DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E LARVAL DE · 2016. 4. 12. · período embrionário dos peixes...

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E LARVAL DE

Colossoma macropomum, Piaractus brachypomus E DO

HÍBRIDO TAMBATINGA

Mayanny Carla de Carvalho Lima

Orientador: Prof. Dr. Emmanuel Arnhold

GOIÂNIA

2014

iii

MAYANNY CARLA DE CARVALHO LIMA

DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E LARVAL DE

Colossoma macropomum, Piaractus brachypomus E DO

HÍBRIDO TAMBATINGA

Dissertação apresentada para obtenção do

grau de Mestre em Ciência Animal junto à

Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás.

Área de Concentração:

Produção Animal

Orientador:

Prof. Dr. Emmanuel Arnhold – U.F.G.

Comitê de orientação:

Profa. Dra. Maria Lúcia Gambarini Meirinhos

– U.F.G.

Profa. Dra. Fernanda Gomes de Paula

– U.F.G.

GOIÂNIA

2014

vi

Dedico este trabalho a Deus, aos meus pais

João Batista e Divina Celma, ao meu esposo

Cassio Roberto e a minha amiga Dayane Lenz.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por me

abençoar todos os dias e por estar sempre ao meu lado, iluminando meu

caminho, me tornando capaz.

Ao professor Dr. Emmanuel Arnhold por todo apoio, orientação, paciência e

compreensão.

Ao setor de piscicultura da Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás. À professora Dra. Fernanda Gomes pelos

ensinamentos, paciência e apoio.

À professora Dra. Maria Lúcia Gambarini pela dedicação, paciência,

ensinamentos e acima de tudo compreensão, os quais foram essenciais para meu

aprendizado.

Ao meu esposo Cassio Roberto, pelo companheirismo, compreensão e

apoio sempre.

À Dayane Lenz pela amizade, pelos ensinamentos, pela convivência,

paciência, pela ajuda sempre.

Aos meus pais João Batista e Divina Celma pelo incentivo na busca da

sabedoria.

À Juliana Macedo, Alex Pereira, Rafael Ferro, Diogo Ferro pelo incentivo,

amizade e companheirismo.

Aos parceiros de todas as horas, André Luiz, Alexandre Akio, Anderson

Pires, Fabricio Sado, Thainan Menezes, Luís Antônio, Ludiero, Rafael, pelo

companheirismo, amizade, e ajuda na execução do experimento.

À Piscicultura Buritizal, especialmente ao Sr. Ebraim Arantes que

gentilmente abriu as portas de sua piscicultura para realização deste trabalho.

Ao Valdir, Abadia e Valdir Junior pela ajuda durante a fase experimental.

Ao Marcelo, pela sua amizade, atenção e ajuda, sempre.

Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho.

Muito Obrigada!

viii

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... x

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... xi

LISTA DE QUADROS .......................................................................................... xiii

RESUMO .............................................................................................................. xiv

ABSTRACT ........................................................................................................... xv

1INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1

2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 3

2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 3

2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 3

3 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 4

3.1 Espécies estudadas ......................................................................................... 4

3.1.1 Tambaqui ...................................................................................................... 4

3.1.2 Pirapitinga ..................................................................................................... 5

3.2 Hibridação ........................................................................................................ 6

3.2.1 Tambatinga ................................................................................................... 7

3.3 Desenvolvimento embrionário em peixes ......................................................... 8

3.4 Desenvolvimento larval em peixes ................................................................... 9

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 11

4.1 Local ............................................................................................................... 11

4.2 Seleção de reprodutores e indução hormonal ................................................ 11

4.3 Fertilização dos gametas ................................................................................ 12

4.4 Coleta dos embriões e larvas ......................................................................... 13

4.5 Análise sob estereomicroscopia ..................................................................... 14

4.3 Delineamento experimental ............................................................................ 15

5 RESULTADOS .................................................................................................. 16

5.1 Embriogênese ................................................................................................ 16

5.1.1 Estágio de zigoto ......................................................................................... 16

5.1.2 Estágio de clivagem .................................................................................... 18

5.1.3 Estágio de mórula........................................................................................ 20

5.1.4 Estágio de blástula ...................................................................................... 21

5.1.5 Estágio de gástrula ...................................................................................... 22

ix

5.1.6 Estágio de organogênese ............................................................................ 24

5.1.7 Eclosão ........................................................................................................ 27

5. 2 Desenvolvimento larval ................................................................................. 27

6 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 37

7 CONCLUSÃO .................................................................................................... 42

8 REFERÊNCIAS ................................................................................................. 43

x

LISTA DE ABREVIATURAS

MAF - Minutos após a fertilização

AF - Após fertilização

HAE - Horas após a eclosão

HG - Horas- grau

g - Gramas

ml - Mililitros

kg - Quilogramas

h - Hora

min Minutos

m - Metro

cm - Centímetros

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Crescimento do espaço perivitelino observado em

diferentes momentos após a fertilização (AF) nos ovos de

(Colossoma macropomum)....................................................

17

Figura 2 Início da formação dos polos animal e vegetal, aos 12

minutos após a fertilização..................................................

17

Figura 3 Clivagem dos ovos de tambaqui (Colossoma

macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do

seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X

♂Piaractus brachypomus)......................................................

19

Figura 4 Clivagem dos ovos de tambaqui (Colossoma


seu híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂ P.

brachypomus).........................................................................

20

Figura 5 Fase de mórula nos ovos de tambaqui (Colossoma




21

Figura 6 Fase de blástula nos ovos de tambaqui (Colossoma




22

Figura 7 Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma

macropomum),pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do


♂Piaractus brachypomus).......................................................

23

Figura 8 Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma




24

Figura 9 Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma




25

Figura 10 Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus).......................................................

26

xii

Figura 11 Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma



♂Piaractus brachypomus)..................................................

27

Figura 12 Larva de tambaqui (Colossoma macropomum) logo após a

eclosão...................................................................................

28

Figura 13 Larva de pirapitinga (Piaractus brachypomus) logo após a

eclosão...................................................................................

28

Figura 14 Larva do híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂ P.

brachypomus) logo após a eclosão........................................

29

Figura 15 Desenvolvimento larval do tambaqui (Colossoma

macropomum)........................................................................

30

Figura 16 Desenvolvimento larval da pirapitinga (Piaractus

brachypomus).......................................................................

31

Figura 17 Desenvolvimento larval do híbrido tambatinga (♀.C.macropomum X ♂.P. brachypomus)............................

32

Figura 18 Desenvolvimento larval do tambaqui (Colossoma macropomum)........................................................................

34

Figura 19 Desenvolvimento larval da pirapitinga (Piaractus

brachypomus).......................................................................

35

Figura 20 Desenvolvimento larval do híbrido tambatinga

(♀.C.macropomum X ♂.P. brachypomus)............................

36

xiii

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Esquema dos cruzamentos realizados.......................................... 13

xiv

RESUMO

O conhecimento do desenvolvimento embrionário e larval dos peixes é essencial para o entendimento da biologia das espécies, desenvolvimento da cadeia produtiva e estudos de melhoramento genético e de tecnologia da reprodução de peixes. Assim, objetivou-se descrever o desenvolvimento embrionário e larval do tambaqui (Colossoma macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀C. macropomum x ♂ P. brachypomus). O experimento foi realizado na Piscicultura Buritizal, localizada no município de Palmeiras de Goiás. Foram utilizados três fêmeas tambaqui, três fêmeas pirapitinga, cinco machos tambaqui e cinco machos pirapitinga em idade reprodutiva. A reprodução foi realizada através de indução hormonal. Os ovos foram incubados em incubadoras verticais, com capacidade para 200L d’água. As amostragens ocorreram em tempos pré-determinados, desde o momento da extrusão dos ovócitos até 84 horas após a fertilização. As amostras foram fixadas em solução formol salina tamponada a 10% imediatamente após a coleta e analisadas em estereomicróscopio. As fêmeas de tambaqui e pirapitinga produziram ovócitos esféricos, não adesivos e translúcidos. Durante o período de desenvolvimento embrionário foram observadas as fases de zigoto, clivagem, mórula, blástula, gástrula, organogênese e eclosão. O polo vegetativo permaneceu indivisível durante todo o desenvolvimento embrionário, caracterizando o tipo de segmentação meroblástica discoidal, típica de ovos com grandes quantidades de vitelo. Os ovos de tambaqui e pirapitinga eclodiram 15 horas ou 422 horas-grau após a fertilização, já os ovos do híbrido tambatinga eclodiram 14 horas ou 394 horas-grau após a fertilização, à temperatura média de 28,13±0,06ºC. As espécies parentais e o híbrido em estudo apresentaram desenvolvimento embrionário e larval característico dos peixes com ovos telolécitos, na qual a larva recém eclodida, ainda não apresenta todos os sistemas orgânicos completamente formados, limitada a poucos órgãos, e ainda dependente do vitelo para sua nutrição. Não foi observado nenhuma diferença morfológica no desenvolvimento embrionário e larval do híbrido tambatinga em relação as espécies parentais. Palavras-chave: embriologia, larvicultura, tambaqui, pirapitinga, hibridação.

xv

ABSTRACT

Knowing fish embryonic and larval development is essential to understand species biology, supply chain development and studies of breeding and reproduction of fish technology. This study aimed was to describe Tambaqui (Colossoma macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) and its hybrid tambatinga (♀C. Macropomum x ♂ P. brachypomus). embryonic and larval development. The experiment was conducted in Buritizal Fish Farm, located in Palmeiras de Goiás district. It was used three Tambaqui females, three pirapitinga females, five males tambaqui and five pirapitinga in reproductive age. Reproduction was performed by hormonal induction. Eggs were incubated in vertical incubators of 200L water capacity. Sampling took place at pre-determined time from the moment of extrusion of oocytes to 84 hours after fertilization. Samples were fixed in formalin buffered saline to 10% immediately after collection, and examined under a stereomicroscope. Tambaqui and pirapitinga females produced spherical, non-adhesive, translucent oocytes. During embryonic development stage of the zygote, cleavage, morula, blastula, gastrula, organogenesis and hatching were observed. The vegetative pole remained undivided throughout embryonic development, characterizing segmentation type meroblastic discoidal, typical egg yolk with large amounts. Pirapitinga and tambaqui eggs hatched 15 hours or 422 hours-degree after fertilization, tambatinga hybrid eggs hatched 14 hours or 394 hours-degree after fertilization, at an average temperature of 28.13 ± 0,06ºC. Parental species and hybrid under study showed characteristic embryonic and larval of telolecithal fish with eggs, wherein the newly hatched larvae, has not yet fully formed, all organic systems, limited to a few organs, and depending on the yolk for nourishment . No morphological difference in embryonic and larval development of hybrid tambatinga regarding parental species was observed. Keywords: embryology, hatchery, tambaqui, pirapitinga, hybridization.

1 INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, vários aspectos relacionados à reprodução induzida,

nutrição e técnicas de criação de espécies de peixes nativos, vêm sendo

estudados com frequência. Entretanto, o desenvolvimento embrionário e a

produção de larvas não receberam a atenção necessária, e frente à enorme

diversidade de espécies de peixes encontradas no Brasil, o conhecimento

dessas fases ainda é escasso.

O conhecimento e identificação de cada estágio ontogênico é de

extrema importância, principalmente nos peixes de piracema, pelas mudanças

dos fatores ambientais aos que estão expostos na sua rotina migratória, e a

alta mortalidade nas primeiras fases do desenvolvimento embrionário e larval

(MACIEL, 2006).

No Brasil, o tambaqui (Colossoma macropomum) e a pirapitinga

(Piaractus brachypomus) são espécies nativas migradoras de grande

importância econômica e ecológica. Apesar dos avanços tecnológicos para

produção de peixes neotropicais no país, ainda são necessárias informações

sobre características biológicas destas espécies com potencial para a

piscicultura nas diferentes fases do desenvolvimento inicial (GODINHO, 2007).

Porém, observa-se que pisciculturas de diversas regiões brasileiras tem

realizado cruzamentos entre estas espécies, fazendo com que o cultivo de

peixes híbridos cresça cada vez mais no país (PORTO-FORESTI et al. 2011;

HASHIMOTO et al. 2012).

Entre os peixes híbridos, destaca-se o tambatinga produzido a partir do

cruzamento da fêmea de tambaqui (Colossoma macropomum) com o macho

de pirapitinga (Piaractus brachypomus), o qual apresenta superioridade em

relação as suas espécies parentais quanto ao crescimento e produtividade

(HASHIMOTO et al., 2012; DIAS et al. 2012).

No entanto, verifica-se poucos relatos quanto aos aspectos básicos do

período embrionário dos peixes híbridos. É necessário caracterizar o

desenvolvimento embrionário dos peixes híbridos e das suas espécies

parentais, uma vez que o conhecimento da embriogênese dos peixes, constitui

ferramenta útil na localização de áreas de desova e no estudo do crescimento

2

da espécie em ambiente natural (REYNALTE-TATAJE et al., 2001). Além de

permitir a identificação temporal da morfologia no processo de formação de um

novo organismo, o qual ajuda no manejo da incubação e da produção de larvas

(VALBUENA et al., 2012).

3

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

- Realizar uma comparação morfo-temporal das diferentes fases do

desenvolvimento embrionário e larval das espécies parentais tambaqui e

pirapitinga, e do seu híbrido tambatinga.

2.2 Objetivos específicos

- Descrever e comparar o formato e a coloração dos ovócitos;

- Descrever e comparar as possíveis alterações morfológicas advindas do

processo de hibridação nas fases de zigoto, clivagem, mórula, blástula,

gástrula, organogênese e eclosão;

- Comparar o tempo de eclosão dos ovos;

- Descrever e comparar a coloração das larvas ao eclodir;

- Descrever e comparar o tempo de formação dos principais órgãos observados

na fase larval.

4

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Espécies estudadas

O tambaqui (Colossoma macropomum) e a pirapitinga (Piaractus

brachyopomus) pertencem a ordem Characiformes, família Characidae e

subfamília Serrasalminae (VÁSQUEZ-TORRES, 2005; GRAÇA & PAVANELLI,

2007).

Segundo NELSON (2006) a ordem Characiformes é um dos maiores

grupos de peixes água doce, compreendendo 18 famílias, com cerca de 1.674

espécies válidas em 270 gêneros. Possuem ampla distribuição em águas

continentais do sul dos Estados Unidos, México, América Central e do Sul e

África.

3.1.1 Tambaqui

O tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) é nativo dos rios

Amazonas, Orinoco e afluentes, amplamente distribuído na parte tropical da

América do Sul e na Amazônia Central (DIAZ & LOPEZ, 1995; ARAÚJO-LIMA

& GOMES, 2005). É a espécie nativa mais cultivada no Brasil com produção de

54.313,1 toneladas em 2010 e crescimento de 39% de 2008 a 2010 (MPA,

2012). Possui grande porte, e na natureza pode atingir 1,0 m de comprimento e

peso médio de 30 kg. É considerado o segundo maior peixe de escamas da

bacia Amazônica (KUBTZA, 2004; ARAUJO-LIMA & GOMES, 2005).

A popularidade dessa espécie se deve à facilidade de produção de

alevinos, resistência ao manuseio, a temperaturas elevadas, enfermidades e a

baixos níveis de oxigênio dissolvido, além de apresentar rápido crescimento

(ARAÚJO-LIMA & GOMES, 2005).

O habitat do tambaqui é caracterizado por águas ricas em nutrientes, com

temperaturas médias entre 25 e 34ºC e abundância de áreas alagáveis

(ARAÚJO-LIMA & GOMES, 2005).

5

Reprodutivamente o tambaqui é um peixe de piracema com fecundação

externa e desova total. O periodo de desova é sincronizado com o periodo

chuvoso, normalmente de outubro a fevereiro na sua região de origem, época

em que realiza grandes migrações (VIEIRA et al., 1999). Apresenta alta

fecundidade e não possui cuidado parental, atinge a maturidade sexual entre o

terceiro e o quarto ano de vida, é mais tardio em regiões onde a temperatura

média anual é mais baixa (GRAÇA & PAVANELLI, 2007).

Como ocorre com a maioria das espécies migradoras, em cativeiro o

tambaqui é induzido com utilização de hormônios (ARAÚJO-LIMA & GOMES,

2005). Em laboratório a desova ocorre entre 200 a 300 horas-grau após a

indução hormonal e os ovos devem ser incubados com taxa de estocagem de 1

a 2 g/L ou 3.000 ovos/L. A temperatura deve estar entre 22oC a 28oC, e o

tempo de incubação varia de 18 a 22 horas (ANDRADE & YASUI, 2003).

3.1.2 Pirapitinga

A pirapitinga Piaractus brachypomus (CUVIER, 1818), é uma espécie

natural dos rios Solimões, Amazonas, Orinoco e seus afluentes

(WOYNAROVICH, 1988), pode atingir 80 cm de comprimento e 20 kg de peso.

De hábito alimentar onívoro, a pirapitinga se alimenta de frutas, folhas,

sementes e microcrustáceos (VÁSQUEZ-TORRES, 2005).

A pirapitinga é a única espécie do gênero Piaractus encontrada na Bacia

Amazônica (SOBRINHO et al., 1984). Segundo KUBITZA (2004), é

considerado o terceiro maior peixe de escamas da Amazônia, perdendo

apenas para o pirarucu e o tambaqui.

Possui um crescimento rápido, rusticidade, resistente a elevadas

temperaturas, ao manejo, às enfermidades e a baixos níveis de oxigênio

dissolvido (VÁSQUEZ-TORRES, 2005). Em 2010, a produção nacional da

pirapitinga atingiu 783,6 toneladas (MPA, 2012).

As fêmeas de Pirapitinga alcançam sua maturidade sexual aos três anos,

enquanto que nos machos ocorre ao final de dois anos. São espécies de

fecundação externa que liberam seus gametas no meio ambiente (ALMEIDA,

6

1997). Nas condições naturais estes peixes realizam piracema, migrando rio

acima no período entre junho e julho até outubro, quando os ovários das

fêmeas ainda não estão desenvolvidos. Já em cativeiro é necessária indução

hormonal e fertilização artificial, pois não conseguem desovar naturalmente. A

desova ocorre no período de outubro a fevereiro quando as condições

ambientais se tornam ideais, com temperatura média da água de 27°C, após as

primeiras chuvas (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008).

Em condições normais, a uma temperatura de 26ºC, o desenvolvimento

embrionário da pirapitinga pode variar entre 16 e 18 horas, porém, em

temperaturas maiores, de até 29-30ºC, o tempo de eclosão pode diminuir para

13 a 14 horas (NAKATANI et al., 2010).

3.2 Hibridação

O fenômeno da hibridação tem como objetivo aproveitar o possível vigor

híbrido ou heterose (SENHORINI et al., 1988), alcançado por meio do

cruzamento de grupos ou indivíduos geneticamente diferenciados. A hibridação

pode envolver tanto cruzamentos entre linhagens diferentes dentro de uma

mesma espécie, quanto entre indivíduos de espécies diferentes (BARTLEY et

al., 2001).

A heterose é utilizada para descrever a manifestação da superioridade de

um caráter quantitativo em combinações híbridas, é a expressão genética dos

efeitos da hibridação (BASTOS et al., 2003), manifesta-se quando a

característica avaliada no híbrido é maior (heterose positiva), ou menor

(heterose negativa) do que a média dos genitores. Assim do ponto de vista

comercial, considera-se como heterose aquela resultante de um híbrido cuja

média é superior à média do genitor de melhor desempenho (SENHORINI et

al., 1988).

A aplicação da técnica de hibridação nas grandes pisciculturas visa

produzir animais que possam obter melhor desempenho que as espécies

parentais (QUAGGIO et al., 2009), como o aumento da taxa de crescimento,

maior qualidade da carne, resistência a doenças e capacidade de tolerar

7

variações ambientais, além do aperfeiçoamento de diversas outras

características (BARTLEY et al., 2001), de maneira que o sistema se torne

mais competitivo e o produto final tenha maior aceitação por parte dos

consumidores (BOTERO et al., 2004).

No entanto, há necessidade de mais estudos sobre a biologia reprodutiva

dos peixes híbridos, bem como do impacto ambiental que podem vir a causar,

antes da exploração em larga escala destes animais. Ademais, o sucesso da

criação de peixes depende basicamente do conhecimento da biologia da

espécie e, em especial, do processo reprodutivo (ROMAGOSA et al., 2000).

3.2.1 Tambatinga

O tambatinga é um peixe híbrido resultante do cruzamento de fêmea

tambaqui (Colossoma macropomum) com o macho de pirapitinga (Piaractus

brachypomum). Apresenta coloração clara, com a ponta das nadadeiras caudal

e anal avermelhadas, coloração herdada da pirapitinga. Tem hábito alimentar

onívoro, especialmente frugívoro-herbívoro e pode alcançar até 80 cm de

comprimento e pesar mais de 15 kg de peso corporal (CRUZ et al. 2006).

O tambatinga é superior em crescimento e produtividade (HASHIMOTO et

al., 2012) e apresenta melhor conversão alimentar quando comparado com as

suas espécies parentais (PAULA et al., 2009a e 2009b).

A produção nacional do híbrido tambatinga em 2010 foi de 4.915,6

toneladas (MPA, 2012).

Possui filamentos branquiais mais desenvolvidos que a pirapitinga,

possibilitando assim, maior eficiência no processo de filtragem do plâncton

existente no meio durante sua alimentação (FLORES et al., 1992).

Dessa forma, esse peixe híbrido apresenta características de ambas as

espécies parentais, com a vantagem de maior resistência às doenças adquirida

da pirapitinga e o crescimento do tambaqui (HASHIMOTO et al., 2012), sendo

cultivado principalmente nos estado do Amapá, Pará, Tocantins, Piauí, Mato

Grosso e Mato Grosso do Sul (IBAMA, 2007).

8

3.3 Desenvolvimento embrionário em peixes

O desenvolvimento embrionário em peixes compreende eventos

morfogenéticos que ocorrem desde a fertilização até a eclosão do ovo

(KIMMEL et al., 1995). Após os eventos desencadeados pela fertilização, o ovo

passa por alterações que incluem os estágios de zigoto, clivagem, mórula,

blástula, gástrula, organogênese e eclosão (FAUSTINO et al., 2007).

A duração da embriogênese varia entre as espécies, depende do

tamanho dos ovos, das características reprodutivas das mesmas (NAKATANI

et al., 2001), e da temperatura da água (KUBTIZA, 2004). Ela é expressa em

horas-grau (HG) obtida pela soma das temperaturas da água, a cada hora,

durante o evento. Em geral, a embriogênese dos peixes de piracema é mais

curta, observa-se a eclosão dos ovos antes de completar 500 HG, já a de

peixes sedentários situa-se entre 1000 HG (SATO et al., 2003).

O processo de desenvolvimento embrionário tem início após a

fecundação do ovócito pelo espermatozóide, via micrópila (FAUSTINO et al.,

2010). Em contato com a água o óvulo hidrata e sua micrópila fecha

gradativamente (ANDRADE & YASUI, 2003). O período de hidratação pode

variar entre as espécies devido ao tamanho do ovo: menos de um minuto para

o pacu (Piaractus mesopotamicus) (RIBEIRO et al., 1995), 20 minutos para o

tambaqui (Colossoma macropomum) (ALBUQUERQUE et al., 1994) e 30

minutos para a piracanjuba (Brycon orignyanus) (LANDINEZ et al., 2004).

Assim, no caso do pacu, em aproximadamente um minuto já é inviável a

fecundação, porque os espermatozóides ativados inicialmente pelo contato

com a água têm tempo de vida e motilidade aproximadamente igual ao período

em que a micrópila dos óvulos permanece aberta (ANDRADE & YASUI, 2003).

Após a fertilização, tem-se o início do estágio de zigoto. Nesta fase o

ovo absorve água e ocorre a formação do espaço perivitelino, com a separação

do córion da membrana vitelina, segregação dos polos animal e vegetativo e

clivagem do blastodisco (LANGELAND & KIMMEL, 1997; NAKATANI et al

2001).

A fase de clivagem compreende seis divisões mitóticas sucessivas do

blastodisco até atingir os 64 blastômeros passando pelos estágios de duas,

9

quatro, oito, 16, 32 e 64 células, dando origem a mórula. O tipo de divisão é

meroblástica, e só acontece no polo animal sem comprometer o polo vegetal,

que permanece indivisível durante todo o desenvolvimento embrionário que

forma, posteriormente, o saco vitelínico (KIMMEL et al., 1995) do qual o

embrião irá nutrir-se durante a embriogênese, e que é também utilizado para

nutrir a larva por algum tempo após a eclosão (NAKATANI et al., 2001).

O período de blástula começa a partir de 128 células, e se estende até o

início dos movimentos de epibolia (KIMMEL et al. 1995).

Na gastrulação ocorre os movimentos de involução, convergência e

extensão que darão origem às camadas germinativas primárias e ao eixo

embrionário. A involução marca o início da fase de gástrula quando o embrião

atinge 50% de epibolia e surge o anel germinativo no bordo do blastoderma. Na

convergência se dá uma acumulação de células ao longo do anel germinativo.

Já o movimento morfogenético de extensão faz referência ao alongamento do

eixo embrionário (KIMMEL et al., 1995). No final da gastrulação, quando a

epibolia está próxima de seu término, ocorre o acúmulo de células que darão

origem a notocorda. Essa fase é caracterizada pelo fechamento do blastóporo

(GANECO, 2003; SAMPAIO, 2006).

A fase de organogênese é caracterizada pelo surgimento dos primeiros

somitos e do saco vitelino. O embrião continua se desenvolvendo e nesta fase

são visíveis a cauda livre, aumento da região da cabeça, vesícula ótica, tubo

neural na região cefálica, notocorda, deslocamento da cauda, alongamento do

embrião a partir do eixo cefálico caudal e os primeiros movimentos musculares

do mesmo (SAMPAIO, 2006; NEUMANN, 2011).

A eclosão ocorre após movimentos da cauda, que resulta no rompimento

do córion (GANECO, 2003).

3.4 Desenvolvimento larval em peixes

O período de desenvolvimento larval inicia-se após a eclosão e termina

com a reabsorção do vitelo e início da alimentação exógena (HELFMAN et al.,

2000).

10

A maioria das larvas de peixes de água doce eclodem com boca e

mandíbulas ainda não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico

grande (NAKATANI et al., 2001). Antes da abertura da boca, as larvas nutrem-

se do vitelo, que é reabsorvido constantemente através de endocitose via

camada sincicial vitelínica (SHAHSAVARANI et al., 2002). Nesse período,

poucos melanóforos são visualizados e a larva é muito transparente

(NAKATANI et al., 2001).

Durante o desenvolvimento larval vários eventos devem ser observados,

destacando-se a pigmentação dos olhos, abertura bucal e do sistema digestivo

(lúmen intestinal), inflação da bexiga natatória, flexão da notocorda,

desenvolvimento das nadadeiras, início do consumo de alimentos exógenos,

entre outras. A abordagem desses aspectos é crucial no estudo da ontogenia

de espécies nativas, sejam estes migradores ou não (GODINHO, 2007;

SANTOS & GODINHO, 2002).

11

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local

O experimento foi realizado na Piscicultura Buritizal, empreendimento

destinado à produção de alevinos de peixes nativos, localizado no município de

Palmeiras de Goiás/GO, em novembro de 2013.

4.2 Seleção de reprodutores e indução hormonal

Para a realização do experimento foram selecionadas três fêmeas de

tambaqui e três fêmeas de pirapitinga, sexualmente maduras, escolhidas

subjetivamente pela aparência da papila urogenital, do abdômen e canulação

intra-ovariana dos ovócitos. Após a seleção, as fêmeas foram identificadas por

fio de cobre revestido de pvc colorido na nadadeira dorsal, pesadas e

encaminhadas ao laboratório de reprodução, onde foram acondicionadas em

caixas d’água de volume de 1000 L com fluxo de água contínuo e submetidas à

indução hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa na quantidade de 5,5

mg/kg de peso vivo, diluído em solução salina de NaCl 0,9% aplicado via

intraperitonial, em duas doses de 0,5 mg/kg e 5,0 mg/kg respectivamente com

intervalo de 12 horas entre doses. Após a aplicação da segunda dose de

hormônio foi realizada a contagem de 260 horas-grau para a extrusão dos

ovócitos de tambaqui e 275 horas-grau para a extrusão dos ovócitos de

pirapitinga por pressão abdominal no sentido céfalo-caudal em meio e

recipiente seco, sem presença de água, urina ou sangue.

Também foram selecionados dez exemplares machos, cinco da espécie

tambaqui e cinco da espécie pirapitinga, sexualmente maduros, que liberaram

sêmen com leve pressão abdominal sem indução hormonal. Após a seleção, os

indivíduos foram identificados por fio de cobre revestido de pvc colorido na

nadadeira dorsal, pesados e encaminhados ao laboratório de reprodução de

peixes, onde foram acondicionados em caixas d’água de volume de 1000 L

com fluxo de água contínuo e submetidos à indução hormonal com extrato

12

bruto de hipófise de carpa, na quantidade de 2,0 mg/kg de peso vivo, diluído

em solução salina de NaCl 0,9%, na quantidade de 0,5 mL/kg de peso vivo e

aplicado via intraperitonial. Decorridas 12 horas da indução hormonal os

indivíduos foram envoltos em toalha úmida e submetidos à extrusão dos

gametas por pressão abdominal no sentido céfalo-caudal, realizada em meio

seco, sem presença de água, urina ou sangue. O sêmen foi coletado em

seringas graduadas de 10,0 mL previamente identificadas com o nome da cor

de identificação de cada reprodutor.

Para cada amostra foi realizado o teste de contaminação, que consistiu

em avaliar a motilidade espermática com o auxílio de microscópio óptico com

aumento de 400X, em que foram rejeitadas as amostras que apresentarem

mais de 1,0% de motilidade no campo óptico sem a ativação com água.

Atestada a viabilidade das amostras, o sêmen foi acondicionado em caixa

térmica com gelo, na temperatura de aproximadamente 5,0ºC.

4.3 Fertilização dos gametas

Para a realização da fertilização foram coletadas duas alíquotas de 200 g

dos ovócitos de cada fêmea de tambaqui e uma alíquota de 200 g de cada

fêmea de pirapitinga, totalizando nove alíquotas. O sêmen dos reprodutores de

cada espécie foi misturado em alíquotas de igual proporção formando dois

“pools” de sêmen, um de tambaqui e outro de pirapitinga.

Para os ovócitos de cada fêmea de tambaqui ocorreu a fertilização com o

“pool’’ de sêmen de tambaqui e de pirapitinga, já os ovócitos das fêmeas de

pirapitinga foram fertilizados apenas com pool de sêmen de pirapitinga (Quadro

1).

Os gametas foram misturados em meio seco e em seguida ativados com

água da incubadora onde se seguiu a incubação, eclosão dos ovos e

larvicultura. Cada repetição foi realizada em incubadora individual de 200 L de

capacidade e fluxo de água vertical e contínuo na densidade de 1,0 g de

ovos/L.

As incubadoras foram previamente identificadas com o número do

tratamento e repetição correspondente, e o fluxo de água foi previamente

13

ajustado em 2 L/min. Além disso, todas as incubadoras compartilhavam a

mesma fonte de água, para não haver diferenciação dos parâmetros físicos e

químicos da água de incubação dos ovos e larvicultura. Durante todo o período

experimental a temperatura da água foi aferida a cada hora com termômetro

digital.

Quadro 1 – Esquema dos cruzamentos realizados.

Cruzamentos

♀ C. macropomum

X

♂ C. macropomum =

C. macropomum

♀ P. brachypomus

X

♂ P. brachypomus =

P. brachypomus

♀ C. macropomum

X

♂ P. brachypomus =

Híbrido tambatinga

4.4 Coleta dos embriões e larvas

Os intervalos de coleta foram estabelecidos em função do tempo após a

fertilização. Devido ao fato do padrão de crescimento em peixes mudar

rapidamente no início do ciclo de vida, este foi mensurado em curtos intervalos

de tempo.

O tempo após fertilização foi iniciado no momento da ativação dos

gametas e cronometrado para cada repetição em cronômetro digital, que

registrou o tempo durante todo o período do experimento.

A primeira coleta realizada foi de uma amostra de ovócitos de cada fêmea

após a extrusão. Em seguida, os ovócitos foram coletados 15 segundos após a

fertilização, um minuto após a fertilização e dois minutos após a fertilização.

Após completados dois minutos de fertilização as coletas se tornaram

mais espaçadas, ocorrendo a cada dois minutos até completar 22 minutos após

a fertilização. Daí em diante, foram coletadas mais 14 amostras com intervalos

regulares de cinco minutos, completando 78 minutos após a fertilização e uma

coleta aos 90 minutos após a fertilização.

14

A partir dos 90 minutos após a fertilização as coletas ocorreram a cada 15

minutos até completar duas horas após a fertilização, quando passaram a ser

realizadas em intervalos de 30 minutos, até atingir nove horas após a

fertilização.

Após nove horas da fertilização dos ovócitos, as coletas passaram a ser

realizadas com intervalos de uma hora até que os embriões completassem 24

horas após a fertilização. A partir desse momento, as coletas ocorreram com

intervalos de quatro horas até atingir 84 horas após a fertilização.

Para a metodologia de coleta realizada foram obtidas 76 amostras de

cada repetição, totalizando 684 coletas durante todo experimento.

As amostras foram fixadas em solução formol salina tamponada a 10%

imediatamente após a coleta. O formol tamponado foi preparado com 270 mL

de formol, e 730 mL de tampão fosfato (5,2g de fosfato de sódio monobásico,

23g de fosfato de sódio dibásico e 1000 mL de água destilada).

4.5 Análise sob estereomicroscopia

Após a fixação na solução formol salina tamponada, as amostras foram

encaminhadas para o Laboratório de Reprodução Animal, da Universidade

Federal de Goiás, e analisadas em estereomicroscópio Coleman. As imagens

foram registradas pelo sistema de captura, Câmera CMOS digital colorida, 5

megapixels TUCSEN USB 2.0

Para visualização dos ovócitos, ovos, embriões e larvas, foi necessária

adequação do “zoom” do estereomicroscópio em certos tempos de coleta.

Assim para análise de todas as repetições foi utilizado o “zoom’’ de 40X até a

coleta de número 30 (01h45min após a fertilização), a partir da coleta de

número 31 (02:00h após a fertilização) passou a ser utilizado o aumento de

34X. Já na coleta de número 54 (17:00h após a fertilização) foi utilizado

aumento 28X, e a partir da coleta número 60 (24:00h após a fertilização)

“zoom” de 22X.

Alterações que ocorreram desde a fertilização dos ovócitos, até 84:00h

após a fertilização e puderam ser vistas no estereomicroscópio foram descritas.

15

Neste estudo, foi utilizada a classificação de FAUSTINO et al. (2010), ou

seja, a expressão “ovócito” refere-se ao gameta feminino, antes da fertilização.

O termo “ovo” referiu-se aos estágios compreendidos entre a fertilização até o

final da fase de gastrulação, quando então ocorre a formação do eixo

embrionário passando a ser denominado "embrião". A denominação “larva” foi

utilizada desde o momento da eclosão até a absorção total do vitelo.

4.3 Delineamento experimental

Foi realizada uma análise descritiva, comparando todos os estágios de

desenvolvimento embrionário do tambaqui, pirapitinga e do seu hibrido

tambatinga.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, sendo

tomado como tratamento as duas espécies puras e o híbrido (T1 = tambaqui;

T2 = pirapitinga e T3 = híbrido tambatinga). Cada fêmea utilizada nos

cruzamentos foi considerada uma repetição

Como unidade experimental foram utilizadas nove incubadoras verticais

de 200L, devidamente instaladas no laboratório de reprodução, com renovação

de água continua, registros e tubulações que permitiram controlar a vazão de

abastecimento.

16

5 RESULTADOS

5.1 Embriogênese

As fêmeas de tambaqui e pirapitinga produziram ovócitos esféricos, não

adesivos e translúcidos, porém com coloração distinta. Os ovócitos de

tambaqui apresentaram coloração amarelada, e os de pirapitinga verde-

azulada.

Os ovos das espécies estudadas foram classificados como telolécitos,

uma vez que exibiram grande quantidade de vitelo concentrado no polo

vegetativo enquanto o citoplasma e organelas foram distribuídos ao longo do

polo animal.

Durante o desenvolvimento embrionário foram observadas sete fases

comuns as espécies puras e ao híbrido, sendo elas: zigoto, clivagem, mórula,

blástula, gástrula, organogênese e eclosão, cada uma com suas características

que poderam ser vistas no estereomicroscópio descritas a seguir.

5.1.1 Estágio de zigoto

Com 15 segundos após a fertilização (AF) foi observado o início da

expansão do córion e a formação do espaço perivitelino nos ovos de tambaqui,

pirapitinga e do híbrido tambatinga. O espaço perivitelino, apresentou

crescimento com o decorrer do tempo e do desenvolvimento embrionário,

estando presente até a formação do embrião (Figura 1).

17

A B C

D E F

FIGURA 1 – Crescimento do espaço perivitelino observado em diferentes momentos

após a fertilização (AF) nos ovos de (Colossoma macropomum). A - 15

segundos AF; B - 1 MAF (minuto após fertilização); C - 10 MAF; D - 18 MAF; E - 26 MAF; F - 34 MAF. Destaca-se o aumento do espaço perivitelino no decorrer do tempo (↔).

Aos 12 minutos após a fertilização (MAF) já era visível o início da

formação dos polos animal e vegetal, nos ovos de tambaqui, pirapitinga e do

híbrido tambatinga (Figura 2).

A B CB

FIGURA 2 – Início da formação dos polos animal e vegetal, aos 12 minutos após a

fertilização. A - ovo de tambaqui (Colossoma macropomum); B - ovo de pirapitinga (Piaractus brachypomus); C - ovo do híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus).

O polo animal foi formado pelo citoplasma ativo e um núcleo que se

acumulou, originando uma protuberância em forma de disco, o blastodisco

unicelular (zigoto ou célula-ovo). Já o polo vegetal foi composto por vesículas

globosas de vitelo. Este estágio teve duração de 25 minutos nos ovos de

tambaqui pirapitinga e o híbrido tambatinga

18

5.1.2 Estágio de clivagem

As primeiras divisões celulares foram observadas simultaneamente nos

ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, tendo início aos 26

MAF.

Os ovos das espécies estudadas apresentaram clivagem meroblástica

discoidal ou parcial, em que foi observado o seguinte padrão de divisão celular:

A primeira clivagem foi orientada verticalmente. O sulco de clivagem

surgiu no polo animal e avançou rapidamente em direção ao polo vegetal,

passou no disco de citoplasma, e originou dois blastômeros visíveis aos 30

MAF nos ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga (Figuras 3A, 3B

e 3C respectivamente).

A segunda clivagem orientou-se também verticalmente e em ângulo reto

ao plano da primeira clivagem, gerou quatro blastômeros dispostos em duas

fileiras, aos 34 MAF nos ovos de tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 3D

e 3F), e aos 38 MAF nos ovos de pirapitinga (Figura 3E).

A terceira clivagem permaneceu vertical, todavia mostrou dois sulcos

paralelos ao plano da primeira clivagem, originando oito blastômeros, dispostos

em duas fileiras de quatro blastômeros, 42 MAF para tambaqui (Figura 3G), 50

MAF para a pirapitinga (Figura 3H) e do híbrido tambatinga aos 46 MAF (Figura

3I).

A quarta clivagem foi vertical e paralela à segunda, ocorreu também em

dois sulcos. Esta clivagem gerou 16 blastômeros dispostos em quatro fileiras

de quatro células, 54 MAF para o tambaqui e o híbrido tambatinga (Figuras 3J

e 3L) e pirapitinga aos 62 MAF (Figura 3K).

19

G

A B C

D E F

H I

J K L

A B C

D E F

FIGURA 3 – Clivagem dos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),

pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, D, G, J –

Ovos de tambaqui com dois, quatro, oito e 16 blastômeros, respectivamente; B, E, H, K - Ovos de pirapitinga com dois, quatro, oito e 16 blastômeros, respectivamente; C, F, I, L - Ovos de tambatinga com dois, quatro, oito e 16 blastômeros, respectivamente.

A quinta clivagem permaneceu vertical segmentando as quatro fileiras

de células, portanto mais quatro sulcos se formaram, produzindo 32

blastômeros dispostos em oito fileiras de quatro células a 62 MAF nos ovos

tambaqui e tambatinga (Figuras 4A e 4C), e pirapitinga aos 74 MAF (Figura

4B).

20

A sexta clivagem orientou-se na horizontal, dando origem a duas

camadas de células, totalizando 64 blastômeros a 78 MAF nos ovos de

tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 4D e 4F), e na pirapitinga aos 90

MAF (Figura 4E). A medida que as segmentação ocorreram, os blastômeros

diminuíram gradativamente de tamanho.

Durante a fase de clivagem o polo vegetativo permaneceu indivisível. As

divisões mitóticas ocorreram somente no polo animal.

G

A B C

D E F

H I

J K L

A B C

D E F

FIGURA 4 – Clivagem dos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum), pirapitinga

(Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂P. brachypomus). A, D - Ovos de tambaqui com 32 e 64 blastômeros, respectivamente; B, E - Ovos de pirapitinga com 32 e 64 blastômeros, respectivamente; C, F - Ovos de tambatinga com 32 e 64 blastômeros, respectivamente.

5.1.3 Estágio de mórula

A fase de mórula foi caracterizada inicialmente pela presença de 64

blastômeros e em seguida por 128 blastômeros, notando-se um

desalinhamento dos mesmos. Várias camadas foram observadas, formou-se

um maciço celular com arranjo semelhante à uma amora.

Este estágio de desenvolvimento pode ser observado a partir de 78 MAF

nos ovos de tambaqui e tambatinga (Figuras 5A e 5C), e nos ovos de

pirapitinga aos 90 MAF (Figura 5B).

21

A B C

FIGURA 5 – Fase de mórula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),

pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A – ovos de

tambaqui; B – ovos de pirapitinga; C – ovos do híbrido tambatinga.

5.1.4 Estágio de blástula

Esta fase se estendeu desde o momento em que o polo animal

apresentou-se abaulado, com mais de 128 blastômeros, até o início da

movimentação celular.

Este formato abaulado foi resultante da primeira clivagem no sentido

horizontal (sexta clivagem), que dividiu o embrião em duas camadas de células

e formou uma cavidade entre elas, a blastocele.

O início da fase de blástula foi observado aos 105 MAF nos ovos de

tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 6A e 6C), e às 02:00h AF para a

pirapitinga (Figura 6B).

O término desta fase ocorreu às 03h30min AF nos ovos de tambaqui e

tambatinga (Figuras 6D e 6F), e 04:00h AF para a pirapitinga (Figura 6C),

quando aproximadamente 30% do vitelo foi recoberto pelo movimento de

epibolia (Figura 6).

22

A B C

D E F

FIGURA 6 – Fase de blástula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),

pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A - Início da

fase de blástula nos ovos de tambaqui; B – início da fase de blástula nos ovos de pirapitinga; C - Início da fase de blástula nos ovos tambatinga; D - Final da fase de blástula nos ovos de tambaqui; E- Final da fase de blástula nos ovos de pirapitinga; F – Final da fase de blástula nos ovos de tambatinga.

5.1.5 Estágio de gástrula

Na fase de gástrula, pôde-se visualizar o movimento de epibolia das

células blastodérmicas, que realizaram um movimento de divergência partindo

do polo animal em direção ao polo vegetal envolvendo totalmente o ovo.

O início dessa fase foi observado às 04:00h AF nos ovos de tambaqui e

tambatinga (Figuras 7A e 7C), e às 04h30min AF para a pirapitinga (Figura 7B),

quando visualizou-se 50% de epibolia. Às 05:00h AF, cerca de 70% de epibolia

foi observado para as espécies parentais e seu híbrido em estudo (Figuras 7D,

7E e 7F).

Às 05h:30min AF foi observada 90% de epibolia e formação do

blastóporo nos ovos de tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 7G e 7I), e

às 06:00h AF nos ovos de pirapitinga (Figura 7H).

23

A B C

D E F

G H I

FIGURA 7 – Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),

pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, D, G – 50,

70 e 90% de epibolia nos ovos de tambaqui, respectivamente; B, E, H – 50, 70, 90% de epibolia nos ovos de pirapitinga, respectivamente; C, F, I – 50, 70 e 90% de epibolia nos ovos de tambatinga, respectivamente.

Com 06:00h AF observou-se 95% de epibolia para o tambaqui e o

híbrido tambatinga (Figuras 8A e 8C), e 06h30min AF para a pirapitinga (Figura

8B).

No término da gastrulação, 100% de epibolia, ocorreu o fechamento do

blastóporo com 06h30min para o tambaqui e tambatinga (Figuras 8D e 8F), e

07:00h para a pirapitinga (Figura 8E).

24

A B C

D E F

A B C

D E F

A

FIGURA 8 – Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),

pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A - 95% de

epibolia nos ovos de tambaqui; B – 95% de epibolia nos ovos de pirapitinga; C – 95% de epibolia nos ovos de tambatinga; D – fechamento do blastóporo nos ovos de tambaqui; E – fechamento do blastóporo nos ovos de pirapitinga; F - fechamento do blastóporo nos ovos de tambatinga.

5.1.6 Estágio de organogênese

A fase de organogênese iniciou logo após o fechamento do blastóporo, e

foi caracterizada pela formação de órgãos rudimentares, do saco vitelino e dos

somitos.

O início da formação do eixo embrionário, a diferenciação das regiões

cefálica e caudal, e o surgimento dos primeiros somitos (tecidos mesodermais)

que se alongaram em ambos os lados da notocorda, foram observados às

07:00h AF para tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 9A e 9C), e

07h30min para a pirapitinga (Figura 9B).

A vesícula óptica evidenciou-se as 08:00h AF para tambaqui e

tambatinga (Figuras 9D e 9F) e às 08h30min AF nos embriões de pirapitinga,

ocorrendo simultaneamente o aumento no número de somitos (Figura 9E).

25

A B C

D E F

G H I

FIGURA 9 – Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),

pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, B, C - Início

da formação dos somitos, do eixo embrionário e diferenciação das regiões cefálica e caudal, nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, respectivamente. D, E, F - A vesícula óptica e somitos evidentes nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, respectivamente. Legenda: op - vesícula óptica; so – somitos.

Com 09:00h AF foi observada a vesícula de Kupffer nos embriões de

tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 10A e 10C), e as 10:00h AF nos

embriões de pirapitinga (Figura 10B).

Com 10:00h AF foi constatado o início do desprendimento da cauda do

saco vitelino nos embriões de tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 10D e

10F) e às 11:00h AF nos de pirapitinga (Figura 10E).

Nesse estágio foram observados movimentos de contração muscular,

que se tornaram mais intensos a medida que a cauda soltava-se do saco

vitelínico, o qual apresentou-se alongado, acompanhando o formato larval.

op

op

op

so

26

A B C

D FE

G H I

J K L


pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus) A, B, C - Vesícula

de Kupffer visível nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, respectivamente. D, F, G - Início do desprendimento da cauda dos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, respectivamente. Legenda: vk – vesícula de Kupffer.

A formação da nadadeira embrionária teve início às 11:00h AF nos

embriões de tambaqui (Figura 11A), e as 12:00h AF nos embriões de

pirapitinga e do híbrido tambatinga (Figuras 11B e 11C). Neste momento a

vesícula ótica e tubo neural, estavam bastante visíveis nos embriões

estudados.

Às 13:00h AF os embriões das espécies parentais e do híbrido em

estudo, apresentaram-se totalmente alongados e cauda completamente solta.

vk

vk

vk

27

A B C

D FE

A B C

D E F


pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga

(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, B, C - Início

da formação da nadadeira embrionária, visualização da vesícula ótica e

tubo neural nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido

tambatinga, respectivamente. D, E, F – embriões de tambaqui, pirapitinga

e do híbrido tambatinga, respectivamente, totalmente alongados e cauda

completamente solta. Legenda: ot - vesícula ótica.

5.1.7 Eclosão

A eclosão dos ovos de tambaqui e pirapitinga ocorreu as 15 horas após a

fertilização ou 422 horas-grau, já os ovos do híbrido tambatinga eclodiram com

14 horas após a fertilização ou 394 horas-grau. Nesta fase, as larvas

realizaram movimentos fortes, essenciais para o rompimento do córion.

5. 2 Desenvolvimento larval

No momento da eclosão, as larvas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido

tambatinga apresentaram-se esbranquiçadas, eram desprovidas de pigmentos,

acuidade visual (olhos ainda despigmentados), e capacidade natatória,

havendo somente uma nadadeira embrionária recobrindo toda a região caudal.

ot ot ot

28

A cabeça encontrava-se em posição ventral, aderida à região anterior do saco

vitelino, que apresentou-se alongado, e o tubo digestório rudimentar sem

aberturas oral e anal (Figuras 12,13, 14).

Foram constatados os esboços do coração, vesícula ótica, formação do

cristalino e cálice óptico, notocorda e somitos.

FIGURA 12 – Larva de tambaqui (Colossoma macropomum) logo após a eclosão.

FIGURA 13 – Larva de pirapitinga (Piaractus brachypomus) logo após a eclosão.

29

FIGURA 14 – Larva do híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂P. brachypomus)

logo após a eclosão.

O processo de pigmentação dos olhos foi observado 17:00 h após a

eclosão (AE) das larvas de tambaqui (Figura 15 A), as 09:00h AE nas larvas de

pirapitinga (Figura 16A) e as 10:00h AE nas larvas do híbrido tambatinga

(Figura 17A). O olho apresentou-se levemente pigmentado e

predominantemente esférico.

O inicio da diferenciação da boca foi evidenciada as 25:00h AE nas larvas

de tambaqui (Figura 15B), 15:00h AE nas larvas de pirapitinga (Figura 16C) e

as 14:00h AE para o híbrido tambatinga (Figura 17B). Pode-se observar que a

boca é ampla em relação ao tamanho do olho e da cabeça.

No decorrer do desenvolvimento larval, alguns pigmentos puntiformes

foram observados ao longo do intestino na região ventral. O início da

pigmentação do corpo das larvas de pirapitinga foi observado 21:00h AE

(Figura 16B), as 30:00h AE nas larvas do híbrido tambatinga (Figura 17C), e as

57:00h AE nas larvas de tambaqui (Figura 15F).

As 45:00h AE os arcos branquiais se tornaram evidentes nas larvas de

tambaqui (Figura 15C), as 37:00h AE nas larvas de pirapitinga (Figura 16D) e

as 38:00h AE nas larvas do híbrido tambatinga (Figura 17D).

Com 45:00h AE a bexiga natatória das larvas de tambaqui (Figura 15D)

começou a inflar. Nas larvas de pirapitinga a bexiga natatória foi visualizada as

41:00 h AE (Figura 16F), e no híbrido tambatinga as 46:00h AE (Figura 17E).

30

As 49:00h AE já era visível as nadadeiras peitorais nas larvas de

tambaqui (Figura 15E), as 50:00h AE no híbrido tambatinga (Figura 17F), e as

41:00 h AF nas larvas de pirapitinga (Figura 16E).

A B

C D

E F

FIGURA 15 – Desenvolvimento larval do tambaqui (Colossoma macropomum). A –

início do processo de pigmentação dos olhos; B – início diferenciação da boca; C – início da formação dos arcos branquiais; D – bexiga natatória começa a inflar; E - nadadeira peitoral evidente; F – início da pigmentação do corpo. Legenda: bn - bexiga natatória; ab- arcos branquiais; np - nadadeira peitoral.

bn

np

ab

31

A B

D

E F

C

FIGURA 16 – Desenvolvimento larval da pirapitinga (Piaractus brachypomus). A – início

da pigmentação dos olhos; B – início da pigmentação do corpo; C- início da diferenciação da boca; D – desenvolvimento dos arcos branquiais; E – nadadeira peitoral evidente; F – bexiga natatória começa a inflar.

32

A B

C D

E F

FIGURA 17 – Desenvolvimento larval do híbrido tambatinga (♀.C. macropomum X ♂.P.

brachypomus). A – início pigmentação do olho; B – início da diferenciação

da boca; C - início da pigmentação pelo corpo; D – início do desenvolvimento dos arcos branquiais; E – bexiga natatória começa a inflar; F - nadadeira peitoral começa a se desenvolver.

33

As nadadeiras peitorais tornaram-se mais evidentes as 57:00h AE nas

larvas de tambaqui (Figura 18A) e pirapitinga (Figura 19A), e as 58:00h AE nas

larvas do híbrido tambatinga (Figura 20A). Nesse momento também observou-

se a placa olfatória na cabeça das larvas.

A nadadeira embrionária observada nas larvas logo após a eclosão

transformou-se ao longo da embriogênese, originando a nadadeira caudal.

Assim, com 61:00h AE foi possível a visualização bem nítida da nadadeira

caudal nas larvas de tambaqui e pirapitinga (Figuras 18B e 19B), e as 62:00h

AE (Figura 20B) nas larvas do híbrido tambatinga.

Com 65:00h AE pode-se observar o coração bastante desenvolvido,

bexiga natatória mais inflada e arcos branquiais maiores nas larvas de

tambaqui e pirapitinga (Figuras 18C, 19C), e as 66:00h AE nas larvas do

híbrido tambatinga (Figura 20C).

As 69:00h AE pode-se observar olhos bastante pigmentados, boca

aberta, saco vitelino bastante reduzido, intestino e canal anal diferenciados,

nas larvas de tambaqui, pirapitinga (Figuras 18D, 19D), e as 70:00h AE nas

larvas do híbrido tambatinga (Figura 20D). O intestino apresentou-se longo,

com sua parte terminal ultrapassando a metade do corpo.

Durante o período larval observado, não foi verificada a formação do

estômago nas larvas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga.

34

C D

BAA B

FIGURA 18 - Desenvolvimento larval do tambaqui (Colossoma macropomum). A – nadadeiras peitorais e placa olfatória; B - nadadeira caudal se desenvolvendo; C - coração bastante visível, arcos branquiais maiores, bexiga natatória mais inflada; D - olhos bastante pigmentados, boca formada e aberta intestino e canal anal diferenciados, saco vitelino reduzido. Legenda: co – coração.

co

35

A B

C D

FIGURA 19 – Desenvolvimento larval da pirapitinga (Piaractus brachypomus). A -

nadadeiras peitorais e placa olfatória; B –nadadeira caudal se desenvolvendo; C - coração bastante visível, arcos branquiais maiores, bexiga natatória mais inflada; D - olhos bastante pigmentados, boca formada e aberta intestino e canal anal diferenciados, saco vitelino reduzido.

36

DC

A B

FIGURA 20 – Desenvolvimento larval do híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂P.

brachypomus). A - nadadeiras peitorais e placa olfatória; B –

nadadeira caudal se desenvolvendo; C - coração bastante visível, arcos branquiais maiores, bexiga natatória mais inflada; D - olhos bastante pigmentados, boca formada e aberta, intestino e canal anal diferenciados, saco vitelino reduzido.

37

6 DISCUSSÃO

A temperatura média da água durante o desenvolvimento embrionário e

larval do tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga foi de 28,13±0,06ºC.

Segundo KIMMEL et al. (1995) essa temperatura é considerada ótima para o

desenvolvimento de peixes tropicais.

Os ovócitos de tambaqui e pirapitinga apresentaram-se, pequenos,

esféricos, não adesivos e translúcidos. Os ovócitos pequenos são típicos de

espécies migradoras, com desova total, de fecundação externa e sem cuidado

parental (VAZZOLER, 1996), e quando hidratados, aumentam muito seu

diâmetro (SATO et al., 2000), dando início ao processo de expansão do córion

e a formação do espaço perivitelino.

O espaço perivitelino existente nos ovos de peixes protege o embrião

contra as injurias do meio ambiente, delimitando o espaço para seu

desenvolvimento (RIBEIRO et al., 1995). Os ovos de tambaqui, pirapitinga e do

híbrido tambatinga apresentaram amplo espaço perivitelino, que também foi

observado em outras espécies de peixes teleósteos (RIBEIRO et al., 1995;

SHARDO 1995; ROMAGOSA et al., 2001; FAUSTINO et al., 2007).

Os ovos das espécies parentais e do híbrido estudados podem ser

classificados como telolécitos, pois apresentaram grande quantidade de vitelo

concentrado no polo vegetativo, e o citoplasma e suas organelas localizadas no

polo animal. Essas características obtidas são semelhantes às observadas por

BOTERO et al. (2004) nos ovos do híbrido tambatinga, OLAERTE et al (2010)

nos ovos de pirapitinga, e LEITE et al.(2013) em ovos de tambaqui.

A clivagem dos ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, foi

do tipo meroblástica ou parcial, ou seja, o polo vegetativo permaneceu

indivisível durante todo o desenvolvimento embrionário. Tal clivagem é típica

dos ovos de peixes e foram similares aos descritos em outros teleósteos

(RIBEIRO et al., 1995; GANECO, 2003, NINHAUS-SILVEIRA et al., 2006;

FAUSTINO et al., 2007; MARQUES et al., 2008;).

As clivagens iniciam do centro para as bordas do blastodisco

(SHARDO,1995). Até a fase de 32 blastômeros (quinta clivagem), as

segmentações ocorrem em um único sentido (vertical), e o embrião é composto

38

por uma camada simples de células, conhecida como blastoderme (SALMITO-

VANDERLEY & SANTANA, 2010).

Durante o estágio de clivagem as divisões mitóticas ocorrem para que a

relação existente entre o núcleo e citoplasma no polo animal atinja um novo

equilíbrio, ou seja, o enorme volume do citoplasma zigótico é dividido cada vez

mais em células menores, enquanto o volume citoplasmático não aumenta

(GILBERT, 2003). Este fato também foi observado por RIBEIRO et al. (1995) e

LEITE et al. (2013) em ovos de tambaqui, e BOTERO et al. (2004) estudaram o

híbrido tambatinga.

O abaulamento observado nos ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido

tambatinga é característico da fase de blástula. Segundo SALMITO-

VANDERLEY & SANTANA (2010) esse abaulamento é resultante da primeira

clivagem no sentido horizontal (sexta clivagem), dividindo o embrião em duas

camadas de células com uma cavidade entre elas chamada de blastocele.

No final da fase de blástula e início da gástrula evidenciou-se movimento

de epibolia. Este movimento foi acompanhado do surgimento de um anel

germinativo na borda marginal da blastoderme, e consequente formação do

escudo embrionário. O mesmo foi observado por (KIMMEL et al., 1995)

estudando o zebrafish (Brachidanio rerio).

Na fase de gástrula a medida que as divisões mitóticas prosseguiram, o

polo animal tornou-se cada vez mais abaulado devido ao acumulo de células

no polo animal que iniciaram um movimento em direção ao polo vegetal,

recobrindo gradativamente a região vitelínica. Este movimento, é conhecido

como epibolia, é característico da fase de gástrula, pois durante a epibolia

ocorrem também movimentos de involução das células do polo animal para

dentro da blastocele, através do blastóporo, para a formação de tecidos

embrionários (GARCIA E FERNANDEZ, 2006).

Os principais eventos observados durante a fase de organogênese foi a

formação da notocorda e tubo neural, formação dos somitos e da vesícula de

kuppfer. A notocorda é um órgão provisório que possui função de formação do

tubo neural e posterior sistema nervoso central (GILBERT, 2003), já os somitos

entram em miogênese para posterior formação dos músculos, desenvolvidos

em blocos celulares (BUZZOLO, et al., 2011).

39

O processo de formação do tubo neural, rudimento do sistema nervoso

central, é chamado neurulação e o tubo neural se origina de um sólido cordão

de células da placa neural formando uma estrutura com aspecto de cordão que

migra dentro do embrião fechando-se para formar o tubo. Assim, a porção mais

anterior do tubo sofre mudanças drásticas, expandindo-se em três vesículas

primárias, cérebro anterior (prosencéfalo), cérebro médio (mesencéfalo) e

cérebro posterior (rombencéfalo) (GILBERT, 2003).

A vesícula de Kupffer também foi observada por KIMMEL et al. (1995)

estudando Danio rerio (zebrafish), FAUSTINO et al. (2007) nos embriões de

híbridos de pintado (Pseudoplatystoma corruscans) e cachara

(Pseudoplatystoma fasciatum) e por NEUMANN (2008) em matrinxã (B.

amazonicus). KIMMEL et al. (1995) relataram que esta vesícula apresenta-se

como uma depressão no broto da cauda, sendo uma estrutura transitória

encontrada apenas em embriões de teleósteos. Recentemente, estudos

mostraram que esta vesícula, possui fluido e cílios, os quais proporcionam um

fluxo direcional sempre da direita para a esquerda, imprescindível para a

assimetria dos órgãos durante o desenvolvimento (ESSNER et al. 2005).

A eclosão dos ovos ocorrem após contrações musculares vigorosas da

cauda e do corpo das larvas (NAKATANI et al., 2001), sendo o córion

amolecido como resultado da ação de enzimas (BLAXTER, 1988). A eclosão

dos ovos de tambaqui e pirapitinga ocorreu as 15 horas após a fertilização ou

422 horas-grau, já os ovos do híbrido tambatinga eclodiram com 14 horas após

a fertilização ou 394 horas-grau.

LEITE et al. (2013) observaram eclosão das larvas de tambaqui 13:00h

após a fertilização, o equivalente a 357 horas-grau, com temperatura da água

de 27,5°C.

BOTERO et al. (2004) descreveram o desenvolvimento embrionário do

híbrido tambatinga, e encontraram um tempo de eclosão das larvas de 19

horas, à temperatura de 27ºC na incubadora.

OLAERTE et al (2010) observaram eclosão dos ovos de pirapitinga

14:00h após a fertilização, a temperatura de 26.9 ± 0.4oC.

Segundo KUBTIZA (2004) esta variação no período embrionário deve-se

ao fato do desenvolvimento dos teleósteos ser muito sensível às mudanças

ambientais, principalmente temperatura. Assim, o período de desenvolvimento

40

é geralmente menor em temperaturas elevadas do que em temperaturas mais

baixas.

Os estágios observados durante o desenvolvimento embrionário das

espécies e seu híbrido descritos neste trabalho (zigoto, clivagem, mórula,

blástula, gástrula, organogênese e eclosão), foi semelhante à relatada para o

tambaqui (ALBUQUERQUE et al.,1994; LEITE, 2011), pirapitinga (OLAERTE et

al. 2010), para o híbrido tambatinga (BOTERO et al. 2004), e para outras

espécies da família Characidae (ANDRADE-TALMELLI et al., 2001;

REYNALTE-TATAJE et al., 2004).

Logo após a eclosão as larvas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido

tambatinga apresentaram-se esbranquiçadas, com poucos órgãos formados,

quase sem pigmentos pelo corpo e ainda dependente do vitelo para sua

nutrição. Porém, de acordo com NAKATANI et al. (2001) no primeiro estágio de

desenvolvimento após a eclosão (larval vitelino) várias espécies de peixes

apresentam-se pouco desenvolvidas. Em Characiformes a maioria das larvas

de peixes recém-eclodida não possui boca aberta, intestino, ânus, brânquias,

bexiga natatória, nadadeiras pares, pigmentação e acuidade visual

Segundo BLAXTER (1998) e FUIMAN (2002) o desenvolvimento corporal

das larvas nesse estágio está intimamente relacionado com a estratégia

reprodutiva da espécie. Ou seja, espécies com ovócitos pequenos, geralmente

apresentam curtos períodos de incubação e consequentemente pouco

desenvolvimento corporal.

No decorrer do desenvolvimento larval, alguns pigmentos puntiformes

foram observados ao longo do intestino na região ventral das larvas de

tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga. O mesmo foi relatado por

OLIVEIRA et al. (2008) em larvas de piraputanga (Brycon hilarii), sendo

característico, nos indivíduos mais desenvolvidos a presença destes pigmentos

puntiformes enfileirados desde a região terminal do intestino até o pedúnculo

caudal. No entanto as larvas de tambaqui demoraram mais para iniciarem a

pigmentação corporal, sendo a mesma observada somente as 57:00h AE, já

nas larvas de pirapitinga foi observado as 21:00h AE, e as 30:00h AE nas

larvas do híbrido tambatinga.

A abertura da boca e do intestino, e a pigmentação dos olhos observadas

no final do estágio larval vitelínico, são eventos que ocorrem quase que

41

simultaneamente. Segundo OLIVEIRA et al. (2012), a pigmentação dos olhos e

abertura da boca e do intestino estão relacionadas com o início da alimentação

exógena da larva.

42

7 CONCLUSÃO

Não foi observado nenhuma diferença morfológica no desenvolvimento

embrionário e larval do híbrido tambatinga em relação as espécies parentais,

que pudesse ser visualizada em estereomicróscopio.

Apesar dos ovos estarem mantidos em água da mesma temperatura e

fonte de origem, foi observada eclosão em tempos diferentes. Os ovos do

híbrido tambatinga eclodiram com 394 horas-grau, ou 14:00 horas após a

fertilização, e os ovos de tambaqui e pirapitinga eclodiram com 422 horas-grau

ou 15:00 horas após a fertilização.

As larvas recém eclodidas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido

tambatinga não apresentaram todos os sistemas orgânicos completamente

formados, limitada a poucos órgãos, e ainda dependente do vitelo para sua

nutrição.

43

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