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DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA RESISTÊNCIA À

ERITROMICINA E À CLINDAMICINA EM CEPAS DE Streptococcus agalactiae DE

ORIGENS HUMANA E BOVINA ISOLADAS NO BRASIL

Tatiana de Castro Abreu Pinto

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia),

Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas (Microbiologia).

Orientador: Leslie Claude Benchetrit

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

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2

Trabalho realizado no Laboratório de Cocos

Patogênicos do Departamento de Microbiologia

Médica do Instituto de Microbiologia Professor Paulo

de Góes, sob orientação do Professor Leslie Claude

Benchetrit.

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DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA RESISTÊNCIA À

ERITROMICINA E À CLINDAMICINA EM CEPAS DE Streptococcus agalactiae DE

ORIGENS HUMANA E BOVINA ISOLADAS NO BRASIL

Tatiana de Castro Abreu Pinto

Orientador: Leslie Claude Benchetrit

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade federal

do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de

Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia).

Aprovada por:

Prof. Sérgio Eduardo Longo Fracalanzza – Doutor, IMPPG, UFRJ - Presidente

Profa. Bernadete Teixeira Ferreira Carvalho – Doutora, IMPPG, UFRJ

Prof. João Ramos Costa Andrade – Doutor, UERJ

Regina Maria Pilotto Domingues – Doutora, IMPPG, UFRJ

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

4

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Marcia e Marcos, pelo grande amor, a verdadeira amizade, os valiosos

ensinamentos, o incondicional apoio em todas as minhas escolhas e a presença constante em

minha vida.

À minha querida família, Júlia, Sílvia, Vera, Bernardo e Angela, pelo exemplo de

união, amor, carinho e pelo grande esforço em entender os microrganismos.

Ao meu namorado, Gustavo, pelo incentivo, amor, amizade, atenção, companheirismo

e por fazer parte da minha vida, estando longe ou perto, e à sua família, pelo carinho e

interesse sempre demonstrados.

À família do meu pai, Celinha, Catarina e Gilmar, por me acolher tão carinhosamente

e também torcer por mim.

Ao Professor Leslie Claude Benchetrit pela orientação, paciência e apoio, que foram

vitais para a realização deste trabalho.

À grande amiga e colega de trabalho Ivi Cristina Menezes de Oliveira, que é parte

fundamental não só deste trabalho como também da minha vida.

Aos meus amigos do Laboratório de Cocos Patogênicos, Ana Beatriz, Marcos, Helena

e Ana Rosa, sem os quais a realização deste trabalho seria muito mais difícil e não teria a

menor graça.

Às equipes do Laboratório de Biologia Molecular de Bactérias, do Laboratório de

Biologia de Anaeróbios, do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, do Laboratório de

Epidemiologia de Infecções e do Laboratório de Bacteriologia Médica, nas quais eu

conquistei grandes amigos.

Aos funcionários e amigos do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes por

estarem sempre dispostos a ajudar.

Aos Professores Sergio Eduardo Longo Fracalanzza, Regina Maria Pilotto Domingues

e Bernadete Teixeira Ferreira Carvalho pelo incentivo, carinho e atenção.

À professora Angela Cristina Dias de Castro por ceder cordialmente as cepas-controle

para este estudo.

Aos donos e funcionários da Fazenda Miguel Pereira pela disponibilidade e pela

gentileza.

5

RESUMO

PINTO, Tatiana de Castro Abreu. Determinação dos mecanismos envolvidos na resistência à

eritromicina e à clindamicina em cepas de Streptococcus agalactiae de origens humana e

bovina isoladas no Brasil. Rio de Janeiro, 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências

Biológicas – Microbiologia) – Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes,

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Os Streptococcus agalactiae ou estreptococos do grupo B (EGB) são importantes

agentes de infecções em adultos imunocomprometidos, gestantes e neonatos. Além disso, este

microrganismo é uma das principais causas de mastite bovina, o que acarreta prejuízos na

indústria pecuária mundial. A penicilina é a droga de escolha para tratamento e profilaxia das

infecções causadas pelo EGB, já que cepas resistentes a este antibiótico ainda não foram

detectadas, enquanto que a eritromicina e a clindamicina são alternativas em pacientes

alérgicos a β-lactâmicos, apesar dos índices de resistência a essas duas drogas terem

aumentado consideravelmente na última década, em vários países do mundo. A partir dessas

observações, os objetivos deste trabalho foram estudar os mecanismos de resistência à

eritromicina e à clindamicina em cepas de EGB, de origens humana e bovina, isoladas no

Brasil entre 1980 e 2006, através das técnicas de disco-difusão para a verificação do fenótipo

de resistência e de “PCR” para pesquisa dos genes ermA, ermB, mefA e linB. Os resultados

demonstraram índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 3,9% e 2,8% para

cepas de origem humana e de 36% e 32% para cepas de origem bovina, respectivamente,

sendo o fenótipo MLSB constitutivo e o gene ermB predominantes, sugerindo que no Brasil

essa resistência ainda não emergiu entre as cepas isoladas de humanos, mas sim entre as cepas

isoladas de bovinos. Além disso, os dados indicam que a resistência à eritromicina e à

clindamicina nas cepas analisadas está associada ao sorotipo V e que os índices de resistência

vêm aumentando ao longo dos anos, apresentando-se maior na última década.

PALAVRAS CHAVE: Streptococcus agalactiae, bovino, humano, resistência, eritromicina,

clindamicina.

6

ABSTRACT

PINTO, Tatiana de Castro Abreu. Determination of the mechanisms involved in erythromycin

and clindamycin resistance in Streptococcus agalactiae strains from human and bovine origin

isolated in Brazil. Rio de Janeiro, 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas –

Microbiologia) – Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal

do Rio de Janeiro.

Streptococcus agalactiae or group B streptococci (GBS) are important agents of

infections in immune compromised adults, pregnant women and neonates. Besides that, this

microorganism is one of the major causes of bovine mastitis, which leads to economic losses

in the farming industry world widely. Penicillin is the drug of choice for treating and

preventing GBS infections, since resistant strains have not been detected, while erythromycin

and clindamycin are alternatives in patients allergic to β-lactam agents, although the

resistance levels to these two drugs have considerably increased in the last decade, in different

countries of the world. The aim of the present study was to evaluate the mechanisms of

erythromycin and clindamycin resistance in GBS strains of human and bovine origin, isolated

in Brazil between 1980 and 2006, through the disk-diffusion method to check the resistance

phenotype and through the PCR method to screen for ermA, ermB, mefA e linB genes. The

results show erythromycin and clindamycin resistance levels of 3,9% e 2,8% for strains of

human origin, and 36% e 32% for strains of bovine origin, respectively, with the MLSB

constitutive phenotype and the ermB gene being the prevalent, suggesting that in Brazil this

resistance has not emerged yet in strains isolated from humans, but has emerged in strains

isolated from cattle. Besides that, the data indicate that erythromycin and clindamycin

resistance in the analyzed strains is associated with serotype V and that resistance levels have

been increasing through the years, with higher numbers in the last decade.

KEY WORDS: Streptococcus agalactiae, bovine, human, antimicrobial resistance,

erythromycin, clindamycin.

7

SUMÁRIO

Introdução 1

1) Streptococcus agalactiae 1

2) Classificação sorológica 2

3) Distribuição dos sorotipos 4

4) Infecções em bovinos 7

5) Infecções em humanos 8

5.1) Colonização e manifestações clínicas em adultos não gestantes 8

5.2) Colonização e complicações em mulheres grávidas 9

5.3) Síndromes clínicas em crianças 10

6) Profilaxia Antibiótica Intraparto (“IAP”) 13

7) Susceptibilidade aos antimicrobianos 15

Objetivos 20

Material e métodos 21

1) Cepas bacterianas 21

1.1) Isoladas de humanos 21

1.2) Isoladas de bovinos 21

2) Meios de cultura 21

3) Soluções 22

4) Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma) 22

5) Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 23

6) Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 24

Resultados 27

Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma) 27

Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 27

Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina 27

Tabelas 29

Tabela 1 29

Tabela 2 30

Tabela 3 31

Tabela 4 32

Tabela 5 33

Figuras 34

Figura 1 34

Figura 2 35

8

Figura 3 36

Figura 4 37

Figura 5 38

Discussão 39

Conclusões 49

Referências bibliográficas 50

9

INTRODUÇÃO

1) Streptococcus agalactiae

O gênero Streptococcus é formado por bactérias Gram-positivas, catalase-negativas,

que crescem em pares ou cadeias. Esses cocos podem ser encontrados como componentes da

microbiota anfibiôntica ou como agentes de infecções em homens e outros animais

(SCHUCHAT, 1998).

A espécie Streptococcus agalactiae coloniza mucosas de adultos saudáveis,

particularmente as dos tratos gastrointestinal e genitourinário, de forma persistente,

intermitente ou passageira (SCHRAG et al., 2002).

Além disso, a espécie pode também ser encontrada colonizando porcos, macacos,

gatos, cachorros e outros animais, ou, ocasionalmente, causando doenças nestes hospedeiros

(LÄMMLER, ABDULMAWJOOD & WEIB, 1998).

O S. agalactiae apresenta um histórico epidemiológico dinâmico. Esta espécie foi

inicialmente descrita em 1887 como um patógeno animal responsável por quadros de mastite

bovina (NOCARD & MOLLEREAU, 1887 apud KEEFE, 1997). Tal doença permanece até

hoje como um dos mais importantes problemas econômicos na indústria mundial do gado, já

que a qualidade e a quantidade do leite são substancialmente alteradas pela presença do

microrganismo (MERL et al., 2003).

A capacidade de colonizar e provocar infecções em humanos foi reportada 50 anos

depois, a partir da década de 1930 (FRY, 1938). No entanto, somente na década de 1960, o S.

agalactiae foi reconhecido como importante agente de doenças em recém-nascidos,

emergindo como um significante causador de morbidade e mortalidade neonatal nos anos 70,

quando aproximadamente 50% dos neonatos infectados pela bactéria chegavam ao óbito

(MCCRACKEN, 1973).

Atualmente, a espécie é responsável por aproximadamente 1.600 casos de infecções

10

invasivas e 80 mortes em bebês por ano, nos Estados Unidos, sendo, portanto, a ocorrência

deste microrganismo relativamente rara (SCHRAG et al., 2002).

Entretanto, apesar de raras atualmente, as síndromes neonatais causadas por este

microrganismo continuam sendo severas e fatais e, nas últimas décadas, o foco da atenção de

vários profissionais da saúde vem sendo a elaboração de medidas que consigam reduzir ainda

mais a incidência dessas doenças. Uma dessas medidas foi a implementação nacional nos

Estados Unidos, a partir dos anos 90, do programa de profilaxia antibiótica intraparto

(Intrapartum Antibiotic Prophylaxis, “IAP”; CDC, 1996), estima-se que consiga prevenir de

4.000 a 4.500 casos de infecções invasivas e de 200 a 225 casos de morte em neonatos por

ano (SCHRAG et al., 2002).

2) Classificação sorológica

Os estreptococos β-hemolíticos são classificados e identificados pelo método de

LANCEFIELD (1933). Os antígenos detectados nesse sistema podem ser polissacarídeos da

parede celular, como nos grupos A, B, C, F e G, ou ácidos lipoteicóicos, como nos grupos D e

N.

A espécie S. agalactiae representa o grupo B de Lancefield e, por este motivo, é

também designada como estreptococo do grupo B (EGB). O polissacarídeo, também

denominado carboidrato C, detectado nesta espécie é composto de galactose, N-

acetilglucosamina, ramnose e glucitol fosfato (SCHUCHAT, 1998).

Além do carboidrato C, o EGB apresenta polissacarídeos tipo-específicos capsulares e

antígenos protéicos ancorados à superfície bacteriana, ambos utilizados na tipagem sorológica

deste microrganismo.

Atualmente os polissacarídeos tipo-específicos que podem ser isolados tanto de

humanos como de animais são Ia, Ib, II, III, IV e V e, mais raramente de humanos, VI, VII e

11

VIII (MARTINEZ et al., 2000). Em todos esses sorotipos a cápsula contém ácido siálico, que

atua como o fator crucial para a sobrevivência bacteriana no sangue humano, em função da

interferência com a ativação do sistema complemento e com os mecanismos

opsonofagocíticos dos neutrófilos (DORAN, LIU & NIZET, 2003).

Já entre os antígenos protéicos, são encontrados cα, cβ, R e X. Os antígenos cα

(resistente à tripsina) e cβ (sensível à tripsina e ligador de IgA) formam uma única proteína, a

proteína c, apesar de poderem ser encontrados isoladamente nas cepas de S. agalactiae

(FLORES & FERRIERI, 1996). A subunidade cα, codificada pelo gene bca, possui uma

região N terminal, unidades repetitivas idênticas e consecutivas e uma região C terminal

(MICHEL et al., 1992), e foi identificada como uma importante invasina para aderência,

internalização e translocação do microrganismo em células eucarióticas (BOLDUC et al.,

2002). Já a subunidade cβ, codificada pelo gene bac, possui uma região N terminal, um

domínio C terminal, que se estende ao longo da membrana e da parede celular, e dois

domínios funcionais, denominados A e B, que são responsáveis pela ligação à IgA

(JERLSTRÖM, CHHATWAL & TIMMIS, 1991).

As proteínas R são resistentes à tripsina e apresentam estrutura semelhante a da

proteína cα (FLORES & FERRIERI, 1996). Já a proteína X é mais freqüentemente isolada

de cepas de origem bovina, se destacando como um bom imunógeno nesses casos

(RAINARD et al., 1991).

Como já mencionado, a cápsula polissacarídica é um dos fatores de virulência mais

importantes do EGB. Entretanto, o papel das proteínas de superfície na patogênese e proteção

deste microrganismo ainda está sob investigação.

3) Distribuição dos sorotipos

12

Estudos iniciais realizados nos Estados Unidos acerca da distribuição dos sorotipos,

nas décadas de 1960 e 1970, demonstraram a predominância dos sorotipos Ia e III dentre

cepas de S. agalactiae obtidas de adultos e neonatos, sendo estas isoladas tanto de casos

clínicos como de carreadores assintomáticos (EICKHOFF et al., 1964; BAKER &

BARRETT, 1974).

Em estudos pioneiros realizados no Brasil na década de 1980, BENCHETRIT e

colaboradores (1982) demonstraram a predominância dos tipos Ia e Ib dentre cepas obtidas de

gestantes e seus recém-nascidos na cidade do Rio de Janeiro, enquanto que SMÂNIA e

colaboradores (1988) sugeriram a predominância dos sorotipos II e III para casos

semelhantes, na cidade de Florianópolis.

WENGER e colaboradores em 1990 observaram que 36% das crianças menores de 7

dias de vida e 71% das crianças maiores de 7 dias de vida estudadas foram acometidas por

infecções associadas ao sorotipo III, enquanto que 20% das infecções em adultos estavam

associadas a este mesmo sorotipo, nos Estados Unidos.

Entretanto, a partir dos anos 90, o sorotipo V, descrito pela primeira vez na década de

1970 (WILKINSON, 1977), emergiu como um freqüente colonizador e causador de doenças

invasivas em adultos não gestantes em vários países do mundo. Além disso, particularmente

nos Estados Unidos e na Europa, este sorotipo vem se destacando como uma causa relevante

de síndromes neonatais (HARRISON, DWYER & JOHNSON, 1995; ELLIOT, FARMER &

FACKLAM, 1998; HICKMAN et al., 1999; ZALEZNIK et al., 2000).

Em Atlanta, nos Estados Unidos, cepas pertencentes ao sorotipo V foram detectadas

em 14% das cepas de EGB isoladas de neonatos e em 31% das cepas isoladas de adultos não

gestantes (BLUMBERG et al., 1996). Em Maryland, este sorotipo foi responsável por 30 a

45% das infecções invasivas em adultos não gestantes (HARRISON et al., 1998).

Atualmente, os tipos Ia, III e V são descritos como os mais comumente isolados em

13

vários países, tanto a partir de casos invasivos como a partir de carreadores assintomáticos

(BLUMBERG et al., 1996; KO et al., 2001; FERRIERI et al., 2004; FIGUEIRA-COELHO et

al., 2004), embora estudos realizados na Argentina e na Alemanha tenham encontrado uma

prevalência moderadamente alta do sorotipo II (LOPARDO et al., 2003; BRIMIL et al.,

2005).

Os sorotipos VI e VIII têm sido mais freqüentemente encontrados como agentes de

infecções em mulheres grávidas no Japão, onde os tipos VI e VIII representam,

respectivamente, 25% e 36% de todos os sorotipos identificados em gestantes

(LACHENAUER et al., 1999). Além disso, MATSUURA e colaboradores (1996) observaram

que 28,6% a 35,3% das cepas de EGB isoladas de idosos no Japão pertenciam ao sorotipo

VIII.

Através de estudos de citotoxicidade, HAYASAKI e colaboradores (1999) sugeriram

que os sorotipos VI e VIII seriam menos virulentos, enquanto que os tipos Ib e III seriam

altamente virulentos. Contudo, recentemente, MATSUBARA e colaboradores (2006)

reportaram, pela primeira vez, três casos de infecção fatal causados pelo sorotipo VI no Japão,

dentre os quais dois envolviam homens adultos apresentando diabetes e o terceiro caso um

neonato prematuro, demonstrando o potencial de agressão deste sorotipo.

A colonização vaginal e/ou retal em mulheres por múltiplos sorotipos já foi relatada.

Recentemente, FERRIERI e colaboradores (2004) observaram a presença de múltiplos

sorotipos em 21,6% das mulheres sexualmente ativas não gestantes. A maioria dessas

mulheres (61,8%) apresentava doenças sexualmente transmissíveis e é possível que a

aquisição e a colonização por diferentes sorotipos esteja relacionada com o número de

parceiros sexuais. Igualmente, MEYN e colaboradores (2002) demonstraram que relações

sexuais freqüentes e múltiplos parceiros sexuais estavam associados à aquisição vaginal de

um novo sorotipo de S. agalactiae por mulheres jovens não gestantes.

14

Em relação aos antígenos protéicos, o c, principalmente a subunidade cα, e o R são os

mais comumente encontrados em cepas coletadas de humanos (FERRIERI et al., 2004;

STRAKOVÁ & MOTLOVÁ, 2004).

Dentre as cepas bovinas, o tipo III é um dos mais isolados no Quênia, Canadá, Brasil e

Estados Unidos (MOSABI, ARIMI & KANG'ETHE, 1997; DAIGNAULT et al., 2003;

DUARTE et al., 2004; DOGAN et al., 2005). Na Alemanha e Eslováquia predominam os

tipos Ia, III e IV (BOPP & LÄMMLER, 1995; MERL et al., 2003; SHAKLEINA et al.,

2004). Já na Indonésia e Inglaterra o sorotipo II é o mais encontrado em rebanhos

(ESTUNINGSIH et al., 2002; BISHARAT et al., 2004).

Dentre os antígenos protéicos, a proteína X é a mais freqüentemente encontrada nas

cepas de origem bovina (SELLIN et al., 1992; BOPP & LÄMMLER, 1995; QUENTIN et al.,

1995; MARTINEZ et al., 2000; DAIGNAULT et al., 2003; MERL et al., 2003).

Algumas cepas de EGB são não-tipáveis, ou seja, não têm um polissacarídeo

detectado, fato que ocorre principalmente entre as cepas de origem bovina (WIBAWAN &

LÄMMLER, 1990). Uma possível explicação é o fato de que essas cepas podem não

apresentar cápsula. Já foi relatado anteriormente que o cultivo in vitro de S. agalactiae

provoca nessas cepas uma mudança da forma capsulada para a forma não capsulada

(SALASIA et al., 1994).

Em relação às cepas de origem humana, FERRIERI e colaboradores (2004)

observaram que há uma baixa prevalência de cepas não-tipáveis em mulheres que apresentam

doença invasiva, enquanto há uma grande prevalência de cepas não-tipáveis em mulheres

carreadoras assintomáticas, o que pode ser reflexo da perda da cápsula no trato genital

feminino colonizado por longos períodos. Além disso, os autores verificaram que quase 80%

das cepas não-tipáveis expressavam alguma proteína, sendo a proteína R a predominante.

4) Infecções em bovinos

15

O S. agalactiae é atualmente considerado um dos maiores agentes de infecções

bovinas intramamárias. Esta bactéria é um patógeno obrigatório da glândula mamária, onde

pode sobreviver por longos períodos de tempo, além de ser altamente contagioso (KEEFE,

1997).

A mastite causada por EGB pode ser clínica, caracterizada pela presença de sinais

visíveis da doença tais como dores, tumefação e rubor da mama, ou subclínica, onde há a

ausência dos sintomas, tornando o animal um importante reservatório do microrganismo

(FARIA, FIGUEIREDO & SANTOS, 1982).

A presença do microrganismo no quarto mamário é freqüentemente associada a

contagem elevadas de células somáticas e à baixa produção de leite (KEEFE, 1997). Além

disso, ocorrem mudanças na composição do leite que resultam na redução do valor nutricional

e na perda de sabor. A qualidade e a validade de produtos derivados do leite, como o queijo,

também diminuem, devido ao aumento de crescimento bacteriano (OZ, HILLMANN &

FARNSWORTH, 1985).

A mastite bovina freqüentemente se torna crônica e pode levar à perda total do quarto

mamário. Por esse motivo, uma identificação rápida dos casos é importante para um controle

eficaz da infecção, o que nem sempre é atingido, principalmente em casos de mastite

subclínica (RIFFON et al., 2001).

Visando à detecção mais rápida e eficaz dos casos clínicos e subclínicos, foram

criados em diversos países programas nacionais e regionais de controle da doença, nos quais o

foco é o desenvolvimento de métodos para a prevenção e terapia em todo o rebanho, em vez

de tratar casos individuais (KEEFE, 1997).

Esses programas têm como base o aprimoramento da prática da ordenha, a limpeza das

tetas e a terapia antimicrobiana intramamária, utilizando soluções comerciais contendo um ou

mais antibióticos, dentre os quais destacam-se as penicilinas e seus derivados, as

16

cefalosporinas e as tetraciclinas (BASEGGIO et al., 1997).

Em Israel, a ocorrência do microrganismo em gados foi reduzida de 28% para menos

de 2% nos primeiros cinco anos do programa (BAR-MOSHE et al., 1987). Na Dinamarca

houve um decréscimo de 13% em 20 anos (AGGER et al., 1994) e nos Estados Unidos,

durante o ano de 1992, foram observados índices de cura da doença maiores do que 90%

devido à implementação do programa de controle (KEEFE, 1997).

5) Infecções em humanos

5.1) Colonização e manifestações clínicas em adultos não gestantes

O S. agalactiae coloniza o trato genital e gastrointestinal de 25% dos adultos

saudáveis e também pode ser encontrado compondo a microbiota da faringe (LÓPEZ et al.,

2002). Os índices de colonização podem variar de acordo com a etnia, idade do indivíduo e

localização geográfica (HANSEN et al., 2004).

Classicamente o EGB é relacionado a patologias gestacionais e neonatais. No entanto,

vem ocorrendo, nas últimas décadas, um aumento na incidência de infecções invasivas e o

aparecimento de novas formas clínicas, causadas por este microrganismo, em adultos não

gestantes. Este fato está possivelmente relacionado com a maior expectativa de vida de

pacientes que apresentam algum grau de imunodepressão ou enfermidades graves (DE

CUETO & DE LA ROSA, 1998). Além disso, o avanço de novas medidas e explorações

médicas também pode colaborar com o maior desenvolvimento de infecções por esta bactéria

(LÓPEZ et al., 2002).

A apresentação clínica mais freqüente em adultos é a bacteremia sem foco aparente,

seguida por infecções de tecidos moles, do trato urinário e, mais raramente, endocardites,

meningites, infecções osteoarticulares, peritonites e pneumonias (JACKSON et al., 1995;

MUÑOZ et al., 1997).

17

Já foram descritos vários fatores que predispõem esses indivíduos para infecções por

S. agalactiae, como apresentar idade superior a 55 anos, diabetes mellitus, hepatopatia

crônica e neoplasias, todos relacionados com um certo grau de imunodepressão, evidenciando

um aspecto oportunista desta bactéria (GIMÉNEZ et al., 1996).

HENNING e colaboradores (2001) observaram que idosos moradores de asilos

apresentavam um maior risco de desenvolver doenças por EGB do que idosos vivendo na

comunidade. Uma possível explicação para este fato é a maior prevalência de doenças

crônicas nos idosos dessas casas de amparo, se comparado com os da comunidade. Além

disso, os pesquisadores também notaram uma maior incidência de infecções por este

microrganismo nos senis negros, tanto entre os idosos dos asilos como entre os idosos da

comunidade.

Em adultos não gestantes saudáveis, o S. agalactiae raramente causa algum tipo de

doença invasiva. AGOURIDAKIS e colaboradores (2005) reportaram recentemente um caso

de meningite por EGB em uma mulher jovem não gestante após a sua primeira relação sexual,

na Grécia. A paciente não apresentava nenhum imunocomprometimento e a microbiota

vaginal foi apontada pelos autores como a fonte da infecção.

5.2) Colonização e complicações em mulheres grávidas

Apesar da colonização reto-vaginal ser geralmente assintomática, o S. agalactiae pode

causar doenças em carreadores susceptíveis. Nos Estados Unidos, 10 a 35% das gestantes

carreiam assintomaticamente este microrganismo nos tratos genital e gastrointestinal no

momento do parto (REGAN, KLEBANOFF & NUGENT, 1991).

O tratamento de grávidas colonizadas pelo EGB erradica o microrganismo

temporariamente, já que a maioria dessas mulheres é recolonizada em até seis semanas após o

tratamento (SHET & FERRIERI, 2004).

18

A colonização materna por S. agalactiae é freqüentemente associada a partos

prolongados, ruptura antecipada de membrana amniótica e partos prematuros. No entanto, não

existem ainda evidências suficientes e definitivas que confirmem esta relação causa-

conseqüência (SCHUCHAT, 1998).

Em gestantes, o EGB pode ocasionar desde infecções do trato urinário até sepses,

incluindo corioamnionite, endometrite, cistite, pielonefrite e bacteremia. Febre no período

pós-parto também é uma manifestação comum (SHET & FERRIERI, 2004). Infecções do

trato urinário associadas ao EGB ocorrem em 2 a 4% de todas as gestantes (SCHRAG et al.,

2002). Corioamnionite e endometrite pós-parto ocorrem mais freqüentemente em gestantes

colonizadas pelo microrganismo do que nas não colonizadas (YANCEY et al., 1994).

5.3) Síndromes clínicas em crianças

A enfermidade no infante se manifesta, principalmente, como sepse, pneumonia ou

meningite, e aproximadamente 25% das infecções ocorrem em prematuros. Endocardites e

epiglotites já foram descritas em crianças com mais idade (YOUNG, FINN & POWELL,

1996; ALSOUB, NAJMA & ROBIDA, 1997).

Mais de 80% das infecções causadas por S. agalactiae em neonatos ocorrem nos

primeiros dias de vida e, por isso, são chamadas de síndrome precoce. Já as infecções que

acontecem entre a 1ª semana e 3 meses de vida são chamadas de síndrome tardia

(SCHUCHAT, 1998).

Os recém-nascidos com síndrome precoce geralmente adquirem a bactéria no

momento do parto, por transmissão vertical, ao entrar em contato com o trato genital materno

que se encontra colonizado. Em mais de 80% dos infantes, a apresentação sintomática inicial,

geralmente durante as primeiras 24 horas, é a dificuldade respiratória. Além disso, em

aproximadamente 70% dos casos ocorrem complicações obstétricas na mãe (SHET &

19

FERRIERI, 2004).

Contudo, algumas das infecções precoces são resultados da difusão ascendente do

microrganismo, geralmente após a ruptura da membrana, no fluido amniótico, que, uma vez

aspirado pelo infante, leva ao surgimento de doenças invasivas. Se o EGB alcançar o trato

respiratório inferior e danificar as células epiteliais pulmonares, o neonato pode apresentar

pneumonia e disfunções respiratórias logo nas primeiras horas de vida. Se a bactéria

conseguir invadir o sistema circulatório e o hospedeiro for incapaz de eliminá-la, pode ocorrer

sepse severa (SPELLERBERG, 2000).

Além disso, há relatos de que a transmissão do S. agalactiae possa ocorrer através de

membranas amnióticas intactas e os eventos subseqüentes da aspiração do fluido amniótico

contaminado pelo feto ocorrerem in utero, resultando em bebês natimortos ou falecimento

logo após o parto (KATZ & BOWES, 1988).

Segundo SHET & FERRIERI (2004), as maiores complicações relacionadas com a

síndrome precoce são bacteremias sem foco primário de infecção, pneumonias e meningites,

representadas por 50, 35 e 15% dos casos, respectivamente, com índice de mortalidade de 10

a 15%.

A patogênese da síndrome tardia é diferente da precoce e ainda não muito bem

elucidada, embora alguns casos provavelmente reflitam a aquisição do S. agalactiae durante a

passagem do neonato pelo canal vaginal. Estudos demonstraram que aproximadamente 50%

das mães carreavam o EGB do mesmo sorotipo que acarretava a síndrome tardia na criança

(ANTHONY, OKADA & HOBEL, 1979; DILLON, KHARE & GRAY, 1987). No entanto, a

transmissão do microrganismo geralmente ocorre a partir de outras fontes, como as

nosocomiais (NOYA et al., 1987). Há também relatos de síndromes tardias associadas à

ingestão de leite materno contaminado (KENNY, 1977; KUBIN et al., 1987; BINGEN et al.,

1992; OLVER et al., 2000).

20

Os sintomas iniciais neste tipo de síndrome são febre, letargia, irritabilidade, má

alimentação e taquipnéia. A manifestação clínica mais comum é a meningite e mais de 20%

dos infantes sobreviventes podem desenvolver seqüelas neurológicas permanentes de

severidades variáveis, incluindo paralisia cerebral, retardamento mental e surdez

(SCHUCHAT, 1998). O índice de mortalidade é de 2 a 6% (SHET & FERRIERI, 2004).

As enfermidades causadas pelo S. agalactiae ocorrem com maior freqüência em

neonatos afro-americanos do que em outros grupos raciais (ZANGWILL, SCHUCHAT &

WENGER, 1992). Embora parte desta diferença esteja relacionada com a maior prevalência

de fatores de risco entre os afro-americanos, como baixo peso dos recém-nascidos e

prematuridade, a colonização pelo microrganismo é significantemente mais comum entre

pessoas com descendência africana (NEWTON, BUTLER & SHAIN, 1996).

Embora 50 a 65% dos bebês nascidos de mães carreadoras sejam colonizados no

momento do parto e apresentem culturas positivas para EGB de membranas mucosas e pele

(canal auditivo externo, garganta, umbigo, sítios anorretais), somente 1 a 2% dessas crianças

apresentam infecções invasivas (HICKMAN et al., 1999). Isto porque a transmissão passiva

de anticorpos maternos contra os polissacarídeos capsulares do S. agalactiae parece proteger

o neonato contra o desenvolvimento dessas doenças.

Foi demonstrado que gestantes com altos níveis desses anticorpos no soro raramente

têm bebês com síndromes causadas por EGB e os recém-nascidos, nos quais a infecção

consegue se estabelecer, geralmente apresentam baixos níveis desses anticorpos (BAKER &

KASPER, 1976). Além disso, CAMPBELL e colaboradores (2000) observaram que grávidas

colonizadas pelo microrganismo possuíam concentrações significantemente maiores de IgG

no momento do parto do que as gestantes não colonizadas.

Além da colonização materna, diferentes fatores aumentam o risco do neonato

desenvolver infecções por EGB, tais como prematuridade, ruptura prolongada de membrana,

21

corioamnionite, febre intraparto e ter irmão que tenha apresentado síndrome precoce

(SCHRAG et al., 2002).

6) Profilaxia Antibiótica Intraparto ("IAP")

As recomendações da "IAP", desenvolvidas pelo Centers for Disease Control and

Prevention ("CDC"), para profilaxia de síndromes precoces foram originalmente postas em

prática em 1996 (CDC, 1996).

Na época, duas abordagens preventivas foram propostas: uma baseada na cultura para

EGB de todas as gestantes e outra baseada na presença de fatores de risco.

O primeiro procedimento consiste na pesquisa do microrganismo em todas as

mulheres grávidas entre a 35ª e a 37ª semana de gestação, utilizando culturas vaginais e retais.

Antibióticos são administrados em todas as que apresentam cultura positiva,

independentemente da presença de fatores de risco clínicos.

Já o segundo procedimento consiste na administração de antibióticos baseada somente

na presença de fatores de risco pré-natais e intrapartos, tais como parto prematuro, ruptura

prolongada (mais de 18 horas) ou prematura (antes de 37 semanas) de membrana amniótica,

febre intraparto (mais de 38°C), histórico de um prévio bebê com síndrome precoce e

bacteriuria por S. agalactiae durante a gestação.

Atualmente, a abordagem baseada na cultura reto-vaginal das gestantes é o

procedimento padrão, porque mostrou ser 50% mais eficiente em prevenir as síndromes

precoces, sendo a sua grande vantagem a inclusão de gestantes colonizadas pela bactéria que

podem nunca apresentar nenhum dos fatores de risco clínicos, mas cujos neonatos possuem

maiores chances de desenvolver doença do que aqueles nascidos de mães não colonizadas.

Além disso, este protocolo se apresentou menos ambíguo, mais fácil de ser seguido e mais

freqüentemente implementado de forma correta (JOLIVET, 2002).

22

Os agentes antimicrobianos de escolha para a administração intraparto são a penicilina

ou a ampicilina. A penicilina é sempre preferível quando possível porque possui um amplo

espectro de ação e menor propensão de contribuir para o desenvolvimento e a disseminação

de resistência em outros patógenos, um sério e preocupante aspecto da saúde pública mundial

atualmente. Além disso, este antibiótico apresenta uma passagem transplacentária eficiente e

baixo custo (STOLL et al., 2002).

No entanto, se a gestante é alérgica a beta-lactâmicos, são recomendados cefazolina,

para casos com baixo risco de anafilaxia, e clindamicina ou eritromicina, para casos de alto

risco de anafilaxia. Aproximadamente 10% dos adultos demonstram alergia à penicilina e o

índice de anafilaxia induzida por esta droga varia de quatro casos em 10.000 a quatro casos

em 100.000 (SCHRAG et al., 2002).

Baixo risco de anafilaxia ocorre quando a paciente apresenta um histórico de “rash”

como reação alérgica, principalmente se foi primeiramente induzida pela utilização de

ampicilina. Já um alto risco de anafilaxia ocorre quando a gestante possui histórico de reações

de hipersensibilidade imediata (SALKIND, 2001).

Para todas as gestantes com alto risco de anafilaxia, as amostras de EGB coletadas

devem ser submetidas a testes de sensibilidade a clindamicina e eritromicina e, no caso de

resistência a esses dois antibióticos, a vancomicina é recomendável.

O "CDC" recomenda ainda não oferecer a "IAP" para gestantes que serão submetidas

a operações cesarianas. Apesar do EGB ser capaz de atravessar membranas amnióticas

intactas, a incidência de infecções por este microrganismo nestes casos particulares é tão

baixa que os riscos associados à aplicação de antibiótico intravenoso superam os benefícios

(RAMUS, MCINTIRE & WENDEL, 1999).

A incidência de síndromes precoces causadas por S. agalactiae nos Estados Unidos foi

reduzida em 31% entre os anos de 2000 e 2004, comprovando a eficácia da “IAP” (CDC,

23

2005).

7) Susceptibilidade aos antimicrobianos

A penicilina é a droga de escolha para a profilaxia e para o tratamento das infecções

causadas pelo S. agalactiae e cepas deste microrganismo resistentes a este antibiótico ainda

não foram encontradas, embora alguns pesquisadores já tenham detectado cepas tolerantes ou

com sensibilidade diminuída (ou intermediária), um fenômeno de significado questionável por

outros autores (KIM & ANTHONY, 1981; BETRIÚ et al., 1994; VILLAR, JUGO &

FARINATI, 1994; WU et al., 1997; MERCER et al., 1999; DE AZAVEDO et al., 2001;

HSUEH et al., 2001; MORIKAWA et al., 2003).

Os macrolídeos e as lincosaminas são a segunda opção no tratamento das doenças por

EGB e a alternativa em indivíduos alérgicos à penicilina.

Ambas as drogas atuam no ribossomo bacteriano, impedindo a síntese protéica do

microrganismo. A eritromicina, principal representante dos macrolídeos, é produzida pelo

Streptomyces erythreus e impede os movimentos de translocação se fixando à subunidade

ribossomal 50S. Já as lincosaminas, representadas pela lincomicina, produzida pelo

Streptomyces lincolensis, e seu cloro-derivado, a clindamicina, impedem a união dos

aminoácidos pela inibição da peptidiltransferase bacteriana (DE AZAVEDO et al., 2001; DE

MOUY et al., 2001; GONZÁLEZ & ANDREU, 2003).

Resistência à eritromicina em cepas de EGB vem sendo reportada desde 1962 nos

Estados Unidos (EICKHOFF et al., 1964) e, durante a última década, emergiu em vários

países, levantando questões sobre a possibilidade do tratamento e da profilaxia estarem

inadequados se continuarmos a utilizar esses agentes como segunda opção.

Para cepas de S. agalactiae já foram descritos dois diferentes mecanismos de

resistência a macrolídeos: um baseado na modificação do alvo do antibiótico, e outro baseado

24

na expulsão do antibiótico para fora da célula bacteriana.

No primeiro mecanismo, enzimas metiltransferases adicionam radicais metil a uma

adenina específica do rRNA 23S bacteriano, impedindo a ligação do antibiótico à subunidade

50S do ribossomo (LIVERMORE, 2003). Esse foi o primeiro mecanismo de resistência a

macrolídeos relatado nesta espécie e resulta em uma resistência cruzada a macrolídeos,

lincosaminas e estreptograminas B, constituindo o fenótipo MLSB (DE MOUY et al., 2001).

As metiltransferases são codificada por genes erm (sigla em inglês para “erythromycin

ribosome methylation”) e podem adicionar um ou dois grupos metil ao rRNA 23S (MENSA,

GARCÍA-VÁZQUEZ & VILA, 2003). Entre os muitos genes que compõem a grande família

erm, foram detectados no gênero Streptococcus, até o presente momento, somente os genes

ermA, ermB, ermC, ermF e ermQ, sendo os dois primeiros predominantes (ROBERTS et al.,

1999).

O fenótipo MLSB pode ainda ser subdividido em constitutivo, no qual a cepa de EGB

se apresenta constitutivamente resistente à eritromicina e à clindamicina, e induzido, no qual a

cepa de EGB se apresenta constitutivamente resistente à eritromicina e indutivamente

resistente à clindamicina na presença de eritromicina (LIU & DOUTHWAITE, 2002). O

fenótipo induzido predominava nas décadas de 1960 e 1970, no entanto, atualmente, é muito

mais comum, em diferentes áreas geográficas, encontrar a predominância de cepas

apresentando o fenótipo constitutivo (ROBERTS et al., 1999).

No segundo mecanismo, como já mencionado, ocorre o efluxo do antibiótico para fora

da célula bacteriana através de proteínas hidrofóbicas presentes na membrana, que

provavelmente utilizam a energia da força próton motora para tal (CLANCY et al., 1996).

Essas proteínas são codificadas pelo gene mefA (sigla em inglês para “macrolide efflux”) e a

este mecanismo é atribuído o fenótipo M, que foi descrito mais recentemente, no final da

década de 1980. Este fenótipo confere resistência aos macrolídeos cuja estrutura química

25

apresenta anel com 14 átomos (eritromicina e claritromicina) ou 15 átomos (azitromicina).

Entretanto, as cepas continuam sensíveis aos macrolídeos que apresentam anel com 16 átomos

(josamicina, espiramicina e tilosina), às lincosaminas e às estreptograminas (ARPIN et al.,

1999; DE MOUY et al., 2001).

HSUEH e colaboradores (2001) relataram o aumento na resistência a eritromicina e

clindamicina, em cepas de EGB isoladas de humanos em Taiwan, de 19 e 18% em 1994 para

46 e 37% em 1997, respectivamente. Os autores também verificaram que o fenótipo MLSB

constitutivo foi o predominante e que a resistência estava relacionada aos sorotipos III e IV.

FITOUSSI e colaboradores (2001) detectaram 18% de resistência à eritromicina em

cepas isoladas de neonatos e gestantes na França, com o fenótipo MLSB induzido e o gene

ermB sendo prevalentes, representando 71 e 47% dos casos, respectivamente.

Na Espanha, GONZÁLEZ & ANDREU (2003) observaram que 12,45% e 11,8% das

cepas de S. agalactiae de origem humana analisadas apresentavam resistência a eritromicina e

clindamicina, respectivamente, sendo o fenótipo MLSB constitutivo o mais encontrado.

Estudos realizados em um hospital de Portugal com cepas de EGB de origem humana

revelaram índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 10,7 e 9,9%,

respectivamente, sendo o fenótipo MLSB constitutivo o mais comum (FIGUEIRA-COELHO

et al., 2004).

Em cepas de S. agalactiae de origem bovina isoladas na Argentina foram relatados

índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 27,6 e 25,5%, respectivamente, sendo

o fenótipo MLSB constitutivo o prevalente, representando 23,4% de todas as cepas resistentes

(DENAMIEL et al., 2005).

Na Bélgica, 16,7% e 11% de cepas de EGB isoladas de gestantes se apresentaram

resistentes à eritromicina e à clindamicina, respectivamente, com o fenótipo MLSB

constitutivo sendo encontrado na maioria delas (63,6%) (DECOSTER et al., 2005).

26

Já MOSCA, RUSSO & MIRAGLIOTTA (2006) observaram que 19,2% de cepas

isoladas de gestantes na Itália se apresentaram resistentes à eritromicina e à clindamicina

simultaneamente.

Nos Estados Unidos, DIPERSIO & DIPERSIO (2006) verificaram, recentemente,

índices de resistência à eritromicina e à clindamicina de 54% e 33%, respectivamente, em

cepas isoladas de humanos a partir da vagina e do reto. Já DOGAN e colaboradores (2005),

no mesmo país, observaram índices de 26,9% de resistência à eritromicina em cepas humanas

e de 3,6% em cepas de origem bovina. Nestas últimas, somente o gene ermB foi detectado.

No Brasil, D’OLIVEIRA e colaboradores (2003) relataram 4,3% e 1,1% de resistência

à eritromicina e à clindamicina, respectivamente, em cepas de EGB de origem humana, com a

maioria apresentando o fenótipo MLSB induzido e o gene ermA.

Igualmente, na cidade do Rio de Janeiro, foi demonstrado que 4,6% das cepas

humanas apresentavam resistência à eritromicina e à clindamicina, dentre as quais se

destacaram o fenótipo MLSB induzido, o gene ermA e os sorotipos Ia e V. Já entre as cepas de

origem bovina, isoladas no Rio de Janeiro e em Minas Gerais, 23,7% se apresentaram

resistentes à eritromicina e à clindamicina, destacando-se o fenótipo MLSB constitutivo, o

gene ermB e os sorotipos II e III (DUARTE et al., 2005).

Em contraste a resistência cruzada, conferida pelo fenótipo MLSB, a resistência

específica às lincosaminas, obtida pela modificação bacteriana desses antibióticos, já foi

relatada para esta espécie. DE AZAVEDO e colaboradores (2001) observaram, pela primeira

vez, a presença do gene linB (sigla em inglês para “lincosamide inactivation

nucleotidylation”) em uma cepa de S. agalactiae que era sensível à eritromicina, mas

resistente à clindamicina. Este gene, que codifica para uma nucleotidiltransferase responsável

pela adenilação da hidroxila na posição 3 das moléculas de lincosaminas, é um mecanismo de

resistência descrito inicialmente em Enterococcus faecium (BOZDOGAN et al., 1999).

27

Outros estudos também observaram a existência de cepas de EGB resistentes à

clindamicina mas sensíveis à eritromicina. Porém, nestes estudos a presença do gene linB não

foi analisada (GONZÁLEZ & ANDREU, 2003; WERNO, ANDERSON & MURDOCH,

2003).

A contribuição do genótipo no desenvolvimento do fenótipo de resistência tem

importantes implicações na terapia antimicrobiana, já que há diferenças na susceptibilidade às

drogas dependendo do mecanismo de resistência utilizado.

Por este motivo, torna-se cada vez mais necessária a verificação dos mecanismos de

resistência mais comuns, através da análise genotípica e fenotípica, para uma melhor

orientação em medidas profiláticas e terapêuticas contra o S. agalactiae.

Entretanto, poucas informações sobre os índices de resistência à eritromicina e à

clindamicina em cepas de EGB de origem humana isoladas no Brasil estão disponíveis

atualmente, assim como não há dados suficientes sobre esses mesmos índices em cepas de

origem bovina. Além disso, não há relatos na literatura, até o presente momento, sobre a

presença do gene linB nas cepas brasileiras de S. agalactiae de ambas as origens.

Portanto, o desconhecimento atual de tais informações e dados, que apresentam

aplicações diretas e importantes na clínica médica, intensifica a necessidade de estudos mais

freqüentes e minuciosos, incluindo não só as cepas de origem humana, como também as de

origem bovina, isoladas no Brasil.

OBJETIVOS

28

Tendo em vista os dados expostos anteriormente, os objetivos deste trabalho foram:

Analisar a susceptibilidade de cepas de S. agalactiae de origem bovina a sete

diferentes antibióticos, como cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, clindamicina,

tetraciclina, rifampicina e ampicilina;

Determinar para as cepas de origem bovina que se apresentem resistentes à

eritromicina e/ou à clindamicina, os mecanismos responsáveis por esta resistência;

Determinar os mecanismos de resistência à eritromicina e à clindamicina em cepas de

S. agalactiae de origem humana que se apresentaram resistentes à eritromicina em

estudo realizado previamente em nosso laboratório (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados

não publicados).

MATERIAL E MÉTODOS

29

1) Cepas bacterianas

1.1) Isoladas de humanos:

Foram utilizadas 15 cepas de S. agalactiae de origem humana, isoladas entre os anos

de 1980 e 2002 nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo, cujos sorotipos já foram

estabelecidos, pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Cocos Patogênicos

(Departamento de Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes,

Universidade Federal do Rio de Janeiro). Tais cepas apresentaram-se resistentes à

eritromicina e/ou à clindamicina em teste de susceptibilidade a antimicrobianos pelo método

de disco-difusão em meio sólido (antibiograma), realizado previamente em nosso laboratório

(I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados) (Tabela 1).

1.2) Isoladas de bovinos:

Foram utilizadas 25 cepas de S. agalactiae de origem bovina, isoladas entre os anos de

1987 e 2006 nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Santa Catarina, cujos sorotipos já

foram estabelecidos, também pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Cocos

Patogênicos (Tabela 2).

2) Meios de cultura

♦ Blood Agar Base (Merck): Base acrescida de 5% de sangue desfibrinado de carneiro,

denominada agar sangue, utilizada para cultivo das cepas congeladas e verificação de

pureza das mesmas.

♦ Mueller-Hinton Agar (Merck): Meio que foi suplementado com 5% de sangue

desfibrinado de carneiro para ser utilizado nos testes de disco-difusão.

♦ Todd-Hewitt Broth (Difco): Caldo utilizado para crescimento das cepas.

3) Soluções

30

♦ Salina: solução de NaCl a 0,85%, utilizada no preparo do inóculo para os testes de

disco-difusão.

♦ TBE 0,5X: solução de Tris 0,05 M; ácido bórico 0,05 M; e EDTA dissódico 0,01 M;

pH final 8,0. Utilizada no preparo do gel de agarose e como tampão da eletroforese.

♦ TE: solução de Tris – HCl 10 mM (pH 8,0) e EDTA dissódico 1 mM (pH 8,0).

Utilizada no processo de extração do DNA.

♦ Solução de lise: lisozima (10 mg/mL), mutanolisina (5 U/mL), Brij (0,5% v/v) e

RNAse (3,75 U/mL) (todos obtidos na Amershan Pharmacia Biotech). Utilizada no

processo de extração do DNA.

♦ Solução de degradação protéica: protease (Amershan Pharmacia Biotech) (10 mg/mL)

e SDS (Amershan Pharmacia Biotech) 10%. Utilizada no processo de extração do

DNA.

♦ Solução de precipitação: acetato de sódio (Reagen) 3M e etanol (Reagen) PA gelados.

Utilizada no processo de extração do DNA.

4) Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma)

A susceptibilidade das cepas de EGB de origem bovina foi avaliada pelo método de

disco-difusão em meio sólido (antibiograma) de acordo com os parâmetros estabelecidos pelo

“NCCLS/CLSI” (Clinical Laboratory Standards Institute, 2003).

As cepas congeladas foram semeadas em placas de Petri contendo agar sangue e

incubadas a 37°C por 24 horas. Após crescimento, cada cepa foi então ressemeada em nova

placa contendo agar sangue e incubada a 37°C por 18 horas.

A seguir, algumas colônias foram emulsificadas em um tubo de vidro contendo salina

estéril e a turbidez foi ajustada de modo que ficasse equivalente ao padrão 0,5 da escala de

McFarland (aproximadamente 108 UFC/mL).

31

A partir desse tubo, com o auxílio de um “swab”, foi realizada uma semeadura

confluente em 3 planos em placas contendo agar Mueller-Hinton suplementado com 5% de

sangue desfibrinado de carneiro.

Em seguida, foram colocados discos de cloranfenicol (30μg), eritromicina (15μg),

vancomicina (30μg), clindamicina (2μg), tetraciclina (30μg), rifampicina (5μg) e ampicilina

(10μg) (todos obtidos na CECON) na superfície da placa. Essas placas foram então incubadas

a 37°C por 18 horas.

Após esse período, os halos de inibição do crescimento bacteriano foram então

avaliados e as cepas foram classificadas como resistentes, intermediárias ou sensíveis aos

antibióticos utilizados.

A cepa Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 foi utilizada como controle de

qualidade dos testes de antibiograma.

5) Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina

O mecanismo fenotípico de resistência à eritromicina foi determinado através da

técnica de disco-difusão descrita por SEPPÄLÄ e colaboradores (1993).

As cepas de EGB de origem humana e bovina resistentes à eritromicina e/ou

clindamicina foram semeadas em placas de Petri contendo agar sangue e incubadas a 37°C

por 24 horas. Após crescimento, cada cepa foi então ressemeada em nova placa contendo agar

sangue e incubada a 37°C por 18 horas.

A seguir, algumas colônias foram emulsificadas em um tubo de vidro contendo salina

estéril e a turbidez foi ajustada de modo que ficasse equivalente ao padrão 0,5 da escala de

McFarland.

A partir desse tubo, com o auxílio de um “swab”, foi realizada uma semeadura

confluente em 3 planos em placas contendo agar Mueller-Hinton suplementado com 5% de

32

sangue desfibrinado de carneiro.

Em seguida, foram colocados um disco de eritromicina (15μg) (CECON) e um disco

de clindamicina (2μg) (CECON), no centro da placa, a uma distância de aproximadamente 16

mm entre eles. Essas placas foram então incubadas a 37°C por 18 horas.

Após esse período, os halos de inibição do crescimento bacteriano foram avaliados de

acordo com os parâmetros estabelecidos pelo “NCCLS/CLSI” (2003) e o resultado foi

interpretado da seguinte forma:

Fenótipo M: foi atribuído àquela cepa que se apresentou resistente à eritromicina e

sensível à clindamicina;

Fenótipo MLSB constitutivo: foi atribuído àquela cepa que se apresentou resistente à

eritromicina e à clindamicina;

Fenótipo MLSB induzido: foi atribuído àquela cepa que se apresentou resistente à

eritromicina e sensível à clindamicina, mas com a presença de um estreitamento do

halo de inibição da clindamicina próximo ao disco de eritromicina, formando uma

letra “D” (SEPPÄLÄ et al., 1993);

Fenótipo L: foi atribuído àquela cepa que se apresentou sensível à eritromicina e

resistente à clindamicina (DE AZAVEDO et al., 2001).

6) Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina

O mecanismo genotípico de resistência foi avaliado através da detecção dos genes

ermA, ermB, mefA e linB nos cromossomos das cepas estudadas.

Para tal, foi realizada a amplificação desses genes pela técnica de reação em cadeia da

polimerase (Polymerase Chain Reaction, “PCR”), utilizando primers previamente descritos

por outros autores e sintetizados pela BIOSYNTHESIS (Tabela 3).

O DNA das cepas analisadas foi extraído pelo método de precipitação (MANIATS,

33

FRITSCH & SAMBROOK, 1989). As cepas congeladas foram primeiramente semeadas em

placas contendo agar sangue e incubadas a 37°C por 24 horas. Após esse período, algumas

colônias foram transferidas para tubos de vidro contendo 1 mL de caldo, que foram incubados

a 37°C por 18 horas.

Em seguida, este crescimento foi vertido em tubos Falcon contendo 10 mL de caldo,

que foram incubados a 37°C por 5 a 6 horas. Após o período de incubação, o crescimento foi

novamente vertido em garrafas de vidro contendo 90 mL de caldo. Estas foram então

incubadas a 37°C “overnight”.

Posteriormente, o crescimento bacteriano presente nas garrafas foi transferido para

tubos, que foram centrifugados a 3000 g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante foi então

desprezado e 1 mL de TE foi acrescentado e homogeneizado a cada tubo.

Esses tubos foram então novamente centrifugados a 3000 g por 30 minutos a 4°C. O

sobrenadante foi então desprezado e 1 mL da solução de lise foi adicionado a cada tubo, que

foi incubado a 37°C “overnight”.

A seguir, 1 mL da solução de degradação protéica foi adicionado a cada tubo, que foi

incubado a 37°C por 1 hora. Após esse período, 1 mL da solução de precipitação gelada foi

adicionado a cada tubo, que foi incubado a -20°C por 30 minutos. Esses tubos foram, então,

centrifugados a 4000 g por 30 minutos a 5°C. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet”

suspenso em 1 mL de água bidestilada estéril.

Em seguida, mais 1 mL da solução de precipitação gelada foi adicionado a cada tubo,

que foi incubado e centrifugado novamente utilizando os parâmetros descritos anteriormente.

O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” suspenso em 1 mL de etanol 70% gelado e

transferido para eppendorfs, que foram então centrifugados a 10.000 g por 5 minutos a frio.

O sobrenadante foi desprezado e os eppendorfs invertidos para evaporação do etanol a

37°C. Após a evaporação, o DNA purificado foi suspenso em água bidestilada estéril e

34

estocado a -20°C até ser utilizado na reação de “PCR”.

A mistura para o “PCR” conteve um volume total de 50 μL, incluindo 1 U da enzima

Taq DNA Polymerase (Biotools do Brasil), 50 ng de DNA cromossômico purificado, 20 pM

de cada primer, 10 nM de cada deoxinucleotídeo e 2 mM de cloreto de magnésio.

Para os genes ermA, ermB e mefA foi realizado um “PCR” multiplex, cujo ciclo

incluiu uma desnaturação inicial a 93°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a

93°C por 1 minuto, anelamento dos primers a 52°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1

minuto, seguidos de uma extensão final a 72°C por 5 minutos (SUTCLIFFE et al., 1996).

Para esses três genes foram incluídas cepas de EGB de controle positivo, cordialmente

cedidas pela Professora Angela Cristina Dias de Castro, cujos números de identificação são

06196 (controle positivo para o gene mefA), 53157 (controle positivo para o gene ermA) e

015195 (controle positivo para o gene ermB). Além disso, foram incluídas também 2 cepas de

EGB sensíveis à eritromicina e à clindamicina, pertencentes a nossa Coleção de Culturas,

como controle negativo, cujos números de identificação são 87149 (origem bovina) e 02008

(origem humana).

Para a detecção do gene linB, o ciclo compreendeu uma desnaturação inicial a 94°C

por 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 45 segundos, anelamento a

54°C por 45 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto, seguidos de uma extensão final a 72°C

por 5 minutos (BOZDOGAN et al., 1999; DE AZAVEDO et al., 2001).

A análise eletroforética dos produtos de amplificação foi realizada em gel de agarose a

1%, que foi preparado com TBE 0,5X, onde foi também incluído o padrão de massa

molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen). Após a eletroforese, o gel foi corado com

brometo de etídio a 1%, visualizado sob luz ultravioleta e fotografado com filme Polaroid

667.

RESULTADOS

35

Teste de susceptibilidade das cepas de origem bovina (antibiograma):

Todas as 25 cepas de EGB de origem bovina analisadas (100%) apresentaram-se

sensíveis ao cloranfenicol, à vancomicina, à rifampicina e à ampicilina. Vinte cepas (80%)

apresentaram resistência à tetraciclina e nove cepas (36%) apresentaram-se resistentes à

eritromicina. Destas últimas, 8 cepas ou 88,9% também apresentaram-se resistentes à

clindamicina, representando 32% do total de 25 cepas analisadas (Tabela 4 e Figura 1).

Análise fenotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina:

Entre as 15 cepas de EGB de origem humana resistentes à eritromicina, 4 (26,7%)

apresentaram o fenótipo M e 11 (73,3%) apresentaram o fenótipo MLSB constitutivo.

Entre as 9 cepas de EGB de origem bovina resistentes à eritromicina, 1 (11,1%)

apresentou o fenótipo M e 8 (88,9%) apresentaram o fenótipo MLSB constitutivo.

Entre as 24 cepas resistentes à eritromicina analisadas, incluindo 15 de origem humana

e 9 de origem bovina, 5 (20,8%) apresentaram o fenótipo M e 19 (79,2%) apresentaram o

fenótipo MLSB constitutivo (Tabela 5 e Figura 2).

Os fenótipos MLSB induzido e o fenótipo L não foram encontrados em nenhuma cepa

de origem humana ou bovina.

Análise genotípica do mecanismo de resistência das cepas de origem humana e bovina:

Entre as 15 cepas de EGB de origem humana resistentes à eritromicina, 4 (26,7%)

apresentaram somente o gene mefA, 3 (20%) apresentaram somente o gene ermB, 2 (13,3%)

apresentaram os genes ermB e mefA, 1 (6,6%) apresentou os genes ermA e mefA, 1 (6,6%)

apresentou os genes ermA e ermB e 4 (26,7%) não apresentaram nenhum dos três genes

pesquisados.

36

Entre as 9 cepas de EGB de origem bovina resistentes à eritromicina, 1 (11,1%)

apresentou somente o gene mefA, 6 (66,7%) apresentaram somente o gene ermB, 1 (11,1%)

apresentou os genes ermA e ermB e 1 (11,1%) apresentou os genes ermA e mefA.

Entre as 24 cepas analisadas, incluindo as de origem humana e bovina, 5 (20,8%)

apresentaram somente o gene mefA, 9 (37,5%) apresentaram somente o gene ermB, 2 (8,3%)

apresentaram os genes ermA e mefA, 2 (8,3%) apresentaram os genes ermA e ermB, 2 (8,3%)

apresentaram os genes ermB e mefA e 4 (16,7%) não apresentaram nenhum dos 3 genes

(Tabela 5, Figuras 3 e 5).

De um modo geral, incluindo as cepas de origem humana e bovina, o gene mefA

esteve presente em 9 cepas (37,5%), o gene ermA presente em 6 cepas (25%) e o ermB

presente em 13 cepas (54,2 %) (Figura 4).

O gene linB não foi encontrado em nenhuma das cepas analisadas, originárias tanto de

origem humana como bovina.

Tabela 1 – Número de identificação, ano de isolamento, origem clínica, local de isolamento,

37

sorotipo e susceptibilidade à eritromicina e à clindamicina das cepas de Streptococcus

agalactiae de origem humana analisadas.

Número Ano de isolame

nto

Origem clínica

Local de

isolamento

Sorotipo

Suscept.# à

eritromicina

Suscept. à clindamici

na

Suscept. à

tetraciclina

80358 1980 Cérvice HUCFF (RJ)¹ II Resistente Sensível Resistente

81055 1981 Orofaringe ND III Resistente Sensível Resistente

81376 1981 Cérvice HUCFF (RJ)¹ II Resistente Resistente Resistente

90180 1990 Urina IFF (RJ)² Ia Resistente Sensível Resistente

90184 I 1990 Orofaringe IFF (RJ)² III Resistente Sensível Resistente

96008 1996 ND Marília (SP) IV Resistente Resistente Resistente

96009 1996 ND Marília (SP) IV Resistente Resistente Resistente

02019 2002 ND LABS (RJ)4 NT Resistente Resistente Sensível

02031 2002 ND LABS (RJ)4 V Resistente Resistente Resistente

02054 2002 ND LABS (RJ)4 V Resistente Resistente Resistente

02056 2002 ND LABS (RJ)4 IV Resistente Resistente Resistente

02060 2002 Urina LABS (RJ)4 NT Resistente Resistente Resistente

02063 2002 Urina LABS (RJ)4 NT Resistente Resistente Resistente

02065 2002 Urina LABS (RJ)4 V Resistente Resistente Resistente

02082 2002 ND HUGG (RJ)³ NT Resistente Resistente Resistente

# Susceptibilidade

RJ – Rio de Janeiro; SP – São Paulo; ND – Não descrito.

¹ HUCCF – Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ)

² IFF – Instituto Fernandes Figueira

³ HUGG - Hospital Universitário Gafrée Guinle (UNIRIO) 4 LABS – Laboratório de Patologia Clínica LABS

38

Tabela 2 – Número de identificação, ano de isolamento, origem clínica, local de isolamento e

sorotipo das cepas de Streptococcus agalactiae de origem bovina analisadas.

Número Ano de isolamento Origem clínica Local de isolamento Sorotipo

87149 1987 leite IBSP (SP)¹ NT


87153 1987 leite IBSP (SP)¹ Ia


87155 1987 leite IBSP (SP)¹ Ia

87159 1987 leite IBSP (SP)¹ V










88057 1988 leite Florianópolis (SC) V

88058 1988 leite Florianópolis (SC) V

03028 2003 leite Penedo (RJ) II

03029 2003 leite Penedo (RJ) Ia

06001 2006 leite Miguel Pereira (RJ) V



06004 2006 leite Miguel Pereira (RJ) NT


06006 2006 leite Miguel Pereira (RJ) NT

SP – São Paulo; SC - Santa Catarina; RJ - Rio de Janeiro.

¹ Instituto Biológico de São Paulo, São Paulo.

39

Tabela 3 – Genes de resistência relacionados, seqüência dos primers, tamanho esperado dos

amplicons e referências dos primers utilizados.

Gene

Seqüência dos primers

forward

reverse

Tamanho do

amplicon (em

pares de bases)

Referência

ermA 5’ GCATGACATAAACCTTCA 3’

5’ AGGTTATAATGAAACAGA 3’ 206 pb SEPPÄLÄ et al., 1998

ermB 5’ CGAGTGAAAAAGTACTCAACC 3’

5’ GGCGTGTTTCATTGCTTGATG 3’ 616 pb

KLUGMAN et al.,

1998

mefA 5’ AGTATCATTAATCACTAGTGC 3’

5’ TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG 3’ 348 pb

SUTCLIFFE et al.,

1996

linB 5’ CTACCTATTGTTTGTGGAAC 3’

5’ ATAACGTTACTCTCCTATTC 3’ 900 pb

BOZDOGAN et al.,

1999;

DE AZAVEDO et al.,

2001

40

Tabela 4 – Número de identificação e susceptibilidade ao cloranfenicol, eritromicina,

vancomicina, clindamicina, tetraciclina, rifampicina e ampicilina das cepas de S. agalactiae

de origem bovina analisadas.

Número CLO¹ ERI VAN CLI TET RIF AMP

87149 Sensível Sensível Sensível Sensível Resistente Sensível Sensível


87153 Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível









87165 Sensível Resistente Sensível Resistente Resistente Sensível Sensível



87169 Sensível Resistente Sensível Sensível Sensível Sensível Sensível











¹ CLO – cloranfenicol; ERI – eritromicina; VAN – vancomicina; CLI – clindamicina; TET –

tetraciclina; RIF – rifampicina; AMP – ampicilina.

41

Tabela 5 – Número de identificação, origem, sorotipo, fenótipo e genótipo de resistência das

cepas de origens humana e bovina analisadas.

Número Ano de

isolamento Origem Sorotipo Fenótipo Genótipo

80358 1980 Humana II M mefA

81055 1981 Humana III M mefA

81376 1981 Humana II MLSB Constitutivo ermA e mefA

87165 1987 Bovina V MLSB Constitutivo ermA e ermB

87169 1987 Bovina NT M mefA

90180 1990 Humana Ia M mefA

90184 I 1990 Humana III M mefA

96008 1996 Humana IV MLSB Constitutivo ermB e mefA

96009 1996 Humana IV MLSB Constitutivo ermB e mefA

02019 2002 Humana NT MLSB Constitutivo -

02031 2002 Humana V MLSB Constitutivo -

02054 2002 Humana V MLSB Constitutivo -

02056 2002 Humana IV MLSB Constitutivo -

02060 2002 Humana NT MLSB Constitutivo ermB

02063 2002 Humana NT MLSB Constitutivo ermB

02065 2002 Humana V MLSB Constitutivo ermB

02082 2002 Humana NT MLSB Constitutivo ermA e ermB

03029 2003 Bovina Ia MLSB Constitutivo ermA e mefA

06001 2006 Bovina V MLSB Constitutivo ermB



06004 2006 Bovina NT MLSB Constitutivo ermB


06006 2006 Bovina NT MLSB Constitutivo ermB

42

36% 32%

80%

Eritromicina Clindamicina Tetraciclina

Porcentagem de cepas resistentes

Figura 1 – Porcentagem de cepas de Streptococcus agalactiae de origem bovina resistentes à

eritromicina, à clindamicina e à tetraciclina entre as 25 cepas analisadas.

43

20,8%

79,2%

Fenótipo M Fenótipo MLSB constitutivo

Figura 2 - Distribuição dos fenótipos de resistência à eritromicina e à clindamicina das cepas

de Streptococcus agalactiae de origens humana e bovina analisadas.

44

20,8%

37,5%8,3%

8,3%

8,3%

16,7%mefAermBermA + ermBermA + mefAermB + mefANenhum gene

Figura 3 – Distribuição específica dos genes pesquisados, utilizando a técnica de “PCR”,

entre as cepas de Streptococcus agalactiae de origens humana e bovina resistentes à

eritromicina.

45

25,0%

54,2%

37,5%

ermA ermB mefA

Figura 4 - Distribuição geral dos genes pesquisados, utilizando a técnica de “PCR”, entre as

cepas de Streptococcus agalactiae de origens humana e bovina resistentes à eritromicina.

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

2000 pb 1200 pb 800 pb

400 pb 200 pb

14 15 16 17 18 19 20 21 22

2000 pb 1200 pb 800 pb

400 pb 200 pb

Figura 5 – Avaliação da presença dos genes de resistência nas cepas de Streptococcus

agalactiae de origens humana e bovina analisadas. Canaletas 1 e 14: Padrão de massa

molecular (Low DNA Mass Ladder); 2: Controle negativo (cepa 87149); 3: Controle positivo

do gene ermB (cepa 015195) (616 pb); 4: Controle positivo do gene mefA (cepa 06196) (348

pb); 5: Controle positivo do gene ermA (cepa 53157) (206 pb); 6: cepa 80358 (origem

humana; mefA); 7: cepa 81055 (humana; mefA); 8: cepa 03029 (bovina; ermA e mefA); 9:

cepa 87165 (bovina; ermA e ermB); 10: cepa 87169 (bovina; mefA); 11: cepa 90180

(humana; mefA); 12: cepa 90184 I (humana; mefA); 13: cepa 96008 (humana; ermB e mefA);

15: cepa 02065 (humana, ermB); 16: cepa 96009 (humana; ermB e mefA); 17: cepa 02019

(humana; negativo para os 3 genes); 18: cepa 02031 (humana; negativo para os 3 genes); 19:

cepa 02054 (humana; negativo para os 3 genes); 20: cepa 02056 (humana; negativo para os 3

genes); 21: cepa 06001 (bovina; ermB); 22: cepa 06004 (bovina; ermB).

47

DISCUSSÃO

Atualmente, a espécie S. agalactiae é responsável por um índice de mortalidade

neonatal que varia de 2 a 30%, dependendo do número de semanas de gestação do neonato.

Este número é consideravelmente menor do que o que era encontrado na década de 1970,

quando aproximadamente 50% dos casos eram fatais, evidenciando a eficácia do programa de

profilaxia (“IAP”) durante a gravidez (SCHRAG et al., 2002).

A penicilina é o antibiótico de primeira escolha, não só para a profilaxia mas também

para o tratamento das infecções causadas pelo EGB em humanos. No caso do paciente

apresentar hipersensibilidade aos β-lactâmicos, são indicadas, então, a eritromicina ou a

clindamicina.

S. agalactiae foi inicialmente descrito como um patógeno animal e é, ainda hoje,

considerado um dos principais agentes de mastite bovina, doença que representa um dos mais

importantes problemas econômicos na indústria mundial do gado, já que a qualidade e a

quantidade do leite são substancialmente prejudicadas (MERL et al., 2003).

Visando à redução da incidência dessa doença, foram criados em diversos países

programas nacionais e regionais de controle da mastite, que têm como base o aprimoramento

da prática da ordenha, a limpeza das tetas e, principalmente, a terapia antimicrobiana

intramamária, utilizando soluções comerciais contendo um ou mais antibióticos, dentre os

quais destacam-se as penicilinas e seus derivados, as cefalosporinas e as tetraciclinas

(BASEGGIO et al., 1997).

Cepas de EGB resistentes à penicilina ainda não foram relatadas, no entanto, o índice

de cepas resistentes à eritromicina e à clindamicina vem crescendo, nos últimos anos, em

vários países, em uma freqüência que varia de 2 a 46% (TRAUB & LEONHARD, 1997;

HSUEH et al., 2001).

48

No Brasil, a emergência desta resistência não está clara, principalmente devido a

escassez de estudos que analisem esse aspecto. Até o presente momento, somente dois estudos

desenvolvidos com cepas isoladas no Brasil são encontrados na literatura científica e, nestes,

somente cepas de S. agalactiae de origem humana isoladas na última década são examinadas.

Da mesma forma, a análise da emergência da resistência em cepas de EGB de origem bovina

não foi ainda muito bem avaliada mundialmente, já que poucos trabalhos no mundo incluem

cepas desta origem.

Por este motivo, torna-se cada vez mais necessário que pesquisadores brasileiros

avaliem os índices de resistência à eritromicina e à clindamicina não só em cepas de S.

agalactiae de origem humana como também em cepas de origem bovina, para assim, fornecer

suporte para a tomada de decisões racionais e econômicas na aplicação e utilização de

antibióticos específicos para o tratamento das infecções associadas ao EGB.

Entre os muitos genes que podem codificar resistência a esses dois antibióticos, os

genes ermA, ermB e mefA são os mais comuns na espécie S. agalactiae (ROBERTS et al.,

1999) e, por isso, são os mais pesquisados.

Em testes de susceptibilidade a antimicrobianos realizados previamente em nosso

laboratório (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados), 385 cepas de EGB de origem

humana, isoladas entre as décadas de 1970 e 2000, foram analisadas. Todas (100%)

apresentaram susceptibilidade à vancomicina e à penicilina. No entanto, 35 (9,1%)

apresentaram resistência ao cloranfenicol, 338 (87,8%) à tetraciclina e 19 (4,9%) à

rifampicina. Além disso, 15 cepas (3,9%) apresentaram-se resistentes à eritromicina, das quais

11 (73,3%) também apresentaram-se resistentes à clindamicina. Essas 11 cepas representam

um índice de 2,8% de resistência à clindamicina, do total de 385 cepas de origem humana

estudadas e foram as cepas selecionadas para este estudo (Tabela 1).

O índice de resistência à eritromicina em cepas de origem humana encontrado no

49

estudo citado acima (3,9%) assemelha-se aos índices encontrados nos outros dois estudos

realizados no Brasil, nos quais o índice gira em torno de 4%. O mesmo acontece com o índice

de resistência à clindamicina (2,8%), que é bem parecido com os índices encontrados nos

mesmos outros dois estudos, os quais variam de 1 a 2% (D’OLIVEIRA et al., 2003;

DUARTE et al., 2005).

Além disso, esse número é também semelhante aos índices encontrados na Argentina

(LOPARDO et al., 2003), no Japão (MATSUBARA et al., 2001) e na Alemanha (RUESS et

al., 2000). Entretanto, é mais baixo do que os índices detectados na Espanha (PORTILLO et

al., 2001), nos Estados Unidos (MURDOCH & RELLER, 2001), no Canadá (DE AZAVEDO

et al., 2001) e em Taiwan (HSUEH et al., 2001), sugerindo que, pelo menos por enquanto,

não é visualizada a emergência descontrolada de cepas resistentes no Brasil, como vem

ocorrendo em outros países do mundo na última década.

Neste estudo, foram analisadas 25 cepas de origem bovina, isoladas entre os anos de

1987 e 2006 nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Santa Catarina (Tabela 2). Todas

(100%) apresentaram-se sensíveis ao cloranfenicol, à vancomicina, à rifampicina e à

ampicilina. Vinte cepas (80%) apresentaram resistência à tetraciclina. Além disso, 9 cepas

(36%) apresentaram-se resistentes à eritromicina, das quais 8 cepas (88,9%) apresentaram-se

também resistentes à clindamicina. Essas 8 cepas representam um índice de 32% de

resistência à clindamicina, do total de 25 cepas de origem bovina analisadas (Tabela 4 e

Figura 1).

Os índices encontrados entre as cepas de origem bovina, 36% de resistência à

eritromicina e 32% de resistência à clindamicina, são bem maiores do que os encontrados nos

Estados Unidos (DOGAN et al., 2005), que correspondem a 3,6%, e relativamente maiores

aos encontrados no Brasil (DUARTE et al., 2005) e na Argentina (DENAMIEL et al., 2005),

que giram em torno de 25%.

50

Somando-se as 385 cepas de S. agalactiae de origem humana analisadas anteriormente

(I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados) com as 25 cepas de origem bovina

analisadas no presente estudo consta um total de 410 cepas de EGB analisadas em nosso

laboratório. Dessas 410 cepas, 24 apresentaram-se resistentes à eritromicina, incluindo 15

cepas de origem humana e 9 de origem bovina, representando um índice de resistência à

eritromicina de aproximadamente 5,8%. Além disso, dentre essas mesmas 410 cepas de EGB,

19 cepas, incluindo 11 cepas de origem humana e 8 cepas de origem bovina, apresentaram

resistência à clindamicina, representando um índice de resistência à clindamicina de

aproximadamente 4,6%.

Dentre as 15 cepas de origem humana resistentes à eritromicina encontradas no estudo

anterior (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados), 1 cepa (6,7%) pertence ao

sorotipo Ia, 2 (13,3%) ao sorotipo II, 2 (13,3%) ao tipo III, 3 (20%) ao tipo IV, 3 (20%) ao

tipo V e 4 (26,7%) apresentaram-se como não-tipáveis. Estatisticamente, a resistência à

eritromicina não pôde ser associada a um único sorotipo nessas cepas de EGB, no entanto os

tipos IV e V foram os mais encontrados.

Já entre as 9 cepas de origem bovina resistentes à eritromicina encontradas neste

estudo, o sorotipo V foi o prevalente (5 cepas – 55,5%), seguido pelo tipo Ia (1 cepa – 11,1%)

enquanto três cepas (33,4%) apresentaram-se como não-tipáveis.

No total, entre as 24 cepas de EGB resistentes à eritromicina analisadas quanto ao

mecanismo de resistência, incluindo as isoladas de humanos e as de bovinos, o sorotipo V foi

o predominante (8 cepas – 33,3%), seguido pelo tipo IV (3 cepas – 12,5%) e pelos tipos Ia, II

e III (2 cepas – 8,3% cada um), enquanto 7 cepas (29,3%) apresentaram-se como não-tipáveis.

Portanto, neste estudo, a resistência à eritromicina pôde ser associada ao sorotipo V.

De acordo com alguns autores, os altos índices de resistência à eritromicina e à

clindamicina podem estar relacionados com certos sorotipos, principalmente com o tipo V

51

(FERNANDEZ, HICKMAN & BAKER, 1998; DE AZAVEDO et al., 2001). No entanto,

outros autores acreditam que cepas pertencentes ao sorotipo III apresentem maiores índices de

resistência do que cepas pertencentes a outros sorotipos (FITOUSSI et al., 2001). O aspecto

preocupante da predominância dos tipos III e V entre as cepas de EGB resistentes à

eritromicina é o fato destes sorotipos estarem usualmente associados a casos de infecções

invasivas (FITOUSSI et al., 2001).

Tanto as 15 cepas resistentes à eritromicina de origem humana (I. C. M. OLIVEIRA et

al., dados não publicados) como também as 9 de origem bovina encontradas neste estudo

foram isoladas de diferentes locais de dois estados distintos, Rio de Janeiro e São Paulo,

sugerindo que a resistência à eritromicina no Brasil, apesar de ainda relativamente baixa,

encontra-se disseminada, pelo menos na região Sudeste.

Além disso, dentre essas mesmas 24 cepas, foi verificado que o índice de resistência à

eritromicina e à clindamicina vem aumentando ao longo dos anos, emergindo

consideravelmente na última década. Cinco cepas resistentes à eritromicina (20,8%), das

quais 2 também são resistentes à clindamicina (10,5%), foram isoladas na década de 80.

Quatro cepas resistentes à eritromicina (16,7%), das quais 2 são também resistentes à

clindamicina (10,5%), foram isoladas na década de 90. No entanto, 15 cepas resistentes à

eritromicina (62,5%), das quais todas são também resistentes à clindamicina (79%), foram

isoladas na década de 2000. Esses dados levam ao questionamento se o aparecimento de

índices alarmantes de resistência à eritromicina e à clindamicina no Brasil não seria apenas

uma questão de tempo.

O fenótipo de resistência M foi encontrado em 5 (20,8%) das 24 cepas analisadas,

incluindo 4 de origem humana e 1 de origem bovina, foi completamente associado ao gene

mefA, mas a nenhum sorotipo específico.

O fenótipo MLSB constitutivo foi encontrado nas outras 19 cepas (79,2%), incluindo

52

11 de origem humana e 8 de origem bovina, foi predominantemente associado ao gene ermB,

representado por 13 cepas (68,4%), e ao sorotipo V, representado por 8 cepas (42,1%) (Tabela

5 e Figura 2).

O fenótipo MLSB induzido não foi encontrado em nenhuma cepa de origem humana

ou bovina, assim como ocorreu em um outro estudo realizado na Argentina com cepas

isoladas de bovinos (DENAMIEL et al., 2005).

Esses dados discordam dos outros dois estudos brasileiros, nos quais o fenótipo MLSB

induzido e o gene ermA prevaleceram nas cepas de origem humana analisadas (D’OLIVEIRA

et al., 2003; DUARTE et al., 2005). Entretanto, os resultados deste estudo concordam com os

dados obtidos para as cepas de origem bovina em uma das pesquisas realizadas no Brasil, nas

quais prevaleceram o fenótipo MLSB constitutivo e o gene ermB (DUARTE et al., 2005).

A prevalência do fenótipo MLSB constitutivo, assim como o gene ermB, em cepas de

origens humana e bovina, é encontrada na maioria dos estudos realizados por outros autores

em diferentes locais do mundo, como França, Taiwan, Portugal, Bélgica, Argentina e Estados

Unidos (FITOUSSI et al., 2001; HSUEH et al., 2001; FIGUEIRA-COELHO et al., 2004;

DECOSTER et al., 2005; DENAMIEL et al., 2005; DOGAN et al., 2005). Essa

predominância levanta questões preocupantes, já que a clindamicina, os macrolídeos de 16

átomos e as estreptograminas B também não podem ser utilizados como agentes terapêuticos

e profiláticos nesses casos.

Neste estudo, seis cepas (25%) apresentaram 2 genes de resistência, todas

apresentando o fenótipo MLSB constitutivo, sendo 4 de origem humana e 2 de origem bovina,

incluindo as seguintes 3 combinações: ermA e mefA, ermA e ermB e ermB e mefA (2 cepas –

8,3% cada um) (Tabela 5 e Figura 3). Este fenômeno já foi descrito por outros autores e não é

incomum (DE MOUY et al., 2001; BETRIU et al., 2003; ACIKGOZ et al., 2004; DOGAN et

al., 2005), entretanto, ainda não foi explicado porque sua ocorrência é mais comum em certos

53

estudos e que implicações este genótipo pode ter no desenvolvimento do fenótipo de

resistência.

Além disso, quatro cepas (16,7%) de origem humana apresentando o fenótipo MLSB

constitutivo não apresentaram nenhum dos 3 genes pesquisados (Tabela 5 e Figura 3). Este

fenômeno também já foi relatado na literatura por outros autores de diferentes países (DE

MOUY et al., 2001; FITOUSSI et al., 2001; BETRIU et al., 2003; ACIKGOZ et al., 2004;

BINGEN et al., 2004; DOGAN et al., 2005; UH et al., 2005). Essas cepas podem possuir

outros mecanismos de resistência que não os pesquisados neste estudo, como diferentes genes

erm, mutações no rRNA 23S ou em uma das proteínas ribossomais, como L4 e L22,

fenômenos já descritos para cepas de Streptococcus pneumoniae (TAIT-KAMRADT et al.,

2000).

Nenhuma das cepas analisadas neste estudo apresentou o fenótipo L ou o gene linB.

Este gene foi detectado, pela primeira e única vez, em uma cepa de S. agalactiae sensível à

eritromicina mas resistente à clindamicina por DE AZAVEDO e colaboradores (2001). Um

estudo também realizado no Brasil pesquisou a presença deste gene em cepas de EGB de

origem humana e bovina, porém este também não foi encontrado (DUARTE et al., 2005).

Outros autores também observaram a existência de cepas de S.agalactiae resistentes à

clindamicina mas sensíveis à eritromicina (fenótipo L), porém, nestes casos não foi analisada

a presença do gene (GONZÁLEZ & ANDREU, 2003; WERNO, ANDERSON &

MURDOCH, 2003).

O índice de resistência à eritromicina encontrado nas cepas de origem bovina no

presente estudo foi notoriamente maior do que o encontrado nas cepas de origem humana em

estudo anterior (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não publicados). Este é um fato inusitado já

que a eritromicina não é usualmente utilizada para o tratamento ou profilaxia das infecções

bovinas, e sim das infecções humanas.

54

Da mesma forma, o alto índice de resistência à tetraciclina encontrada não só nas

cepas de origem bovina analisadas neste estudo (80%) (Figura 1) como também nas cepas de

origem humana analisadas em estudo anterior (87,8%) (I. C. M. OLIVEIRA et al., dados não

publicados) também é um fato inexplicável, já que a tetraciclina nunca foi utilizada para o

tratamento de infecções em humanos, mas sim em bovinos (DE AZAVEDO et al., 2001).

No estudo realizado anteriormente em nosso laboratório (I. C. M. OLIVEIRA et al.,

dados não publicados), 93,3% e 91% das cepas de origem humana resistentes à eritromicina e

à clindamicina, respectivamente, se apresentaram também resistentes à tetraciclina. Neste

estudo, 88,9% e 100% das cepas de origem bovina resistentes à eritromicina e à clindamicina,

respectivamente, se apresentaram também resistentes à tetraciclina (Tabela 4). Esses dados

sugerem uma alta associação entre essas três resistências.

Acredita-se que os genes que conferem resistência à tetraciclina estejam presentes nos

mesmos elementos móveis dos genes que conferem resistência aos macrolídeos e às

lincosaminas, levando ao questionamento do papel das cepas resistentes à tetraciclina na

disseminação de resistência aos outros antibióticos, já que é provável que esses transposons

conjugativos sejam rapidamente transferidos de uma cepa para outra sob pressão seletiva do

meio (SPEER, SHOEMAKER & SALYERS, 1992).

Portanto, surge o questionamento se esses transposons, contendo os genes de

resistência, poderiam ser transferidos não só entre cepas da mesma origem (humana ou

bovina), como também entre cepas de origens diferentes (humana e bovina). A investigação

dessa hipótese elucidaria não só as dúvidas quanto à disseminação da resistência, como

também o grau de intimidade que as cepas de ambas as origens possuem, já que, até hoje, não

se esclareceu se essas duas populações de cepas são totalmente distintas ou relacionadas entre

si.

Estudos sobre a capacidade de transferência in vitro de genes de resistência à

55

eritromicina já foram relatados para várias espécies de Streptococcus e alguns trabalhos

relatam a presença desses transposons conjugativos nos cromossomos de cepas de EGB de

origem humana (LE BOUGUÉNEC, CÉSPEDES & HORAUD, 1990; MARIMON et al.,

2005).

Apesar de comprovadamente eficientes, as recomendações da "IAP" vão

indubitavelmente aumentar o uso de antibióticos durante o parto e existem sérias

preocupações acerca dos efeitos desse aumento, como reações anafiláticas severas ou a

possível emergência de resistência antimicrobiana tanto em cepas de S. agalactiae quanto em

outros patógenos perinatais (SHET & FERRIERI, 2004).

Para um patógeno com as características do EGB, a estratégia de prevenção ideal seria

a vacinação. Uma vacina segura, eficiente e de baixo custo seria bem mais simples de

administrar, diminuiria os riscos associados ao uso extensivo de antibióticos, como a

emergência de cepas resistentes, e não atrapalharia o processo do parto.

O desenvolvimento desta vacina é uma das grandes prioridades da saúde pública

atualmente, no entanto, enquanto ainda não é uma realidade, é extremamente necessário que

os índices de resistência, principalmente aos antimicrobianos mais utilizados, como a

penicilina, eritromicina e clindamicina, sejam freqüentemente monitorados.

Por outro lado, enquanto é quase indiscutível que o uso extensivo de antibióticos na

medicina acabe por aumentar a resistência bacteriana aos antimicrobianos, evidências de que

a utilização de antibióticos em fazendas de animais contribua para a emergência de cepas

resistentes em humanos são ainda limitadas, apesar de vários estudos terem sugerido que o

uso de antimicrobianos em animais influencie no desenvolvimento de resistência entre

patógenos humanos (AARESTRUP, 1999). Por este motivo, é também necessário e

importante monitorar os índices de resistência aos antimicrobianos em cepas isoladas de

animais.

56

Portanto, este estudo reafirma a importância e a necessidade de se tornar os testes de

susceptibilidade à eritromicina e à clindamicina um protocolo de rotina para cepas de S.

agalactiae nos laboratórios e hospitais de todo o mundo, a fim de que essa resistência possa

ser monitorada e controlada corretamente. Além disso, o estudo dos mecanismos envolvidos

na resistência à eritromicina e à clindamicina pode ajudar na elucidação do surgimento e da

transmissão desta resistência entre as cepas de EGB, além de orientar os profissionais de

saúde para a tomada de decisões corretas e eficientes quanto ao antibiótico a ser aplicado nos

pacientes.

57

CONCLUSÕES

O índice de resistência à eritromicina e à clindamicina nas cepas de S. agalactiae de

origem humana apresentou-se baixo (3,9% e 2,8%, respectivamente), enquanto que

nas cepas de origem bovina esse índice foi significantemente mais alto (36% e 32%,

respectivamente).

O fenótipo MLSB constitutivo e o gene ermB foram predominantes entre as cepas de

S. agalactiae de origens humana e bovina analisadas.

A resistência à eritromicina pôde ser associada ao sorotipo V nas cepas de EGB

analisadas.

O gene linB, assim como o fenótipo MLSB induzido, não foram encontrados em

nenhuma das cepas de EGB estudadas, tanto as de origem humana quanto as de

origem bovina.

Nossos dados aliados a uma amostragem utilizada em estudo anteriormente realizado

no laboratório sugerem que os índices de resistência à eritromicina e à clindamicina

vêm aumentando ao longo do tempo, revelando índices mais altos na última década.

58

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