Dissertação de Mestrado - Sistema de...

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA PRÉ·TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR: IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES

POTENCIAIS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS

Hellen Cristiane Maciel Cunha

Lorena - SP - Brasil 1999 Tranferido da Biblioteca do

DEBIQ para a Bilblioteca Universitária em Junhoi2004

Proc, n" .202/04 ~---- ..... _ __,


PÔS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR: IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES POTENCIAIS DE

PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Dr. Flávio Teixeira da Silva (presidente) Dr. José Domingos Fontana Dr. Adilson Roberto Gonçalves

Estudante:

Hellen Cristiane Maciel Cunha

Lorena - SP - Brasil 1999


PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR: IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES POTENCIAIS DE

PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.

Lorena - SP - Brasil 1999

Aos meus pais Paulo e Luiza, que tanto me apóiam

Ao Elias, meu eterno amor

AGRADECIMENTOS

A Deus, que me ilumina e me guia.

Ao Dr. Flávio Teixeira, por sua amizade e por ter me aceito sob sua orientação.

Aos Drs. Adilson Roberto Gonçalves e André Ferraz pelas sugestões e críticas

apresentadas durante a realização deste trabalho.

À Cleyde, que me iniciou na vida científica e ensinou muito do que aprendi no

laboratório.

Aos meus amigos de muitos anos, Andersen, Régis, Márcia, Luane, Luciane,

Sirlene, José Carlos, José Moreira, Jussara, Larissa e Denise.

Aos demais funcionários do DEBIQ e aos outros grupos de pesquisa que me

deram oportunidade de utilizar alguns aparelhos.

Ao CNPq pela bolsa concedida.

LISTA DE ABREVIATURAS:

BSTFA = N, 0-bis(trimetilsilil)fluoroacetamida

CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DP = Grau de Polimerização

FA1 = Fase Aquosa 1

F A2 = Fase Aquosa 2

FA3 = Fase Aquosa 3

FIO= Detector de Ionização de Chama

F01 = Fase Orgânica 1




FOS = Fase Orgânica 5


GC/MS = Cromatografia Gasosa acoplada a Espectroscopia de Massas

HPSEC = Cromatografia de Exclusão por Tamanho

TIC = Cromatograma de Íons Reconstituído

TMS = Trimetilsilil

CONTEÚDO

Lista de tabelas i

Lista de figuras iii

Resumo viii

Abstract. ix

1. INTRODUÇÃ0 1

1.1. ASPECTOS GERAIS 1

1.2. CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 2

1.2.1. CELULOSE 2

1.2.2. POLIOSES 3

1.2.3. LIGNINA 5

1.2.4. ESTRUTURA DO TECIDO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

E A ASSOCIAÇÃO ENTRE CELULOSE, POLIOSES E LIGNINA. 5

1.3. SEPARAÇÃO DOS COMPONENTES DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 8

1.4. INIBIDORES PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÓSIC0 15

2. OBJETIVOS 32

3. MATERIAIS E MÉTODOS 33

3.1. PREPARAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA 33

3.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE CANA. 35

3.2.1. DETERMINAÇÃO DOS EXTRAÍVEIS 35

3.2.2. DETERMINAÇÃO DE LIGNINA KLASON INSOLÚVEL EM MEIO ÁCID0 35

3.2.3. DETERMINAÇÃO DE LIGNINA KLASON SOLÚVEL EM MEIO ÁCID0 36

3.2.4. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS NO BAGAÇO DE CANA 36

3.2.5. DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS E ÁCIDOS ORGÂNICOS POR CLAE 37

3.2.6. DETERMINAÇÃO DE FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL.. 38

3.3. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO A VAPOR A

190ºC POR 15 MIN 38

3.4. IDENTIFICAÇÃO DOS OLIGÔMEROS DE GLICOSE E XILOSE POR CLAE 41

3.4.1. HIDRÓLISE DE XILANA E CELULOSE 41

3.5. DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLAR DOS COMPOSTOS PRESENTES NO

HIDROLISAD0 42

3.5.1. CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA A DISTRIBUIÇÃO DA MASSA

MOLAR DOS COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISAD0 43

3.6. SEPARAÇÃO DE CARBOIDRATOS E COMPOSTOS AROMÁTICOS

PRESENTES NO HIDROLISAD0 44

3.6.1. SEPARAÇÃO EM CARTUCHOS DE EXTRAÇÃO SÓLIDA (SEP-PAK C18) .44

3.6.2. SEPARAÇÃO POR EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUID0 45

3.7. ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA NO INFRA VERMELH0 46

3.8. IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS AROMÁTICOS DE

BAIXA MASSA MOLAR PRESENTES NO HIDROLISAD0 48

3.8.1. DERIVATIZAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISES DE GC/MS E GC/FID .48

3.8.2. CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS .48

3.8.3. CROMATOGRAFIA GASOSA/DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA 49

4. RESULTADOS E DISCUSSÃ0 51

4.1. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO A VAPOR. 51

4.2. DETERMINAÇÃO DE OLIGÔMEROS DE XILOSE E GLICOSE POR CLAE 55

4.3. IDENTIFICAÇÃO DE COMPLEXOS LIGNINA-CARBOIDRATO PRESENTES NO

HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO

AVAPOR 60 4.4. FRACIONAMENTO DOS COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISADO POR

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUID0 68

4.4.1. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA

DE MASSAS 69

4.4.2. ESPECTROSCOPIA NO INFRA VERMELH0 85

4.4.3. CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE OS COMPOSTOS IDENTIFICADOS

POR GC/MS 88

5. CONCLUSÕES 91

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 92

APÊNDICES

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Concentração de alguns compostos identificados no hidrolisado de

carvalho vermelho e seus efeitos inibitórios na subseqüente fermentação de

xilose a etanol (TRAN e CHAMBERS, 1986) 22

Tabela 2. Compostos derivados de lignina identificados em hidrolisados de

álamo, switchgrass e com stover (FENSKE et ai., 1998) 28

Tabela 3. Proteínas utilizadas na calibração da coluna cromatográfica e suas

respectivas massas molares .43

Tabela 4. Programas de temperatura da coluna para análises das frações

orgânicas nas análises de GC/MS e GC/FID 49

Tabela 5. Balanço de massa do pré-tratamento do bagaço de cana a 190ºC, 15

min. Quantidades expressas em relação a 100 g de bagaço seco 51

Tabela 6: Balanço de massa do pré-tratamento do bagaço de cana a 190ºC,

15 min. Quantidades expressas em relação a 100 g de bagaço seco (SILVA,

1995) 52

Tabela 7. Composição do bagaço de cana pré-tratado a 190ºC por 15 min

comparada aos dados obtidos por SILVA (1995) 53

Tabela 8. Distribuição dos compostos identificados no hidrolisado do pré-

tratamento por explosão a vapor a 190ºC por 15 min. Quantidades expressas

em relação a 100 g de bagaço 54

Tabela 9. Tempos de retenção dos açúcares identificados no hidrolisado

hemicelulósico obtido por explosão a vapor (190ºC/15 min) analisado na coluna

Aminex HPX 42A d t · - d 1· A 56 , para a e ermmaçao e o 1gomeros ..

ii

Tabela 10. Cromatograma de uma amostra padrão contendo xilose, xilobiose e

xilotriose 57

Tabela 11. Tempos de retenção dos xilo-oligômeros obtidos por hidrólise de

xilana (25ºC/7min) e analisados na coluna Aminex HPX 42A 58

Tabela 12. Tempos de retenção dos gluco-oligômeros obtidos por hidrólise de

celulose (45ºC/7min) e analisados na coluna HPX 42A 59

Tabela 13. Rendimento das frações obtidas no procedimento de extração

líquido-líquido 68

Tabela 14. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados na

fração F O 1 71


fração F02 7 4


fração F03 77


fração F 04 80


fração FOS 83

Tabela 19. Quantidade total de cada composto identificado por GC/MS no

hidrolisado obtido do pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a

vapor. 88

ili LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura da celulose. Parte central da cadeia molecular (FENGEL e

WEGENER, 1989) 3

Figura 2. Fórmula dos açúcares presentes nas polioses (FENGEL e

WEGENER, 1989) 4

Figura 3. Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando

alguns grupos substituintes. Xyl = 1,4-0-xilopiranose; Ara = L-arabinofuranose;

(4-Me)-GlcA = ácido (4-0-metil)-D-glucopiranurônico; Ac = acetil; FA = ácido

ferúlico; DDFA = ácido desidroferúlico (McDOUGAL, 1993) .4

Figura 4. Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (1) álcool p-

cumárico; (li) álcool coniferílico; (Ili) álcool sinápico (FENGEL e WEGENER,

1989) 6

Figura 5. Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler

(FENGEL e WEGENER, 1989) 6

Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão das células de madeira

mostrando as camadas da parede celular: ML= lamela média, P= parede

primária, S1= parede secundária, S2= parede secundária, T= parede terciária e

W= camada de verrugas. (a) (Picea abies) (b) (Fagus sy/vatica) (FENGEL e

WEGENER 1989) 7

Figura 7: Corte ilustrativo do sistema de camadas na parede das células da

madeira (FENGEL e WEGENER, 1989) 7

Figura 8. Representação esquemática do processo de separação dos

componentes do bagaço de cana por explosão a vapor 34

iv

Figura 9. Representação esquemática do sistema de pré-tratamento de

materiais lignocelulósicos por explosão a vapor, em escala de bancada .40

Figura 10. Curva de calibração da coluna cromatográfica Asahipak-320H

eluída com água bidestilada a 1,0 mUmin 44

Figura 11. Representação esquemática do processo de extração do

hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana com diferentes solventes .47

Figura 12. Hidrolisado hemicelulósico obtido por explosão a vapor (190ºC/

15 min) analisado na coluna Aminex HPX 42A, para a determinação de

oligômeros 55

Figura 13. Cromatograma de uma amostra padrão contendo xilose, xilobiose e

xilotriose 56

Figura 14. Xilana hidrolisada com H2SQ4 72% a 25º C e analisada na coluna

Aminex HPX-42A, em um detector de Índice de Refração '. 57

Figura 15. Celulose hidrolisada com H2S04 72% a 45º C e analisada na coluna

Aminex HPX-42A, em um detector de indice de Refração 59

Figura 16. SEC da fração do hidrolisado filtrada somente em membrana, para

retirada de sólidos ;.61

Figura 17. SEC da fração do hidrolisado hemicelulósico filtrada em cartucho de

extração sólida Sep-Pak C18 61

Figura 18. SEC da fração do hidrolisado hemicelulósico retida em cartuchos de

extração sólida Sep-Pak C18 (Waters) e dessorvida com etanol 62

V

Figura 19. Espectro de infravermelho dos compostos presentes no hidrolisado

eluído em uma série de cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18. Espectro

obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da matéria orgânica presente no

hidrolisado liofilizado 63

Figura 20. Espectros FTIR de transmissão de Euca/yptus regnans e seus

componentes (MICHEL, 1988) 65


adsorvido em uma série de cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18,

dessorvido com etanol e concentrado a pressão reduzida. Espectro obtido a

partir de pastilhas de KBr com 0,5% da matéria orgânica presente no

hidrolisado adsorvido e seco 66

Figura 22. Espectro FTIR da lignina de bagaço de cana pré-tratado por

explosão a vapor e extraída com NaOH 1 % a 1 OOºC. Espectros tirados de

pastilhas de KBr com 0,5% de lignina (SILVA, 1995) 67

Figura 23. Cromatograma reconstituído (TIC) dos compostos presentes na

fração orgânica F01 após derivatização com BSTFA e detectados por

espectrometria de massas 70

Figura 24. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica F01

após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama

(FID) 70




vi



(FID) 73






(FID) 76






(FID) 79


fração orgânica FOS após derivatização com BSTFA e detectados por


Figura 32. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica FOS


(FID) 82

Figura 33. Cromatograma reconstituído (TIC) da fração orgânica 6 evaporada

a pressão reduzida e derivatizada com BSTFA. 85

vii

Figura 34. Espectro de infravermelho da fração fenólica F01 obtida por

extração com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana.

Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F01 86

Figura 35. Espectro de infravermelho da fração ácida F02 obtida por extração

com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Espectro

obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F02 86

Figura 36. Espectro de infravermelho da fração total F04 obtida por extração



Figura 37. Espectro de infravermelho da fração neutra F06 obtida por extração



viii Caracterização de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor: identificação de inibidores potenciais de processos fermentativos e enzimáticos. Hellen Cristiane Maciel Cunha. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Flávio Teixeira da Silva (CP 116, 12600000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. José Domingos Fontana e Dr. Adilson Roberto Gonçalves. Dezembro de 1999.

Resumo O pré-tratamento de bagaço de cana por explosão a vapor produz hidrolisados contendo polioses solúveis em H20, além de compostos inibidores de processos fermentativos e enzimáticos, tais como ácido acético e produtos de degradação de açúcares e lignina. Neste trabalho, o bagaço de cana foi pré- tratado a 190ºC por 15 min. O pré-tratamento solubilizou 34% do bagaço de cana. As frações obtidas (bagaço pré-tratado e hidrolisado hemicelulósico) foram caracterizadas quimicamente. Açúcares livres e seus oligômeros foram determinados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), em uma coluna Aminex HPX-87H e HPX-42A, respectivamente. Lignina e cinzas foram determinadas por gravimetria. A análise qualitativa do hidrolisado mostrou a presença de oligômeros de xilose com grau de polimerização variando de 2 a 6, com predominância de xilobiose e xilotriose. Os resultados de HPSEC mostraram que a massa molar média dos carboidratos presentes no hidrolisado foi menor que a dos compostos aromáticos. Tal resultado foi confirmado por CLAE e infravermelho, mostrando que na fração adsorvida em C18 houve a formação de complexo lignina-carboidrato. O uso de C18 foi efetivo para separar os compostos de baixa massa molar derivados da lignina e complexo lignina-carboidrato, mas ineficaz para identificação dos compostos de baixa massa molar por CG/MS. As frações orgânicas obtidas da extração líquido-líquido dos compostos presentes no hidrolisado foram analisadas por CG/MS e quantificadas por CG/FID. Nas frações ácidas (F02 e F03) foram identificados os ácidos trans-cumárico (4,01 % e 2,56%) e ferúlico (0,04% e 0,32%) como principais compostos, além dos ácidos p-hidroxibenzóico (0,05%), vanílico (0,01%), siríngico (0,39%) e cis-cumárico (0,51%), vanilina (0,40%) e siringaldeído (0,36%). Os produtos contidos nas frações fenólicas (F04 e F05} foram similares aos encontrados na fração ácida, sendo o ácido cumárico (0,05% e 2,99%) o principal produto, além dos ácidos ferúlico (O, 14% e 0,45%), p-hidroxibenzóico (0,06%), vanílico (0,67%), cis-cumárico (0,64%), p-hidroxibenzaldeído (1,5%) e siringaldeído (0,51 %). Na fração neutra (F06) nenhum composto foi identificado.

iv Characterization of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion: identification of potencial inhibitors for enzimatic and fermentative process. Hellen Cristiane Maciel Cunha. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Flávio Teixeira da Silva (CP 116, 12600000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. José Domingos Fontana e Dr. Adilson Roberto Gonçalves. Dezembro de 1999.

Abstract Sugarcane bagasse pretreatment by steam explosion produces hydrolysates containing polyoses soluble in H20, as well as compounds that are inhibitors of the fermentative and enzymatic processes, such as acetic acid and products of sugar and lignin degradation. ln this study, sugarcane bagasse was pretreated at 190ºC for 15 min. The pretreatment solubilized 28% of the sugarcane bagasse. The fractions obtained (pretreated bagasse and hemicellulosic hydrolysate) were chemically characterized. Free sugars and their oligomers were determined by HPLC in two Aminex columns: HPX-87H and HPX-42A, respectively. lignin and ashes were determined by gravimetry. The qualitativa analyses of the hydrolysate showed the presence of xylose oligomers with polimerization degrees ranging from 2 to 6, xylobiose and xylotriose being predominant. HPSEC results showed that the average molar mass of the carbohydrates present in the hydrolysate was smaller than that of the aromatic compounds. This was confirmed by HPLC and infrared, showing that in the fraction in C 18 these was the formation of lignin-carbohydrate complex. The use of C 18 was effective for separating the low molecular weight compounds derived from lignin and lignin-carbohydrate complex, but ineffective for identifying low molecular weight compounds by GC/MS. ln the acid fractions (F02 and F03), the coumaric acid (4.01% and 2.56%) and ferulic acid (0.04% and 0.32%) were identified as the main compounds, besides of them p- hydroxybenzoic acid (0.05%), vanilic acid (0.01%), siring acid (0.39%), eis- coumaric acid (0.51 %), vanilin (0.4%) and syringealdehyde (0.36%). The products contained in the phenolic fractions were similar to those found in the acid fraction, the coumaric acid (0.05% and 2.99%) being the main product, besides of them ferulic acid (0.14% and 0.45%), p-hydroxybenzoic acid (0.06%), vanilic acid (0.67%), cis-coumaric acid (0.64%), p- hydroxybenzaldehyde (1.5%) and syringealdehyde (0.51 %). ln the neutral fraction no compound was identified.

1. INTRODUÇÃO

1.1. ASPECTOS GERAIS

O bagaço de cana é freqüentemente citado na literatura como um

material lignocelulósico promissor para a obtenção de açúcares, que podem

ser transformados em etanol ou outros compostos químicos (SASKA E OZER, 1995).

A cana-de-açúcar, uma gramínea pertencente ao gênero Saccharum, é

originária da Índia. Com o decorrer do tempo, sua cultura expandiu-se por

várias regiões do mundo e foi introduzida no Brasil logo após seu

descobrimento (PAIVA, 1980).

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) cresce na maioria dos países

tropicais e subtropicais e é usada principalmente para a obtenção de açúcar e

álcool. Após sua moagem, o principal subproduto é o bagaço, que representa

de 12% a 14% da massa seca da cana (ICIDCA, 1987).

Em 1998 foram produzidas no Brasil 287 milhões de toneladas de cana

de açúcar, que foram convertidos em açúcar e álcool, gerando quantidades

superiores a 40 milhões de toneladas de bagaço (MA TIOLI et ai., 1998). Esse

bagaço tem sido utilizado principalmente para geração de vapor e energia, que

são consumidos nas próprias usinas (ARMAS e BIANCHI, 1990). Mesmo

assim, é produzido um grande excedente. Estima-se que é gerado um excesso

de cerca de 1 milhão tonlano, que causa sérios problemas de estocagem e

impacto ao meio ambiente.

Entretanto, o preço do bagaço de cana é baixo e pode ser aproveit_ado

para fins mais nobres, pois é uma fonte abundante de carboidratos com um alto

potencial para ser hidrolisado e fermentado a etanol (MARTIN et ai., 1999). Em

muitos países do mundo, inclusive no Brasil, o bagaço já está sendo usado na

produção de polpa celulósica, papel e papelão (ATCHISON,1993).

MARTIN et ai. (1999) estimaram que as usinas de açúcar e álcool podem

liberar de 30% a 50% do bagaço produzido para usos alternativos, com a

produção de compostos de maior valor econômico, empregando-se a

2

tecnologia já existente (CASTRO et ai., 1995; DESCHAMPS et ai., 1996;

LACORTE et ai .. 1986).

1.2. CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS MATERIAIS

LIGNOCELULÔSICOS

A dificuldade de se converter o bagaço de cana e outros materiais

lignocelulósicos em insumos químicos é atribuída às suas características

químicas e morfológicas. Esses materiais são um compósito de microfibrilas de

celulose envolvidas em uma matriz amorfa de polioses e lignina. Esta matriz

amorfa age como uma barreira natural ao ataque de microrganismos e/ou

enzimas e torna esses materiais estruturalmente rígidos e poucos reativos

(FENGEL e WEGENER, 1989).

A compreensão da complexidade estrutural e da reatividade dos

materiais lignocelulósicos requer o conhecimento das características e das

propriedades de cada um de seus componentes.

1.2.1. CELULOSE

A celulose é um polímero linear de subunidades de glicose associadas

por ligações J3-(1-A), sendo a celobiose a unidade repetitiva do polímero

(figura 1 ). As cadeias de celulose se encontram agregadas paralelamente para

formar as fibrilas elementares, que são insolúveis em água e apresentam

regiões cristalinas e amorfas (FENGEL e WEGENER, 1989; PARHAM, 1993).

As pontes de hidrogênio inter- e intramolecular são responsáveis pela

manutenção das regiões cristalinas, e tornam a celulose altamente resistente à

hidrólise ácida, alcalina ou enzimática (WOOD e SADDLER, 1988; CONVERSE

e WARE, 1994).

3

H 00 ?°'2~ H 00

'0J,;-~,t-~:'-(º~c1 Hl~o./"''~ H~O.,/\

HOH ~~ Hai ~~

lndade de Celobiose ---

Figura 1. Estrutura da celulose. Parte central da cadeia molecular (FENGEL e

WEGENER, 1989).

1.2.2. POLIOSES

As polioses diferem substancialmente da celulose por serem amorfas,

com estrutura ramificada e compostas pela combinação de vários açúcares

(pentases, hexases, ácidos hexurônicos e deoxiexoses) (figura 2) (PARHAM,

1993; FENGEL e WEGENER, 1989). As polioses são classificadas

basicamente de acordo com os açúcares presentes na cadeia principal do

polímero: xilanas, glucomananas e galactanas.

A cadeia principal pode ser um homopolímero, como no caso das

xilanas, ou um heteropolímero, como no caso das glucomananas e podem

apresentar arabinose, galactose, ácido 4-0-metilglucurônico e grupos acetil

ligados à cadeia principal. As madeiras moles apresentam maior proporção de

galactogluco-mananas do que de xilanas, enquanto as madeiras duras são

mais ricas em xilanas (PARHAM, 1993). A composição de xilanas de

gramíneas foi estudada por vários autores, entre eles por McDOUGALL et ai.

(1993). A representação esquemática de uma xilana típica de gramíneas está representada na figura 3.

4

Pentases Hexases Acides Hexurõnicos

Deoxi-hexoses

~OH

p- D - Xilose

~VOH

Ho"~ HO~OH CH3

H H

p-D -Glicose

HOQOH OH

H

a-L -Arabinopiranose p-D-Manose ácido a-D-4-0-Metilglucurônico a-L-Fucose

"º",º~~ ~q. ~~ a-L -Arabinofuranose a-D -Galactose ácido a-D -Oalacturônico

Figura 2. Fórmula dos açúcares presentes nas polioses (FENGEL e

WEGENER, 1989).

(4-M e )-G lcA (4-M e )-G lcA Ac 1 Ac Ac 1 Ac

I ai 1 1 ai I 2 2 3 3 2 2

-Xyl -p -Xyl- p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl- p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl- p -Xyl- 3 3 3 3 3

ai Llgnina1 af ai ai ai 1 1 1 1 1

Ara D-Ara Ara D-Ara Llgnlna -FA-Ara

D I D F Ac F

FA -Ara A-Ara A-Ara Ara 1 1 1 1

ai ai ai ai 3 3 3 3

-Xyl-p-Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p-Xyl-p-Xyl-p-Xyl- p-Xyl-p-Xyl-p-Xyl-p-Xyl-p -Xyl- 2 3 3 2 2 1 1 1 ai ai

Ac Ac Ac 1 Ac (4-Me)-GlcA

Figura 3. Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando

alguns grupos substituintes. Xyl = 1,4-D-xilopiranose; Ara = L-arabinofuranose;

(4-Me)-GlcA = ácido (4-0-metil)-D-glucopiranurônico; Ac = acetil; FA = ácido

ferúlico; DDFA = ácido desidroferúlico (McDOUGALL, 1993).

5

1.2.3. LIGNINA

Depois da celulose, a lignina é a macromolécula orgânica mais

importante e abundante do reino vegetal. A lignina aumenta a resistência

mecânica das plantas, de tal forma que árvores de mais de cem metros podem

se manter em pé (FENGEL e WEGENER, 1989).

A lignina é uma macromolécula altamente complexa e ramificada,

gerada pela polimerização desidrogenativa dos álcoois hidroxicinamílicos: p-

cumarílico (1), coniferílico (li) e sinapílico (Ili) (figura 4). A lignina é

principalmente constituída de unidades fenilpropano associadas por ligações

estáveis do tipo C-C, aril-éter e aril-aril, sendo as mais abundantes ~-(O-A) e

a-(0--A) (40-60%), ~-5 (10%), ~-1 (5-10%), 5-5 (10%), ~-~ (5%) e 4-0~5

(5%) (HIGUCHI, 1985). Um modelo proposto para a estrutura da lignina de

abeto é mostrado na figura 5.

1.2.4. ESTRUTURA DO TECIDO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS E

A ASSOCIAÇÃO ENTRE CELULOSE, POLIOSES E LIGNINA

Na parede celular vegetal, celulose, polioses e lignina, organizam-se

formando diferentes camadas (figura 6): parede primária (P), secundária (5) e

terciária (T). As diferentes células encontram-se separadas pela lamela média

(ML), que é uma camada fina que mantém as células coesas e é responsável

pela integridade estrutural do tecido das plantas. A parede primária (P) é a

camada mais fina da parede celular e a primeira a ser depositada nas células.

Do lado de dentro da parede primária é formada a parede secundária, em uma

seqüência de três lamelas, 51, 52 e 53(ou T). Nestas regiões as microfibrilas de

celulose possuem distintas orientações com respeito ao eixo longitudinal da

célula. A parede mais espessa é a 52, na qual as microfibrilas de celulose se

encontram orientadas de forma quase paralela ao eixo axial da célula. As

fibrilas de celulose próximas ao lúmen da célula compreendem a camada

terciária e estão orientadas quase perpendicularmente ao eixo da célula.

6

CH:zOH CH20H Cf'20H 1 1 1 CH CH CH li li li CH CH

* ~ ~OCH3 u3co oca, OH OH OH

1 II III álcool p-cumaríllco álcool conlferíllco álcool slnapíllco

Figura 4. Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (1) álcool p-

cumarílico; (li) álcool coniferílico; (Ili) álcool sinapílico (FENGEL e WEGENER,

1989).

H2COH Y !

HC-o- l3 1

HCOH

HCOJ@ 3 1

HOCH~ 1 4

HC-----0 1

HCOH C=O 1 1

H3CO~OCH3 OH OH

[o e]

Figura 5. Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler

(FENGEL e WEGENER, 1989).

7

Na parede celular, as fibrilas elementares estão separadas umas das

outras por uma camada de polioses, formando as microfibrilas, que são

envolvidas em uma matriz de lignina, formando a parede celular (FENGEL e

WEGENER, 1989).

A maior quantidade de lignina é encontrada na camada 82, porém se

apresenta em concentração mais elevada na lamela média. A figura 7

apresenta um modelo da construção da parede celular dos materiais

lignocelulósicos, ilustrando a descrição acima.

Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão das células de madeira

mostrando as camadas da parede celular: ML= lamela média, P= parede

primária, 81= parede secundária 1, 82= parede secundária 2, T= parede

terciária e W= camada de verrugas. (a) (Picea abies) (b) (Fagus sy/vatica)

(FENGEL e WEGENER 1989).

Figura 7: Corte ilustrativo do sistema de camadas na parede das células da madeira (FENGEL e WEGENER, 1989).

8

1.3. SEPARAÇÃO DOS COMPONENTES DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

Para se obter uma conversão simples e efetiva dos três pnnctpars

componentes dos materiais lignocelulósicos (celulose, polioses e lignina) em

produtos de maior econômico, é necessário a separação seletiva dos mesmos.

Há, portanto, a necessidade de se romper o complexo lignina-celulose-poliose

e remover cada fração por técnicas de pré-tratamento e deslignificação (SILVA,

1995).

Várias técnicas de pré-tratamento baseadas na combinação de

processos mecânicos, físicos, químicos e biológicos estão associadas aos

processos de separação e aproveitamento desses componentes (FERRAZ et ai., 1996; McMILLAN, 1994a). Nestas, inclui-se o emprego de álcalí, hidrólise

ácida, explosão a vapor e uso de fluídos supercríticos, todas usadas ou

propostas com o objetivo de produzir combustíveis renováveis e insumos

químicos a partir de biomassa (McMILLAN, 1994a).

A tendência atual está baseada no desenvolvimento e no estudo de

processos para o .aproveitamento integral dos materiais lignocelulósicos

(SILVA, 1995). A produção, prtncipalmente de etanol, através da fermentação

de açúcares obtidos a partir desses materiais, tem sido sistematicamente

estudada (CLARK e MACKIE, 1984; DELGENES, et ai., 1996; HAHN-

HÃGERDAL et ai., 1991; HAHN-HÃGERDAL, 1996; MARTÍN et ai., 1995;

McMILLAN, 1994a;b; PALMQVIST, et ai., 1996a;b; 1997; PFEIFER et ai., 1984;

PRIOR et ai., 1989; RIVARD et ai., 1996; WILSON et ai., 1989). Uma das

vantagens do uso etanol como combustível, por exemplo, é que o dióxido de

carbono produzido não representa um acréscimo de C02 na atmosfera, como

no caso da combustão dos compostos fósseis.

A utilização dos materiais lignocelulósicos requer que o processo de pré-

tratamento proporcione um fracionamento completo ou parcial da biomassa,

como por exemplo, nos processos usados nas indústrias de papel e celulose

(HAHN-HÃGERDAL et ai., 1991 ). O pré-tratamento deve ser eficiente do ponto

de vista energético e químico, para que o processo seja economicamente

vantajoso e deve promover ou proporcionar a conversão efetiva dos

carboidratos a açúcares fermentáveis, para se obter o produto final com alto

9

rendimento. Logo, a degradação ou a perda de carboidratos devem ser

evitadas, bem como a formação de compostos inibidores do metabolismo

celular ou da ação de enzimas usadas nos processos de conversão da

biomassa (McMILLAN, 1994a).

O processo de explosão a vapor tem sido considerado um processo

viável no pré-tratamento de biomassa para a produção econômica de insumos

químicos, combustível, alimentos e polímeros. A explosão a vapor permite a

recuperação de grande parte dos componentes dos materiais lignocelulósicos,

minimizando a sua degradação (AVELLAR e GLASSER, 1998). Além disso, é

uma técnica que tem sido proposta como uma possível alternativa para o

tratamento termo-mecânico dos materiais lignocelulósicos (FOCHER et ai.,

1998).

No processo de explosão a vapor, os materiais lignocelulósicos sofrem

inicialmente reações de hidrólise (EXCOFFIER et ai., 1991; LORA e WAYMAN,

1978). As ligações poliose-lignina são clivadas, solubilizando as polioses e

parte da lignina (AVELLAR e GLASSER, 1998). A ruptura das ligações ~-

(1-+4) entre as unidades de xilose da cadeia principal do polímero com adição

de uma molécula de água (FENGEL E WEGENER, 1989), produzem xilose

livre (equação 1) e seus oligômeros (equação 2) (SADDLER et ai., 1993).

A arabinose é formada pela hidrólise das ligações a-(1~3) (equação 3),

formada entre uma unidade de arabinose e a cadeia principal da xilana (figura

3).

H20,H+

e/ou CALOR ... ~

H

OH OH

+

equação 1

10

CO OH

~

"·: 0~H -<E(º H -Ac

--- o ~ H

equação 2

OH HO",C... r-lH

'Q~A o OH

+ C':OOH

OH OH

OH OH

equação 3

Essas reações de hidrólise são catalisadas pela presença do ácido

acético liberado das reações de hidrólise dos grupos acetil (BOUCHARD et ai.,

1990 e 1991; FOCHER et ai., 1998; SADDLER et ai., 1983; MARTÍN et ai.,

1995), que encontram-se ligados aos átomos de carbono C2 e C3 das unidades

de xilose da cadeia principal da xilana (equação 4) (figura 3).

11

OH COOH

",~ OOCCH3

~º •'6-oç• ! H20, H+

e/ou CALOR

+ ~º'6-oÇ• OH COOH

_"·-~4à~ OH

+ HOOCCH3

equação 4

A presença de furfural deve-se às reações de desidratação das

pentasanas ( arabinose I xilose) hidrolisadas durante o pré-tratamento ( equação

5) (SILVA, 1995; PALMQVIST, 1996b). Entretanto, devido à instabilidade do

furfural, este tende a sofrer polimerização, formando compostos não

identificados (equação 6). Da mesma forma, parte da glicose formada sofre

desidratação para hidroximetilfurfural ( equação 7), que por sua vez também é

degradado a compostos não identificados ( equação 8 ).

equação 5

12

~HO o -~~:~~0~'ºR~u-·~ COMPOSTOS NÃO IDENTIFICADOS

equação 6

OH

equação 7

ÍQ1 ~~~ .... COMPOSTOS NÃO IDENTIFICADOS HOH2C~~~CHO

equação 8

Com o decorrer da hidrólise das polioses, há o aumento da

susceptibilidade da celulose, que sofre hidrólise das ligações glicosídicas,

principalmente da fração amorfa, para formar glicose ( equação 9) e oligômeros

(equação 10).

~o.w fk-ºv) .... cdlt n ~ º"

equação 9

HOH C H20 H+ ç OH HOH ' ~ O O 2

e/ou CALOR " ~" + ~ ... H~c ~

equação 10

13

Paralelamente às reações de hidrólise, desidratação e degradação dos

carboidratos, ocorrem também as reações de hidrólise da lignina,

principalmente sobre as ligações a-(0~) e J3-(0~), com a formação de

compostos de baixa massa molar ( equação 11 ). Essas reações ocorrem ainda

concomitantemente às reações de condensação da lignina (equação 12).

\ LIGt-.lNA

HC"H ~ 2 l B)CO ~OCH)

"'T~CHJ HCI o

acl ' º~ o-cu CH1 ~

* HzCO.H ~ I oca, se-o

U3CC o e as

- --

equação 11

As polioses e a celulose degradam-se através da hidrólise das ligações

glicosídicas, enquanto a lignina degrada-se através de reações que alguns

autores afirmam ser de natureza radicalar (FOCHER et ai., 1998; TANAHASHI

et ai., 1989; 1990), enquanto outros postulam que a lignina degrada-se através

de reações de hidrólise (MICHALOWICZ et ai., 1991; AVELLAR e GLASSER,

1998; EXCOFFIER et ai., 1991 ).

14

K,COH - 1 o R: -- -rn, Rz<X>H f f & li:: clt

l * L k l~" r,s º'" 'l •oo .:: ® ca, H <X> li:: .\.:./. O -c!H ~

' -& CH, ~ n,l~oce,

* ff:,COH Q li:: o O

11::1_ ca, s::bt octt,-

11,co H, *11

; H,<X> Clfi LIGNINA O

\ LIGNINA

+ PRODUTOS DA DECOMPOSIÇÃO DOS AÇÚCARES

H+ E/OU CALOR

PRODUTOS DE CONDENSAÇÃO

equação 12

As reações citadas anteriormente são interrompidas pela

descompressão súbita do reator. Neste momento, o material é desfibrado e

reduzido a partículas menores, devido às forças de cisalhamento do processo.

(BARNET et ai., 1989; MICHALOWICZ et ai., 1991; AVELLAR e GLASSER,

1998; EXCOFFIER et ai., 1991; GLASSER e WRIGHT, 1998; MARTÍN et ai., 1995).

Enquanto o efeito térmico da explosão a vapor causa variações

estruturais nos componentes dos materiais lignocelulósicos, o efeito mecânico,

devido à expansão adiabática da água presente nos poros do material, provoca

variações a níveis morfológicos, aumentando a acessibilidade e a área

superficial do material (FOCHER et ai., 1998). Ocorrem mudanças na

macroestrutura (tamanho das partículas) e na microestrutura (distribuição dos

poros) desses materiais. A macroestrutura é modificada em função do

desfibramento, que reduz o tamanho das partículas e a microestrutura em

função do tratamento com vapor, que causa a abertura de microporos (SILVA,

15

1995). Esse fato facilita a ação posterior de reagentes químicos e: de enzimas

para a hidrólise enzimática da celulose (MICHALOWICZ et ai., 1991).

Em geral, tanto a velocidade quanto a extensão da hidrólise enzimática

dos materiais pré-tratados aumentam com o aumento do tempo de duração do ,· .•. ~

pré-tratamento. Isto, porém, só é verdade quando a sacarificação enzimática se

processa sobre o material pré-tratado e lavado. A biomassa pré-tratada bruta

contém produtos de degradação que são inibidores das enzimas e que devem

ser removidos antes da hidrólise enzimática e subseqüente fermentação.

Assim, embora a extensão e a velocidade de hidrólise enzimática dos sólidos

pré-tratados e lavados aumente com a severidade do tratamento, o rendimento

de sacarificação global pode cair devido à remoção dos açúcares solubilizados

na lavagem, como os provenientes da hidrólise das polioses (McMILLAN,

1994a).

O rendimento total de carboidratos é o fator mais importante nos

processos de conversão de biomassa em escala comercial. Estudos para

melhorar os processos de pré-tratamento devem ser direcionados para

minimizar ou eliminar os produtos de degradação dos carboidratos presentes

na biomassa, bem como os derivados da degradação da lignina e dos

extrativos. Os extrativos consistem em um grande número de compostos que

podem ser extraídos da madeira por solventes polares e apoiares. A

concentração desses compostos são maiores em certas regiões das árvores,

como nos galhos, raízes e cascas (FENGEL e WEGENER, 1989).

1.4. INIBIDORES PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÔSICO

Hidrolisados hemicelulósicos provenientes do tratamento de biomassa

por explosão a vapor contêm carboidratos como principais produtos.

Entretanto, esses açúcares são contaminados com pequenas quantidades de

uma grande variedade de outros compostos, que inibem a fermentação e o

crescimento de microrganismos. Esses inibidores podem ser divididos em

grupos, em função de sua origem (FENSKE, 1998, HAHN-HAGERDAHL, 1996, McMILLAN, 1994b):

16

( 1) Compostos liberados durante o pré-tratamento. Ex: ácido acético;

(2) Produtos de degradação dos açúcares. Ex: furfural e

hidroximetilfurfural;

(3) Produtos de degradação da lignina. Ex: siringaldeído e vanilina;

(4) Íons metálicos liberados pela corrosão dos equipamentos usados no

processo. Ex: crômio, ferro, etc.;

(5) Produtos de fermentação. Ex: etanol e subprodutos, como ácido

acético, acetaldeído, ácido fórmico e ácido lático.

A identificação e quantificação dos inibidores potenciais dos processos

fermentativos e de sacarificação enzimática podem auxiliar na escolha do

processo ou das condições de pré-tratamento mais apropriadas para um dado

material lignocelulósico (PALMQVIST et ai., 1996a;b). Há uma relação entre a

concentração desses compostos e o efeito inibitório que estes causam no meio

fermentativo.

A presença de compostos inibidores da ação de microrganismos nos

processos de bioconversão dos componentes de madeira pré-tratada com

vapor tem sido relatada por vários autores (ANDO et ai., 1986; MES-HARTREE

e SADDLER, 1983). Geralmente, estes inibidores são compostos de baixa

massa molar, solúveis em água e incluem ácido acético (1), derivados de

açúcares e produtos de degradação da lignina (PULS et ai., 1985; SILVA,

1995). A natureza e a concentração desses inibidores variam com as

condições de pré-tratamento e com a matéria-prima usada. O ácido acético (1)

é liberado durante o pré-tratamento através da hidrólise dos grupos acetil

presentes nas polioses de madeiras duras e gramíneas; o furfural (2) e o

hidroximetilfurfural (3) são formados pela desidratação das pentases e

hexases, produzidas na hidrólise das polioses e da celulose, respectivamente;

e os produtos de degradação da lignina incluem uma grande variedade de

compostos aromáticos, que serão mostrados ao longo deste trabalho.

2

HJC-COOH 1

17

SINEIRO et ai. (1997) reportaram a inibição da atividade de celulases de

Trichoderma reesei por compostos fenólicos, na extração aquosa de óleo de

girassol. O ácido clorogênico (4), testado a concentrações que variaram de

1,20 mM a 4,50 mM, foi o composto que apresentou a menor capacidade

inibitória, seguida pelos ácidos caféico (5) (0,22 mM - 0,70 mM), ferúlico (6)

(0,58 mM- 2,00 mM) e sinápico (7) (0,83 mM - 1,64 mM). Nas concentrações

testadas, a inibição causada pelos ácidos sinápico (7) e ferúlico (6) foi 100 e 1 O vezes maior do que a do ácido clorogênico (4), respectivamente. A inibição

causada por fenóis e polifenóis foi muito maior que a causada pela glicose,

pelo etanol e mesmo pela celobiose, que é considerada um· inibidor forte de

celulases em processos de sacarificação enzimática. O ácido sinápico (7), por

exemplo, apresentou um poder inibitório 1000 vezes maior do que a celobiose

(HOLTZAPPLE et ai., 1990; SINEIRO et ai., 1997).

CHCOOH li H

: ~-- OH

OH

5

COOH

1 ílH CH

~OCTD OH

6

COOH 1 CH li CH

H3CO~OCH3 OH 7

EXCOFFIER et ai. (1991) mostraram que as reações de sacarificação

enzimática de madeira de álamo pré-tratada por explosão a vapor (20-50 bar e

210-260ºC, usando H2S04 0,4% (massa /massa do substrato)) são afetadas

pela inativação das celulases causada por lignina e fenóis solúveis em água. O

rendimento da hidrólise de celulose cristalina por celulases de Trichoderma

18

reesei foi reduzido em até 24% na presença de lignina. Adicionalmente, esses

autores demonstraram a adsorsão e a inativação de endo-1,4-f3-glucosidases

por ligninas. Eles também isolaram e estudaram a ação sobre a atividade das

celulases de ácidos triidroxibutíricos (THBA) (8) e fenóis formados durante o

processo de pré-tratamento. Os resultados mostraram uma diminuição no

rendimento de glicose, o que pode ser explicado pela inibição das f3- glucosidases pelos fenóis e pelos THBA, mesmo em baixas concentrações. Os

THBA podem formar lactonas em soluções aquosas, cuja ação inibitória sobre

as reações de sacarificação enzimática de substratos lignocelulósicos já foi

descrita por DEKKER (1986).

C3H4(0H)3COOH

8

MES-HARTREE e SADDLER (1983) estudaram o efeito de inibidores

produzidos no pré-tratamento por explosão a vapor sobre a hidrólise enzimática

de celulose usando celulases de Trichoderrna harzianum. Como substrato,

usaram palha de trigo e madeira de álamo. A sacarificação enzimática da

celulose presente nos substratos pré-tratados a 250°C por 20 s com e sem a

impregnação dos cavacos com H2S04 só foi eficiente após a remoção dos

compostos de baixa massa molar, através da lavagem dos substratos com

água.

Furfural (2) e hidroximetilfurfural (3) foram durante muito tempo

considerados os principais inibidores produzidos durante o pré-tratamento de

lignocelulósicos. MES-HARTREE e SADDLER (1983) testaram esses

compostos nas concentrações normalmente encontradas nos hidrolisados:

0, 1 g/L - 0,5 g/L em hidrolisado de palha de trigo e 0,01 g/L - 0,05 g/L em

hidrolisado de madeira de álamo e não constataram a inibição das reações de

sacarificação. Testaram também xilana e xilose nos níveis produzidos durante

hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos. Nenhum efeito inibitório foi

constatado. Aparentemente as xilanas foram usadas em parte como substrato

para enzimas hemicelulolíticas presentes nos extratos enzimáticos. Por outro

lado, a adição suplementar do extrato aquoso, isolado do hidrolisado, no

substrato das reações de sacarificação, reduziu drasticamente a produção de

19

glicose, sem afetar significativamente a quantidade de açúcares redutores

totais, o que indica inibição das ~-glucosidases.

PALMQVIST et ai. (1996a) estudaram o efeito inibitório de compostos

solúveis em água sobre a hidrólise enzimática e a fermentação para etanol da

madeira de salgueiro, pré-tratada com vapor, na presença de 802 a 205ºC por

6 min. Os sólidos foram separados do hidrolisado por filtração. O filtrado foi

fracionado por destilação a vácuo para render duas frações, uma de voláteis e

outra de não voláteis, que foram usadas para a determinação do potencial

inibitório dos compostos presentes em cada fração. Os resultados mostraram

que os compostos voláteis não afetaram nem a hidrólise enzimática nem a

fermentação subsequente da glicose para etanol. Por outro lado, a fração do

hidrolisado contendo os compostos não voláteis afetou não só a sacarificação,

mas também a fermentação de glicose usando Saccharomyces cerevisiae.

A susceptibilidade de diferentes microrganismos a um mesmo

hidrolisado contendo inibidores de fermentação foi estudado por BUCHERT et

at. (1988; 1989). Em um desses trabalhos, madeira de bétula foi pré-tratada à 200ºC por 15 min (BUCHERT et at., 1989). Uma parte do extrato aquoso foi

pós-hidrolisado por enzimas de Tricoderma reesei e outra por ácido sulfúrico.

Xilose pura e os pós-hidrolisados foram usados como substrato para a

produção de ácido xilônico (9), etanol e proteína unicelular por Gluconobacter

oxydans, Fusarium oxysporum e Candida utilis, respectivamente. Todos os

microrganismos fermentaram eficientemente xilose pura. Entretanto, quando os

pós-hidrolisados foram usados como fonte de carbono, a fermentescibilidade

foi sofrível. Candida uti/is apresentou tolerância aos inibidores nos

experimentos contendo xilose a concentrações de até 20 g L-1. Por outro lado,

Fusarium oxysporum e Gluconobacter oxydans sofreram forte inibição por parte

dos compostos presentes nos dois hidrolisados. Além disso, a inibição variou

de um microrganismo para outro em função da concentração de inibidores no

hidrolisado. Apesar de terem sido identificados vanilina (10), siringaldeído (11), álcool coniferílico (12), álcool sinapílico (13), furfural (2), hidroximetilfurfural (3)

e alguns ácidos orgânicos nos hidrolisados, nenhum teste de toxicidade foi

efetuado com esses compostos purificados.

20

COOH

1 HC-OH

1 HO-CH

1 HC-oH

1 H2C-OH

9

~ lliC040Clli OH OH 10 11

CH20H

1 CH

li H

CH3 H3CO

12 OH

13

Os processos fermentativos são mais sensíveis aos inibidores do que os

processos de sacarificação enzimática. Em um artigo sobre a fermentação de

D-xilose a etanol por Candida shehatae e Pichia stipitis, PRIOR et ai. (1989)

relacionaram a eficiência das fermentações a fatores nutricionais, temperatura,

pH, concentração de substrato e produto, presença de outros açúcares,

demanda de oxigênio e compostos tóxicos presentes em hidrolisados

hemicelulósicos. Mostraram, por exemplo, que para diferentes cepas de uma

mesma levedura, açúcares outros que a D-xilose, como D-galactose, D-

celobiose, L-arabinose, D-glucose e D-manose, podem funcionar tanto como

co-substratos quanto inibidores. Entretanto, segundo ANDO et ai. (1986) e

McMILLAN (1994b), os maiores problemas dessas fermentações são causados

por outros compostos presentes nos hidrolisados, tais como, ácido acético (1),

furfural (2), hidroximetilfurfural (3) e ácidos, álcoois e cetonas derivados de

lignina, que inibem a fermentação por leveduras.

A forma de ação de alguns inibidores tem sido descrita na literatura.

WEIGERT et ai. (1988), citado em PRIOR et ai. (1989), descobriu que furfural

21

(2) inibiu diretamente a respiração e o crescimento de P. stipitis e foi

imediatamente reduzido a álcool furfurílico (14), o qual também diminuiu a

velocidade da produção de etanol .

14

O ácido acético (1) é, em geral, um inibidor de leveduras e o seu grau

de toxicidade é dependente do pH (HERRERO et ai., 1985), mesmo para

microrganismos modificados geneticamente (LAWFORD e ROUSSEAU,

1993a).

A forma de ação de outros inibidores, diferentes dos compostos

furânicos e ácido acético (1), tem sido pouco descrita na literatura. Entretanto,

alguns autores têm estudado de forma sistemática a ação de alguns compostos

aromáticos derivados da lignin~ (ANDO et ai., 1986; BUCHERT et ai., 1988,

1989; CLARK e MACKIE, 1984; DELGENES et ai., 1996; NISHIKAWA et ai.,

1988;. PFEIFER et ai., 1984; TRAN e CHAMBERS, 1986a,b ).

TRAN e CHAMBERS (1985) investigaram a fermentescibilidade, por

Pichia stipitis, de hidrolisados de xilose produzidos no pré-tratamento de

madeira de carvalho na presença de H2S04. Identificaram e examinaram o

efeito inibitório de compostos modelo derivados das polioses, lignina e

extrativos dessa madeira. Foram identificados e quantificados no hidrolisado,

vanilina (10)-, siringaldeído (11); ácido vanílico (15), álcool coniferílico (12),

ácido siríngico (1&); aldeído sinapíiico (17); álcool diidroconiferílico (18),

siringilmetilcetona (19), álcool diidrosinapHico (20) e álcool f3-oxisinapílico (21),

todos derivados da lignina. Dos extrativos foram identificados os ácidos

capróico (22), pelargônico (23), caprílico (24) e palmítico (24): Além desses

compostos, o hidrolisado continha outros não identificados.

Cada um desses compostos foram misturados a soluções contendo

50 g/L de xilose e nutrientes (como controle) antes da esterilização e

fermentação. Os resultados da inibição por esses compostos podem ser vistos

na tabela 1.

- --

22

Tabela 1. Concentração de alguns compostos identificados no hidrolisado de

carvalho vermelho e seus efeitos inibitórios na subseqüente fermentação de

xilose a etanol (TRAN e CHAMBERS, 1985).

Composto [ ] (gil) Etanol (gil)

Controle 22,3

Furfural 1,32 20,2

Ácido acético 12,14 5,4

Vanilina 0,086 10,2

Siringaldeído 0,213 6,2

Ácido vanílico 0,084 16,7

Ácido siríngico 0,092 19,9

Ácido capróico 0,022 19,4

Ácido caprílico 0,019 18,3

Ácido pelargônico 0,014 17,4

Ácido palmítico 0,016 21,9

Os resultados mostraram que o furfural (2) foi mais inibitório que o ácido

acético (1). Dos modelos de lignina, siringaldeído (11) foi menos tóxico que

vanilina (10) e ácido siríngico (16) menos tóxico que o ácido vanílico (15). O

efeito inibitório em ordem decrescente foi: vanilina > siringaldeído > ácido

vanílico > ácido siríngico. Isto significa que os ácidos aromáticos foram menos

tóxicos que os aldeídos e que um grupo metoxílico adicional reduziu a

toxicidade dos derivados da lignina. Entre os extrativos, os ácidos caproíco

(22), caprílico (24) e pelargônico (23) foram mais inibitórios do que o ácido

palmítico (25). O efeito inibitório em ordem decrescente foi: ácido pelargônico >

ácido caprílico > ácido capróico > ácido palmítico. Esses resultados mostram

que o aumento de tamanho das moléculas é inversamente proporcional ao

efeito inibitório. Esses compostos modelo foram testados a concentrações

similares às encontradas no hidrolisado de carvalho e o estudo sugeriu que os efeitos inibitórios seriam cumulativos.

23

COOH

~ OH

15

COOH

CHO 1 CH li CH

H3CO~OCH3 OH

17

OH

16

H2IOH CH

ijH

":rrb r----Y'ocH3 H O

OH 18

HÍOH

CH

~H

H:r CH20 6 ~OCH3

----o CH3-(CH2)4-COOH

22

20

CH3-(CH2)7-COOH 23

OH

CH3-(CH2 )6-COOH

24

CH3-(CH2)14-COOH 25

Em outro trabalho, TRAN e CHAMBERS (1986b) estudaram a

fermentescibilidade de manose para butanodiol por Klebsiella pneumoniae,

além de identificar e examinar o efeito inibitório dos derivados de lignina e dos

extrativos de madeira de pinho pré-tratada com vapor e ácido sulfúrico. Foram

testados como compostos modelo derivados de lignina: vanilina (10), ácido

vanílico (15), ácido p-hidroxibenzóico (26), ácido protocatecóico (27) e

24

protocatecoldeído (28), álcool coniferílico (12) e álcool diidroconiferílico (18);

como modelos dos extrativos: campesterol (29), a-pineno (30), 0-limoneno

(31 ), bomeol (32), pirogalol (33), p-sitosterol (34), estigmastanol (35) e os

ácidos linoleico (36), abiético (37) e palmítico (25). Todos os compostos

modelo derivados de lignina exibiram efeito inibitório sobre a fermentação de

manose. Os ácidos protocatecóico (27) e p-hidroxibenzóico (26) foram os mais

tóxicos. A vanilina (10) apresentou a menor toxicidade e a ordem decrescente

do efeito inibitório foi: ácido p-hidroxibenzóico > ácido protocatecóico > álcool

coniferílico >protocatecaldeído »ácído vanílico >álcool diidroconiferílico >

vanilina. A combinação de todos os compostos modelo causou toxicidade

cumulativa sobre a fermentação de manose a butanodiol. A toxicidade dos

compostos modelo dos extrativos decresceu na seguinte ordem: esteróis >

resinas ácidas > ácidos graxos > monoterpenos > álcoois mono- ou

triterpênicos. Para os compostos em específico a ordem foi: ácido linoléico > 13- sitosterol > ácido abiético > 0-limoneno > a-pineno > campesterol > ácido

palmítico > bomeol > estigmastanol > pirogalol. A comparação dos resultados

mostrou ainda que os derivados da lignina foram mais tóxicos do que os

extrativos.

COOH COOH

~

CH3

OH OH 27 28

Cf-b

31

25 C!-13 LiYOH

32 OH 33

36

H3C-{CH2 )1-CH=CH-CH2-CH=CH-{CH2)4-COOH

37

Esses autores compararam os resultados de fermentação do hidrolisado

sem e com a presença dos compostos citados acima por diferentes métodos. A

remoção dos inibidores proporcionou uma melhora no rendimento das

fermentações.

Além dos compostos modelo testados, TRAN e CHAMBERS (1986b)

identificaram vários derivados da lignina: 4-hidroxi-3-metoxifenilacetaldeído

(38), álcool vanílico (39), aldeído coniferílico (40) e álcool (3-oxiconiferílico (41 ).

Também identificaram os seguintes derivados dos extrativos: a-terpineol (42),

D-verbenona (43), os ácidos nonanóico (= pelargônico) (23), oléico (44), esteárico (45) e desidroabiético (46). Apesar de não terem estudado a

toxicidade desses compostos, postularam, com base nos estudos com

compostos modelo, que os mesmos devem apresentar efeito inibitório sobre a

fermentação de manose para butanodiol.

26

CHO 1

fCHO f fr CH

9'0CHa OCH3 OCH3 OH OH 38 39 OH

40

CHO 1 c=o CH3

lH

9'0CH3 H3

OH ~o CH3

OH 42 43

41

H3C-(CH2)1 s-COOH

45

H3C-(CH2)1-CH=CH-(CH2)1-COOH

44

46

NISHIKAWA et ai. (1988) estudaram a influência de produtos de

degradação da lignina sobre a fermentação de xilose para etanol em meio

sintético, a partir do mesmo microrganismo (K/ebsie/la pneumoniae) estudado

por TRAN e CHAMBERS (1986b). Ácido p-hidroxibenzóico (26); p-

hidroxibenzaldeído (47), ácido vanílico (15), vanilina (10), álcool vanílico (39),

ácido siríngico (16), siringaldeído (11) e dimetoxibenzeno (48) foram testados

em concentrações de O, 1 a 0,6 g/L. O ácido p-hidroxibenzóico (26) e o p-

hidroxibenzaldeído (47) foram mais inibitórios ao crescimento dos

microrganismos e à produção de etanol do que os derivados do tipo guaiacil e

siringil. Logo, o efeito inibitório pode estar associado com a ligação desses

compostos com enzimas, através das posições 3 e 5 do anel aromático.

27

CHO

9 OH 47

lEE e McCASKEY (1983) testaram o efeito de uma mistura de

siringaldeído (11) e vanilina (10) no crescimento da levedura Pachysolen

tannophilus usando como substrato, hidrolisado de Pinus radiata e concluíram

que o crescimento foi completamente inibido a uma concentração de 2,5 gil,

com 50% de inibição a 1,0 g/L. Os autores também testaram a toxicidade da

vanilina (10) e ácido vanílico (15) na fermentação com S. cerevisiae e os

resultados mostraram que ocorreu uma inibição completa pela vanilina (10) a 5,0 g/l, enquanto 50% da inibição correspondeu a 1,3 g/L. Ácido vanílico (15)

foi menos inibitório com 50% de inibição a 3, 7 g/L.

DElGENES et ai. (1996) estudaram o efeito dos produtos de

degradação da lignina na fermentação a etanol de glicose e xilose por S.

cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis e Candida shehatae. Para Pichia

stipitis e Candida shehatae, a intensidade da inibição é fortemente relacionada

com a concentração inicial dos compostos testados. Vanilina (10) apresentou o

maior efeito inibitório. Tanto crescimento quanto a produção de etanol foram

totalmente inibidos a uma concentração inicial de vanilina (10) de 1,0 g/L. Uma

comparação dos compostos modelos de lignina indicaram que siringaldeído

(11) foi menos tóxico que p-hidroxibenzaldeído (47) para as duas cepas. S.

cerevisiae foi significativamente inibida pela presença de furfurat (2),

hidroximetilfurfural (3) e vanilina (10), a qual inibiu a ação dessa levedura

quando presente em concentrações muito baixas (0,5 g/l). Zymomonas

mobilis foi fortemente inibida na fermentação de glicose por p-

hidroxibenzaldeído (47) (0,5 gil).

RANATUNGA et ai. (1997) estudaram a fermentação de xilose para

obtenção de etanol pela bactéria Zymomonas mobilis usando como sustrato, o

hidrolisado de uma mistura de madeiras ( carvalho vermelho, carvalho branco e

álamo amarelo). Vários compostos fenólicos foram testados. Vanilina (10) e

28

siringaldeído (11), com concentrações de 43 mg/L e 130 mgll,

respectivamente, apresentaram os mais altos níveis inibitórios. Ácido vanílico

(15) (84 mg/L) e ácido siríngico (16) (93 mg/L) tiveram efeitos inibitórios fracos.

FENSKE et ai. (1998) testaram os efeitos inibitórios de alguns

compostos derivados de lignina em três substratos diferentes: madeira de

álamo, "switchgrass" e "com stover". Os compostos testados foram ácido p- hidroxibenzóico (26), ácido cumárico (49), siringaldeído (11) e vanilina (10) e as

concentrações desses compostos estão mostradas na tabela 2.

IOOH CH

li

~ OH 49

Tabela 2. Compostos derivados de lignina identificados em hidrolisados de

álamo, switchgrass e com stover (FENSKE et ai., 1998).

:s: [ ] (mg/L) Acido p- [ ] (mgll) [ 1 (mgll) [ ] (mgll)

hidroxibenzóico Ácido Siringaldeído Vanilina

cumárico s

AI amo 11, 1 n.d. 29,3 15,1

"Switchgrass" n.d. 7,7 n.d. 16,5

"Com stover" n.d. 10,9 10,0 19,6

n.d. = não detectado.

Os compostos identificados nos três hidrolisados são conhecidos por

inibir fermentação de Pichia stipitis e são: vanilina (10), siringaldeído (11), ácido

acético (1) e furfural (2). Os compostos derivados de lignina, como

siringaldeído (11) e vanilina (10), são particularmente mais inibidores da

29

produção de etanol e do crescimento microbiano, especialmente quando

comparados a ácido acético ou compostos de degradação de açúcares. A

vanilina (10), um composto contendo grupo guaiacil, foi mais inibitório que

compostos contendo grupos siringil e hidroxibenzil.

ANDO et ai. (1986) também relacionaram os diferentes grupos

funcionais dos derivados de lignina à toxicidade. Identificaram e determinaram

quantitativamente vários compostos aromáticos em hidrolisado de madeira de

álamo pré-tratada por explosão a vapor a 205ºC por 1 O min. A influência

desses compostos sobre a fermentação de glicose a etanol por

Saccharomyces cerevisiae foi estudada em meio sintético. Siringaldeído (11 ),

ácido m-hidroxibenzóico (50) e ácido siríngico (16) em concentrações de até

0.1 % (massa /massa seca da madeira pré-tratada) não afetaram a

fermentação. Vanilina (10) apresentou inibição moderada e foi maior do que o

ácido p-hidroxibenzóico (26), que por sua vez foi maior que do p-

hidroxibenzaldeído (47). O ácido cinâmico (51) e o cinamaldeído (52)

interromperam a fermentação quase completamente e promoveram um efeito

tóxico nas leveduras durante a incubação. A vanilina (10) afetou a fermentação

no estágio inicial da incubação, mas após 25 h a fermentação foi recuperada e

o rendimento final de etanol foi o mesmo do controle. Considerando os

resultados de fermentação, os autores estimaram valores emplricos para o

grau de inibição de cada substituinte presente nos compostos aromáticos

examinados: CH=CH = +3,0; CHO = +1,5; p-OH = +1,0; COOH = +0,5; m-OH =

O e OCH3 = -1,0. Segundo esses autores, os valores atribuídos a cada grupo

funcional ligado a um composto podem ser usados para simular o poder

inibitório do mesmo sobre a fermentação. Os resultados obtidos na simulação

mostraram-se concordantes com os resultados das fermentações.

CHO

[ HCCOOH 1 li CH

li HC

~ ~

50 OH

51 52

30

Os trabalhos acima trataram, em sua grande parte, do efeito inibitório

dos compostos formados em diferentes processos de pré-tratamento sobre a

fermentescibilidade de xilose. Resultados semelhantes foram obtidos em

fermentações alcoólicas de hidrolisados contendo glicose como substrato,

usando-se diferentes microrganismos (CLARK e MACKIE, 1984; DELGENES

et ai., 1996; PFEIFER et ai., 1984). Entretanto, não encontramos nenhum

trabalho sistemático envolvendo os possíveis inibidores formados nos

processos de pré-tratamento do bagaço de cana.

O processo de separação dos componentes do bagaço de cana por

explosão a vapor, com ou sem catalisadores, tem sido sistematicamente

estudado em nosso grupo e pesquisa (SILVA, 1995; SILVA et ai. 1997,

MATTOS e SILVA, 1999). Na ausência de catalisador, os melhores resultados

foram alcançados nos pré-tratamentos a 190ºC por 15 min (SILVA, 1995).

Nessas condições, cerca de 36% do bagaço de cana foi solubilizado. 86% da

glucana foi recuperada como celulose no bagaço pré-tratado, 3,2% foi

hidrolisado a glicose, O, 12% foi decomposto a hidroximetilfurfural e 11 % a

compostos desconhecidos. 73% das xilanas foram hidrolisadas a arabinose

(2,5%), a arabinose ligada às xilanas (1%), a xilose (7,4%), a furfural (2,8%), a

oligômeros de xilose (51%) e a compostos não identificados (8,3%). Os grupos

acetil foram hidrolisados a ácido acético (39%) e a grupos acetil ligados às

xilanas (36% ); 12% permaneceram no bagaço pré-tratado e 13% foram

perdidos como compostos não identificados. A quantidade de lignina

hidrolisada a produtos solúveis foi de 20%. Pré-tratamentos sob condições

mais brandas mostraram-se ineficientes quando se buscou altos rendimentos

na recuperação das polioses hidrolisadas e, sob condições mais drásticas,

promoveram reações de condensação entre a lignina, o hidroximetilfurfural e o

furfural. Os resultados obtidos no pré-tratamento de 1 O kg de bagaço (base

seca) a 190°C, 15 min, em um reator de 240 L foram muito próximos daqueles

alcançados em escala de laboratório (SILVA, 1995). Nessas condições, a

quantidade de celulose presente no bagaço pré-tratado foi superior à dos

experimentos de bancada. A quantidade de xilana e dos grupos acetil,

recuperados no licor como compostos conhecidos foi menor, mostrando que as

polioses sofreram maior decomposição em escala piloto. Por outro lado, a

31

composição qualitativa dos hidrolisados foi praticamente a mesma nas duas

escalas.

Nesses estudos, os principais produtos obtidos nos procedimentos de

explosão a vapor (bancada e piloto) foram os oligomêros de xilose, que não

foram determinados quanto ao grau de polimerização. Também não foram

identificados compostos de baixa massa molar derivados da degradação da

lignina.

Nesse trabalho caracterizamos de forma mais completa a fração

solubilizada durante o pré-tratamento, através da identificação e quantificação

de vários compostos. Foram identificados os oligômeros de xilose (principais

produtos obtidos) e foram identificados e quantificados os compostos de baixa

massa molar produzidos pela degradação da lignina. Tais compostos são tidos

como inibidores potenciais de processos fermentativos e enzimáticos.

32

2. OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi identificar e quantificar compostos

que são inibidores potenciais de processos fermentativos e enzimáticos e estão

presentes no hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana pré-tratado por

explosão a vapor.

Para atingirmos esse objetivo, foram propostas as seguintes etapas de

trabalho:

- Caracterização química do bagaço de cana utilizado no pré-tratamento por

explosão a vapor;

Pré-tratamento por explosão a vapor do bagaço de cana, para a obtenção

do hidrolisado hemicelulósico;

- Caracterização da fração solubilizada durante o pré-tratamento;

- Separação das frações do hidrolisado hemicelulósico por diferentes

métodos;

Identificação dos compostos presentes nas diferentes frações obtidas do

pré-tratamento;

- Caracterização espectroscópica por infravermelho das frações contendo

carboidratos e compostos aromáticos.

33

3. MATERIAIS E MÉTODOS

O procedimento experimental foi dividido em 3 tópicos principais:

1 . Preparação (item 3.1 ) e caracterização química do bagaço de cana

(item 3.2);

2. Pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a vapor, em escala

de bancada, a 190ºC por 15 min (item 3.3);

3. Separação e caracterização das frações geradas no processo de pré-

tratamento.

O tópico 3 inclui a determinação da composição dos hidrolisados

gerados no pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a vapor (itens

3.2.5, 3.4 e 3.5), os procedimentos de separação das frações contendo os

compostos aromáticos e os carboidratos (itens 3.6.1 e 3.6.2) e a identificação e

quantificação de compostos aromáticos de baixa massa molar presentes no

hidrolisado (item 3.8).

A representação esquemática geral do procedimento experimental é

mostrada no diagrama de blocos da figura 8.

3.1. PREPARAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA

O bagaço de cana, cedido pela Usina Nova América, foi misturado,

homogeneizado, quarteado, embalado em saco de polietileno contendo

aproximadamente 1 kg, com umidade média de 50% e armazenado em câmara

fria a -20ºC, até sua utilização no experimento de explosão a vapor.

Uma amostra de aproximadamente 200 g foi seca em estufa a 60ºC, por

cerca de 12 h, moída, classificada em partículas de tamanho menor ou igual a

20 mesh e caracterizada quimicamente, de acordo com o procedimento

descrito no item 3.2.

34

BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

' EXPLOSÃO A

VAPOR

1 FILTRAÇÃO 1

'

1 1 HIDROLISADO

HEMICEWLÓSICO BAGAÇO

PRÉ· TRATADO

I CARACTERIZAÇÃO I

SEPARAÇÃO CARBOIDRATOS I

COMPOSTOS BAIXA MASSA MOLAR POR EXTRAÇÃO

LÍQUIDO/LÍQUIDO

SEPARAÇÃO CARBOIDRATOS I

AROMÁTICOS POR C18

•

I CARACTERIZAÇÃO I I CARACTERIZAÇÃO I I CARACTERIZAÇÃO I

Figura 8. Representação esquemática do processo de separação dos

componentes do bagaço de cana por explosão a vapor.

35

3.2. CARACTERIZAÇÃO QUIMICA DO BAGAÇO DE CANA

3.2.1. DETERMINAÇÃO DOS EXTRAiVEIS

O bagaço de cana foi extraído com etanol 95%, em um Soxhlet até o

solvente tomar-se incolor (cerca de 10 sifonações). O bagaço extraído foi seco

ao ar para evaporação do solvente, e em seguida seco em estufa a 105ºC até

massa constante, determinada em balança analítica.

3.2.2. DETERMINAÇÃO DE LIGNINA KLASON INSOLÚVEL EM MEIO

ACIDO

A quantidade de lignina insolúvel em meio ácido foi determinada de

acordo com o método Klason modificado (ASTM, 0.1106-56).

Uma amostra de 2 g de bagaço de cana extraído e seco, pesada com

incerteza de O, 1 mg, foi transferida para um bécher de 100 ml e tratada com

1 O ml de H2S04 72%, sob vigorosa agitação, em um banho termostatizado a

45 ± 0,5°C por 7 min. A reação foi interrompida com a adição de 50 ml de

água destilada. A amostra foi transferida quantitativamente para um

Erlenmeyer de 500 ml, usando-se 275 ml de água.

Para a completa hidrólise dos oligômeros restantes, o Erlenmeyer foi

fechado com papel alumínio e autoclavado por 30 min a 1,05 bar. Após a

descompressão da autoclave, o frasco foi retirado e resfriado à temperatura

ambiente. A mistura reacional foi primeiramente filtrada para um balão

volumétrico de 500 ml, o qual foi posteriormente avolumado com água

destilada. A solução foi armazenada para análises posteriores de lignina

solúvel, cinzas, carboidratos e furfural e hidroximetilfurfural, de acordo com o

procedimento descritos nos itens 3.2.3, 3.2.4, 3.2.5 e 3.2.6, respectivamente.

Os sólidos retidos no papel de filtro foram lavados com

aproximadamente 1,2 L de água destilada e secos em estufa a 105 ± 3°C até

massa constante. O material foi calcinado de acordo com o procedimento

descrito no item 3.2.4. A quantidade de cinzas foi determinada e a massa de

lignina determinada por diferença.

36

3.2.3. DETERMINAÇÃO DE LIGNINA KLASON SOLÚVEL EM MEIO ACIDO

A quantidade de lignina solúvel em meio ácido foi determinada conforme

metodologia descrita por SILVA (1995).

Uma alíquota de 5 mL do hidrolisado obtido no item 3.2.2 foi alcalinizada

com NaOH 6,5 m.L-1 até pH 12,5 (- 2 mL) e diluída com água destilada em um

balão de 100 ml.

A absorbância da solução em 280 nm foi determinada em um

espectrofotômetro UVNisível de duplo feixe, modelo Cintra 20, usando-se água

destilada como referência. A concentração de lignina foi calculada conforme a

equação 13.

Clig = (Ãt.idr2ao - Apct2ao) I &lig

onde:

- Cu9 = concentração de lignina, em gil.

- Atiidr2aa = absorbância do hidrolisado contendo a lignina, em 280

equação 13

nm.

- ~ao = Ctur1 &tur1 + Chmf &hmf = absorbância em 280 nm dos

produtos de decomposição dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural), cujas

concentrações (Ctur1 e Chmt) e as absortividades (&turt e &hmr) foram determinados

previamente por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e por UV,

respectivamente. O valores das absortividades obtidas para furfural e

hidroximetilfurfural foram 146,85 e 114,00 L g-1 cm", respectivamente,

conforme descrito em SILVA (1995).

- &ug = absortividade para lignina (25,20 L g-1 cm") (SILVA,

1995).

3.2.4. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS NO BAGAÇO DE

CANA

A determinação do teor de cinzas no bagaço de cana ou lignina foi feita

conforme metodologia descrita em SILVA (1995). Cerca de 1,8 a 2,0 g de

bagaço de cana, com umidade conhecida, foram pesados, com incerteza de

O, 1 mg, em um cadinho de porcelana previamente calcinado e tarado. Em

. . 37

seguida, o bagaço de cana foi calcinado inicialmente a 300ºC e depois por

mais 2 h a BOOºC. Após a calcinação, o cadinho foi resfriado em dessecador e

a massa de cinzas determinada. A massa de cinzas da lignina foi usada para .. corrigir o teor de lignina insolúvel, determinado no item 3.2.2.

O teor de cinzas foi calculado pela equação 14:

% czs = (M2 - M1) I M3 x 100

onde:

equação 14

-% czs = porcentagem em massa de cinzas.

= massa do cadinho calcinado vazio, em g.

= massa do cadinho com cinzas, em g.

= massa de lignina seca, em g.

3.2.5. DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS E ÁCIDOS

ORGÂNICOS POR CLAE

Os carboidratos e os ácidos orgânicos presentes no hidrolisado foram

identificados em um cromatógrafo ,líquido Shimadzu, modelo CT0-6A (ROCHA

et ai., 1997). Uma alíquota de 40 mL do hidrolisado, obtido no item 3.2.2., teve

o pH ajustado com NaOH 2 moí.L" de 0,6 para a faixa de 1 a 3 e, em seguida,

foi diluída com água destilada em balão volumétrico de 50 mL .

O hidrolisado ácido foi extraído em cartuchos de extração sólida Sep-Pak

C1a (Waters), para a remoção de compostos aromáticos e, então, injetado em

uma coluna Aminex HPX-87H (300 X 7,8 mm, Bio-Rad Laboratories Ltd)

acoplada a uma pré-coluna trocadora de cátions (Bio-Rad Laboratories Ltd),

usando-se H2S04 0,005 mol.L" como fase móvel a uma vazão de 0,6 mUmin

a 45°C, segundo procedimento descrito por SILVA (1995). Os compostos foram

monitorados com um detector de índice de refração (RI) (Shimadzu R10-6A).

As áreas dos picos correspondentes às hexoses e às pentases foram

utilizadas para calcular as massas de glucana e xilana, respectivamente. Essas

massas foram divididas pelo peso seco do material inicial e multiplicadas pelo

fator de hidrólise. Os fatores de hidrólise para conversão de glicose e celobiose

38

em glucana são 0,90 e 0,95, respectivamente. De maneira similar, xilose e

arabinose foram convertidas em xilana e o ácido acético em grupos acetil

usando-se os fatores 0,88 e 0,72, respectivamente.

As concentrações de 'ceíobiose, glicose, xilose, arabinose e ácido acético

foram determinadas a partir de curvas de calibração obtidas com padrões

analíticos.

3.2.6. DETERMINAÇÃO DE FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL

Furfural e hidroximetilfurfural foram determinados por CLAE em uma

coluna LiChrospher 100 RP-18 (5µm) de 125 x 4mm (Hewlett-Packard),

utilizando-se acetonitrila/água 1 :8 (v/v) com 1 % de ácido acético como fase

móvel a uma vazão de 0,8 mUmin a 25ºC, conforme descrito em SILVA (1995).

O hidrolisado foi previamente diluído com água na razão de 1: 100, filtrado em

membrana com diâmetro de poro de 0,47 µm (Millipore) e injetado com uma

válvula Rheodyne equipada com alça de injeção de 20 µL. Os compostos foram

detectados a 276 nm, em um detetor UVNisível HP 79875. As concentrações

de furfural e hidroximetilfurfural foram determinadas a partir de curvas de

calibração obtidas com os compostos puros.

3.3. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO A

VAPOR A 190°C POR 15 MIN

O pré-tratamento do bagaço de cana foi realizado em escala de

bancada, usando-se um reator de aço inox 316 com capacidade para 0,65 L,

cuja representação esquemática é mostrada na figura 9 (SILVA, 1995).

No reator [3] pré-aquecido à temperatura de 190ºC foram introduzidos,

com o auxílio de elevador hidráulico (9], 10 g de bagaço seco, pesados com

incerteza de O, 1 mg. O reator foi fechado e o vapor injetado até a temperatura

atingir o equilíbrio, o qual permaneceu por 15 min. A válvula de alimentação de

vapor [2] foi fechada e a válvula de descompressão [4] aberta imediatamente.

Em função da descompressão súbita do reator, o material pré-tratado foi

ejetado para o ciclone (5], do qual foi removido quantitativamente com cerca de

500 mL de água destilada. Os experimentos foram realizados em quatro

39

bateladas. As suspensões foram misturadas e a mistura final filtrada em um

funil de Büchner.

O bagaço pré-tratado, retido no funil de Büchner, foi lavado com um

volume adicional de 2000 ml de água destilada a 50ºC. O filtrado foi

transferido quantitativamente do kitassato para provetas de 2000 ml. O volume

final obtido foi de 4200 ml. O bagaço pré-tratado foi lavado com cerca de 2000

ml de água adicionais, até a água de lavagem tomar-se incolor. A água de

lavagem foi desprezada e o bagaço foi levado à estufa a 60ºC até massa

constante, determinada em balança analítica. Em seguida, a amostra foi moída

e classificada em partículas menores ou iguais a 20 mesh, num moinho do tipo

Wiley, e a seguir caracterizada pelo procedimento descrito no item 3.2.

Do filtrado foram retiradas duas alíquotas de 5 ml, sendo uma para

análise da lignina solúvel (item 3.2.3) e a outra para análise do

hidroximetilfurfural e do furfural (item 3.2.6), além de uma alíquota de 40 ml,

para determinação das concentrações dos monômeros de açúcares (item

3.2.5), do ácido acético livre (item 3.2.5) e dos oligômeros de glicose e xilose

(item 3.4).

Outra alíquota de 250 ml foi transferida para um Erlenmeyer de 500 ml

e acidificada com H2S04 a pH 0,6. O frasco foi fechado com papel alumínio e

a amostra foi autoclavada por 30 mina 1,05 bar para a hidrólise completa dos

oligômeros presentes. O hidrolisado foi avolumado para 500 ml, dos quais

foram retiradas duas alíquotas: uma de 5 ml, para determinação de lignina

solúvel (item 3.2.3) e uma de 40 ml para determinação de carboidratos e de

seus produtos de decomposição por CLAE (item 3.2.5).

Outra alíquota de 40 ml do hidrolisado foi extraída em 12 cartuchos de

extração sólida Sep-Pak C 18 (Waters) conectados em série. Os carboidratos e

os oligômeros aluídos nos cartuchos foram determinados por CLAE (itens 3.2.5

e 3.4). Os compostos aromáticos retidos na coluna foram dessorvidos com

etanol (itens 3.2.5 e 3.4). Para as duas frações, foram feitas análises de FTIR

(item 3.7)

Outra alíquota de 580 ml foi extraída com diferentes solventes

sucessivamente, conforme descrito no item 3.6.2. Para cada fração separada,

contendo os compostos aromáticos, foram feitas análises de GC/MS e GC/FID

40

(item 3.8). As análises de FTIR (item 3. 7) foram feitas para quatro frações

orgânicas obtidas no procedimento descrito pelo item 3.6.2 .

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Figura 9. Representação esquemática do sistema de pré-tratamento de

materiais lignocelulósicos por explosão a vapor, em escala de bancada.

41

3.4. IDENTIFICAÇÃO DOS OLIGÔMEROS DE GLICOSE E XILOSE POR

CLAE

Os oligômeros de glicose e xilose presentes no hidrolisado, obtido no

item 3.3, foram identificados por CLAE em um cromatógrafo líquido Shimadzu,

modelo CT0-6A, de acordo com o procedimento descrito abaixo.

Uma alíquota de 40 ml do hidrolisado teve o pH ajustado para 7 com

NaOH 2 mol. L"1 e em seguida foi diluída com água destilada em balão

volumétrico de 50 ml.

Os compostos aromáticos foram removidos do hidrolisado por extração

em cartuchos Sep-Pak C18 (Waters). O hidrolisado foi injetado diretamente em

uma coluna Aminex HPX-42A (300 X 7,8 mm, Bio-Rad Laboratories ltd)

acoplada a duas pré-colunas: catiônica e aniônica. Como fase móvel foi

empregada água bidestilada com vazão de 0,6 mUmin, a 45°C. Os compostos

foram monitorados com um detector de RI (Shimadzu R10-6A).

A identificação do grau de polimerização dos oligômeros de xilose

presentes no hidrolisado foi feita a partir de uma amostra padrão contendo

xilose, xilobiose e xilotriose, gentilmente cedida pelo Prof. Dr. José Domingos

Fontana, da Universidade Federal do Paraná (UFPR). Os tempos de retenção

da xilotetraose, xilopentaose e xiloexaose foram determinados por

extrapolação, a partir do cromatograma obtido da hidrólise ácida de xilana de

bétula (Sigma).

A identificação dos oligômeros de glicose foi feita de maneira análoga, a

partir da hidrólise de uma amostra de celulose cristalina (Sigmacell - Sigma).

Os procedimentos de hidrólise da xilana e da celulose estão descritos no item

3.4.1.

3.4.1. HIDRÓLISE DE XILANA E CELULOSE

Uma amostra de 1 g de xilana ou de celulose, pesadas com incerteza de

O, 1 mg, foi transferida para um bécher de 100 ml e tratadas com 1 O mL de

H2S04 72%, sob vigorosa agitação, em um banho termostatizado. A xilana foi

hidrolisada à temperatura ambiente (25ºC) e a celulose a 45,0 ± 0,5°C, ambas

por 7 min. A reação foi interrompida com a adição de 50 ml de água destilada.

42

As amostras foram transferidas quantitativamente para erlenmeyers de 500 ml,

usando-se 275 ml de água.

Em seguida, uma alíquota de 25 ml de cada amostra foi retirada e o pH

elevado a 5,5 com auxílio de Ba(OH)2. A solução foi filtrada em papel de filtro e

injetada diretamente na coluna Aminex HPX-42A (300 X 7,8 mm, Bio-rad

Laboratories Ltd) acoplada a duas pré-colunas trocadoras de íons: uma

catiônica e outra aniônica (Bio-Rad Laboratories Ltd). Como fase móvel foi

empregada água bidestilada com vazão de 0,6 mUmin, a 45ºC. Os compostos

foram monitorados em um detector de índice de refração (RI) (Shimadzu

R10-6A).

3.5. DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLAR DOS COMPOSTOS

PRESENTES HIDROLISADO

A determinação da distribuição da massa molar média dos compostos

presentes no hidrolisado, obtido no item 3.3, foi feita por cromatografia de

exclusão por tamanho (HPSEC) em um cromatógrafo líquido de alta eficiência

Shimadzu modelo CT0-6A, segundo o procedimento descrito por PAIVA et ai.

(1997).

Três frações do hidrolisado foram analisadas: uma fração filtrada em

membrana (Millipore), para remoção de sólidos; uma fração eluída em um

cartucho de extração sólida Sep-Pak C 18 contendo os carboidratos; e a fração

adsorvida em C 18 e dessorvida com etanol, contendo os compostos

aromáticos. As amostras (20 µL) foram aluídas em uma coluna Asahipak GS-

320H com água bidestilada, a uma vazão de 1,0 mUmin. Os compostos foram

monitorados por RI (detector Shimadzu R10-6A).

A distribuição da massa molar dos compostos presentes no hidrolisado

foi determinada a partir de curvas de calibração, usando-se 4 proteínas de

massas molares conhecidas, conforme descrito no item 3.5.1.

43

3.5.1. CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA A DISTRIBUIÇÃO DE MASSA

MOLAR DOS COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISADO

A curva de calibração para a distribuição da massa molar dos compostos

presentes no hidrolisado foi feita com proteínas, cujas massas molares médias

são mostradas na tabela 3. O volume de exclusão e o volume de permeação

total do sistema da coluna foram determinados por eluição de blue dextran

(2.000.000 g/mol} e acetona (58 g/mol}, respectivamente. As proteínas foram

aplicadas na coluna nas mesmas condições da amostra. O valor médio do

volume de eluição das proteínas foi transformado em um valor que independe

do tamanho da coluna (Kd} conforme a equação 15:

Kd= (Ve1-Vo}/(Vac -Vo)

equação 15

Onde:

V e1 = volume de eluição

Vo = volume de exclusão total

Vac = volume de permeação total

Tabela 3: Proteínas utilizadas na calibração da coluna cromatográfica e suas

respectivas massas molares.

PROTEINAS MASSA MOLAR (g/mol) VOLUME DE ELUIÇAO (ml}

Albumina 66.000 3.4

Anidrase Carbônica 29.000 4.2

Citocromo e 12.400 5.9

Aprotinina 6.500 6.7

A curva de calibração obtida é apresentada na figura 1 O e descrita pela

equação 16.

44

Log MM= -3.2492 Kd + 5.1633

R2 = 0.9748

equação 16

onde: MM= massa molar e Kd = (Ve1- Vo)/(Vac - Vo);

6

.. 5 l'tl õ 4 E l'tl = 3 l'tl E 2 CII ..2 1

O+-~~~-,--~~~.---~~--, o 0,5 1,5

Kd

Figura 1 O. Curva de calibração da coluna cromatográfica Asahipak-320H

eluída com água bidestilada a 1,0 mUmin.

3.6. SEPARAÇÃO DE CARBOIDRATOS E COMPOSTOS AROMÁTICOS

PRESENTES NO HIDROLISADO

Para separar compostos aromáticos dos carboidratos foram tentados

dois diferentes procedimentos experimentais, que são descritos nos itens 3.6.1 e 3.6.2.

3.6.1. SEPARAÇÃO EM CARTUCHOS DE EXTRAÇÃO SÓLIDA (SEP-PAK C18)

Uma alíquota de 40 ml do hidrolisado, obtido no item 3.3, foi eluída em 12 cartu<:hos de extração sólida Sep-Pak C18 (Waters) conectados em série, recolhida e avolumada em um balão volumétrico de 50 ml.

Uma alíquota de 5 mL foi analisada para determinação de carboidratos por CLAE (item 3.2.5 ); outra alíquota de 5 ml foi analisada por HPSEC (item

45

3.5), para determinação da distribuição de massa molar dos compostos

presentes; e finalmente, uma alíquota de 40 ml foi liofilizada em um aparelho

Edwards, seca em P20s e analisada por FTIR (item 3. 7).

A fração retida nos cartuchos, contendo os compostos aromáticos, foi

dessorvida com 25 ml de etanol. A partir de uma alíquota de 5 ml dessa

solução, foram feitas análises de açúcar (item 3.2.5) e HPSEC (item 3.5). 20

ml foram evaporados a pressão reduzida, secos em P205 e analisados por

FTIR e GC/MS, conforme descrito nos itens 3.7 e 3.8.2, respectivamente.

3.6.2. SEPARAÇÃO POR EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO

Os carboidratos, os derivados de lignina de massa molar mais alta e os

compostos aromáticos de baixa massa molar solúveis em água, foram

separados por extração líquido-líquido, de acordo com o procedimento

experimental descrito abaixo e ilustrado pelo diagrama de blocos da figura 11. Uma alíquota de 580 ml do hidrolisado, obtido no item 3.3, foi

acidificada com HCI 2 mol.L" até pH 2,0. Em seguida, o hidrolisado foi extraído

com acetato de etila. Após a extração, foram separadas a fração aquosa,

contendo carboidratos (FA1) e a fração orgânica, contendo acetato de etila.

Uma alíquota de 2 ml da fração orgânica foi separada e injetada diretamente

em um cromatógrafo gasoso acoplado a um detector de massas Finnigan,

modelo MAT GCQ™ (item 3.8.2) e analisada por GC/MS (item 3.8). Uma

alíquota de 100 ml foi evaporada, seca em P205, derivatizada e analisada por

GC/MS (F01) (item 3.8.2). A alíquota restante de 500 ml da fração orgânica foi

extraída com uma solução de NaHC03 saturada e NaOH 2 mol.L", três vezes

sucessivamente. As frações solúveis em NaHC03 e NaOH foram acidificadas

com HCI 2 mol.L" e extraídas três vezes com diclorometano e acetato de etila,

sucessivamente.

A fase aquosa obtida da extração com solução saturada de NaHC03 foi

acidificada e extraída com diclorometano, sendo obtidas duas fases: uma

aquosa e outra orgânica. O solvente presente na fase orgânica foi evaporado, a

amostra foi seca em P205 , derivatizada e analisada por GC/MS (F03). A fase

aquosa foi extraída com acetato de etila, três vezes sucessivamente e foram

46

obtidas duas fases: uma aquosa (FA2) e outra orgânica. Dessa fase, o solvente

foi eliminado por rotaevaporação, a amostra seca em P20s, submetida à derivatização e analisada por GC/MS (F02).

O solvente da fase orgânica proveniente da extração com solução

saturada de NaHC03 e extraída com NaOH 2 mol.l," foi evaporado; a amostra

foi seca em P205, submetida à derivatização e analisada por GC/MS (F06). A

fase aquosa foi acidificada e extraída com diclorometano três vezes

sucessivamente. O solvente presente na fase orgânica obtida nessa extração

foi evaporado, a amostra seca em P205 submetida à derivatização e analisada

por GC/MS (FOS). A fase aquosa foi extraída com acetato de etila, três vezes

sucessivamente e separadas duas fasés: uma aquosa (FA3) e outra orgânica,

da qual o solvente foi evaporado, a amostra seca em P20s, submetida à derivatização e analisada por GC/MS (F03). As três frações aquosas (FA1,FA2

e FA3) separadas dos solventes não foram analisadas.

Esse procedimento teve por objetivo separar os compostos aromáticos

presentes no hidrolisado em frações ácida (F02 e F03), fenólica (F04 e FOS)

e neutra (F06) (TANAHASHI et ai, 1989). Para cada uma das frações

orgânicas (F01 - F06), foram feitas análises de GC/MS, conforme descrito no

item 3.8.2. As frações F01, F02, F04 e F06 foram também analisadas por

FTIR, conforme descrito no item 3. 7.

3.7. ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO

As amostras de carboidratos e de compostos de lignina, obtidas no item

3.6.1 e as frações orgânicas F01, F02, F04 e F06, obtidas no 3.6.2, foram

previamente secas em dessecador com pentóxido de fósforo sob vácuo

durante 3 a 4 dias. Foram preparadas pastilhas de KBr contendo 0,5% da

amostra compactadas a 1 O - 12 kgf/cm2 sob vácuo. Os espectros foram

varridos na região de 4.000 a 400 cm", número de scans = 64 e resolução = 4 cm", em um espectrofotômetro FTIR Nicolet 520.

HIDROLISADO EXPLOSÃO A VAPOR (190 oC/ 15 MIN)

SOLÚVEIS ( Hi<))

• HC1 2 mol.L • 1 (ACIDIFICAÇÃO pH = 2)

• EXTRAÇÃO COM ACETATO OE ETILA

-FA1 FASE ORGÂNCA 500ML

- EXTRAÇÃO C/

NaHC03SAT.

FASE ORGÂNCA.

- EXIRAÇÃO CJ

NaOH 2 mol.L·1.

FASE ORGÂNCA

FASE AQUOSA

-HCl2mol.Lº1 pH=2

- EXTRAÇÃO C/ O-fi02

• ROTA EVAPORAÇÃO

- SECAGEM P205

F06 FASE ORGÂNCA

FASE AQUOSA

- EXTRAÇÃO C/ ACETATO OE CGJMS

ETILA FASE

ORGÂNCA

• ROTABIAl'ORAÇÃO

• SB:AGEMP205

- DERIVA llZAÇÃO

CG/MS

FASE AQUOSA.

-HCl2mol.Lº1 pH=2

• EXTRAÇÃO C/ CH:?02

FASE ORGÂNCA

- ROTAEVAl'ORAÇÃO

- ss:AGEM PiQ5

F03

- DERIVATIZAÇÃO

FASE ORGÂNCA F06

- ROTAEVAl'ORAÇÃO

- SB:AGEM PiQ5 - OERWA TIZAÇÃO

CG/MS

- DERIVATIZAÇÃO

CG/MS

FA3

47

ALCUOTA 100ML

-ROTAEVAl'ORAÇÃO

- SID\GEM PiQ5

F02

- DERIVA TIZAÇÃO

CG/MS

FASE AQUOSA

CG/MS

-EXTRAÇÃO C/ ACETATO OE

ETILA

FA2

- ROTAEVAl'ORAÇÃO

• SID\GEM P205

• DERIVA llZAÇÂO

Figura 11. Representação esquemática do processo de extração do

hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana com diferentes solventes.

48

3.8. IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS

AROMÁTICOS DE BAIXA MASSA MOLAR PRESENTES NO HIDROLISADO

A fração obtida pela dessorção (com etanol) dos compostos retidos na

série de cartuchos Sep-Pak C 18 (item 3.6.1) foi rotoevaporada, a amostra foi

seca em P20s, derivatizada conforme o item 3.8.1 e analisada por GC/MS (item

3.8.2).

Amostras das frações orgânicas F01, F02, F03, F04, F05 e F06,

obtidas no item 3.6.2, foram derivatizadas conforme o item 3.8.1 e analisada

por GC/MS (item 3.8.2). As frações orgânicas F01, F02, F03, F04, FOS e

F06 foram também submetidas a análise por GC/FID, conforme descrito no

item 3.8.3.

3.8.1. DERIVATIZAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISES DE

GC/MS E GC/FID

Os compostos de baixa massa molar, presentes na fração dessorvida

da série de cartuchos C18 (item 3.6.1) e nas frações orgânicas (F01 - F06)

(item 3.6.2) foram identificados por GC/MS. Cerca de 2 mg de amostra de cada

fração acima citada foi rotoevaporada, seca em P205, pesada e dissolvida em

100 µL de piridina. A seguir foi adicionado 1 mL de N,0-bis(trimetilsilil)

trifluoroacetamida (BSTFA) às amostras. O frascos foram fechados e mantidos

a 60ºC por 1 h (COTRIM, 1990) e resfriados à temperatura ambiente. Uma

alíquota de 1 µLda mistura reacional foi injetada no cromatógrafo e foi diluída

por um fracionamento mecânico (split) na razão de 1 :100, usando hélio como diluente.

3.8.2. CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS

As amostras derivatizadas foram analisadas em um cromatógrafo de

ga~es acoplado a um detector de massas Finnigan, modelo MAT GCQ ™, calibrado com perfluorotributilamina (PFTBA) na faixa de varredura de m/z de

49

20 a 900. Os espectros foram medidos após ionização das moléculas por

impacto de elétrons (70 eV). Foi utilizada uma coluna cromatográfica 08-5 de

30 m x 0,25 mm. O fluxo de hélio usado foi de 33,0 cm/s. A fonte de ionização

foi aquecida a 190ºC, a interfase a 220ºC e a temperatura de transferência de

linha a 275ºC.

Para melhor separação dos compostos presentes nas amostras, foram

utilizadas três diferentes rampas de temperatura da coluna, de acordo com as

condições mostradas na tabela 4.

Tabela 4 . Programas de temperatura da coluna para análises das frações

orgânicas nas análises de GC/MS e GC/FID.

AMOSTRAS INICIAL INTERMEDIARIA FINAL

Temp. Tempo Temp. Tempo Taxa Temp. Tempo Taxa (ºC) (min) (ºC) (min) (ºC/min) (ºC) (min) (ºC/min)

F02, F04, 60 1 140 2 15 280 10 2

F06

F01 80 1 140 4 4 280 25 4

F03, F05 60 1 140 3 30 240 13.33 2

A identificação dos compostos foi feita por comparação dos espectros de

massa obtidos com aqueles de bibliotecas de espectros instalados no

equipamento de GC/MS, bem como por proposições de fragmentações lógicas,

conforme mostrado no apêndice 1.

3.8.3. CROMATOGRAFIA GASOSA/DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA

As amostras foram analisadas em um cromatógrafo de gases acoplado a

um detector de ionização de chama (FIO), modelo Varian 3400 CX. Foi

utilizada uma coluna cromatográfica DB-5 de 30 m x 0,25 mm. O fluxo de hélio

usado foi de 33,0 cm/se split 1:100. Para quantificar compostos fenólicos, o

fluoranteno foi utilizado como padrão interno e o programa de temperatura da

coluna foi o mesmo usado nas análises de GC/MS (item 3.8.2).

50

A quantificação por GC/FID dos compostos identificados por GC/MS foi

feita por cromatografia gasosa utilizando-se a mesma coluna cromatográfica.

No entanto, a detecção foi feita empregando-se um detector de ionização de

chamas (FIO) para as frações orgânicas derivatizadas com BSTFA. Nesse

detector, as respostas de compostos de diferentes classes são parecidas, o

que não acontece no detector de massas, onde a resposta é mais dependente

da estrutura do composto (GUERRA, 1998).

51

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO A VAPOR

A quantidade de bagaço de cana solubilizada a 190ºC, 15 min foi de

34%. Esse valor foi calculado pela diferença entre a massa de bagaço (base

seca) introduzida no reator e a massa de bagaço pré-tratado (base seca) após

a remoção da fração solúvel em água (hidrolisado ). Este resultado coincide

com a diferença observada entre o valor total referente à composição do

bagaço bruto e tratado, mostrada na tabela 5, cujos valores foram

determinados pela análise química das duas frações.

Tabela 5: Balanço de massa do pré-tratamento do bagaço de cana a 190ºC,

15 min. Quantidades expressas em relação a 100 g de bagaço seco .

BAGAÇO BRUTO BAGAÇOPRE- MATERIAL TOTAL

TRATADO SOLUBILIZADO RECUPERADO

COMPONENTE (%) (%) (%) (%)

GLUCANA 39,2 ±0,9 35,7±0,1 1,25 ±0,01 36,95 ±0,01

Xlu\NA 25,2±0,6 4,2±0,1 14,04 ±0,06 18,3 ± 0,2

GRUPOS ACETIL 3,5±0,2 0,5960 ± 0,0001 1, 189 ± 0,001 1,785±0,001

LIGNINA TOTAL 23±2 19,1 ±0,3 4,8± 0,1 23,9±0,4

EXTRAI VEIS 2,0 ± 0,1 n.a n.a n.a CINZAS 3,1 ±0,4 2,29±0,01 n.a 2,29±0,01

TOTAL 96±5 61,9±0,5 21,2±0,2 83,2±0,6

n.a = não analisado

O balanço de massa mostrado na tabela 5 mostra que foram

solubilizados 8, 9% do total de glucanas presentes no bagaço de cana. Deste

total, 3,2% na forma de oligômeros de glicose e hidroximetilfurfural e o restante

(5,7%) para compostos não identificados.

A xilana foi o componente que sofreu maior solubilização (83% ). Desse

total, 55, 7% foi recuperada na forma de xilose, oligômeros de xilose, furfural,

arabinose e arabinose ligada a oligômeros de xilose. Essa maior solubilização,

52

também foi acompanhada de uma grande quantidade de compostos não

identificados (27,4%). Esses compostos são derivados de furfural, que nas

condições de reação tendem a sofrer reação de polimerização, formando

resinas furânicas e produtos de condensação com a lignina (FENGEL e

WEGENER, 1989).

Os grupos acetil também foram intensamente solubilizados (83,3%),

acompanhando a hidrólise das xilanas. A quantidade de grupos acetil

identificados na forma de ácido acético livre e grupos acetil ligados a

oligômeros de xilana foi de 34%. Uma grande fração dos grupos acetil não foi

identificada (48,9%).

A lignina sofreu uma solubilização apreciável (17%). Por outro lado, a

quantidade de lignina solúvel no hidrolisado foi de 20,9%. Estes resultados

mostram que a quantidade total de lignina recuperada foi de 103,9%, o que

demonstra que houve reações de condensação com os produtos de

degradação dos açúcares.

Esse pré-tratamento foi realizado nas mesmas condições usadas por

SILVA (1995), cujos resultados são apresentados na tabela 6.

Tabela 6: Balanço de massa do pré-tratamento do bagaço de cana a 190ºC, 15

min. Quantidades expressas em relação a 100 g de bagaço seco (SILVA,

1995). BAGAÇO BRUTO BAGAÇOPRE- MATERIAL TOTAL

TRATADO SOLUBILIZADO RECUPERADO

COMPONENTE (%) (%) (%) (%)

GLUCANA 43 ± 1 37,0±0,7 1,5 ± 0,2 38,4±0,9 XILANA 25 ± 1 6,8±0,2 16,2±0,6 23,0±0,8

GRUPOS ACETIL 2,8±0,8 0,33 ±0,05 2,1 ±0,5 2,4±0,6 LIGNINA TOTAL 23±2 18,30 ±0,04 4,6 0,2 22,9 ±0,2

EXTRAIVEIS 3,53 ±0,01 n.a n.a n.a CINZAS 1,5 ± 0,4 1,54 ±0,08 n.a 1,54 ±0,08 TOTAL 99±2 64 ± 1 24±2 88 ±3


A comparação dos dados das tabelas 5 e 6 mostra que os dois

experimentos foram bastante reprodutíveis. A composição química do bagaço

53

de cana foi semelhante, exceto para o conteúdo de glicose, que variou de

39,2% para 43%. As composições do bagaço pré-tratado foram muito

próximas. A principal diferença se deve à quantidade de xilana, que variou de

4,2% para 6,8%. Quanto ao hidrolisado, a maior variação foi observada em

relação ao teor de grupos acetil, que variaram de 1,2% para 2, 1 %. O total de

material recuperado foi de 83,2% contra 88%, sendo a principal diferença sobre

o conteúdo de xilana (18,3% contra 23%). Nestas condições, aproximadamente

21 % da lignina inicial foi solubilizada, contra 20%.

A composição dos componentes do bagaço de cana pré-tratado é

mostrado na tabela 7.

Tabela 7: Composição do bagaço de cana pré-tratado a 190ºC por 15 min

comparada aos dados obtidos por SILVA (1995).

COMPONENTE COMPOSIÇAO (%) COMPOSIÇAO (%)

(SILVA, 1995)

GLUCANA 54,2±0,2 62,0 ±0,6

XILANA 6,4±0,2 7,3 ± 0, 1

GRUPOS ACETIL 0,9057 ± 0,0001 n.d LIGNINA SOLUVEL 0,87 ±0,04 1,19±0,06

LIGNINA INSOLUVEL 28,2±0,4 28,8 ±0,2

LIGNINATOTAL 29,1 ±0,4 30,0±0,2

EXTRAI VEIS n.a n.a CINZAS 3,48 ±0,02 1,51 ± 0,01

TOTAL 94,1 ±0,8 100,8 ±0,9


n.d = não detectado

Os resultados referentes à composição do resíduo celulósico em ambos

os experimentos foram bastante reprodutíveis, com exceção da quantidade de

glucana.

A distribuição dos componentes presentes no hidrolisado do bagaço de

cana, para os pré-tratamentos citados acima, é mostrada na tabela 8.

54

Tabela 8: Distribuição dos compostos identificados no hidrolisado do pré-

tratamento por explosão a vapor a 190ºC por 15 min. Quantidades expressas

em relação a 100 g de bagaço seco.

COMPONENTE COMPOSIÇAO COMPOSIÇAO (%)

(%) (SILVA, 1995)

OLIGOMEROS DE GLICOSE 1,25±0,01 1,4 ± 0,2 HIDROXIMETILFURFURAL 0,077 ± 0,004 0,05 ±0,01 XILOSE 2,70 ±0,01 1,86±0,06 OLIGOMEROS DE XILOSE 10,67 ±0,03 12,8±0,6 ARABINOSE 0,543 ± 0,001 0,63 ±0,08 ARABINOSE LIGADA A OLIGOMEROS 0,13 ±0,01 S0,3 FURFURAL 0,55±0,03 0,71 ±0,01 ACIDO ACETICO 1,063±0,002 1,1 ±0,2 GRUPOS ACETIL LIGADO A OLIGOMEROS 0,2±0,1 1,0±0,7 LIGNINA SOLUVEL NO HIDROLISADO ANTES DA POS- 4,75 ±0,01 4,6±0,2 HIDRÓLISE

LIGNINA SOLUVEL NO HIDROLISADO DEPOIS DA POS- 2,6 ±0,1 1,7 ± 0, 1 HIDRÓLISE

LIGNINA INSOLUVEL NO HIDROLISADO DEPOIS DA n.a 3,0 ± 0,1 PÓS-HIDRÓLISE

TOTAL IDENTIFICADO* 22,0 ±0,3 24±2 TOTAL SOLUBILIZADO** 34,0 36,0 TOTAL SOLUBILIZADO PARA COMPOSTOS NAO 12,0 12,0 IDENTIFICADOS


*valores calculados pela soma de todos os componentes, menos a quantidade de lignina

solúvel no hidrolisado depois da pós-hidrólise e da lignina insolúvel no hidrolisado depois da

pós-hidrólise

**calculado pela diferença, em relação à base seca, entre a massa de bagaço introduzida no

reator e a massa de bagaço pré-tratado após a remoção da fração solúvel em água

(hidrolisado)

Como pode ser visto, os resultados de oligômeros de glicose,

hidroximetilfurfural, furfural, arabinose, grupos acetil e lignina solúvel

apresentam a mesma magnitude dos resultados reportados por SILVA (1995).

A quantidade de oligômeros de xilose foi menor e variou de 10,67% para

12,8%, porém está dentro do erro experimental estimado para o processo.

55

No hidrolisado, 1,25% do bagaço solubilizado provieram da celulose,

14,04% das polioses, 1,189% dos grupos acetil ligados às polioses e 4,8% da

lignina (tabela 5). A celulose foi solubilizada como oligômeros de glicose

(1,25%) e hidroximetilfurfural (0,077%). As polioses foram solubilizadas como

arabinose livre (0,543%), arabinose ligada à oligômeros (O, 13%), xilose

(2,70%}, furfural (0,546%) e oligômeros de xilose (10,67%). Os grupos acetil

foram hidrolisados a ácido acético livre (1,063%) e parte permaneceu ligada a

oligômeros (0,2%) (tabela 8). A quantidade de bagaço hidrolisado a compostos

não identificados foi de 12,0%.

4. 2. DETERMINAÇÃO DE OLIGÔMEROS DE XILOSE E GLICOSE POR CLAE

Os principais produtos identificados no hidrolisado de bagaço de cana

pré-tratado por explosão a vapor foram oligômeros de xilose (10,67%) (tabela

6). A análise cromatográfica do hidrolisado, usando uma coluna apropriada

para separação dos oligômeros de açúcares (HPX-42A), produziu o

cromatograma mostrado na figura 12, cujo tempo de retenção de cada pico é mostrado na tabela 9.

RI

A

o 5 10 15 20 25

t (min)

Figura 12. Hidrolisado hemicelulósico obtido por explosão a vapor ( 190ºC/15

min) analisado na coluna Aminex HPX 42A, para a determinação de

oligômeros.

56

Tabela 9. Tempos de retenção dos açúcares identificados no hidrolisado

hemicelulósico obtido por explosão a vapor (190ºC/15 min) analisado na coluna

Aminex HPX 42A para a determinação de oligômeros.

Açúcar Tempo de Retenção

(min)

H 6,5

F 12,063

E 13, 171

D 14,075

e 15, 171

8 16,464

A 18,023

G 19,952

O cromatograma produzido pela injeção de uma amostra contendo

xilose, xilobiose e xilotriose é mostrado na figura 13, cujo os respectivos

tempos de retenção são mostrados na tabela 1 O.

RI 8

e A

o 5 10 15 20

Figura 13. Cromatograma de uma amostra padrão contendo xilose, xilobiose e xilotriose

57

Tabela 10. Cromatograma de uma amostra padrão contendo xilose, xilobiose e

xilotriose.


(min)

e 15,269

B 16,5

A 17,982

Observou-se que nessa amostra padrão, o oligômero de xilose com grau

de polimerização 2 (xilobiose) apresenta maior concentração, seguido de

xilotriose e por fim, xilose.

O cromatograma produzido pela hidrólise de xilana de bétula é mostrado

na figura 14 e os respectivos tempos de retenção para os picos são mostrados

na tabela 11 .

RI A

8

o 5 10 15 20 25 t(min)

Figura 14. Xilana hidrolisada com H2SQ4 72% a 25º C e analisada na coluna

Aminex HPX-42A, em um detector de Índice de Refração.

58

Tabela 11. Tempos de retenção dos xilo-oligômeros obtidos por hidrólise de

xilana (25ºC/7min) e analisados na coluna Aminex HPX 42A.


(min)

F 12,061

E 13.329

D 14,258

e 15,344

B 16,610

A 18,109

A comparação entre os tempos de retenção dos açúcares presentes na

amostra padrão, com os tempos de retenção dos açúcares presentes nos

hidrolisados (figura 12 e 14), permitiu atribuir os picos A, B e C à xilose,

xilobiose e xilotriose, respectivamente. Por extrapolação, os picos D, E e F

foram atribuídos à xilotetraose, xilopentaose e xitoexaose.

Para se confirmar que no cromatograma do hidrolisado, nenhum dos

picos atribuídos aos oligômeros de xilose estavam sobrepostos aos oligômeros

de glicose, foi preparada uma solução contendo oligômeros de glicose a partir

da hidrólise parcial de uma amostra de celulose cristalina, cujo cromatograma

está mostrado na figura 15.

59

RI

o 5 10 15 20

t (min)

Figura 15. Celulose hidrolisada com H2S04 72% a 45º C e analisada na coluna

Aminex HPX-42A, em um detector de Índice de Refração.

Observou-se a glicose pura em maior quantidade, seguido do seu

dímero e seus oligômeros, com o grau de polimerização variando de 1 a 6. Os

tempos de retenção de cada açúcar pode ser visto na tabela 12.

Tabela 12. Tempos de retenção dos gluco-0ligômeros obtidos por hidrólise de

celulose (45ºC/7min) e analisados na coluna Aminex HPX 42A.


(min)

N 10,344

M 11,229

L 12,334

K 13,736

J 15,524

1 17,680

Os tempos de retenção mostraram-se bastante diferentes dos obtidos

nos cromatogramas contendo oligômeros de xilose. A ausência de oligômeros

de glicose é ainda reforçada pelos resultados mostrados na tabela 6, cuja

quantidade de oligômeros de glicose foi mínima (1,25%). Esses oligômeros

60

provavelmente podem ser atribuídos ao pico de alta massa molar com tempo

de retenção de 6,5 min (pico H).

Desta forma, a análise qualitativa do hidrolisado mostrou a presença de

oligômeros de xilose com grau de polimerização variando de 2 a 6, com

predominância de xilobiose e xilotriose, além de arabinose (figura 12).

A determinação quantitativa dos oligômeros de xilose não pôde ser

efetuada devido à ausência de padrões cromatográficos. Foi feita uma tentativa

usando uma curva padrão de xilose, assumindo-se que o índice de refração

dos oligômeros fosse próximo ao desse carboidrato. O balanço de massa

efetuado a partir do cromatograma obtido da hidrólise parcial de uma

quantidade conhecida de xilana de bétula (Sigma), mostrou que somente

58,5% da massa inicial foi reportada. Isto revela que o índice de refração dos

oligômeros é inferior ao da xilose e não pode ser usado na quantificação.

4.3. IDENTIFICAÇÃO DE COMPLEXOS LIGNINA-CARBOIDRA TO

PRESENTES NO HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE

CANA POR EXPLOSÃO A VAPOR

A distribuição da massa molar dos compostos presentes no

hidrolisado é mostrada na figura 16. O cromatograma exibe uma região de alta

massa molar, que equivale a 10% da área total do cromatograma e que foi

eluída entre 3,8 ml e 4,4 ml, correspondendo a uma faixa de 85 kg/mola 33

kg/mol. Uma região de massa molar intermediária, eluída entre 6 ml e 7 ml,

correspondendo a uma variação de 7195 g/mol a 2777 g/mol e outra de massa

molar mais baixa, eluída entre 7,9 e 8,8, correspondendo a massas entre

1297 g/mol e 500 g/mol. Nesta coluna o volume de exclusão (Vo) foi de 2,84 ml

e todas as frações do hidrolisado foram aluídas a volumes maiores que o Vo.

61

RI

3 6 9 12 T(min)

Figura 16. SEC da fração do hidrolisado filtrada somente em membrana, para

retirada de sólidos.

A distribuição da massa molar da fração do contendo os carboidratos e

que foi separada do hidrolisado por filtração em cartucho de extração sólida

Sep-Pak C18, é mostrada na figura 17. Esta fração possui massa molar mais

baixa e foi eluída entre 8 e 1 O ml, correspondendo a uma faixa de massa

molar variando de 1073 a 160 g/mol.

RI

o 2 4 6 8 10 12

Volume de eluição (ml)

Figura 17. SEC da fração do hidrolisado hemicelulósico filtrada em cartucho de

extração sólida Sep-Pak C18.

62

A distribuição de massa molar da fração contendo os compostos

aromáticos retidos no cartucho de extração sólida Sep-Pak C18 e que foi

posteriormente dessorvida com etanol é mostrada na figura 18 . Essa fração foi

eluída entre 4 e 8 ml, correspondendo a uma faixa que variou de 18 kg/mal a

2780 g/mol. A fração eluída entre 8,5 e 12 ml corresponde ao etanol (solvente

usado para dessorção dos compostos de lignina no cartucho C18).

RI

o 2 4 6 8 10 12

Elution Volume (ml)

Figura 18. SEC da fração do hidrolisado hemicelulósico retida em cartuchos de

extração sólida Sep-Pak C18 (Waters) e dessorvida com etanol.

A comparação dos cromatogramas mostrados nas figuras 16, 17 e 18

mostra que a maior parte da fração de massa molar compreendida entre

85 kg/mal a 33 kg/mol (que na figura 16 eluiu entre 3,8 ml e 4,4 ml) ficou

retida nos cartuchos de extração sólida Sep-Pak C 18 e portanto não foi

· detectada nos cromatogramas das figuras 17 e 18.

O fato de uma fração dos compostos presentes no hidrolisado ser

adsorvida em Sep-Pak C 18 indica o caráter aromático desses compostos.

Assim, a fração pode ser composta de derivados de lignina e/ou de complexos

lignina-carboidrato. Como essa fração foi detectada por índice de refração, a

hipótese de que ela seja composta também por complexos lignina-carboidrato

é reforçada.

A presença desses complexos decorre da associação íntima entre os

polissacarídeos e lignina da parede celular (LIN e DENCE, 1992) e esses

63

dados mostram a dificuldade de separá-los por processos químicos e físicos,

incluindo o pré-tratamento por explosão a vapor.

A hipótese da presença de complexos lignina-carboidrato foi ainda

reforçada pela análise de carboidratos na fração adsorvida em C-18 (item

3.6.1 ). A determinação por CLAE mostrou a presença de celobiose (0,26 g/L) e

de xilose (0,45 g/L).

A fração eluída em C18 (item 3.6.1) foi composta predominantemente de

carboidratos: celobiose (O, 17 g/L), ácido metilglucorônico (0,05 g/L), xilose

(0,03 g/L) e arabinose (0,06 g/L). A ausência de compostos aromáticos

derivados da lignina nessa fração foi confirmada pelo espectro de

infravermelho, mostrado na figura 19.

o Ili

.... u e • J:I t. o • J:IO < • ..

li

o

li

3eoo 3000 2eoo 2000 1eoo Wavanumber Ccm-1)

1000 eoo


eluído em uma série de cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18. Espectro

obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da matéria orgânica presente no

hidrolisado liofilizado.

64

O espectro de infravermelho dessa fração mostrou bandas em

3418 cm", 2964cm-1 e 1094 - 1044 cm", atribuídas a absorção dos grupos

0-H, C-H e C-0, respectivamente. A comparação do espectro dessa fração

com o espectro de infravermelho de celulose e hemicelulose de eucalipto,

apresentados na figura 20 (MICHEL, 1988), mostra as semelhanças entre eles,

apresentando uma banda intensa em aproximadamente 1140 cm", típica

desses compostos. Além disso, no espectro da figura 19, a banda em

151 O cm", característica de compostos aromáticos derivados de lignina, está

ausente.

O espectro de infravermelho da fração do hidrolisado adsorvida em Sep-

Pak C 18 e dessorvida com etanol é apresentada na figura 21. Esse espectro

apresenta uma banda em 1510 cm", indicando a presença de compostos

aromáticos derivados da lignina, cujo espectro é mostrado na figura 22.

o.0of · f.

000 t ,a) 0.70 o 060 t t:'. ó 050 ~ . .o ,_

0.40 ! o "" . .o 0.30 «l

0.20 0.10 - 0.00

0.60 r ; ~ 0.50 i- u ' e:: l a 0.40 .o r "- o 0 .. 30 i- <..':t 1 ,O

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0.32 0.28

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WOOD

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l j I t j 1

l l l l j I l l I

I i I l l CELLULOSE

l 1 !

l l a l l I l l í I

HEM 1CELLULOSE 1 ! l

I l

O.iO

600

Figura 20. Espectros FTIR de transmissão de Eucalyptus regnans e seus componentes (MICHEL, 1988).

65

66

o N

1) ... u e • a L o • ao < . ..

1)

o

o ºt40~0~0..,......, ......... ~3~e~oo .......... ---.-+3-oo~o--......;,=2~e~o~o--.'"'=~2Fo~oo::::..,_ __ ...-+1e-o-o---r-r-+-10-o-o._.._,..~e-oo

H•venumber- (cm-1)


adsorvido em uma série de cartuchos de extração sólida Sep-Pak C 18,

dessorvido com etanol e concentrado a pressão reduzida. Espectro obtido a

partir de pastilhas de KBr com 0,5% da matéria orgânica presente no

hidrolisado adsorvido e seco.

- -_.,,

O espectro mostrou também bandas em 3417 cm", 1607 cm" e

1094 - 1044 cm", atribuídas à absorção dos grupos 0-H, C=C e C-0,

respectivamente. Apresentou ainda uma pequena banda localizada

aproximadamente em 1167 cm" associada à banda em 1125 cm".

As bandas ( 1670-1700 cm") podem ser atribuídas à presença de

ésteres dos ácidos p-cumárico e ferúlico, que em complexos lignina-carboidrato

apresentam-se ligados à arabinose (McDOUGALL et ai., 1993).

Adicionalmente, o espectro apresenta uma banda em 1050 cm", característica

também de carboidratos (figura 19) e que foi mostrada no espectro de celulose

e hemicelulose da figura 20. Essa banda aparece sobreposta à banda atribuída

67

aos derivados de lignina entre 1094 - 1044 cm", confirmando a existência de

complexos lignina-carboidratos, conforme postulado a partir das análises do

hidrolisado por HPSEC e CLAE.

fi o

\ . ... •• ,, .• ., .... · ) · .. :-,..~'.'f". · _., P la •• 1 ·Ili'-' 1 1:.Y.~-f--- ............ -+--

3l900 SSOCQ aeno aooo "!.BOC l(:IO(I W•v•~ [D&*lj

Figura 22. Espectro FTIR da lignina de bagaço de cana pré-tratado por

explosão a vapor e extraída com NaOH 1 % a 1 OOºC. Espectros tirados de

pastilhas de KBr com 0,5% de lignina (SILVA, 1995).

A análise da fração dessorvida com etanol (item 3.6.1 ), derivatizada e

analisada por GC/MS (item 3.8) não mostrou a presença de compostos

aromáticos de baixa massa molar, pois nenhum pico foi detectado. Isto significa

que os compostos de baixa massa molar, ou ficaram ligados de modo

irreversível à coluna C18 (Sep-Pak), ou a quantidade presente na alíquota

analisada (40 mL) foi pequena ou esses compostos sofreram polimerização.

Dessa forma, o uso de C 18 foi efetivo para separar compostos derivados

de lignina e complexo lignina-carboidrato, mas ineficaz para a separação e

identificação dos compostos de baixa massa molar.

68

4.4. FRACIONAMENTO DOS COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISADO POR EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO

O rendimento das diversas frações obtidas no procedimento de extração

líquido-líquido é mostrado na tabela 13.

Tabela 13. Rendimento das frações obtidas no procedimento de extração

líquido-líquido.

FRAÇAO QUANTIDADE (g) RENDIMENTO(%)

Bagaço solubilizado 3,4 34

Fração aquosa (FA1) 2,9463 29,5

Fração orgânica 1 (F01) 0,0907 0,9

Fração orgânica 2 (F02) 0,1372 g 1,4


Fração orgânica 4 (F04) 0,087 g 0,87





Do bagaço seco submetido à solubilização, cerca de 29,5% dos

compostos ficaram retidos na fração aquosa FA1 e 4,35% foram distribuídos

entre as frações ácidas, fenólicas e neutra (F02 - F06). Esse valor é muito

próximo do valor reportado pela lignina solúvel (4,8%), mostrado na tabela 5.

Portanto, os 29,5% presentes na fração FA1 devem englobar os carboidratos e grupos acetil presentes no hidrolisado (16,5%), além dos 12% de bagaço solubilizado para compostos não identificados (tabela 5), os quais foram

produzidos pelas reações de degradação do furfural e hidroximetilfurfural. O

fato dos compostos não identificados estarem solubilizados na fração aquosa,

indica que são compostos altamente polares, provavelmente ácidos carboxílicos (FENGEL e WEGENER, 1989).

69

O balanço de massa mostrado na tabela 13 indica ainda que a

quantidade de compostos presentes nas frações aquosas F A2. e FA3 devem

ser atribuídas ao NaCI produzido nas etapas de acidificação e neutralização

envolvidas no processo de extração líquido-líquido e não aos compostos

presentes no hidrolisado.

4.4.1. Cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massas

Com o objetivo de identificar os compostos voláteis de baixa massa

molar presentes na solução de acetato de etila, proveniente da extração do

hidrolisado (item 3.6.2), uma pequena alíquota foi separada e analisada por

GC/MS sem derivatização prévia. Nessa fração, nenhum composto volátil foi

detectado, o que demonstra que os compostos voláteis como o furfural e o

hidroximetílfurfural provavelmente foram eluídos próximos do tempo de

retenção do solvente e portanto foram eliminados no intervalo de corte do

solvente.

Dessa forma, uma outra alíquota de 100 mL foi retirada e seca em P20s (F01 ), derivatizada e analisada por GC/MS e GC/FID. Os cromatogramas TIC

e FIO dessa fração são apresentados nas figuras 23 e 24, respectivamente. A

atribuição dos picos dos compostos identificados, bem como os respectivos

tempos de retenção, massa dos íons moleculares dos derivados sililados,

massa e a quantidade relativa dos compostos em relação à massa total da

fração são mostrados na tabela 14.

70

49

. , ., -T"""":""""T"""""t""""T'""T""l"" .. , .. --,---,····T··-,----,-·············r··--,-···r

F

1

f-: :,:::::~D:= ·;,~".:; :,1 ., 1000 2000 ::soo o 4000

26: 42



espectrometria de massas.

47 1

i 1

~


após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama (FIO).

71


fração F01.

Pico nº Trre1 lon Derivado TMS do m (g) %

Molecular

47 0,42 194 1,9x10~ 2,12

Ho----@-rno

10 0,59 224 6,7 X 10-4 0,74

:?-CHO 26 0,69 282 8,2 X 10-s 0,09

Ho----@-cooH

11 0,75 254

~~

3,6 X 10-4 0,40

OH O CHO

CH3 49 0,92 308 Ho--0)--CH=CH-COOH

3,7 X 10-;j 4,1

F 1,0 202 ©r$ - - fluoranteno

6 1,02 338 H:P-CHaCH-COOH 1,5 X 10-4 0,17

CH3

O composto responsável pelo maior pico presente no cromatograma da

figura 23 foi identificado como derivado sililado do ácido p-cumárico (49). O

composto 6 foi identificado como derivado sililado do ácido ferúlico. O

composto 47 foi identificado como derivado sililado do p-hidroxibenzaldeído. O

composto responsável pelo pico 26 foi identificado como derivado sililado do

ácido p-hidroxibenzóico e os compostos 11 e 1 O como dos derivados sililados

do siringaldeído e vanilina, respectivamente. Os picos eluídos no início do

cromatograma (até Trrel = 0,36) foram atribuídos a produtos de decomposição

do agente sililante (BSTFA) e após Trret = 1,05 foram atribuídos à provável

72

sangria de coluna. Todos os espectros de massas citados anteriormente estão

apresentados no Apêndice 1 .

Para a quantificação dos compostos identificados no GC/MS utilizou-se

uma calibração feita com fluoranteno (GONÇALVES, 1995) . Os resultados

obtidos na quantificação dos compostos dessa fração orgânica são mostrados

na tabela 14. O ácido cumárico foi o composto presente em maior quantidade

(4,1%). Além desse ácido cinamílico também foi detectado na amostra a

presença de pequena quantidade de ácido ferúlico (0, 17%). Esses ácidos

seriam provenientes da hidrólise dos ésteres correspondentes presentes nas

ligninas de gramíneas (FENGEL e WEGENER, 1989). O mesmo ocorre para o

ácido p-hidroxibenzóico (26). O composto 47 identificado como p-

hidroxibenzaldeído foi detectado em quantidade moderada (2, 12%). Esse

aldeído pode ter sido gerado na clivagem das ligações f3-éter das ligninas de

gramíneas (LIN e DENCE, 1992). Os compostos 11 e 1 O identificados como

siringaldeído e vanilina, respectivamente, foram detectados em pequenas

quantidades (0,40% e 0,74%) e foram encontrados como monômeros

proeminentes entre os produtos de degradação da lignina. HISHIYAMA e

SUDO (1989) postulam que esses aldeídos aromáticos são formados pela

clivagem de ligações éter existente entre grupos benzaldeído terminais e a

macromolécula de lignina ou a partir das reações hidrolíticas sobre as ligações

f3-0-4 de grupos terminais contendo grupos hidroxilas livres. TANAHASHI et ai.

( 1989) postulam a quebra homo lítica na posição ex de unidades fenilpropano

terminais.

Somente 7,62% da massa total da fração F01 (tabela 14) corresponde a

compostos identificados. Parte dos compostos volatilizados não puderam ser

identificados e a maior parte dos compostos restantes provavelmente são de

alta massa molar.

Os cromatogramas TIC e FIO da fração ácida (F02) obtida na extração

dos compostos solúveis em acetato de etila após extração com NaHC03,

diclorometano e acetato de etila são apresentados nas figuras 25 e 26,

respectivamente. A atribuição dos picos dos compostos identificados, bem

como os respectivos tempos de retenção, massa dos íons moleculares dos

73

derivados sililados, massa e quantificação relativa dos compostos em relação

à massa total da fração são mostrados na tabela 15.

····r···r•···,·-·,··r···,····r···,--··r-~·-r·--,----,···,····r···, .. -- r- --,--·-i-··r···r··,--------,--··r···,--------1-···r·-·1·'. ,~-r- • ~ººº 3000

~<, s o~

• • 1. ·~




,·-, 49 F. - l - . ....; "' ... ,, - ç-,j ,,i fi

6

26

15



74


fração F02.


molecular

26 0,51 282 Ho-@--cooH

6,9 X 10-0 0,05

15 0,67 312 1,6 X 10-º 0,01 H~COOH

CH3 16 0,84 342

~caE

5,4 X 10-4 0,39

CH3 49 0,87 308

Ho--(Q)-CH=CH-COOH 5,5 X 10-~ 4,01

F 1,0 202 - -

~

fluoranteno

6 1,05 338 H:P--CH=CH-COOH

5,5 X 10-º 0,04

CH3





ácido p-hidroxibenzóico e os compostos 15 e 16 como derivados sililados do

ácido vanílico e ácido siríngico, respectivamente. Os picos aluídos no início do

cromatograma (até Trre1 = 0,34) foram atribuídos a produtos de decomposição

do agente sililante (BSTFA) e após Trrel = 1,06 foram atribuídos sangria de

coluna. Todos os espectros de massas citados anteriormente estão apresentados no Apêndice 1 .

Os resultados obtidos na quantificação dos compostos dessa fração

orgânica são mostrados na tabela 16, que mostra o ácido cumárico como o

composto presente em maior quantidade (4,01%). Além desse ácido cinamílico

75

também foi detectado na amostra a presença de pequenas quantidades do

ácido ferúlico (0,04%). O ácido p-hidroxibenzóico (composto 26) também foi

detectado em quantidades ínfimas (0,05%). Os compostos 15 e 16

identificados como ácido vanílico e ácido siríngico, respectivamente, foram

detectados em pequenas quantidades (0,01% e 0,39%) e podem ser formados

através da hidrólise ácida das ligações éter ou éster das ligninas de gramíneas

(LIN e DENCE, 1992).

Somente 4,5% da massa total da fração F02 (tabela 15) correspondem

a compostos identificados. Parte dos compostos volatilizados não puderam ser


alta massa molar.

Os cromatogramas TIC e FIO da outra fração ácida (F03), obtida na

extração dos compostos solúveis em diclorometano após extração NaHC03,

são apresentados nas figuras 27 e 28, respectivamente. A atribuição dos picos

dos compostos identificados, bem como os respectivos tempos de retenção,

massa dos íons moleculares dos derivados sililados, massa e a quantidade

relativa dos compostos em relação à massa total da fração são mostrados na

tabela 16.

TOT·

76

49 63

1

F

""'º -re o c 24.f:00 'l.200

.:,o: 02




53

t. 1

r-

49

li 6

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i 11

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f 11 ,1 ?. ~· .... :2 -e

i',"" i' e::, (·1 .,

~ j ..: -·



77


fração F03.

Pico nº Trrel íon Derivado TMS do m (g) %

molecular

53 0,36 246 Não identificado - -

10 0,40 224 O~CIIO

8,0x 10-4 0,40

CH30 11 0,58 254 :?-rno 7,2 X 10-o 0,36

54 0,68 308 Ho--@-CH=CH-COOH

6,2 X 10-o 0,51

49 0,87 308 Ho--@-CH=CH-COOH

5, 1 X 10-0 2,56

F 1,0 202

©x$ - -

fluoranteno

6 1,05 338 H:P--ffi,Q(.COQH 6,4 X 10-o 0,32

CH3



tempo de retenção dos compostos 49 e 54 são diferentes. No entanto, o

caminho de fragmentação dos dois compostos são idênticos, sendo atribuído

ao composto 54 o isômero eis do ácido p-cumárico (isômeros eis e trans). O

composto 53 não foi identificado. O composto 6 foi identificado como derivado

sililado do ácido ferúlico. Os compostos 1 O e 11 foram identificados como

derivados sililados da vanilina e siringaldeído, respectivamente. Os picos

aluídos no início do cromatograma (até Trre1 = 0,29) foram atribuídos a produtos

de decomposição do agente sililante (BSTFA) e após Trre1 = 1,06 foram

78

atribuídos à sangria de coluna. Todos os espectros de massas citados

anteriormente estão apresentados no Apêndice 1 .


orgânica são mostrados na tabela 16, que mostra o ácido cumárico como o

composto presente em maior quantidade (2,56%). Além desse ácido cinamílico

também foi detectado na amostra a presença de uma quantidade muito

pequena de ácido ferúlico (0,32%). Os compostos 10 e 11 identificados como

vanilina e siringaldeído, respectivamente, foram detectados em pequenas

quantidades (0,01% e 0,39%).




alta massa molar.

As frações F02 e F03 foram obtidas com o intuito de separar os ácidos

carboxílicos presentes no hidrolisado. No entanto, a quantidade (0,002 g) de

compostos extraídos com diclorometano (F03) foi muito menor do que da

fração (F02) extraída com acetato de etila (O, 1372 g).

Os ácidos trans-cumárico e ferúlico são compostos comuns às duas

frações. Entretanto, na fração F02 o ácido ferúlico e o ácido trans-cumárico

aparecem em quantidades 10 e 100 vezes maiores que na fração F03,

respectivamente.

Esses resultados mostram também que o ácido cis-cumárico não foi

solúvel em acetato de etila, pois aparece apenas na fração F03. O mesmo

acontece com o siringaldeído e com a vanilina. Por outro lado, os resultados

mostram ainda que os três ácidos carboxílicos (ácido p-hidroxibenzóico, ácido

vanílico e ácido siríngico) foram solubilizados apenas na fração extraída com acetato de etila (F02).

Os cromatogramas TIC e FIO da fração fenólica F04, obtida na extração dos compostos solúveis em acetato de etila após extração com NaOH 2N e

diclorometano são apresentados nas figuras 29 e 30, respectivamente. A

atribuição dos picos dos compostos identificados, bem como os respectivos

tempos de retenção, massas íons moleculares dos derivados sililados, massa e

quantidade relativa dos compostos em relação à massa total da fração são mostrados na tabela 17.

79

LOQ ...

1 1

l i

F

TO"X'''I ·- 1 1 1

\

• 49 \ L.,.,.,,)_../'\ 47 ~ 1 1

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.. ~<>-: o~ .a o i 02 30: O:::? 40:. 02




J



80


fração F04.


molecular

47 0,30 194 1,3 X 10..;j 1,5 Ho--@--rno

26 0,38 282 Ho---@--cooH

6,9x10-::i 0,06

49 0,87 308 Ho--@--CH=CH-COOH

4,3 X 10-::, 0,05

F 1,0 202

~

- - fluoranteno

6 1,05 338 H:?--Cl-laQI-O)()H 1,6 X 10-4 0,14

CH3


figura 29 foi identificado como derivado sililado do p-hidroxibenzaldeído (47). O


composto 49 foi identificado como derivado sililado do ácido p-cumárico. O


ácido p-hidroxibenzóico. Os picos aluídos no início do cromatograma (até Trre1 = 0,27) foram atribuídos a produtos de decomposição do agente sililante (BSTFA)

e após Trre1 = 1,06 foram atribuídos sangria de coluna. Todos os espectros de

massas citados anteriormente estão apresentados no Apêndice 1 .


orgânica são mostrados na tabela 17, que mostra o p-hidroxibenzaldeído (47)

como o composto presente em maior quantidade (1,5%), seguido de uma

quantidade pequena de ácido ferúlico (6) (0, 14%). Os ácidos p-hidroxibenzóico

(26) e trans-cumárico (49), foram detectados em pequenas quantidades (0,06%

e 0,05%).

81




alta massa molar.

Os cromatogramas TIC e FIO da outra fração fenólica (FOS), obtida na

extração dos compostos solúveis em diclorometano após extração com NaOH

2 mol.L" são mostrados nas figuras 31 e 32, respectivamente. A atribuição dos

picos dos compostos identificados, bem como os respectivos tempos de

retenção, massas íons moleculares dos derivados sililados, massa e

quantidade relativa dos compostos em relação à massa total da fração são

mostrados na tabela 18.

82

'"º-~, i3 1

F

49

1 ~

l t.:«: ,. .•• , •• -·,· ..• y .. ,~K.c, ... 1lJ .... J ... , .... 1\ .. 1 .. r····~·······) ..•. =,····,J=·'i·.·.,cc,~CC ··i r:»; .: ,,... r: , ':.: '. ...... oo 11:100

4 C) ~ ô?.

2400 e o a O:..?


fração orgânica FOS após derivatização com BSTFA e detectados por


Figura 32. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica FOS


83

Tabela 18. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados

na fração F05.


molecular

53 0.36 246 Não identificado - -

11 0.58 254

~

1,0 X 10-.i 0,51

~ O CHO

15 0.67 312 4,2 X 10-o 0,012 H~COOH

CH3 54 0.68 308

Ho---@--CH=CH-COOH 1,3 X 10-:i 0,64

49 0.87 308 Ho---(Q)--CH=CH-COOH

6,0 X 10--> 2,99

F 1.0 202 -s - - fluoranteno

6 1.05 338 H:P--CHaCl-1-COOH

9 X 10-o 0,45

CH3



tempo de retenção dos compostos 49 e 54 foram diferentes. No entanto, o

caminho de fragmentação dos dois compostos são idênticos, sendo atribuído

ao composto 54 o isômero eis do ácido p-cumárico. O composto 53 não foi

identificado. O composto 6 foi identificado como derivado sililado do ácido

ferúlico. O composto 11 foi identificado como derivado sililado do siringaldeído.

Os picos aluídos no início do cromatograma (até Trre1 = 0.31) foram atribuídos a

produtos de decomposição do agente sililante (BSTFA) e após Trre1 = 1.06

84

foram atribuídos sangria de coluna. Todos os espectros de massas citados

anteriormente estão apresentados no Apêndice 1 .


orgânica são mostrados na tabela 18. O ácido trans-cumárico foi o composto

presente em maior quantidade (2,99%), seguido de seu isômero eis (0,64%).

Além desses ácido cinamílicos, também foi detectada na amostra a presença

de uma quantidade pequena de ácido ferúlico (0,45%). O siringaldeído (11) foi

detectado em pequena quantidade (0,51 %), bem como o ácido vanílico (15)

(0,012%).

Apenas 4,8% da massa total da fração F05 (tabela 18) corresponde a

compostos identificados. Parte dos compostos volatilizados não puderam ser


alta massa molar.

As frações F04 e F05 foram obtidas com o intuito de separar os fenóis

presentes no hidrolisado. No entanto, a quantidade (0,002 g) de compostos

extraídos com diclorometano (F05) foi bem menor do que a fração F04,

extraída com acetato de etila (0,0866 g).

Os ácidos trans-cumárico e ferúlico foram compostos comuns às duas

frações. Entretanto, na fração F04, o ácido ferúlico aparece em quantidades 18

vezes maiores que na fração F05, enquanto a quantidade de ácido trans-

cumárico foi praticamente a mesma nas duas frações.

Esses resultados mostram também que o ácido cis-cumárico não é solúvel em acetato de etila, aparecendo apenas na fração F05. O mesmo

ocorre com o siringaldeído (11) e com o ácido vanílico (15). Por outro lado, o

ácido p-hidroxibenzóico (26) e o p-hidroxibenzaldeído (47) foram solubilizados

apenas na fração extraída com acetato de etila (F04).

Na fração orgânica F06, considerada fração neutra, nenhum composto

foi identificado. Os picos com Tretre1 = 10,50 min e Tretre1 = 11, 06 min são os

únicos picos que aparecem no cromatograma. Foi feita a injeção de um branco

com os solventes utilizados na análise da fração neutra e foi constatado que os

picos citados são derivados de impurezas contidas nos solventes.

85

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~0:02 4000

-4;~ 1 ~2

Figura 33. Cromatograma reconstituído (TIC) da fração orgânica 6 evaporada

a pressão reduzida e derivatizada com BSTFA.

4.4.2. Espectroscopia no Infravermelho

Amostras das frações F01, F02, F04 e F06 foram submetidas a

espectroscopia no infravermelho. Os espectros produzidos são mostrados nas

figuras 34 a 37, respectivamente. As frações F03 e FOS não foram produzidas

em quantidades suficientes para a realização dos espectros e foram usadas

exclusivamente para as análises de GC/MS.

Os espectros das frações F01, F02 e F04 são muito parecidos e

apresentam as características esperadas de compostos aromáticos. Os

espectros mostraram bandas em 3417 cm", 1607 cm" e 1094 - 1044 cm",

atribuídas a absorção dos grupos 0-H, C=C e C-0, respectivamente.

As bandas (1670-1700 cm") podem ser atribuídas à presença de ácidos

carboxílicos aromáticos, tais como, ácidos p-cumárico e ferúlico ou seus

ésteres.

A ausência de uma banda forte na região de 1050 cm", característica de

derivados de celulose e polioses foi observada, o que indica a ausência de

carboidratos nas mesmas frações.

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86

Figura 34. Espectro de infravermelho da fração fenólica F01 obtida por

extração com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana.

Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F01.

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Figura 35. Espectro de infravermelho da fração ácida F02 obtida por extração


obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F02.

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87

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1-- • 1!100

Figura 36. Espectro de infravermelho da fração total F04 obtida por extração



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• o . e • • a.,. e, •. ao ... • ~ .

;.. • • ,.. t .,.. r 4000 :91500

1

Figura 37. Espectro de infravermelho da fração neutra F06 obtida por extração



'-,.. _ __..,-.,, . . . ' ' ,. ' . 21500 2000

W•venufflbar (c,n- ~)

88

4.4.3. Considerações finais sobre os compostos identificados por GC/MS

A quantidade total de cada composto identificado por GC/MS no

hidrolisado obtido do pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a vapor é

mostrada na tabela 19.

Tabela 19. Quantidade total de cada composto identificado por GC/MS no

hidrolisado obtido do pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a vapor.

Composto Massa (mg) [composto] (mg/L)

no hidrolisado*

1 - p-Hidroxibenzaldeído 3,2 5,5

2 - Acido p-hidroxibenzóico 0,19 0,33

4 - Ácido trans-cumárico 9,3 16,0

6 - Acido ferúlico 0,38 0,66

7 - Siringaldeído 0,38 0,66

8 - Acido cis-cumárico 1,9 X 10-:.! 3,3x10-;.:

9-Vanilina 1,5 2,60

1 O - Acido vanílico 2,0 X 10-2 3,4 X 10-:.!

11 - Acido siríngico 5,4 X 10-1 0.93

Total 15,5 27.0

* Cálculo efetuado em relação a 580 ml de hidrolisado.

O ácido cumárico (49) foi o principal produto identificado, seguido pelo p-

hidroxibenzaldeído (47), vanilina (10), ácido ferúlico (6), siringaldeído (11),

ácido p-hidroxibenzóico (26) e em quantidades bem menores, ácido siríngico

(16) e ácido vanílico (15), perfazendo um total de 15,5 mg. Esse valor

corresponde a 0,5% de toda a lignina presente no bagaço de cana e 3,2% da

quantidade total de lignina presente no hidrolisado.

A concentração dos compostos contendo grupo p-hidroxifenil foi de

22 mg/L, que foi aproximadamente 6, 7 vezes maior do que a concentração dos

compostos contendo grupo guaiacil (3,3 mg/l) e 14 vezes maior do que a

concentração dos compostos contendo grupo siringil (1,6 mg/l).

89

Dos compostos obtidos da extração líquido-líquido, os considerados

mais tóxicos para vários tipos de fermentação (TRAN e CHAMBERS, 1985;

FENSKE, 1998) foram identificados nesse estudo como derivados sililados dos

ácidos carboxílicos e aldeídos aromáticos. E não foram detectados álcoois e

dímeros.

O hidrolisado obtido no item 3.3 contém 17% de açúcares (3,4 g), que

para ser fermentado teria que ser concentrado por volta de 19 vezes

(McMILLAN, 1994b). Desta forma, os compostos tóxicos também poderiam ser

concentrados 19 vezes, produzindo um hidrolisado contendo esses compostos

em uma faixa de concentração que provavelmente deve contribuir para a

inibição de processos fermentativos, envolvendo o uso de xilose como

substrato.

Por exemplo, TRAN e CHAMBERS (1986a) concluíram que o ácido

siríngico é moderadamente inibitório a P.stipitis e K. pneumoniae quando

presente a níveis de 0,08 mg/l e 0,2-0,5 g/L, respectivamente, mas é

fracamente inibitório a Candida utilis a 4 g/l (MIKULÁSOVÁ et ai., 1990).

Todos esses compostos não são inibitórios a S. cerevisiae a 1.0 g/l (ANDO et

ai., 1986). Similarmente, P. stipitis, K. pneumoniae e C. utilis exibem mais

sensibilidade à vanilina que S. cerevisiae.

O ácido p-hidroxibenzóico mostrou efeito inibitório quando S. cerevisiae

foi utilizada na fermentação de madeira de álamo ou de resíduos agrícolas a

etanol (McMILLAN, 1994b) e p-hidroxibenzaldeído foi inibidor de S. cerevisiae

quando o hidrolisado de álamo foi usado para obter etanol. Ácido siríngico

inibiu a ação de P. sitipis quando os substratos usados foram hidrolisados de

carvalho vermelho, álamo e bétula. Ácido vanílico e vanilina foram inibidores da

mesma levedura quando o substrato usado foi carvalho vermelho na obtenção

de etanol. Siringaldeído foi inibidor de P. stipitis e S.cerevisiae quando

hidrolisados de carvalho vermelho e álamo foram usados como substrato para

fermentação, respectivamente.

Neste trabalho, o efeito inibitório dos compostos aromáticos identificados

no hidrolisado não foi estudado.

A identificação dos compostos aromáticos encontrados no hidrolisado

de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor abre prespectivas para o

início de um trabalho, que leve em conta o efeito inibitório dos mesmos sobre

90

processos fermentativos de interesse industrial, usando xilose e xilana como substratos.

91

5. CONCLUSÕES

No hidrolisado, os principais componentes obtidos foram oligômeros de

xilose, com grau de polimerização (DP) variando de 2 a 6, com predominância

de xilobiose e xilotriose.

A distribuição de massa molar (HPSEC) dos compostos presentes no

hidrolisado mostrou que os carboidratos compõem a fração de menor massa

molar, enquanto a fração contendo lignina solúvel e complexos lignina-

carboidrato compõe a fração de massa molar média mais elevada.

O uso de C18 foi efetivo para a separação entre os compostos de baixa

massa molar e a fração contendo lignina solúvel e complexos lignina-

carboidrato, mas foi ineficaz para a separação e identificação de compostos de

baixa massa molar.

Os compostos de baixa massa molar foram isolados a partir do

fracionamento do hidrolisado por extração líquido-líquido, permitindo sua

identificação por CG/MS.

O ácido cumárico, principal composto identificado, é proveniente da

lignina e da estrutura de heteroxilana, enquanto p-hidroxibenzaldeído e vanilina

são compostos derivados da lignina.

Todos os compostos aromáticos identificados e quantificados são

considerados inibidores de vários processos fermentativos e enzimáticos.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE 1

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o ácido ferúlico (m/z=338).

Background Subtract C:\GCQ\DATA\AMl-280 Date: 05/04/99 12:49:26 Comment: ~-1 FO (NaOH/ di ~l .metano/acetato) (efluent3/eflubagl) Avt:?t'c,g~, or : 1805 to 1809 M·;nus: 1777 t o 1781 100% = 29041 100% 323 .. ,

1 1

SMP l B~G·1

i_ : ,-g ~~

249

219

279

35S

r !

S78j : : :

338

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 SSO

HSi(CH3)3 r: ·CHs r mlz= 308

~e~ m/z= 279

·0Si(CHJ3

ltm/z=219

/~·CHs r: m/z=293 "'Ç Si(CHs)3

m/z= 235

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para a vanilina (m/z=224).

Background subtract C:\GCQ\DATA\AMSFLl..k)R Comment: am. 5 e/ fluoranteno (efluent2/eflubagl) Avera.ge of: 273 to 277 Minus: 297 to 301 100% 194

· Si(CH3h CHO (._-., m/z = 151

·CH3

(' .- m/z=209 OCH3

Si(CH3h · 0Si(CH3)3

"'Çm/z= 163

1

l SMP l B~G ·1

1 1c~ : -3 "' : "l8 ( . , ... . .. or.: : .. \.,-r,y:/r-,i·r;h,i1t1~t:r~+~·r\-., r

50 100 150 200

Date: 06/23/99 10:57:03 100% :. 33349

209

224

HOSi(CH3h ( »r: 119 / _·CH3

~ .- m/z= 194

~C02 m/z= 165

·CH r .. ~=179

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o siringaldeído (m/z=254).

Background subtract C:\GCQ\DATA\AM3FLl.k)R Comment: am. 3 e/ fluoranteno (efluent3/eflubagl) Average of: 469 to 473 Minus: 495 to 499 100% 2S4

Date: 06/29/99 12:15:47

100%: 6822

· Si(CH3h vm/z=181

CHO l' 0Si(CH3)3

~m/z=165

·C~ ~co I oca, <' .. m1z = 239

0Si(CH3h ~CHO

~mlz=225

HOSi(CHJ3

( »r: 149 / _·e~ ~-e~

? ... m/z= 224 .....;('---_..., mlz= 209 <, ~co2

""m/z= 195

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o ácido vanílico (m/z=312)

Background subtract c:\GCQ\DATA\AMl-280 Date: 05/04/99 12:49:26 Ccmment: am.1 FO (NaOH/ dicl.metano/acetato) (efluent3/eflubagl) Average of: 1286 to 1290 M-ir:us: 1268 to 1272 100% : 17319 100% 297

l .:.i:,

~pi :,:::.;._ B~G·1,,·

312

· · 1., 341 385 419447 490 537 607 j .. ,,.,. , ,..!'!-r=·r:·r~t:'h"r"T'i'>"l4t-1.,.1~: · : : : · , "'!'-1 · , • . · , ;'' , ·ryr:·r:·r.,.r:.,.,·,"T'T"l"''l'''fYr:p-rYrfT1":''j''1'"1YFfY;Y'!'l'f'':'''!'''t:"'"r't

50 100 150 20ô 250 300 350 400 450 soo 550 600

267

282

J.81

Ao e~ '-OSi(CHs)3

oc~ ~·OSi(CHs)s

0Si(CHJ3 "'

m/z= 223

HSi(CH3)s r: ·CHs

é ... mlz= 297

HOSi(CH3)3 • 0Si(Ctis}3

( »": 207 {,,m1z= 193

/ _·CHs /(·CHs . ?.., mlz=282---m/z=267

"=C02 ~Si(CHsh m/z = 253 m/z = 209

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o ácido siríngico (m/z=342)

Background Subtract c:\GCQ\DATA\AM2FLl.OR DaT.e: 06/29/99 16:52:15 Comment: am. 2 e/ fluoranteno (melich 2.0-280-10.0/eflubagl) Aver age of : 1315 te 1319 M1 nus: 1310 to 1314 100% ::. 23 54 100% 327

l .

1,,. 29~12

5>!P J 342 1

r r i ~·1 ·: .., - i

j 4 5 1i3

89 150 .i s < t73 5 5 381 418 446 487 541 1 ··i·r,,1·,\'1-r-r~·r':"'r,·rr11,-r,'rr~1tl'; ... ~·1+r~~~Jr~~';· : ,., T ,·,, fr:·r1..-r'T'T~Fr,.r:·r,-["T'ºí"T'ºPT'T,.:"'T1º:"':'T,.r•·p-;-r,..-;-i-

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

HSi(CH3)s

Y m/z=268

ho c::,,- 'oSi(CHs)3 . CHs

é • mlz= 327

H3CO/ OC~ . OSi(CHs)s OSi(CHJ,, "'<:

'\J mlz=253 e 0-C-O-ei(CH:i)3

m/z= 221

·CHs

,}' .. mlz= 312 ·CHs r: m/z=297

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o ácido p-hidroxibenzóico (m/z=282)

Background Subtract C:\GCQ\DATA\AMl-280 D,1te: 05/04/99 12:49:26 Comment: arn.1 FO (NaOH/ dicl .metano/acetato) (efluent3/eflubagl) Average of: 653 to 657 Minus: 672 to 676 J..00% == 24405 100! 267

i

SMP 1 B~G··,

i 1 28

73 193

50 100 150 200

ho e:::-,-- ~ 'osi(CH,),

0Si(C~3

282

2 5 O 3Sú 400 450 500 550

·Si(CH3)3

(___, mlz= 209

(HSi(CH3}s --~·mfz= 238

·CH3

L .. mtz=2a1

"<: · OSi(CHs)3

mfz= 193

HOSi(CH3h ( /mfz= 177 / _·CHs

? m/z=252 ,......._.co2

"'mlz= 223

606 641.

r

1

1 r

f

r •••• ! . ·:

600 650

·CHs

( .. m/z=237

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o p-hidroxibenzaldeído (m/z=194).

Background subtract C:\GCQ\DATA\AM3FLUOR Date: 06/29/99 12:15:47 C<;mment: ~· 3 e/ fluoran~eno (efluent3/eflubagl) Aver.1ge or : 405 to 409 Minus: 387 to 391 100'% = 17825 100% . 169

r r

1 1:_i,_

SMP i

151 r,.

179

...

.) 28 4 5 65 "l?l:J: ..,/,:, 10~ 123 lt 5 Jli lj5l I l J ll '15 ,_, .. , l .lr . ..l.r'·v··1r1J .r, ~ •• :··",'·!.1-•t· "t'~"'··'rll,.J,., .•. J..; . .1.,...),l ..... ,.J.~ ... r-·,·'J. 'e- t.iJ. , '·v'- , L,..1 . •,····--r·::~'.'r".v···r··-:-,.~; ... , ... ).,

20 40 60 80 100 l20 140 160 180 200 220 240

HOSi(CH3h ( /m/z=89

/ _·CH3

r"' .. m/z= 164

~ ";;i!º: 135

m/z=151

CHO

· Si(CH3h k_mtz=121

('HSi(CH3h --'-----. .... mlz = 12 O

·CH3

~ ., mlz= 179

194

·CH (., ~/z= 149

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o ácido cis-cumárico (m/z=308).

Background subtract c:\GCQ\DATA\AMJ.-280 Date.: 05/04/99 12:49:26 i:omment: am.l FO (NaOH/ di cl .metano/acetato) (efluent3/eflubagl) .A.verage of : 1328 te 1332 Minus: 1348 to 1352 100% ::: 13230 10096 293

1 SMP j B;G··1

1 219

l 1 ' , ~- 7-.) 1'7Q "=,, ·i "-"' · · ···o~ i 1,4s l llS fsgj ;·I~ 341 377 447 50653€,567 625 662 l

º'í'T' ,f-r~,,. 't:'h'~fr~'r~l'f!'~·!411. - .... !--··1. . ;-r;"!':'j.,.í":.,.f"':Tj"":1"1'T'":'"f"':'TYf1TYr:Tf'º:Tf'ºf'Fr'"P"f'Y,T'T'T'T1:'ºPT'1''1"1T;. 50 100 150 200 2 50 300 3 50 400 4 50 soo 5 50 600 650 700

249

308

f

l r

Si(CH3)s ;r:=235 ~Si(CH3)3 {·Ct-i:3 {·Ct-i:3 .

J_--r- m/z=233 -- .. ~ m/z=218-- .. mfz=203

·Ct-i:3

("' -. m/z= 293

C02

~., m/z=249

'-<: · 0Si(Ct-i:3h

mlz= 219 y O=C-0-Si(CH,)3

mfz= 191

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o composto 53 (m/z=246).

Composto não identificado.

Background Subtract C:\GCQ\DATA\.AMSFLI.X)R Ccmment: am. 5 e/ fluoranteno (efluent2/eflubagl) .4.verage af: 181 to 185 Minus: 203 to 207 1005\lí. 73

Date: 06/23/99 10:57:03 1.00% = 321123

SMP

BKG

43 91

1 r

r 605\

24 S

161

1.29

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

Apêndice 1

Espectro de massas e proposta de fragmentação para o ácido trans-cumárico (m/z=308).

Background Subtract c:\GCQ\DATA\AMl-280 D,1te: 05/04/99 12 :49:26 Comment: am.1 FO (NaOH/ dicl .metano/acetato) (efluent3/eflubagl) Average of : 1328 te 1332 M"i nus; 1348 to 13 52 100% ::: 13230 100% 293

267 1 341 371 447 506:i36::67 62:, 662

: ·: ~-~-1 ; .. :'T':''"f•T'T":1·r""·:1·;vrr:,·r,·:"·f""t1·r,·ri-r"·r:·r1·r:·p·r:·r:·:·:·p~-,-:-:T:·f:r:~-c-r:T'1!1-q·:r:r. 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

249

308

Sí(CH3h ;r:=235 1'Si(CH3h

~ m/z=233

·Ct-b (' .., m/z=293

·Ct-b ( m/z=218

-ca, ( mlz= 203

C02 r' • mlz=249

'Ç · OSi(CH,),

m/z= 219 y O=C-0-Si(CH},

mlz= 191

Dissertação de Mestrado - Sistema de...

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