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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA

PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E SAÚDE

Cleiton Werner

DESENVOLVIMENTO DE UM COMPOSTO QUÍMICO À BASE DE

METILXANTINAS E POLIFENÓIS COM AÇÃO CRIOPROTETORA PARA CÉLULAS

ESPERMÁTICAS

Dissertação de Mestrado

Joaçaba

2016

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Cleiton Werner

DESENVOLVIMENTO DE UM COMPOSTO QUÍMICO À BASE DE METILXANTINAS E POLIFENÓIS COM AÇÃO CRIOPROTETORA PARA

CÉLULAS ESPERMÁTICAS

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Biociências e Saúde, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biociências e Saúde da Universidade do Oeste de Santa Catarina.

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio E. Montano

Co-orientadora: Dra. Francine Carla Cadoná

Joaçaba

2016

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CLEITON WERNER

DESENVOLVIMENTO DE UM COMPOSTO QUÍMICO À BASE DE

METILXANTINAS E POLIFENÓIS COM AÇÃO CRIOPROTETORA

PARA CÉLULAS ESPERMÁTICAS

Esta dissertação foi julgada e aprovada como requisito parcial para a obtenção do

grau de Mestre em Biociências e Saúde no Programa de Mestrado em Biociências e

Saúde da Universidade do Oeste de Santa Catarina.

Joaçaba, 16 de setembro de 2016.

________________________ Prof. Dr. Jovani Steffani

Coordenador do Programa

BANCA EXAMINADORA

_______________________ Prof. Dr. Marco Aurélio E. Montano

Orientador

_______________________ Prof. Dr. Carina Rossoni

Universidade do Oeste de Santa Catarina (UNOESC) Examinador Interno

_______________________ Prof. Dra. Ivana Beatrice Mânica da Cruz

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Examinador Externo

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RESUMO

A infertilidade por anos tem sido tratada como uma incapacidade biológica. Com o aprimoramento dos estudos, ao longo dos anos, métodos foram desenvolvidos e vêm sendo aprimorados para que seja possível uma reprodução, antes inviável. No entanto, a criopreservação, utilizada em técnicas de fertilização, pode causar injúrias às células espermáticas, pelo fato de aumentar o estresse oxidativo. Diante disso, o objetivo deste estudo foi desenvolver um composto químico à base de metilxantinas e polifenóis (CCMP) com ação crioprotetora para células espermáticas. Assim, foi desenvolvido o CCMP, com base na matriz química do guaraná (Paullinia cupana), cafeína, catequina e teobromina, enriquecido com resveratrol. Amostras de esperma foram obtidas de indivíduos jovens e saudáveis e diluídas em um meio nutritivo e criopreservante, meio Tris Modificado. As amostras foram expostas a três diferentes concentrações do CCMP, altas (H-CCMP), intermediárias (I-CCMP) e baixas concentrações (L-CCMP), e incubadas a 37ºC em estufa de CO2 por 1 hora. Posteriormente, foram congeladas em nitrogênio líquido (-196ºC) e ultrafreezer (-80°C) por 24 horas. Análises pré e pós-congelamento foram realizadas, onde parâmetros de viabilidade celular foram averiguados pelos ensaios Fluorimétrico de Quantificação de DNA por reagente DNAPicoGreen®, por Citometria de fluxo e pelo teste de Violeta Genciana. Além disso, foram mensurados os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), de óxido nítrico (NO) e função mitocondrial, pelos ensaios DCFH-DA, Reação de Griess e MTT, respectivamente. Os resultados encontrados sugeriram que o CCMP em todas as concentrações não apresentou citotoxicidade às amostras de esperma. Ainda, o CCMP em algumas concentrações melhorou a viabilidade e o metabolismo oxidativo nas amostras pré-congelamento. Também, o CCMP em algumas concentrações, apresentou efeito criopreservante, já que aumentou a viabilidade e diminuiu estresse oxidativo em amostras descongeladas. Portanto, sugere-se que o sinergismo de diversas moléculas bioativas presentes no CCMP poderia assegurar uma melhor qualidade de esperma e assim aumentar o sucesso reprodutivo em técnicas de fertilização in vitro. Palavras-chave: cafeína, catequina, teobromina, resveratrol, criopreservação de esperma

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ABSTRACT

Infertility has been reported as a biologic incapacity. Assisted reproduction techniques were developed over the years to solve this problem. On the other hand, cryopreservation that is used in reproduction techniques, can cause damage in spermatic cells by increasing oxidative stress. Therefore, the aim of this study was to develop a chemical compound based on metaxanthine and polyphenols molecules (CCMP) with cryoprotective action in spermatic cells. CCMP was developed based on guaraná (Paullinia cupana) bioactive molecules, caffeine, catechin and theobromine, enriched with resveratrol. Sperm samples obtained of healthy and young donors were diluted in cryoprotective Tris Modified Medium. Samples were exposed to three different concentrations of CCMP, high concentrations of CCMP (H-CCMP), intermediated (I-CCMP) and low concentrations (L-CCMP) and incubated at 37ºC with 5% CO2 incubator for 1 hour. After that, sperm samples were stored in liquid nitrogen (-196ºC) and ultrafreezer (-80ºC) for 24 hours. Pre-freezing and post-thaw analyses were performed. The cellular viability was measured by Cell Free double-strand DNA PicoGreen Assay, Flow Cytometry and Crystal Violet Assay. Moreover, levels of oxygen reactive species (ROS), Nitric Oxide and mitochondrial function were evaluated by DCFH-DA Assay, Griess Reaction and MTT Assay, respectively. The results suggested that different concentrations tested of CCMP did not present cytotoxicity in sperm samples. Moreover, CCMP, in some concentrations, was able to improve viability and oxidative metabolism in sperm samples pre-freezing. Furthermore, CCMP showed cryoprotective activity by increasing viability and decreasing oxidative stress in post-thaw sperm samples. In conclusion, the findings of this study suggested that the synergism of bioactive molecules present in CCMP could improve the sperm quality and ensure the sperm quality and the reproductive success in assisted reproduction techniques. Keywords: caffeine, catechin, theobromine, resveratrol, sperm cryoprotection

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Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

Siglas

CCMP – Composto Químico à base de metilxantinas e polifenóis.

DCFH-DA – 2'-7'-diclorofluoresceínadiacetato

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucleico

EROs – Espécies Reativas de Oxigênio

FIV – Fertilização In Vitro

H2O2 – Peróxido de Hidrogênio

H-CCMP – Alta concentração do Composto Químico à base de metilxantinas e

polifenóis.

I-CCMP – Intermediária concentração do Composto Químico à base de metilxantinas

e polifenóis.

L-CCMP –Baixa concentração do Composto Químico à base de metilxantinas e

polifenóis.

MTT – brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio

NO – Óxido Nítrico

TRA – Tecnologia de Reprodução Assistida

TYB – Tampão Gema de Ovo

Símbolos

TM Trade Mark

® Registrado

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SUMÁRIO

2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 11

2.1 SAÚDE REPRODUTIVA HUMANA ................................................................. 11

2.2 INFERTILIDADE HUMANA ............................................................................. 11

2.3 IMPACTO DO ESTRESSE OXIDATIVO NA QUALIDADE DO ESPERMA .... 14

2.4 FERTILIZAÇÃO IN VITRO .............................................................................. 15

2.5 CRIOPRESERVAÇÂO E OS EFEITOS CITO/GENOTÓXICOS DO

CONGELAMENTO ................................................................................................ 16

2.6 USO DE MOLÉCULAS BIOATIVAS NA PREVENÇÃO DOS DANOS

CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO .......................................................... 18

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 20

3. 1 Objetivo Geral ................................................................................................ 20

3. 2 Objetivos Específicos ................................................................................... 20

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 21

4.2 Coleta e preparo da amostra ......................................................................... 21

4.4 Avaliação da viabilidade celular ................................................................... 25

4.4.2 Ensaio Fluorimétrico de Quantificação de DNA por reagente

DNAPicoGreen® ............................................................................................... 25

4.5.3 Citometria de Fluxo ................................................................................. 26

4.5.4 Violeta Genciana ...................................................................................... 26

4.6 Avaliação do metabolismo oxidativo: .......................................................... 27

4.6.1 Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio ................................ 27

4.6.2 Avaliação dos níveis de Óxido Nítrico ................................................... 28

4.6.3 Ensaio do MTT ......................................................................................... 28

4.7 Análise estatística .......................................................................................... 29

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 30

5.1 Caracterização inicial da amostra ................................................................ 30

5.2 Viabilidade celular pré-congelamento .......................................................... 30

5.3 Metabolismo oxidativo pré-congelamento................................................... 33

5.4 Viabilidade celular pós-congelamento a -196ºC .......................................... 35

5.5 Metabolismo oxidativo pós-congelamento a -196ºC ................................... 37

5.6 Viabilidade e metabolismo oxidativo pós-congelamento a -80°C .............. 39

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 43

7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 46

8

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS A RESPEITO DA INTERDISCIPLINARIDADE......... 47

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 48

ANEXOS ................................................................................................................... 52

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1 INTRODUÇÃO

O impacto social e psicológico da infertilidade pode ser uma condição

devastadora para casais que pretendem ter filhos. Afetando homens e mulheres,

relaciona-se a angústia, depressão e até baixa autoestima. Existem culturas nas quais

a repercussão social da infertilidade pode ser motivo de divórcio, perda de recurso

econômicos e, inclusive, anulação dos direitos ao sepultamento. A definição clínica

para infertilidade se dá acerca do sistema reprodutivo, caracterizada como doença

que torna o indivíduo incapaz de conseguir uma gravidez. É a incapacidade de

produzir um nascimento vivo. A distinção pode ocorrer entre primária, onde uma

mulher nunca foi capaz de ter um filho, e secundária, que ocorre após um nascimento

(MASCARENHAS et al. 2012).

Uma alternativa que vem produzindo resultados satisfatórios ao longo dos

anos, é a técnica de fertilização in vitro (FIV), que responde por 1% de todos os

nascimentos que acontecem nos EUA. A tecnologia de reprodução assistida (TRA)

pode ser dividida em três processos, sendo que o primeiro envolve uma sequência de

passos onde cada resultado influencia na próxima etapa, por exemplo a etapa de

recuperação de ovócitos deve ser bem sucedida, a fim de proceder à adubação,

adubação deve ser bem sucedida, a fim de proceder à transferência de embriões, e

assim por diante. Segundo a gravidez bem sucedida depende tanto do saúde da mãe

e da viabilidade dos embriões transferidos. E em terceiro lugar, as mulheres

submetidas a FIV podem sofrer mais do que um ciclo de tratamento, porque tendem

a ter semelhantes resultados em gestações sucessivas (MISSMER et al. 2011).

Para o sucesso de uma fertilização in vitro, é necessário criopreservar o

esperma de forma eficiente. A criopreservação facilita o transporte e o

armazenamento para posteriormente ser usada em tecnologias de reprodução

artificial, contudo esse processo pode resultar em danos na membrana celular,

comprometendo a viabilidade dos espermatozoides, que sofrem com o estresse

oxidativo, tendo a mobilidade diminuída bem como a quantidade, devido a apoptose

e isso reduz significativamente o poder de fertilização (SIEME, OLDENHOF,

WOLKERS, 2015).

Essa oxidação ocorre devido ao processo de congelamento e

descongelamento, mas ainda assim a criopreservação de sêmen foi validada como

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um método para preservar a possibilidade de ter o seu próprio filho biológico no futuro

de acordo com Yokonishi e Ogawa (2015).

A diferenciação das técnicas de criopreservação acontece de acordo com o

crioprotetor usado, que incluem normalmente leite desnatado, gema de ovo e glicerol

que envolvem a membrana celular, diminuindo os danos sofridos pelo estresse

oxidativo, isso torna a amostra muito mais viável após o descongelamento, o que

consequentemente influencia no sucesso da reprodução (SIEME, OLDENHOF,

WOLKERS, 2015).

Admitindo-se que a criopreservação pode gerar danos, muitas vezes,

irreversíveis para as células gaméticas, muitos alimentos funcionais estão sendo

estudados para contribuir para uma possível intervenção terapêutica, a fim de que

moléculas antioxidantes presentes na matriz nutricional possam auxiliar na otimização

de biotécnias reprodutivas. É nesse contexto que se insere o estudo que realizado por

Pariz e Hallak (2016) que sugeriram que a incubação da amostra de esperma humano

com a cafeína após o congelamento promove um aumento progressivo da motilidade

e atividade mitocondrial, indicando que a cafeína poderia ser um importante agente

terapêutico para pacientes que apresentam baixa qualidade de células espermáticas

submetidos a tratamento de infertilidade.

Assim como, o estudo desenvolvido por Garcez e colaboradores (2010), onde

foi descrito o efeito crioprotetor do resveratrol em sêmen humano, uma vez que o

mesmo evita danos oxidativos oriundos do congelamento. Ainda, em um estudo prévio

utilizando amostra de esperma humano, indicou que o extrato de guaraná (Paullinia

cupana), um fruto amazônico rico em cafeína, apresentou efeito crioprotetor contra o

dano oxidativo causado pelo congelamento (Cadoná et al., 2016).

Apesar de haverem estudos sugerindo ação crioprotetora de alimentos e

moléculas antioxidantes, os mecanismos de criopreservação, assim como a existência

de sinergismo de diferentes compostos bioativos a fim de potencializar a ação

crioprotetora, ainda não estão bem compreendidos.

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2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 SAÚDE REPRODUTIVA HUMANA

A reprodução é o mecanismo através do qual os seres vivos se reproduzem,

perpetuando e diversificando a espécie. Todas as espécies possuem grande

variedade de mecanismos de propagação, no caso dos humanos a reprodução

sexuada. Os gametas fazem a transferência dos genes para as próximas gerações.

Apesar das dificuldades de estudos das células germinativas, com os avanços

científicos e tecnológicos já foram conseguidos na obtenção de bebes saudáveis na

espécie humana por técnicas de reprodução assistida. A gametogênese humana é o

fenômeno biológico de formação dos ovócitos e espermatozoides. A gametogênese

pode ser caracterizada por três etapas: multiplicação (mitose), crescimento e

maturação (meiose). A gametogênese masculina é denominada espermatogênese e

ocorre nos túbulos seminíferos dos testículos, o processo inicia na puberdade e ocorre

continuamente durante toda a vida. Cada espermatogônia dará origem a quatro

espermatozoides. Durante a espermiogênese, processo de diferenciação celular para

formação dos verdadeiros gametas masculinos, as espermátides ganham o

acrossomo e o flagelo. O acrossomo está localizado na região anterior da cabeça do

espermatozoide e nele estão presentes várias enzimas que favorecem a entrada do

espermatozoide através da zona pelúcida durante o processo de fertilização. A cauda

do espermatozoide é fundamental para a mobilidade do gameta masculino até o local

da fertilização (ARAÚJO et al., 2007).

2.2 INFERTILIDADE HUMANA

A infertilidade é considerada um problema de saúde pública, atingindo milhões

de pessoas ao redor do mundo e possui grande impacto na qualidade de vida dos

indivíduos afetados. A organização mundial de saúde afirma que 8 a 15% dos casais

em idade produtiva sofrem por infertilidade (GRADVOHL, OSIS, MAKUCH, 2013).

Nos países ocidentais, 15% dos casais são diagnosticados com infertilidade e

em cerca de 50% destes casos, o problema subjacente reside com o homem e

abrange vários defeitos como: varicocele, dano vesicular devido à torção, obstrução

de passagem do esperma e falhas ejaculatórias, infecções do trato genital, disfunção

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na gametogênese, distúrbios endócrinos e problemas imunológicos. Fatores

extrínsecos também são considerados, destacando o tabagismo que afeta os gametas

e o desenvolvimento do embrião. Homens inférteis sem histórico para tal e que

possuem sêmen normal são designados com infertilidade idiopática e vários fatores,

incluindo o estresse oxidativo, induzido por espécies reativas de oxigênio (EROs),

danos ao DNA do esperma e anormalidades genéticas moleculares, são responsáveis

por induzir os sintomas desse tipo de infertilidade, pois não é possível identificar as

causas dessas ocorrências (TAHMASBPOUR, BALASUBRAMANIAN, AGARWAL,

2014).

Cerca de 8% dos homens procuram aconselhamento médico por problemas

relacionados à infertilidade, e no âmbito geral, quase metade dos casos não é possível

determinar a causa, pois mesmo em exames de sêmen, 40% dos homens inférteis

apresentam parâmetros normais para essa avaliação. Defeitos genéticos podem estar

envolvidos na verdadeira causa de infertilidade nestes homens.

As causas da infertilidade são diversas, estando entre elas alguma alteração

genética ou mesmo cânceres relacionados ao sistema reprodutor. A sensibilidade

excepcional do espermatozoide pode transformar infertilidade masculina em um

indicador da outras patologias, incluindo câncer testicular ou da próstata. Atualmente,

é amplamente aceito que a incidência do câncer testicular aumenta em homens

inférteis. Alterações genéticas contribuem para 25% das causas para câncer

testicular, os outros 75% são atribuídos a fatores ainda desconhecidos. O estresse

oxidativo crônico, frequentemente relatado em pacientes inférteis, é indicativo de uma

deficiência nas vias de reparo de DNA, o que está relacionado a diversos tipos de

câncer, isso contribui para afirmar que há relação entre câncer e infertilidade (TVRDA,

AGARWAL, ALKUHAIMI, 2015).

As causas da infertilidade podem ser quantificadas como pelo fator do sexo

masculino em 45%; transtornos na ovulação em 37% e dano tubário em 18%.

Aproximadamente, 20% dos casais possuem uma combinação de vários fatores. No

ano de 2008, a Sociedade Europeia de Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE)

recomendou que fosse feita uma análise do sêmen e uma avaliação da ovulação

seguido de teste de permeabilidade tubária e através dessa investigação iniciar um

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tratamento adequado para os casais que desejassem uma gravidez, garantindo que

ela fosse de sucesso (SCHANKATH et al. 2012).

Além disso, há um importante problema clínico relacionado a infertilidade, que

é a doença inflamatória intestinal (DII), desde quadros cirurgicos até farmacológicos.

Em mulheres a diminuição da fertilidade pode se dar por inflamação pélvica, redução

da frequencia das relações sexuais (devido a localização perianal). Nos homens essa

influência tem sido menos estudada, mas um estudo no Reino Unido mostrou que a

fertilidade masculina (semelhante a feminina), não é significativamente afetada em

pacientes com DII tratados não cirurgicamente, com a doença em repouso e os fatores

psicológicos também acabam interferindo na função reprodutiva e sexual. Doenças

inflamatórias intestinais afetam principalmente a população jovem e, portanto, a

fertilidade e questões relacionadas com a gravidez nesse grupo de pacientes são de

grande interesse para os cientistas e médicos e que ainda pouco se sabe como

preservar a eficiência fertilidade em pacientes com DII, especialmente aqueles

qualificados para cirurgia (KOKOSZKO-BILSKA, SOBKIEWICZ, FICHNA, 2016).

A infertilidade masculina pode ter ligação com infecção bacteriana, não estando

ainda bem definida. Há indícios de que as interações diretas entre bactérias e esperma

facilitam a imobilização dos espermatozoides, afetando a morfologia do esperma e

diminuindo a habilidade de fertilização. Por outro lado, a infiltração massiva de

leucócitos ativados para o sítio inflamatório pode ser associados ao comprometimento

do potencial de fertilização do esperma, devido à oxidação, apoptose, e processos

imunes (FRACZEK e KURPISZ, 2015).

Essas avaliações feitas sobre a saúde reprodutiva têm repercutido

mundialmente nos últimos anos, melhorando a saúde materna e infantil. Salienta-se

ainda que a infertilidade pode levar à angústia e depressão (MASCARENHAS et al.

2012). Apresentar com precisão as taxas de infertilidade masculina de base regional

torna-se um desafio, e uma das principais razões é que ao contrário da infertilidade

masculina não é bem relatada, principalmente por aspectos culturais, impedindo

recolher estatísticas precisas. Por exemplo, na África do Norte a parceira é

frequentemente acusada de infertilidade, sendo que os homens não se submetem a

avaliação de fertilidade, resultando em sub-registro de infertilidade masculina. Além

disso, a poligamia é uma prática comum em muitos culturas. Uma das razões para a

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poligamia é superar a infertilidade e aumentar a probabilidade de ter crianças. Além

disso, em alguns países africanos, existe uma tradição chamada "Chiramu" que

permite um homem estéril trazer um parente para impregnar sua esposa, a fim de

manter sua identidade “fértil” para a comunidade, sendo assim um falso-negativo em

relação aos dados estatísticos de infertilidade (AGARWAL, 2015).

2.3 IMPACTO DO ESTRESSE OXIDATIVO NA QUALIDADE DO ESPERMA

Investigações têm indicado que concentrações baixas e controladas de

Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), contribuem para um aumento do sucesso

reprodutivo. Moléculas reativas como o H2O2, óxido nítrico (ON) e superóxido, estão

diretamente envolvidas em processos de fertilização, como capacitação espermática,

motilidade, reação acrossômica e fusão gamética (Zini et al., 1993; Aitken et al., 1995;

O'Flaherty et al., 2003). No entanto, altos níveis de EROs podem promover impactos

negativos aos espermatozoides.

O estresse oxidativo é gerado por um desbalanço entre pró-oxidantes e o

sistema antioxidante, e promove assim um aumento nas EROs, o que pode acabar

danificando as membranas celulares e comprometer a qualidade do sêmen. Dessa

forma, o estresse oxidativo está fortemente relacionado com a infertilidade masculina.

Fatores extrínsecos também têm forte influência como: como estilo de vida

(tabagismo), ambiental (pesticidas, poluição do ar, radiação eletromagnética) e saúde

(quimioterapia, infecção urogenital, prostatite) pode alterar significativamente a

capacidade antioxidante. Níveis elevados de EROs são detectados em 25 % a 80 %

de homens inférteis (AYAZ, 2015). Devido as altas concentrações de ácidos

graxos poli-insaturados e limitações nos mecanismos de reparação, os

espermatozoides são sucetíveis ao ataque oxidativo, assim ocorre uma peroxidação

lipídica na membrana plasmática que acaba perdendo fluidez e integridade

necessárias para fusão da membrana no ato da fertilização. Por conter uma variedade

de antioxidantes no plasma seminal, é possível combater os efeitos nocivos das

EROs. As enzimas superóxido dismutase (SOD – responsável pela dismutação do

superóxido, produzindo H2O2 e oxigênio) e a catalase (CAT – que atua na

desintoxicação do H2O2 formando água e oxigênio), são as principais mediadoras

dessa ação antioxidante. Uma característica de homens inférteis é a diminuição das

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defesas antioxidantes enzimáticas e um aumento na geração de EROs no sêmen,

mesmo antes da criopreservação. Também, baixos níveis de vitamina E e C foram

encontrados nesse grupo (GARCEZ et al. 2010)

Os espermatozoides de mamíferos apresentam alta composição lipídica, alto

teor de ácidos graxos poli-insaturados, plasmalogenes e esfingomielinas. Esse

diferencial é responsável por sua flexibilidade e capacidade funcional das células de

esperma. Entretanto, os lipídios de espermatozoides são os principais substratos para

peroxidação, o que pode provocar desordem funcional grave de esperma. A geração

de EROs ocorre fisiologicamente durante o metabolismo celular e tem sido observado

que pequenas quantidades de EROs em sêmen humano melhoram a capacidade dos

espermatozoides de ligarem-se a zona pelúcida. As alterações funcionais e estruturais

na membrana lipídica, durante a peroxidação, podem ser úteis para se compreender

o papel do metabolismo lipídico e ajudar a desenvolver novas estratégias terapêuticas

para a infertilidade masculina (SANOCKA e KURPISZ, 2004).

Diante disso, muitas biotécnicas que possam contribuir para o sucesso

reprodutivo, estão em constante ascensão, como, por exemplo a tecnologia de

reprodução assistida (TRA). Uma vez que a TRA é em geral bem-sucedida,

independentemente da causa da infertilidade, ela é muitas vezes a oportunidade para

os casais com infertilidade inexplicada (ESTEVES, 2016).

2.4 FERTILIZAÇÃO IN VITRO

Fertilização In Vitro (FIV) é uma alternativa que foi implantada há vários anos e

que tem trazido resultados satisfatórios, exemplo disso são os Estados Unidos onde

os ciclos de fertilização in vitro aumentaram de 46.000 para 120.000 num período de

10 anos. Esse processo envolve controle hormonal do processo ovulatório, a remoção

de óvulos e sua fertilização com o esperma. O ovo já fertilizado, zigoto propriamente

dito, é transferido para o útero da paciente e inicia-se o processo gestacional. Cultiva-

se o embrião por 2 – 5 dias, e após é transferido para o útero e 18 dias depois da

transferência é feito o teste de gravidez (MAITY et al. 2014). Assim sendo, a

criopreservação é peça chave para armazenar os gametas a fim de garantir que a FIV

tenha bons resultados.

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No entanto, o estresse oxidativo é um mecanismo potencial pelo qual a

fragmentação do DNA pode ser induzida em espermatozoides e como o processo de

criopreservação parece aumentar o nível de espécies reativas de oxigênio (EROs) é

possível que o estresse oxidativo seja responsável por crio-lesão de DNA do esperma.

Existem antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos para proteger os

espermatozoides do ataque oxidativo, porém o estresse oxidativo é criado quando a

geração celular de EROs supera estes antioxidantes e isto pode ocorrer durante a

criopreservação (THOMSON et al., 2009).

2.5 CRIOPRESERVAÇÂO E OS EFEITOS CITO/GENOTÓXICOS DO

CONGELAMENTO

Uma alternativa muito utilizada por clínicas é a criopreservação de esperma,

para as mais variadas situações, incluindo banco de esperma antes de quimioterapia

ou demais tratamentos por radiação contra câncer, pois essa técnica tem por objetivo

preservar o esperma em baixas temperaturas para uso posterior com tecnologia de

reprodução artificial. Apesar da praticidade a criopreservação apresenta alterações na

composição lipídica da membrana, alterações de motilidade e vitalidade dos

espermatozoides, causando inclusive aumento de danos no DNA espermático. Tudo

isso pode estar relacionado com o estresse osmótico, choque frio, formação de cristais

de gelo intracelular, excessiva produção de EROs e até alteração no sistema

antioxidante que estas células possuem. O desequilíbrio entre EROs e antioxidantes

podem resultar em estresse oxidativo, que causará danos ao DNA e apoptose devido

defeitos na cromatina, causando infertilidade masculina. A integridade da cromatina

para mamíferos tem vital importância para o desenvolvimento normal do embrião,

sendo crucial a sua avaliação após a criopreservação (NEKOONAM et al., 2016).

No processo de criopreservação há produção excessiva de EROs, levando a

danos celulares, especialmente devido à peroxidação lipídica. Considerando a

necessidade de diluir ou remover o plasma seminal, a principal fonte de antioxidante

para os espermatozoides, pode aumentar a susceptibilidade do esperma ao dano

oxidativo. Mesmo quando o DNA é danificado, o esperma é ainda capaz de fertilizar o

óvulo e isso pode gerar alterações na cromatina e ter consequências graves no

desenvolvimento do embrião (CASTRO et al., 2015).

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Para que o pós-descongelamento do esperma seja o menos danoso possível,

é importante encontrar um crioprotetor de maior eficiência, aliado aos fatores como

concentração ideal do criprotetor, métodos de congelamento, e temperatura utilizada.

A perda de espermatozoides é de aproximadamente 50% se a técnica de

criopreservação não for padronizada e isso afeta a taxa de fertilidade. O uso de glicerol

contribui para a manutenção da motilidade dos espermatozoides. O Dimetilsulfóxido

(DMSO) é também um agente crioprotetor importante para preservação de células

(SESHOKA, MPHAPHATHI, NEDAMBALE, 2016)

Além disso, tratamentos com tampão de gema de ovo (TYB) parecem

benéficos para a fertilização. A incubação do esperma em TYB pode preservar a

integridade dos espermatozoides, aumentando a sua porcentagem para fertilizar um

óvulo. As proteínas da gema do ovo podem reduzir danos por EROs (JENSEN et al.,

2004).

Os crioprotetores geralmente são basicamente compostos por leite desnatado,

gema de ovo e glicerol incluindo compostos que vão ser específicos para cada padrão.

A qualidade do esperma é normalmente avaliada com base nas características de

motilidade espermática (motilidade progressiva e velocidade). Ainda, durante o tempo

de criopreservação, os espermatozoides são expostos a grave estresse osmótico,

devido a adição e remoção de crioprotetores, bem como durante o congelamento e

descongelamento. Os espermatozoides acabam sendo expostos a formação de gelo

extracelular e isto resulta em desidratação celular devido ao transporte de água para

fora da célula para manter o equilíbrio entre as concentrações de soluto intra e

extracelular. Enquanto durante o descongelamento, o processo inverso ocorre

resultando em captação de água e inchaço. Deve-se salientar que um dos primeiros

fatores de morte celular é o gelo intracelular, adquirido no resfriamento rápido (SIEME,

OLDENHOF, WOLKERS, 2015).

Apesar da eficiência, a criopreservação é também prejudicial aos

espermatozoides, devido aos fatores físicos, como o choque térmico, a formação de

cristais de gelo, desidratação e aumento da concentração intracelular de sal causada

por choque osmótico e a alteração estrutural e funcional. Junto a esses fatores, há

uma redução da motilidade e vitalidade do esperma, relacionada aos danos na

mitocôndria e no plasma, o aumento da fragmentação do DNA e a geração de EROs

e apoptose. Tais modificações ocorrem em 25 - 75% dos espermatozoides

18

submetidos a criopreservação, comprometendo o potencial de fertilidade da amostra

(PARIZ E HALLAK, 2016).

2.6 USO DE MOLÉCULAS BIOATIVAS NA PREVENÇÃO DOS DANOS

CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO

Considerando que a criopreservação, utilizada em técnicas de reprodução

assistida, pode gerar danos, muitas vezes, irreparáveis aos gametas, diminuindo as

chances de fecundação, muitos alimentos funcionais e moléculas bioativas estão

sendo investigados, como as utilizadas no estudo de Cadoná et al. (2016), a fim de

garantir a integridade dos espermatozoides durante o manejo e aumentar a qualidade

do esperma durante a criopreservação.

Alguns antioxidantes estão sendo investigados, como vitaminas C e E, a fim

de minimizar efeitos dos danos que esse método pode causar aos espermatozoides,

devido ao aumento da produção de EROs, como o superóxido e o péroxido de

hidrogênio (H2O2). Embora espermatozoides com ácido desoxirribonucleico (DNA)

danificado parecem ser incapazes de fertilizar óvulos, no caso de ocorrer uma

fertilização, há possibilidade do embrião ter um desenvolvimento anormal. Sendo

assim, é possível utilizar outros dois antioxidantes, que são: ácido L-ascórbico e o

resveratrol (3,5,4' -trihydroxystilbene), que previnem danos ao DNA induzidos pela

criopreservação, tanto em espermatozóides de homens férteis quanto de homens

inférteis. A utilização de resveratrol 10 mM pode evitar completamente danos no DNA

induzidos por criopreservação em homens inférteis. (BRANCO et al. 2010).

Tanto o ácido ascórbico, quando o resveratrol não alteram a concentração

espermática pós-descongelamento ou a morfologia durante sua ação antioxidante,

porém nem por isso previnem a diminuição de motilidade na criopreservação,

sugerindo assim que a perda de motilidade não está só relacionada com o estresse

oxidativo. (BRANCO et al. 2010).

O consumo de cafeína, em estado natural ou como aditivo de alimentos e

medicamentos, aumenta o risco de aborto espontâneo, redução da fertilidade

feminina. Em contrapartida nos homens esse consumo aumenta a concentração de

espermatozoides. Outro porém é que o gasto de energia diminui a capacidade de

19

fertilização do esperma após a criopreservação e há indícios de que a cafeína tem um

potencial para aumentar a concentração de energia da célula, exemplo disso é o

aumento da mobilidade espermática após adição de cafeína em amostras de sêmen

pós-criopreservação (PARIZ E HALLAK, 2016).

Agentes antioxidantes como as vitaminas E e C e os carotenoides, contribuem

para a restauração do balanço pró-oxidante/antioxidante, mantendo o DNA dos

espermatozoides íntegros, sem dano oxidativo, melhorando inclusive a motilidade e a

morfologia. Outro mineral importante é o zinco, que atua na organização polimérica

do RNA e DNA, na síntese protéica, na divisão celular e na estabilidade das

membranas. (PEREIRA, 2004).

Neste sentido, um dos alimentos funcionais estudado atualmente é a Paullinia

cupana, conhecida popularmente como guaraná, é uma espécie nativa da região

Amazônica prestigiada por ter propriedades estimulantes e medicinais que podem ser

atribuídas à presença de diversas moléculas bioativas presentes na sua composição,

com destaque a cafeína, teobromina, teofilina e catequinas. O extrato hidroalcóolico

do guaraná foi utilizado como agente crioprotetor em amostras de sêmen humano em

estudo in vitro realizado por Cadoná e colaboradores (2016). Os resultados

encontrados nesse estudo sugeriram que o guaraná reduz os danos oxidativos

gerados pelo congelamento.

Estudos utilizando alimentos funcionais, assim como moléculas bioativas

presentes na matriz nutricional a fim de garantir a integridade dos espermatozoides

durante o manejo e para aumentar a qualidade do esperma durante a criopreservação,

estão em constante ascensão. Entretanto, a maior parte dessas investigações utilizam

compostos isolados. Por isso, é de grande relevância investigar o sinergismo

crioprotetor de moléculas bioativas, assim como os mecanismos causais relacionados

com esse efeito.

20

3 OBJETIVOS

3. 1 Objetivo Geral

Desenvolver um composto químico à base de metilxantinas e polifenóis

(CCMP) com ação crioprotetora para células espermáticas.

3. 2 Objetivos Específicos

Desenvolver um composto crioprotetor e averiguar o efeito desse

criopreservante à base de moléculas bioativas antioxidantes em espermatozoides, de

adultos jovens e saudáveis, pré-congelados e pós-descongelados, a partir da

avaliação:

- Na viabilidade celular;

- Na função mitocondrial;

- Na produção de EROs;

- Nos níveis de óxido nítrico (NO).

21

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Reagentes

Todos os reagentes foram obtidos de Sigma ChemicalCo. (St. Loius, MO, USA) e

InvitrogenCo. (USA) e CultilabCo. (São Paulo, Brazil).

4.2 Coleta e preparo da amostra

Foi conduzido um estudo in vitro a partir da amostra de sêmen doada por sete

voluntários adultos jovens e saudáveis. O sêmen foi coletado em quarto individual

especificamente para esta finalidade, na Universidade Federal de Santa Maria

(UFSM), por masturbação em um recipiente estéril e descartável. Previamente f oi

solicitado a todos os homens absterem-se de ejaculação por pelo menos 72 horas

antes de seu sêmen ser coletado. Todos os doadores eram adultos jovens e saudáveis

com similar idade (20-25 anos), dieta e hábitos. Foi solicitado para os doadores se

absterem de dieta com antioxidantes para evitar interferências experimentais.

Fonte: Werner (2016).

A amostra acondicionada no recipiente estéril, foi entregue no laboratório de

Biogenômica da UFSM e foi mantida por 30 minutos em estufa de CO2 a 37°C para

que se procedesse à liquefação seminal, já que durante a fase de coagulação, além

do esperma ser naturalmente heterogêneo, os espermatozoides ficam retidos nos

"coágulos" formados após a ejaculação, o que pode alterar a análise. As análises de

22

sêmen foram realizadas manualmente dentro de 01 hora depois da amostra ter sido

recolhida, pelo mesmo analisador de acordo com os critérios da Organização Mundial

da Saúde (OMS). A percentagem de morfologia [(número de espermatozoides com

cabeça e cauda normais/ número total de espermatozoides)x100] e a percentagem da

motilidade [(número de espermatozoides móveis/número total de

espermatozoides)x100] foram avaliados inicialmente na amostra para assegurar a

qualidade do esperma para o estudo (Stanic et al., 2000).

Para avaliar a qualidade da amostra, foi utilizado contagem com azul de Tripan

em uma diluição de 1:1. Já para obter uma concentração celular de 1x106 foi utilizado

formol salina 2.9%, a qual imobiliza os espermatozoides a fim de que possam ser

contados na Câmara de Neubauer (HANCOCK, 1957).

4.3 Criopreservação com o composto químico à base de metilxantinas e polifenóis

(CCMP)

A amostra foi diluída em uma concentração 1:1 de Tris modificado, que é um

meio nutritivo, a fim de evitar a degradação das células, o qual é composto por 2.42g

Tris (hidroximetilaminometano), 1.50g Ácido cítrico monohidratado, 1.25g glicose,

20mL gema de ovo, 6 mL de glicerol, 1ml de antibiótico e completado o volume para

100mL com água destilada (DISSANAYAKE et al. 2014). A suplementação de gema

de ovo, presente no meio Tris modificado, protege as células contra os efeitos

prejudiciais das baixas temperaturas; o efeito benéfico de gema de ovo na

criopreservação do esperma pode ser atribuído a um fator de resistência, que ajuda a

proteger as células contra o choque a frio, a fim de manter a viabilidade. O fosfolipídio,

colesterol e os teores de lipoproteína de baixa densidade da gema de ovo de galinha

foram especificamente identificados como o componente de proteção o qual protege

a integridade da membrana fosfolipídica durante a criopreservação.

O composto químico à base de metilxantinas e polifenóis (CCMP) foi

desenvolvido com cafeína, teobromina, catequina e resveratrol. As amostras foram

expostas a três diferentes concentrações do CCMP. O esperma foi exposto a altas

concentrações do CCMP (H-CCMP), intermediárias (I-CCMP) e baixas (L-CCMP)

concentrações. Os espermatozoides foram incubados com as diferentes

23

concentrações de CCMPs à 37ºC em estufa de 5% de CO2 por 1 hora, conforme

realizado no estudo de Garcez e colaboradores (2010). As concentrações de cafeína,

teobromina e catequina foram estimadas considerando proporção encontradas no

extrato hidroalcóolico de guaraná em 10 mg/mL, concentração utilizada no estudo

realizado por Cadoná e colaboradores (2016). Já as concentrações de resveratrol

foram determinadas conforme o estudo desenvolvido por Garcez e colaborabores

(2010). Diante disso, as concentrações estipuladas para a formulação do H-CCMP, I-

CCMP e L-CCMP variaram de 12-1.2% de cafeína, 6-0.6% de teobromina, 4-0.4% de

catequina e 1-0.1% de resveratrol.

Fonte: Werner (2016)

Após o tratamento com as CCMPs, o volume das amostras foi dividido em três

partes. Uma parte foi utilizada para realizar análises pré-congelamento, onde foram

averiguados parâmetros de viabilidade e metabolismo oxidativo. As outras duas partes

das amostras foram direcionadas para o congelamento em nitrogênio líquido (-196ºC)

e ultrafreezer (-80ºC).

24


O congelamento das células em nitrogênio líquido foi realizado conforme

descrito por Garcez e colaboradores (2010). O congelamento foi executado de forma

lenta e gradual. Primeiramente, as células foram congeladas a -20ºC por 10 minutos

e expostas ao vapor de nitrogênio líquido por duas horas antes de serem

armazenadas em nitrogênio líquido a -196ºC.


Para a realização das análises de viabilidade e metabolismo oxidativo pós-

descongelamento, depois de 24 horas as células foram descongeladas de maneira

rápida, por meio da incubação em temperatura ambiente por 5 minutos e em seguida

a 37ºC por 10 minutos (Garcez et al., 2010). As células foram lavadas com Tampão

Fosfato 1X (PBS) para evitar interferências dos compostos bioativos nas análises

celulares.

25

Fonte: Werner (2016)

4.4 Avaliação da viabilidade celular

4.4.2 Ensaio Fluorimétrico de Quantificação de DNA por reagente

DNAPicoGreen®

A fim de determinar a viabilidade celular, foi conduzido o ensaio fluorimétrico

de determinação da presença de DNA dupla fita livre no meio celular, utilizando o

corante Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA, obtido da empresa Invitrogen (Life

Technologies), o qual é um reagente fluorescente e estável que possui alta afinidade

pelo DNA de fita dupla, permitindo assim, a avaliação da integridade celular, partindo

do princípio de que a presença de DNA livre no meio é indicativo de morte celular por

rompimento de membranas (AHN et al., 1996; HÁ et al., 2011).

A metodologia empregada foi baseada no descrito por Ahn e colaboradores

(1996), utilizando 50μL de amostra juntamente com 50μL do reagente de uso (1:1;

v:v), seguido de incubação por 5 minutos a temperatura ambiente e posterior leitura

da emissão de fluorescência a 480nm de excitação e 520nm de emissão.

26


4.5.3 Citometria de Fluxo

A citotoxicidade foi mensurada por Citometria de Fluxo, utilizando o reagente

Iodeto de Propídeo (PI), o qual é uma sonda fluorescente que permite avaliar a

integridade da membrana plasmática, já que o PI só entra para o interior da célula se

houver ruptura da membrana (VERMES et al., 1995).


4.5.4 Violeta Genciana

Esse ensaio consiste na utilização do corante Violeta Genciana na

concentração de 0.2% diluído em etanol 2%. A viabilidade celular é mensurada pela

fixação do núcleo das células íntegras, já que esse reagente é considerado um

intercalante do DNA. Posteriormente, o corante foi dissolvido através da utilização do

27

SDS 1% e a leitura da absorbância foi realizada no comprimento de onda de 550nm

(CUBILLOS-ROJAS et al., 2014).


4.6 Avaliação do metabolismo oxidativo:

4.6.1 Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio

Para verificar a taxa total de radicais livres foi usado o reagente 2'-7'-

diclorofluoresceínadiacetato (DCFH-DA) conforme Esposti (2002), o qual possui a

capacidade de atravessar a membrana celular, sendo desacetilado por enzimas

mitocondriais, dando origem a 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína, que reage com as

EROs, principalmente peróxido de hidrogênio (H2O2) e produz 2’,7’-

diclorofluoresceína que emite fluorescência. Assim, foi determinada a fluorescência

no aparelho espectrofluorímetro baseando-se nos comprimentos de onde de 488nm

de excitação e 525nm de emissão.


28

4.6.2 Avaliação dos níveis de Óxido Nítrico

O teste do óxido nítrico detecta a presença de nitrito orgânico na amostra. O

nitrito é detectado e analisado pela formação de uma coloração rosada quando o

reagente de Griess é adicionado à amostra contendo NO2−. A sulfanilamida do

reagente de Griess é responsável pela formação de sais de diazônio a partir do nitrito

da amostra. Quando o azo-composto (N-1-naftiletilenodiamino-bicloridrato) interage

com os sais de diazônio, a coloração rosa é identificada na amostra. A absorbância é

mensurada no comprimento de onda de 540 nm (CHOIN et al., 2012).


4.6.3 Ensaio do MTT

A função mitocondrial dos espermatozoides foi averiguada pelo Ensaio do MTT

(brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). O MTT é um sal de

tetrazolium, hidrossolúvel e de coloração amarelada, que é facilmente incorporado por

células viáveis, que reduzem este composto em suas mitocôndrias pela atividade da

enzima succinato desidrogenase. Ao ser reduzido, o MTT é convertido em um

composto formazan, insolúvel em água e de coloração roxo-azulado, que fica

armazenado no citoplasma celular, posteriormente solubilizado, pela a adição do

DMSO e quantificado colorimetricamente, através de espectrofotometria em um

comprimento de onda de 560 nm (FUKUI et al., 2010).

29


4.7 Análise estatística

Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística através de teste

de Anova de uma via, seguido de post hoc de Dunnett, utilizando o programa de

produção de gráficos e estatístico Graphpad Prism 5.0. Ainda, os tratamentos foram

expressos como percentagem do controle (%), considerando resultados

estatisticamente significativos aqueles onde p ≤ 0.05.

30

5 RESULTADOS

5.1 Caracterização inicial da amostra

Aspectos de volume total, morfologia e motilidade foram avaliados inicialmente

nas amostras dos doadores para assegurar a qualidade do esperma para o estudo.

Esses critérios foram realizados conforme a OMS e os resultados obtidos estão

representados na Tabela 1.

Tabela 1. Características iniciais das amostras de esperma

Volume (mL) 3.6 ± 1.74

Morfologia (%) 39 ± 10.24

Motilidade (%) 49 ± 7.61

Os dados estão expressos em média ± desvio padrão.

5.2 Viabilidade celular pré-congelamento

Primeiramente, o efeito das três concentrações do CCMP foi averiguado em

amostras incubadas à 37ºC por 1 hora antes do congelamento.

Na análise da viabilidade pela Citometria de Fluxo, foi observado um aumento

de 10 % de células viáveis tratadas com o I-CCMP, quando comparado com o controle

das células não tratadas (controle negativo) (p<0.05). No entanto, esse mesmo efeito

não foi encontrado no tratamento com H-CCMP e L-CCMP (Figura 1).

Esse aumento da viabilidade celular pelo I-CCMP foi confirmado pelo Ensaio

do Violeta Genciana. Além disso, os resultados encontrados nesse teste sugeriram

que também houve um aumento significativo da viabilidade dos espermatozoides

tratados com o H-CCMP (Figura 2).

No entanto, no Ensaio Quantificação de DNA dupla-fita, não foi encontrada

diferença significativa entre os diferentes tratamentos (Figura 3). Levando em

consideração os resultados encontrados de uma forma geral, pode-se sugerir que o I-

CCMP melhora a viabilidade celular do esperma em comparação com o controle

negativo.

31

Figura 1. Análise pré-congelamento da viabilidade celular por Citometria de Fluxo

utilizando PI, dos espermatozoides expostos baixas, médias e altas concentrações do

CCMP, L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP, respectivamente. N=3

32

Figura 2. Análise pré-congelamento da viabilidade celular por meio do Ensaio da

Violeta Genciana, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP.

Todos os resultados foram comparados com o controle negativo (células não

tratadas). N=3, ***(p<0.0001).

Figura 3. Análise pré-congelamento da viabilidade celular por meio da quantificação

do DNA dupla-fita pelo Teste do DNA PicoGreen®, dos espermatozoides expostos ao

L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os resultados foram comparados com o controle

negativo (células não tratadas). N=3.

33

5.3 Metabolismo oxidativo pré-congelamento

Em comparação ao grupo controle, todas as concentrações de CCMP

apresentaram redução significativa nos níveis de EROs. (Figura 4).

No entanto, apenas as amostras suplementadas com concentrações I-CCMP

e L-CCMP tiveram redução nos níveis de NO (Figura 5). Ainda, o tratamento com o

H-CCMP aumentou a função mitocondrial (Figura 6). Diante disso, sugere-se que os

tratamentos apresentaram um resultado semelhante na atividade metabólica.

Figura 4. Análise pré-congelamento de parâmetros do metabolismo oxidativo por

meio da quantificação das EROs pelo Ensaio da DCFH-DA, dos espermatozoides

expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os resultados foram comparados

com o controle negativo (células não tratadas). N=3, **(p<0.001) e ***(p<0.0001).

34


meio da quantificação do óxido nítrico pela Reação de Griess, dos espermatozoides

expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os resultados foram comparados

com o controle negativo (células não tratadas). N=3, **(p<0.001) e * (p<0.005).


meio da determinação da função mitocondrial pelo Ensaio do MTT, dos

espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os resultados

foram comparados com o controle negativo (células não tratadas). N=3, * (p<0.005).

35

5.4 Viabilidade celular pós-congelamento a -196ºC

As amostras armazenadas a -196ºC foram descongeladas e as mesmas

variáveis foram analisadas. A Citometria de Fluxo (Figura 7) mostrou que os

tratamentos com H-CCMP e I-CCMP melhoraram a viabilidade das células de

esperma descongelado. Essas concentrações aumentaram cerca de 12% de

espermatozoides viáveis em relação ao grupo controle sem tratamento.

O Ensaio de Violeta Genciana (Figura 8) indicou um aumento da viabilidade

das células de esperma em todas as concentrações do CCMP Já o Ensaio de dupla-

fita livre de DNA apresentou um pequeno aumento na viabilidade do esperma tratado

com o L-CCMP.

Figura 7. Análise pós-congelamento em Nitrogênio Líquido da viabilidade celular por Citometria de Fluxo utilizando PI, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP, respectivamente. N=3

36

Figura 8. Análise pós-congelamento em Nitrogênio Líquido da viabilidade celular por

meio do Ensaio da Violeta Genciana, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-

CCMP e H-CCMP. Todos os resultados foram comparados com o controle negativo

(células não tratadas). N=3, * (p<0.005).

Figura 9. Análise pós-congelamento em Nitrogênio Líquido da viabilidade celular por meio da quantificação do DNA dupla-fita pelo Teste do DNA PicoGreen®, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os resultados foram comparados com o controle negativo (células não tratadas). N=3, * (p<0.005).

37

5.5 Metabolismo oxidativo pós-congelamento a -196ºC

A suplementação com o CCMP diminuiu significativamente os níveis de NO em

todas as concentrações testadas (Figura 10). Porém, houve um aumento na função

mitocondrial apenas no tratamento com o L-CCMP (Figura 11). Além disso, a

suplementação com o L-CCMP apresentou um efeito significativo na redução de

EROs (Figuras 12).

Figura 10. Análise pós-congelamento em Nitrogênio Líquido de parâmetros do

metabolismo oxidativo por meio da quantificação do óxido nítrico pela Reação de

Griess, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os

resultados foram comparados com o controle negativo (células não tratadas). N=3, *

(p<0.005), **(p<0.001) e ***(p<0.0001).

38


metabolismo oxidativo, por meio da determinação da função mitocondrial pelo Ensaio

do MTT, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os

resultados foram comparados com o controle negativo (células não tratadas). N=3,

***(p<0.0001).


metabolismo oxidativo por meio da quantificação das EROs pelo Ensaio da DCFH-

DA, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os


**(p<0.001).

39

5.6 Viabilidade e metabolismo oxidativo pós-congelamento a -80°C

Uma análise complementar foi realizada em amostras pós-congelamento a -

80ºC com e sem suplementação de CCMP. A partir da Citometria de Fluxo foi possível

identificar que menores concentrações CCMP melhoraram significativamente a

viabilidade das células de esperma. Nesse tratamento houve aumento de 15% de

células viáveis em comparação ao grupo controle (Figura 13). Infelizmente, os demais

ensaios de viabilidade não confirmaram esses dados (Figura 14 e 15). Entretanto, os

níveis de NO e EROs diminuíram quando as amostrasforam tratadas com a menor

concentração do CCMP. Além disso, os níveis de NO também reduziram com a

suplementação do I-CCMP (Figuras 16 e 17). No entanto, todos os tratamentos

apresentaram níveis semelhantes da atividade mitocondrial (Figura 18).

Figura 13. Análise pós-congelamento em Ultrafreezer -80ºC da viabilidade celular por

Citometria de Fluxo utilizando PI, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP

e H-CCMP, respectivamente. N=3

40


meio da quantificação do DNA dupla-fita pelo Teste do DNA PicoGreen®, dos

espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os resultados

foram comparados com o controle negativo (células não tratadas). N=3.


meio do Ensaio da Violeta Genciana, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-

CCMP e H-CCMP. Todos os resultados foram comparados com o controle negativo

(células não tratadas). N=3.

Tratamentos

41

Figura 16. Análise pós-congelamento em Ultrafreezer -80ºC de parâmetros do

metabolismo oxidativo por meio da quantificação do óxido nítrico pela Reação de

Griess, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os


**(p<0.001).


metabolismo oxidativo por meio da quantificação das EROs pelo Ensaio da DCFH-

DA, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os


**(p<0.001).

Tratamentos

42


metabolismo oxidativo por meio da determinação da função mitocondrial pelo Ensaio

do MTT, dos espermatozoides expostos ao L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP. Todos os

resultados foram comparados com o controle negativo (células não tratadas). N=3.

43

6 DISCUSSÃO

O conjunto dos resultados descritos nesse estudo, sugerem que as diferentes

concentrações testadas do CCMP, L-CCMP, I-CCMP e H-CCMP, não apresentaram

citotoxicidade aos espermatozoides, tanto nas análises pré-congelamento quanto nos

ensaios pós-congelamento. Além disso, o CCMP, em algumas concentrações, foi

capaz de promover uma melhora na viabilidade e no metabolismo oxidativo dos

espermatozoides no pré-congelamento e ainda, atuou como um crioprotetor, já que

aumentou a viabilidade e reduziu o estresse oxidativo pós-congelamento.

O potencial crioprotetor de algumas moléculas bioativas presentes no CCMP

tem sido descrito. Conforme o estudo realizado por Pariz e Hallak (2016), o qual

indicou que a incubação da amostra de esperma humano com a cafeína após o

congelamento promoveu um aumento progressivo da motilidade e atividade

mitocondrial e isso corrobora com os resultados encontrados no presente estudo, pois

o CCMP, o qual apresenta cafeína, aumentou a função mitocondrial no pré-

congelamento e pós-congelamento no nitrogênio líquido, através do tratamento com

o H-CCMP e o L-CCMP. Além disso, esse aumento da viabilidade foi confirmado

através do teste de Citometria de Fluxo pré-congelamento, no qual foi observado um

aumento de 10% de células viáveis tratadas com a concentração intermediária do

composto criopreservante. Adicionalmente, confirmou-se o aumento na viabilidade

celular pelo Ensaio do Violeta Genciana, o qual sugere um aumento significativo da

viabilidade dos espermatozoides tratados, no pré-congelamento, com a alta

concentração desse mesmo composto.

Além disso, outra molécula que vem sendo estuda como crioprotetora é o

resveratrol. Segundo Garcez e colaboradores (2010), esse composto evita danos

oxidativos oriundos do congelamento. Outro estudo que utilizou amostra de esperma

humano, indicou que o extrato de guaraná (Paullinia cupana), um fruto amazônico rico

em cafeína, catequina e teobromina, apresentou efeito crioprotetor contra o dano

oxidativo causado pelo congelamento (Cadoná et al., 2016). Esses dados veem ao

encontro do composto criopreservante utilizado no presente estudo, uma vez que

todas as concentrações apresentaram redução significativa nos níveis de EROs, e

todas as amostras apresentaram atividade metabólica semelhante. Ainda, houve

44

redução nos níveis de NO nas células de esperma suplementadas com concentrações

intermediária e baixa do composto.

Pariz e Hallak (2016), constataram que a criopreservação é também

prejudicial aos espermatozoides, devido aos fatores físicos, como o choque térmico,

a formação de cristais de gelo bem como a redução da vitalidade do esperma, o

aumento da fragmentação do DNA e a geração de EROs e apoptose. Tais

modificações ocorrem em 25 - 75% dos espermatozoides submetidos a

criopreservação. Porém, com o novo composto criopreservante, utilizado neste

estudo, foi possível identificar a diminuição nos níveis de NO, independente das

concentrações. Ainda, com a concentração intermediária houve aumento no

metabolismo mitocondrial e com a suplementação baixa do composto apresentou um

efeito significativo na redução de EROs. Dessa forma, pode-se sugerir que o

criopreservante atua na defesa contra os danos oxidativos das células durante o

congelamento.

Corroborando com o que foi postulado por Pariz e Hallak (2016), os

resultados encontrados no presente estudo, a partir das amostras armazenadas a -

196ºC, sugeriram que a concentrações alta e intermediária do CCMP melhoraram a

viabilidade das células de esperma descongelado e, também, aumentaram cerca de

12% de espermatozoides viáveis em relação ao grupo controle sem tratamento. Ainda,

o ensaio de violeta genciana confirmou aumento da viabilidade das células de

esperma em todas as concentrações.

Com uma análise complementar pós-congelamento a -80ºC em ultrafreezer,

também com e sem suplementação do composto criopreservante, foi observado que

menores concentrações melhoraram significativamente a viabilidade das células de

esperma, houve aumento de 15% de células viáveis e com a baixa suplementação os

níveis de EROs e NO diminuíram. Atividade mitocondrial apresentou níveis

semelhantes e infelizmente os demais ensaios de viabilidade não confirmaram esses

dados. Mas conforme apontam Ha et al., independentemente de concentração ou

composto cripreservante usado não há diferenças na taxa de recuperação, com base

na viabilidade pós-descongelamento. Estes dados sugerem que as células

germinativas em meio criopreservante podem suportar os rigores de criopreservação

mecânica a -80ºC.

45

Os resultados obtidos aqui corroboram com o que foi descrito por Branco et al.

(2010), onde foi postulada uma grande capacidade antioxidante do resveratrol. Essa

molécula bioativa exibiu alta capacidade crioprotetora nos espermatozoides, onde a

utilização de resveratrol em 10 mM pode evitar completamente danos no DNA

induzidos por criopreservação. Contudo, a ação antioxidante do resveratrol

demostrada não foi capaz de prevenir a diminuição de motilidade na criopreservação,

sugerindo assim que a perda de motilidade não está só relacionada com o estresse

oxidativo. No entanto, no estudo realizado por PARIZ e HALLAK (2016) foi

demostrado que a cafeína, em determinadas concentrações, poderia aumentar a taxa

de motilidade pós-congelamento dos espermatozoides, por meio de aumento dos

níveis de energia da célula.

Apesar do estudo desenvolvido aqui ser preliminar e necessitar de mais testes

comprabatórios e um número de amostras maior, os resultados obtidos indicam que

o suplemento desenvolvido no presente estudo, CCMP, à base de vários compostos

bioativos, dentre eles a cafeína e o resveratrol, podem contribuir para as técnicas de

criopreservação, já que um sinergismo dessas moléculas antioxidantes poderia

potencializar o efeito crioprotetor e assim, garantir a integridade dos espermatozoides

e aumentar o sucesso reprodutivo, e conforme destacado no quadro 1 a

suplementação baixa do composto (L-CCMP) foi apropriada na maioria dos testes.

Quadro 1 – Comparativo das concentrações do CCMP usado nas diferentes análises.

Análises Pré-congelamento

Pós-congelamento -196ºC

Pós-congelamento -80ºC

Citometria de fluxo I-CCMP I-CCMP H-CCMP L-CCMP

Violeta Genciana I-CCMP H-CCMP

L-CCMP I-CCMP H-CCMP

---------

DNA PicoGreen® ------- L-CCMP ----------

Ensaio do MTT H-CCMP L-CCMP ---------

Teste da Dicloro (DCFH-DA)


L-CCMP L-CCMP

Reação de Griess L-CCMP I-CCMP


L-CCMP I-CCMP


46

7 CONCLUSÃO

Nesse estudo foi analisado o efeito in vitro de um composto à base de diferentes

moléculas bioativas, CCMP, em diferentes concentrações, a fim de investigar o efeito

sinérgico crioprotetor dessas moléculas antioxidantes em células espermáticas de

adultos jovens e saudáveis.

Assim, com base nos resultados descritos nessa investigação, concluímos que

apesar dos efeitos positivos de um novo criopreservante com algumas moléculas

presentes no guaraná, o qual já foi descrito pela sua propriedade antioxidante e

criprotetora, os resultados podem apresentar aspectos diferentes, pois não questiona-

se somente o efeito do crioprotetor, mas também demais fatores que, independente

disso, podem contribuir para que haja dano na célula espermática durante ou depois

do processo de criopreservação, seja ele em nitrogênio líquido ou congelamento

tradicional (ultrafreezer). Entretanto, comparando-se com outras técnicas existentes

de criopreservação, esse novo composto demonstrou aumentar a viabilidade

espermática e diminuindo o estresse oxidativo, por meio do controle dos níveis dos

EROs e do óxido nítrico das amostras submetidas à criopreservação. Desta forma,

acreditamos que este criopreservante possui aplicação potencial para ser utilizado em

técnicas de infertilidade humana e/ou reprodução assistida.

47

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS A RESPEITO DA INTERDISCIPLINARIDADE

A criopreservação por si só, trata-se de um método que abrange saúde

reprodutiva humana e animal. Os métodos são testados em humanos e aplicados em

animais ou vice-versa. De antemão já é proposto um estudo baseado nas necessidade

de diversas fontes de auxílio a reprodução em grande escala, no caso de animais ou

reprodução para humanos que biologicamente não são capazes de reproduzir, pelos

motivos anunciados no trabalho sobre a infertilidade. Para chegar a uma análise

afirmativa, estão envolvidos diversos profissionais, como biólogos, farmacêuticos,

bioquímicos, médicos, psicólogos e outros.

48

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

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TERMO DE CONFIDENCIALIDADE

Título do projeto: ESTUDOS IN VITRO EM CÉULAS HUMANAS E LINHAGENS

CELULARES DE EXTRATOS E COMPOSTOS BIOATIVOS PRESENTES EM

ALIMENTOS DA DIETA AMAZÔNICO

Pesquisador responsável: Ivana Beatrice Mânica da Cruz

Instituição/Departamento: UFSM/CCS/ Departamento de Morfologia

Telefone para contato: 55-32208163

Local da coleta de dados: Laboratório de Biogenômica

Os pesquisadores do presente projeto se comprometem a preservar a privacidade dos

pacientes cujos dados serão coletados sob a forma de entrevista estruturada

(questionário), análises antropométricas e coleta de material biológico (sangue e/ou

esperma) no Laboratório de Biogenômica, Departamento de Morfologia, CCS, UFSM.

Concordam, igualmente, que estas informações serão utilizadas única e

exclusivamente para execução do presente projeto. As informações somente poderão

ser divulgadas de forma anônima e serão mantidas no (a) sala número 3102 do Depto

de Morfologia, Prédio 19, Campus da UFSM por um período de cinco anos sob a

responsabilidade do Prof.(a) Pesquisador (a) Ivana Beatrice Mânica da Cruz. Após

este período, os dados serão destruídos. Este projeto de pesquisa foi revisado e

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFSM, com o número do CAAE

23081.015838/2011-10.

Santa Maria, maio de 2016

Profa. Dra. Ivana Beatrice Mânica da Cruz

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