page 47: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

3.3.4 Identificação dos indivíduos resistentes

Foi empregada a mesma metodologia descrita no item 3.1.4.

3.3.5 Construção dos bulks e extração protéica

Com os dados da avaliação fenotípica, puderam-se agrupar, por dia de coleta,

as amostras que apresentaram reação semelhante (resistência ou susceptibilidade) para

construção dos bulks resistentes e susceptíveis, obtendo-se, assim, para cada dia de coleta e

para cada isolado, quatro bulks, totalizando 24 bulks por isolado.

Para a extração de proteínas totais as amostras de cada bulk foram

acondicionadas em almofariz e maceradas em nitrogênico líquido com auxílio de pistilo,

previamente esterilizados, até formar um pó finamente dividido. A amostra foi recolhida e

processada em microtubo de 1,5 mL, no qual foi adicionado 1000 µL de solução tampão de

extração (Tris-HCl 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 2 mM; DTT 2 mM; PMSF 1 mM;

Leptina 10 mg.mL-1 e Apotinina 10 mg.mL-1) na relação 1:4 (v/v). A suspensão formada

foi agitada em agitador tipo vórtex por um minuto e posteriormente centrifugada a 4ºC

com uma força de 16000 XG por 30 minutos; o sobrenadante foi transferido para novo

microtubo, sendo então repetidas a centrifugação e transferência do sobrenadante por mais

duas vezes. O sobrenadante final foi retirado para dosagem de proteínas e ensaios

enzimáticos.

3.3.6 Quantificação de proteínas totais e determinação de curva de

calibração

Para quantificação de proteínas totais, foi adicionado em um microtubo 1,5 ml

de reagente de Bradford a 30 µl do extrato protéico de cada amostra e em outro microtubo

foi adicionado 1,5 ml de reagente de Bradford a 30 µl de água destilada autoclavada para

calibração do aparelho. Os microtubos foram incubados em banho-maria a 40ºC por 15

minutos. As amostras foram então lidas em espectofotômetro SPECTRUM SP-2000 UV

Page 48: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

para determinação da absorbância de cada amostra, utilizando comprimento de onda de

595 nm.

Para determinar a curva de calibração foram preparados cinco microtubos, cada

um contendo reagente de Bradford, água e BSA, uma proteína bovina comercializada de

concentração conhecida (1 mg.mL-1), em diferentes quantidades. Foram então incubados

em temperatura ambiente por 15 minutos e lidos em espectofotômetro SPECTRUM SP-

2000 UV, com comprimento de onda de 595 nm, obtendo-se cinco pontos. Estes pontos

foram plotados em planilha do software Microsoft Excel® do pacote Office® para geração

de um gráfico de dispersão.

A partir da construção do gráfico é possível se obter uma equação da reta,

necessária para determinação da quantidade de proteínas totais em cada amostra. De posse

da equação da reta, y = 0,154x + 0,089, tem-se que: y = concentração total de proteína na

amostra, 0,154 e 0,089 são constantes para essa reta e x = valor de absorbância obtido de

cada amostra. A curva de calibração foi construída utilizando os dados descritos no Anexo

C. O gráfico gerado pode ser visualizado no Anexo D e os valores de absorbância e

concentração de proteínas totais estão plotados no Anexo E.

3.3.7 Ensaio de atividade de β-1,3-glucanase

A determinação da atividade de β-1,3-glucanase foi realizada em meio

reacional (laminarina 1%, tampão acetato de sódio 1,0 M), com volume final de 500 ml e

pH 5,5, em que foram adicionados 100 µl do extrato bruto obtido das folhas dos bulks a

350 µl do reagente. A reação foi incubada em banho-maria a 40ºC por duas horas, sendo

então adicionados 1000 µl de DNS e incubada novamente em banho-maria a 100ºC por 20

minutos (Figura 6). As leituras foram feitas em espectofotômetro SPECTRUM SP-2000

UV, utilizando comprimento de onda de 500 nm.

Page 49: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 6. Incubação em banho-maria a 100ºC para ensaio de atividade de β-1,3-glucanase.

3.3.8 Ensaio de atividade de peroxidase

A determinação da atividade de peroxidase foi realizada em meio reacional

(2,2’-Anzino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, ~ 98%

(ABTS) 40%, tampão acetato de sódio 1,0 M). Para cada leitura, foram adicionados na

cubeta 2 mL do reagente, 200 µL de peróxido de hidrogênio (H2O2) e 50 µL do extrato

bruto obtido das folhas dos bulks. As leituras foram feitas em espectofotômetro

SPECTRUM SP-2000 UV, utilizando comprimento de onda de 405 nm.

Os dados obtidos foram submetidos à anàlise de variância e teste Tukey,

utilizando o procedimento GLM no software SPSS®, versão 16.0.

Page 50: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 ESTUDO DA HERANÇA DE ALELOS DE RESISTÊNCIA NAS

CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO CICA-8 E METICA-1

4.1.1 Cruzamento: Metica-1 (S) x Cica-8 (R)

Observou-se que a cultivar Metica-1, ao ser inoculada com o isolado 1049,

apresentou reação de susceptibilidade em todas as trinta plantas inoculadas. A cultivar

Cica-8 apresentou reação de resistência em todas trinta plantas inoculadas (Tabela 4,

Figuras 7 e 8). A população F1 do cruzamento entre Metica-1 e Cica-8, inoculada com o

mesmo isolado (1049), apresentou reação de resistência em todas as plantas inoculadas

(Tabela 4), representada pelas notas 1 e 3 (Figura 9), indicando dominância do caráter

resistência.

Tabela 4. Frequências esperadas e obtidas das populações de arroz Metica-1, Cica-8, F1,

F2, RC1:1 e RC1:2, inoculadas com isolado 1049.

GeraçãoNúmero de

plantas

Freq. Esp. (N)1

Freq. Obs. (N)2

Freq. esp. (%)3

Freq. obs. (%)4

R S R S R S R SMetica-1 30 0 30 0 30 0 100 0 100Cica-8 30 30 0 30 0 100 0 100 0

F1 20 20 0 20 0 100 0 100 0

F2 200150

50 137 63 75 25 68,5 31,5

RC1:1 82 41 41 31 51 50 50 37,8 62,2

RC1:2 100100

0 79 21 100 0 79 21

Total 462 . . . . . . . .1 Frequência esperada, valor nominal;2 Frequência observada, valor nominal;3 Frequência esperada, valor em porcentagem;4 Frequência observada, valor em porcentagem;

Page 51: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 7. Frequência de plantas da população Metica-1 para o isolado 1049.

Figura 8. Frequência de plantas da população Cica-8 para o isolado 1049.

Figura 9. Frequência de plantas da população F1 para o isolado 1049.

Page 52: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

A população F2, inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de

resistência em 137 das duzentas plantas inoculadas (Tabela 4). Observou-se que houve

segregação entre os indivíduos da população, com 68,5% das plantas apresentando reações

que variam entre as notas 0, 1 e 3, prevalecendo a nota 1 e 31,5% das plantas com reação

susceptível variaram entre as notas 5, 7 e 9, com prevalência da nota 7 (Figura 10).

Figura 10. Frequência de plantas da população F2 para o isolado 1049.

A população RC1:1, inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de

resistência em 31 das 82 plantas inoculadas (Tabela 4). Em 37,8% (plantas resistentes),

observou-se uma variação entre as notas 1 e 3 (Figura 5). Entre 62,2% das plantas

susceptíveis, as reações variaram entre as notas 5, 7 e 9, com predominância da nota 7

(Figura 11). A população RC1:2, inoculada com o isolado 1049, apresentou reação de

resistência em 79 das cem plantas inoculadas (Tabela 4). Entre 79% de plantas resistentes,

houve predominância da nota 1 (Figura 12). Entre as susceptíveis, predominou a nota 7

(figura 6).

Page 53: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 11. Frequência da população RC1:1 para o isolado 1049.

Figura 12. Frequência da população RC1:2 para o isolado 1049.

4.1.2 Cruzamento Cica-8 (S) x Metica-1 (R)

A cultivar Cica-8, ao ser inoculada com o isolado 435, apresentou reação de

susceptibilidade em 100% das trinta plantas testadas (Tabela 5), observando-se a mesma

frequência entre as notas 5, 7 e 9 (Figura 13). A cultivar Metica-1 apresentou 100% de

resistência ao isolado 435, das trinta plantas testadas (Tabela 5). Entre as reações

observadas, houve predominância da nota 1 (Figura 14).

Tabela 5. Frequências esperadas e obtidas das populações inoculadas com isolado 435.

Page 54: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

GeraçãoNúmero

de plantas

Freq. Esp. (N)1

Freq. Obs. (N)2

Freq. Esp. (%)3

Freq. Obs. (%)4

R S R S R S R SCica-8 30 0 30 0 30 0 100 0 100Metica-1 30 30 0 30 0 100 0 100 0F1 20 20 0 20 0 100 0 100 0F2 200 150 50 136 64 75 25 68 32RC1:1 100 50 50 39 61 50 50 39 61RC1:2 75 75 0 57 18 100 0 76 24

Total 455 . . . . . . . .1 Frequência esperada, valor nominal;2 Frequência observada, valor nominal;3 Frequência esperada, valor em porcentagem;4 Frequência observada, valor em porcentagem.

Figura 13. Frequência da população Cica-8 para o isolado 435.

Figura 14. Frequência da população Metica-1 para o isolado 435.

Page 55: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

A população F1 do cruzamento Cica-8 x Metica-1, inoculada com isolado 435,

apresentou reação de resistência em 100% das vinte plantas testadas (Tabela 5). Entre as

plantas resistentes houve predominância absoluta da nota 1 (Figura 15).

Figura 15. Frequência da população F1 para o isolado 435.

A população F2, inoculada com o isolado 435, apresentou reação de resistência

em 68% das duzentas plantas testadas (Tabela 5), com predominância da nota 1 em relação

a nota 3 e 0 (Figura 16). Entre as planta susceptíveis observou-se frequência similar entre

as notas 5, 7 e 9 (Figura 16).

Figura 16. Frequência da população F2 para o isolado 435.

Page 56: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

A população RC1:1, inoculada com o isolado 435, apresentou reação de

resistência em 39% das cem plantas testadas (Tabela 5), com predominância da nota 1 em

relação às notas 3 e 0 (Figura 17). Entre as 61 plantas susceptíveis observadas nesta

população, houve predominância da nota 9 (Figura 17). A população RC1:2, inoculada com

o mesmo isolado, apresentou reação de resistência em 76% das 75 plantas testadas (Tabela

5). Entre as plantas resistentes houve predominância da frequência da nota 1, enquanto

entre as plantas susceptíveis houve frequência similar entre as notas 5, 7 e 9 (Figura 18).

Figura 17. Frequência da população RC1:1 para o isolado 435.

Figura 18. Frequência da população RC1:2 para o isolado 435.

Page 57: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Os dados foram submetidos ao fator de correção de Yates e procedida a análise

de χ2 (∑[(|o - e|-0,5)2/e]) e teste F descritos na Tabela 6, devido o teste ser aplicado com

apenas um grau de liberdade, como recomendado por Strickberger (1971).

Tabela 6. Teste de χ2 e significância para as frequências esperadas para as populações

inoculadas com isolado 1049 e 435.

Isolado População Frequência esperada (R:S) χ² F1049 F2 3:1 4,167 0,041227 *1049 RC1:1+ 1:1 4,402 0,035888 *

1049 RC1:2++ 1:0 4,203 0,040364 *

435 F2 3:1 4,860 0,027486 *

435 RC1:1+ 1:1 4,41 0,035729 *

435 RC1:2++ 1:0 4,083 0,043308 *+ Retrocruzado com genitor susceptível;++ Retrocruzado com genitor resistente;* Significância a 5% de probabilidade.

Para a população F2, do cruzamento Cica-8 (S) x Metica-1 (R), tendo, portanto,

Metica-1 como doador de resistência, inoculada com o isolado 1049, observou-se que a

segregação 3:1 apresentou significância, indicando que as frequências obtidas não diferem

significativamente das frequências esperadas. Assim, o caráter resistência na cultivar

Metica-1 é controlado por um par de alelos dominantes. Este resultado foi confirmado na

população RC1:1 ao apresentar uma segregação de 1:1 e na população RC1:2, apresentando

segregação de 1:0 (Tabela 6).

As segregações entre as plantas resistentes e susceptíveis na população F2, do

cruzamento Metica-1 (S) x Cica-8 (R), em que Cica-8 foi o genitor doador de resistência,

inoculada com o isolado 435, foi melhor explicada pela hipótese de um par de alelos. A

razão esperada de 3:1 não diferiu estatisticamente da razão obtida. Este resultado foi

confirmado nas segregações obtidas em RC1:1 e RC1:2 (1:1 e 1:0, respectivamente) (Tabela

6).

Page 58: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Na caracterização fenotípica foi possível identificar que a resistência das

cultivares Metica-1 e Cica-8 são controladas por um gene, diferentes entre si, com um par

de alelos dominantes cada, e segregam de forma independente.

Estudos da herança da resistência à brusone em arroz vêm sendo conduzidos

desde a década de 60 por Kiyosawa. Esta metodologia de cruzamento de genitor resistente

com suscetível também é utilizada para identificar genes de resistência, como por exemplo:

Pi-a, Pi-k, Pi-km, Pi-m, Pi-ta, Pi-z, Pi-i, Pi-zt, Pi-kh, Pi-b, Pi-t, localizados em sete loci: Pi-k,

Pi-ta, Pi-a, Pi-i, Pi-z, Pi-b, Pi-t.

Em 1961, Hsieh et al., citado por Silva, 1993, estudando vários cruzamentos e

várias raças de brusone, concluíram que a maioria das cultivares possui um par de alelos

dominantes de resistência, reforçando a proporção obtida de 3:1, em que dois alelos

dominantes atuam na expressão da resistência.

Yu et al. (1986), avaliando a resistência genética em cinco cultivares

melhoradas e quatro tradicionais a três isolados de brusone, encontraram proporções

fenotípicas de 15:1 (R:S) e 3:1 (R:S), com predominância desta última, concluindo que a

resistência à brusone pode ser controlada por um ou dois genes dominantes. Este resultado

demonstra que a herança da resistência à brusone ocorre de forma simples, sendo então, a

variabilidade natural encontrada na população de M. oryzae o complicador para o

estabelecimento de cultivares com resistência durável.

4.2 MARCADORES MOLECULARES APLICADOS AO ESTUDO DA

HERANÇA DE GENES DE RESISTÊNCIA EM DUAS

CULTIVARES DE ARROZ IRRIGADO

Onze marcadores microssatélites foram inicialmente testados nos genitores

Metica-1 e Cica-8. Entre eles, quatro marcadores (RM224, RM7102, RM1261 e yca72)

amplificaram o polimorfismo, diferenciando o genitor resistente do susceptível (Figura 19).

Page 59: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Figura 19. Padrão de amplificação nos genitores Metica-1 e Cica-8, apresentado por onze

marcadores em gel de poliacrilamida desnaturante (6%). Da esquerda para a

direita: M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1);

P2: Genitor doador de resistência ao isolado 1049 (Cica-8). Marcadores

microssatélites: 9871.T7E2b, RM224, RM7102, OSR32, RM144, RM6836,

RM1261, JJ817, yca72, pBA14 e RM28130.

Os quatro marcadores polimórficos foram, então, testados nos bulks das

populações segregantes F2 resistente e F2 susceptível e F1 (Figura 20). Foi possível

Page 60: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

detectar uma mesma amplificação nos bulks, verificada nos genitores, em três marcadores

(RM224, RM1261 e RM7102). Apenas o marcador RM7102 apresentou padrão de

amplificação e polimorfismo esperados, ou seja, a amplificação observada no genitor

resistência repetiu-se nos bulks F1 e F2 resistente, apresentando bandas polimórficas com

170 e 190 pares de base, sendo, então, testado nos sete indivíduos componentes de cada

bulk.

Figura 20. Padrão de amplificação observada em gel de poliacrilamida desnaturante (6%)

para os primers RM224, RM7102, RM1261 e yca72 nos bulks das populações

F1 e F2 resistente e susceptível. Da esquerda para a direita: M: Ladder 10 bp;

P1: Genitor susceptível ao isolado 1049 (Metica-1); P2: Genitor doador de

MM M M

Page 61: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

resistência ao isolado 1049 (Cica-8); BH: Bulk da população F1; BFR: Bulk da

população F2 resistente; BFS: Bulk da população susceptível.

Foi possível observar nos indivíduos F1-1 a F1-7, testado com o marcador

RM7102, a presença de duas bandas, uma superior, semelhante à observada no genitor

Cica-8, resistente ao isolado 435, com 190 pares de base (pb), e uma inferior, com 170 pb,

semelhante à observada no genitor Metica-1, susceptível a este isolado. Este padrão de

amplificação é condizente com sua condição de heterozigoto (Figura 21).

Os indivíduos da população F2 resistente (F2R1 a F2R7) obtiveram o mesmo

padrão de amplificação para o marcador microssatélite RM7102, em que todos

apresentaram ambas as bandas, indicando que estes sete indivíduos também são

heterozigotos. Os indivíduos F2 susceptíveis apresentaram apenas a banda inferior (170

pb), semelhante ao genitor Metica-1 (susceptível). Este padrão de amplificação sugere que

a banda superior (190 pb) está associada à resistência ao isolado 1049, observado nesta

população, e que a banda inferior, possivelmente um alelo recessivo, está associada à

susceptibilidade herdada do genitor Metica-1 (Figura 21). Através da análise de ligação,

verificou-se que este marcador está ligado ao gene de resistência a uma distância de 2,2

cM.

Figura 21. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%)

nos indivíduos das populações F1, F2 resistente e F2 susceptível pelo marcador

RM7102. M: Ladder 10 bp; números 1 a 7: indivíduos do bulk F1; números 8 a

14: indivíduos do bulk F2 resistente; números 15 a 21: indivíduos do bulk F2

susceptível.

MM

Page 62: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Os marcadores 9871.T7E2b, yca72, RM224, OSR32, RM7102, RM6836,

pBA14, RM144, RM28130, RM1261 e JJ817 foram testados nas populações inoculadas

com o isolado 435. Destes, o marcador RM144 apresentou polimorfismo entre os pais,

diferenciando o genitor resistente e susceptível. Este marcador foi testado nos bulks F1, F2

resistente e F2 susceptível, porém não apresentou polimorfismo nos bulks das populações

testadas, indicando que não possui associação ao caráter resistência para o isolado 435

nesta população (Figura 22).

Figura 22. Padrão de amplificação observado em gel de poliacrilamida desnaturante (6%)

nos genitores Metica-1, Cica-8 e bulks das populações F1 e F2 resistente e

susceptível. M: Ladder 10 bp; P1: Genitor susceptível ao isolado 435 (Cica-8);

P2: Genitor doador de resistência ao isolado 435 (Metica-1); BH: Bulk da

população F1; BFR: Bulk da população F2 resistente; BFS: Bulk da população

susceptível.

Yang et al. (2009), trabalhando na identificação e mapeamento do gene Pi41,

utilizaram as cultivares 93-11 (resistente) e Nipponbare (susceptível) e a população F2

derivada deste cruzamento, desafiadas a dois isolados de brusone (CHL724 e CHL743), os

quais elicitam diferentes respostas de resistência/susceptibilidade nestes genitores. Para o

estudo, utilizaram 180 marcadores microssatélites, obtendo-se sete marcadores ligados ao

gene Pi41, sendo RM7102 um deles.

M M

Page 63: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Os marcadores RM144, RM224 e yca72 foram relacionados aos genes de

resistência Pi-ks, Pi1 e Pia, respectivamente (Suh et al., 2009; Jia & Moldenhauer, 2010),

sinalizando que estes genes não estão associados à resistência nas cultivares Metica-1 e

Cica-8. O marcador 1261 (Yang et al., 2009), apresentou amplificação polimórfica nos

genitores, mas não nos bulks F1, F2R e F2S. Este marcador também está relacionado ao

gene Pi41, porém não apresentou associação ao alelo de resistência da cultivar Cica-8, isso

leva a inferir que Pi41 e os alelos identificados em Cica-8 são semelhantes, porém

apresentam alguma diferença entre si.

Bryan et al. (2000) relatam que a mudança em um único aminoácido diferencia

alelos resistentes de susceptíveis no gene Pi-ta, pois modificam as proteínas que serão

codificadas pelo gene. Jia et al. (2000) relatam que a substituição de um único aminoácido

no domínio rico em leucina do gene Pi-ta ou no gene AVR-Pita176 resulta na perda da

resistência da planta. Estes resultados demonstram que mesmo as menores alterações nos

aminoácidos dos genes de resistência e/ou avirulência são capazes de gerar variabilidade e

perda de resistência.

Jia (2010) relata que o gene Pita está localizado em uma região estável,

próxima ao centrômero. Este gene codifica uma proteína predita citoplasmática NBS-LRR,

seguindo o molde da maioria dos genes de resistência clonados. Neste trabalho, o autor

mostra que o mesmo alelo Pi-ta é capaz de produzir 12 diferentes proteínas, as quais são

efetivas a dez patótipos distintos. Por outro lado, o alelo de avirulência AVR-Pita está

localizado em uma região telomérica, região instável do cromossomo, e que a proteína tem

se mostrado frequentemente alterada em condições de campo.

4.3 CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA RELACIONADA A GENES

DE RESISTÊNCIA EM DUAS CULTIVARES DE ARROZ

IRRIGADO

Os valores obtidos da atividade enzimática de β-1,3-glucanase e peroxidase,

submetidos à análise de variância e os valores dos quadrados médios encontram-se nas

Page 64: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Tabelas 7, 8, 9 e 10. Dos resultados das análises, pode-se concluir que houve diferença

estatística entre genótipos, entre tempo de coleta e na interação genótipos e tempo de

coleta, com exceção da atividade da enzima peroxidase em relação a tempo de coleta e

interação, quando os genitores e populações foram inoculados com isolado 435.

Tabela 7. Análise de variância da atividade enzimática de β-1,3-glucanase das populações

segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado

1049.

Fontes de variação Graus de Liberdade Quadrado MédioGenótipos 3 0,341 *Coletas 5 0,163 *Genótipos x coletas 15 0,118 *Erro 48 0,001

CV = 0,87* Significativo a 5% pelo teste F

Tabela 8. Análise de variância da atividade enzimática de β-1,3-glucanase das populações

segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435.

Fontes de variação Graus de Liberdade Quadrado MédioGenótipos 3 0,551 *Coletas 5 0,158 *Genótipos x coletas 15 0,094 *Erro 48 0,001

CV = 1,15* Significativo a 5% pelo teste F

Tabela 9. Análise de variância da atividade enzimática de peroxidase das populações

segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado

1049.

Fontes de variação Graus de Liberdade Quadrado Médio

Genótipos 3 0,001 *Coletas 5 0,001 *

Page 65: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Genótipos x coletas 15 0,000 *Erro 48 0,000

CV = 0,83* Significativo a 5% pelo teste F

Tabela 10. Análise de variância da atividade enzimática de peroxidase das populações

segregantes F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado

435.

Fontes de variação Graus de Liberdade Quadrado MédioGenótipos 3 0,149 *Coletas 5 0,017 n.s.Genótipos x coletas 15 0,015 n.s.Erro 48 0,018

CV = 0,68* Significativo a 5% pelo teste Fn.s. Não significativo

Tabela 11. Atividade enzimática de β-1,3-glucanase (U.mg-1) das populações segregantes

F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049.

GenótiposHoras após inoculação

CV0 24 48 72 96 120

Cica (R)3 0,182 a1 B2 0,204 a B 0,102 a A 0,168 a A 0,156 a A 0,150 a A 0,4

Continua...

Tabela 11. Continuação.

GenótiposHoras após inoculação

CV0 24 48 72 96 120

Metica (S)4 0,092 a A 0,120 ab A 0,238 b A 0,209 ab B 0,182 ab A 0,146 ab A 0,4

F2 (R)5 0,113 a A 0,098 a A 0,213 b A 0,275 b C 0,111 a A 0,225 b A 0,54

F2 (S)6 0,576 d C 0,267 c B 0,238 bc A 1,206 e D 0,153 a A 0,205 ab A 0,87

CV 0,26 0,43 0,45 1,2 0,23 0,3 -1 - Letras minúsculas correspondem a comparação entre horas. Letras iguais na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;2 – Letras maiúsculas correspondem a comparação entre genótipos. Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;3 - Cultivar Cica-8, doador de resistência ao isolado 1049;4 - Cultivar Metica-1, genitor susceptível ao isolado 1049;5 - População segregante F2, resistente ao isolado 1049;6 - População segregante F2, susceptível ao isolado 1049.

Page 66: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Tabela 12. Atividade enzimática de β-1,3-glucanase (U.mg-1) das populações segregantes

F2 resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435.

GenótiposHoras após inoculação

CV0 24 48 72 96 120

Metica (R)3 0,092 ab1 B2 0,113 a A 0,242 c A 0,183 b A 0,069 a A 0,120 a A 0,27

Cica (S)4 0,182 a A 0,226 b B 0,181 ab A 0,214 ab A 0,218 b C 0,126 a A 0,29

F2 (R)5 0,113 a A 0,177 bc B 0,220 c A 0,200 c A 0,123 ab B 0,142 ab A 0,28

F2 (S)6 0,576 c C 0,809 d C 1,033 e B 0,431 b B 0,096 a AB 0,118 a A 0,88

CV 0,29 1,15 1,34 0,9 0,46 0,1 -1 - Letras minúsculas correspondem a comparação entre horas. Letras iguais na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;2 - Letras maiúsculas correspondem a comparação entre genótipos. Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;3 - Cultivar Metica-1, doador de resistência ao isolado 435;4 - Cultivar Cica-8, genitor susceptível ao isolado 435;5 - População segregante F2, resistente ao isolado 435;6 - População segregante F2, susceptível ao isolado 435.

Tabela 13. Atividade enzimática de peroxidase (U.mg-1) das populações segregantes F2

resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 1049.

GenótiposHoras após inoculação

CV0 24 48 72 96 120

Cica (R)3 0,021 a A 0,059 a A 0,032 a A 0,015 a A 0,014 a B 0,006 a A 0,92

Metica (S)4 0,019 ab A 0,025 b A 0,027 b A 0,015 ab A 0,010 ab B 0,006 a A 0,37

Continua...

Tabela 13. Continuação.

GenótiposHoras após inoculação

CV0 24 48 72 96 120

F2 (R)5 0,023 ab A 0,010 a A 0,032 b A 0,016 ab A 0,008 a B 0,005 a A 0,48

F2 (S)6 0,016 bc A 0,006 abc A 0,016 c A 0,013 bc A 0,000 a A 0,004 ab A 0,69

CV 0,54 1,08 0,25 0,07 0,7 0,061 - Letras minúsculas correspondem a comparação entre horas. Letras iguais na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;2 – Letras maiúsculas correspondem a comparação entre genótipos. Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;3 - Cultivar Cica-8, doador de resistência ao isolado 1049;

Page 67: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

4 - Cultivar Metica-1, genitor susceptível ao isolado 1049;5 - População segregante F2, resistente ao isolado 1049;6 - População segregante F2, susceptível ao isolado 1049.

Tabela 14. Atividade enzimática de peroxidase (U.mg-1) das populações segregantes F2

resistente e susceptível e genitores, inoculados com isolado 435.

GenótiposHoras após inoculação

CV0 24 48 72 96 120

Metica (R)3 0,019 a1 A2 0,016 ab A 0,038 b A 0,023 ab A 0,010 a A 0,006 a A 0,44

Cica (S)4 0,021 ab A 0,245 a A 0,404 a A 0,289 a A 0,110 a A 0,091 a A 0,22

F2 (R)5 0,023 b A 0,018 ab A 0,010 a A 0,011 ab A 0,009 a A 0,006 a A 0,48

F2 (S)6 0,016 b A 0,003 a A 0,001 a A 0,001 a A 0,000 a A 0,000 a A 0,9

CV 0,55 0,52 0,93 0,73 0,67 0,68

1 - Letras minúsculas correspondem a comparação entre horas. Letras iguais na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;2 - Letras maiúsculas correspondem a comparação entre genótipos. Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey 5%;3 - Cultivar Metica-1, doador de resistência ao isolado 435;4 - Cultivar Cica-8, genitor susceptível ao isolado 435;5 - População segregante F2, resistente ao isolado 435;6 - População segregante F2, susceptível ao isolado 435.

4.3.1 Atividade de β-1,3-glucanase

Verificou-se atividade de β-1,3-glucanase no tempo de coleta 0h, isto é, antes

da inoculação, havendo diferença significativa entre os genitores, entre Cica-8 e a

população F2 susceptível e entre Metica-1 e F2 resistente e F2 susceptível. Esta informação

indica que existe atividade constitutiva desta enzima e que há diferenças entre os

genótipos. Não foi observado o mesmo comportamento para a atividade de peroxidase nos

genitores e populações F2 (Tabelas 11, 12, 13 e 14).

4.3.1.1 Metica-1 (S) x Cica-8 (R)

Encontra-se na Tabela 11 a atividade de β-1,3-glucanase ao longo de seis

coletas. Na população F2 resistente a atividade de β-1,3-glucanase às 48h, 72h e 120h

foram diferentes de 0h, 24h e 96h. Em F2 susceptível houve diferença entre 0h, 24, 72h e

96h, sendo 48h estatisticamente igual a 24h e 120h estatisticamente igual a 96h. Não houve

Page 68: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

diferença estatística na atividade enzimática do genitor resistente e susceptível ao longo

das coletas, exceto o genitor susceptível, entre 0h e 48h. Porém, dentro de cada período de

coleta observou-se diferença entre os genitores às 48h.

O genitor resistente diferiu estatisticamente da população F2 susceptível nas

coletas 0h, 24h, 48h e 72h. Em relação à população F2 resistente, foi estatisticamente

semelhante nas coletas 0h, 24h e 96h (Tabela 11). O genitor susceptível apresentou

semelhanças estatísticas em relação à população F2 resistente ao longo de todas as coletas

e, em relação à população F2 susceptível, foi estatisticamente semelhante nos tempos 48h,

96h e 120h.

4.3.1.2 Cica (S) x Metica (R)

A atividade de β-1,3-glucanase da cultivar Metica-1 (R) se diferenciou das demais

às 48h. Para a cultivar Cica-8 (S) houve diferença entre os tempos de coleta 0h e 24h,

sendo estes, estatisticamente semelhantes aos demais. A atividade de β-1,3-glucanase em

F2 resistente às 48h e 72h diferenciou-se de 0h, 96h e 120h. Na população F2 susceptível

houve diferença entre todos os tempos de coleta, exceto entre 96h e 120h. A cultivar

Metica-1 (R) apresentou diferenças em relação à população F2 susceptível em todos os

tempos de coleta, exceto às 96h e 120h. Em relação à população F2 resistente, verificou-se

atividade estatisticamente semelhante às 48h, 72h e 120h. Entre a cultivar Cica-8 (S) e a

população F2 susceptível, houve semelhança estatística apenas às 120h. Entre esta cultivar

e a população F2 resistente, houve diferença apenas às 96h (Tabela 12).

Em ambas as populações F2 susceptíveis foi possível identificar um grande

aumento da atividade enzimática de β-1,3-glucanase em momentos diferentes, dependendo

do isolado inoculado. A população F2 susceptível inoculada com o isolado 1049 apresentou

maior atividade às 72h, enquanto a população F2 susceptível inoculada com o isolado 435

teve sua maior atividade às 48h (Tabelas 11 e 12).

Edreva (2005) relata que o acúmulo de PRP’s em plantas resistentes pode ser

maior ou menor quando comparadas à plantas susceptíveis. Estudos de plantas de tomate

infectadas com Phytophtora infestans (Tonón et al., 2002), maçãs infectadas com Venturia

Page 69: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

inaequalis (Poupard et al., 2003), entre outros, demonstram que este acúmulo depende do o

patossistema em estudo, verificando-se respostas diferenciadas de plantas

resistentes/susceptíveis

Este fato demonstra que a maior ou menor expressão de PRP’s não está

necessariamente associado à resistência ou susceptibilidade, mas na presença de genes

codificadores de PRP’s e na eficiência de cada etapa dos processos da regulação desses

genes, desde os receptores, transdução dos sinais até as cascatas de eventos (Edreva, 2005).

4.3.2 Atividade de Peroxidase

4.3.2.1 Metica-1 (S) x Cica-8 (R)

A cultivar Cica-8 (R) não apresentou diferenças estatísticas ao longo dos

tempos de coleta. A cultivar Metica-1 (S) apresentou diferença apenas dos tempos 24h e

48h em relação à 120h. Verificou-se diferença na atividade de peroxidase na população F2

resistente nos tempos 24h, 96h e 120h em relação à 48h. A atividade desta enzima na

população F2 susceptível apresentou diferença no tempo 96h em relação aos tempos 0h,

48h e 72h e o tempo 48h se diferenciou de 120h. Foi possível verificar diferença entre os

genótipos apenas no tempo 96h, em que a população F2 (S) das demais (Tabela 13).

4.3.2.2 Cica (S) x Metica (R)

O genitor Metica-1 (R) apresentou diferença no tempo 48h dos tempos 0h, 96h

e 120h. O genitor Cica-8 (S) não apresentou diferença estatística em nenhum dos tempos

de coleta. Houve diferença no tempo 0h na população F2 (R) em relação aos tempos 48h,

96h e 120h. A população F2 (S) apresentou diferença entre 0h e os demais tempos de coleta

(Tabela 14).

Foi possível observar que existe atividade constitutiva da proteína β-1,3-

glucanase entre os genitores e que existem diferenças entre os genitores. Esta diferença foi

refletida na população segregante. A associação da atividade de β-1,3-glucanase com a

Page 70: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

tentativa de defesa das plantas ao longo do tempo foi mais evidente quando comparada à

atividade de peroxidase, principalmente na população F2 suscetível, para ambos os

isolados.

Guimarães et al. (2009) encontraram diferenças estatísticas na atividade de

peroxidase aos 7, 14 e 21 dias quando comparadas testemunhas inoculadas com não

inoculadas, mas não encontraram diferenças na atividade de β-1,3-glucanase. Nojosa et al.

(2002) observaram que o complexo de enzimas do tipo peroxidases avaliadas em sua

atividade total não tem correlação com a resistência de cacau à vassoura-de-bruxa, porém

relatam ser possível que existam isoenzimas do tipo peroxidases que atuem isoladamente

no processo de defesa constitutiva ou na defesa induzida em cacau. Estes resultados

indicam que a maior ou menor atividade das enzimas peroxidase e β-1,3-glucanase

dependem do patossistema em estudo.

Acredita-se que proteínas relacionadas à patogênese estão mais relacionadas à

severidade do sintoma expresso do que à resistência em si. Esta hipótese decorre de

diversos estudos realizados em diferentes patossistemas. Especula-se, também, que a

indução de PRP’s que acompanham a expressão do sintoma apresenta-se como uma

“última barreira” protetora frente à completa destruição das plantas estressadas tanto por

restrições internas quanto por ambientais. A autora explica, ainda, que alguns aspectos

fundamentais dos mecanismos de regulação já foram elucidados, outros, entretanto, ainda

são pouco conhecidos, tornando-se desafios para os estudos fundamentais e aplicados

(Edreva, 2005).

Evidências experimentais fundamentam a utilidade dos genes codificadores de

PRP’s em desenvolver resistência genética em plantas transgênicas. Estes genes estão

também relacionados à resistência sistêmica adquirida (SAR – Systemic Acquired

Resistance) (Edreva, 2005), ampliando as possibilidades de uso destes genes.

Page 71: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

5 CONCLUSÕES

• O caráter resistência à brusone apresenta distribuição discreta e segregação

independente;

• A resistência da cultivar Cica-8 ao isolado 1049, patótipo IB-1, é condicionada por

um gene com dois alelos, de ação dominante;

• A resistência da cultivar Metica-1 ao isolado 435, patótipo IB-9, é condicionada por

um gene com um par de alelos, de ação dominante;

• Os genes e alelos controladores do caráter resistência nas cultivares Metica-1 e

Cica-8 não são os mesmos;

• Os genes aqui identificados são efetivos contras os patótipos IB-1 e IB-9, que são

os mais freqüentes na região produtora de arroz irrigado de várzeas tropicais.

• O marcador microssatélite identificado, RM7102 (Forward:

CGGCTTGAGAGCGTTTTTAG; Reverse: TACTTGGTTACTCGGGTCGG), está

associado à resistência da cultivar Cica-8 ao isolado 1049, patótipo IB-1;

• Não foi possível identificar um marcador microssatélite associado à resistência da

cultivar Metica-1 ao isolado 435, patótipo IB-9.

• Existem diferenças na atividade constitutiva de β-1,3-glucanase entre as cultivares

Cica-8 e Metica-1;

• Existem diferenças claras na atividade enzimática de β-1,3-glucanase das

populações ao longo do tempo quando expostas aos agentes desafiantes, isolado

1049, patótipo IB-1 e isolado 435, patótipo IB-9;

Page 72: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

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Page 84: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

ANEXOS

Anexo A. Composição centesimal média (% na matéria seca) de arroz integral, branco polido e parboilizado polido

Constituinte Arroz integral Arroz branco polido Arroz parboilizado polidoAmido total 74,12 87,58 85,08Proteínas 10,46 8,94 9,44Lipídios 2,52 0,36 0,69Cinzas 1,15 0,30 0,67Fibra total 11,76 2,87 4,15Fibra insolúvel 8,93 1,05 1,63Fibra solúvel 2,82 1,82 2,52

Fonte: Adaptado de Storck (2004), citado por Walter et al. (2008).

Anexo B. Levantamento sistemático da produção agrícola brasileira para a cultura do arroz, safra 2010

Estado Variável Setembro/2010 Participação (%)TOTAL Área plantada (ha) 2.755.187 100.0

Produção (t) 11.280.501 100.0Rend. médio (kg.ha-1) 4.174 100.0

Região Norte Área plantada (ha) 381.860 13.9Produção (t) 1.026.185 9.1Rend. médio (kg.ha-1) 2.692 .

Rondônia Área plantada (ha) 69.263 2.5Produção (t) 167.814 1.5Rend. médio (kg.ha-1) 2.423 .

Acre Área plantada (ha) 14.490 0.5Produção (t) 21.031 0.2Rend. médio (kg.ha-1) 1.472 .

Amazonas Área plantada (ha) 4.800 0.2Produção (t) 10.300 0.1Rend. médio (kg.ha-1) 2.146 .

Roraima Área plantada (ha) 15.500 0.6Produção (t) 84.584 0.7Rend. médio (kg.ha-1) 5.457 .

Pará Área plantada (ha) 136.011 4.9Produção (t) 290.686 2.6Rend. médio (kg.ha-1) 2.145 .

Amapá Área plantada (ha) 3.850 0.1Produção (t) 4.450 0.1Rend. médio (kg.ha-1) 1.156 .

Tocantins Área plantada (ha) 137.946 5.0

Page 85: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Produção (t) 447.320 4.0Rend. médio (kg.ha-1) 3.243 .

Região Nordeste Área plantada (ha) 674.513 24.5Continua...

Anexo B. Continuação.Estado Variável Setembro/2010 Participação (%)

Produção (t) 872.775 7.7Rend. médio (kg.ha-1) 1.324 .

Maranhão Área plantada (ha) 466.586 16.9Produção (t) 548.862 4.9Rend. médio (kg.ha-1) 1.176 .

Piauí Área plantada (ha) 133.457 4.8Produção (t) 114.181 1.0Rend. médio (kg.ha-1) 926 .

Ceará Área plantada (ha) 27.483 1.0Produção (t) 63.297 0.6Rend. médio (kg.ha-1) 2.303 .

Rio Grande do Norte Área plantada (ha) 2.319 0.1Produção (t) 5.247 0.0Rend. médio (kg.ha-1) 3.847 .

Paraíba Área plantada (ha) 5.531 0.2Produção (t) 378 0.0Rend. médio (kg.ha-1) 148 .

Pernambuco Área plantada (ha) 6.992 0.3Produção (t) 103.7 0.4Rend. médio (kg.ha-1) 8.7 .

Alagoas Área plantada (ha) 3.000 0.1Produção (t) 17.940 0.2Rend. médio (kg.ha-1) 5.980 .

Sergipe Área plantada (ha) 10.610 0.4Produção (t) 48.601 0.4Rend. médio (kg.ha-1) 5.105 .

Bahia Área plantada (ha) 18.535 0.7Produção (t) 33.463 0.3Rend. médio (kg.ha-1) 1.805 .

Região Sudeste Área plantada (ha) 72.370 2.6Produção (t) 189.687 1.7Rend. médio (kg.ha-1) 2.664 .

Minas Gerais Área plantada (ha) 52.606 1.9Produção (t) 115.090 1.0Rend. médio (kg.ha-1) 2.238 .

Espírito Santo Área plantada (ha) 1.175 0.0

Page 86: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

Produção (t) 3.156 0.0Rend. médio (kg.ha-1) 2.686 .

Rio de Janeiro Área plantada (ha) 2.189 0.1Produção (t) 7.941 0.1Rend. médio (kg.ha-1) 3.628 .

São Paulo Área plantada (ha) 16.400 0.6Produção (t) 63.500 0.6Rend. médio (kg.ha-1) 3.872 .

Continua...Anexo B. Continuação.

Estado Variável Setembro/2010 Participação (%)Região Sul Área plantada (ha) 1.270.975 46.1

Produção (t) 8.130.796 72.1Rend. médio (kg.ha-1) 6.579 .

Paraná Área plantada (ha) 40.902 1.5Produção (t) 169.009 1.5Rend. médio (kg.ha-1) 4.132 .

Santa Catarina Área plantada (ha) 150.473 5.5Produção (t) 1.041.587 9.2Rend. médio (kg.ha-1) 6.922 .

Rio Grande do Sul Área plantada (ha) 1.079.600 39.2Produção (t) 6.920.200 61.3Rend. médio (kg.ha-1) 6.626 .

Região Centro-Oeste Área plantada (ha) 355.469 12.9Produção (t) 1.061.058 9.4Rend. médio (kg.ha-1) 2.990 .

Mato Grosso do Sul Área plantada (ha) 26.980 1.0Produção (t) 142.650 1.3Rend. médio (kg.ha-1) 5.383 .

Mato Grosso Área plantada (ha) 235.287 8.5Produção (t) 687.137 6.1Rend. médio (kg.ha-1) 2.922 .

Goiás Área plantada (ha) 93.202 3.4Produção (t) 231.271 2.1Rend. médio (kg.ha-1) 2.481 .

Fonte: IBGE, 2010

Anexo C. Obtenção da curva de calibração para determinação de proteínas totais.

Ponto Concentração

de proteína

Reagentes Valor absorbância

(595 nm)Bradford BSA Água

Page 87: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

(mg.mL-1)(mL) (µL) (µL)

0 0,00 1,5 0,0 30,0 0,0001 0,25 1,5 7,5 22,5 0,2362 0,50 1,5 15,0 15,0 0,4143 0,75 1,5 22,5 7,5 0,5384 1,00 1,5 30,0 0,0 0,708

Anexo D. Gráfico de dispersão e equação da reta da curva de calibração obtida

Anexo E. Valores de absorbância e concentração de proteínas totais

AmostraAbsorbância

(nm)Concentração

(mg.mL-1)Amostra

Absorbância(nm)

Concentração(mg.mL-1)

IFR 1P 0,489 0,1643 IFR 4P 1,403 0,3051IFS 1P 3,888 0,6878 IFS 4P 0,771 0,2077IMS 1P 0,717 0,1994 IMS 4P 0,971 0,2385ICR 1P 0,793 0,2111 ICR 4P 0,970 0,2384IIFR 1P 0,312 0,1370 IIFR 4P 1,157 0,2672IIFS 1P 0,246 0,1269 IIFS 4P 0,171 0,1153IIMR 1P 0,545 0,1729 IIMR 4P 0,937 0,2333

Page 88: Dissertação final corrigida - Thiago M . Pinheiro

IICS 1P 0,650 0,1891 IICS 4P 0,662 0,1909IFR 2P 0,425 0,1545 IFR 5P 0,191 0,1184IFS 2P 0,766 0,2070 IFS 5P 0,025 0,0929IMS 2P 0,821 0,2154 IMS 5P 0,344 0,1420ICR 2P 0,448 0,1580 ICR 5P 0,287 0,1332IIFR 2P 0,398 0,1503 IIFR 5P 0,158 0,1133IIFS 2P 0,241 0,1261 IIFS 5P 0,015 0,0913IIMR 2P 0,707 0,1979 IIMR 5P 0,218 0,1226IICS 2P 0,542 0,1725 IICS 5P 0,198 0,1195IFR 3P 1,066 0,2532 IFR 6P 0,110 0,1059IFS 3P 0,851 0,2201 IFS 6P 0,061 0,0984IMS 3P 0,711 0,1985 IMS 6P 0,133 0,1095ICR 3P 1,484 0,3175 ICR 6P 0,260 0,1290IIFR 3P 1,077 0,2549 IIFR 6P 0,190 0,1183

Continua...Anexo E. Continuação.

AmostraAbsorbância

(nm)Concentração

(mg.mL-1)Amostra

Absorbância(nm)

Concentração(mg.mL-1)

IIFS 3P 0,233 0,1249 IIFS 6P 0,044 0,0958IIMR 3P 0,868 0,2227 IIMR 6P 0,212 0,1216IICS 3P 0,951 0,2355 IICS 6P 0,154 0,1127