DETECÇÃO DE Strongyloides stercoralis POR PCR EM AMOSTRA ... · RESUMO Strongyloides stercoralis...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE REGIONAL JATAÍ

DETECÇÃO DE Strongyloides stercoralis POR PCR EM AMOSTRA DE FEZES DE PACIENTES PORTADORES DE DIABETES MELLITUS

TIPO 2

JATAÍ – GO

2017

MARCIA CAROLINA MAZZARO

MARCIA CAROLINA MAZZARO

DETECÇÃO DE Strongyloides stercoralis POR PCR EM AMOSTRA DE

FEZES DE PACIENTES PORTADORES DE DIABETES MELLITUS

TIPO 2

Dissertação apresentada à Comissão Examinadora como requisito para obtenção de título de Mestre em Ciências Aplicadas do à Saúde da Universidade Federal de Goiás, Regional Jataí

Orientadora:

Prof.ª. Dr.ª Rosângela Maria Rodrigues

JATAÍ - GO

2017

AGRADECIMENTOS

Ao meu esposo Rodrigo pelo apoio incondicional em todos os momentos,

principalmente nos de incerteza, muito comuns para quem tenta trilhar novos

caminhos.

Aos meus pais Geni (in memorian) e Clovis, que dignamente me

apresentaram à importância da família e ao caminho da honestidade e persistência. A Prof.ª Dr.ª Rosangela Maria Rodrigues o meu reconhecimento pela

oportunidade de realizar este trabalho; meu respeito e admiração pela sua

serenidade, capacidade de análise do perfil de seus alunos, e pelo seu Dom no ensino

da Ciência.

Aos amigos do Laboratório de Parasitologia pela ajuda na realização de

todo o processo de pesquisa.

A prof.ª Dr.ª Fabiana Martins de Paula, pois a realização de um projeto de

pesquisa como este só foi possível com o apoio de colaboradores.

E em especial a todos os meus pacientes que pacientemente contribuíram

para realização desse projeto.

“Que o desânimo e a tristeza sejam

sempre vencidos pela vontade e fé que

habitam em nós”.

Humberto Queiroz

RESUMO Strongyloides stercoralis é um nematódeo intestinal que infecta aproximadamente 100 milhões de pessoas no mundo, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. A maioria dos portadores de S. stercoralis são assintomáticos ou oligoassintomáticos, o que não significa ausência de ação patogênica. As manifestações extra-intestinais podem levar a quadros graves e potencialmente fatais principalmente em pacientes imunocomprometidos. Na literatura são descritos casos de estrongiloidíase disseminada em pacientes diabéticos, porém não há estudos que determinam a relação existente entre o diabetes e o desenvolvimento da estrongiloidíase. O Objetivo desse estudo foi avaliar o perfil parasitológico e molecular da estrongiloidíase em pacientes portadores Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e analisar sua performance na detecção de infecção crônica assintomática nesses pacientes. A pesquisa foi realizada com pacientes atendidos no ambulatório de diabetes da prefeitura de Jataí - GO e indivíduos não diabéticos residentes no município. Amostras fecais frescas foram obtidas de 149 indivíduos, sendo caracterizados em dois grupos: Grupo I (97) pacientes portadores de DM2, Grupo II (52) indivíduos não portadores de DM2. As amostras fecais fornecidas foram analisadas pelos métodos parasitológicos de Hoffman, Rugai e cultura em placa de ágar, e posteriormente submetidas à análise molecular por técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando primer específico. A positividade geral de S. stercoralis pelas técnicas parasitológicas foi de 2,6%(4/149), e apenas um paciente DM2 foi positivo. Com a utilização de técnica de PCR, a positividade geral foi de 16,1% (24/149), sendo 9,3% (9/97) no Grupo I, e 28,8% (15/52) no Grupo II. DM2 mostrou ser um fator de proteção para estrongiloidiase (OR 0,252 IC95% 0,101 a 0,628 p=0,003). Não houve concordância entre os métodos parasitológicos e PCR na detecção de S. stercoralis. Desta forma, a técnica de PCR utilizando primer espécie-especifico para S. stercoralis apresentou maior capacidade de detecção de infecção em portadores assintomáticos diabéticos e não diabéticos.

Palavras-chave: Estrongiloidiase; Diabetes mellitus, parasitológico, Diagnóstico molecular.

ABSTRACT Strongyloides stercoralis is an intestinal nematode that infects approximately 100 million people worldwide, mainly in tropical and subtropical regions. Most S. stercoralis carriers are asymptomatic or oligo-symptomatic, which does not mean absence of pathogenic action. Extra-intestinal manifestations can lead to severe and life-threatening conditions, especially in immunocompromised patients. The medical literature has case reports of disseminated strongyloidiasis in diabetic patients, but no studies have determined the relationship between diabetes and strongyloidiasis. The objective of this study aims to evaluate the parasitological and molecular profile of strongyloidiasis in patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) and to analyze their value in the detection of chronic asymptomatic infection in these patients. The population for this research were patients from Diabetes Outpatient Clinic of Jataí - GO and other non - diabetic individuals living in the city. Fresh stool samples were obtained from 149 individuals, and were characterized in two groups: Group I (97) patients with DM2, Group II (52) individuals not carrying DM2. The fecal samples provided were submitted to parasitological methods of Hoffman, Rugai and agar plate culture, and subsequently, to molecular analysis by Polymerase Chain Reaction (PCR). The overall positivity of S. stercoralis by parasitological techniques was 2,6 % (4/149), and only one DM2 patient was positive for the infection. With PCR, the positivity was 16.1% (24/149), 9,3% (9/97) in the group I, and 28,8% (15/52) in the group II. DM2 showed to be a protective factor for strongyloidiasis (OR 0,252 IC95% 0,101 a 0,628 p=0,003). There was no agreement between the parasitological methods and PCR in the detection of S. stercoralis. Thus, the PCR technique using primer species-specific for S. stercoralis showed a greater ability to detect infection in asymptomatic diabetic and non-diabetic patients.

.

Keywords: Strongyloidiasis; Diabetes mellitus, Parasitological, Molecular diagnosis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Prevalência Mundial do S. stercoralis ..........................................................13

Figura 2: Estágios Evolutivos e formas larvares do S. stercoralis ...............................15

Figura 3: Ciclo Biológico do S. stercoralis ...................................................................18

Figura 4: Resposta Imune ao S. stercoralis ................................................................22

Figura 5: Mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do Diabetes

mellitus tipo 2 .............................................................................................................36

Figura 6: Distribuição das associações parasitológicas nos Grupos I e II ...................54

Figura 7: Amplificação de DNA primer Gênero...........................................................58

Figura 8: Amplificação de DNA primer Específico.......................................................59

Tabela 1: Descrição dos aspectos socioeconômicos dos Grupos I e II........................52

Tabela 2: Prevalência de infecção parasitária em pacientes dos Grupos I e II ............53

Tabela 3: Frequência de parasitos intestinais patogênicos e comensais encontrados

nas em amostras fecais de pacientes dos Grupos I e II ..............................................53

Tabela 4: Fatores de risco para infecção parasitária nos Grupos I e II ........................55

Tabela 5: Fatores de risco para infecção parasitária no Grupo I..................................56

Tabela 6: Análise dos parâmetros clínicos e laboratoriais dos Grupos I e II ................57 Tabela 7: Fatores de risco associados à infecção por S. stercoralis utilizando método de diagnóstico molecular............................................................................................60 Tabela 8: Fatores de risco associados à infeção por S. stercoralis em pacientes diabéticos (DM2) utilizando diagnóstico molecular....................................................61 Tabela 9: Análise dos parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes positivos e negativos dos Grupo I e II utilizando método diagnóstico molecular.........................62 Tabela 10: Métodos de diagnóstico parasitológico e molecular para detecção de S. stercoralis nos Grupos I e II........................................................................................63 Tabela 11: Concordância entre os exames parasitológicos e PCR na detecção de S. stercoralis nos Grupos I e II (n=149)..........................................................................63

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ºC Graus Celsius

% Por cento/porcentagem

µg Micrograma

µl Microlitro

µm Micrometro

1n Haploide

2n Diploide

3n Triploide

ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpos

APC Célula apresentadora de antígeno

CoEP

CD

dL

Comitê de Ética em Pesquisa

Células Dendríticas

Decilitros

DM2 Diabetes mellitus Tipo 2

DNA Ácido desoxirribonucleico

ELISA

ES

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Produtos excretores/secretores específicos de helmintos

GO

GPAT

Goiás

Teste de aglutinação indireta de partículas em gelatina

Grupo I Pacientes portadores de DM2

Grupo II Pacientes sem DM2

HCl Ácido clorídrico

HIV Vírus da imunodeficiência humana

HTLV1 Vírus Linfotrópico Da Célula Humana

IC

IDF

ILC

Imunocomplexo

Federação Internacional de Diabetes

Linfócitos inatos

IFI Imunofluorescência Indireta

IFN-γ Interferon gama

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

iNK

KDa

Células T invariantes natural killer

Quilodalton

Kg

LIPS

Quilograma

Sistemas de imunopreciptação luciferase

L1 Larva rabditoide de primeiro estádio

L2 Larva rabditoide de segundo estádio

L3 Larva filarioide

L4 Estádio de diferenciação de larvas filarioides

M Molaridade

mg Média geométrica

Mg

MHC

Miligrama

Complexo Principal de Histocompatibilidade

Min Minutos

mL Mililitro

mm Milímetro

NaOH

NIE

Hidróxido de sódio

Antígenos recombinantes

nm Nanômetro

OPD Orto-fenilenodiamina

PBS Tampão fosfato salino

PBS-T PBS acrescido de Tween

PBS-TM PBS-T acrescido de leite desnatado

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PECDM Programa de Educação e Controle de Diabetes

pH

qPCR

RAS

rRNA

Potencial hidrogeniônico

Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa

Rede de atenção à saúde

Ácido ribonucleico ribossomal

Sp Espécie

TCLE

TGF-β

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Fator de transformação de crescimento β

Th1 Células T helper tipo 1

Th2 Células T helper tipo 2

TNF-α

TOTG

Fator de necrose tumoral

Teste de tolerância à glicose

T reg

TSLP

Células T reguladoras

Citocinas linfóides do estroma tímico

Tween Polioxietilensorbitano-monolaurato

UFG Universidade Federal de Goiás

WB Western blotting

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................12

1.1 Epidemiologia da estrongiloidíase.........................................................................12

1.2 Biologia do parasita ..............................................................................................15

1.3 Ciclo de vida do parasita .......................................................................................17

1.4 Fisiopatologia e formas clínicas ............................................................................18

1.4.1 Autoinfecção .....................................................................................................19

1.4.2 Estrongiloidíase aguda e crônica .......................................................................19

1.4.3 Síndrome de hiperinfecção (SH) .......................................................................20

1.4.4 Estrongiloidíase disseminada (ED) ...................................................................20

1.5 Sistema imune e strongyloides stercoralis ...........................................................21

1.6 Fatores de risco e populações de risco ...............................................................25

1.7 Desafios do diagnóstico .......................................................................................27

1.7.1 Diagnóstico parasitológico.................................................................................27

1.7.2 Diagnóstico sorológico.......................................................................................29

1.7.3 Diagnóstico molecular........................................................................................32

1.8 Tratamento ...........................................................................................................33

1.9 Diabetes mellitus tipo 2 .........................................................................................34

1.10 Diabetes mellitus e Estrongiloidíase ..................................................................37

2 OBJETIVOS .........................................................................................................40

2.1 Objetivos gerais ....................................................................................................40

2.2 Objetivos específicos ............................................................................................40

3 METODOLOGIA ...................................................................................................41

3.1 Aspectos éticos ....................................................................................................41

3.2 Caracterização da área do estudo ........................................................................41

3.3 Local e período do estudo ....................................................................................41

3.4 População do estudo ............................................................................................42

3.5 Os critérios de inclusão ........................................................................................42

3.6 Os critérios de exclusão .......................................................................................43

3.7 Perfil socioeconômico dos pacientes ...............................................................43

3.8 Controle metabólico, Hemtócrito e eosinofilia ......................................................43

3.9 Diagnóstico Parasitológico ...................................................................................44

3.9.1 Método de Lutz .................................................................................................44

3.9.2 Método de Rugai ..............................................................................................45

3.9.3 Método de cultura em placa de ágar ................................................................46

3.9.4 Leitura das lâminas ...........................................................................................46

3.10 Diagnóstico Molecular .......................................................................................46

3.10.1.Extração de DNA das Amostras de fezes ...................................................... 46

3.10.2. Iniciadores ......................................................................................................47

3.10.3.Reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................48

3.10.4.Eletroforese em gel de agarose ......................................................................48

3.10.5.Reação de sequenciamento ...........................................................................49

3.11 Retorno à comunidade .......................................................................................49

3.12 Normas de biossegurança .................................................................................49

3.13 Análise estatísticas ............................................................................................50

4 RESULTADOS ......................................................................................................51

4.1. Variáveis socioeconômicas..................................................................................51

4.2 Resultados Parasitológicos...................................................................................52

4.3 Resultados da PCR...............................................................................................58

4.4 Comparação dos métodos diagnósticos...............................................................63

5 DISCUSSÃO .........................................................................................................65

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................73

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................76

8 ANEXOS/ APÊNDICES.........................................................................................94

12

1. INTRODUÇÃO

1.1 Epidemiologia da Estrongiloidíase

A estrongiloidíase ou estrongiloidose é uma enteroparasitose, de caráter

endêmico, globalmente distribuída, e que se estima afetar entre 30 a 100 milhões de

pessoas pelo mundo (BETHONY et al., 2006). Causada principalmente pelo

Strongyloides stercoralis, um nematódeo intestinal que infecta humanos, em áreas

úmidas, tropicais e subtropicais onde coexistem condições sanitárias deficientes (HALL

et al., 1994). S. stercoralis é considerado atualmente o geo-helminto mais negligenciado

entre as doenças tropicais incluídas nessa categoria (OLSEN et al., 2009).

A prevalência global da estrongiloidíase é diversa, bem heterogênea e

subestimada, podendo ainda variar de acordo com o tipo de estudo realizado, e vem

crescendo nos últimos anos, principalmente em algumas áreas endêmicas.

As informações existentes sugerem que S. stercoralis afeta entre 10 a 40% da

população em países tropicais e subtropicais, podendo chegar a 60% naquelas regiões

onde as condições ecológicas e socioeconômica contribuem para a sua proliferação

(SCHAR; TROSTDORF; et al., 2013). Essas regiões estão localizadas principalmente

na África do Sul, Caribe, Sudeste Asiático, regiões tropicais do Brasil, Camboja e

regiões temperadas da Espanha (PUTHIYAKUNNON et al., 2014). Comunidades

aborígenes da Austrália e Sudeste Asiático também são citadas como áreas endêmicas

para a estrongioidíase (JOHNSTON et al., 2005) (Figura 1).

Um dos maiores estudos realizado na África, ao norte de Gana, envolvendo

20.250 pessoas, utilizando microscopia de larvas em cultura, demonstrou uma taxa de

infecção por S. stercoralis de 11.6%, com uma maior prevalência em homens (12,7%)

em relação as mulheres (10,6%) (YELIFARI et al., 2005).

Na Tailândia, estudos conduzidos diretamente em comunidades demonstram

prevalência geral de 23,7% e com aumento ainda maior de infeção na população

hospitalizada (34,7%) (SCHAR; TROSTDORF; et al., 2013).

13

Figura 1 – Distribuição mundial da ocorrência de S. stercoralis, observando endemicidade nos continentes latino-americano, africano e asiático. Adaptado Puthiyakunnon et al. (2014).

Nos países desenvolvidos, foram realizados estudos em populações de

refugiados e imigrantes que revelaram uma prevalência de até 75% para a

estrongiloidíase (SCHAR; TROSTDORF; et al., 2013). No Canadá, autores

demonstraram uma soroprevalência de S. stercoralis em 11,8% dos refugiados

vietnamitas e em 76,6% dos refugiados cambojanos (GYORKOS et al., 1990). Outro

estudo, nos EUA, realizado com crianças Sudanesas abandonadas e com refugiados

do grupo étnico minoritário Somali Bantu, demonstrou taxas de soropositividade para

S. stercoralis de 46% e 23%, respectivamente (KEYSTONE, 2007; POSEY et al.,

2007). Na Suíça em estudo de revisão sobre viajantes e imigrantes do sudeste Asiático,

foi encontrado uma positividade em casos suspeitos de estrongiloidíase de

aproximadamente 38%, com a utilização de exames parasitológicos e sorológicos

(NUESCH et al., 2005).

Na Espanha, foi descrito presença de infecção em 12,4% das 250 amostras de

fezes colhidas aleatoriamente de trabalhadores agrícolas da costa mediterrânea.

(ROMAN-SANCHEZ et al., 2003).

Nos EUA, a estrongiloidíase aparece em focos endêmicos nas áreas rurais dos

estados do sudeste, em regiões Apalacianas e em Porto Rico. Estudos epidemiológicos

realizados no Kentucky e Tennessee indicaram que as taxas de prevalência podem

14

chegar a 3% em crianças e até 6% em pacientes hospitalizados (CROKER et al., 2010).

SCHAR et al (2013) relataram os seguintes dados sobre as taxas de prevalência de

estrongiloidíase nos EUA: 40% entre os imigrantes, 49,2% nos indivíduos

hospitalizados e 2,7% na comunidade.

Em relação à América latina temos um panorama de altas taxas de positividade

para o parasito. Na região da Amazônia Peruana, estudos apontam uma incidência de

8,7% a 19,5% para S. stercoralis em exames parasitológicos (EGIDO; DE DIEGO;

PENIN, 2001; YORI et al., 2006). Na Argentina são descritos soro-positividades entre

24% a 28,6% em comunidades aborígenes nas províncias de Salta e Misiones

(KROLEWIECKI et al., 2010), porém, foram descritos menores taxas nas áreas urbanas

(0,2 a 9,6%) (BORDA et al., 1996; GAMBOA et al., 2009). No Equador existe uma

grande varibilidade na proporção de pessoas infectadas, e os dados descrevem entre

0,7% a 24% de prevalência da estrongiloidíase (COOPER; GUEVARA; GUDERIAN,

1993; JACOBSEN et al., 2007).

No Brasil estão concentrados 12.1% (43) dos estudos realizados em todo o

mundo. Os dados também demonstram uma grande heterogeneidade de prevalência

do parasito (SCHAR; TROSTDORF; et al., 2013). Entre 1990 e 2009, foi descrito a

ocorrência de infecção por S. stercoralis aproximadamente de 5,5%, caracterizando o

país como uma área hiperendêmica (PAULA; COSTA-CRUZ, 2011). A prevalência

entre cincos regiões brasileiras variou entre 3,9% a 7,9%, não sendo encontrada

diferença entre as positividade para a parasitose nas áreas rurais e urbanas. A região

norte apresentou positividade de 5.3%, a região nordeste de 7,9%, o Sudeste de 3,9%,

o centro-oeste de 6,6% e o Sul de 4,0%. São descritas maiores prevalências da

estrongiloidíase na região nordeste, e segundo os autores, podem chegam a 14%

(KOBAYASHI et al., 1996).

Com base em revisão de dados de inquéritos populacionais, SCHAR e

TROSTDORF et al., (2013) afirmam existir uma prevalência de 13% para S. stercoralis

no Brasil. Já para os inquéritos realizados em população hospitalar, os autores

apresentaram uma prevalência de 17% de infecção.

Apesar do avanço do conhecimento científico e tecnológico, a estrongiloidiase

continua a ser uma doença de importância para a saúde pública no Brasil, e os aspectos

epidemiológicos dessa patologia não são bem conhecidos. A prevalência do

S.stercoralis continua subestimada principalmente pela baixa sensibilidade dos

métodos diagnósticos utilizados (PAULA; COSTA-CRUZ, 2011).

15

1.2 Biologia do parasita

São descritas pelos menos 52 espécies do nematódeo do gênero

Strongyloides, porém somente duas delas são consideradas infectantes para os

humanos: S. stercoralis (BAVAY, 1876) e S. fuelleborni (VON LINSTOW, 1905). O S.

stercoralis inicialmente foi descoberto pelo médico Louis A. Normand, e descrito por

Arthur R.J.Bavay, em 1876, nas fezes de soldados franceses que voltaram do Vietnã.

Primeiramente a forma larvar do helminto foi denominada Anguillula stercoralis. Em

1902, Stiles & Hassal a denominaram de S. stercoralis, que significa arredondado

(GROVE, 1996)

No Brasil, Ribeiro da Luz, em 1880, salientou a importância deste parasito

como agente etiológico da estrongiloidíase ou anguilulose. Posteriormente, o parasito

foi também descrito por Lutz e Moraes (HUGGINS, 1971).

O nematódeo S. stercoralis apresenta diferentes formas evolutivas durante o

seu ciclo de vida, como pode ser visto na figura 2, sendo elas a fêmea partenogenética,

fêmea e macho de vida livre, larva rabditoide, larva filarióide e ovo (GROVE, 1996;

OLSEN et al., 2009).

Figura 2- Representação esquemática das formas evolutivas S. stercoralis1. Adaptado de COSTA-CRUZ, J. M. Strongyloides stercoralis. In: NEVES (2011).

1 an (ânus); bo (boca); ca (cauda entalhada); cl (cloaca); ep (espículo); es (esôfago); in (intestino); ov (ovário); pg(primórdio genital); te (testículo); ut (útero divergente); vb (vestíbulo bucal curto); vu (vulva).

16

A fêmea parasita partenogenética é filiforme, alongada e sua porção posterior

é afinada. Possui entorno de 2,5mm de comprimento, apresenta cutícula fina e

transparente, e vive mergulhada nas criptas de Lieberkuhn do duodeno e parte superior

do jejuno, onde faz a postura. O aparelho digestivo é simples com a boca trilabiada,

com esôfago longo (filarióide), intestino simples e ânus na extremidade posterior. A

fêmea é ovovivípara e elimina na mucosa intestinal ovos já larvados, com a larva

rabditóide, que normalmente é eliminada no interior do hospedeiro, e que corresponde

a forma evolutiva de importância diagnóstica (GROVE, 1989; COSTA-CRUZ, 2011).

A fêmea de vida livre é fusiforme e mede aproximadamente 1,2mm de

comprimento. Também é transparente com cutícula fina e estriada. Possui aparelho

digestivo fino e boca com três lábios: o esôfago que é curto (rabditóide) com uma parte

posterior globulosa (bulbo), o intestino que é simples e retilíneo, e se abre para o

exterior por um ânus (COSTA-CRUZ, 2011).

Os ovos são elípticos, de parede fina e transparente, muito parecidos com os

ovos de ancilostomídeos. Os ovos provenientes da fêmea parasita medem cerca de

0,05mmx0,03mm, já os da fêmea de vida livre são maiores (0,07mm). Raramente

podem ser evidenciados nas fezes, sendo mais frequentemente encontrados em casos

de diarreia (COSTA-CRUZ, 2011).

As larvas rabditoides (L1 e L2) possuem esôfago do tipo rabditóide, e as

originárias das fêmeas parasitas são indistinguíveis das larvas originárias de fêmeas

de vida livre. Possuem cutícula fina e hialina e medem cerca de 0,2 mm. Apresentam

vestíbulo bucal curto, diferente das larvas de ancilostomídeos, cujo vestíbulo bucal é

longo. Possuem primórdio genital nítido, característica que também ajuda na

diferenciação com as larvas de ancilostomídeo. São eliminadas nas fezes, mas podem

ser encontradas em outros fluídos corpóreos, como biles, escarro, urina, líquidos

pleurais e encefalorraquidiano, característica da forma clínica disseminada da doença

(COSTA-CRUZ, 2011).

As larvas filarioides possuem esôfago do tipo filarióide que é longo, e

corresponde à metade de seu tamanho. Medem de 0,35 a 0,50mm de comprimento.

Possuem vestíbulo bucal curto e intestino terminado em ânus. A porção posterior afina-

se gradualmente e termina em duas pontas, conhecida como cauda entalhada. Essa é

a forma infectante do parasito (L3), que penetra na pele ou mucosa, e também pode

ser encontrada no meio ambiente. Quando evoluem no interior do hospedeiro levam

aos casos de autoinfecção interna (COSTA-CRUZ, 2011).

17

Os machos possuem aspecto fusiforme, com extremidade anterior arredonda

e posterior recurvada ventralmente com dois espículos copulatórios. Possui boca com

três lábios, esôfago do tipo rabditóide seguido de intestino que termina em cloaca

(COSTA-CRUZ, 2011).

1.3 Ciclo de vida do parasita e formas de transmissão

A infecção humana pelo S. stercoralis, ocorre quando há penetração na pele

de larvas filarióides (L3), geralmente por contato direto com o solo contaminado por

fezes humanas. Além da invasão da pele, a estrogiloidíase também pode ser adquirida

ocasionalmente pelas mucosas, através da ingestão de água ou de alimentos

contaminados (COSTA-CRUZ, 2011). Esse parasito apresenta uma fase de

desenvolvimento complexo, com dois ciclos distintos: O direto, partenogenético e o

indireto, sexuado ou de vida livre (STREIT, 2008).

No ciclo direto (Figura 3), as larvas filarióides (L3) presentes no solo infectam

o homem através da penetração pela pele, entram na circulação e são transportadas

para os pulmões. Penetram no espaço alveolar, se transformam em larvas L4, que

ascendem pela árvore brônquica. Em seguida, são deglutidas e atingem o intestino

delgado. Nesse local, as fêmeas partenogenéticas (3n) infiltram na mucosa intestinal,

depositam os ovos embrionados, que eclodem e liberam as larvas rabditoides (2n) na

luz intestinal sendo então eliminadas nas fezes. Elas também podem se transformar na

luz intestinal em larvas filarióides maduras, sendo capazes de infectar a própria mucosa

ou a pele da região perianal (autoinfecção externa), reiniciando, assim, o ciclo do

parasito (STREIT, 2008; COSTA-CRUZ, 2011).

18

Figura 3- Representação esquemática do ciclo biológico do S. stercoralis. Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/strongyloides/biology.html (2016).

As larvas rabditóides eliminadas pelas fezes, sendo que as larvas diploides

(2n) dão origem a fêmeas de vida livre, e as larvas haploides (1n) dão origem a machos

de vida livre. Os ovos originados do acasalamento das formas adultas de vida livre são

triploides, e dão origem às larvas rabditoides. Essas evoluem para larvas filarióides (L3)

infectantes, permanecendo no solo entorno de quatro semanas (ciclo indireto). Os

ciclos direto e indireto se completam quando ocorre a penetração ativa das larvas L3

na pele e ou mucosa oral do hospedeiro (GROVE, 1989; COSTA-CRUZ, 2011).

1.4 Fisiopatologia e formas clínicas

1.4.1 Autoinfecção

A transformação prematura de larvas rabdtóides em larvas filarióides ainda na

luz intestinal do hospedeiro pode levar a um mecanismo de cronificação da doença por

meses a vários anos. As larvas infectantes filarióides entram novamente na circulação

através da penetração da mucosa do cólon e do intestino delgado e causam

19

autoinfecção interna. Já a penetração da larva infectante pela pele da região perianal

causa a autoinfecção externa. Essa segunda via, na maioria das vezes, leva ao

desenvolvimento de “larva currens” quando a larva atinge o pulmão e repete o ciclo, e

é principalmente encontrada em áreas endêmicas (GROVE, 1989).

No hospedeiro saudável, a autoinfecção é mantida sob controle pelo sistema

imune, porém, em pessoas com deficiência da resposta imune mediada por células,

ocorre aumento do risco de desenvolvimento das duas formas graves de infeção pelo

S. stercoralis: a síndrome de hiperinfecção (HIS) e a forma disseminada (DS)

(VADLAMUDI; CHI; KRISHNASWAMY, 2006; CROKER et al., 2010).

1.4.2 Estrongiloidíase aguda e crônica

Na forma aguda, a sintomatologia está associada com a migração larvar para o

intestino delgado. As larvas secretam proteases que auxiliam na penetração nos

tecidos. Na sua porta de entrada, geralmente provocam um rash petequial, com prurido

intenso, edema e congestão. A migração para a circulação pulmonar pode causar

hemorragia nos capilares pulmonares e ao passar para os espaços alveolares causam

uma resposta inflamatória intensa associada à infiltração eosinofílica levando à

pneumonite (BERK et al., 1987).

Os pacientes infectados apresentam quadro clínico inicial de irritação na pele,

geralmente no local de entrada da larva, seguido de irritação traqueal, tosse seca e

sintomas gastrointestinais (GI), como diarreia, dor abdominal, anorexia. Os sintomas

respiratórios são mais precoces que os sintomas gastrointestinais. O segundo

geralmente ocorre duas semanas após a contaminação, e a detecção de larvas nas

fezes pode ocorrer após 3 a 4 semanas (FREEDMAN, 1991).

A estrongiloidíase crônica normalmente causa infecção assintomática em

pacientes imunocompetentes. Aqueles que apresentam sintomatologia possuem

queixas gastrointestinais crônicas, como diarreia, constipação e vômitos, além de

manifestações cutâneas (tipo larva currens), como irritação, urticária e rash petequial.

Mais de 75% dos portadores crônicos apresentam eosinofilia em sangue periférico e

aumento de IgE (>250IU/ml) (BAATEN et al., 2011).

Outras manifestações não comuns, mas já descritas na literatura são: artrite

(RICHTER et al., 2006), síndrome nefrótica (COPELOVITCH et al., 2010), síndrome de

20

má absorção (ATUL et al., 2005), obstrução duodenal (HINDY et al., 2011), hepatite

focal (GULBAS et al., 2004) e asma recorrente. (KUZUCU, 2006).

1.4.3 Síndrome de hiperinfecção (SH)

Essa condição representa uma síndrome de autoinfecção acelerada, resultante

de alguma alteração do sistema imunológico (estados de imunossupressão), sendo

atribuído à presença de sinais e sintomas referentes à migração das larvas (HAUBER

et al., 2005). Ocorre um aumento do número de larvas em locais de migração não

usuais, como regiões extra intestinal, sendo possível encontrar larvas no escarro e

fezes ao mesmo tempo. As manifestações clínicas decorrem da localização da origem

da autoinfecção, e incluem dor abdominal, dispepsia, diarreia, constipação, íleo

paralitico, obstrução, enterite e sangramento digestivo. Além disso, podem apresentar

piora da função respiratória, pneumonite hemorrágica e até mesmo insuficiência

respiratória (CONCHA; HARRINGTON; ROGERS, 2005).

Os fatores de risco associados à SH são corticoterapia, transplante de células

tronco, alcoolismo, Diabetes, infecção pelo HIV, infecção pelo HTLV-1, e transplantes

de órgãos (SAFDAR et al., 2004; HAUBER et al., 2005; SHORMAN; AL-TAWFIQ,

2009).

A mortalidade da síndrome de hiperinfecção pode chegar a 15%, e está

correlacionada diretamente com a falta de familiaridade das manifestações clínicas por

parte dos profissionais da saúde. Por isso é importante que se faça o rastreamento da

infeção por S.stercoralis em situações de imunossupressão (BOULWARE et al., 2007).

1.4.4 Estrongiloidíase disseminada (ED)

A estrongiloidíase disseminada também é uma forma clínica que decorre da

migração de larvas a partir do pulmão e do trato gastrointestinal para vários locais do

organismo, tais como fígado, rins, órgãos endócrinos e sistema nervos central (HONG

et al., 2004). A migração de um grande número de larvas filarióides passa a ser uma

porta de entrada para a translocação de bactérias entéricas gram-negativas, resultando

em quadros graves de infeção secundária, como meningite, derrame pericárdico e

pleural, abdômen agudo e perfuração intestinal (BROWN; CARTLEDGE; MILLER,

2006).

21

Esses achados clínicos são relativamente comuns em populações de risco, e são

frequentemente diagnosticados como septicemia por germes gram-negativos ou

síndrome do desconforto respiratório agudo (GALIMBERTI et al., 2009). A ED

apresenta alta mortalidade, sendo descrito entorno de 87%, chegando a 100% se não

tratada adequadamente (VADLAMUDI et al., 2006; GHOSH; GHOSH, 2007).

1.5 Sistema imune e Strongyloides stercoralis

Apesar da infeção por S. stercoralis ser altamente prevalente e ter caráter de

cronicidade, os mecanismos imunoprotetores envolvidos na resposta contra infecção

por esse parasita ainda não estão bem esclarecidos (MARCOS et al., 2011). Sabe-se

que a expulsão de parasitas de intestino hospedeiro é a forma mais efetiva da

imunidade contra parasitoses intestinais (MAIZELS; YAZDANBAKHSH, 2003). Estudos

em animais têm sugerido um papel importante tanto da imunidade inata quando da

adaptativa no controle da estrongiloidíase (MONTES et al., 2009).

Os mecanismos imunológicos efetores específicos envolvidos no controle de

infecção por S. stercoralis e na proteção ao hospedeiro são do tipo Th2 (Figura 4),

através da síntese de interleucinas (IL - 4, IL - 5, IL - 9 e IL- 13), e a consequente

produção de imunoglobulina IgE, eosinofilia, estimulação de mastócitos e de

macrófagos alternativamente ativados M2 (FINKELMAN et al., 1997; ANTHONY, et al.,

2007; EL-MALKY et al., 2013)

De acordo com BULEK, KATARZYNA et al, (2010), o dano epitelial provocado

pela passagem das larvas, leva a ativação de alarminas, como interleucina (IL) -25 e

IL-33 e citocinas linfóides do estroma tímico (TSLP), que juntamente com produtos

excretores/secretores específicos de helmintos (ES) ativam resposta Th2 e as células

T reguladoras (Treg) através de células dentriticas (CD) linfócitos inatos (ILC) e células

T invariantes natural killer (iNK).

22

Figura 4: Resposta imune ao S. stercoralis. Adaptado de Jovanovic, K, M Siebeck, and R Gropp (2017).

A degranulação de mastócitos e o ataque direto de eosinófilos contra o parasito

são os dois mecanismos de resposta imune do tipo Th2 recrutados para matar as larvas

infectantes. Os mastócitos são ativados por IL-4 e IL-13 e sua degranulação depende

da presença de IgE contra antígenos específicos (ABE et al., 1993). No intestino ocorre

ativação de mastócitos pela IL-9 e também estimulação da produção de eosinófilos

(KHAN et al., 1993).

Os eosinófilos representam o maior componente do sistema imune envolvido na

reposta a helmintos. São capazes de migrar para qualquer local onde existe o parasita

e liberam toxinas a fim de destruí-lo (MIR et al., 2006). A IL-5 é a citocina vital para a

ativação, proliferação e diferenciação dos eosinófilos envolvidos nessa resposta

conforme DE’BROSKI, R. HERBERT et al. (2000). Devido ao seu grande tamanho, os

helmintos não podem ser ingeridos pelos fagócitos, então são recobertos por anticorpos

Helminto

Mecanismos Regulatórios

Resposta Imune à helmintos

CD

Célula Th2

IL-4 IL-13

Célula B IL-5

IgE

Eosinófilos

Mastócitos IgE

Morte da Larva Sobrevivência da Larva

Anticorpos inibitórios

IL-10

Célula B

IL-10 TGF-β

Treg

M2 IL-10 TGF-β

23

da classe IgE onde os eosinófilos irão se ligar de maneira específica como descrito por

EVERING e WEISS (2006). Os antígenos de S. stercoralis induzem a ativação

molecular da classe MHC II pelos eosinófilos, e de moléculas co-estimulatórias de

células T. Os eosinófilos funcionam então como APCs para indução de resposta Th2,

demonstrando assim o papel necessário desses na interface entre as resposta imune

inata e adaptativa (PADIGEL et al., 2006). Em geral a eosinofilia é uma resposta típica

Th2, e em pacientes imunocromprometidos sua ausência é um sinal de mau

prognóstico (MACDONALD; ARAUJO; PEARCE, 2002).

Os linfócitos B são essenciais para o desenvolvimento de resistência por parte

do hospedeiro à Larva de S. stercoralis, claramente demonstrado em estudos com

animais Knockout para populações células B-1, que perdiam a habilidade de matar o

parasita após 24h de infecção, configurando a importância dessas células na resposta

imune secundária (HERBERT et al., 2002). A produção de IL-4 induz ativação e

diferenciação de células B, que leva a produção de anticorpos das classes IgE e IgG4.

Na fase inicial da infecção ocorre aumento da produção de imunoglobulinas IgG, IgA e

IgE. As IgG1 e IgG4 específicas estão mais elevadas em hospedeiros

imunocompetentes, mas apenas a IgG4 está presente nos casos crônicos da infecção

(GENTA; LILLIBRIDGE, 1989; ATKINS et al., 1999; MARCOS, et al., 2001).

Anticorpos IgM e IgG são protetores contra as larvas de S. stercoralis. Esses

anticorpos reconhecem diferentes antígenos e utilizam mecanismos de controle que

sinergicamente são efetivos para matar as larvas de acordo com LIGAS, et al., (2003).

É descrito que os pacientes com a forma grave da parasitose apresentam diminuição

significativa de IgM e IgG quando comparados com aqueles portadores da forma

assintomática ou leve (LIGAS et al., 2003).

A imunoglobulina IgA também está presente na resposta imune contra larvas

filarióides, e o seu aumento se correlaciona com a diminuição da produção de larvas

(GENTA; FREI; LINKE, 1987; RIBEIRO et al., 2010). A resposta mediada por IgA

parece reduzir a fecundidade e a viabilidade dos ovos de S. stercoralis, e

consequentemente reduz a geração de larvas (ATKINS et al., 1999). Como é a classe

de imunoglobulina mais abundante na superfície de mucosas e em secreções como a

saliva, ela fornece proteção local contra o parasita (MOTA-FERREIRA et al., 2009;

BOSQUI et al., 2015).

Além da resposta Th2, a infecção por helmintos também estimula as células T

reguladoras (Treg) (TAYLOR; VAN DER WERF; MAIZELS, 2012). As células Treg

24

reduzem a injúria ao hospedeiro, através da inibição ou supressão de citocinas, e por

mecanismos de contato célula-a-célula (MONTES et al., 2009). Elas podem suprimir a

resposta Th2, por meio da inibição da ativação de eosinófilos dependente de IL-5

(MAIZELS; YAZDANBAKHSH, 2003). As respostas Th2 e Treg são compostas por

mecanismos que fazem a interface entre resposta imunológica protetora, com a

expulsão do parasito, e mecanismos que promovem a tolerância do sistema

imunológico, a fim de reduzir o dano no hospedeiro causado pela migração larvar

(CHEN et al., 2012).

A IL-10 pode ser produzida por células Th1 e vários tipos de células Treg durante

a infecção por helmintos. Juntamente com a IL-3 e fator de transformação de

crescimento β (TGF-β) modula negativamente a resposta Th1 (SCHOPF, et al., 2002;

CHEN et al., 2012).

Existe um fino balanço entre as respostas Th2, Treg e Th1 na resposta do

hospedeiro contra a infeção pelo S. stercoralis. Quando a resposta imune tende a ser

do tipo Th1, ocorre produção de interferon (IFN-γ), ativação de macrófagos, de células

citotóxicas CD8+ e geração de IgG2a (SEGURA et al., 2007). Também ocorre aumento

de IL-12, que leva à diminuição dos níveis de eosinófilos e de sua atividade, e a

resposta protetora é comprometida (ROTMAN et al., 1997; SEGURA et al., 2007). A

diminuição de IL-4 e IL-13 que ocorre, favorece a transformações de larvas rabditoides

em filarióides e a autoinfecção (NEVA, 1986; REYNOLDS; MAIZELS, 2012).

Para a maioria dos indivíduos há um equilíbrio entre a tolerância e a resistência

à presença dos helmintos, o que permite que um pequeno número de parasitas

sobreviva no hospedeiro sem causar patologia (MEDZHITOV; SCHNEIDER; SOARES,

2012). Porém, quando ocorrem rupturas da resposta celular do tipo Th2, da imunidade

da mucosa e da imunidade humoral, poderá ocorrer transformação de larvas

rabditoides em filarioides, seguido pela replicação e migração do intestino para o

pulmão e outros órgãos, levando ao desenvolvimento da síndrome de Hiperinfeção

(COOK, 1998; SIDDIQUI; BERK, 2001).

25

1.6 Fatores de risco e populações de risco para desenvolvimento da síndrome de hiperinfecção

Os maiores fatores de risco para a infeção de S. stercoralis são: morar ou visitar

áreas endêmicas; os solos contaminados e a ingestão de água contaminada.

Agricultores e pessoas que trabalham com a terra também estão expostos (HERRERA

et al., 2006).

A maioria dos casos de hiperinfecção é percebida após o início de terapia

imunossupressiva (corticoterapia, anti-TNF-α, etc.), e também em pacientes portadores

de HTLV-1, nos alcóolatras, nos portadores de doenças malignas, nos diabéticos, nos

transplantados e nos idosos (MONTES et al., 2009).

O uso de corticosteroides em doses supressivas constitui o maior fator de risco

para a síndrome de hiperinfecção, e está associado a um aumento de duas a três vezes

de chances de desenvolvê-la. Os corticosteroides reduzem os eosinófilos circulantes,

inibem sua proliferação e induzem apoptose. Também são capazes de induzir a morte

de linfócitos imaturos; de prejudicar a resposta de mastócitos presentes na mucosa

jejunal e aumentar a liberação de larvas infectantes (NEVA, 1986; ROXBY; GOTTLIEB;

LIMAYE, 2009). Também podem aumentar a presença de substâncias similares a

ecdisteróides, que atuam como sinalizadores para o desenvolvimento de ovos e larvar

rabditoides, levando a transformação em larvas filarioides e consequentemente à

disseminação (SIDDIQUI; BERK, 2001).

A associação de malignidade e estrongloidiase é bem estabelecida na literatura,

e o linfoma é a patologia mais encontrada (WILKINSON; LEEN, 1993; MARCOS et al.,

2011). Em um estudo retrospectivo de pacientes portadores de doenças malignas

hematológicas, foi descrito a presença de S. stercoralis em 21% dos casos (NUCCI et

al., 1995). Em outro estudo, também retrospectivo, os autores demonstraram a

presença de S. stercoralis em 1 a cada 10.000 casos novos de neoplasia entre os anos

de 1971 a 2003 (SAFDAR et al., 2004).

Pacientes em tratamento dialítico são considerados uma população em situação

de comprometimento imunológico e são mais susceptíveis a infeção oportunistas,

incluindo parasitárias. Estudo realizado com um grupo de pacientes em hemodiálise

encontrou 94% positividade para parasitas intestinais e, uma prevalência 24% de S.

stercoralis (ELNADI et al. 2004).

26

Com relação aos transplantes de órgãos e o desenvolvimento de

estrongiloidíase, a associação mais frequente encontrada é com o transplante renal,

principalmente se o transplante for de cadáveres (SAID et al., 2007). As diretrizes atuais

recomendam a triagem sorológica (ou exame de fezes em casos selecionados) para

detectar estrongiloidíase intestinal crônica em pacientes antes do transplante de órgãos

(ROXBY et al., 2009).

No Brasil a prevalência descrita de S. stercoralis em pacientes com infecção pelo

HIV é de 4,5% a 5,5% (CIMERMAN; CIMERMAN; LEWI, 1999; CYSIQUE; MARUFF;

BREW, 2004.). Estudo de caso-controle realizado na Tailândia demonstrou que o vírus

da imunodeficiência humana foi um fator de risco independente para a infecção pelo S.

stercoralis (JONGWUTIWES et al., 2014). HOCHBERG et al., 2011 encontrou uma

soroprevalência de 26% em pessoas portadoras do HIV nascidas fora dos EUA. Na

Nigéria, autores descreveram uma positividade de 18,9% (BABATUNDE et al., 2010).

Também é descrito que a melhora do sistema imunológico após o início de terapia

antirretroviral pode levar ao desenvolvimento da síndrome de hiperinfecção (BROWN

et al., 2006), porém a HS é mais frequente em pacientes coinfectados pelo HTLV-1(

N'DRI et al., 2008; JANSSEN et al., 2013).

Existem evidências epidemiológicas de que a infeção pelo HTLV-1 está

associada à presença de todas as formas clínicas de estrongiloidiase, e também com

o desenvolvimento de falência terapêutica ( NEVA, 1986; CARVALHO; DA FONSECA

PORTO, 2004; HIRATA et al., 2006; MONTES et al., 2009; PAYS, 2011). Pacientes

portadores de HTLV-1 e S. stercoralis apresentam uma diminuição da resposta imune

celular Th2 e aumento da resposta imune celular Th1(MONTES et al., 2009). Ocorre

aumento de IFN-γ, que leva a diminuição de IL-5 e IL-4, e diminuição de IgE, resultando

em prejuízo do recrutamento de eosinófilos e diminuição da atividade antiparasitária

desses ( NEVA, 1986; CARVALHO; DA FONSECA PORTO, 2004).

Pouco se sabe sobre a frequência de parasitas intestinais em idosos. NAVES;

COSTA-CRUZ, (2013) afirmam que encontraram uma frequência de 7,5% (15/200) de

enteroparsitores em idosos, sendo que 5% (10/200) desse total eram positivos para S.

stercoralis, não havendo diferença de taxa de infeção entre pacientes

institucionalizados ou não.

Em pacientes alcoólatras a frequência encontrada também foi alta (33.3% versus

5% em grupo controle), principalmente naqueles que já apresentam cirrose hepática

(DE OLIVEIRA et al., 2002). No estudo de SILVA et al. (2016), foi encontrada uma

27

frequência de S.stercoralis de 23,5% em pacientes alcoólatras, e em pacientes não

alcoólatras esta foi de 5,4%. Estudo mais antigo, (AVENDANO et al., 1999) encontrou

prevalência de 5,7% em pacientes portadores dessa condição clínica.

Estudo brasileiro, realizado na cidade do Rio de Janeiro, descreveu uma

associação significante (OR: 4.96) entre o S. stercoralis intestinal e a artrite reumatoide,

e a positividade foi atribuída ao uso de terapia imunossupressiva com esteroides.

Segundo os autores, como a coritcoterapia potencializa a reprodução do parasita no

intestino, levando ao aumento da sua excreção, facilitando a detecção pelos métodos

de diagnóstico (CABRAL et al., 2015)

GERI et al. (2015) descrevem que as principais causas de Síndrome de

hiperinfeção (SH) foram os estados de imunossupressão, sendo a frequência

encontrada com o uso de corticoterapia de 83,5%; com doenças autoimunes de 24,8%;

com doenças hematológicas malignas de 20,3% e com infeção pelo HIV de 10,7%.

A relação entre certas condições clínicas e estrongiloidíase ainda se mantém

controversa. Um melhor entendimento dessa relação poderá beneficiar pacientes que

apresentam estado de imunossupressão ou que irão ser submetidos a tratamento

imunossupressor, principalmente aqueles que habitam regiões endêmicas do

S.stercoralis.

1.7 Desafios do diagnóstico

1.7.1 Diagnóstico parasitológico

Várias técnicas laboratoriais têm sido desenvolvidas para o diagnóstico de S.

stercoralis, como testes em fezes, métodos imunológicos e técnicas moleculares, e

suas acurácias são objetos de estudos (ARAKAKI et al., 1990; BON et al., 2010;

BECKER et al., 2015; ).

Na estrongiloidíase sem complicações, a descoberta de larvas rabditoides nas

fezes é diagnóstica (SIDDIQUI; BERK, 2001). Entre os exames parasitológicos

tradicionais que permitem a identificação de formas de S. stercoralis podemos citar: o

exame direto de fezes, o método de sedimentação espontânea (HOFFMANN et al.,

1934), o de centrifugação pela técnica de Ritchie (RITCHIE, 1948), o método de

Baermann-Moraes (BAERMANN, 1917; MORAES, 1948) e suas variações, o de cultura

28

em placa ágar (ARAKAKI et al., 1988) e o método de cultura em papel filtro de Harada-

Mori (HARADA e MORI, 1955).

Nas infecções sem complicações onde poucas larvas são eliminadas, o exame de

fezes simples detecta apenas 1/3 dos casos (UPARANUKRAW; PHONGSRI;

MORAKOTE, 1999). GROOVE (1984) demonstrou que a coleta de três amostras de

fezes em dias alternados pode aumentar a sensibilidade da microscopia direta de 68%

para 84%. NIELSEN; MOJON, (1987) conseguiram atingir uma taxa elevada de

detecção com a coleta de sete amostras de fezes em dias consecutivos. Porém, essa

metodologia aumenta o tempo para realização do exame e é inconveniente para o

paciente.

A técnica de concentração de Ritchie melhora a sensibilidade diagnóstica em

comparação com o método de exame direto, e suas variações aumentam em até duas

vezes a sensibilidade diagnóstica (ANAMNART et al., 2010). Esse método tem base a

realização de uma centrífugo-sedimentação com o uso do éter etílico (C4H10O) e

formaldeído (CH2O), dois reagentes tóxicos tanto para a saúde ambiental quanto para

a ocupacional (RITCHIE, 1948).

O estudo de ARAKAKI et al., (1990) demonstrou que o método de cultura em placa

de ágar para o diagnóstico de S. stercoralis aumenta em duas a quatro vezes a

eficiência de diagnóstico quando comparado com a técnica de Ritchie. SATO et al.,

(1995), demonstraram uma sensibilidade de 96% para o método de cultura em placa

de ágar. Comparando essa técnica com a técnica de Baermann-Moraes, estudos

relataram superioridade de detecção com a técnica de cultura em placa de ágar

(SALAZAR; GUTIERREZ; BERK, 1995; INES EDE et al., 2011). Porém, essa técnica

gasta muito tempo para realização e é extremamente trabalhosa.

O método de Baermann-Moraes é baseado na capacidade de ter um ciclo de

vida livre que S. stercoralis apresenta. Esse método é mais sensível que o exame direto

de fezes, porém não é realizado na prática diária dos laboratórios apesar de ser barato

e simples (DE KAMINSKY, 1993). Em comparação aos métodos tradicionais, a técnica

de Baermann aumenta a capacidade de diagnóstico em três a quatro vezes (ASSEFA;

WOLDEMICHAEL; SEYOUM, 1991). Já STEINMANN et al., (2007) compararam as

técnicas de concentração de Kato-Katz com os métodos de cultura em placa de ágar e

o método de Baermann na detecção de S. stercoralis. Os autores encontraram melhor

sensibilidade com o método de Baermann, em que todos os casos de S. stercoralis

foram detectados por esse método.

29

As técnicas parasitológicas apresentam baixa sensibilidade diagnóstica

principalmente nos casos de infecção crônica. SATO et al. (1995) demonstraram

sensibilidade de apenas 60% com a técnica de cultura em placa ágar nesses casos.

Como na infeção crônica a eliminação das larvas é baixa, faz-se necessário o uso de

pelo menos duas técnicas combinadas para se obter uma melhora de acurácia

diagnóstica (WILLCOX; COURA, 1991; MOUSTAFA, 1997; HIRATA et al., 2007).

1.7.2 Diagnóstico sorológico

Vários métodos de imunodiagnósticos têm sido testados nos últimos anos a fim

de aumentar a capacidade diagnóstica da infeção por S. stercoralis. Entre elas

podemos citar a técnica de imunofluorescência indireta (IFI), a técnica de ELISA, de

aglutinação de partículas em gelatina (GPAT), de Western-blot, de pesquisa de

coproantígeno e de imunocomplexo (NEVA, 1986; SATO et al., 1995; SCHAFFEL et

al., 2001; SILVA, L. P. et al., 2003; SYKES; MCCARTHY, 2011).

Na literatura, a sensibilidade das técnicas de imunodiagnóstico é descrita entre

66,7 e 96,7 %, enquanto que a especificidade entre 96,7 e 100% (SCHAFFEL et al.,

2001; KOOSHA; FESHARAKI; ROKNI, 2004). Essas diferenças são, provavelmente,

devido às diferentes populações estudadas e em diferentes estágios da doença

(JOHNSTON et al., 2005).

O teste de microscopia de imunofluorescência indireta (IFI) apresenta maior

sensibilidade se comparado aos testes parasitológicos na detecção de S. stercoralis

(SATO et al., 1991). Ensaio de imunofluorescência indireta desenvolvido utilizando

larvas inteiras de S. stercoralis, apresentou elevado nível de precisão de diagnóstica

para títulos de anticorpo ≥1:20, alcançando uma sensibilidade de 97% e especificidade

de 98 % (BOSCOLO et al., 2007). Muitos pesquisadores vêm utilizando antígenos

heterólogos de outras espécies de Strongyloides (por exemplo, Strongyloides ratti e

Strongyloides venezuelensis), com resultados promissores. Esses antígenos

heterólogos além de apresentarem uma fonte segura de antígenos, não apresentam

riscos de contaminação para seus manipuladores (COSTA-CRUZ et al., 2003; SILVA,

L. P. et al., 2003; GONZAGA et al., 2011).

Pacientes com estrongiloidiase desenvolvem anticorpos específicos do tipo IgG,

IgA, IgM e IgE, mas os métodos para detectar e diagnosticar a doença utilizam

principalmente a IgG (GROVE, 1989). O teste ELISA (Enzyme Linked Immunono

30

Sorbent Assay) para a detecção e IgG sérica contra o extrato bruto de larvas filariformes

de S. stercoralis está disponível em vários centros, e tem sido bastante utilizado (LINDO

et al., 1994). É demonstrada uma sensibilidade para esse método de 88%, e

especificidade de 99%.

Em comparação com IFI, o ELISA apresentou melhor sensibilidade (93,5%)

conforme relato de KOOSHA et al. (2004). Vale lembrar que os testes que utilizam

anticorpos contra S. stercolaris podem apresentar uma reatividade cruzada com outras

infecções incluindo ascaridíase, hidatidose e toxocaríase. (SATO et al., 1990). A

reatividade cruzada com outros nematódeos, é o maior problema da utilização dessas

técnicas, além do fato que os antígenos não serem bem definidos e os protocolos serem

bem variados (JOHNSTON et al., 2005).

Dois kits comerciais de ELISA também estão disponíveis no momento, o Bordier-

ELISA (Bordier Affinity Products) e IVD–ELISA (S-stercoralis serology Microwell ELISA

Kit, IVD Research Carlsbad, CA), e todos estes ensaios demonstraram elevada

sensibilidade variando entre 73- 100 % (BON et al., 2010).

SATO et al. (1991) desenvolveram teste de aglutinação indireta de partículas em

gelatina (GPAT), de fácil realização e em um curto espaço de tempo, e que não

necessita de equipamento especializado. Quando comparado com o teste de ELISA, o

GPAT apresentou uma sensibilidade de 81%, e uma especificidade de 74%

(SITHITHAWORN et al., 2005).

Antígenos recombinantes de S. stercoralis (NIE) podem ser utilizados para o

imunodiagnóstico e podem apresentar menor reação cruzada com outras infeções por

nematoides (RAVI et al., 2002). A utilização de antígenos recombinante em sistemas

de imunopreciptação luciferase (LIPS) apresentou sensibilidade de 97% e

especificidade de 100%, resultados que foram melhores quando comparados com NIE-

ELISA (RAMACHANDRAN et al., 2008).

A utilização de técnica de Imunoblotting na detecção de antígenos dominantes

de S. stercoralis e S. ratti apresenta sensibilidade descrita entre 65-100% (SILVA et al.,

2003). Para melhorar essa sensibilidade, proteínas antigênicas da superfície da larva

infectante têm sido identificadas, e as descritas são 26, 31 e 41 KDa. Particularmente

as proteínas de 26 e 41KDa apresentaram melhor sensibilidade de diagnóstico

(CONWAY et al., 1994; SUDRE et al., 2007).

Como a IgA é um dos anticorpos mais prevalente no soro de pessoas infectadas,

e também está presente nas secreções de mucosa, amostras de saliva podem ser

31

utilizadas como fonte alternativa para quantificação de anticorpos contra helmintos,

incluindo S. stercoralis (SHARIATI et al., 2010). A vantagem da utilização de saliva

como uma ferramenta diagnóstica alternativa, é que ela é prontamente disponível e o

processo de coleta é menos invasivo (RIBEIRO et al., 2010).

A técnica de ELISA também pode ser utilizada para detecção de coproantígenos

de S. stercoralis em amostras de fezes. EL-BADRY (2009) desenvolveu uma técnica

de ELISA capaz de capturar coproantígenos de S. stercoralis em fezes de pacientes

infectados, sem apresentar reação cruzada com os nematoides ou trematódeos. Essa

técnica tem fácil execução e menor custo, mas ainda são necessários estudos para

avaliar o seu desempenho no diagnóstico da estrongiloidiase.

A técnica de detecção de coproantígeno desenvolvida a partir de anticorpos

policlonais de coelhos imunizados por S. ratti, foi capaz de detectar S. stercoralis em

fezes de humanos, e não apresentou reação cruzada com outros nemotóides,

mostrando-se, ainda, estável em fezes armazenadas sob congelação (SYKES;

MCCARTHY, 2011).

A formação de imunocomplexos durante a infeção por S. stercoralis serve como

substrato para seu diagnóstico. A detecção de antígenos do parasita ligados a IgGs no

soro de pacientes pode ser realizada através de técnica de captura por ELISA

(GONCALVES et al., 2012). O antígeno da forma larvar se mostrou mais sensível para

a detecção da infeção, uma vez que as larvas estão em contato direto com a mucosa

intestinal e desencadeiam uma resposta imunológica mais rica e específica. Assim,

esse antígeno pode ter grande importância no diagnóstico da estrongiloidíase humana,

e essa ferramenta diagnóstica deve ser considerada principalmente em pacientes

imunocomprometidos (GONCALVES et al., 2012).

Os testes sorológicos apresentam boa acurácia para acompanhamento de

pacientes infectados pelo S. stercoralis que apresentam cura após o tratamento

medicamentoso. As técnicas de ELISA e IFI apresentaram melhor desempenho na

demonstração da soroconversão dos pacientes tratados segundo (BUONFRATE et al.,

2015).

Interessante lembrar que os testes sorológicos apresentam limitação técnica em

pacientes imunocomprometidos, e em caso de suspeição clínica, eles não apresentam

capacidade de afastar infeção nos casos de resultados negativos, necessitando assim,

de uma probabilidade pré-teste alta (MARCOS et al., 2011).

32

1.7.3 Diagnóstico molecular

O diagnóstico molecular por reação de cadeia de polimerase (PCR) tem sido

utilizado para pesquisa de infecção por S stercoralis em amostras de fezes. É uma

ferramenta altamente específica, pois a detecção de ácido desoxirribonucleico (DNA)

do parasito nessas amostras melhora a sensibilidade diagnóstica quando comparada

com exames parasitológicos convencionais (TANIUCHI et al., 2011). REPETTO et al.

(2016) confirmaram o desempenho superior da PCR em relação ao método de

referência (cultura em placa de ágar), no diagnóstico da estrongiloidiase, mesmo fora

de áreas endêmicas. Essa técnica aumentou em duas vezes a taxa de detecção desse

helminto quando comparada com método de Baermann (VERWEIJ et al., 2009).

A PCR tem o potencial de aumentar a acurácia de detecção de S. stercoralis

independentemente do estágio de desenvolvimento parasitário (TEN HOVE et al.,

2009), também em casos de infecções leves (VERWEIJ et al., 2009), além de

apresentar boa reprodutibilidade e capacidade de ser realizado em larga escala

(BASUNI et al., 2011). O aumento da sensibilidade de diagnóstico acarreta elevação

do poder de detecção de vários fatores de risco significantemente associados com a

infeção por helmintos, o que não acontece quando técnicas menos sensíveis são

aplicadas em estudos de inquérito populacionais (KRAMME et al., 2011).

A escolha dos primers (inciadores) é de extrema importancia para a

sensibilidade do método em diagnosticar o S. Stercoralis. As sequências alvo de DNA

utilizadas nos diagnosticos por PCR de parasitas intestinais é constituida pela unidade

menor do RNA ribossonal. Esse gene está pesente em eucariotos, e os dados das

sequencias estão disponiveis para a maioria dos parasitas intestinais (STENSVOLD et

al. 2011). Iniciadores espécie-específico e gênero-específico de DNA de S. Stercoralis

são utilizados nas tecnicas de PCR e produzem fragmentos de 102 a 392bp. Estas

regiões são descritas como marcadores de diagnóstico de espécie dentro do genero

Strongyloides sp (HASEGAWA et al. 2011; REPETTO et al. 2013).

Regiões hipervariáveis do gene ribossomal (rRNA) que codificam as

subunidades 18S e 28S, e sequências do DNA mitocondrial (genes da cythocrome

oxidase subunidade CI), também são cogitadas como marcadores de diagnóstico

espécie-específico de Strongyloides spp. (HASEGAWA et al., 2009; JANWAN et al.,

2011).

33

VERWEIJ et al. (2009) utilizando sequências de 18S do rRNA demonstraram

100% de especificidade para S. stercorlais e 100% de homologia para outras espécies

de Strongyloides. Em estudo de comparação analítica para diagnóstico de S.

stercoralis, PAULA et al. (2013) demonstraram sensibilidade de 87,9% com a utilização

de iniciador espécie-específico, e de 78.8% para o iniciador gênero-especifico.

Quando utilizada em pequenos estudos populacionais a técnica de PCR

demonstrou boa acurácia diagnóstica. SCHAR et al. (2013) utilizando primer de 101pb

espécie-específico, encontraram sensibilidade de 88,9% no Camboja. SAUGAR et al.

(2015) utilizando o mesmo primer, encontraram sensibilidade de 93,8% na Espanha, e

BECKER et al. (2015) de 76.8% no oeste da África.

Além de alta sensibilidade, a PCR também pode aumentar a especificidade de

diagnóstico, reduzindo os erros de avaliação microscopica de larvas de helmintos

morfologicamente semelhantes, como no caso de ancilostomíase e S. stercoralis,

principalmente em locais onde coexistem duas espécies de helmintos. A combinação

de PCR em tempo real e microscopia mostrou alta precisão para o diagnóstico S.

Stercoralis (BECKER et al., 2015). O diagnóstico molecular também apresenta

capacidade de distinguir o poliparasitismo mais frequentemente que a microscopia

simples (64,7% versus 24,2%, p<0,05) conforme descrito por CIMINO et al. (2015).

Alguns grupos criaram ensaios de PCR multiplex para detectar 2, 5 ou mesmo 7

parasitas intestinais diferentes ao mesmo tempo, e são relatados alta especificidade

maior sensibilidade do que métodos parasitológicos convencionais (TANIUCHI et al.

2011).

O desenvolvimento e a validação de técnicas diagnósticas mais sensíveis para

a detecção de infecções mais brandas são necessários, uma vez que na literatura

existem ainda poucos estudos relacionados ao uso de PCR no diagnóstico da

estrongiloidíase na caracterização de diferentes níveis de intensidade de infecção, e na

definição de fatores de riscos associados (REPETTO et al., 2010).

1.8 Tratamento

Na infecção por S. stercoralis não complicada, o uso de Ivermectina 200μ/Kg por

dois dias, é o tratamento de escolha. Alternativamente pode-se usar o Albendazol,

400mg duas vezes ao dia por 3-7 dias (SUPUTTAMONGKOL et al., 2011). Em um

estudo de comparação de eficácia de tratamentos em pacientes infectados, o uso da

34

Ivermectina atingiu 82,9% de taxa de cura, contra 45,0% com o uso de Albendazol

(MARTI et al., 1996).

Na síndrome de hiperinfecção e na forma disseminada da estrongiloidíase, a

recomendação, além da redução da imunossupressão sempre que possível, é para o

uso de Ivermectina 200μ/Kg, em doses divididas, até a negativação dos exames

parasitológicos por pelo menos duas semanas (PORNSURIYASAK;

NITICHAROENPONG; SAKAPIBUNNAN, 2004).

Em áreas endêmicas para S. stercoralis deve-se considerar a quimioprofilaxia

especifica para todos os paciente que forem receber corticoide em doses

imunossupressoras (FARDET et al., 2006).

O Tratamento definitivo de S. stercoralis pode ser de difícil obtenção devido à

capacidade de desenvolvimento de resistência e a facilidade de reinfecção a partir do

meio ambiente, e também da capacidade que as larvas rabditoides apresentam de

autoinfecção (OLSEN et al., 2009). A eficácia medicamentosa também depende do

“status” imunológico do hospedeiro, do uso concomitante de outras drogas, de

coinfecção pelo HTLV-1 e de fatores intestinais, como síndromes disabsortivas

(CARVALHO; DA FONSECA PORTO, 2004; VADLAMUDI et al., 2006).

1.9 Diabetes mellitus tipo 2 (DM2)

O DM2 constitui-se em um dos mais sérios problemas de saúde na atualidade,

tanto em termos de número de pessoas afetadas, como incapacidade e mortalidade

prematura (DEFRONZO, 2009; SHAW; SICREE; ZIMMET, 2010). Previamente

chamado de não-insulino dependente ou de instalação na vida adulta, é a forma mais

comum de Diabetes no mundo, chegando a 90% dos casos, e a sua prevalência

mundial tem crescido em proporções endêmicas (WILD et al., 2004; WINER;

SOWERS, 2004). As estimativas mais recentes da Federação Internacional de

Diabetes (IDF) indicam que 8,8% dos adultos, ou 415 milhões de pessoas tenham

diabetes, e que 75% vivem em países subdesenvolvidos. Além disso, 318 milhões de

adultos apresentam intolerância diminuída a glicose o que os coloca em risco de

desenvolver diabetes no futuro2 (CHO, 2016).

2 Disponível em: http://www.diabetesatlas.org. (2015)

35

No Brasil, estudo multicêntrico realizado no final da década 1980, descreveu

prevalência de 7,6% entre indivíduos com 30-69 anos de idade. Essa taxa aumentava

com idade e foi de 17,4% no grupo etário de 60-69 anos. Cerca de metade dos

pacientes desconheciam ter DM2, e aproximadamente 20% daqueles com diagnóstico

prévio não faziam nenhuma forma de tratamento (GOMES et al., 2006). Atualmente as

estimativas referem que 14 milhões de pessoas estejam com Diabetes no Brasil, o que

gera uma prevalência entorno de 10,4%. Aproximadamente 40% dos diabéticos não

sabem ser portadores da doença, e em 7,9% já apresentam alteração a tolerância a

glicose3·. (COUTINHO; SILVA JUNIOR, 2015).

A patogênese da DM2 é complexa e envolve interação entre vários fatores, como

predisposição genética, fatores ambientais, o excesso de consumo de calorias, a

obesidade e o sedentarismo (SMILEY; CHANDRA; UMPIERREZ, 2011). A

apresentação clínica é bastante heterogênea, variando desde a idade de início, a

gravidade dos sintomas associados à hiperglicemia e ao grau de obesidade (SHAW et

al., 2010).

Idade, sexo, etnia, sedentarismo e obesidade são importantes fatores de risco

para o desenvolvimento de diabetes (HARRIS et al., 1998). Cerca de 70 a 90% dos

pacientes com DM2 apresentam síndrome metabólica, caracterizada por um conjunto

de fatores que implicam em risco cardiovascular elevado (dislipidemia, obesidade

abdominal, resistência insulínica, tolerância à glicose alterada ou diabetes e

hipertensão (LAAKSONEN, et al., 2004).

O DM2 surge habitualmente após os 40 anos e em pessoas mais velhas

(MOKDAD et al., 2001), porém com o aumento da obesidade na infância, o diagnóstico

de DM2 nessa faixa etária aumentou em 30%, principalmente em Africanos e

Hispânicos (GORAN; BALL; CRUZ, 2003).

A combinação de resistência à ação da insulina no músculo e no fígado e

insuficiência de células-β pancreáticas representam os defeitos fisiopatológicos

fundamentais dessa doença (BELL; POLONSKY, 2001). Atualmente é afirmado que a

deficiência de células-β ocorre muito mais precocemente e é mais grave do que se

pensava. Os indivíduos com glicose no tercil superior do teste de tolerância à glicose

(TOTG) são praticamente resistentes à insulina, e já perderam cerca de 80% da sua

função de células-β (ABDUL-GHANI et al., 2006). Além do músculo, do fígado, e de

3 Idem.

36

células-β, as células gordurosas (lipólise acelerada), o trato gastrointestinal

(deficiência/resistência de incretinas), as células-α (hiperglucagonemia), os rins

(aumento da reabsorção de glucose) e o cérebro (resistência à insulina), desempenham

papéis importantes (Figura 5) no desenvolvimento da intolerância à glucose em

indivíduos diabéticos (DEFRONZO, 2009).

Figura 5: Mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do Diabetes mellitus tipo 2. Adaptado DeFronzo, 2009.

Uma significativa proporção de diabéticos tipo 2 é formada por assintomáticos

ou oligoassintomáticos, o que leva ao atraso no diagnóstico da doença, fazendo com

que as complicações micro ou macro vasculares não raramente estejam presentes,

quando da detecção inicial da hiperglicemia (LUDDEKE, 1998). Em consequência das

complicações crônicas, os diabéticos apresentam em comparação à população não

diabética, uma elevada morbidade (perda de visão, insuficiência renal, amputação não

traumática de membros inferiores, infarto agudo do miocárdio, acidente vascular

cerebral, etc.) e uma mortalidade três vezes maior (EMERGING RISK FACTORS et al.,

2011).

Como resultado, o Diabetes mellitus cria um enorme fardo econômico para os

indivíduos acometidos, para suas famílias, para os sistemas de saúde e para a

economia dos países (AMERICAN DIABETES, 2013).

HIPERGLICEMIA

Secreção Insulina

Diminuição Do Efeito Incretínico

Lipólise

Reabsorção de glicose

Utilização de Glicose

Disfunção de Neurotransmissores

Células α - ilhotas

Secreção de Glucagon

Produção glicose

37

O critério para o diagnóstico de DM2 foi modificado em 1997, pela American

Diabetes Association (ADA) e, posteriormente, aceito pela Organização Mundial da

Saúde (OMS) e pela Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD). Atualmente são três os

critérios aceitos para o diagnóstico com utilização da glicemia: 1- Sintomas de poliúria,

polidipsia e perda ponderal acrescidos de glicemia casual ≥ 200 mg/dL; 2- Glicemia de

jejum ≥ 126 mg/dL; 3-Glicemia de 2 horas pós-sobrecarga de 75 g de glicose ≥ 200

mg/dL.

1.10 Diabetes mellitus e estrongiloidíase

É bem conhecido o efeito negativo que o Diabetes tipo 2 (DM2) tem sobre os

desfechos de algumas infecções em seres humanos, e vários mecanismos podem estar

envolvidos nessa resposta (GEERLINGS; HOEPELMAN, 1999; BERTONI; SAYDAH;

BRANCATI, 2001). Evidências sugerem que as comorbidades associadas ao diabetes

podem contribuir de uma maneira importante para essa susceptibilidade à infecções

(SHAH; HUX, 2003; KNAPP, 2013).

Uma evidência descrita seria uma alteração da resposta imune inata, incluindo

prejuízo da função de neutrófilos (STEGENGA et al., 2008). Apesar do aumento da

expressão intracelular de moleculas de adesão do tipo1 e E-selectinas (AUDRAN et

al.,1996), a quimiotaxia de neutrofilos está alterada nos estados hiperglicêmicos

(DELAMAIRE et al., 1997).

Além das alterações das funções de neutrófilos, a produção de citocinas também

está alterada nos estados hiperglicêmicos. Pacientes diabéticos apresentam aumento

de citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina (IL)

6 e IL-8 (PICKUP; CROOK, 1998), e essas citocinas estão envolvidas nas complicações

crônicas do diabetes, como na retinopatia proliferativa (DOGANAY et al., 2002).

A adipocina resitina é produzida pelo tecido adiposo e também no pulmão. Ela

apresenta função metabólica, e seus níveis elevados estão associados com resistência

insulínica e inibição da diferenciação de pré-adipócitos (GREGOIRE, 2001). Foi

demonstrado que a resistina é capaz de alterar a resposta de neutrófilos em estado

hiperglicêmicos, como a quimiotaxia e fagocitose (COHEN et al., 2008). Outra

adipocina, a leptina, secretada pelas células gordurosas também apresenta importante

interface entre desordens metabólicas e prejuízo da resposta imune (MANCUSO et al.,

2002).

38

Como DM2 é uma doença extremamente complexa, onde coexistem vários

distúrbios metabólicos, é impossível atribuir a susceptibilidade aumentada a infeções

somente para uma via da resposta imune ou um tipo celular (GEERLINGS;

HOEPELMAN, 1999).

Na literatura científica são descritos alguns casos de estrongiloidíase

disseminada e hiperinfecção em pacientes, em que o fator de risco conhecido era o

Diabetes, sugerindo que o DM2 tenha um papel de prejuízo da resposta imunológica

para essa infecção ( HIGASHIYAMA et al., 1997; AL SAMMAN; HAQUE; LONG, 1999;

EMAD, 1999; COOVADIA; RAJPUT; BHANA, 1993; LINDER et al., 2000; LAM et al.,

2006; AZIRA; ZEEHAIDA, 2010; MURALI et al., 2010; IRAZ et al., 2014; SHUKLA et

al., 2015).

Estudo de revisão demonstrou que 25% dos pacientes internados em um hospital

escola com diagnóstico de S. stercoralis tinham Diabetes mellitus (AZIRA; ABDEL

RAHMAN; ZEEHAIDA, 2013). RETS; GUPTA; HASEEB (2013) descreveram que

algumas condições clínicas estavam associadas com reativação de infeções latentes

de S. stercoralis em pacientes hospitalizados, dentre elas o DM2.

MENDONCA et al. (2006) demonstraram evidências de uma possível associação

entre positividade sorológica para S. stercoralis e a presença de Diabetes, sendo

encontrado uma positividade em 23% nos pacientes diabéticos versus 7,1% em

pacientes controles.

HAYS; ESTERMAN; MCDERMOTT (2015) demostraram falência terapêutica

contra S. stercoralis em pacientes portadores de DM2, numa comunidade aborígene na

Austrália. Os autores acreditam que além de possível interação medicamentosa e da

alteração da absorção intestinal da Ivermectina, os pacientes diabéticos apresentavam

maior falência terapêutica em função de uma carga parasitaria maior, associada a um

prejuízo da resposta imune.

Mais recentemente foi explorada a relação entre a adipocina resistina e infeções

por helmintos. Foi demonstrado em humanos que o aumento da resistina está

associado com aumento da resposta imune do tipo Th1, e consequente aumento da

carga parasitária durante infecções por geo-helmintos, e também com a diminuição da

depuração de larvas (JANG et al., 2015).

Porém, até o presente momento, ainda não sabemos o quanto o diabetes por

si só resulta em um defeito imunológico específico que pode predispor esses pacientes

ao desenvolvimento da síndrome de hiperinfeção (HS) pelos S. stercoralis. Propor uma

39

rotina de rastreamento para pacientes assintomáticos poderá prevenir desfechos

graves e fatais da estrongiloidíase, principalmente naqueles pacientes que apresentam

controle metabólico ruim.

40

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral Verificar os perfis clínico, socioeconômico, parasitológico e molecular da

estrongiodiase em pacientes portadores de Diabetes mellitus tipo 2.

2.2 Objetivos específicos

• Verificar a ocorrência de parasitoses intestinais e de Strongyloides stercoralis em

pacientes diabéticos;

• Detectar a presença de DNA de Strongyloides stercoralis nesses pacientes;

• Avaliar os parâmetros clínicos e laboratoriais e epidemiológicos dos pacientes

infectados;

• Relacionar os resultados dos exames parasitológicos e moleculares com

parâmetros clínicos e laboratoriais de cada paciente.

• Comparar os métodos de diagnóstico parasitológico e molecular da estrongiloidíase

em pacientes portadores de Diabetes mellitus tipo 2

41

3. METODOLOGIA

3.1 Aspectos éticos

O presente estudo foi aprovado pelo apreciado pelo Comitê de Ética e Pesquisa

(CoEP) da Universidade Federal de Goiás sob Protocolo 929.187/2015 (Anexo A).

Todos os pacientes foram esclarecidos sobre os objetivos e procedimentos da

pesquisa e concordaram por escrito em participar, mediante assinatura do TCLE

(Anexo B).

Esta pesquisa também foi aprovada quanto a sua realização pela diretora do

Programa de Saúde da Família e o Secretário Municipal de Saúde de Jataí/GO que

também foram devidamente orientados sobre a natureza, objetivos e procedimentos

necessários para a realização da pesquisa conforme Termo de Anuência Institucional

(Anexo C).

3.2 Delineamento do estudo

Trata-se de estudo de caso controle.

3.3. Caracterização da área do estudo

O estudo foi realizado no município de Jataí/GO, no período de janeiro de 2015

a dezembro de 2016. O município de Jataí/GO tem uma população estimada de 88.600

habitantes (IBGE, 2010), situa-se no sudoeste de Goiás, a 327 km da capital estadual,

Goiânia, 535 km da capital federal, Brasília.

A rede de atenção à saúde (RAS) conta com 16 Equipes de Saúde da Família,

sendo uma delas rural e um Programa de Agentes Comunitários de Saúde,

correspondendo a uma cobertura populacional de 61,4%.

Além da Atenção Básica, Jataí conta com um Ambulatório de Diabetes, em que

há o acompanhamento especializado por equipe multidisciplinar dos pacientes que não

alcançam a estabilidade com o tratamento na atenção básica.

Essa equipe é composta por uma médica endocrinologista, uma enfermeira, uma

nutricionista, uma psicóloga e uma fisioterapeuta.

42

3.4 População do estudo

A população de estudo consistiu de pacientes portadores de Diabetes mellitus

tipo 2, de ambos os sexos, independente do estado civil, renda, escolaridade, com

idade igual ou superior a 18 anos, acompanhados pelo Programa de Educação e

Controle do Diabetes (PECDM), que aceitarem participar da pesquisa através de seu

consentimento pela assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo

B). Os sujeitos de pesquisa (portadores de DM2) foram selecionados aleatoriamente

durante atendimento na Unidade Básica de Saúde do Município de Jataí (GO),

localizados na Av. Goiás sem número. A avaliação foi agendada previamente com os

participantes para não haver prejuízo nenhum no andamento das atividades da Unidade

Básica de Saúde.

Os participantes do grupo controle foram pessoas que declararam não possuir

diabetes, de ambos os sexos, independente do estado civil, renda, escolaridade, com

idade igual ou superior a 18 anos e que estavam acompanhando pacientes do PECDM,

ou em consulta na UBS, e que aceitaram participar através de seu consentimento, esse

dado pela assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Foram fornecidos material apropriado aos participantes para coleta de amostras

de fezes. Os mesmos receberam informações para a coleta adequada, e foram

agendados o local da entrega do material e coleta de amostras de sangue para análises

biológicas.

3.5 Os critérios de inclusão estabelecidos para a participação no estudo

Foram adotados os seguintes critérios de inclusão para o grupo DM2: Ter mais

de 30 anos, ambos os sexos, ter o diagnóstico de DM2 estabelecido conforme critérios

estabelecidos pela OMS e fazer uso de insulinas há mais de 5 anos. Estar cadastrado

no programa de Educação e Controle de Diabetes da unidade básica de saúde James

Phillip Minelli, do município de Jataí/GO, ter realizado consulta médica e exames de

sangue nos últimos dois anos. E por fim, compreender as informações fornecidas pelo

pesquisador durante a coleta de dados.

Para o grupo não diabético (controle) foram adotados os seguintes critérios: ter

mais de 30 anos, não referir diagnóstico de DM2, ter a dosagem de hemoglobina

43

glicosilada (HbA1c) <6,5%, e compreender as informações fornecidas pelo pesquisador

durante a coleta de dados.

3.6 Os critérios de exclusão estabelecidos

Foram excluídos do estudo os sujeitos de pesquisa que não forneceram

consentimento formal por meio da assinatura do Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido, e também aqueles que fizeram uso de medicações anti-helmínticas no

último ano.

3.7 Cadastro do perfil socioeconômico dos pacientes

Os dados dos portadores de DM2 e indivíduos não diabéticos foram registrados

na ficha de avaliação elaborada pelos autores, que incluiu os seguintes itens: Dados

pessoais (nome, sexo, idade, estado civil, procedência), nível educacional, raça, renda

familiar, ocupação, tempo de diagnóstico e tratamento do Diabetes, medicações de uso,

frequência da realização de glicemia capilar, presença de comorbidades, hábitos

higiene e saneamento e uso de anti-helmíntico prévio (Apêndice A).

3.8 Avaliação do controle metabólico (HbA1c), hematócrito e eosinofilia

Foram coletados 10mL de amostra de sangue por punção venosa periférica de

cada participante do estudo, em tubos com EDTA e tubos sem coagulante. As amostras

foram enviadas para o Laboratório da Clínica Plena (Jataí/GO) para a determinação

hematócrito para avaliação de anemia, contagem de eosinófilos e análise de

hemoglobina glicosilada (A1c) para avaliar o controle metabólico. A eosinofilia é

definida pela contagem de eosinófilos em sangue periférico >450 Células/mm3.

Para análises hematológicas foi utilizado o analisador hematológico MINDRAY

modelo BC-5380. O aparelho é um analisador de hematologia automático e quantitativo

além de um contador diferencial de 5 partes para uso diagnóstico in vitro em

laboratórios clínicos. Os métodos de medição usado no analisador são: o método de

impedância elétrica para determinar a quantidade e tamanho das plaquetas, eritrócitos

e leucócitos; o método colorimétrico para determinar hemoglobina e citometria de fluxo

por laser para determinar os dados WBC (Contagem diferencial de glóbulos Brancos).

44

A dosagem de Hemoglobina glicada (HbA1c) seguiu as orientações da

International Federation for Clinical Chemistry (IFCC). Tradicionalmente, a A1C tem

sido considerada como representativa da média ponderada global das glicemias

médias diárias (incluindo glicemias de jejum e pós-prandial) durante os últimos dois a

três meses. O NycoCard HbA1C é um ensaio de afinidade de borato. O kit contém

dispositivos de teste com um filtro de membrana porosa, cubetas pré-cheias com

reagente e uma solução de lavagem. O reagente contém agentes que lisam eritrócitos

e precipitam hemoglobina especificadamente, assim como o ácido bórico azul

conjugado que se liga aos grupos cis-diol da hemoglobina glicada. É acrescentada ao

dispositivo de teste uma alíquota da mistura de reação e toda a hemoglobina

precipitada, ligada ou não ao conjugado, permanece ao topo do filtro. O excesso de

conjugado colorido é retirado com a solução de lavagem. O precipitado é avaliado

medindo a intensidade da cor azul (hemoglobina glicada) e vermelho (hemoglobina

total) com o NycoCard Reader II, sendo a relação entre elas proporcional à

percentagem de HbA1c na amostra.

3.9 Diagnóstico parasitológico

Foram colhidas três amostras fecais de cada indivíduo em dias alternados sem

conservantes para a realização de exame parasitológicos, através dos métodos de

sedimentação espontânea Lutz (1919), de Rugai, Mattos e Brisola (1954) e de cultura

em placa de ágar (ARAKAKI et al., 1988). Os exames foram realizados no Laboratório

de Parasitologia da Universidade Federal de Goiás na Regional Jataí.

De cada amostra fresca de fezes, foram retiradas alíquotas, e congeladas a -

20°C, e foram submetidas à análise molecular utilizando-se técnica de PCR no

laboratório citado acima.

3.9.1 Método de Lutz

Esse método foi descrito por Lutz (1919), é também conhecido por Hoffman, Pons

e Janer (1934) e permite a detecção de ovos e larvas de helmintos além de cistos de

protozoários (NEVES, 2011).

Em um becker com capacidade de 200 ml, contendo cerca de 5 ml de água de

torneira, foram depositadas 2 a 6g de fezes, que foram fragmentadas por meio de um

45

bastão de vidro, acrescentando-se mais água, até completar um volume aproximado

de 20 ml sob agitação constante.

A suspensão foi filtrada, através de gaze cirúrgica dobrada quatro vezes, sobre

tela metálica com 100 malhas por cm2 e transferida para o cálice cônico de

sedimentação com 200 ml de capacidade. Os detritos retidos na gaze foram lavados

com água corrente, agitando-os constantemente com o bastão de vidro, sobre o mesmo

cálice.

A suspensão assim preparada foi deixada em repouso durante 24 horas. Caso o

sobrenadante esteja turvo, este foi descartado cuidadosamente sem levantar ou perder

o sedimento. Em seguida, foi novamente ressuspenso, completando-se o volume com

água até um total de 200 ml e deixado em repouso por duas horas, período após o qual,

descartou-se o sobrenadante, deixando no recipiente o sedimento para leitura em

microscopia (Olympus CX 41) nos aumentos de 10X e 40X.

3.9.2 Método de Rugai

O método de Rugai, Matos e Brisola (1954) é mais indicado para a detecção de

larvas de S. stercoralis. Sobre uma placa Petri, foi colocada uma gaze dobrada em

quatro partes, em seguida as fezes foram retiradas do recipiente e colocadas

aproximadamente de 2 a 6g de fezes frescas sobre a gaze. As fezes foram envolvidas

na gaze formando uma “trouxa”, que foi amarrada firmemente e colocada em um

suporte por meio de um bastão de vidro para sustentação, em um cálice contendo água

aquecida a 45ºC por aproximadamente uma hora em repouso, após retirou-se

cuidadosamente a “trouxa”.

O sedimento do fundo do cálice foi colhido cuidadosamente com uma pipeta, e

corado com lugol para leitura em microscopia (Olympus CX 41) nos aumentos de 10X

e 40X.

3.9.3 Método de cultura em placa de ágar

Para realização do método de cultura em placa de ágar foram semeadas

aproximadamente 2g de fezes em placa de Petri descartáveis contendo o meio (na

proporção de 1,5g de ágar, 0,5g de extrato de carne, 1g de peptona, 0,5g de cloreto de

46

sódio e 100 ml de água destilada) em uma superfície de aproximadamente um

centímetro de diâmetro.

As placas foram lacradas com parafilme e incubadas a temperatura de 28ºC em

estufa de incubação por dois dias. Findo este tempo, as placas foram lavadas com

formol a 10%. O lavado foi colhido da superfície do ágar e centrifugado a 3000 rpm por

três minutos. Logo após, o sedimento foi corado com solução de iodo de Lugol e

analisado no microscópio (Olympus CX 41) nos aumentos de 10 e 40X.

3.9.4 Leitura das lâminas

Para cada amostra fecal submetida aos métodos de Lutz e Rugai foram

preparadas nove lâminas. Essas foram então divididas para três leitores, ficando cada

leitor com três laminas por amostra de fezes.

3.10 Diagnóstico molecular

3.10.1 Extração do DNA

A extração do material genético das amostras de fezes foi realizada no Instituto

de Medicina Tropical do Hospital das Clinicas da Universidade de São Paulo. Para tal,

foi utilizado o kit QIAmp DNA Stool Mini Kit (Qiagen® Hilden, Alemanha), segundo

instruções do fabricante. Aproximadamente 600mg (pool) de fezes congeladas das três

amostras de cada paciente foram diluídos 1mL com solução a 2%

polivinylpolypyrrolidone (PVPP; Sigma, Steinheim, Alemanha) em tampão PBS. Em

seguida, cada pool de amostra foi levado a banho seco por 10 minutos a 100°C, e após

foi retirado o sobrenadante. Adicionou-se 1,4 mL de tampão ASL em cada amostra de

fezes, e homogeneizado cuidadosamente em vórtex por 1 minuto.

Após esse tempo, o material foi incubado por 5 minutos a 70°C, e em seguida

foi centrifugado por 1 minuto a 14.000rpm. Cerca de 1,2 mL do sobrenadante foi

pipetado e colocado em novo eppendorf estéril. Um tablete do Inibex® foi adicionado

em cada tubo de amostra e novamente homogeneizado em vórtex até que se

dissolvesse.

Em seguida, o material ficou por 1 minuto em temperatura ambiente e

posteriormente foi centrifugado por 3 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi

47

pipetado e transferido para um novo tubo de 1,5 mL. Em um novo tubo estéril foi

colocado 1,5μL de proteinase K e adicionado 200 μL do sobrenadante obtido da etapa

anterior. A mistura foi homogeneizada em vórtex, e incubada por 2h a 56°C. Adicionou-

se então, 200 μL de tampão AL, e homogeneizado no vórtex e incubado por 10 minutos

a 70°C. Após essa etapa, Adicionou-se 200 μL de etanol (96-100%) gelado e

novamente este foi homogeneizado em vórtex. Cuidadosamente foi aplicado todo o

lisado do passo anterior em uma coluna de spin do Kit QIAamp acoplada em tubo

coletor.

O material foi centrifugado por 1 minuto a 8.000 rpm para retirada das bolhas.

Após o conteúdo ter passado pelo filtro, os tubos foram trocados e o filtrado foi

descartado e a coluna transferida para um novo tubo coletor. Foi adicionado

cuidadosamente 500 μL de tampão AW1 e centrifugado por 1 minuto a 14.000 rpm.

Novamente os tubos foram trocados após a filtração. Em seguida a essa etapa, foi

adicionado 500 μL do tampão AW2, e centrifugado 14.000rpm por três minutos.

Realizou-se a última troca de tubos, e centrifugado por 1 minuto. A coluna foi transferida

para um tubo estéril de 1,5mL, e adicionado tampão AE (eluição) em duas etapas (com

50 μL cada). O tampão foi despejado sobre a membrana e incubado por 1 minuto em

temperatura ambiente, para ao final do processo ser centrifugado a 14.000rpm e

retirado a coluna do tubo. O DNA eluído foi distribuído em alíquotas e armazenado a -

20°C. A quantificação de DNA nas amostras foi realizada em Espectrofotômetro V3.2.1

NanoDrop ND-100 UV-VIS (NanoDrop Technologies, Wilminton, DE, EUA).

3.10.2 Iniciadores

Foram utilizados dois iniciadores (primers) referente a subunidade 18S do

gene do DNA ribossomal, com fragmentos esperados de ~392bp (caracteristico do

gênero Strongyloides, descrito por DORRIS, BLAXTER, 2000) e de ~101bp (específico

da espécie S. stercoralis, descrito por VERWEIJ et al., 2009).

A sequencia do primer espécie-específico utilizado nas reações de PCR foi a

seguinte: forward (5’-GAATTCCAAGTAAACGTAAGTCATTAGC-3’) e reverse (5’-

TGCCTCTGGATATTGCTCAGTTC-3’). E a sequencia do primer gênero-específico

utilizado foi: forward (5’-AAAGATTAAGCCATGCATG-3’) e reverse (5’-

GCCTGCTGCCTTCCTTGGA-3’).

48

3.10.3 Reação de Cadeia de Polimerase (PCR)

A reação de PCR foi realizada em volume final de 10 µl, sendo 4 μL de DNA e

6 μL de MIX (0,6 μL de MgCl2, 2,8 μL de água; 1,0 μL de 10x PCR; 0,5 μL de dNTPs;

0,5 μL de cada primer (forward e reverse)), 0,1 μL Platinum® Taq DNA polimerase (5U/

μL, Invitrogen, Life Technologies, Val Allen way, carisbas, CA, USA). As condições de

PCR incluíram a desnaturação inicial a 95oC durante 5 min , seguido de 45 ciclos a

95oC durante 30 segundos (desnaturação), 60oC em 30 segundos, 72oC durante 30

segundos, e uma extensão final em 72oC por 10 minutos. A reação foi realizada no

termocilador Master cycler ep gradiente S thermocycler (Eppendorf Hamburg,

Alemanha).

Em cada reação de PCR foi adicionado um controle positivo, contendo DNA

extraído de larvas filarioides de S. stercoralis de uma amostra positiva no exame

parasitológico de um paciente, e um controle negativo (mix da reação e água, sem o

produto de extração de DNA).

3.10.4 Eletroforese em gel de Agarose

Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose a

2 %, contendo 5 μL do produto de PCR e 2 μL de Bluejuice Gel Loading Buffer (Invitro,

Life Techonoogies, Val Allen Way, Carisbas, CA, USA). A eletroforese seguiu-se em

tampão TAE 1X (Invitro, Life Techonoogies, Val Allen Way, Carisbas, CA, USA) por 1

hora, sob tensão eletrica de 80 volts e corrente eletrica 400mA. Acrescido ao gel um

padrão de peso molecular de 100 pares de bases (Invitro, Life Techonoogies, Val Allen

Way, Carisbas, CA, USA), uma amostra controle negativo e uma controle positivo.

Ao final, foram vizualizados em fonte de luz ultravioleta e documentados por

sistema de captura de imagens.

3.10.5 Sequenciamento

Para o sequenciamento foi empregada técnica derivada da metodologia de

Sanger (1977), utilizando didesoxinucleotideos (ddNTPs) contendo marcadores

49

fluorescentes, seguindo instruções do Kit ABI Prism BigDye terminator (applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA), em sequenciador automático ABI 3500 (applied

Biosystems). Os produtos gerados no segundo ciclo de PCR foram purificados

utilizando enzima EXOSAP (GR Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) e submetidos à

reação de sequenciamento para incorporação de ddNTPs marcados. Os produtos da

amplificação foram sequenciados em ambos os sentidos (sense e antisense) da fita de

DNA para aumentar especificidade dos resultados.

A reação de sequenciamento foi realizada utilizando 4μL de BidDye mix; 2 μL do

produto purificado e 10 μL de água Mili-Q para volume final de 20 μL. As condições de

PCR para o sequenciamento adotadas foram: 92°C por 2 minutos; 96°C por 30

segundos, 52°C por 30 segundo, 40 vezes e extensão final de 60°C por 4 minutos. O

produto de PCR foi precipitado e adicionado 65 μL de solução (EDTA 125mM e etanol

absoluto), seguido pela incubação de 15 minutos em temperatura ambiente e

centrifugação por 30 minutos a 14.000 rpm. Sobrenadante foi descartado e adicionado

60 μL de etanol ao pellet, centrifugado por 15minutos novamente. Foi adicionado ao

pellet 10 μL de formamida e incubado a 95°C. o produto foi resfriado em banho de gelo

e submetido a sequenciamento. As sequencias geradas foram alinhadas utilizando o

programa BioEdit (Biological Sequence Alignment Editor) e comparada com outras

sequencias presentes no banco de dados do GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), utilizando a ferramenta BLAST (Basic Local

Alignment Search tool).

3.11 Retorno à comunidade

Os resultados de todos os exames realizados foram enviados aos pacientes, e os

casos detectados como positivos/alterados foram encaminhados para tratamento

específico.

3.12 Normas de biossegurança

Todos os procedimentos seguiram normas básicas de biossegurança, tanto nos

procedimentos de colheita, manuseio dos materiais biológicos e reagentes, bem como,

a utilização dos equipamentos (MASTROENI, 2011).

50

3.13 Análise estatística

Para as análises estatísticas foi utilizado programa ACTION STAT. Os dados

apresentaram distribuição normal, e foram descritos por média ± desvio padrão. Para

análise das variáveis categóricas foi utilizado teste do Qui-quadrado com correção de

Yates. No caso de ocorrência de menos de cinco eventos, foi empregado o teste exato

de Fisher. Em todos os testes foram fixados o nível de 5% para a rejeição da hipótese

nula. Regressão logística múltipla foi utilizada, pelo programa SPSS statistic versão 23,

para examinar a associação entre infecção parasitária e as variáveis contínuas

clínicas/laboratoriais do presente estudo (dados epidemiológicos, hemoglobina

glicosilada, hematócrito e eosinofilia). Foi estipulado intervalo de confiança (IC) de 95%.

Os resultados da técnica de PCR foram comparados com resultados dos exames

parasitológico de fezes, e o grau de concordância entre eles foi verificado pelo

coeficiente Kappa e IC 95%.

51

4. RESULTADOS

4.1. Variáveis socioeconômicas

Um total de 149 indivíduos concordou em participar da pesquisa no período de

janeiro de 2015 a junho de 2016. Destes, 89 (59,7%) eram do sexo feminino, e 60

(40,3%) do sexo masculino.

A população de estudo foi dividida em dois grupos (Tabela 1), sendo 97

pacientes portadores de Diabetes mellitus tipo 2 (Grupo I), e 52 de indivíduos não

diabéticos (Grupo II). A média de idade do Grupo I foi de 62,98 anos (± 10,6) e no

Grupo II foi de 60,35 anos (± 15,29) (p=0,304).

Entre os 97 pacientes do Grupo I, 61 (62,9%) eram do sexo feminino e 36

(37,1%) eram do sexo masculino. A maioria dos pacientes desse grupo estava na faixa

etária entre 61-70 anos (36%). Entre as 52 pessoas do Grupo II, 32 (61,5 %) eram do

sexo feminino e 24 (46,1%) eram do sexo masculino, e maioria das pessoas pertencia

a faixa etária > 70 anos (32,7%). Houve diferença estatística na distribuição de faixa

etária entre os grupos (p=0,008).

Nos dois grupos a maioria dos participantes era aposentado (53,6% grupo I e

48,2% grupo II), e possuíam nível fundamental de educação (68% e 57,1%). Não houve

diferença estatística em relação a esses aspectos entre os grupos.

52

Tabela 1: Descrição dos aspectos socioeconômicos dos Grupos I e II.

Variáveis socioeconômicas Grupo I (DM2) Grupo II p*

GÊNERO Masculino 36(37,1%) 24 (46,1%) 0,5967 Feminino 61(62,8%) 32 (61,5%) IDADE (anos) 30-40 2 (2%) 8 (15,4%) *0,008 41-50 12 (12,3%) 8 (15,4%) 51-60 24 (24,7%) 9 (17,3%) 61-70 35 (36%) 10 (19,24%) >71 24 (24,7%) 17 (32,7%) EMPREGO Empregado 16 (16,49%) 12 (21,4%) 0,0782 Desempregado 10 (10,3%) 9 (16,07%) Aposentado 52 (53,6%) 27 (48,2%) Do lar 2 (2,06%) 3 (5,35%) Autônomo 5 (5,15%) 5 (8,9%) Pensionista 11 (11,3%) 0

NÍVEL EDUCACIONAL

Sem escolaridade 18 (%) 13 (23,2%) 0,5697 Ensino Fundamental 66 (68%) 32 (57,14%) Ensino médio 10 (10,3%) 9(16%) Ensino superior 3 (3) 2 (3,57%)

*Qui-quadro ou teste Exato de Fisher, DM2: Diabetes Mellitus tipo 2, Grupo I (DM2), Grupo II (não-DM2)

4.2 Resultados Parasitológicos

Foram obtidas três amostras de fezes de 149 indivíduos (97 pacientes do Grupo

I e 52 do Grupo II), totalizando 447 amostras, colhidas em dias alternados e analisadas

pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai e cultura em placa de ágar, no

período de janeiro de 2015 a junho de 2016.

Quanto aos resultados parasitológicos verificou-se uma positividade para

parasitas e comensais intestinais, em pelo menos uma técnica empregada, de 28,9%

(43), sendo que no Grupo I foi de 30,9% (30) e no Grupo II foi de 25% (13).

Não houve diferença estatística na positividade entre os grupos, e utilizando

análise de regressão logística, Diabetes mellitus tipo 2 não foi um fator de risco

independente para positividade nos testes parasitológicos (Tabela 2).

53

Tabela 2: Prevalência de infecção parasitária em pacientes nos Grupos I e II N° Testados N° Infectados (%) OR IC95% p* DM2 Sim 97 30 (30,9%) 1.3433 0.6275 a 2.8757 0.4473 Não 52 13 (25%)

*Teste de Regressão logística, OR: Odds ratio; IC: intervalo confiança. DM2: Diabetes mellitus tipo 2.

Ao verificar a frequência de enteroparasitoses e comensais no Grupo I (Tabela 3), foi encontrado maior prevalência do protozoário comensal Endolimax nana (13 casos), seguido por Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni (12 casos) e do protozoário potencialmente patogênico Blastocystis hominis (12 casos). Com relação aos helmintos somente um paciente foi positivo para S. stercoralis, e um paciente positivo para

Hymenolepsis nana. No Grupo II também foi observado maior prevalência de protozoários comensais,

sendo os mais frequentes o E. hartmanni e E.nana (7 casos) e E. coli (4 casos). Entre os protozoários patogênicos, o B. hominis (5 casos) foi o mais frequente. Nesse grupo, 3 pacientes foram positivos para S. stercoralis. Tabela 3: Frequência de parasitos intestinais patogênicos e comensais encontrados em amostras fecais de pacientes nos Grupos I e II.

Tipo de parasita Grupo I (DM2) Grupo II p* HELMINTOS H. nana 1(1%) 0

S. stercoralis 1(1%) 3 (5,7%) 0.1421

PROTOZOÁRIOS PATOGÊNICOS

G. lamblia. 1 (1%) 0 E. histolytica/dispar 2 (2,1%) 2 (3,51%) B. hominis 12 (12,4%) 5 (8,77%) 0.5157 PROTOZOÁRIOS COMENSAIS

E. coli 12 (12,4%) 5 (8,92%) 0.3144 E. nana 13 (13,4%) 7 (12,28%) 0,9814 E. hartmanni 12 (12,4%) 8 (12,28%) 0.9814 I. butschlii 2 (2,1) 1 (1,75%) 0.9056

*Qui-quadro ou teste Exato de Fisher, Grupo I (DM2), Grupo II (Não-DM2), DM2= Diabetes mellitus tipo 2

Não houve diferença estatística entre as taxas de infeção pelos agentes

descritos acima entre o Grupo I e Grupo II.

54

Em relação às associações parasitológicas (Figura 6), verificou-se que 16

(16,4%) pacientes do Grupo I estavam monoparasitados, 6 (6,1%) biparasitados e 8

(8,2%) poliparasitados. No Grupo II, 5 (8,9%) estavam monoparasitados, 3 (5,3%)

biparasitados e 5 (8,9%) poliparasitados. Houve forte associação entre DM e

monoparasitismo (OD 3,4897 IC95% 0.9695 A 12.5617 p=0,0558).

Figura 6: Distribuição das associações parasitológicas nos Grupos I e II.

A positividade para S. stercoralis foi presente apenas em monoparasitismo no

Grupo I, já no Grupo II, em dois indivíduos o S. stercoralis esteve presente em

monoparasitismo, e no terceiro esteve presente em poliparasitismo (E. hartmanni e E.

coli).

Ao analisar a distribuição de fatores de risco para infecção parasitária entre os

dois grupos (Tabela 4) verificou-se que não houve diferença entre eles para sexo,

idade, nível educacional, tipo de água ingerida e mexer com terra. Para o fator andar

descalço, a positividade no exame parasitológico foi maior no Grupo I (n=10) em relação

ao Grupo II (n=0) (p=0,039).

0

5

10

15

20

25

MONOPARASITISMO BIPARASITISMO POLIPARASATISMO

Nºp

acie

ntes

*P=0,0558 - Qui- quadrado

*

Grupo I Grupo II

55

Tabela 4: Fatores de risco para infecção parasitária nos Grupos I e II

Fator de Risco Grupo I (n/%) Grupo II (n/%) Total p*

GÊNERO Masculino 14 (46,6) 6 (10,7) 20 0,7337 Feminino 16 (53,3) 5 (8,9) 21

IDADE (anos) 30-40 0 1 (1,7) 1 0,6040 41-50 5 (5,1) 1 (1,7) 6 51-60 8 (8,2) 2 (3,5) 10 61-70 11 (11,3) 4 (7,1) 15 >71 6 (6,1) 3 (5,3) 9

NÍVEL EDUCACIONAL

Sem escolaridade 6 (6,1) 3 (5,3) 9 0,6975 Ens. Fund. 22 (22,6) 10 (17,8) 32 Ens. Médio 2 (2) 0 2 Ens. Superior 0 0 0

ÁGUA INGERIDA Filtrada 18 (18,5) 7 (12,5) 25 0,1117 Torneira 12 (12,3) 4 (7,1) 16 ANDAR DESCALÇO Sim 10 (10,3) 0 10 *0,039 Não 20 (20,6) 11 (21,1) 31 MEXER COM TERRA Sim 16 (16,4) 8 (15,3) 24 0,3091 Não 14 (14,4) 3 (5,7) 17

*Qui-quadro ou teste Exato de Fisher. Grupo I (DM2), Grupo II (Não-DM2), DM2= Diabetes mellitus tipo 2

Ao analisar os fatores de riscos independentes para infecção parasitária em

pacientes diabéticos (Tabela 5), não identificamos nenhuma associação para as

variáveis: sexo, grupo etário, nível educacional, tipo de água ingerida, andar descalço

e mexer com terra.

56

Tabela 5: Fatores de risco para infecção parasitária no Grupo I

Fator de risco Infectado/total OR IC95% para OR p*

GENERO Feminino 16/61 0,512 0,211 a 1.245 0,140 Masculino 14/36

IDADE 30-40 0/2 - - - 41-50 5/7 2,143 0,491 a 9,351 0,311 51-60 7/17 1,500 0,428 a 5,259 0,526 61-70 11/24 1,375 0,428 a 4,419 0,593 >71 7/14 - - -

NÍVEL EDUCACIONAL Sem escolaridade 6/18 1,6667 0,3298 a 8,4236 0,536 Ens. Fundamental 23/66 1,6047 0,6225 a 4.1363 0,327 Ens. Médio 1/10 1,1053 0,0359 a 34,0341 0,954 Ens. Superior 0/3 0,7143 0,0103 a 49,7119 0,876

ÁGUA INGERIDA Filtrada 18/64 0,685 0,280 a 1,675 0,407 Torneira 12/33

ANDAR DESCALÇO Sim 10/27 1,471 0,576 a 3,755 0,420 Não 20/70

MEXER COM TERRA Sim 16/45 1,498 0,631 a 3,556 0,360 Não 14/52

*Teste de Regressão logística, OR: Odds ratio; IC: intervalo confiança. Grupo I (DM2: Diabetes mellitus tipo 2)

Com relação aos parâmetros clínicos e laboratoriais (Tabela 6) não foi

encontrada diferença no tempo de DM2 referido pelos pacientes do Grupo I (DM2) entre

aqueles positivos e negativos para enteroparasitoses.

A média de hemoglobina HbA1c, que refere o controle glicêmico dos pacientes

diabéticos (Grupo I), foi maior naqueles positivo para infecção parasitária (Tabela 6). A

média de HbA1c nos pacientes positivos nos exames parasitológicos foi de 9.6 % (±

2,56) e nos negativos foi de 8.4% (±1.57) (p=0,006).

Não houve diferença entre a contagem absoluta de eosinófilos entre grupos I e

II positivos ou não para parasitose, e também não do houve diferença do hematócrito

entre os grupos analisados. Nenhum dos pacientes positivos para S. stercoralis

apresentou eosinofilia (>450 Células/mm3) tanto no Grupo I e Grupo II.

57

Tabela 6: Análise dos parâmetros clínicos e laboratoriais dos Grupos I e II Parâmetros Grupo I (DM2) Grupo II p* Media (DP) Media (DP) HbA1C (%) Positivos 9,66% (±2,56) 5,87 (±0,36) *0.006 Negativos 8,45% (±1,57)* 5,74 (±0,46) HEMATÓCRITO Positivos 37.78% (±3,674) 40,04% (±2,419) 0,875 Negativos 38.02% (±7,756) 38,04% (±3,943) 0,116 EOSINÓFILOS (Células/mm3)

Positivos 237 (±320,4) 205,09 (±119,5) 0,467 Negativos 204 (±119,4) 202,82 (±142,9) 0,936 TEMPO DE DM2 (anos) Positivos 13,16 (±6,77) - 0,932 Negativos 13,04 (±6,387) -

*Teste T student para amostras independentes. DM2: Diabetes mellitus tipo 2, Eosinofilia (>450 celulas/mm3)

58

4.3 Resultados da PCR

Os produtos de amplificação, utilizando os primers para identificação de Gênero

e espécie-Específico, obtidos de uma amostra com parasitológico positivo para S.

stercoralis (controle positivo) foram sequenciados. As sequências obtidas foram

submetidas ao banco de dados do GenBank apresentaram 100% de homologia com a

região 18S do DNA ribossomal de S. stercoralis.

O DNA foi extraído do pool das três amostras de fezes congeladas de cada um

dos 149 participantes. A concentração média de DNA obtida foi de 29,45 ng/µL (±24,90)

no Grupo I, e de 26,61 ng/µL (± 25,25) no Grupo II (p=0,48 IC95% 5,41 a 11, 33).

A PCR utilizando o primer Gênero-específico demonstrou positividade de 40,9%

(61/149) nos dois grupos. Foi observada amplificação do fragmento alvo (~392bp) de

14,4% (14/97) nos pacientes do Grupo I, e também foi encontrado amplificação de um

fragmento inespecífico de aproximadamente 400bp em 21,6% (19/97). No Grupo II (não

diabéticos), houve amplificação do fragmento alvo (~392bp) em 14,1% (6/52) e

amplificação dos fragmentos inespecíficos (~400 e 500bp) em 9,8% (7/52) dos

pacientes. Na Figura 7 está demonstrado à amplificação de DNA das amostras dos

Grupos I e II utilizando o primer Gênero-específico.

Figura 7: Amplificação de DNA utilizando primer Gênero. Amplificação de DNA proveniente de amostras fecais do grupo não diabético (1, 2) e do grupo de diabéticos (3,4,5,6,7,8,9), utilizando primer Gênero (~392bp). CP (controle positivo – amostra positiva para S. stercoralis no parasitológico) e PM (padrão de peso molecular 100bp,X controle negativo da reação. Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific Corporation, Waltham, MA USA).

Para confirmar a alta positividade visualizada no gel de agarose foi realizado o

sequenciamento dos produtos amplificados, utilizando o primer Gênero. De um modo

← 400bp ← 300bp

PM CP 1 2 X 3 4 5 6 7 8 9

392bp → 392bp →

59

geral, as sequências obtidas apresentaram baixa qualidade, e quando comparadas no

banco de dados do GenBank, a sua maioria não apresentou similaridade com as

sequências de S. stercoralis, com exceção de 5 amostras no grupo controle.

A PCR utilizando o primer Espécie-específico demonstrou positividade de 16,1%

(24/149) nos dois grupos. Foi observada amplificação do fragmento alvo (~101bp) de

9,3% (9/97) dos pacientes no Grupo I, e em 28,8% (15/52) no Grupo II. Apesar de haver

diferenças nas intensidade do fragmento alvo amplificado (101bp), todas as amostras

com amplificação positiva foram sequenciadas e confirmadas a sua homologia com as

sequencias de S. stercoralis depositadas na base de dados do GenBank. Na Figura 8

está demonstrado à amplificação de DNA das amostras dos grupos I e II utilizando o

primer Específico.

Figura 8: Amplificação de DNA utilizando primer Específico. Amplificação de DNA proveniente de amostras fecais do Grupo II (1, 2, 3, 4, 5) e do Grupo DM2 (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12), utilizando primer Específico (~101bp). CP (controle positivo – amostra positiva para S. stercoralis no parasitológico) e PM (padrão de peso molecular 100bp, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific Corporation, Waltham, MA USA).

Ao utilizar os dados de amplificação específica de S. stercorlaes para determinar

se Diabetes mellitus tipo 2 é um fator de risco para estrongiloidiase (tabela 7), as

análises estatísticas demonstraram haver uma associação de proteção entre DM2 e

infecção intestinal por S. stercoralis (OR 0,252 IC95% 0,101 a 0,628 p=0,003).

Com relação aos fatores socioedemográficos possivelmente implicados com a

infecção por S. stercoralis (tabela 7), os grupos etários 41-50 a 61-70 apresentaram

uma associação estatística significante com a positividade na PCR (OR:5,6 IC95%

1,174 a 26,722 p= 0,031). Da mesma maneira, o fato de mexer com terra, demonstrou

ser um fator de risco para infecção por S. stercoralis, detectada por técnica molecular

de diagnóstico (OR: 2,202 IC95% 1,071 a 4,528 p=0,032).

PM CP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

101bp →

60

Tabela 7: Fatores de risco associados à infecção por S. stercoralis utilizando diagnóstico molecular#

Fatores de Risco Infectado/total OR IC95% para OR p*

DIABETES

Sim 9/97(9,3%) 0,252 0,101 a 0,628 *0,003 Não 15/52 (28,3%)

GENERO Feminino 16/89 0,610 0,298 a 1.248 0,176 Masculino 8/60

IDADE 30-40 5/10 3,000 ,606 a 14,864 0,178 41-50 5/20 5,600 1,174 a 26,722 *0,031 51-60 5/33 10,250 2,050 a 51,256 *0,005 61-70 5/45 7,200 1,524 a 34,022 *0,013 >71 5/41 - - -

NÍVEL EDUCACIONAL Sem escolaridade 5/31 1,300 0,119 a 14,205 0,830 Ens. Fundamental 12/95 1,729 0,178 a 16,794 0,637 Ens. Médio 6/18 0,500 ,045 a 5,514 0,571 Ens. Superior 1/5

ÁGUA INGERIDA Filtrada 19/98 0, 722 0,34 a 1,506 0,385 Torneira 5/50

ANDAR DESCALÇO

Sim 5/37 0,887 0. 38 a 2,036 0,777 Não 19/112

MEXER COM TERRA Sim 6/66 2,202 1,071 a 4,528 *0,032 Não 18/83

*Teste de Regressão logística, OR: Odds ratio; IC: intervalo confiança #primer espécie-espefício

A análise por regressão logística de fatores de risco para infeção intestinal por

S.stercoralis em pacientes diabéticos (Tabela 8), não apresentou nenhuma associação

de significância para as variáveis: sexo, idade, nível educacional, tipo de água ingerida,

andar descalço e mexer com terra.

61

Tabela 8: Fatores de risco associados à infeção por S. stercoralis em pacientes diabéticos (DM2) utilizando diagnóstico molecular#

Fator de risco Infectado/Total OR IC95% para OR p* GENERO

Feminino 7/54 2,204 0,432 a 11,236 0,342 Masculino 2/34

IDADE (anos) 30-40 0/2 - - - 41-50 3/12 0,130 0,012 a 1,425 0,095 51-60 2/14 0,478 0,040 a 5,658 0,558 61-70 2/35 0,464 0,045 a 4,746 0,517 >71 1/24 - - -

NÍVEL EDUCACIONAL Sem escolaridade 6/18 1,525 0,270 a 8,600 0,633 Ens. Fundamental 5/61 0,500 0,059 a 4,232 0.327 Ens. Médio 2/8 - - - Ens. Superior 0/3 - - -

ÁGUA INGERIDA Filtrada 7/57 2,030 0,395 a 10,4309 0,396 Torneira 2/31

ANDAR DESCALÇO Sim 2/25 0,720 0.140 a 3,706 0.694 Não 7/63

MEXER COM TERRA Sim 16/45 1.498 0.631 a 3.556 0,360 Não 14/52

*Teste de Regressão logística, OR: Odds ratio; IC: intervalo confiança #primer espécie-específico

Com relação aos parâmetros clínicos e laboratoriais (Tabela 9) não foi

encontrada diferença entre HbA1c entre os pacientes diabéticos positivos e negativos

para S. stercoralis, e também não houve relação entre o tempo de Diabetes e a

detecção de S. stercoralis por diagnóstico molecular.

Nessa investigação, a contagem de eosinófilos entre os dois grupos analisados

não se mostrou diferente entre os infectados e não infectados, e nenhum paciente

positivo na PCR para S. stercoralis apresentou eosinofilia (>450 células/mm3) em

sangue periférico. Os indivíduos positivos para parasitose no Grupo I apresentaram um

valor de hematócrito maior que os não parasitados desse grupo (p=0.008). Entre os

indivíduos do Grupo II (não DM2) não houve diferença dos valores de hematócrito.

62

Tabela 9: Análise dos parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes positivos e negativos dos Grupo I e II utilizando método diagnóstico molecular#

Parâmetros Grupo I Grupo II *p

Media (DP) Media (DP) HbA1C (%) Positivos 8.91% (±2,18) 5.66 (±0,45) Negativos 8,82% (±1,9) 5.80 (±0,44) 0,898 HEMATÓCRITO Positivos 43.52% (±17,59) 38,33% (±2,419) 0,718 Negativos 37.37% (±4,25)* 39,86% (±3,943) *0,008

EOSINÓFILOS (Células/mm3)

Positivos 249,33 (±85,38) 205,09 (±119,5) 0,729 Negativos 211,41 (±210,95) 202,82 (±142,9) 0,936

TEMPO DE DM2 (anos) Positivos 12,89 (±3,333) - 0,443 Negativos 14,73 (±7,071) -

*Teste T student para amostras independentes #primer espécie-específico

63

4.4 Comparação dos métodos diagnósticos

A positividade de S. stercoralis considerando todos os métodos diagnósticos

(tabela 10) aplicados nos dois grupos de pacientes foi de 18,79%. No grupo I (DM2) a

ocorrência dessa infecção foi de 10,3%, e no Grupo II (não diabéticos) foi de 34,6%. A

diferença de positividade apresentou significância estatística, e demonstrou haver uma

associação de proteção entre DM2 e infecção intestinal por S. stercoralis (OR: 0.2171

IC 95% 0.0911 a 0.5176, p=0,0006).

Tabela 10: Métodos de diagnóstico parasitológico e molecular para detecção de S. stercoralis nos Grupos I e II. *Parasitológico PCR#

n Positivo Negativo Positivo Negativo

Grupo I 97 1 (1%) 96 (99%) 9 (9,2%) 88 (90,7%)

Grupo II 52 3 (5,7%) 49 (94,6%) 15 (28,8) 37 (71,1%)

149 4 (2,6%) 24 (16,1%)

*Métodos: Cultura em ágar, Rugai e sedimentação espontânea #Primer específico

A concordância entre as técnicas de exames parasitológicos e PCR utilizando o

primer específico na detecção da infecção está descrita na tabela 11. No Grupo I, o

único caso detectado de S. stercoralis pelo método de sedimentação espontânea, não

apresentou amplificação na PCR. Da mesma maneira as três amostras positivas nos

métodos parasitológicos empregados no Grupo II também não apresentaram

amplificação na PCR.

Tabela 11: Concordância entre os exames parasitológicos e PCR na detecção de S. stercoralis nos Grupos I e II (n=149).

n Parasitológico PCR# Rugai Cultura

ágar Sedimentação Positivo Negativo

Grupo I 1 - - + 0 1 88 - - - 9 87

Grupo II 1 + + + 0 1 1 + - + 0 1 1 - - + 0 1 49 - - - 15

34

Grupo I = DM Grupo II = Controles Coeficiente Kappa (κ) = -0,048 IC95% -0,092 a -0,013) #Primer específico

64

Entre os 9 casos positivos para S. stercoralis do Grupo I na PCR utilizando o

primer específico, 4 apresentaram resultados positivos nas técnicas parasitológico para

outros parasitas, sendo que em 1 paciente foi detectada a presença de G. lamblia. Nos

pacientes do Grupo II, somente 1 paciente positivo na PCR apresentou positividade nos

exames parasitológicos para outros parasitas.

65

5. DISCUSSÃO

A estrongiloidiase é uma doença tropical negligenciada e pode se tornar uma

condição clínica de grande importância. Normalmente os exames de detecção

utilizados na atenção básica de saúde apresentam reduzida sensibilidade, apesar de

serem bastante específicos. (DONG et al., 2016).

No presente estudo, a frequência de S. stercoralis utilizando os métodos

parasitológicos e PCR foi de 18,7% nos dois grupos analisados. Uma positividade bem

elevada, como revisado por PAULA, COSTA-CRUZ (2011), em estudo de aspectos

epidemiológicos da estrongiloidiase no país. Autores compilaram dados que apontaram

algumas regiões no Brasil com altas taxas de positividade, como 14% na região norte,

12% no sudeste e de 17,3% no sul do pais.

Os exames parasitológicos foram capazes de identificar somente um (1.03%)

paciente portador de DM2 positivo para S. stercoralis, e 3 (5,7%) indivíduos do grupo

não diabético, não havendo diferença estatística entre os grupos (p=0,1421). No estudo

de BORA, et al 2016, que avaliou a prevalência de parasitoses intestinais em várias

condições de imunossupressão, no grupo de pacientes portadores de DM2 e

complicações crônicas, os autores não relataram positividade para S. stercoralis

utilizando métodos direto de detecção.

MOHTASHAMIPOUR et al., (2015) avaliando pacientes ambulatoriais,

empregando técnicas parasitológicas simples, também não descrevem a presença de

S. stercoralis nessa condição específica. AKINBO et al., (2013) em estudo conduzido

em área endêmica em pacientes ambulatoriais, através de exames parasitológicos, não

relataram a presença de S. stercoralis em DM2. CABRAL et al., (2015) utilizando a

técnica de Baermann-Moraes identificaram em pacientes diabéticos hospitalizados a

prevalência de 4,9% de infecção pelo S. stercoralis, mas não foi constatada uma

associação significativa entre diabetes e estrongiloidíase.

Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que os exames

parasitológicos diretos podem apresentar uma grande falha na detecção do S.

stercoralis, principalmente nos pacientes portadores crônicos assintomáticos ou com

sintomatologia mínima, sendo necessária a utilização de combinação de técnicas para

a correta exclusão diagnóstica. Porém esses métodos requerem várias amostras de

fezes frescas e um profissional bem experiente na identificação (SIDDIQUI, A. A.;

BERK, S. L, 2001; BLATT; CANTOS; (2003)

66

Com a utilização de imunodiagnóstico para detecção de S. stercoralis já

encontramos um cenário diferente de prevalência em pacientes com DM2.

MENDONÇA et al. (2006) utilizando técnica de ELISA, imunofluorescência indireta e

Western Blotting, para detectar anticorpo IgG específico para S. stercoralis em

pacientes diabéticos, encontraram uma alta positividade, com uma possível associação

de fator de risco independente de 3,9 (p<0.05). HAYS et al., (2016) encontraram

positividade de 25% utilizando diagnóstico por ELISA em pacientes diabéticos, e a

razão de chance para estrongiloidiase foi de 2,8 (p<0,05).

A literatura aponta que os métodos sorológicos baseados na detecção de

anticorpos circulantes contra o S. stercoralis funcionam melhor em pacientes que não

apresentam alteração do sistema imunológico, e em adição, e também não possuem a

capacidade de diferenciação entre as diferentes formas clínicas da estrongiloidíase

(DONG et al., 2016). O emprego de antígenos purificados de S. stercoralis tem

possibilitado o desenvolvimento de testes diagnósticos mais confiáveis, uma vez que

apresentam sensibilidade e especificidade superiores aos antígenos obtidos de

extratos totais, e podem ser aplicados como uma ferramenta importante no

imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana relacionada à imunossupressão (SILVA,

2014).

O uso de técnica de PCR para diagnóstico de protozoários e helmintos em

amostras fecais tem demonstrado maior sensibilidade que as técnicas convencionais,

principalmente em situações de baixa carga parasitária (VERWEIJ et al., 2009;

TANIUCHI et al., 2011; REPETTO et al., 2016). No presente estudo a técnica de PCR

utilizando o primer Gênero demonstrou alta positividade nos dois grupos, mas a maioria

dos resultados positivos não apresentou similaridade com as sequências de DNA de S.

stercoralis, com exceção de 5 amostras no grupo controle. PAULA et al., (2013)

descrevem que sequências de produtos de PCR a partir de DNA obtido de larvas

filariforme utilizando primer Gênero, mostraram uma similaridade mais baixa com as

sequencias de DNA de S. stercoralis depositadas na base de dados GenBank. Os

autores acreditam que a presença de bandas inespecíficas podem ocorrer porque o

primer (iniciador) Gênero amplifica uma região diferente 18S do gene do RNA

ribossomal, em vez da região específica dos nematoides.

Com a utilização do primer Especifico, a frequência de infecção por S. stercoralis

em todas as amostras de fezes foi de 16,10%. E as 24 amostras com amplificação

positiva foram sequenciadas e apresentaram 100% de homologia no banco de dados.

67

SITTA et al. (2013) descrevem que a utilização de primer espécie-específico

apresentou boa sensibilidade na detecção de S. stercoralis em fezes humanas. E que

a sua utilização em conjunto com exames parasitológicos podem ser aplicados em

estudos epidemiológicos, a fim de aumentar a capacidade de detecção dessa infecção,

principalmente em pacientes imunocomprometidos que estejam em risco de

desenvolvimento da forma fatal da estrongiloidiase.

Para aumentar a sensibilidade do método no diagnóstico de S. stercoralis a

escolha do primer é muito importante. O iniciador (primer) gênero-especifico utilizado

para analisar a presença de DNA de larvas de S. stercoralis, produz fragmentos de

392pb. Mas a sua utilização, pode estar associada ao aparecimento de bandas não

específicas, pois esse iniciador pode amplificar regiões ubíquas da subunidade 18S do

gene do RNA ribossomal, ao invés de regiões específicas do nematódeo (DORRIS et

al., 2002). A utilização de iniciador espécie-específico, produz fragmento de 101pb, e

tem sido descrito na literatura como marcadores mais específicos para o gênero

Strongyloides sp (VERWEIJ et al., 2009). MOGHADDASSANI et al., (2011)

demonstraram que a presença de resultados falso negativos com a utilização de técnica

de PCR podem ser atribuídos ao tamanho do fragmento de DNA amplificado.

A extração de DNA é o procedimento crucial para o aumento da sensibilidade da

PCR em detectar o S. stercoralis. A cutícula dos nematoides confere uma importante

barreira química, enzimática e física (DAWKINS; SPENCER, 1989). Por essa razão,

REPETTO et al. (2013) descreveram uma variação do protocolo de extração de DNA,

que aumentou a performance do método de PCR, mas extremamente trabalhosa. No

presente estudo a quantificação de DNA após a extração se mostrou satisfatória nos

dois grupos analisados.

Deve ser observado que a eficiência das reações de amplificação de PCR

depende de diversos fatores, tais como: o cuidado nas pipetagens, a qualidade e

integridade das amostras, desenho dos primers, qualidade e quantidade dos reagentes,

condições de termociclagem e também o tamanho do produto amplificado (KUBISTA

et al., 2006). Todas as condições específicas para cada experimento foram

padronizadas a fim de aumentar a eficiência diagnóstica nesse estudo.

Quatro sujeitos de pesquisa (1 diabético e 3 não diabéticos) foram positivos nas

técnicas parasitológicas para S. stercoralis mas não apresentaram amplificação de

DNA em ambos os primers utilizados. KNOPP et al., (2014) na Tanzânia, também

encontrou uma sensibilidade baixa (30, 9%) na utilização de PCR convencional para

68

detecção em infeções com baixa carga parasitária de S. stercoralis, e SULTANA et al.

(2013) também descrevem que nessas condições, a PCR quantitativa conseguiu

identificar apenas 15% dos casos positivos em técnica parasitológica para S.

stercoralis.

Uma outra possível explicação para a não concordância entre a positividade para

S. stercoralis nos métodos parasitológicos e PCR, se deve a quantidade de fezes

utilizadas nos testes parasitológicos serem aproximadamente 40 vezes maior do que

usada para isolamento de DNA. No presente estudo optou-se por fazer um pool de

600mg das três amostras coletas consecutivas a fim de diminuir essa influência

negativa nos resultados da PCR.

Outro fator que deve ser considerado em ensaios que utilizam técnica de PCR

para diagnóstico de parasitose, se deve ao fato de que em amostras de fezes, podemos

encontrar substancias que podem inibir a amplificação de DNA como descrito por

REPETTO et al. (2013). Por esse fato, faz-se necessário a utilização de um controle

interno de reação nos experimentos.

Por outro lado, estudos que avaliaram a presença de DNA de S. stercoralis em

amostras de fezes em situações de baixa eliminação parasitária, indicam que a

utilização de técnica de PCR pode ser uma ferramenta útil nesses casos (VERWEIJ et

al., 2009). ZUETER et al., (2014) particularmente descrevem que a qPCR pode detectar

e quantificar uma pequena quantidade de DNA do parasita e gerar uma positividade de

2 a 3 vezes maior que a de métodos parasitológicos e serológicos em pacientes

imunossuprimidos. Estudo recente realizado no Quênia, em indivíduos infectados pelo

vírus da imunodeficiência humana, a qPCR foi capaz de detectar mais infecções por S.

stercoralis (sensibilidade, 83,3%) do que a combinação das técnica de Kato-Katz e

Técnica de concentração de formalina-éter modificada (sensibilidade, 16,7%),

(ANAMNART et. al.,2013).

Em revisão da literatura, os dados sobre a utilização de técnicas moleculares

para o diagnóstico de S. stercoralis em pacientes diabéticos são limitados,

principalmente relacionados ao rastreamento de portadores crônicos assintomáticos.

Os resultados encontrados no presente estudo, apontam para uma melhor

especificidade da técnica de PCR convencional quando se utiliza o primer espécie

específico. A prevalência de S. stercoralis no grupo controle (28,8%) foi maior que o

grupo de pacientes DM2 (9,3%), e essa diferença foi estatisticamente diferente

(p=0,004). Os resultados demonstram haver uma associação de proteção entre DM2 e

69

S. stercoralis. Como descrito na literatura, infecções helmínticas estão associadas a

menor prevalências de patologias imunológicas, como alergia e doenças autoimune,

devido a habilidade de induzir uma resposta imune do tipo Th2 (EL-MALKY et al., 2013).

DM2 também é vista como uma doença inflamatória não relacionada a um antígeno

específico, e o excesso de alimentação, cronicamente, pode ativar várias vias

inflamatórias em vários órgãos, que podem levar ao aumento da resistência insulínica,

e com o tempo desencadear diabetes mellitus tipo 2. Como infecções helmínticas levam

a mudança do padrão de reposta imune para um padrão de reposta anti-inflamatória,

contribuindo assim para diminuição da resistência insulínica, sendo esse efeito

traduzido como um fator de proteção dos helmintos em relação ao DM2 (WIRIA et al.,

2014).

Embora o aumento alarmante da carga mundial de DM2, especialmente em

países de baixa e média renda, esteja relacionada a fatores muito bem estabelecido,

como sedentarismo, alimentação, tabagismo, estresses, fatores de risco genético,

pode-se supor que a diminuição concomitante de exposição a certos patógenos, como

helmintos, também pode estar contribuindo para a forte emergência de DM2 (WIRIA et

al.,2014). E estudos epidemiológicos em diferentes populações têm relatado uma

associação inversa entre helmintos e doenças metabólicas (NAZLIGUL et. al., 2001,

WIRIA et. al., 2014).

Estudos transversais relataram uma ligação entre infecções por diferentes

espécies de helmintos e doenças metabólicas, incluindo S. stercoralis (NAZLIGUL et.

al., 2001; MENDONÇA et. al., 2006; ARAVINDHAN et. al., 2010; WU et. al., 2011;

CHEN et. al., 2013; YANG et. al., 2013; WIRIA et. al., 2014; HAYS et. al., 2015; SHEN

et. al., 2015; HUSSAARTS et. al., 2015; HAMS et. al., 2016). Três estudos inicialmente

relatam o estado diabético como um fator de risco para susceptibilidade à infecções por

helmintos (MENDONÇA et. al., 2006; ARAVINDHAN et. al., 2010).

Em um estudo realizado na Turquia, a prevalência de parasitas intestinais foi

significativamente menor entre os pacientes com diabetes, em comparação com o

grupo controle de não-diabéticos (NAZLIGUL et. al., 2001). ARAVINDHAN et. al. (2010)

observaram uma prevalência significativamente menor de filariose linfática em

indivíduos diabéticos em comparação com indivíduos pré-diabéticos e não diabéticos.

CHEN et. al. (2013) detectou que a prevalência de DM2 e síndrome metabólica foi

significativamente menor no grupo com infecções esquistossomóticas (PSI) quando

comparado ao grupo não PSI (14,9% vs 25,4%, P <.0001, 14,0% vs 35,0%, P <.0001,

70

respectivamente). Além disso, a PSI foi associada a níveis mais baixos de índice de

massa corporal (IMC), glicemia plasmática em jejum (GPJ), glicemia pós-prandial

(GPB), hemoglobina glicosilada A1c (HbA1c) e HOMA-IR (resistência insulínica).

Meta-análise mais recente, incluindo quatro dos estudos acima mencionados,

mostrou que indivíduos que tiveram infecção por helmintos foram 50% menos

propensos a desenvolver algum grau de disfunção metabólica (hiperglicemia, DM2,

síndrome metabólica ou resistência à insulina) em comparação com os não infectados

(OR 0,50; IC 95%: 0,38-0,66) (TRACEY et al. 2016). No entanto, estudos transversais

são limitados em fornecer informações sobre a relação causal entre helmintos e

doenças metabólicas sendo necessário a realização de estudos longitudinais para

obtenção real dessa relação.

No presente estudo não foi encontrado associação entre eosinofilia (>400

células/mm3) e positividade parasitológica nos dois grupos analisados. Os pacientes

positivos para S. stercoralis nos dois grupos também não apresentaram aumento de

eosinófilos no sangue periférico. Sabe-se que a eosinofilia é comum nas infecções por

S. stercoralis, principalmente na fase aguda da infecção, e se torna menos pronunciada

nos casos crônicos (KLION; NUTMAN, 2004). HAYS et al. (2016) ao analisarem a

presença de eosinofilia como teste para indicar infeção por S. stercoralis, encontraram

uma sensibilidade de 60,0% e especificidade de 71%, e os pacientes diabéticos tivera

um valor preditivo negativo maior (87,5% versus 64,3%). CABRAL et al. (2015)

encontraram associação positiva entre eosinofilia e estrongiloidíase em pacientes

portadores de condições imunodepressoras, mas os autores não analisaram esta

relação somente no grupo de diabéticos.

Não houve diferença do controle metabólico (HbA1c) entre os pacientes

portadores de DM2 positivos e negativos na PCR para S. stercoralis. Também não

encontramos diferença no tempo de diabetes entre esses pacientes. Sabe-se que os

níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1c) representam o melhor método para

demonstrar o controle metabólico crônico. Ao correlacionar a frequência de infecção

por S. stercoralis e níveis de HbA1c, pretende-se estimar a relação existente entre o

controle inadequado da glicemia e a chance desses pacientes permanecerem

cronicamente infectados. MENDONÇA et.al., (2006) descreveram que os pacientes que

apresentaram melhor controle metabólico (HbA1c <7%) foram menos positivos para S.

stercoralis (9% vs.14%) em técnicas de imunodiagnótico.

71

Apesar de parasitas intestinais na maioria das vezes causarem doenças de

evolução benigna, às vezes podem estar associados a complicações com alta

morbidade e mortalidade. Protozoários e helmintos são os patógenos de maior

importância como agentes etiológicos de infeção parasitaria em pacientes com

comprometimento imunológico, uma vez esses pacientes apresentam algum grau de

alteração da resposta imunológica, podendo levar a desfechos clínicos desfavoráveis

(CIMERMAN et al., 1999).

O DM2 tem sido designado como uma condição clínica de

imunocomprometimento (MOAZEZI et al., 2014), e alguns dados na literatura tem

demonstrado alta prevalência de parasitoses em pacientes diabéticos (ELNADI et al.,

2015; MOHTASHAMIPOUR et al., 2015SA; BAH; TEMSAH, 2015).

No presente estudo foi observada uma positividade de 30,9% de infeção

parasitária em pacientes diabéticos, sendo14 mulheres e 16 homens, sem diferença

estatística entre os gêneros. Uma taxa bastante elevada como descrito por alguns

trabalhos (AKHLAGHI et al., 2005; AKINBO et al., 2013; ELNADI et al., 2015), porém

não encontramos associação entre a presença de infeção parasitária e o fato de ser

portador de DM2 (OR= 1,481, IC95% 0.8335 a 4.0256, p=0,3080).

AKINBO et al., (2013) encontraram uma positividade de 18,7% de infecções

parasitárias em pacientes diabéticos e essa condição foi um fator de risco independente

para infecção parasitaria intestinal (OR = 14.192, IC95%0.842-239.22, p= 0.02).

AKHLAGHI et al., (2005) encontraram uma taxa de infecção de 15% em pacientes

diabéticos, e essa foi maior que o grupo controle, porém não foi demonstrado

associação entre DM e parasitose intestinal. ELNADI et al., (2015) relatam que

parasitas intestinais foram encontrados em 25% no pacientes no grupo portador de

diabetes e em 7% no grupo controle, sendo o risco relativo estimado de 4.6 (p<0.05).

Estudo de NAZLIGUL; SABUNCU; OZBILGE, (2001); demonstrou parasitose

intestinal em 47%(94/200) dos pacientes diabéticos, sendo 61 mulheres e 33 homens.

Essa prevalência encontrada no grupo DM2 foi significativamente inferior em relação à

encontrada grupo controle (47% versus 55%, p<0,05). Não foi encontrada diferenças

com relação à incidência de parasitoses intestinais entre pacientes do sexo masculino

e do sexo feminino (45,8 e 47,6%, respectivamente).

TANGI et al. (2016) demonstraram uma prevalência de 10%, de parasitose em

pacientes diabéticos e 23,5% no grupo controle, e associação entre DM e parasitose

foi significativa. Diante do resultado, o autor descreve uma associação de proteção

72

entre DM2 e infecção parasitária, em função da alta prevalência encontrada no grupo

controle.

Diante da alta positividade (30,9%) para parasitose em pacientes diabéticos

encontrada, os dados sugerem que o controle da infecção e a eliminação intestinal de

parasitas e comensais pode estar prejudicada nesses pacientes, porém o mecanismo

exato dessa alteração ainda não está totalmente esclarecido. Sabe-se que o controle

da infeção parasitária é feito pela resposta imune inata e adaptativa, sendo a resposta

celular específica, principalmente a mediada pelas células T, a mais importante para a

eliminação dos parasitas pelo intestino (STARK et al., 2009). No DM2 além das

alterações descritas no funcionamento de neutrófilos e macrófagos, as alterações do

funcionamento das células T ainda são conflitantes (STEGENGA et al., 2008).

Alguns estudos demonstram alteração da resposta de linfócitos em pacientes com

mau controle metabólico (CASEY; HEETER; KLYSHEVICH, 1977), e também

alterações da quimiotaxia, adesão e fagocitose de polimorfo mononucleares em

pacientes diabéticos (DELAMAIRE et al., 1997). Mas a associação entre essas

alterações e o efeito que o mau controle metabólico possa exercer sobre elas ainda

requer comprovação experimental (GEERLINGS; HOEPELMAN, 1999).

A idade e condições sanitárias afetaram de forma significativa a prevalência de

parasitose no estudo de AKINBO et al. (2013). Os autores descreveram maior

prevalência de positividade na faixa etária entre 51-60 anos. No presente estudo, as

variáveis: idade, nível de escolaridade, ocupação, fonte de água, mexer com terra e

andar descalço não afetaram de maneira significativa a prevalência de parasitoses

intestinais em pacientes com DM e nem no grupo controle. No estudo de

MOHTASHAMIPOUR et al.(2015), os autores relataram que a presença de sintomas

gastrointestinais e ter animais domésticos foram os fatores de risco associados à

positividade nos exames parasitológicos nos grupos avaliados.

Não foram observadas diferenças nas taxas de infeção por organismos

patogênicos ou oportunistas nos dois grupos analisados. Cinco parasitas intestinais

foram identificados nos participantes diabéticos, sendo dois tipos de Helmintos (H.

nana, S. stercoralis), e três tipos de Protozoários (G. lamblia, E. histolytica e B.

hominins). TANGI et al. (2016) também descreveram dois helmintos (A. lumbricoides e

Ancilostoma sp.) e três tipos de protozoários (E. histolytica, B. hominis C. parvum) em

seus grupos de pacientes, e E. hitolytica foi o parasita mais prevalente (2,7%) tanto em

DM quanto no grupo controle. AKINBO et al.,(2013) encontraram A. lumbricoides

73

apenas nos pacientes com DM, e as infeções mais prevalente nesse grupo foram por

ancilostomídeos (10.6%), seguido por A. lumbricoides (7,6%) e 1,5% por E. histolytica.

Assim como no estudo de MOHTASHAMIPOUR et al.,(2015) o protozoário B.

hominis foi o de maior prevalência (12,4%) no grupo de pacientes DM2. Tem sido

descrito na literatura uma maior prevalência de B. hominis em pacientes portadores de

condições de imunocomprometimento, como em portadores de HIV (ZALI et al., 2004)

e em pacientes dialíticos (BARAZESH et al., 2015). É levantada a hipótese de a quebra

da integridade da defesa imunológica da mucosa intestinal nesses pacientes favorece

a infecção por esse parasita, situação muito parecida com as descritas em pacientes

diabéticos.

Não houve diferença dos valores de hematócrito entre os pacientes diabéticos

positivos e negativos para parasitose, e nem quando comparamos com os sujeitos de

pesquisa do grupo controle. O tempo de diagnóstico de DM2 também não influenciou

na positividade do exame parasitológico. No estudo de AKINBO et al.,(2013) o tempo

de doença também não afetou essa positividade, porém nossos pacientes tinham mais

tempo de doença (13 anos) do que os pacientes do estudo referido (3 anos). Diferente

de nosso estudo, os autores descreveram que os pacientes diabéticos positivos para

parasitoses tiveram mais anemia quando comparados com pacientes diabéticos não

positivos (p=0,016).

No grupo DM2, os pacientes que apresentaram pior controle metabólico, ou seja,

uma média de A1c maior, (9.66% versus 8,45 %) tiveram de uma maneira significativa

mais resultados positivos para infecções parasitárias (p=0,023).

ELNADI et al., (2015) também descreveram uma maior positividade de

parasitoses em pacientes que apresentavam pior controle glicêmico. Classicamente a

literatura descreve que paciente com controle metabólico inadequado, e que

apresentam consequentemente maiores níveis de HbA1c, são mais susceptíveis a

infeções, configurando assim um estado de imunocomprometimento (TANAKA, 2008;

KNAPP, 2013). Segundo a associação americana de diabetes (2002) pacientes mal

controlados do ponto de vista metabólico apresentam maiores chances de

complicações microvasculares, e que estas alterações poderiam estar implicadas nas

alterações da resposta imune da mucosa intestinal. Estudos sugerem que as alterações

da microcirculação podem estar envolvidas na quebra da integridade da mucosa

intestinal desses pacientes, predispondo os mesmos a infecções parasitárias

(TANAKA, 2008; KNAPP, 2013; MOHTASHAMIPOUR et al.;2015).

74

A maioria dos métodos aplicados no diagnóstico de enteroparasitoses em especial

a estrongiloidiase apresentam vantagens e desvantagens, e geralmente apresentam

limitações em sua utilização. A combinação de métodos parasitológicos e moleculares

podem levar a resultados mais rigorosos. O tamanho da amostra foi um fator de

limitação nesse estudo, mas apresentou capacidade suficiente em demonstrar uma

diferença de infecções parasitárias entre pacientes diabéticos e pessoas não

diabéticas.

75

6. CONCLUSÃO

No presente estudo, a frequência de S. stercoralis foi de 18,7% nos dois grupos

analisados (DM2 e não DM2). A técnica de PCR utilizando primer espécie-específico

demonstrou uma positividade foi de 16,1%, já as técnicas parasitológicas

demonstraram uma positividade foi de 2,7%. Os dados descritos apontam para uma

associação de proteção entre DM2 e S. stercoralis.

A utilização de primer gênero apresentou uma positividade maior, porém

sequências obtidas apresentaram baixa qualidade, e quando comparadas no banco de

dados GenBank, e a sua maioria não apresentou similaridade com as sequências de

S. stercoralis. Já com a utilização de primer espécie-específico, todas as amostras com

amplificação na PCR apresentaram homologia com banco de dados.

Não houve concordância de significância estatística entre as técnicas

parasitológicas e moleculares na detecção de S. stercoralis nos grupos de pacientes

analisados, porém a PCR utilizando primer Específico apresentou maior capacidade de

detecção de portadores assintomáticos.

No presente estudo foi encontrada uma alta positividade de infecção parasitária

em pacientes diabéticos, e aqueles positivos nos exames parasitológicos apresentaram

média de hemoglobina glicosilada (A1c) maior, sugerindo que um pior controle

metabólico seja um fator de risco para infeção parasitária. Apesar dos métodos

parasitológicos terem apresentado elevada positividade para outras enteroparasitoses,

eles não apresentaram capacidade de detecção de S. stercoralis em pacientes

diabéticos.

Conclui-se que o diagnóstico molecular utilizando o primer espécie-específico pode

ser utilizado como uma ferramenta importante para diagnóstico da estrongiloidíase,

principalmente nas formas subclínicas, onde ocorre baixa eliminação de larvas,

condição que dificulta a sua detecção pelos métodos parasitológicos.

76

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8. ANEXOS e APÊNDICES ANEXO A

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ANEXO B

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA

LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário (a), desta pesquisa. Após ser esclarecido (a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa você não será penalizado de forma alguma. Em caso de dúvida você poderá procurar o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás pelos telefones (62) 3521-1215 /1076 INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA: Título do Projeto: “Avaliação do perfil parasitológico, imunológico e molecular da estrongiloidíase em pacientes com Diabetes mellitus” Pesquisador Responsável: Profa. Dra. Rosângela Maria Rodrigues Telefone para contato: (64)3606-8286/ 3632-7261 e (64) 9623-2172 – aceita ligação a cobrar Pesquisadores participantes: Prof.ª. Esp. Márcia Carolina Mazzaro, Técnico em Análises Clínicas Curso de Biomedicina João Batista Alves de Souza Acadêmicos do Curso de Biomedicina: Jefferson Elias de Oliveira; Laura Vilela Souza Discente de pós-graduação: Émelin Alves dos Santos - Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Saúde Regional Jataí Descrição da pesquisa: A sua participação será de grande importância para o nosso estudo. Através dela poderemos verificar a presença de infecção por um parasito chamado Strongyloides stercoralis. Para tal, precisamos do seu consentimento para obtenção de três amostras de fezes e uma de sangue para realização do diagnóstico parasitológico e imunológico e também para termos acesso ao seu prontuário para anotarmos os dados laboratoriais e clínicos. Se você concordar em participar deste estudo entregaremos um pote de plástico, para que o Sr. (a) em sua residência proceda a coleta de amostras de fezes, posteriormente entregaremos os potes seguintes até completar as três amostras. Os potes poderão ser entregues nos postos de saúde, ou no centro médico, ou se não for possível levar até esses locais, buscaremos em sua residência. Nessa amostra de fezes serão realizados testes para pesquisa de parasito intestinal (Strongyloide stercoralis), e caso seja positivo, será oferecido tratamento gratuito. Também, se o senhor concordar, será coletada 1 amostra de seu sangue (10 mililitros, ou o correspondente a uma colher de sobremesa) para ser submetido a exames laboratoriais exclusivamente destinado a este estudo. Na amostra de sangue faremos o diagnóstico

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para verificar a presença de anticorpos contra este parasito. Esta punção venosa para exames laboratoriais podem resultar em dor no local da punção ou manchas rochas transitórias chamadas de equimoses.

As amostras de fezes e as de sangue serão acondicionados em caixas de isopor separadamente e conduzidas para o Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal da Regional Jataí onde serão analisadas. O benefício do estudo é conhecer quantos pacientes que tratam diabetes apresentam essa infecção. Seu nome não será exposto em hipótese alguma. As fezes serão identificadas por números. Serão garantidos o anonimato e sigilo das informações, além da utilização dos resultados para fins unicamente científicos.

O Sr. (a) poderá solicitar informações ou esclarecimentos sobre o andamento da pesquisa a qualquer momento, pelos telefones informados acima. O Sr. (a) poderá retira-se do estudo e poderá não permitir a utilização de seus dados em qualquer momento. Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento para o Sr. (a) pela sua participação na pesquisa. Se o Sr. Tiver algum gasto com o seu transporte para a entrega das fezes ou para a coleta do sangue, estes serão ressarcidos pela equipe. Se houver a necessidade do Sr.(a) se alimentar após a coleta de sangue, será oferecido um lanche no local da coleta.

Os riscos referentes sua participação na pesquisa possíveis poderão ser decorrentes da punção venosa periférica para coleta de sangue, e caso ocorram serão acompanhados e tratados pela equipe médica gratuitamente, além da indenização para cobrir eventuais custos adicionais decorrentes desses problemas. ___________________________________________________________________

Assinatura do membro da equipe Telefone para contato: (64) 9623-2172 Comitê de Ética: (62) 3521-1215 /1076

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Termo de Anuência Institucional Eu _________________________________________________________________, me responsabilizo pela participação de ____________________________________________ no projeto de pesquisa intitulado “Avaliação do perfil parasitológico, imunológico e molecular da estrongiloidíase em pacientes com Diabetes mellitus”

Este projeto será realizado no Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Goiás Regional Jataí.

Estou ciente de todos os procedimentos abaixo relacionados serão realizados no Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Goiás

- Coleta de três amostras de fezes, para realização de exames coproparasitológicos e análise molecular.

- Coleta de uma amostra de sangue (10ml), para a realização da análise sorológica para estrongiloidíase.

Terei a garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida a cerca de procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a investigação. Terei a liberdade de me retirar da pesquisa a qualquer momento em que desejar, sem a necessidade prévia de explicações. Estarei ciente que a amostra de soro obtida pela coleta do sangue poderá ser utilizada para realização de outras pesquisas clínicas pelos pesquisadores no intervalo de 10 anos.

Enfim, tendo sido orientado quanto ao teor de todo o aqui mencionado e compreendido a natureza e o objetivo do já referido estudo, manifesto meu livre consentimento em participar, estando totalmente ciente de que não há nenhum valor econômico, a receber ou a pagar, por minha participação.

Será respeitado o caráter confidencial das informações fornecidas, não sendo permitida minha identificação.

Autorizo amostra de sangue para pesquisas futuras ( ) Não autorizo ( )

Jataí, _____ de __________________ de 201__

Assinatura do Responsável

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ANEXO C

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APÊNDICE A

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA QUESTIONÁRIO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO Nome:__________________________________________________________ Sexo: F ( ) M ( ) Idade: _______________ DM tipo: I ( ) II ( ) Ausente ( ) Nº do prontuário: ___________________ 1- Cor ou raça: ( ) Branca ( ) Preta ( ) Parda ( ) Amarela ( ) Indígena 2- Escolaridade: ( ) Ensino Fundamental ( ) Ensino Médio ( ) Ensino Superior ( ) Sem escolaridade 3- Ocupação: ( ) Aposentado ( ) Desempregado ( ) Trabalha. Com quê? _____________ 4- Qual a renda mensal de sua família? ( ) Até 1 salário mínimo ( ) De 1 a 3 salários mínimos ( ) De 3 a 6 salários mínimos ( ) De 6 a 9 salários mínimos ( ) Mais de 9 salários mínimos 5- Existência de diabetes na família: ( ) Sim. Grau de parentesco: _________ ( ) Não 6- Tempo do diagnóstico: ___________ 7- Tipo de tratamento: ( ) Dieta ( ) Dieta e medicamento oral ( ) Dieta e insulina ( ) Dieta, medicamento oral e insulina ( ) Outro _________________________ 8- Tempo de tratamento: ____________ 9- Você possui alguma outra doença crônica? ( ) Hipertensão arterial ( ) Sobrepeso/obesidade ( ) Outra _______________________ 10- Dificuldades com o tratamento: ( ) Fazer a dieta ( ) Tomar a medicação ( ) Fazer atividade física ( ) Não fumar ( ) Não fazer uso de bebida alcoólica ( ) Outra ________________________ 11- Você possui alguma outra doença relacionada ao diabetes?

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( ) Infarto agudo do miocárdio ( ) Acidente vascular cerebral ( ) Pé diabético ( ) Amputação por diabetes mellitus ( ) Doença renal ( ) Outras _______________________ 12- Você costuma fazer teste de glicemia? ( ) Sim. Frequência: ___________________ ( ) Não

13- Você sabe o que é estrongiloidíase? ( ) Sim ( ) Não 14- Você sabe como se contrai estrongiloidíase? ( ) Sim. Como? _______________________ ( ) Não 15- Já foi diagnosticado com estrongiloidíase? ( ) Sim ( ) Não

16- A água que você costuma ingerir? ( ) Torneira ( ) Fervida ( ) Filtrada 17- Em sua casa tem: -Água encanada? ( ) Sim ( ) Não -Instalação sanitária? ( ) Sim ( ) Não 18- Após ir ao banheiro você lava as mãos? ( ) Sim ( ) Não Em caso afirmativo: ( )Água e sabão ( ) Somente água 19- Você lava as mãos antes das refeições? ( ) Sim ( ) Não ( ) Algumas vezes 20- Lava os alimentos antes de consumi-los? ( ) Sim ( ) Não ( ) Algumas vezes 21- Costuma andar descalço? ( ) Sim ( ) Não ( ) Algumas vezes

22- Você tem hábito de mexer com terra? ( ) Sim ( ) Não 23- Você já fez exame de fezes? ( ) Sim ( ) Não

24- Em caso afirmativo, há quanto tempo foi feito o último exame? ( ) 03 meses atrás ( ) 06 meses atrás ( ) 01 ano atrás ( ) Mais de 01 ano ( ) Não sei 25- Há quanto tempo você tomou vermífugo? ( ) 03 meses atrás ( ) 06 meses atrás ( ) 01 ano atrás ( ) Mais de 01 ano ( ) Nunca tomou Em caso afirmativo: ( ) Sob recomendações do médico ( ) Auto medicação

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