Desenvolvimento Embrionário: das Células ao...

Desenvolvimento Embrionário: das Células ao Coração.

Ana Paula Alves

2011

Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Instituto de Ciências Exatas - ICEx

Programa de Pós Graduação em Física

Desenvolvimento Embrionário: das Células ao Coração.

Ana Paula Alves

Orientador: Prof. Ubirajara Agero Batista

Co-orientador: Prof. Oscar Nassif de Mesquita

Dissertação apresentada ao departamento de Física da Univer-

sidade Federal de Minas Gerais, para a obtenção de Título de

Mestre em Física

Área de Concentração: Física Biologica .

2010

Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lança toda a força de

sua alma, todo o universo conspira a seu favor. (Goethe)

Agradecimentos

Quero agradecer ao meu orientador Professor Ubirajara Agero pelo compromisso com este

trabalho, além do grande entusiasmo e compreensão. Ao Professor Oscar Nassif de Mesquita

pela oportunidade de conhecer o trabalho do grupo e me encaminhar ao Bira. Aos colegas

do laboratório de Física de Sistemas Biológicos da UFMG, Lívia, Ulisses, Paula, Pedro,

Barbara e ao Edgar. Aos funcionários da o�cina mecânica do departamento de física da

UFMG, Sr. João e ao Thiago e ao funcionário da o�cina elétrica, Rubens. Eles contribuiram

bastante no desenvolmento da montagem experimental deste trabalho. À minha família, pelo

apoio, especialmente minha mãe e minha irmã. Aos amigos do mestrado, pelos momentos de

descontração e de bandejão, especialmente gostaria de agradecer ao clube da luluzinha pelas

muitas risadas, e pelo grande apoio em todas as horas. Aos meus amigos de alguns anos,

boa parte da turma de 2005 de física. Gostaria de agradecer também à agência �nanciadora

CAPES pela bolsa de mestrado no periodo de 2 anos.

iv

Resumo

Usamos a Microscopia de Desfocalização (MD), técnica desenvolvida no laboratório de

Física de Sistemas Biológicos para obter informações sobre Desenvolvimento Embrionário.

Estudamos células extraídas de embriões de galinha nos primeiros estágios de desenvolvi-

mento, o batimento cardíaco e o crescimento de vasos no embrião. Desenvolvemos um

processo de extração e cultura de células mesenquimais somáticas no laboratório. As células

mesenquimais somáticas vão dar origem aos tecidos e órgãos do embrião, nosso objetivo

neste trabalho é caracterizar a dinâmica celular (membrana + citoesqueleto). Para tanto

foram obtidas células aderidas, em cultura, as quais exibiam diversos formatos. Através

das análises de correlação temporal do contraste obtemos os tempos de relaxação das �u-

tuações na membrana. Para uma mesma célula foram encontrados diferentes tempos de

relaxação na membrana celular, diferentemente dos resultados obtidos com células de outros

vertebrados analisados no laboratório. Neste trabalho conseguimos relacionar o tempo de

relaxação encontrado na membrana com a direção do movimento da célula, resultados pre-

liminares mostram que a célula se move na direção da região da membrana que apresenta

menor tempo de relaxação. Além disso, foram feitas análises da freqüência de batimento

cardíaco fazendo a transformada de Fourier do sinal do batimento cardíaco do embrião de

galinha durante o desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos mostram que em

estágios iniciais do desenvolvimento a freqüência de batimento é aleatória e similar à fre-

qüência das células do coração em cultura, os cardiomiócitos, tornando-se de�nida com o

desenvolvimento do embrião. Outro grande interesse neste trabalho é conseguir acompanhar

o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionário. Para tanto, conseguimos

obter o embrião em estágios no qual não apresentava vasos, e em estágios posteriores já

vascularizado. Assim temos um sistema poderoso para estudar como ocorre o crescimento

de vasos no tempo, durante o desenvolvimento embrionário.

Palavras-chave:células mesenquimais somáticas, desenvolvimento embrionário, MD

I

Abstract

We use the defocusing microscopy, technique developed at laboratory, Physics of Bio-

logical Systems, for information on Embryonic Development. We study cell extracted from

chicken embryos in the early stages of development, heartbeat and vessel growth in the em-

bryo. We developed an extraction and culture procedure to obtain somatic mesenchymal

cells applied our laboratory. Somatic mesenchymal cells will give rise to tissues and organs

in embryo, our goal in this work is to characterize the cellular (membrane + cytoskeleton).

Adherent cells were obtained in culture, which exhibited a variety of formats. Through the

analysis of temporal correlation of the contrast of gray level we obtain the relaxation times

of the �uctuations in the membrane. For the same cell were found di�erent times in the

cell membrane, unlike the results obtained with cells of other vertebrates analyzed in the

laboratory. Relate the relaxation time found in the membrane with the movement of the cell,

preliminary results show that the cell moves toward the membrane region of least time. Also,

tests were made of the frequency of heart rate by doing the Fourier transform of the signal

from the heartbeat of the chicken embryo during embryonic development. The results show

that in the early stages of developing the beat frequency is similar to the random frequency

of heart cells in culture, cardiomyocytes, making it set to the developing embryo. We also

get the embryo stages in which had no pots, and in later stages as vascularized. So we have

a powerful system for studying how growth occurs in the time of vessels during embryonic

development.

Keywords: somatic mesenchymal cells, Embryonic Development, Defocusing Microscopic

II

Sumário

Resumo I

Abstract II

Lista de Figuras IV

1 Introdução 1

2 Desenvolvimento Embrionário 5

2.1 Introdução Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2 Formação do Embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Gastrulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Formação e Regressão da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Folhetos Embrionários . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Mesoderme Paraxial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Somitogênese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3 Formação do Coração Durante o Desenvolvimento Embrionário . . . . . . . . 16

Batimento Cardíaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3 Microscopia de Desfocalização 20

3.1 Campo Elétrico da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Espaço Real e espaço dos vetores de onda . . . . . . . . . . . . . . . . 22

Propagação do campo elétrico através de um objeto de fase. . . . . . . 23

3.2 Propagação do Campo Elétrico através do microscópio desfocalizado . . . . . 25

4 Montagem Experimental 28

III

SUMÁRIO IV

4.1 Extraindo Embriões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Protocolo de Extração de Embriões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.2 Extraindo células dos somitos do embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Porta-Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Meio de cultura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Cultura de Células Mesenquimais Somáticas. . . . . . . . . . . . . . . 35

4.3 Cultura de Embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5 Resultados e Discussões 41

5.1 Células Mesenquimais Extraídas dos Somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Caracterizando a membrana das células mesenquimais somáticas. . . . 43

5.2 Frequência de Batimento Cardíaco Durante o Desenvolvimento Embrionário. . 48

5.3 Crescimento de vasos em embrião de galinha

(Gallus gallus). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

6 Conclusões 1

A Programa para auto-correlação temporal. 3

Referências Bibliográ�cas 6

Lista de Figuras

2.1 Estágios Embrionários . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2 Formação da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.3 Grastulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4 Regressão da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.5 Divisões da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.6 Regiões da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediária e Paraxial com os

respectivos derivados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.7 Somitos no embrião: estágio 10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.8 Somitogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.9 Corte transversal da região pericardial do embrião em vários estágios . . . . . 16

2.10 Coração corte ventral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.1 Sistema de Coordenadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.2 Esboço de um objeto de fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.3 Esquema óptico do microscópio com óptica corrigida no in�nito . . . . . . . . 25

4.1 Esboço da montagem experimental para obtenção dos embriões . . . . . . . . 31

4.2 Embrião no estagio 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.3 Montagem experimental para extração de material dos somitos . . . . . . . . 34

4.4 Montagem esquemática do microoscopio usado para obter �lmes das células . 37

4.5 Montagem da caixa de acrílico sobre a Lupa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.1 Tempo de aderencia das Células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.2 Células aderidas a partir do terceiro dia de cultura . . . . . . . . . . . . . . . 43

5.3 Diferentes regiões da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

V

LISTA DE FIGURAS VI

5.4 Correlação temporal das região da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . 45

5.5 Células aderidas extraídas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois . . . . 46

5.6 Correlação temporal para diferentes regiões das células observadas em inter-

valos de tempo de 1 a 2 horas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.7 Sinal obtido da variação da interface do coração. . . . . . . . . . . . . . . . . 48

5.8 Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um cardiomiocito. . . . . 49

5.9 Espectro de potência pela freqüência em (Hz) para um embrião cultivado em

vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5.10 Freqüência do pico do espectro pela idade do embrião em: horas e número de

somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

5.11 Embrião no estágio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina. . . . . . . . . 52

5.12 Embrião no estágio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina. . . 53

5.13 (a) Vasos do arco interno, na região da área pelucida em um embrião de 36

horas.(b) Vasos do arco interno em um embrião de 49 horas. . . . . . . . . . . 53

5.14 Embrião está no estágio 29, com o sistema vasculatório está bem avançado . . 54

Capítulo 1

Introdução

Nesta dissertação apresentaremos os primeiros trabalhos de uma nova linha de pesquisa

em Desenvolvimento Embrionário que se inicia no Laboratório de Física de Sistemas Biológi-

cos do Departamento de Física da UFMG. Essa linha no laboratório se iniciou a partir dos

trabalhos do professor Ubirajara Agero na Universidade de Indiana EUA, com o professor

James Glazier. Interessados em caracterizar as regiões que compõem embrião de galinha

no estágio 10 através das propriedades elásticas. Eles aplicaram uma deformação na região

de interesse e obtiveram diferentes valores para módulo de Young em cada região do em-

brião, a saber: área opaca, pelúcida, notocorda, somitos e tubo neural [1]. Atualmente

temos realizado vários experimentos com embrião de galinha com o objetivo de extrair infor-

mações do comportamento celular, do batimento cardíaco e do crescimento de vasos durante

o Desenvolvimento Embrionário.

Interessados em analisar células extraídas dos embriões no estágio 10 (33-38) horas,

desenvolvemos um protocolo de extração e cultura de células mesenquimais. As células

mesenquimais possuem grande capacidade de diferenciação, são precursoras dos tecidos:

conjuntivo, epitelial, ósseo, cartilaginoso e muscular, que são compostos de células já espe-

cializadas.

1

Capítulo 1. Introdução 2

A MD é uma técnica ideal para estudar objetos de fase, células bem aderidas em uma

lâmina são objetos de fase ideais para a aplicação da microscopia de desfocalização. Os

objetos de fase são transparentes quando estão no foco, tornando-se visíveis quando desfo-

calizados por um microscópio óptico operando em campo claro. A desfocalização do objeto

introduz uma diferença de fase entre a luz difratada e a luz não difratada que produz um con-

traste não nulo quando interferem no plano imagem. A Microscopia de Desfocalização agora

com seus limites de validades bem de�nidos é uma técnica ideal para extrair informações

quantitativas da dinâmica que ocorre na membrana celular [2].

Usamos a Microscopia de Desfocalização (MD), para analisar a membrana das células

extraídas dos embriões de galinha. O objetivo deste trabalho foi explorar as informações

extraídas das células mesenquimais através da MD. Esta técnica já está bem estabelecida, e

através dela conseguimos obter informações que caracteriza de forma e�ciente a dinâmica que

ocorre na membrana celular. Atualmente existem na literatura vários trabalhos que usam

marcadores para identi�car os tipos de células que se originam de células mesenquimais.

Quando uma célula mesenquimal se diferencia em um �broblasto, por exemplo, ocorre a

produção de matriz extracelular que neste caso é o colágeno. Assim o marcador usado reage

com uma proteína presente no colágeno mudando a coloração do meio. E para diferentes

matrizes extracelulares produzidas existem diferentes marcadores com protocolos bem esta-

belecidos pela literatura, o que permite caracterizar de forma precisa os diferentes tipos de

células originadas das células mesenquimais [3].

O próximo passo deste trabalho é veri�car se através MD conseguimos caracterizar difer-

entes grupos de células mesenquimais. Para tanto precisaremos usar marcadores em nossa

cultura, e assim para cada grupo separadamente seria estudado a dinâmica que ocorre na

membrana celular. Resultados obtidos em [4][5] mostram que a MD é uma técnica muito

robusta para caracterizar a dinâmica na membrana celular.

No presente trabalho conseguimos através da MD e das análises de correlação temporal,

do contraste em nivel de cinza, determinar o tempo de relaxação da membrana celular.

Através deste tempo de relaxação podemos caracterizar as �utuações na membrana como

rápidas ou lentas. Para tanto, mapeamos a membrana das células mesenquimais e em cada

região obtemos o tempo de relaxação temporal, o qual se mostrou bastante heterogêneo.

Neste trabalho observamos que a heterogênedade do tempo de relaxação da membrana está


relacionada com o movimento da célula. Nossos experimentos con�rmaram que as células

sempre se movimentam na direção da membrana que possue menor tempo de relaxação

temporal.

Além disso, foram feitas análises da freqüência de batimento cardíaco e do crescimento de

vasos durante o desenvolvimento embrionário. Resultados preliminares mostram que durante

o desenvolvimento embrionário o coração do embrião de�ne uma freqüência de batimento que

tende a aumentar até atingir o valor do animal adulto. Inicialmente as contrações do coração

são fracas e bastante aleátorias, com o desenvolvimento do embrião passam ser mais fortes e

regulares. A vascularização do embrião inicia-se com a formação do coração, posteriormente

de�nem-se duas redes de vasos uma mais interna ao corpo do embrião, na região denominada

por área pelúcida e a outra externa ao corpo, na região denominada por área opaca, na

qual os vasos são mais visíveis. Conseguimos obter algumas fotos que mostram diferentes

estágios do processo de vascularização. Nosso objetivo é conseguir acompanhar a criação de

vasos no tempo. Conhecer a dinâmica do crescimento de vasos é muito interessante porque

várias doenças são identi�cadas pelo crescimento desordenado de vasos. E conhecendo este

comportamento podemos fazer ensaios com possíveis inibidores à proliferação dos vasos.

Nesta dissertação desenvolvemos vários protocolos de métodos experimentais para o estudo

do embrião de galinha, e pretendemos que estes protocolos sejam utilizados no laboratório

nos próximos anos.

Esta dissertação está organizada da seguinte forma:

Capítulo 1 é esta a introdução ao trabalho.

No Capítulo 2 será apresentado o Desenvolvimento Embrionário, apresentando o desen-

volvimento do embrião desde momento em que ele é formado ainda no oviducto (dentro da

galinha) até nos estágios posteriores que nós estudamos.

No Capítulo 3 será introduzida a técnica Microscopia de Desfocalização, mostrando suas

aplicações e limites de validade.

No Capítulo 4 será apresentado a montagem experimental e os protocolos de extração e

cultura de células extraídas dos embriões, além do protocolo de cultura de embrião em vitro.

No Capítulo 5 serão apresentados os resultados obtidos para �utuações em células, ba-

timento cardíaco, resultados preliminares da formação de vasos e a discussão dos resultados

obtidos.


No Capítulo 6 serão apresentados as perspectivas e conclusões deste trabalho.

Capítulo 2

Desenvolvimento Embrionário

2.1 Introdução Geral

Neste capitulo faremos uma revisão básica dos termos envolvidos no desenvolvimento do

embrião de galinha Gallus gallus. Não serão apresentadas discussões detalhadas sobre a

biologia do desenvolvimento, pois o objetivo do presente capitulo é apenas abordar os fatos

em ordem cronológica familiarizando o leitor com os termos que serão citados posteriormente.

Descreveremos o desenvolvimento do embrião de galinha desde a fase inicial dos primeiros

agregados celulares até a formação do coração. Os primeiros estágios do desenvolvimento

de todos os vertebrados são muito parecidos, e os embriões de galinha em especial, devido à

facilidade em obter, manipular e monitorar durante o desenvolvimento tem sido um modelo

popular para estudos da formação embrionária ha muito tempo (mais de 2000 anos), desde

Aristóteles, o qual estudou progressivamente os estágios da embriogênese abrindo ovos de

galinha diariamente [6] [7] [8].

Na �gura 2.1 estão apresentados todos os estágios de desenvolvimento do embrião de gal-

inha [9]. Este é um trabalho pioneiro sendo um dos artigos da literatura de desenvolvimento

5

Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 6

Figura 2.1: Estágios Embrionários. Retirado de [9].

embrionário mais citados, pois apresenta um mapeamento completo do desenvolvimento do

embrião de galinha, desde o momento em que o ovo é eclodido, nasce da galinha, até o

nascimento do embrião.

A grande vantagem de trabalhar com embriões de galinha, é que o desenvolvimento

embrionário em galinha é um processo bastante rápido. Nas primeiras 48 horas de incubação,

o embrião se transforma de um disco de células para uma estrutura trilaminar, contendo

três folhetos germinativos que vão dar origem às estruturas embrionárias [10]. Através da

�gura 2.1 conseguimos acompanhar de forma simpli�cada a formação do embrião: entre os

estágios H-H (1-3') o embrião é um disco com espessamento celular na futura região caudal,

posteriormente o espessamento celular se alonga formando uma linha entre estágios H-H

(3-4), e o disco passa a ter um formato oval. E entre estágios H-H (5-7) a linha regressa.

Ao longo deste processo estruturas vão se formando e o embrião sofre uma torssão entre os

estágios H-H (13-14), passando de uma estrutura em 2D para o espaço 3D. No estágio H-H

35 o feto estará completamente formado.


2.2 Formação do Embrião

Nesta secção inicialmenete será introduzida uma de�nição dos conceitos básicos da embri-

ologia em galinha. Vamos apresentar o processo de formação do embrião de galinha Gallus

gallus a partir dos primeiros agregados celulares até a formação de estruturas mais com-

plexas.

Oviducto: canal que inicia no ovário da galinha e segue até a cloaca, anus da galinha.

Ovo: é uma célula, formada pela fecundação do óvulo da galinha pelo espermatozóide

do galo. Durante e copula os espermatozóides do galo penetra pelo oviducto da galinha e

fecunda o óvulo. O ovo galado, óvulo fecundado, ao descer pelo oviducto é revestido pela

albumina, formando uma parede de revestimento, a clara, que vai proteger ovo de impactos

mecânicos.

Vitelo: reserva de nutrientes do ovo, a gema propriamente dita.

Clivagem: é um processo de sucessivas divisões da ciclatrícula, região ativa do ovo, esta

região contém o citoplasma ativo do ovo recém ovulado ver �gura 2.2.

Blastoderme: uma camada unidimensional de células. Formada pelo processo de su-

cessivas clivagens que ocorre na ciclatrícula. Esta região será de grande importância na

formação do embrião. A blastoderme está localizada logo acima do vitelo.

Blastômeros: células �lhas resultante de sucessivas divisões da ciclatura por mitose.

Figura 2.2: Formação da Blastoderme: (A) primeira clivagem. (B) Segunda e terceira

clivagem. (C) Quarta segmentação formando os primeiros blastômeros. (D) O número de

blastômeros aumentam rapidamente na região central, a ciclatrícula cresce e a passa a se

chamar blastoderme. Retirado de [11].

A região da ciclatrícula cresce ocupando parte do vitelo e passa a se chamar blastoderme


ou blastodisco. No momento que a blastoderme contém de 32 a 64 células inicia-se o processo

de separação dos blastômeros centrais, que não tem contato com o vitelo, dos blastômeros

periféricos, que tem contato com o vitelo, por uma fenda chamada de cavidade subgerminal,

esta cavidade esta mostrada na �gura 2.5 (A).

O número das células na região central aumentam muito mais rápido e são menores que

as células marginais. Assim a massa celular central e constituída por várias camadas de

pequenas células acima da cavidade subgerminal. Na região periférica ocorrem clivagens ho-

rizontais que separam as células em camadas superiores, mas as células inferiores desta região

ainda continuam em contato com o vitelo. Nesta fase é possível distinguir a blastoderme em

duas regiões como mostra a �gura 2.2.

Área pelúcida: formada pelos blastômeros centrais, encontra-se sobre a cavidade sub-

germinal. Como não há aderência desta área ao vitelo ela se apresenta transparente [11].

Área opaca: formada pelos blastômeros periféricos. Como esta área não se separa do

vitelo em profundidade, tem um aspecto mais denso e se apresenta mais turva (ou opaca)

[11].

Para se ter uma idéia dos tempos envolvidos no desenvolvimento da galinha, apresentare-

mos resumidamente o seu ciclo de vida. A galinha (Gallus gallus) vive em torno de sete anos.

O desenvolvimento embrionário começa com as clivagens ainda no oviducto da galinha, for-

mando a blastoderme que contém duas regiões bem de�nidas, a área opaca e a área pelúcida.

Posteriormente após ser eclodido e incubado inicia-se a Gastrulação, que vai dar origem a

linha primitiva, no estágio H-H 14 começa a formação dos órgãos no embrião e após 21 dias

de incubação o embrião está pronto para nascer.

Gastrulação

Para prosseguir o desenvolvimento embrionário fora da galinha, o ovo deve ser incubado a

37, 500C e mantido a uma umidade relativa de 50%. Nas primeiras horas de incubação inicia-

se o processo da gastrulação. No �nal deste processo o germe do embrião estará formado

pelos três folhetos germinativos, ectoderme, mesoderme e endoderme. A gastrulação

consiste na migração das células do Epiblasto para o espaço entre o Epiblasto e

Hipoblasto, como mostra a �gura 2.3. Esta migração ocorrerá através da linha primitiva e

da fosseta primitiva do nó de Hensen, que serão de�nidas a seguir.


Figura 2.3: Gastrulação: consiste no deslocamento do nodulo de Hensen da região ventral

para a região dorsal. Retirado de [11].

Formação e Regressão da Linha Primitiva

Formação da linha primitiva: a maior característica da gastrulação em aves, anfíbios e

mamíferos é a formação da linha primitiva. Nota-se um espessamento celular na região caudal

que se alonga para a futura região da cabeça do embrião como mostra a �gura 2.1 entre os

estágios H-H (1-3'). A linha primitiva termina em uma zona mais brilhante, conhecida por

nó de Hensen. Durante a formação da linha primitiva a blastoderme perde sua forma circular

e alonga-se. A linha primitiva de�ne o eixo do embrião e se estende da região posterior à

anterior do embrião. As células migram entrando do lado dorsal, ao longo da futura região

da coluna vertebral, e movem para o lado ventral, separando assim a porção esquerda da

direita do embrião. As células convergem para formar a linha primitiva, e formam uma

depressão dentro da linha. Esta depressão é chamada de sulco primitivo, através da qual

células migram passando para parte interna da blastocole, cavidade entre o hipoblasto e

epiblasto. Na região anterior da linha primitiva surge uma região com espessamento de

células chamado de Nó de Hensen. No centro deste nó aparece uma depressão em forma de

funil na qual as células podem passar para parte interna da blastocole.

Regresão da linha primitiva: agora começa uma nova fase da gastrulação, com a

regressão da linha primitiva mostrado na �gura 2.1 entre os estágios H-H (5-7). O nó de


Hensen desloca da futura região do célebro, na área pelúcida, para a posição mais posterior,

futura região anal, veja a �gura 2.4(A). Ao mover o nó de Hensen em direção posterior, o

notocorda passa a cobrir a parte anterior começando no nível da futura região média do

célebro, como mostra em 2.4(B). Pode-se observar a regressão da linha primitiva na �gura

2.4(B), sinalizada pela linha grossa em vermelho, enquanto a linha preta �na representa

o aumento do notocorda. A �gura 2.4(C) mostra o nó de Hensen, na extremidades da

linha primitiva marcado com carbono, regredindo para a região posterior do embrião e

simultaneamente observa-se a formação das estruturas que vão dar origem ao embrião.

Figura 2.4: Regressão da Linha Primitiva adaptação de [11]. (A) Crescimento da linha

primitiva, alongando a região da aréa pelúcida e posteriormente a regressão da linha. (B)

Regressão da linha primitiva e crescimento do notocorda, linha primitiva sinalizada pela

linha grossa e a linha �na representa o crescimento do notocorda. (C) Regressão da linha

primitiva e o surgimento da prega cefálica e somitos durante este processo. O ponto marcado

na extremidade da linha primitiva, o nódulo de Hensen, que regressa para a região posterior

do embrião.

Como conseqüência da seqüência pelo qual são formados a região da cabeça e notocorda,

os embriões de aves e vertebrados em geral exibem um gradiente de desenvolvimento ântero-

posterior que é atenuado em estágios de maior maturidade. Enquanto as células da porção


posterior do embrião participam da gastrulação, as células no �m da porção anterior estão

começando a formar os órgãos. Tudo isso ocorre paralelamente a somitogênese, formação

de blocos compactados de células, os somitos. Assim nos próximos dias de incubação o �m

anterior do embrião exibirá um desenvolvimento maior que o �m posterior.

Folhetos Embrionários

Grande parte das células centrais da blastoderme formaram o Epiblasto �gura 2.5 (A). Outra

parte destas células migraram para a cavidade subgerminal, formando arquipélagos celulares

contendo de 5 a 20 células. Esse conjunto de vários arquipélagos celulares forma o hipoblasto

primário, �gura 2.5 (B). Na região posterior do embrião localiza-se o crescente de Koller, as

células desse crescente migraram da região anterior para posterior ligando os conjuntos de

células formando assim o hipoblasto secundário �gura 2.5 (C).

Figura 2.5: (A)Formação do Epiblasto. (B)Formação do hipoblasto primário. (C)Formação

do hipoblasto secundário. Retirado de [11].

O embrião forma-se inteiramente a partir do epiblasto, do qual se origina os três folhetos

germinativos: ectoderme (ecto=externo), mesoderme (meso=meio), endoderme (endo=interno),

aminion e mesoderme extra-embrionária. Enquanto oHipoblasto dá origem ao saco vitelino.

Posteriormente da Ectoderme se originam a pele, sistema nervoso e a crista neural. Da

Mesoderme se originam a notocorda, músculo rins e sangue. E da Endoderme se originam

tubo digestivo, faringe e tubo respiratório.


A endoderme é formada pelas primeiras células a migrarem através do nó de Hensen,

estas células estão marcadas em amarelo na �gura 2.3. Dentro da bastocole as células do

hipoblasto, em verde na 2.3, migram con�nando as células da endoderme entre as células do

epiblasto. As próximas células a entrarem na blastocole, através do nó de Hesen, assumem

uma posição entre o endoderme e o epiblasto formando a mesoderme, células marcadas

em rosa na �gura 2.3. Enquanto as células presuntivas da mesoderme e endoderme estão

movendo internamente, as percussoras da ectoderme proliferam no epiblasto. Além disso,

as células da ectoderme migram ao redor da gema pelo epiblasto. A gema é cercada pelo

ectoderme. A gastrulação em aves traça um fechamento, a ectoderma cerca a gema, a

endoderme substituiu o Hipoblasto, e a mesoderme se posiciona entre estas duas regiões.

Mesoderme Paraxial.

Nesta subsecção vamos apresentar a mesoderme Paraxial. O Ectoderme no estágio da neu-

rulação do embrião pode ser dividida em cinco regiões, mesoderme intermediária, corda-

mesoderme, mesoderme paraxial, mesoderme lateral e tubo neural mostrado na �gura 2.6.

Figura 2.6: Regiões da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediária e Paraxial com os

respectivos derivados. Retirado de [11].

A mesoderme paraxial, é uma região que vai dar origem aos somitos, blocos de células

do mesoderme em ambos os lados do tubo neural. As células da região que irão formar a

cabeça e os somitos, que produzirão tecidos conectivos, a saber: osséo; músculo; cartilagem


e derme. A mesoderme intermediária, forma o sistema urogenital. A corda-mesoderme

contém material que dará origem ao notocorda. A placa da mesoderme lateral dará origem

ao coração, veias sanguíneas, células do sangue e sistema circulatório, bem como a linhagem

da cavidade do corpo, além disso, formará membranas extra-embrionárias, importantes para

transportar nutrientes no embrião.

Uma das tarefas da gastrulação é criar a camada da mesoderme entre a endoderme e a

ectoderme. A formação da mesoderme e órgãos da endoderme ocorrem simultaneamente à

formação do tubo neural. O notocorda estende debaixo do tubo neural da base da cabeça até

a cauda. Com a regressão da linha primitiva, as pregas neurais começam a se juntar ao centro

embrião, a mesoderme paraxial se separa em blocos de células chamado somitos. Embora

os somitos sejam estruturas transientes, elas são extremamente importantes na organização

do padrão segmental dos embriões de vertebrados. Os somitos determinam o caminho de

migração das células da crista neural e o eixo do nervo espinhal.

Somitogênese

A somitogênese é o processo de formação dos somitos, massas celulares compactadas en-

�leiradas imediatamente na lateral da dobra neural �gura 2.7. Os somitos darão origem as

células que formarão as vértebras e costelas, a derme da pele dorsal, o músculo esquelético

das costas e os músculos esqueléticos da parede do corpo e membros.

Primeira estrutura organizada metamericamente que aparece no embrião de galinha são

os somitos. Estes se originam da divisão do mesoderme dorsal para formar blocos de massas

celulares.

A adição regular dos somitos durante o crescimento do embrião em idade faz com que

o número de somitos seja um critério con�ável para analisar o estagio de desenvolvimento.

Embriões que tenham sido incubados por um dado número de horas encontram-se em estágios

bastante diferentes, enquanto embriões com o mesmo número de somitos variam muito pouco

entre si. Assim normalmente designamos o estágio do embrião com base no número de pares

de somitos que ele tem formado. A palavra par usualmente é omitida, mas entendemos que

um embrião de 6 somitos é um embrião de 6 pares de somitos [12]. Até agora tratamos do

estágio de desenvolvimento do embrião em horas, porque ainda não tinha sido introduzido

a somitogênese e sua importância para designar o estágio do embrião.


Figura 2.7: Em (A) está apresentado o embrião indenti�cando a região dos somitos. Em

(B) está mostrando um zoom dos somitos, massas celulares compactadas.

Componentes importantes da somitogenese são: periodicidade, epitelização, especi�cação

e diferenciação. Os primeiros somitos aparecem na porção anterior do tronco, e os novos

somitos brotam do �nal da mesoderme paraxial em intervalos regulares.

A partir das 25 horas começam a se formar os primeiros pares de somitos e a cada 90

minutos surge um novo par e assim sucessivamente até o embrião estiver completamente de-

senvolvido com 52-somitos. Existe na literatura muitos trabalhos sobre os mecanismos que

controlam a periodicidade na formação dos somitos, um agente chave é a expressão gênica

[6] [13]. Apresentaremos um modelo para ilustrar como ocorre à divisão da mesoderme. É

expresso na parte mais caudal da mesoderme não segmentada uma onda cíclica a cada 90

minutos metamerizando-a, como se fosse uma onda na praia que vai deixando conchas na

areia como mostra a �gura 2.8 [6]. A associação do processo de segmentação foi primeira-

mente reconhecido em embriões de galinha como ondas cíclicas expressas nas células da


mesoderme que estão relacionadas aos fatores de transcrição do gene c-hairy1[13]. Este gene

é fortemente expressado na mesoderme pre-somática, onde mRNAs exibem ondas cíclicas

de expressão as quais correspondem a periodicidade de formação de um somito a cada (90

min). O movimento aparente destas ondas é devido aos pulsos coordenados da expressão

c-hairy1, não esta ligada ao deslocamento de células ao longo do eixo ântero-posterior tam-

pouco com a propagação de um sinal. A expressão rítmica do c-hairy1 é uma propriedade

autônoma da mesoderme paraxial funciona como um relógio oscilador. Este oscilador foi

denominado de relógio de segmentação, pois controla a transcrição periódica de um grupo

de genes, chamados genes cíclicos. Estes genes cíclicos, ativam e desativam a transcrição

do c-hairy1 dentro de um processo auto- recursivo [6] [13]. Além disso, a expressão gênica

está relacionada com a posição na qual o somito se separará da mesoderme não segmentada.

O processo de diferenciação das células somáticas em estruturas mais complexas também

envolve fatores de expressão gênica [13] [14].

Figura 2.8: Um modelo da Somitogênese determinando a segmentação horária

e a frente de onda: são caracterizados pelo FCF (Fator de crescimento de �broblasto)

este está marcado (lilás), e pela concentração de acido retinoíco (verde) [6]. A cada 90 min

um novo par de somitos surge. A expressão gênica da onda cíclica é controlada pelo relógio

oscilador de segmentação que esta marcado ao lado esquerdo do embrião (laranja). A linha

preta marca o limite entre a mesoderme não segmentada (pre-somática) e a segmentada.

Retirado de [6].


2.3 Formação do Coração Durante o Desenvolvimento Embri-

onário

Nesta secção descreveremos a formação anatômica dos primeiros estágios do coração de

galinha (Gallus gallus) acompanhada de sua função �siologica. O coração é um dos primeiros

órgãos a funcionar durante o desenvolvimento do embrião, nos embriões de galinha é possível

acompanhar seu desenvolvimento em embriões cultivados in vitro. O coração é derivado da

mesoderme, e é uma estrutura não pareada, mas surge de um primórdio pareado o qual é

a primeira estrutura a estar extremamente separada de um dos dois lados na linha média

�gura 2.9.

Figura 2.9: Corte transversal da região pericardial do embrião em vários estágios de desen-

volvimento mostrando a formação do coração. (A) Às 25 horas, (B) às 26 horas, (C) às 27

horas, (D) às 28 horas. Retirado de [11].

O coração origina-se da mesoderme lateral, na embriogênese esta camada se divide em

duas, a camada mais interna se une à mesoderme formando a esplanctopleure e a mais ex-

terna à mesoderme formando o somatopleure, como mostra a �gura 2.9 (A). Os primeiros

clusters de células surgem internamente na esplanctopleure entre a camada da mesoderme e

a endoderme como mostra �gura 2.9 (A). Estes clusters de células formaram espessamentos

que darão origem a estruturas tubulares, o primórdio do endocárdio, um par de estruturas

tubulares delicados como mostra �gura 2.9 (B), estas estruturas darão origem a linhagem

endotelial do coração. Grande parte do espessamento original mesodérmico formará a parte

lateral dos tubos como o primórdio do epicárdico, que está destinado a aumentar a parte de


revestimento externo do coração, e camadas musculares pesadas do coração como o miocár-

dio. Em seguida o primórdio do endocárdio, estruturas tubulares, ou tubo endocardial, vão

se aproximando um do outro. Esse processo é concomitante ao fechamento do intestino

�gura 2.9 (C), todos os fenômenos aqui ocorrem sincronizadamente. E �nalmente quando o

embrião completa 29 horas os tubos se fundem formando um único tubo, o Endocárdio como

mostra a �gura 2.9 (D). A parte interna é o Endocárdio, a parte do meio é o Miocárdio e o

revestimento externo posteriormente formará o Epicárdio.

Figura 2.10: (A) As primeiras migrações celulares para formar os tubos do coração, (B)

tubos formados, (C) fusão dos tubos, (D) deslocamento do tubo resultante para a direita.

A linha numerada (1-4) representada o corte da secção transversal da �gura 2.9. Retirado

de [12].

Analisando a formação do coração sob um plano ventral. Sob este plano é possível ob-

servar as células na região do primórdio do endocárdio formando um espessamento celular

�gura 2.10(A). Este espessamento dará origem às estruturas tubulares �gura 2.10(B), estas

estruturas tubulares se encontram primeiro separadas e localizadas ao lado da linha média.

E posteriormente, quando estes tubos estão mais calibrados são aproximados um do outro

�gura 2.10(C). Em um momento posterior ocorre a fusão dos tubos formando o Endocárdio, e


o coração é deslocado para à direita. Através de um estudo cuidadoso das secções do coração

foi descoberto à presença de uma geléia cardíaca entre o miocárdio e o endocárdio [12]. Em

embriões vivos esta geléia aparece homogênea e tem uma função importante de prender o en-

docárdio ao miocárdio, e fazer com que se movam juntos sincronizadamente quando o coração

começa a pulsar. É funcionalmente interessante não apenas como uma unidade mecânica

do endocárdio e miocárdio durante estágios prematuros, mas, posteriormente ela servirá de

substrato em que as células migrarão movendo e formando tecidos celulares bem organiza-

dos. As regiões fundamentais estão começando a ser formadas. No �nal do desenvolvimento

do coração em direção a seu ao seu despejamento �nal serão formados: ventrículo, átrio,

seios venosos e artérias troncosas.

Às 33 horas de incubação, no estágio de 9-somitos, o coração está alargado e deslocado

para a direita da linha média. Neste momento se iniciam as primeiras contrações. Das 36-38

horas, no estágio de 16 somitos, o sangue começa a circular. O Átrio e o ventrículo estão

se estabelecendo. Além disso, parte do coração se encontra mais dobrado para a direita.

E apartir do estágio H-H 14 veja na �gura 2.1 o embrião encontra-se bem deslocado para

à direita. Neste estágio o embrião passa de sua forma planar para a forma mais côncava.

A função �siológica do coração durante o desenvolvimento embrionário está diretamente

relacionada ao processo de sua formação anatômica. A seguir veremos que a dinâmica das

contrações está diretamente relacionada ao processo de formação do coração.

Batimento Cardíaco

As contrações do coração vão se de�nindo durante a formação do coração. Inicialmente os

batimentos são aleatórios e irregulares e com o desenvolvimento do coração esta freqüência

vai se tornando menos aleatória. A partir do quarto dia de incubação estes batimentos

tornam-se mais regulares e provalvemente a freqüência de batimento do embrião já estará

bem próximo de um individuo adulto (5 batimentos/s) [15] [16] [17][18].

Estágio 10 [33-38 horas]- 10 somitos. Durante este estágio começam as primeiras

contrações do coração que tornam-se aparentes no nível da região ventricular, estas con-

trações são ambas irregulares e intermitentes. As contrções se iniciam bem antes do sangue

começar a circular no embrião. Contrações regulares e circulação efetiva do sangue serão

estabelecidas durante estágios posteriores do desenvolvimento [15].


Estágio 11 [40-45 horas]-13 somitos. Durante este período as contrações cardíacas

que inicialmente começaram na area ventricular tornam-se regulares [15].

Estágio 12 [45-49 horas]-16 somitos. Neste estágio o átrio está formado, e as batidas

cardíacas passam a ser controladas pelo átrio, agora à uma taxa mais rápida que quando

estavam com o controle do marca-passo ventricular. No �m deste estágio, a circulação do

sangue torna-se aparente na direção cefalica-caudal [15].

Assim no quarto dia de incubação o coração já esta completamente formado e os bati-

mentos já são bem próximos de uma galinha adulta.

Capítulo 3

Microscopia de Desfocalização

Neste capítulo será apresentado a Microscopia de Desfocalização, técnica que começou a

ser desenvolvida durante o doutorado do Professor Ubirajara Agero no laboratório de Física

de Sistemas Biológicos da UFMG, com o Professor Oscar Nassif de Mesquita [4] [19] [5][20].

Ao estudarem estruturas nas membranas de macrófagos, células brancas que fazem parte do

sistema imune, eles observaram que ao variar o foco as estruturas na membrana mudavam o

contrate. A observação deste fenômeno levou ao desenvolvimento da técnica. Desde então

tem-se feito vários trabalhos no nosso laboratório para mostrar a capacidade da técnica,

torná-la mais robusta e disseminar sua aplicação no meio cientí�co.

Na dissertação do aluno Ulisses Moreira Silveira Andrade, investigou-se os limites da

aproximação paraxial que foi utilizada no desenvolvimento do modelo teórico da técnica. Os

resultados obtidos experimentalmente mostraram-se bastantes promissores comparados com

os teóricos [2]. Para aplicar esta técnica é necessário apenas um microoscopio e um deslocador

de alta precisão, no laboratório usamos um deslocador piezoelétrico, Digital Piezo Controller

(PI E-710-3CD). Através da Microscopia de Desfocalização é possível obter informações

quantitativas de objetos de fase, que outras técnicas ópticas não conseguem extrair. As

membranas biológicas bem aderidas em um substrato são objetos ideais para aplicação da

20

Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 21

Microscopia de Desfocalização pois se comportam como um objeto de fase.

Os objetos de fase são transparentes quando estão no foco, tornando-se visíveis quando

desfocalizados por um microscópio óptico operando em campo claro. A desfocalização do

objeto introduz uma diferença de fase entre a luz difratada e a luz não difratada que produz

um contraste não nulo quando estas interferem no plano imagem. Devido a esta característica

é difícil observar estes objetos no microscópio óptico, sendo necessário o uso de técnicas de

contraste de fase. Uma das técnicas mais usadas é o contraste de fase descrita por Zernike

em 1935. Nesta técnica a mudança na intensidade da imagem é proporcional a mudança de

fase no objeto. Enquanto que na Desfocalização a intensidade local da imagem do objeto é

proporcional a curvatura local. Esta técnica extrai informações físicas da membrana celular,

pois a curvatura é um parâmetro importante na dinâmica de superfícies e a partir deste dado

pode-se obter informações das atividades que ocorrem na célula.

Grande parte dos biólogos que trabalham com técnicas tradicionais de contraste de fase

não conseguem explorar muitas informações quantitativas da dinâmica que ocorre na mem-

brana celular. Atualmente o laboratório tem colaborado bastante com biólogos que buscam

obter maiores informações de membranas, procurando entender os processos dinâmicos que

ali ocorrem.

Aqui será esboçado um tratamento matemático desta técnica apenas apresentando-a.

Pois um tratamento mais rigoroso e detalhado foi desenvolvido em trabalhos anteriores

[20][2].

3.1 Campo Elétrico da Luz

Supondo um campo elétrico monocromático ~E(~r, t) de frequência, ω, e dependência har-

mônica temporal, eiωt, que se propaga na direção do vetor de onda ~k, podemos escrever:

~E (~r, t) = ~E (~r) eiωt. (3.1)

Substituindo a equação do campo elétrico 3.1 na equação de onda .

∇2 ~E = εµ∂2 ~E

∂t2. (3.2)


Obtém-se:

∇2 ~E(~r)eiωt + ω2εµ ~E(~r)eiωt = 0. (3.3)

Usando a relação: k = ωυ = ω

√εµ obtém-se a equação

∇2 ~E(~r) + k2 ~E(~r) = 0. (3.4)

A parte espacial do campo elétrico satisfaz a equação 3.4 que é conhecida por equação de

Helmholtz.

Espaço Real e espaço dos vetores de onda

Vamos trabalhar com campos elétricos escalares, que se propagam na direção do eixo z.

Podemos tratar o sistema, que se encontra no espaço real em termos do espaço dos vetores

de onda. A �gura 3.1 apresenta estes espaços.

Figura 3.1: Coordenadas do Sistema de Referência: (a) No espaço real. (b) No espaço dos

vetores de onda. Onde ~q é a projeção transversal de ~k no espaço dos vetores de onda e ~ρ é

a projeção no plano xy de ~r. Retirado de [2].

É importante introduzir este conceito porque a seguir trataremos do per�l do objeto de

fase h(~ρ), este pode ser de�nido no espaço dos vetores de onda, ~q aplicando a transformada

de Fourier.

Aplicando a transformada de Fourier:

h(~q) =

∫ ∞−∞

h(~ρ)ei~q.~ρdρ (3.5)


Para obtermos h(~ρ) podemos aplicar a transformada inversa:

h(~ρ) =

∫ ∞−∞

h(~q)e−i~ρ.~qd~q (3.6)

Propagação do campo elétrico através de um objeto de fase.

Agora vamos propagar campo elétrico através de objetos de fase. Como descrito anterior-

mente, membranas celulares bem aderidas em um substrato se comportam como objetos de

fase. Objetos de fase são aqueles que mudam a fase da luz incidente sem que ocorra perda

de intensidade. A �gura 3.2 apresenta um esboço de um campo elétrico atravessando um

objeto de fase, que podemos pensar ser a região de uma célula dentro de um meio, separados

pela membrana celular.

Figura 3.2: Esboço de um objeto de fase. Onde ~E0 é o campo elétrico incidente, h(~ρ) é a

amplitude do objeto , n1 e n2 são índices de refração do meio por onde o campo elétrico se

propaga , ~ρ é o vetor posição no plano (x, y) perpendicular à direção z de propagação do

campo elétrico.

A variação da fase do campo elétrico no espaço livre, com índice de refração n1, propa-

gando por uma distância d é dada por:

φ0 = n1k0d. (3.7)

Considerando o objeto de fase, a fase introduzida é dada por:

ϕφ(~ρ) = n1k0(l + h(ρ)) + n2k0[d− (l + h(~ρ))], (3.8)


Assim, a diferença de fase é dada por:

∆φ(~ρ) = ϕφ(~ρ)− φ0 (3.9)

= (n1 − n2)k0(l − d) + (n1 − n2)k0h(~ρ)

= −∆nk0(l − d)−∆nk0h(~ρ)

= constante+ φ(~ρ),

(3.10)

Onde ∆n = n2 − n1.

Então, temos que o campo elétrico ao passar por um objeto de fase é dado por:

~E(~ρ) = E0ei∆φ(~ρ). (3.11)

Retirando o termo contante da fase , pois esta não interfere nos cálculos e substituindo

em 3.11 obtemos:

E(~ρ) = E0eiφ(~ρ) = E0e

−i∆nk0h(~ρ), (3.12)

onde E0 é o campo elétrico incidente.

A equação 3.12 é uma aproximação local para o campo elétrico difratado e deixa de ser

válida para componentes de Fourier de h(~ρ) com números de onda comparáveis ou maior

que o número de onda da luz incidente no meio.

Para φ(~ρ) << 1, o campo elétrico incidente da equação 3.12 é dado por:

E(~ρ) ≈ E0 [1− iφ(~ρ)] = E0 [1 + i∆nk0h(~ρ)] . (3.13)

Como de�nimos em 3.6, é possivel escrever E(~ρ) no espaço dos vetores de onda ~q. E o

vetor ~q representa a ondulação na interface. Assim o campo elétrico ao atravessar um objeto

de fase no espaço dos vetores de onda é dado por:

E(~q) = E0

[1 + i∆nk0

∫ ∞−∞

h(~q)e−i~ρ.~qd~q

]. (3.14)


3.2 Propagação do Campo Elétrico através do microscópio

desfocalizado

Nesta secção apresentaremos a propagação do campo elétrico através do microscópio desfo-

calizado. No microscópio com óptica corrigida no in�nito, o objeto é colocado no foco da

objetiva, assim a imagem é formada no in�nito, por isso é necessário introduzir uma lente

para que a imagem seja conjugada na ocular a qual é conhecida como lente de tubo. A �gura

3.3 representa um esboço do sistema óptico utilizado no laboratório.

Figura 3.3: Esquema óptico do microscópio com óptica corrigida no in�nito: S é a fonte de

luz branca, L1 é a lente objetiva com distância focal f1, L2 é a lente de tubo com distância

focal f2, O é o objeto que está no foco de L1, d é a distância entre lentes, I é o plano imagem

que está no plano focal de L2. (a) Esboço do Microscópio. (b) Microscópio desfocalizado,

é introduzido uma pequena desfocalização ∆f na distância focal da lente L1, a imagem é

desfocalizada no plano I.

O termo −k0f1

kf2que é o fator de magni�cação do microscópio, e o sinal negativo signi�ca

que a imagem é invertida.

Para encontrar o campo elétrico ao passar pelo microscópio desfocalizado, é calculado


o campo após passar por cada elemento óptico como mostrado em [20][2]. O campo �nal

obtido ao passar pelo microscópio desfocalizado e levando se em conta essa desfocalização é

dado por:

E(~ρ,∆f) = ceiβ(~ρ′)E0

{1 + i∆nk0

∫ ∞−∞

h(~q)e−i~ρ.~qd~q)ei∆f2kq2

}(3.15)

Onde c = 1i2π

√k0f1

kf2

E β(~ρ′) é dado por:

β(~ρ′) =

[k(f1∆f) + k0d+ k0f2 +

k20

2f22

(f1

k− d

k0+f2

k0

)]~ρ (3.16)

Vamos obter o contraste de fase de um objeto desfocalizado.

O contraste é dado por:

C(~ρ,∆f) =I(~ρ,∆f)− I0

I0= 0 (3.17)

Obtendo a intensidade para um objeto desfocalizado:

I(~ρ,∆f) = |E(~ρ,∆f)|2

= c2|E0|2{

1 + i∆nk0

[∫ ∞−∞

h(~q)e−i~ρ.~qd~q(ei

∆f2k q2 − ei

∆f2kq2)]}

= I0

{1− 2∆nk0

[∫ ∞−∞

h(~q)e−i~ρ.~qd~qsen(∆f

2kq2)

]}.

(3.18)

Substituindo 3.18 em 3.17 obtemos:

C(~ρ,∆f) = −2∆nk0

[∫ ∞−∞

h(~q)e−i~ρ.~qd~qsen

(∆f

2kq2

)]. (3.19)

O contraste é uma função oscilatória com frequência q2

2k . Para pequenas desfocalizações

temos: sen∆f2k q

2 ≈= ∆f2k q

2 E a relação do contraste de fase torna-se:

C(~ρ,∆f) = −2∆nk0

∫ ∞−∞

∆f

2kq2h(~q)e−i~ρ.~qd~q (3.20)

Como k = n2k0 obtemos:

C(~ρ,∆f) = ∆nk0

∫ ∞−∞

∆f

n2k0q2h(~q)e−i~ρ.~qd~q

=∆n

n2∆f

∫ ∞−∞

q2h(~q)e−i~ρ.~qd~q

(3.21)


Portanto temos uma expressão para o contraste de fase da qual é possível obter caracterís-

ticas quantitativas de células aderidas em especial da dinâmica que ocorre nas membranas

celulares.

Para ∆f = 0 ⇔ microscópio não desfocalizado a equação do contraste torna-se:

C(~ρ,∆f = 0) =∆n

n2∆f

∫ ∞−∞

q2h(~q)e−i~ρ.~qd~q = 0.

Este resultado mostra que os objetos de fase não são visíveis quando estão no foco. A

desfocalização introduz uma diferença de fase ∆f , entre a luz difratada e a não difratada

que ao se interferirem no plano imagem produz um contraste diferente de zero, e assim é

possível visualizar o objeto.

Capítulo 4

Montagem Experimental

Neste capítulo será apresentada toda a montagem experimental desenvolvida neste tra-

balho, bem como todos os protocolos de extração e cultura de embriões, além dos procedi-

mentos usados pra se estabelecer a cultura de células extraídas dos embriões. Nesse trabalho

foi possível adaptar os protocolos de extração e cultura de embrião existentes na literatura

ao laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento de Física. Além de esta-

belecer um protolo de extração e cultura de células mesenquimais somáticas extraídas dos

embriões em estágios prematuros.

4.1 Extraindo Embriões

Os embriões de galinha são obtidos de ovos fertilizados fornecidos pela empresa Rivelli.

Utilizamos uma linhagem para frangos de corte do tipo Cobb Avian tipo 1. Usando uma

incubadora que mantém o ambiente a 37 0C e umidade de 50 % obtêm-se embriões de galinha

em vários estágios de desenvolvimento. Os embriões são extraídos seguindo o protocolo

descrito em [1], que explicitaremos com mais detalhes a seguir.

28

Capítulo 4. Montagem Experimental 29

Protocolo de Extração de Embriões

Material:

• Incubadora que mantém o ambiente a 37 0C e 50 % de umidade, a que utilizamos tem

capacidade para incubar 20 ovos.

• Ovos fertilizados.

• Papel �ltro cortado em forma de anel.

• Pratos petri fundo com 10cm de diâmetro.

• Um aro de arame.

• Tesoura ponta �na.

• Pinça metálica de ponta �na.

• PBS (do inglês Phosphate-Bu�ered Saline) com pH de 7,4.

• Béquer de 1L.

Preparando PBS (Phosphate-Bu�ered Saline).

O PBS pH 7,4 é preparado a partir da diluição de duas soluções bases: solução doadora

(D) e a solução aceitadora (A).

Preparando a solução aceitadora:

• Dissolver 5 mM de Na2HPO4 (Fosfato de Sódio Dibásico Anidro) em 600 mL de H2O

deionizada (DI). Um mol de Na2HPO4 corresponde a m=141,96 g, assim a massa

correspondente a 5 mM será m=426 mg.

Preparando a solução doadora:

• Dissolver 10 mM de NaH2PO4 (Fosfato de Sódio Monobásico Anidro) em 500mL de

H2O DI. Um mol de NaH2PO4 corresponde a m=137,99 mg, então a massa corre-

spondente a 10 mM será m=690 mg.

Para obter o PBS de pH 7,4: 44,6 mL da solução doadora é díluída em 355,4 mL da

solução aceitadora. Posteriormente acrescenta-se 3,27g de NaCl, o pH deverá ser medido


para a con�rmação após o acréscimo de NaCl, pois o pH da solução será levemente alterado.

A osmolaridade desta solução é aproximadamente 0.14M.

Procedimentos

1. Limpar os ovos com álcool 70%.

2. Para romper a casca do ovo: deve-se segurar o ovo horizontalmente na mesma posição

retirado da incubadora, sobre o prato petri de 10 cm de diâmetro, abrir o ovo e remover

a casca. Na maioria dos casos, a blastoderme estará posicionada na parte superior e

aproximadamente na região central da gema.

3. Identi�car a região onde está o embrião, esta região não será nítida nos primeiros

estágios .

4. Retirar o excesso da clara com o aro de arame na região próxima ao embrião, com

cuidado pra não destruir o embrião, pois este é muito frágil. É necessário retirar todo

o excesso de clara para permitir uma boa adesão do papel �ltro em forma de anel à

membrana vitelina.

5. Colocar o anel sobre a membrana vitelina, de forma a cobrir a região onde o embrião

se encontra. É importante que o anel esteja bem aderido a membrana para evitar que

este despreenda da membrana durante o experimento.

6. Recortar com a tesoura a região ao redor do anel.

7. Retirar o anel de papel da superfície da gema com a pinça �na, o anel deve conter em

seu meio o embrião. Retirar o anel sempre obliquamente à superfície, para evitar que

o embrião se depreenda do anel e que não ocorra acúmulo de gema.

8. Em um prato petri de 10 cm colocar PBS, lavar o embrião no PBS de forma a retirar

todo o excesso de gema. Deixando assim a região em que o embrião se encontra

totalmente transparente. Isso é importante porque facilitará a visualização do embrião

na Lupa ou no microscópio.

9. Assim o embrião está pronto para ser cultivado ou para extrair material dos somi-

tos. Sendo que para serem cultivados é necessário a produção de um meio de cultura


Figura 4.1: (a) Incubadora com 20 ovos. (b) Bancada preparada para extração dos embriões.

(c) Os embriões sendo preparados para extração das células dos somitos. (d) Os embriões

levados à Lupa para observar o batimento cardíaco e o crescimento de vasos.

Agar+Albumina que será descrito posteriormente quando tratarmos de cultura de em-

brião.

10. O béquer será utilizado para colher o restante do ovo, o qual o embrião foi retirado.

Em média conseguimos obter 75 % de embriões dos 20 ovos colocados na incubadora.

No �nal dos experimentos tínhamos o equivalente a 1L de material restante dos ovos.

Imagens do processo de extração são mostradas na �gura 4.1.

É importante que todo material usado neste protocolo seja limpo com álcool etanol 70%

e esterilizado. O processo de esterilização usado neste trabalho será descrito a seguir:

Esterilização


1. Levar o material ao microondas juntamente com um béquer de 1L de água e deixar

por 4min. A água do béquer deve ser trocada à cada 4min. Este processo é repetido 4

vezes, que equivale deixar o material 16 minutos no microondas. Durante os 4min que a

água permanece no microondas ela começa a entrar em ebulição, assim o sistema atinge

uma temperatura próxima à 100 0C. À esta temperatura grande parte das bactérias

que conseguem sobreviver a temperatura ambiente morrem. É sempre importante

entre um intervalo e outro manter a porta do microondas fechada.

2. Posteriormente todo o material deve permanecer na luz UV por 20 minutos para de-

struir o restante dos microorganismos.

4.2 Extraindo células dos somitos do embrião

Um dos primeiros padrões estruturados que surgem no embrião em desenvolvimento são os

somitos. As células dos somitos ainda possuem grande capacidade de diferenciação, mas

começam a apresentar alguma especialização com surgimento de epitélio nas bordas. Para

extrair células dos embriões precisamos de um embrião que já tenha somitos desenvolvidos,

entretanto como queremos obter parâmetros que caracterize células não especializadas, é

necessário que o embrião se encontre em um estágio prematuro, ou seja, com pouca diferen-

ciação celular. O embrião no estágio 10 atende estes requisitos segundo [9]. Para se obter

o embrião no estagio 10 o ovo deve permanecer de (33-38) horas na incubadora a 37 oC e

a 50 % de umidade. Como descrito no capitulo 2, neste estágio já houve a segmentação da

mesoderme somática, e o embrião apresenta de 7 a 10 pares de somitos, mas seu sistema

nervoso ainda encontra-se bastante prematuro. A região de interesse para a extração de

células são os somitos mostrados na �gura 4.2, a �gura apresenta um embrião com 9 pares

de somitos.

O material removido dos somitos é extraído usando uma micropipeta com uma ponta de

15 µm a 20 µm de diâmetro. Construimos as pipetas com um puxador comercial de pipetas,

Pipette Puller (CE-HEKA). Realizamos várias tentativas até encontrar os parâmetros que

nos permitiram obter a pipeta com a ponta de dimensões desejadas. Desenvolvemos a

montagem para conectar a micropipeta, por uma mangueira, à uma seringa e assim conseguir

sugar o material dos somitos. A micropipeta esta ligada a um deslocador (x,y,z), o qual


Figura 4.2: Embrião com 9 pares de somitos. Estão identi�cadas acima as principais estru-

turas do embrião no estágio H-H 10 segundo [9]. Esta foto foi obtida com uma Lupa (modelo

GWH10X-D OLYMPUS-JAPAN), calibração da Lupa 1pixel=0.007mm.

permite escolher com bastante precisão o somito do qual será sugado o material 4.3.

O material removido dos somitos é colocado em portas-amostra de acrílico com aproxi-

madamente 0.5ml de meio de cultura RPMI 1640. Como segue os protocolos a seguir.

Porta-Amostras

Para observar as células com objetiva de pequena distância de trabalho foi necessário de-

senvolver portas-amostra especiais os materiais e procedimentos estão descritos a seguir.

Material:

• Reservatório de acrílico de 1,5ml.

• Lamínulas de microscópio (CORNING).

• Graxa de silicone para AUTO-VÁCUO.

• Mistura de ÁLCOOL-ETER 50% de cada.

• Papel de seda branco.


Figura 4.3: Montagem Experimental. (a) Micropipeta acoplada por uma seringa a um

deslocador (x,y,z). (b) Embrião após remover material de um somito.

Todo procedimento abaixo foi realizado dentro do �uxo laminar para evitar a contami-

nação das amostras.

Procedimentos

1. As lamínulas permanecem mergulhadas na mistura de ÁLCOOL-ETER 50% em um

recipiente fechado de um dia para outro. Esta solução retira qualquer gordura da

superfície das lamínulas permitindo ou facilitando a adesão das células

2. As lamínulas devem ser secadas usando papel de seda branco.

3. Os reservatórios de acrílico serão colados às lamínulas usando a graxa de silicone para

auto-vácuo.

Atualmente existe no mercado alguns porta-amostras, apropriados para cultivar células

que posteriormente serão analisadas em objetivas de pequena distância de trabalho. En-

tretanto como não conseguimos adquirir estes porta-amostras em tempo abil à conclusão

do mestrado desenvolvemos porta-amostras com reservatórios de acrilico, lamínulas e graxa

de silicone. Inicialmente encontramos di�culdade em conseguir células aderidas nos porta-

amostras fabricados, pois as colas usadas para aderir o reservatório de acrilico à lamínula

eram tóxicas às células. Posteriormente testamos uma graxa de silicone para auto-vácuo e

obtemos sucesso na cultura. Desde então obtemos células bem aderidas nos porta-amostras

fabricados.


Meio de cultura:

As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com SFB (Soro Fetal Bovino),

com proteínas inativadas. Foram usadas concentrações 10 % e 20 % de SFB.

Procedimentos para fazer 50 ml de meio de cultura:

1-Preparando 50ml de RPMI com 10% SFB.

Após esterilizar todo material a ser utilizado na preparação do meio. Em um béquer de

80 ml é colocado 45 ml de RPMI, e em um béquer de 15 ml são medidos 5 ml de SFB que

será então adicionado ao béquer de 80ml. Usamos antibiotico para evitar contaminação por

bactérias, Penicilina (100Unidades/ml).

2-Preparando 50ml de RPMI com 20% SFB.

Em um béquer de 80 ml é colocado 40 ml de RPMI, e em um béquer de 15 ml são medidos

10 ml de SFB que será então adicionado ao béquer de 80 ml. Todo este procedimento deverá

ser realizado dentro de um ambiente esteril, a capela. Foi observado um maior número de

células aderidas nas amostras que estavam com meio suplementado a 20% de SFB.

Cultura de Células Mesenquimais Somáticas.

A cultura de células mesenquimais somáticas é obtida através do material removido dos

somitos que será mantido em cultura com meio RPMI 1640. O cultivo de células é muito

suscetível à contaminações. Assim, antes de iniciar o processo de colhimento de material dos

somitos para ser colocado em cultura, todo material a ser utilizado na cultura deve estar

previamente separado e esterilizado.

Material:

• Material retirado dos somitos.

• Portas-amostra de acrílico, esterilizados.

• Meio de cultura.

• Câmera de CO2 mantida a 370C e com 5% de CO2.

• Placas petri de 10cm de diâmetro com tampas descartáveis.

• Penicillina 1% da solução total.


Procedimentos

1. O material retirado dos somitos deverá ser colocado no porta-amostra de acrílico e lev-

ado rapidamente à capela para evitar qualquer tipo de contaminação com o ambiente.

O esquema de extração de material dos somitos é mostrado na �gura 4.3-(a).

2. Acrescentar 1ml de meio de cultura RPMI 1640 ao reservatório de acrílico.

3. Os portas-amostra são colocados em placa petri, e levados a câmera de CO2 onde

permaneceram de 2 a 3 dias. Cada placa de petri pode conter até dois portas-amostra.

O meio de cultura deve ser trocado todos os dias para manter o meio sadio e evitar

possíveis contaminações. As células realizam metabolismo rápido e consequentemente o pH

do meio muda, conseguimos identi�car a variação de pH pela mudança da coloração no meio

de cultura. Quando os portas-amostra são colocadas na câmera de CO2 o meio contém uma

coloração rósea e posteriormente quando as células iniciam o metabolismo o meio torna-se

mais amarelo. Se ocorrer uma contaminação por fungo, por exemplo, o tom amarelado

normalmente torna-se bastante escuro. Isso pode ocorrer durante a obtenção de células, e

nesse caso as células devem ser descartadas e o procedimento para obtenção das células deve

ser recomeçado do princípio.

Para veri�car se as células aderiram às lamínulas é necessário aguardar de 2 a 3 dias.

Posteriormente é realizada uma lavagem nas amostras com meio de cultura suplementado

com SBF, neste processo as células não aderidas são removidas da amostra. A amostra

deverá ser levada do �uxo para a montagem experimental da �gura 4.4, normalmente tam-

pamos a amostra com uma lamínula de microscópio previamente esterilizada para evitar

contaminações.


Utilizamos a montagem mostrada no esquema da �gura 4.4 para realizarmos os experi-

mentos. A montagem é feita sobre um microscópio invertido (Nikon Eclipse TE300) com

uma objetiva de imersão a óleo (CFI Plan Apochromat 60X oil) com aumento de 60X e

abertura numérica 1,4.

Para manter o sistema à 37 0C, placas de cerâmicas são ligadas a um controlador de

temperatura e funcionam como aquecedores. Toda a montagem experimental apresentada na


Figura 4.4: Esboço da montagem experimental. A luz da lâmpada de tungstênio halógena

passa por um condensador e ilumina a amostra. A amostra está entre duas placas de cerâmica

que funcionam como aquecedores mantendo o ambiente a 37 0C, estas são ligadas a um

controlador de temperatura. A amostra é livre para deslocar em x, y, z usando um deslocador

piezoelétrico, Digital Piezo Controller (PI E-710-3CD). As estruturas são visualizadas com

uma objetiva de imersão a oléo com aumento de 60X, e as imagens são capturadas por uma

camera CCD (UNIQ Vision lnc) e processadas por um computador.

�gura 4.4 é isolada por uma caixa de acrílico. Usamos um termômetro digital (EQUITHERM

SERIE-27341) para veri�car se a temperatura próximo as amostras permanece a 37 0C.

A imagem é obtida por uma câmera CCD (UNIQ Vision lnc) que está ligada ao com-

putador. Para capturar os �lmes usamos o programa X-CAP (EPIX). E para analisar os

�lmes usamos o ImageJ, software livre http://rsbweb.nih.gov/ij/.

4.3 Cultura de Embrião

Para analisar a freqüência do batimento cardíaco e o crescimento de vasos durante o desen-

volvimento embrionário desenvolvemos um sistema de cultura de embriões no Laboratório

de Física de Sistemas Biológicos. Para tanto �zemos uma adaptação do protocolo descrito

em [21]. O meio de cultura Agar-Albumina, contém os nutrientes necessários para o embrião

http://rsbweb.nih.gov/ij/


sobreviver até 36 horas in vitro.

Preparando meio de Cultura de embriões.

Material:

• 0.18g de Agar (HIMEDIA RM-666).

• 30 ml de solução salina (0.791g de NaCl dissolvido em 100 ml de água destilada).

• 0.6 ml de Penicilina (100Unidades/ml).

• Placas petri de 35mm.

• 2 Béquers de 100ml.

• 30ml de clara �na extraída de 8 ovos frescos.

• Recipiente com grande área super�cial, e com tampa, reservatório de porta-amostras.

Todos materiais utilizados neste protocolo devem ser submetidos ao processo de esteril-

ização.

Procedimentos

1. Colocar 30 ml de salina em um béquer de 100 ml e levar a um aquecedor ou microondas.

Quando a salina começar a entrar em ebulição deve-se adicionar 0.18g de Agar e

devemos mexer até que o Agar esteja completamente dissolvido. Inicialmente a solução

tem uma coloração turva e isso indica que o Agar ainda não está completamente

dissolvido, quando o Agar esta completamente dissolvido a solução terá uma coloração

transparente.

2. Extrair 30ml de clara �na, parte mais líquida da clara, de 8 ovos frescos.

3. Aquecer a clara em banho-maria. Neste procedimento a água deve estar à temper-

atura menor ou igual à 50 0C para evitar que as enzimas presentes na clara sejam

desnaturadas, o que leva à perda da atividade biológica do meio.

4. A clara aquecida em banho-maria é adicionada no bequer contendo o Agar dissolvido

em salina. É necessário adicionar a clara devagar para evitar a criação de bolhas na

solução. As bolhas são indesejadas, pois atrapalham na obtenção dos �lmes.


5. Forrar com papel toalha o reservatório de porta-amostras e molhar para manter o

ambiente úmido, evitando assim que o meio resseque.

6. A solução é distribuida em placas petri de 35 mm, mantendo à temperatura ambiente

o meio adquire uma consistência de gelatina.

Após o embrião ser extraído, no estágio de interesse, de acordo com o protocolo de-

scrito acima e colocado em meio de cultura. O embrião é levado à montagem experimental

apresentada na �gura 4.5 para obtenção dos �lmes, que posteriormente serão analisados.


A montagem experimental apresentada na �gura 4.5 foi desenvolvida para obter �lmes

do embrião in vitro. A montagem é feita sobre uma Lupa, modelo GWH10X-D OLYMPUS-

JAPAN. Esta montagem foi realizada com a colaboração dos funcionários da o�cina mecânica

e elétrica do Departamento de Física da UFMG.

Figura 4.5: Montagem da caixa de acrílico sobre a Lupa, internamente a caixa esta acoplada

a uma resistência que funciona como um aquecedor para manter o sistema a 37 0.

Para manter o sistema à 37 0C e à umidade de 50 % montamos uma caixa de acrílico com

um orifício central, onde a amostra será colocada. Ao redor do orifício na caixa de acrílico

foi acoplada uma resistência que funciona como um aquecedor em imersão à água. A água

umedece a região ao redor da amostra, mantendo assim o ambiente nas condições necessárias

à sobrevivência do embrião in vitro. Entretanto, como a lupa está localizada logo acima da


caixa, a imagem do embrião embaçava devido a grande umidade do ambiente, sendo assim,

foi necessário retirar a água do sistema. A resistência usada era ideal para funcionar imersa

à água, ao retirar a água do sistema ela superaquecia o ambiente. Assim foi necessário ligar

ao sistema um transformador, que diminuiu a tensão da resistência. Desta forma foi possível

manter o sistema a uma temperatura constante próximo aos 370C. Um termômetro digital

foi usado para medir a temperatura próximo as amostras, e veri�car a estabilidade desta

temperatura. Atualmente já instalamos controladores de temperatura para esta montagem,

o que deverá melhorar nosso sistema experimental. A imagem é obtida por uma câmera

CCD, a captura é feita usando o X-CAP e para analisar dos �lmes usamos o Imagej, mesmo

sistema descrito anteriormente para observar células.

Capítulo 5

Resultados e Discussões

Neste capitulo, em primeiro lugar, serão apresentados os resultados obtidos usando a

Microscopia de Desfocalização, para analisar o tempo de relaxação da membrana das células

mesenquimais somáticas. Posteriormente, serão discutidos os resultados da freqüência de

batimento cardíaco e a criação de vasos durante o desenvolvimento embrionário.

5.1 Células Mesenquimais Extraídas dos Somitos

Nas primeiras tentativas para se estabelecer o protocolo de extração, cultura e o tempo

de aderência à lamínula das células extraídas dos somitos, células mesenquimais somáticas,

usamos uma objetiva de 40X para observar as amostras, pois o porta-amostra, placa-petri,

era bastante espesso e não conseguimos analisar as amostras com objetiva 60X, que possui

pequena distância de trabalho.

41

Capítulo 5. Resultados e Discussões 42

Para estabelecer o tempo de aderência das células à lamínula as amostras foram levadas

ao microscópio a partir do primeiro dia após a extração. A �gura 5.1 apresenta as amostras

observadas após o primeiro, segundo e terceiro dia de cultura.

Figura 5.1: (a) Primeiro dia após a extração, di�cilmente se observa células aderidas. (b)

Segundo dia após a extração, poucas células aderidas. (c) Terceiro dia após a extração,

maior quantidade de células aderidas.

Usualmente células de cultura necessitam de algumas horas para aderirem ao substrato

mas como podemos observar na �gura 5.1, apenas após o segundo e terceiro dia que o

material permanece em cultura é possível observar células aderidas à lamínula. Em poucas

amostras foram observados células aderidas no segundo dia de cultura, enquanto o maior

número de células aderidas em 75% das amostras é observado a partir do terceiro dia de

cultura.

Foram testadas concentrações diferentes de SFB (Soro Fetal bovino) 10% e 20% da

solução total de meio de cultura RPMI 1640. Para ambas concentrações foram observadas

células aderidas, entretanto foi observado um número maior de células aderidas para as

amostras com 20% de SFB.

Após estabelecer o protocolo de extração, cultura e o tempo de aderência das células à

laminula, a proxima etapa deste trabalho foi conseguir observar células com uma objetiva

de maior aumento, 60X. A distância de trabalho da objetiva de 60X é pequena, assim foi

necessário desenvolver porta-amostras de acrílico, cubetas de acrílico aderidos com uma graxa

de silicone à laminulas de microscópio, e com estes porta-amostras foi possível analisar as

células em uma objetiva de maior aumento.

A �gura 5.2 apresenta células extraídas dos somitos desfocalizadas de aproximadamente

1, 5µm, mantidas em cultura com 20% de SFB e com mesmo período de incubação na câmera

de CO2, entretanto estas células exibem formatos bem diferentes. Para fazer uma caracteri-


zação mais rigorosa destas células seria necessário usarmos marcadores, através destes seria

possivel detectar quais os tipos de células presentes nas amostras. Entretanto neste trabalho

o objetivo principal foi obter parâmetros quantitativos da dinâmica na membrana celular,

através dos quais conseguiriamos caracterizar o comportamento de uma célula.

Figura 5.2: Células extraídas dos somitos e bem aderidas na lamínula. Esta �gura apresenta

as células a partir do terceiro dia, do qual o material extraído dos somitos permaneceu bem

aderido em cultura.

Caracterizando a membrana das células mesenquimais somáticas.

Para caracterizar as células foi obtido o tempo de relaxação da membrana. Para isto foram

feitas analises de correlação temporal do contraste de �lmes digitalizados. A �gura 5.3

apresenta uma célula que exibe duas regiões com comportamentos diferentes. A seta indica

a direção de movimento de cada região da membrana.

Os tempos de correlação temporal foram obtidos a partir de um �lme de 10 minutos cap-

turado pelo programa X-CAP(EPIX) e processado usando um plugin do Imagej, Correlação

Temporal Média Pixel segue em Anexo. Através deste plugin obtemos as curvas correlação

temporal para o contraste, que podem ser ajustadas pela equação 5.1, que apresenta um

decaimento exponencial simples.

⟨C(~r, t′)

⟩〈C(0)C(t)〉 = (∆n∆f)2

⟨k2⟩e−

tτ . (5.1)

Onde ~r é a distância pixel a pixel, t é o tempo entre um pixel e o pixel de referência.

∆n é a diferença dos índices de refração entre o meio e o objeto de fase, as células. ∆f


Figura 5.3: Através da correlação temporal encontramos resultados diferentes para diferentes

regiões da membrana celular. Nesta �gura estão identi�cadas duas regiões 1 e 2 que exibem

comportametos diferentes.

é a desfocalização introduzida na imagem, e é esta desfocalização que gera a diferença de

fase, que nos permite observar o objeto como descrito no capitulo 3. O termo k2 é a cur-

vatura local da membrana. Para caracterizar o tempo de relaxação da membrana foi feito

um mapeamento em toda membrana celular e obtemos resultados diferentes para regiões

diferentes, o grá�co 5.4(a) mostra o tempo de relaxação característico para a região que ap-

resenta maior motilidade, região 1 sinalizada na �gura 5.3. Obtemos também o tempo de

relaxação da região da membrana que apresenta menor motilidade, região 2 sinalizada na

�gura 5.3. Usualmente as células de vertebrados estudadas no laboratório como macrófagos

e �broblastos apresentam um comportamento isotropico em toda membrana celular, bem

diferente do comportamento apresentado pelas células mesenquimais extraídas dos somitos.

Nos grá�cos 5.4(a) e 5.4(b) os pontos experimentais estam bem ajustados à uma expo-

nencial simples, equação 5.1, através do ajuste da curva obtemos um tempo de relaxação

para a região de menor motilidade e outro para a região de maior motilidade. O tempo de

relaxação da região de maior motilidade é menor que o tempo da região de menor motilidade.

A membrana celular das células mesenquimais somáticas não apresentava um tempo de re-

laxação homogêneo, assim foi necessário fazer novos experimentos, nos quais fosse possivel


(a) (b)

Figura 5.4: Tempo de relaxação obtido do ajuste da equação 5.1 de autocorrelacção temporal

do contraste em nivel de cinza para as regiões de: a)Maior motilidade, menor tempo de

relaxação obtido foi τ = (6.6±0.1)s. b)Menor motilidade, maior tempo de relaxação obtido

foi τ = (17± 3)s.

acompanhar celo comportamento celulra por um longo tempo. Além disso, obtemos o tempo

de relaxação em cada região da membrana para �lmes curtos. Como mostrado na �gura 5.3

para o �lme curto podemos observar a membrana aderindo em uma direção e desaderindo

na direção oposta.Então, nós monitoramos a célula por um longo tempo, a �m de analisar

o comportamento de células com diferentes tempos de relaxação obtidos em membrana. Os

resultados são muito interessantes durante um �lme de (1-2) horas é possível ver o desloca-

mento de células, como mostrado na �gura 5.3.

As células mesenquimais são bastante invasivas, pois elas vão se deslocando pelo embrião,

diferenciando e montando os tecidos [22]. Além disso, estas células tem características bas-

tante semelhantes às células cancerígenas [23]. Sendo assim é esperado que a dinâmica na

membrana celular seja diferente das células de vertebrados já analisadas no laboratório. A

partir da observação dos �lmes veri�cou-se que as regiões das células apresentavam dinâmi-

cas diferentes. Algumas partes da membrana celular estão aderindo em uma direção da

lamínula enquanto outras estavam desaderindo em outra região. Para relacionar o tempo

de relaxação da membrana com o movimento da célula foram feitos �lmes de longa duração


com 1 e 2 horas. A �gura 5.5 apresenta uma foto inicial do �lme de 1 e 2 horas, e uma foto

no �nal do �lme mostrando o deslocamento da célula no intervalo de tempo analisado. Com

os �lmes longos foi possível acompanhar o comportamento da célula em um tempo maior,

observar a direção do deslocamento da célula, enquanto que os �lmes curtos de 10min foram

obtidos para analisar o tempo de relaxação da membrana celular.

Figura 5.5: Fotos de células aderidas extraídas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois,

as setas na região 1 indicam as regiões de maior motilidade, menor tempo de relaxação

temporal. As setas na região 2 indicam as regiões de menor motilidade, maior tempo de

relaxação temporal. A seta GRANDE indica a direção do movimento da célula.

Novamente encontramos o tempo de relaxação em toda membrana e os resultados obtidos

mostram que o tempo de relaxação é menor na região para qual o movimento da célula está

direcionado. Os grá�cos 5.6 e 5.6 apresentam os tempos de relaxação, obtidos nas regiões de

maior motilidade da membrana e de menor motilidade respectivamente. Os �lmes mostram

uma região da membrana espalhando e aderindoem uma direção da lamínula (região com

menor tempo de relaxação) enquanto o maior tempo de relaxação da membrana está na

região contraria à direção do movimento da célula.

Os resultados desta análise mostraram que as células mesenquimias somáticas, extraídas

dos somitos, exibem comportamentos diferentes na membrana celular. Para caracterizar esta


(a) (b)

Figura 5.6: Grá�cos de correlação temporal do contrate em nivel de cinza ajustado com a

equação 5.1 para diferentes regiões das células observadas em intervalos de tempo de 1 a 2

horas. No grá�co a) O tempo de relaxação obtido foi τ = 7 ± 2s para a região de maior

motilidade. No grá�co b) o tempo de relaxação obtido foi τ=20± 2s para a região de menor

motilidade.

diferença, analisamos o tempo de relaxação da membrana, o qual é bastante heterogêneo.

Os tempos obtidos foram: da ordem de τ = 7 ± 2s nas regiões de maior motilidade e da

ordem de τ=20 ± 2s nas regiões de menor motilidade. Associando o tempo de relaxação

da membrana com o movimento da célula obtemos um resultado bastante consistente. As

análises mostram que as regiões na qual encontramos o menor tempo de relaxação é a região

de maior motilidade da membrana celular. Enquanto que na região na qual encontramos o

maior tempo de relaxação da membrana a molitidade é menor. Assim podemos a�rmar que

a célula sinaliza a direção do seu movimento, ou seja a célula sempre se move na direção

da região de maior motilidade. Precisamos agora obter uma estatística maior para com-

provar de�nitivamente nossos resultados. Um outro fator importante que podemos explorar

nos próximos experimentos é usar marcadores de células, com estes é possível analisar se

um mesmo grupo de células tem comportamentos semelhantes. Em nossas amostras tin-

hamos grupos variados de células, algumas apresentaram grande motilidade analisadas em

um tempo maior enquanto outras �cavam completamente paradas.


5.2 Frequência de Batimento Cardíaco Durante o Desenvolvi-

mento Embrionário.

Nesta seção será apresentado o comportamento da freqüência de batimento cardíaco do

embrião de galinha(Gallus gallus), cultivado in vitro em meio de Agar + albumina durante

o desenvolvimento embrionário. A freqüência de batimento cardíaco começa irregular e vai se

de�nindo durante o desenvolvimento embrionário, as primeiras contrações começam quando

os embriões se encontram no estágio 10 (33-38 horas). Aqui vamos apresentar também

resultados encontrados para a freqüência de batimento de cardiomiócitos em cultura, células

do coração para comparação.

Para obter a freqüência de batimento foram feitos �lmes de 900 frames durante 60 se-

gundos. Foram feitos �lmes dos corações de embriões extraídos de acordo com o protocolo

descrito 4. Usamos o plugin, Mouse Listener (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/mouse-

listener.html) para capturar a posição (x,y) da interface do coração. A posição x é mantida

como uma posição �xa enquanto a componente y desloca a medida que o coração se contrai

nos 900 frames do �lme. Assim obtemos o sinal das contrações, variação da componente y,

do coração durante um minuto, a cada intervalo de uma hora. A �gura 5.7 apresenta um

exemplo do sinal obtido das contrações do coração. Usamos o programa Mathcad (PTC

software) para fazer a transformada de Fourier do sinal. Inserimos a posição da interface do

coração e o tempo para obter o espectro de potência pela freqüência em (Hz).

Figura 5.7: (a) Sinal obtido da variação da interface do coração, posição y, mostrando um

zoom em uma região.


Apresentaremos no grá�co 5.8, o resultado do espectro de potência pela frequência

em (Hz) de um cardiomiocito, célula do coração, para comparação com as contrações nos

primeiros estágios de desenvolvimento embrionário

Figura 5.8: Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um cardiomiocito, célula

do coração de camundongo de cultura primária.

Os embriões foram cultivados in vitro e acompanhamos as contrações ao longo de algumas

horas para obter os espectros de potência. A partir do sinal apresentado na �gura 5.7,

obtém-se a transformada de Fourier das contrações do coração. A �gura 5.9 apresenta o

espectro de potência pela freqüência em (Hz). Inicialmente o espectro é bastante aleatório,

similar ao comportamento do espectro obtido para o cardiomiocito apresentado no grá�co

5.8, e posteriormente observa-se a de�nição de um pico em uma determinada frequência de

batimento.

O grá�co 5.10(a) apresenta os resultados obtidos para dois embriões cultivados in vitro.

Apresentaremos a frequência do maior pico em função da idade do embrião em horas. Os

pontos apresentam um comportamento bastante interessante, inicialmente a frequência de

batimento é pequena e vai aumentando com a idade do embrião. Espera-se que esta curva

atinja um ponto de saturação quando a freqüência de batimento cardíaco do embrião estiver

de�nida, esse tempo é da ordem de 9 dias.

Como discutido no capítulo 2, o número de somitos é um parâmetro ideal para indicar o

estágio embrionário, a idade do embrião que se desenvolve in vitro, assim o grá�co 5.10(b)

apresenta a freqüência do batimento cardíaco pelo número de somitos. Os resultados apre-

sentados no grágico 5.10(b) foram obtidos para dois embriões cultivados in vitro. Apesar


Figura 5.9: Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um embrião cultivado em

vitro a partir das 36hs ate 49hs.

do grá�co 5.10(b) ter poucos pontos seu comportamento é similar ao do grá�co 5.10(a),

conseguimos obter um comportamento padrão que descreve a frequência de batimento do

coração de galinha nos primeiros estágios do desenvolvimento embrionário.

Estes resultados são muito interressantes, entretanto não são inéditos, quando iniciamos

o trabalho sobre a freqüência de batimento cardíaco procuramos na literatura trabalhos rela-

cionados e não encontramos, entretanto ao fazer a revisão bibliográ�ca mais rigorosa, após

obter estes resultados foram encontrados alguns trabalhos antigos, publicados em livros de

periódicos. Desde 1932 existem pesquisadores, investigando a freqüência de batimento do

coração de galinha durante o desenvolvimento embrionário. No artigo de 1932 [24] foi in-

vestigado a freqüência de batimento cardíaco do coração de galinha (Gallus gallus) durante

o desenvolvimento embrionário, desde as primeiras contrações do coração até o momento


(a) (b)

Figura 5.10: Freqüência do pico do espectro obtido através da Transformada de Fourier pela

idade do embrião em: horas e número de somitos a)Idade do embrião em Horas. b)Idade

do embrião em número de somitos

em que o embrião nasce. Neste artigo é apresentado um grá�co das batidas do coração em

um minuto pela idade do embrião em horas. Inicialmente o grá�co tem um comportamento

exponencial similar aos resultados que obtemos nesta dissertação, e a partir do nono dia de

incubação a curva satura até o momento do nascimento. Além disso, no artigo [24] foi anal-

isado a freqüência de batimento do coração de galinha para machos e fêmeas e os resultados

obtidos mostram que não ha diferença signi�cativa entre as freqüências de batimentos de

ambos sexos. Em outro artigo de 1967 [25], foi feito uma análise da freqüência de batimento

cardíaco do coração de galinha (Gallus gallus) pela idade do embrião em horas por dois

métodos diferentes, um método não invasivo (embrião não é exposto ao ambiente), e outro

invasivo (embrião é exposto ao ambiente). Os resultados mostram que o comportamento

da curva em ambos casos é o mesmo, entretanto, análises dos batimentos usando o método

invasivo mostram-se menores comparadas com os resultados dos batimentos do método não

invasivo. Em todos os trabalhos citados, a frequência de batimento inicialmente tem um

comportemento exponencial e posteriormente atinge um patamar de saturação. Portanto,

os resultados da literatura comprovam o comportamento exponencial para a frequência de

batimento cárdico que obtemos neste trabalho nos estágios iniciais do desenvolvimento em-

brionário. Ainda assim, esperamos que nosso método seja útil para identi�car parâmetros

importantes que levam o coração a iniciar seu batimento, principalmente quando compara-

mos esses resultados com cultura de cardiomiócitos.


5.3 Crescimento de vasos em embrião de galinha

(Gallus gallus).

O sistema circulatório é muito importante no desenvolvimento embrionário, sua tarefa é

complicada porque além de crescer e ser continuamente remodelado para acompanhar o

crescimento global do embrião, ele deve permanecer totalmente funcional para suprir as

necessidades das células embrionárias desde o início do desenvolvimento. Além disso, é um

modelo interessante para se estudar e entender o processo de formação de vasos, que é um

ponto de partida para se estudar doenças como o câncer, que induz regiões irrigadas de

vasos sanguíneos. Sendo assim, pretendemos usar nosso sistema para estudar a formação

dos vasos, nesta seção será apresentado algumas fotos extraídas dos embriões mantidos na

incubadora.

A �gura 5.11 apresenta um embrião no estágio 10, este embrião apresenta poucas estru-

turas do sistema vasculatório. Não conseguimos identi�car nenhum vaso na area opaca e

é possível identi�car os primeiros vasos que estão se formando na região da área pelucida,

região interna do embrião.

Figura 5.11: Embrião no estágio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina.

A primeira e mais importante estrutura do sistema vascular é o coração que analisamos

anteriormente. As estruturas tubulares que se fundem formando o coração estudado no

capitulo 2, darão origem aos primeiros grandes vasos do sistema vasculatório. A circulação no

embrião de galinha pode ser dividida em circulação de dois arcos distintos sendo que o coração


é uma estrutura comum e está localizado no centro. Um arco completamente circulatório

é estabelecido internamente com o corpo do embrião. E um segundo arco determina veias

localizadas nas membranas extra-embrionárias envolvendo a gema. As veias vitelinas se

comunicam com o coração por meio de veias que atravessam o corpo embrionário [12].

Figura 5.12: Embrião no estágio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina.

Nesta �gura está apresentando os vasos na região da área opaca (são vasos mais calibrados),

e os vasos na região da área pelucida (vasos mais �nos).

Na �gura 5.12 conseguimos observar que o sistema vascular do embrião está em um

estágio bem avançado, as duas arterias principais já estão formadas e a região da area opaca

encontra-se completamente vascularizada.

Figura 5.13: (a) Vasos do arco interno, na região da área pelucida em um embrião de 36

horas.(b) Vasos do arco interno em um embrião de 49 horas.


A seguir apresentaremos na �gura5.14 um embrião extraído no sexto dia de incubação.

Em (A) está apresentado o embrião sobre a super�cíe do ovo identi�cando as regiões 1 e 2.

As regiões 1 e 2 são imagens extraídas das rami�cações dos vasos no embrião.

Figura 5.14: Embrião no estágio 29, neste estágio o sistema vasculatório está bem avançado e

começa envolver toda a superfície do ovo. Na foto (A) do embrião sobre ovo está identi�cado

as regiões 1 e 2, estas regiões são mostradas as imagens obtidas pela lupa. Em 1 está

apresentado as rami�cações das extremidades dos vasos, e em 2 é apresentado o tronco do

qual se origina as rami�cações.

Com as fotos obtidas oberva-se que o crescimento de vasos no embrião de galinha é um

processo que pode ser acompanhado, pois ocorre na ordem de horas . Apesar dos embriões

de galinha não apresentar um desenvolvimento bem característico, em nossos experimentos

conseguimos observar que os primeiros vasos se formam no embrião apartir das 36 horas de

incubação. E segundo [9] as primeiras vesiculas ópticas ocorrem entre os estágios 9(29-33

horas) e 10(33-38 horas).Um dos próximos objetivos deste trabalho é acompanhar a formação

dos vasos no tempo. Queremos acompanhar a evolução no tempo de um embrião no estágio

10 para o estagio 29 por exemplo. A �gura 5.13 mostra que estamos progredindo bastante


para observar esse fenômeno em um embrião. Para tanto precisamos aprimorar o sistema de

observação do embrião in vitro no microscópio.

Capítulo 6

Conclusões

Neste trabalho, desenvolvemos protocolos, também como toda montagem experimen-

tal, para extração e cultura de células mesenquimais somáticas e de embriões de galinha

Gallus gallus adaptados ao Laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento

de Física da UFMG. Usando a Microscopia de Desfocalização foi possível observar célu-

las mesenquimais somáticas aderidas em substrato desfocalizadas aproximadamente 1,5µm,

após o segundo dia de cultura. A partir das análises de correlação temporal do contraste

obtemos os tempos de relaxação de diferentes regiões na membrana celular. Os tempos

de relaxação obtidos foram bastante heterogêneos. Para relacionar o tempo de relaxação

da membrana com o comportamento das células foram capturados �lmes longos de (1-2)

horas. Os resultados indicam que a célula apresenta uma sinalização do seu movimento.

Em nossas análises, as células sempre se movimentam em direção a região da membrana

que apresenta menor tempo de relaxação. Além disso, temos grande interesse em analisar

o tempo de relaxação da membrana durante o processo de diferenciação celular. Células

mesenquimais têm capacidade de se transformarem em outros tipos de células devido a sua

grande plasticidade. No processo de diferenciação a rigidez da membrana varia, com isso

esperamos que o tempo de relaxação da membrana também sofra alterações. Além disso,

analisamos o batimento cardíaco e o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embri-

onário. Utilizamos uma Lupa com aumento de 7.5X para obter os �lmes dos embriões em

diferentes estágios de desenvolvimento. Estudamos a evolução da freqüência de batimento

do coração de galinha nas primeiras horas do desenvolvimento. Para tanto, obtemos o es-

pectro de potência a partir da posição (x-y) na interface do coração capturados durante as

contrações. Em estágios iniciais as contrações são irregulares e fracas, como as contrações em

1

Capítulo 6. Conclusões 2

culturas de cardiomiócitos, tornando-se mais regulares e fortes em estágios posteriores. As

análises da frequência de batimento mostram que inicialmente a freqüência de batimento é

bastante irregular bem próxima da freqüência de batimento de uma única célula do coração,

o cardiomiocito, tornando mais regular durante o desenvolvimento embrionário. Além disso,

conseguimos observar o crescimento de vasos no embrião de galinha, obtemos estágios no

qual o embrião não apresentava vasos e estágios bem vascularizados. Na próxima etapa

deste trabalho queremos acompanhar o crescimento de vasos no tempo e conseguir obter

paramentos da dinâmica de crescimento.

Apêndice A

Programa para auto-correlação

temporal.

import ij.*;

import ij.process.*;

import ij.gui.*;

import java.awt.*;

import ij.plugin.*;

import ij.plugin.filter.*;

public class CorrelaçãoTemporalMediaPixel_ implements PlugIn {

3

public void run(String arg) {

ImagePlus imp = WindowManager.getCurrentImage();

if (imp==null)

{IJ.noImage(); return;}

Roi roi = imp.getRoi();

if (!(roi!=null && roi.getType()==roi.LINE) )

{IJ.error("Straight line selection required."); return;}

double angle = 0.0;

if (roi.getType()==Roi.LINE) {

Line line = (Line)roi;

angle = roi.getAngle(line.x1, line.y1, line.x2, line.y2);

} else if (roi.getType()==Roi.POLYLINE)

angle = ((PolygonRoi)roi).getAngle();

int nSlices=imp.getStackSize();

double[] data = ((Line)roi).getPixels();

int tamanholinha = (int)data.length-1;

double[][] dados = new double[tamanholinha][nSlices];

double[] correlacao = new double[nSlices];

double[] media = new double[tamanholinha];

for (int j=0;j<nSlices;j++) {

IJ.showProgress((double)j/nSlices);

imp.setSlice(j+1);

double[] ddata = ((Line)roi).getPixels();

for(int i=0; i<tamanholinha;i++){

dados[i][j]=(double)ddata[i];

media[i]+=dados[i][j];

}

}

for (int i=0; i<tamanholinha; i++)

media[i]=media[i]/nSlices;

for (int k=0; k<tamanholinha; k++)

{

IJ.showProgress((double)k/tamanholinha);

for (int j=0; j<nSlices;j++)

{

double temp = 0;

for (int i=0; i<nSlices-j; i++)

temp += (dados[k][i]-media[k])*(dados[k][i+j]-media[k])/(media[k]*media[k]);

correlacao[j] += temp/(nSlices-j);

}

}

String headings = "t\t<C(0)C(t)>";

IJ.setColumnHeadings(headings);

for(int i=0;i<nSlices;i++)

{

correlacao[i] = correlacao[i]/tamanholinha;

IJ.write(i+"\t"+(float)correlacao[i]);

IJ.register(CorrelaçãoTemporalMediaPixel_.class);

}

//IJ.write("media="+media);

//IJ.write("tamanho linha="+tamanholinha);

//IJ.write("nSlices="+nSlices);

IJ.showProgress(1.0);

}

}

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