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ISABELA VIOL VALLE

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PLGA

CONTENDO PENTAMIDINA PARA O TRATAMENTO ORAL DA LEISHMANIOSE

Rio de Janeiro 2017

ISABELA VIOL VALLE

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PLGA CONTENDO PENTAMIDINA PARA O TRATAMENTO ORAL DA

LEISHMANIOSE

Orientadores: Prof. Dr. Plínio Cunha Sathler

Profa Dra Flávia Almada do Carmo

Rio de Janeiro 2017

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Curso de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia

da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

ISABELA VIOL VALLE

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PLGA CONTENDO PENTAMIDINA PARA O TRATAMENTO ORAL DA

LEISHMANIOSE

Aprovado em:

Orientadores:

_____________________________________________________________________

Prof. Dr. Plínio Cunha Sathler, Faculdade de Farmácia – UFRJ

_____________________________________________________________________

Profa. Dra. Flávia Almada do Carmo, Faculdade de Farmácia – UFRJ

Banca examinadora:

Profa. Dra. Alessandra Mendonça Teles de Souza, Faculdade de Farmácia – UFRJ

______________________________________________________________________

Profa. Dra. Franceline Reynaud, Faculdade de Farmácia – UFRJ

______________________________________________________________________

Dr. Valter Viana de Andrade Neto, Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ

Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Aos meus pais, João e Mônica,

A minha avó Maria Izabel,

A minha irmã, Gabriela

e ao meu namorado, Gabriel Yudy.

AGRADECIMENTOS

Á toda a minha família pelo carinho, torcida e por me incentivarem tanto. Em

especial aos meus pais, João e Mônica, à minha irmã, Gabriela, e à minha avó, Izabel,

pelo carinho e paciência de sempre.

Ao meu namorado, Gabriel Yudy, pelo amor, incentivo, paciência e

companheirismo.

Ao meu amigo, Wallace de Freitas, que sempre esteje disposto a ajudar, ensinar

e compartilhar suas ideias em relação ao trabalho. Obrigada pela alegria, bom humor,

extrema paciência e ótima convivência diária!

A minha companheira de laboratório, Alyne, pelas dúvidas tiradas, angústias

compartilhadas, risadas e ótima companhia.

Á toda equipe do Laboratório de Controle de Qualidade de Fármacos e

Medicamentos (LabCQ) por todos os ensinamentos, conselhos, cafés e pela ótima

convivência diária. Um agradecimento especial à Tailane, Ana Luiza, Luiz e Eliane.

Á minha aluna de orientação científica, Thaisa Rocha, pela dedicação e

disposição em ajudar.

Aos meus orientadores Prof. Dr. Plínio Cunha Sathler e Profa Dra Flávia Almada

do Carmo, por estarem sempre a minha disposição e pela ajuda ao longo do trabalho.

Agradeço pela paciência e ensinamentos ao longo desses dois anos.

Ao Dr. Edézio Júnior e ao Laboratório de Bioquímica de Tripanosomatídeos

(IOC-Fiocruz) pela realização dos ensaios toxicológicos e farmacológicos.

RESUMO

VALLE, Isabela Viol. Desenvolvimento e avaliação de nanoparticulas de PLGA contendo pentamidina para o tratamento oral da leishmaniose. Rio de Janeiro, 2017. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

A leshmaniose é um conjunto de doenças parasitárias causadas por mais de

20 espécies de Leishmania. Essas doenças são classificadas em leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral. O isotianato de pentamidina (IP) é um fármaco de grande interesse no tratamento da leishmaniose em casos de resistência aos antimoniatos. Devido às duas porções de amidina fortemente básicas presentes na molécula, o IP apresenta baixa biodisponibilidade oral e, portanto, deve ser administrada pelas vias intramuscular ou intravenosa, o que limita o seu uso clínico. Dentre algumas abordagens, os sistemas de liberação de fármacos baseados em nanotecnologia possuem potencial para superar os desafios associados à administração oral. Desta forma, o objetivo do presente trabalho é o desenvolvimento e caracterização de nanopartículas (NPs) de ácido lático-co-ácido-glicolico (PLGA) contendo IP com foco em suas propriedades fisico-químicas e farmacológicas visando sua aplicação no tratamento da leishmaniose por administração oral. As NPs foram preparadas pelo método da dupla emulsificação e evaporação do solvente (DEES). As amostras foram caracterizadas quanto ao tamanho médio de partícula, índice de polidispersividade (PdI) e potencial zeta, percentual de eficiência de encapsulamento e rendimento, morfologia, liberação in vitro e teste farmacológico in vivo. Os resultados mostraram que as NPs de PLGA contendo IP obtidas por esta metodologia apresentam tamanho nanométrico, com valores de PdI referentes à sistemas homogêneos, potencial zeta negativo indicando a estabilidade da formulação, rendimento satisfatório, alta eficiência de encapsulamento e mecanismo de liberação sustentado in vitro. O ensaio experimental in vivo mostrou a eficácia das NPs quando administradas pela via oral, com uma redução significativa da carga parasitária no fígado. Assim, o resultado satisfatório obtido pelo processo de nanoencapsulação proposto indica que as NPs-IP apresentaram características preliminares relevantes como nova alternativa terapêutica para o tratamento da leishmaniose por administração oral.

Palavras-chave: Leishmaniose, Pentamidina, Nanopartículas, PLGA;

Administração oral.

ABSTRACT

VALLE, Isabela Viol. Development and evaluation of PLGA nanoparticules containing pentamidine for oral leishmaniasis treatment. Rio de Janeiro, 2017. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

Leishmaniasis is caused by a protozoa parasite from over 20 Leishmania species. These diseases are classified into cutaneous, mucocutaneous and visceral leishmaniasis.The pentamidine isothiocyanate (PI) is a drug of great interest in the treatment of antimony refractory leishmaniasis. Due to two strongly basic amidine moieties, IP suffers from poor oral bioavailability and thus has to be given by intramuscular or intravenous administration limiting its clinical use. Among various approaches, nanotechnology based drug delivery system has potential to overcome the challenges associated with the oral administration. Thereby, the goal of the present work is the development and characterization of PI-loaded PLGA nanoparticles (NPs) with focus on their physicochemical and pharmacological properties aiming at their application in leishmaniasis treatment by oral administration. The NPs were prepared by double emulsion methodology. The samples were characterized for some parameters, including mean particle size, polydispersity index (PdI) and zeta potential, entrapment efficiency percentual, yield process, shape and morphology, in vitro drug release and in vivo pharmacological assay. The results showed that PLGA NPs containing IP obtained by this methodology have a nanometric size, with PdI values corresponding to homogeneous systems, negative zeta potential indicating formulation stability, satisfactory yield, high encapsulation efficiency and mechanism of sustained release in vitro. The in vivo experimental trial showed the efficacy of NPs when administered orally, with a significant reduction in parasite load in the liver. Thus, the satisfactory results obtained by the proposed nanoencapsulation process indicates that NPs-PI presented relevant preliminary characteristics as a new therapeutic alternative for the treatment of oral leishmaniasis.

Key words: Leishmaniasis; Pentamidine; Nanoparticles; PLGA; Oral Administration.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo biológico da leishmaniose. ................................................................... 16

Figura 2: Figura esquemática mostrando o núcleo, cinetoplasto, blefaroplasto, flagelo e

mitocôndria de forma promastigota e amastigota. ........................................................ 17

Figura 3: Imagens por microscopia óptica de Leishmania spp. (A) Forma promastigota.

(B) Forma amastigota. ................................................................................................... 18

Figura 4: Manifestações clínicas da leishmaniose. (A) Leishmaniose cutânea; (B)

Leishmaniose mucocutânea; (C) Leishmaniose visceral. .............................................. 19

Figura 5: Estrutura química do isotianato de pentamidina. .......................................... 24

Figura 6: Representação esquemática das nanocápsulas e nanoesferas poliméricas: a)

fármaco dissolvido no núcleo; b) fármaco adsorvido à parede polimérica; c) fármaco

retido na matriz polimérica; d) fármaco adsorvido ou disperso na matriz polimérica. ... 31

Figura 7: Esturuta química do polímero PLGA. ............................................................ 32

Figura 8: Cromatograma solução de IP na concentração de trabalho (100µg/mL). ..... 55

Figura 9: (A) Cromatograma da amostra de NPs Placebo; (B) cromatograma da

amostra de NPs-IP. ....................................................................................................... 56

Figura 10: Suspensão de NPs obtidas a partir do método da DEES. ......................... 63

Figura 11: Distribuição de tamanho de partícula. (A) NPs sem o fármaco; (B) NPs com

o fármaco. ..................................................................................................................... 65

Figura 12: Fotomicrografias das NPs-PLGA contendo IP preparadas pelo método da

DEES. ........................................................................................................................... 69

Figura 13: Mudança do aspecto visual das NPs após 90 dias de análise. ................... 70

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Condições cromatográficas para a metodologia proposta para a

quantificação de IP. ....................................................................................................... 42

Tabela 2: Determinação da precisão intra-dia e inter-dia do método analítico. ............ 59

Tabela 3: Resultados da porcentagem de recuperação para análise da exatidão do

método analítico. ........................................................................................................... 60

Tabela 4: Resultados da análise de robustez do método analítico. .............................. 61

Tabela 5: Solubilidade do fármaco nos dois solventes candidatos. .............................. 62

Tabela 6: Condições de preparo das NPs pelo método da DEES. ............................... 63

Tabela 7: Tamanho de partícula médio, índice de polidispersividade (PdI) e Potencial

Zeta (PZ) das NPs-PLGA e NPs-PLGA contendo IP. ................................................... 64

Tabela 8: Eficiência de encapsulamento (%) e Rendimento (%) das NPs-PLGA

contendo IP. .................................................................................................................. 68

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Curva de calibração 1 obtida para o IP........................................................ 57



Gráfico 4: Estabilidade acelerada: Tamanho de partícula da suspensão de NPs

contendo IP nos tempos 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias. .............................................. 72

Gráfico 5: Estabilidade acelerada: Concentração de fármacos da suspensão de NPs

contendo IP nos tempos 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias. .............................................. 72

Gráfico 6: Estabilidade à temperatura ambiente e geladeira: tamanho de partícula da

suspensão de NPs nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias. ..................................... 74

Gráfico 7: Estabilidade à temperatura ambiente e geladeira: Concentração de fármaco

da suspensão de NPs nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias. ................................ 74

Gráfico 8: Perfil de liberação in vitro das NPs-PLGA contendo IP. .............................. 76

Gráfico 9: Eficácia das NPs-PLGA contendo IP por via oral para leishmaniose visceral.

Carga parasitária quantificada por LDA no baço (A) e no fígado (B). ........................... 78

LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS AB – Anfotericina B

AM – Antomoniato de meglumina

CLAE - Cromatografia liquida de alta eficiência

DEES - Dupla emulsificação e evaporação do solvente

DP – Desvio padrão

DPR – Desvio padrão relativo

EE – Eficiência de encapsulamento

FDA – Food and Drug Administration

HIV – Human Immunodeficiency Virus

IM – Intramuscular

IP – Isotianato de pentamidina

IV – Intravenosa

LC – Leishmaniose cutânea

LD – Limite de detecção

LMC – Leishmaniose mucocutânea

LQ – Limite de detecção

LTA - Leishmaniose Tegumentar Americana

LV – Leishmaniose visceral

MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão

NPs – Nanopartículas

OMS – Organização Mundial da Saúde

PA – Paromomicina

PACA – Polialquilcianoacrilato

PBS – Phosphate buffered saline

PCA - Poli (ciano acrilato)

PCL - Poli-ε-caprolactona

PdI – Índice de polidispersividade

PLA – Ácido polilático

PLGA - Ácido lático-co-ácido-glicolico

PVA – Álcool polivinílico

PZ – Potencial zeta

SF – Solução fisiológica

SLF – Sistema de liberação de fármacos

TGI – Trato gastrointestinal

TP – Tamanho de partícula médio

USP – United States Pharmacopeia

WHO – World Health Organization

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

1.1 Leishmanioses ................................................................................................. 14

1.2 Tratamento ....................................................................................................... 20

1.3 Pentamidina ..................................................................................................... 24

1.3.1 Características gerais ................................................................................ 24

1.3.2 Eficácia da Pentamidina ............................................................................ 26

1.4 Alternativas Terapêuticas ................................................................................. 27

1.4.1 Sistemas de Liberação de Fármacos ........................................................ 28

1.5 Via de Administração Oral ............................................................................... 34

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 37

2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 37

2.3 Justificativa....................................................................................................... 38

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material ............................................................................................................ 40

3.1.1 Matérias-primas, Soluções e Reagentes ................................................... 40

3.1.2 Equipamentos ............................................................................................ 40

3.2 Métodos ........................................................................................................... 41

3.2.1 Desenvolvimento da metologia analítica para a quantificação de IP ......... 41

3.2.2 Preparo das curvas de calibração de IP .................................................... 42

3.2.3 Validação da metodologia analítica ........................................................... 43

3.2.4 Determinação da solubilidade do fármaco................................................. 46

3.2.5 Preparo das NPs pelo método da DEES ................................................... 47

3.2.6 Caracterização das NPs ............................................................................ 48

3.2.7 Estudos de estabilidade............................................................................. 50

3.2.8 Avaliação do perfil de liberação in vitro ..................................................... 51

3.2.9 Ensaio farmacológico in vivo ..................................................................... 52

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Validação da metodologia analítica para quantificação de IP por CLAE .......... 55

4.1.1 Seletividade ............................................................................................... 55

4.1.2 Linearidade ................................................................................................ 56

4.1.3 Precisão ..................................................................................................... 58

4.1.4 Exatidão ..................................................................................................... 59

4.1.5 Robustez ................................................................................................... 60

4.2 Determinação da solubilidade do fármaco ....................................................... 61

4.3 Desenvolvimento e caracterização das NPs .................................................... 62

4.3.1 Tamanho de partícula e distribuição do tamanho ...................................... 64

4.3.2 Potencial zeta ............................................................................................ 66

4.3.3 Eficiência de encapsulamento e Rendimento ............................................ 67

4.3.4 Avaliação do tamanho e morfologia por MET ............................................ 68

4.4 Estudos de estabilidade ................................................................................... 70

4.4.1 Estabilidade acelerada .............................................................................. 70

4.4.2 Estabilidade à temperatura ambiente e geladeira ..................................... 73

4.5 Avaliação do perfil de liberação in vitro ............................................................ 75

4.6 Avaliação do perfil farmacológico in vivo ......................................................... 77

5. CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 82

1. INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO 14

1.1 Leishmanioses

A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitas de mais

de 20 espécies de Leishmania (WHO, 2016). Esta doença está presente em

mais de 98 países ou territórios em áreas tropicais e subtropicais, onde estima-

se em 12 milhões o número de pessoas infectadas e em 350 milhões o número

de indivíduos que vivem em áreas com risco de contágio. Contudo, a migração e

mobilidade crescente de indivíduos de áreas afetadas, bem como mudanças

climáticas globais contribuem para a expansão e urbanização da doença (WHO,

2014).

Considera-se que a leishmaniose seja a segunda mais importante e

emergente doença causada por protozoários transmitidos por vetores depois da

malária em termos do número de pessoas afetadas (RODRÍGUEZ; DÍAZ;

PÉREZ, 2013). Cerca de 95% dos casos ocorrem nas Américas, Mediterrâneo,

Oriente Médio e Ásia Central e mais de 90% ocorrem em apenas seis países,

sendo eles: Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Sudão e Sudão do Sul. Além

disso, estima-se de 700.000 a 1 milhão de novos casos e de 20.000 a 30.000

óbitos ocorram anualmente em todo mundo (WHO, 2017).

Este conjunto de doenças causadas por Leishmania spp. está entre as

Doenças Tropicais Negligenciadas (NTD, do inglês, Neglected Tropical

Diseases) e tem sido o foco da Organização Mundial da Saúde (OMS) nos

últimos anos. As NTDs são as doenças mais prevalentes entre os 2,7 bilhões de

pessoas que atualmente vivem com menos de 2 dólares por dia e, tal fato,

historicamente, gera certo desinteresse por parte da indústria farmacêutica na

busca por novas opções quimioterápicas para o seu tratamento (NAKAGAWA et

al., 2015).

Os parasitas causadores da leishmaniose necessitam, essencialmente,

de dois hospedeiros obrigatórios diferentes para completar seu ciclo de vida

biológico: um hospedeiro definitivo e um hospedeiro intermediário. Os

hospedeiros intermediários, os vetores da doença, são insetos denominados

INTRODUÇÃO 15

flebotomíneos, pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília

Phlebotominae, gênero Lutzomyia, conhecidos popularmente como mosquito

palha, tatuquira, birigui, entre outros, dependendo da localização geográfica. Os

hospedeiros definitivos, por sua vez, são várias espécies de animais silvestres

(roedores, masurpiais, edentados e canídeos silvestres), sinantrópicos

(roedores), domésticos (canídeos, felídeos e equídeos) e o homem (BRASIL,

2016).

A leishmaniose é transmitida pela mordida da fêmea infectada do inseto

flebotomínio. Os mosquitos injetam o chamado “estágio infeccioso” (formas

promastigotas) a partir de suas probóscides durante a sua alimentação . As

formas promastigotas que atingem o local da picada entram na corrente

sanguínea e são fagocitados pelos macrófagos e outros tipos de células

fagocíticas mononucleares . Dentro dos macrófagos, os protozoários

transformam-se nas formas amastigotas , as quais se multiplicam por divisão

simples e, posteriormente, infectam outras células fagocíticas mononucleares .

A sintomatologia, bem como o tipo de leishmaniose manifestada (leishmaniose

cutânea ou visceral, por exemplo), dependem de fatores relacionados ao

parasita e ao hospedeiro. Flebonomíneos sadios, ao picarem os

hospedeiros/reservatórios contaminados, ingerem as células contendo os

protozoários e tornam-se infectados , . Após essa ingestão, os protozoários

na sua forma amastigotas transformam-se, no intestino do inseto, em

promastigotas (forma infectante) e migram para a probóscide para início do

ciclo biológico (Figura 1) (CDC, 2013).

INTRODUÇÃO 16

Figura 1: Ciclo biológico da leishmaniose.

Fonte: Adaptado de CDC, 2013.

Os parasitas do gênero Leishmania são flagelados da Família

Trypanosomatidae, Ordem Kinetoplastida, Filo Protozoa. A ordem Kinetoplastida

caracteriza-se por apresentar uma mitocôndria única (denominada cinetoplasto)

rica em DNA mitocondrial, o kDNA. Esta organela localiza-se anteriormente ao

cinetossoma do flagelo, perpendicularmente ao eixo maior do organismo. Os

tripanosomatídeos apresentam uma rede de microtúbulos subpeliculares

bastante rígida, conferindo a estes protozoários formas celulares bem definidas

durante seu ciclo evolutivo (Figura 2) (BRASIL, 2016).

INTRODUÇÃO 17

Figura 2: Figura esquemática mostrando o núcleo, cinetoplasto, blefaroplasto, flagelo e mitocôndria de forma promastigota e amastigota.

Fonte: Adaptado de BRASIL, 2016.

Os parasitas do gênero Leishmania são digenéticos (heteroxenos) e

apresentam em seu ciclo de vida apenas duas formas evolutivas: a forma

promastigota, que é flagelada e extracelular, e a forma amastigota, que é

intracelular e sem movimentos. As promastigotas apresentam corpo alongado,

medindo entre 14 e 20 mm e flagelo livre. As amastigotas têm corpo ovóide,

medindo entre 2,1 e 3,2 mm e flagelo interno (Figura 3) (MISHRA et al., 2009).

INTRODUÇÃO 18

Figura 3: Imagens por microscopia óptica de Leishmania spp. (A) Forma promastigota. (B) Forma amastigota.

Fonte: Brasil, 2006.

A variedade de espécies de Leishmania, vetores e reservatórios

vertebrados em diferentes ambientes geográficos geram apresentações clínicas

e severidade distintas relacionadas à doença (Figura 4). Classicamente, a

leishmaniose é classificada em duas formas principais, a Leishmaniose

Tegumentar Americana (LTA) e a Leishmaniose Visceral (LV). A LTA, por sua

vez, pode se manifestar sob duas formas clínicas diferentes: a Leishmaniose

cutânea (LC) e a Leishmaniose mucosa ou mucocutânea (LMC) (BRASIL, 2016).

A LC é causada por espécies dos subgêneros Viannia (V.) e Leishmania

(L.) e é a forma mais comum da doença. A quantidade e os tipos de lesões na

pele caracterizam o tipo de LC, dentre as quais destacam-se: forma localizada

(lesões únicas ou múltiplas localizadas), forma disseminada (numerosas lesões

por diferentes áreas do corpo) e forma difusa (lesões deformantes e graves). Em

geral, as úlceras são indolores e localizadas em partes expostas do corpo, tais

como face, braços e pernas. Nas últimas décadas têm-se visto um número

crescente de casos e uma ampliação da distribuição geográfica da LC (BRASIL,

2016; WHO, 2017).

A LMC, por sua vez, é caracterizada por lesões nas mucosas das vias

aéreas superiores; frequentemente, as cavidades nasais, faringe, laringe e

INTRODUÇÃO 19

cavidade oral são as áreas mais atingidas. A forma clássica da LMC é

secundária a lesão cutânea. Em 2010, a OMS confirmou 19.600 casos de LTA

no Brasil (WHO, 2014).

A LV é a forma mais grave de leishmaniose que, se não tratada, torna-se

letal. Dentre as suas principais manifestações clínicas, destacam-se a

hepatoesplenomegalia volumosa, febre, perda de peso. Normalmente, o

desenvolvimento desta forma da doença está relacionada a uma redução da

imunidade do indivíduo. Tal fato faz, também, com que haja co-infecções

bacterianas e virais (especialmente em relação ao Vírus da Imunodeficiência

Humana – HIV, do inglês, Human Immunodeficiency Virus) capazes de

ocasionar quadros graves da doença. Estima-se que 10% dos indivíduos

infectados desenvolvem a doença clássica (BRASIL, 2016; WHO, 2014).

Figura 4: Manifestações clínicas da leishmaniose. (A) Leishmaniose cutânea; (B) Leishmaniose mucocutânea; (C) Leishmaniose visceral.

Fonte: WHO, 2014.

No Brasil, pelo menos sete espécies causadoras da doença são

reconhecidas, sendo seis do subgênero Viannia e uma do subgênero Leishmania,

sendo as 3 principais espécies Leishmania (Leishmania) amazonensis,

Leishmania (Viannia) guyanensi e Leishmania (Viannia) braziliensis. A LC é

causada, principalmente, por L. (V.) braziliensis, L.(V.) guyanensis e L. (L.)

amazonensis, e, mais raramente, por L. (V.) laisoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi e L.

(A) (B)

) (a)

(C)

INTRODUÇÃO 20

(V.) lindenbergi, espécies essas de interesse especialmente na região amazônica.

As três primeiras espécies estão envolvidas, também, na LMC, enquanto que a L.

(L.) chagasi e L. (L) donovani são reconhecidos como os agentes causadores da

LV; na América Latina, Leishmania infantum é o agente etiológico causador da LV.

Esssa variedade de espécies de Leishmania gera uma diversidade de quadros

clínicos e respostas terapêuticas e, além disso, a manifestação clínica da doença

depende não só da espécie envolvida, mas também do estado imunológico do

indivíduo infectado (BRASIL, 2016).

1.2 Tratamento

O tratamento de todas as formas de leishmaniose, no geral, é feito com

fármacos que exigem a hospitalização do paciente, possuem efeito clínico limitado

e alto índice de efeitos colaterais importantes; além disso, a eficácia do tratamento

depende das espécies de Leishmania que causaram a infecção. Todos esses

fatores indicam a necessidade para a concepção e prospecção de novos

fármacos, assim como o desenvolvimento de regimes terapêuticos e/ou novos

sistemas de administração para garantir o sucesso da cura, redução dos riscos de

cicatrizes e a prevenção da progressão da doença (DURAND et al., 1997; LOPES

et al., 2012).

Os fármacos de primeira escolha usualmente utilizados no tratamento de

todas as formas de leishmaniose são os antimoniatos pentavalentes como o

Antimoniato de meglumina (AM, Glucantime®) e o Estibogluconato de sódio

(Pentostam®). Estes fármacos apresentam eficácia clínica comprovada,

entretanto, algumas limitações vêm diminuindo o uso desta classe de fármacos na

prática clínica. A via de administração disponível (necessidade de administração

parenteral diária); a longa duração do tratamento; os frequentes efeitos

secundários tóxicos e graves tais como náusea, dor abdominal, inflamação

mialgia, arritmia cardíaca e hepatite; e a eficácia variável contra LC e LV em

relação às espécies de Leishmania, são alguns dos pontos negativos observados

INTRODUÇÃO 21

a partir da utilização dos antimoniatos. Desta forma, são comuns os casos de

desistência e não aderência ao tratamento. Além disso, os frequentes relatos de

resistência relacionada à utilização destes fármacos fazem com que exista um

consenso em relação à procura por tratamentos alternativos para a leishmaniose

(CROFT; OLLIARO, 2011; CRUZ et al., 2009; MILLÁN; OLIVEIRA; BRUNA-

ROMERO, 2011; MONZOTE, 2009).

Além dos antimoniatos, outros fármacos têm sido utilizados para o

tratamento das leishmanioses, dentre os quais pode-se destacar a Paromomicina

(PA), Anfotericina B (AB), Miltefosina e a Pentamidina (CROFT; OLLIARO, 2011).

A PA é um antibiótico aminoglicosídeo que apresenta efeitos clínicos

significativos, baixo custo e segurança, entretanto, exige repetidas administrações

intramusculares (IM), o que torna o tratamento doloroso e incoveniente para o

paciente. A administração tópica na forma de pomada no tratamento da LC

apresenta resultados variáveis e inconclusivos até o momento devido ao baixo

número de estudos em relação à eficácia desta forma farmacêutica. Os efeitos

adversos mais comuns associados à utilização deste fármaco são a ototoxicidade,

problemas hepáticos, erupções cutâneas e prurido (WIWANITKIT, 2012).

A AB é um fármaco de administração sistêmica o qual é utilizado para o

tratamento da LC. Devido a sua alta toxicidade na sua forma livre, a AB também

está disponível na sua forma lipossomal (AmBisome®). Este fármaco apresenta

altas taxas de cura, entretanto, o alto custo da AB lipossomal (assim como as

limitações relacionadas ao seu armazenamento) limita o seu uso em larga escala,

especialmente, levando-se em consideração a população alvo acometida por este

tipo de doença (STAUCH et al., 2012; SUNDAR; CHAKRAVARTY, 2010).

A miltefosina, medicamento originalmente desenvolvido como um

antineoplásico tem ação eficaz sobre as Leishmanias. Este fármaco age

interferindo na membrana celular do parasita, sem interagir com o DNA,

modulando a composição lipídica, a permeabilidade e fluidez da membrana, assim

como o metabolismo de fosfolipídeos, induzindo a morte celular por apoptose.

INTRODUÇÃO 22

Desde o seu registro em 2002, a miltefosina é o primeiro e, até agora, único

agente oral utilizado para o tratamento de todos os tipos de leishmaniose, porém,

esta utilização só é permitida em animais, sendo a sua administração em

humanos ainda não elucidada. Estudos preliminares mostram que a alta

toxicidade e efeitos adversos como alterações cardíacas, renais, pancreáticas e

hepáticas dificultam a adesão dos pacientes ao tratamento (MONGE-MAILLO &

LÓPEZ-VÉLEZ, 2015; SUNDAR; OLLIARO, 2007).

O IP, fármaco em estudo neste trabalho, pertence à classe das diamidinas

aromáticas e é amplamente utilizado para o tratamento de infecções parasitárias.

É ativo contra alguns parasitas como Giardia lamblia, Cryptosporidium e

Toxoplasma gondii e, segundo Poola e colaboradores (2002), é clinicamente

utilizado no tratamento de pacientes com leishmaniose resistentes ao tratamento

com os antimoniatos para ambas as formas da doença (LC e LV). No geral, a

pentamidina é considerada um fármaco de segunda escolha utilizado após falha

ou intolerância em relação ao tratamento com os antimoniatos, entretanto, na

América do Sul, é considerado o agente de escolha inicial para o tratamento desta

doença. A falta de estudos controlados e comparativos faz com que este fármaco

permaneça como uma opção secundária (MÉRIAN et al., 2015; POOLA et al.,

2002).

INTRODUÇÃO 23

Quadro 1: Fármacos usualmente utilizados no tratamento da leishmaniose.

Fonte: Adaptado de MILLÁN; OLIVEIRA; BRUNA-ROMERO, 2011.

Fármacos Dose recomendada Eficácia clínica Resistência Toxicidade Desvantagens Estrutura químca

4mg/kg a cada 72 hrs

Dor no local da

injeção, dor de

cabeça, congestão,

dispnéia

Preço, necessidade

de administra;'ao

IV/IM

Entre 60-70% para

todas as regiões

Não

documentado

Ásia: 94%

África: 60-93%

Ásia: 94%

África: não

determinado

Toxicidade, injeção

dolorosa, duração

do tratamento,

resistência

Necessidade de

infusão EV lenta,

nefrotoxicidade,

instabilidade

térmica

Preço, necessidade

de infusão EV lenta,

instabilidade

térmica

Preço,

teratogenicidade,

resistência em

potencial, baixa

adesão do paciente

Eficácia varia de

acordo com regiões

Efeitos cardíacos,

nefrotoxicidade,

hepatotoxicidade

Nefrotoxicidade

Boa aceitação

(nefrotoxicidade

limitada)

Efeitos

gastrointestinais,

teratogenicidade,

nefrotoxicidade,

hepatotoxicidade

Ototoxicidade rara,

nefrotoxicidade,

hepatotoxicidade

Antimonais

pentavalentes

Anfotericina B

Anfotericina

lipossomal

Miltefosina

Sulfato de

paromomicina

Pentamidina

20mg/kg/ dia por 20-30 dias,

IV ou IM Intralesional para

LC 50 mg/0.5mL a cada 2-3

semanas por 12 semanas

1mg/Kg/dia por 20-30 dias,

IV

3-5 mg/Kg/injeção 3-6

injeções por 10-20 dias, IV

2.5 mg/Kg/dia por 28 dias,

oral

15mg/Kg/dia por 21 dias, IM

Administração tópica para

LC

Falha do

tratamento

(60%) em Bihar,

Índia

Não

documentado

Não

documentado

Somente em

isolados de

laboratório

Somente em

isolados de

laboratório

35-95%

dependendo da

área geográfica

>97% para todas

as regiões

Ásia: >97% e >

91% em doses

únicas África: não

determinado

INTRODUÇÃO 24

1.3 Pentamidina

1.3.1 Características gerais

A pentamidina é comercializada para uso humano apenas sob a forma

liofilizada de isotionato de pentamidina (IP) (Figura 5), em frascos contendo 300

mg do sal. Foi descoberta por Yorke e colaboradores no final da década de 1930.

É classificada como um antiparasitário de amplo espectro e tem sido utilizada,

durante décadas, contra vários tripanossomatídeos, tais como Leishmania major,

Leishmania donovani e Trypanosoma brucei e contra alguns fungos como

Pneumocystis carinii. A descoberta da atividade antiprotozoária das diamidinas foi

consequente à procura por compostos hipoglicemiantes que pudessem

comprometer o metabolismo energético de parasitas (LOPES et al., 2014; SINGH;

DEY, 2007)

Figura 5: Estrutura química do isotianato de pentamidina.

O IP é de uso parenteral exclusivo e pode ser administrado por via

intravenosa (IV) ou IM, sendo completamente absorvido após a administração

parenteral. Após administração IM (4 mg/kg), o fármaco atinge a concentração

plasmática máxima de aproximadamente 0,2 μg/mL; a meia-vida de eliminação é

de 9,4 horas (±2,0); a eliminação renal da substância não-modificada, em 24

horas, é de 4,1%; a depuração renal (clearance) é de 15,4 L/h (±14,9)

(DONNELLY et al., 1988; SNAPPER et al., 1951; WAALKES; DEVITA, 1970).

INTRODUÇÃO 25

O mecanismo de ação do IP relacionado a sua atividade antiparasitária

ainda é pouco compreendido e não totalmente elucidado (NGUEWA et al., 2005;

PATHAK et al., 2002). Sugere-se que sua atividadade possa estar relacionada a

múltiplos alvos. Sabe-se que a ação do fármaco é, em parte, devido à inibição da

enzima topoisomerase II (SINGH; DEY, 2007). Interagindo com ácidos nucleicos

do parasita, este fármaco pode interferir na síntese de DNA dificultando a

replicação e transcrição a nível mitocondrial (BOYKIN, 2002; WILSON et al.,

2008).

Este fármaco tem sido usado no tratamento alternativo tanto da LC como

da LV desde 1952. Sua administração usual é feita a partir de doses de 4mg/kg a

cada 72 horas, não devendo exceder uma dose total de 2g (DAS; KASOJU;

BORA, 2010). Entretanto, assim como a maior parte dos fármacos usualmente

utilizados para o tratamento de todas as formas de leishmnaiose, sua alta

toxicidade é um fator limitante para seu uso (MILLÁN; OLIVEIRA; BRUNA-

ROMERO, 2011). Dor no local da injeção, dor de cabeça, congestão, dispnéia e

alguns efeitos secundários pouco frequentes tais como taquicardia, hipotensão,

hipoglicemia, alterações cardiológicas e nefrotoxicidade são alguns dos efeitos

descritos. O diabetes mellitus pode se manifestar a partir da administração da

dose total de 1g; o efeito diabetogênico parece ser cumulativo e dose dependente

(LOISEAU; BORIES, 2006).

Além da toxicidade e dos efeitos adversos já descritos, o IP apresenta

baixa biodisponibilidade oral e, desta forma, é administrado somente pelas vias IM

e EV. Sabe-se que a maior parte das infecções relacionadas às NTDs ocorre em

países tropicais ou subtropicais que, geralmente, possuem sistemas de

assistência médica precários e, consequentemente, a necessidade de

administração de fármacos por vias parenterais limita o uso clínico dos mesmos

(KOTTHAUS et al., 2011).

INTRODUÇÃO 26

Em relação ao custo do tratamento, o uso do IP apresenta um custo mais

elevado tendo em vista que o fármaco é, de fato, mais caro. Porém, do ponto de

vista operacional, os gastos com os antimoniatos tornam-se, indiretamente,

maiores, uma vez que são necessárias várias aplicações, deslocamentos de

grandes distâncias e maiores gastos com o uso de insumos hospitalares devido

ao tempo prolongado de tratamento. Neste caso, a utilização do IP apresenta

melhor relação custo-benefício (NEVES et al., 2011).

Na tentativa de minimização da problemática descrita envolvendo o

fármaco IP, novas abordagens são descritas na literatura. Dentre elas, pode-se

citar a síntese de novos análogos que apresentem menores efeitos colaterais;

alteração na estrutura química da molécula pelo desenvolvimento de pró-fármacos

visando um aprimoramento nas questões relacionadas à farmacocinética do

fármaco; e o encapsulamento de fármacos em sistema de liberação de fármacos

visando, por exemplo, o aumento da sua biodisponibilidade que poderia estar

relacionada à candidatura do fármaco a uma administração oral (KOTTHAUS et

al., 2011; PACHECO et al., 2009).

1.3.2 Eficácia da Pentamidina

O IP, segunda opção de tratamento para a LTA no Brasil, é considerado o

fármaco de primeira linha no Suriname e Guiana Francesa, locais nos quais há,

predominantemente, infecção por L. guyanensis. Na Guiana Francesa, em

pacientes com LC, a utilização do IP propiciou a cura de quase 100% dos

pacientes, sem efeitos adversos importantes (NACHER et al., 2001).

No Brasil, um estudo comparando a eficácia de 3 aplicações de IP, na dose

de 4mg/kg/dia, por via IM, em dias alternados, e AM, na dose de 20 mg/kg/dia,

durante 20 dias, por via EV, apontou eficácias semelhantes - 71% e 73,2%,

respectivamente. Observou-se a redução do tempo de tratamento e menor

toxicidade cardíaca no grupo do IP. Os principais eventos adversos foram tontura,

lipotímia e dor no local das injeções (PAULA et al., 2003).

INTRODUÇÃO 27

Segundo Neves e colaboradores (2011), o IP e os antimoniatos

apresentaram eficácias similares no tratamento da LTA ocasionada por L.(V.)

guyanensis em um estudo clínico randomizado comparando AM, IP e AB para o

tratamento da LC ocasionada por essa espécie de Leishmania. Observou-se taxas

de cura de 58,1% e 55,5% em pacientes tratados com 3 injeções (IM) de IP (4

mg/kg, a cada 72 horas) e 20 injeções (IM) de antimoniatos (15 mg/kg/dia),

respectivamente. Embora o AM seja considerado a terapia de primeira linha para

o tratamento da LC pelo Ministério da Saúde, na região de Manaus, o IP tem sido

empregado como o fármaco de primeira escolha desde 1985. Neste caso, o

tratamento com o IP pode aumentar a adesão ao tratamento tendo em vista a

menor duração do mesmo e o número reduzido de injeções visando a mesma

eficácia terapêutica (NEVES et al., 2011).

Estudos feitos pelos grupos de Talhari (1985) e Pradinaud (1988) na

Guiana Francesa e alguns países vizinhos, incluindo o Brasil (região amazônica),

utilizou o IP em pacientes com LC causada, também, por L. (V.) guyanensis, na

dose de 4mg/kg via IM profunda de 2 em 2 dias, 3 doses (atingindo-se uma dose

total de 720mg), obtendo-se resposta superior àquela obtida com o AM. Além

disso, os efeitos colaterais foram considerados mínimos.

Roussel e colaboradores (2013) compararam o tratamento a partir de 1 e 2

injeções IM de IP (7mg/kg - dose única) em pacientes da Guiana francesa com

LC e as taxas de cura obtidas foram de 78,8%.

1.4 Alternativas Terapêuticas

A alta prevalência da leishmaniose, a inviabilidade econômica da utilização

de diferentes medicamentos em determinados esquemas terapêuticos e quadros

clínicos relacionados a doença, bem como a resistência aos fármacos

convencionais usualmente utilizados na prática clínica, apontam para a

necessidade de incentivo ao desenvolvimento de novos tratamentos mais

eficientes e menos tóxicos (BORBOREMA, 2010).

INTRODUÇÃO 28

Entretanto, tendo em vista o custo e o tempo demandado para a

descoberta de novas entidades moleculares ativas, embora tal busca possa e

deva ser levada adiante concomitantemente, outra alternativa viável, e

amplamente utilizada no âmbito farmacêutico, seria a busca pelo aprimoramento

dos fármacos já existentes. Modificações estruturais e/ou relacionadas a novos

tipos de formulação, formas farmacêuticas e suas respectivas vias de

administração, e a consequente mudança na farmacocinética, especificidade e

toxicidade do fármaco são algumas estratégias válidas para a obtenção de novos

tratamentos (FRÉZARD; DEMICHELI; RIBEIRO, 2009).

A nanotecnologia é um campo científico multidisciplinar que tem avançado

rapidamente nos últimos anos, tendo aplicações nas mais diversas áreas, desde

os setores de energia e eletrônica até a indústria farmacêutica. O princípio dessa

ciência consiste no fato de que os materiais na escala nanométrica podem

apresentar propriedades químicas, físico-químicas e comportamentais diferentes

daquelas apresentadas em escalas maiores (ABAMOR; ALLAHVERDIYEV, 2016).

A utilização desta, nos últimos anos, permitiu o desenvolvimento de projetos de

grande relevância para a medicina e tecnologia farmacêutica que visam, por

exemplo, a criação de dispositivos em nanoescala para administração de

fármacos, os chamados sistemas de liberação de fármacos (SLFs) (MOGHIMI;

PEER; LANGER, 2011).

1.4.1 Sistemas de Liberação de Fármacos

Diversas pesquisas vêm demonstrando o potencial da nanotecnologia

farmacêutica no tratamento, prevenção e diagnóstico de inúmeros quadros

patológicos, dentre eles os relacionado ás doenças parasitárias. Nesse contexto,

técnicas inovadoras estão sendo aplicadas na obtenção de novas formas

farmacêuticas de liberação controlada de fármacos capazes de manter ou

ampliar a ação de agentes promissores utilizados no combate e controle dessas

doenças (ARIAS et al., 2015; WANT et al., 2014).

INTRODUÇÃO 29

Diferentes sistemas baseados em nanotecnologia, visando a liberação de

fármacos já existentes e de ação conhecida, já foram desenvolvidos, incluindo

os inorgânicos, magnéticos e poliméricos (MITRAGOTRI; LAHANN, 2012) os

quais apresentam vantagens quando comparados às terapias convencionais.

Alguns avanços tecnológicos permitiram, recentemente, o desenvolvimento de

novas técnicas para a obtenção destes sistemas. Essas técnicas são capazes

de regular a taxa de liberação dos fármacos, promover a liberação sustentada

e/ou a vetorização em relação a um tecido específico (QASIM et al., 2014).

O uso de SLFs é uma estratégia para o desenvolvimento de novas formas

terapêuticas combinadas para o tratamento da leishmaniose. Os SLFs podem

ser usados para concentrar um fármaco em determinados tecidos ou células

infectadas e diminuir a toxicidade; proteger a substância ativa da degradação

pelos fluidos biológicos e; permitir a administração por novas rotas, solucionando

problemas relacionados a farmacocinética do fármaco como a baixa solubilidade

em água e degradação em meio ácido (ANDRADE et al., 2013; PHAM;

LOISEAU; BARRATT, 2013; QASIM et al., 2014).

Algumas vantagens relacionadas às formas farmacêuticas de liberação

prolongada de fármacos em relação às convencionais são: menor flutuação dos

níveis plasmáticos do fármaco, uma vez que a liberação controlada permite a

manutenção dos níveis de fármaco dentro da janela terapêutica diminuindo, por

um lado, o risco de efeitos adversos e, por outro, a ineficácia terapêutica; maior

conveniência de administração e consequente adesão ao tratamento, já que a

liberação prolongada permite uma menor frequência de administração; redução

nos custos globais com a saúde, pois embora o custo inicial das formas

farmacêuticas de liberação prolongada seja maior em relação as convencionais,

o custo global do tratamento torna-se menor devido à melhoria da eficácia

terapêutica, redução dos efeitos adversos e redução do tempo requerido para

dispensação e administração do medicamento e monitoramento do paciente

(ANSEL et al., 2007).

INTRODUÇÃO 30

Os SLFs podem ser constituídos de diferentes materiais biocompatíveis e

biodegradáveis, podendo-se relacionar entre os mais estudados as

nanopartículas poliméricas (NPs), as nanoemulsões, as micelas poliméricas, as

ciclodextrinas, os lipossomas, os nanocompósitos, dentre outros (ABAMOR;

ALLAHVERDIYEV, 2016).

1.4.1.1 Nanopartículas poliméricas

As NPs são materiais particulados que apresentam tamanho na faixa

nanométrica, entre 10 e 1000 nm, e podem ser formadas por polímeros naturais

ou sintéticos. O fármaco pode estar incorporado, encapsulado, adsorvido ou

aderido às NPs. Estes SLFs podem se apresentar em duas formas distintas, as

nanocápsulas e nanoesferas, as quais diferem entre si segundo a composição e

organização estrutural (Figura 6) (SCHAFFAZICK et al., 2003; SINGH; LILLARD,

2009).

As nanocápsulas constituem os sistemas do tipo reservatório no qual se

observa um invólucro polimérico disposto ao redor de um núcleo, podendo o

fármaco estar dissolvido neste núcleo e/ou adsorvido à parede polimérica. Por

outro lado, as nanoesferas são sistemas do tipo matricial formadas por uma

matriz polimérica na qual o fármaco pode ficar homogeneamente disperso ou

adsorvido em sua superfície (LETCHFORD; BURT, 2007).

INTRODUÇÃO 31

Figura 6: Representação esquemática das nanocápsulas e nanoesferas poliméricas: a) fármaco dissolvido no núcleo; b) fármaco adsorvido à parede polimérica; c) fármaco retido na matriz

polimérica; d) fármaco adsorvido ou disperso na matriz polimérica.

Fonte: Adaptado de SCHAFFAZICK et al., 2003.

As NPs podem ser preparadas a partir de uma variedade de materiais. A

seleção desse material é dependente de muitos fatores tais como: o tamanho

desejado das partículas, as características inerentes ao fármaco (solubilidade e

estabilidade), as características de superfície (permeabilidade e carga), o grau

de biodegradabilidade, biocompatibilidade e toxicidade, o perfil de liberação do

fármaco, o método utilizado para produção das NPs, dentre outros (RAO;

GECKELER, 2011).

Diversos métodos já descritos em literatura abordam o preparo de NPs.

Dentre os mais comumente utilizados, podem-se destacar dois métodos

distintos: o método da dupla emulsificação e evaporação do solvente (DEES) e o

método da nanoprecipitação (VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009). A escolha do

método de preparação é feita com base em diversos parâmetros, tais como o

tipo de sistema polimérico, a destinação da NPs, área de aplicação, o tamanho

desejado, fármaco que se deseja encapsular, características das moléculas,

dentre outros (RAO & GECKELER, 2011).

INTRODUÇÃO 32

Inúmeros polímeros podem ser utilizados para o preparo das NPs, dentre

eles: ácido polilático (PLA); ácido lático-co-ácido-glicolico (PLGA), poli (ciano

acrilato) (PCA), poli-ε-caprolactona (PCL), dentre outros (MOHANRAJ; CHEN,

2006). Dentre os diversos polímeros utilizados, pode-se destacar o PLGA.

O PLGA é um copolímero utilizado para fins medicinais devido a sua

biocompatibilidade e biodegradabilidade (Figura 7). Copolímeros são polímeros

que apresentam em sua composição dois ou mais tipos de monômeros. A

copolimerização é um processo que resulta em uma grande versatilidade de

propriedades e desempenho de materiais. Essas propriedades variam de acordo

com a porcentagem que cada monômero corresponde na molécula, bem como

distribuição destes ao longo da cadeia. O PLGA é um poliéster adequado para a

liberação controlada de fármacos por apresentar baixa toxicidade. Em condições

fisiológicas, este polímero é degradado por hidrólise das suas ligações éster e

sua taxa de degradação é dependente de uma série de fatores, incluindo a

razão entre seus monômeros, massa molecular, forma e estrutura da matriz

polimérica (ARIAS et al., 2015; WICKLINE et al., 2007; WOODRUFF;

HUTMACHER, 2010).

Figura 7: Esturuta química do polímero PLGA.

Fonte: WOODRUFF; HUTMACHER, 2010.

A liberação de fármacos a partir destes sistemas é controlada por uma

série de fatores, dentre os quais pode-se destacar: desorção do fármaco

adsorvido na superfície da partícula; difusão do fármaco através de poros e

INTRODUÇÃO 33

canais da matriz polimérica; difusão do fármaco pela parede polimérica; erosão

da matriz polimérica (SOPPIMATH et al., 2001).

NPs de poliésteres exibem maior estabilidade no trato gastrointestinal

(TGI) em relação à outros nanocarreadores como os lipossomas. De acordo com

a literatura, as NPs–PLGA são absorvidas por células epiteliais intestinais

especializadas, aumentando a biodisponibilidade de substâncias que

apresentam baixa absorção oral. Além disso, os compostos nanoencapsulados

em NPs de PLGA são protegidos da degradação por oxidação, hidrólise ou

ácido gástrico (TSAI et al., 2012).

Gaspar e colaboradores (1992) avaliaram a ação de NPs de

polialquilcianoacrilato (PACA) carregadas com primaquina contra macrófagos

infectados com L. donovani. Os resultados mostraram que as NPs contendo o

fármaco foram 21 vezes mais eficazes do que a primaquina livre na erradicação

do parasita. Além disso, as NPs de PACA sem o fármaco (NPs branco) exibiram

atividade anti-leishmaniose equivalente a primaquina livre em função da ativação

de macrófagos (GASPAR et al., 1992). Em outro estudo, por sua vez, Date e

colaboradores (2007) avaliaram a ação de NPs de PLA as quais se mostraram 3

vezes mais ativas na redução da carga parasitária em relação a este mesmo

fármaco livre. Neste caso, as NPs que não continham o fármaco não mostraram

qualquer atividade leishmanicida in vitro indicando, desta forma, a importância

do polímero na matriz em relação à eficácia destas formas farmacêuticas

(DATE; JOSHI; PATRAVALE, 2007).

A ação de NPs de PCL encapsuladas com AB foi avaliada em relação a

sua ação anti-leishmanicida, assim como a redução dos efeitos adversos

associados a este fármaco. Os resultados encontrados mostraram que as NPs

carregadas com o fármaco foram de 2 a 3 vezes mais eficazes em relação ao

fármaco livre na redução da carga parasitária além da diminuição dos efeitos

colaterais associados (ESPUELAS et al., 2002).

INTRODUÇÃO 34

O potencial de NPs de metacrilato de polimetila carregadas com IP foi

elucidado a partir de ensaios in vitro e in vivo em macrófagos e em ratos

infectados com parasitas do gênero Leishmania pela via de administração IV. Os

estudos in vitro mostraram que as NPs contendo IP foram 25 vezes mais

eficazes em relação ao fármaco livre enquanto os estudos in vivo revelaram que

estas mesmas NPs mostraram ação superior a do fármaco livre na redução da

carga parasitária no fígado. Além disso, os autores observaram a diminuição dos

efeitos adversos associados ao fármaco (DURAND et al., 1997).

1.5 Via de Administração Oral

Com exceção da miltefosina, os fármacos utilizados no tratamento de

todas as formas de leishmaniose têm baixa biodisponibilidade oral. As principais

razões para tal são a susceptibilidade à degradação enzimática e a baixa

permeação em função das suas propriedades físico-químicas. O fator mais

importante relacionado a estas propriedades seria a baixa solubilidade em água

de determinadas moléculas, fato este que limita, diretamente, a

biodisponibilidade oral (PRASAD et al., 2004).

A absorção de fármacos a partir do trato gastrointestinal (TGI) vem sendo

cada vez mais estudada ultimamente. Este estudo, no geral, está relacionado ás

barreiras que restringem ou dificultam a absorção do fármaco incluindo

características intrínsicas ao fármaco tais como solubilidade e pka, por exemplo,

e relacionados ao meio, como pH, permeabilidade celular, integridade, dentre

outros. Neste contexto, algumas estratégias podem ser empregadas para o

desenvolvimento de sistemas de administração oral seguros e eficazes.

Aumento da solubilidade, modificação do mecanismo de absorção e o aumento

do tempo de meia vida são algumas das alternativas a serem levadas em

consideração para o desenvolvimento destes sistemas e, neste contexto, os

INTRODUÇÃO 35

SFLs têm um papel fundamental a desempenhar. (BERNKOP-SCHNÜRCH,

2013).

Em estudos feitos por Italia e colaboradores (2009) a AB foi encapsulada

em NPs de PLGA na tentativa de um aumento da sua biodisponibilidade oral e

minimização dos seus efeitos adversos. Segundo os autores, a formulação

contendo o fármaco reduziu a sua nefrotoxicidade tanto pela via oral como pela

IV em comparação ao fármaco livre. Além disso, a biodisponibilidade oral

mostrou-se cerca de 8 vezes maior quando encapsulada em NPs. A atividade

anti-leishmania pela via oral também foi aprimorada por esta formulação (ITALIA

et al., 2009). Em outro estudo, NPs também contendo AB com foco na via de

admnistração oral, mostraram-se estáveis em relação aos diferentes valores de

pH encontrados no TGI e baixa toxicidade quando administradas por essa via. A

biodisponibilidade oral deste fármaco foi aumentada em comparação ao fármaco

livre, bem como a sua meia vida plasmática, sugerindo uma liberação controlada

do fármaco em questão (PATEL; PATRAVALE, 2011).

Outros autores já mostraram a preparação de NPs contendo o fármaco

IP. Arias e colaboradores (2015) desenvolveram NPs de PLGA contendo IP com

foco no tratamento de tripassonomíase africana; Durand e colaboradores (1997),

por sua vez, desenvolveram NPs contendo IP, entretanto, com foco na

administração pela via parenteral. Embora os trabalhos aqui mencionados

estejam relacionados ao tratamento de doenças parasitárias, nenhum trabalho,

até o momento, teve como objetivo principal o tratamento da leishmaniose e/ou

a administração oral do IP.

INTRODUÇÃO 36

2. OBJETIVOS

OBJETIVOS 37

2.1 Objetivo geral

O objetivo principal deste trabalho consiste no desenvolvimento e

caracterização de NPs poliméricas para liberação de IP com foco em suas

propriedades físico-químicas, farmacológicas e no seu perfil de liberação,

visando a sua aplicação no tratamento da leishmaniose pelas via de

administração oral.

2.2 Objetivos específicos

Preparar as NPs poliméricas contendo IP;

Desenvolver e validar uma metodologia analítica para quantificação de IP;

Caracterizar os nanossistemas;

Avaliar o perfil de liberação do fármaco in vitro a partir das NPs preparadas;

Estudar a estabilidade dos nanossistemas;

Avaliar o perfil farmacológico in vivo dos nanossistemas.

OBJETIVOS 38

2.3 Justificativa

O IP é um fármaco de grande interesse no tratamento da leishmaniose

visceral e mucocutânea em casos de resistência aos antimoniatos, entretanto,

sabe-se que esta molécula apresenta baixa biodisponibilidade oral e, portanto,

deve ser administrada pelas vias IM e/ou IV. Desta forma, o tratamento usual

para todas as formas de leishmaniose envolve a hospitalização do paciente,

possui efeitos clínicos limitados e alto índice de efeitos colaterais. Tendo em

vista a problemática apresentada anteriormente e que a leishmaniose constitui

um problema de saúde pública considerável, é de grande importância o

desenvolvimento de um novo SLF contendo IP visando melhores perspectivas

relacionadas aos efeitos clínicos usualmente relatados, menor incidência dos

efeitos adversos, aumento da biodisponibilidade do fármaco e consequente

melhor aceitação do paciente ao tratamento pela possibilidade da administração

oral. Neste contexto, a utilização do IP encapsulada em NPs poliméricas para

aplicação no tratamento da leishmaniose torna-se uma possível alternativa em

relação ao tratamento usual.

MATERIAL E MÉTODOS 39

3. MATERIAL E MÉTODOS


3.1 Material

3.1.1 Matérias-primas, Soluções e Reagentes

Acetato de uranila – REAGEN

Acetonitrila – TEDIA

Ácido fosfórico – ANIDROL

Cloreto de potássio – SYNTH

Cloreto de sódio – SIGMA

Diclorometano – TEDIA

Fosfato de potássio dibásico anidro – TEDIA

Fosfato de potássio monobásico anidro – SIGMA

Isotianato de Pentamidina – SIGMA

Metanol – TEDIA

Nipagin – SIGMA

PLGA – SIGMA

Álcool polivinílico (PVA) – SIGMA

3.1.2 Equipamentos

Analisador de tamanho de partículas – Zeta sizer S90

Analisador de Potencial Zeta – NanoBrook ZetaPALS Potential Analyzer

Balança Analítica – SARTORIUS

Banho de Ultrassom - UNIQUE

Câmara Climática – NOVA ÉTICA® 420/LCD 150

Células de difusão vertical do tipo Franz – DISA

Coluna cromatográfica C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) – KROMASIL

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência – PERKIN ELMER FLEXAR

ISOCRATIC LC 250 EQUIPMENT


Estufa – HERAEUS FUNCTION LINE

Garras para Célula de Franz – PYREX

Gotejador Automático - COLE-PARMER

Liofilizador – LIOTOP L101

Microscópio Eletrônico de Transmissão – TECNAI SPIRIT120KV

Pipeta automática – HTL LABMATE SOFT

Placa aquecedora com agitação magnética – CORNING PC230

Potenciômetro – METTLER TOLEDO

Rotaevaporador – IKA RV 10 BASIC

Saco de Diálise – SIGMA MW (12105) 33mm

Ultracentrífuga refrigerada – HITACHI CR 22GIII

Ultrassonicador – HIELSCHER UP100H

Vidraria - PYREX

3.2 Métodos

3.2.1 Desenvolvimento da metologia analítica para a quantificação de IP

A metodologia analítica para quantificação de IP por CLAE foi utilizada para

a determinação do teor das formulações durante as etapas de desenvolvimento e

caracterização das mesmas. A determinação do teor de IP foi realizada através de

um novo método proposto, cujas condições cromatográficas foram baseadas e

adaptadas de uma metodologia previamente descrita (POOLA et al., 2002).

As condições cromatográficas testadas foram: coluna C18 (250 mm x 4,6

mm, 5 µm); fase móvel composta por 75% de fosfato de potássio monobásico

0,025 M, pH 3,2, utilizando-se água purificada como veículo (pH ajustado para 3,2

com ácido fosfórico) e 25% de acetronitrila; fluxo de 1,0 mL/min; volume de injeção

de 30 µL; comprimento de onda de 270 nm; e temperatura do forno de 25°C

(Tabela 1). Definidas as condições cromatográficas a serem utilizadas no método,

o mesmo foi posteriormente validado.


Tabela 1: Condições cromatográficas para a metodologia proposta para a quantificação de IP.

Parâmetros Condições empregadas

Coluna Coluna C18 (250 x 4.6 mm; 5 µm -

Kromasil)

Fase Móvel Tampão fosfato pH 3.2: Acetonitrila

(75:25)

Fluxo 1.0 mL/min

Volume de injeção 30 µL

Temperatura do

forno 25◦C

Tempo de corrida 10 minutos

Comprimento de

onda 270 nm

3.2.2 Preparo das curvas de calibração de IP

O preparo das curvas de calibração do fármaco foi feito a partir de uma

solução estoque de IP. Foram pesados, com precisão analítica, 12,5 mg de

fármaco, os quais foram transferidos para balão volumétrico de 25 mL e o volume

foi completado com metanol, resultando em uma solução de concentração 500

μg/mL.

As soluções de IP foram obtidas a partir de diluições da solução estoque e

foram preparadas nas concentrações de 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100

μg/mL, 150 μg/mL e 200 μg/mL a fim de se obter a curva padrão. Todas as

soluções foram previamente filtradas em filtros descartáveis com membranas

Millipore (Millex®) de 0,45 μm de diâmetro de poro para posterior injeção.


3.2.3 Validação da metodologia analítica

A resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003, dispõe que, no caso da

metodologia analítica não estar descrita em farmacopéias ou compêndios oficiais,

a mesma deverá ser submetida aos parâmetros de validação. A validação de

métodos analíticos é, portanto, um processo pelo qual se estabelece, pelas

análises experimentais laboratoriais, que as características de desempenho do

método, os também denominados parâmetros de validação, apresentem os

requisitos necessários para aplicação analítica pretendida, permitindo assegurar a

confiabilidade dos resultados obtidos e assim garantir a qualidade dos produtos

(ANVISA, 2003).

A validação foi baseada no Guia para Validação de Métodos Analíticos e

Bioanalíticos, anexo da RE n◦ 899, de 29 de maio de 2003, da ANVISA (ANVISA,

2003), sendo avaliados, portanto, os seguintes parâmetros: especificidade e

seletividade, linearidade, precisão, limite de detecção, limite de quantificação,

exatidão e robustez.

3.2.3.1 Seletividade

A seletividade é caracterizada como a capacidade de um método analítico

em avaliar substâncias de interesse na presença de outras as quais podem

interferir na determinação de certa substância em uma amostra complexa

analisada. Avalia, portanto, o grau de interferência de outros componentes

presentes na amostra, bem como excipientes, impurezas, produtos de degradação,

dentre outros, durante a análise da amostra. Um método seletivo deve ser capaz

de garantir que a resposta seja, exclusivamente, do composto de interesse

(RIBANI et al., 2004).


A seletividade foi avaliada pela observação do tempo de retenção dos picos

obtidos nas análises da solução de IP padrão de trabalho e da formulação placebo,

ambos preparados na concentração de 100 μg/mL em fase móvel.

3.2.3.2 Linearidade

A linearidade é definida como a capacidade de uma metodologia analítica

demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais a

concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado (ANVISA,

2003).

Para a avaliação da linearidade, foram preparadas três curvas padrão de IP

com faixa de concentração de 10 a 200 μg/mL. Para cada curva padrão, foram

preparadas 6 soluções de trabalho nas concentrações de 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50

μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL e 200 μg/mL, correspondentes aos pontos da curva

de calibração. As injeções de cada uma das soluções foram feitas em triplicata.

A linearidade do método foi determinada pela análise de regressão linear. O

critério de linearidade foi à obtenção do coeficiente de correlação (r) com valor

mínimo de 0,99, conforme preconizado pela ANVISA (ANVISA, 2003).

3.2.3.3 Limite de detecção e quantificação

O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob

as condições experimentais estabelecidas. Já o limite de quantificação (LQ), por

sua vez, é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser

determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais

estabelecidas (ANVISA, 2003).


Os limites de detecção e de quantificação foram estimados com base na

equação da reta, aplicando-se as equações 1 e 2 apresentados abaixo:

𝐿𝐷 =𝐷𝑃 𝑥 3

𝐼𝐶 (Equação 1)

𝐿𝐷 =𝐷𝑃 𝑥 10

𝐼𝐶 (Equação 2)

Em que, DP é o desvio padrão do intercepto com o eixo das ordenadas de,

no mínimo, 3 curvas de calibração e IC é a inclinação da curva de calibração

(ANVISA, 2003).

3.2.3.4 Precisão

A precisão de uma metodologia analítica consiste na avaliação da

proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma mesma

amostra e pode ser considerada em três níveis: repetibilidade (precisão intra-

corrida), precisão intermediária (precisão inter-corridas) e reprodutibilidade

(precisão interlaboratorial) (ANVISA, 2003).

Para verificá-la, foram preparadas seis soluções a 100% da concentração

do teste, ou seja, a 100 µg/mL, e a análise de precisão foi realizada pela

determinação do desvio padrão (DP) e desvio padrão relativo (DPR), que devem

apresentar variações menores que 5% (ANVISA, 2003).

A precisão intermediária foi determinada repetindo-se o mesmo

procedimento executado para a repetibilidade, em outro dia, e os resultados

obtidos foram avaliados pela concordância entre os resultados.


3.2.3.5 Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos

pelo método em relação ao valor considerado verdadeiro (ANVISA, 2003).

Para análise da exatidão, inicialmente, foram preparadas três soluções de

IP padrão de trabalho em triplicata com níveis de concentração diferentes: baixo

(50 µg/mL), médio (100 µg/mL) e alto (150 µg/mL). Foram realizadas três injeções

de cada amostra.

Para o cálculo da exatidão do método, foi considerada a porcentagem de

recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à solução, com limite

considerado aceitável entre 95% a 105% de recuperação (ANVISA, 2003).

3.2.3.6 Robustez

A robustez é a medida da capacidade de um método analítico em resistir a

pequenas e intencionais variações dos parâmetros analíticos; indica a sua

confiança durante o uso normal (ANVISA, 2003).

Para a determinação da robustez, foram preparadas soluções de IP padrão

de trabalho na concentração de 100 µg/ml. Foram testadas as seguintes variações

das condições cromatográficas: variação do fluxo da fase móvel de 1,0 ml/min

para 1,1 mL/min e para 0,9 mL/min e variação da temperatura de 25oC para 30oC.

3.2.4 Determinação da solubilidade do fármaco

A solubilidade do IP foi determinada em solução fisiológica (SF) 0,9% e em

tampão fosfato salino (PBS, do inglês, phosphate buffered saline) pH=7,4. O

ensaio foi realizado a partir da adição de um excesso do fármaco

(aproximadamente 1 mg) a 1 mL das respectivas soluções candidatas e o sistema

foi mantido sob agitação por 24 horas, à temperatura ambiente. Após esse


período, as soluções foram filtradas em membranas de 0,45 µm. A determinação

da solubilidade do IP foi feita a partir da comparação com uma curva padrão do

fármaco nas concentrações de 10 à 1000 µg/mL. A concentração da solução

amostra (CAmostra) foi determinada com o auxílio da Equação 3:

𝐶𝑜𝑛𝑐. (𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) =Á𝑟𝑒𝑎(𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎) 𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐.(𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜)

Á𝑟𝑒𝑎 (𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜) (Equação 3)

3.2.5 Preparo das NPs pelo método da DEES

O preparo destas NPs foi baseado no método DEES descrito por Souto e

colaboradores (2012) (SOUTO; SEVERINO; SANTANA, 2012). As proporções

utilizadas foram baseadas em trabalhos prévios desenvolvidos por De Abreu

(2016), do grupo de pesquisa do Laboratório de Tecnologia Industrial

Farmacêutica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (LabTIF‐UFRJ) (DE

ABREU et al., 2016).

Inicialmente, uma solução 2,5% de PLGA foi preparada em diclorometano

(DCM). Á 5 mL desta solução, sob ação de um sonicador, gotejou-se 1mL de uma

solução aquosa do fármaco na concentração de 1 mg/mL, a uma velocidade de 12

mL/hora com auxílio de um gotejador automático. Posteriormente, à 40 mL de

uma solução 0,1% de PVA, gotejou-se a emulsão primária previamente obtida, à

20 mL/hora, mantendo-se a aplicação da energia ultrassônica por 5 minutos.

Passados os 5 minutos, transferiu-se a emulsão múltipla obtida para o

rotaevaporador para remoção total dos solventes.


3.2.6 Caracterização das NPs

3.2.6.1 Tamanho de partícula e distribuição do tamanho

A análise do tamanho médio de partículas (TP) foi realizada com o intuito

de verificar se as NPs encontravam-se em escala nanométrica. A análise do TP

das NPs foi realizada utilizando-se o equipamento Zeta sizer S90 (Malvern

Instruments, Malvern, Reino Unido), empregando-se uma célula de quartzo de 1

cm de caminho ótico, à 25ºC, com ângulo de detecção de 90º, a partir da técnica

de dispersão dinâmica de luz (DLS, do inglês, Dynamic Light Scattering). As

amostras foram analisadas sem nenhum tratamento prévio, em triplicata, de modo

que cada análise corresponde à uma média de treze determinações.

Simultaneamente à análise do TP, foram obtidos resultados correspondentes à

distribuição do tamanho o qual avalia a homogeneidade dos sistemas em

suspensão (DA SILVA et al., 2012).

3.2.6.2 Potencial zeta

A avaliação do potencial de zeta (ZP) da suspensão de NPs preparada foi

realizada utilizando-se o equipamento NanoBrook ZetaPALS Potential Analyzer

(Brookhaven Instruments Co., Holtsville, NY, EUA). Foram realizadas dez medidas

para cada amostra (n=3) com cálculo subsequente do valor médio. A

determinação desse parâmetro é importante, uma vez que a carga na superfície

das NPs influencia na estabilidade destas formulações (DA SILVA et al., 2012).

O ensaio foi realizado no Laboratório de Agregação de Proteínas

Amiloidoses da Professora Doutora Débora Foguel, do Instituto de Bioquímica

Médica Leopoldo de Meis, da Universidade Federal do Rio de Janeiro.


3.2.6.3 Eficiência de encapsulamento (EE%)

A eficiência de encapsulamento (EE%) é estimada como sendo a diferença

percentual entre a concentração de fármaco inicialmente adicionado na

formulação e a concentração presente nas partículas.

A EE% foi determinada por um método indireto o qual mede a quantidade

de fármaco não encapsulado (IP livre) após a separação das NPs formadas e do

fármaco livre por ultracentrifugação (DAS; KASOJU; BORA, 2010; DURAND et al.,

1997; FRITZE et al., 2006; LOPES et al., 2012; SHARMA et al., 2015). A

suspensão de NPs preparada foi ultracentrifugada, a 20.000 rpm, durante 30

minutos para a sedimentação das NPs sólidas. Em seguida, o sobrenadante foi

analisado de acordo com a metodologia CLAE relatada anteriormente assumindo-

se que o fármaco não presente no sobrenadante havia sido encapsulado pelas

NPs–PLGA. A EE% foi determinada segundo a seguinte equação (4):

EE (%) =(IP Total−IP Livre)

IP Total x100 (Equação 4)

3.2.6.4 Rendimento (R%)

O rendimento do processo (R%) compreende a massa de NPs obtidas em

relação á quantidade de fármaco e polímero utilizados no processo. Para a

obtenção do pellet de NPs para posterior pesagem, as NPs foram

ultracentrifugadas, á 20.000 rpm, por 30 minutos. Posteriormente, o sobrenadante

foi descartado após utilização no ensaio de EE conforme descrito no item 3.2.6.3 e

o pellet obtido foi liofilizado (DE ABREU et al., 2016). Para cálculo do R%, o

conteúdo liofilzado foi pesado e o cálculo foi feito a partir da equação 5 abaixo:


R% =massa de NPs liofilizadas

massa teórica (fármaco+polímero) (Equação 5)

3.2.6.5 Avaliação do tamanho e morfologia por microscopia eletrônica

de transmissão

A avaliação do tamanho, assim como da morfologia das NPs, foi realizada

por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) em microscópio Tecnai

Spirit120kv (FEI Tecnai,108 Hillsboro, OR, USA).

À uma grade de cobre de 200 mesh (Ted Pella, Redding, CA, EUA), foi

adicionada uma gota da suspensão das NPs preparadas sem nenhum tratamento

prévio e o excesso foi retirado por capilaridade com papel de filtro.

Posteriormente, foi adicionado 10 µL de acetato de uranila 5% e, novamente, o

excesso foi removido. Em seguida, as grades preparadas foram mantidas por um

período de 24 horas em um dessecador a vácuo e então submetidas à análise por

MET (DA SILVA et al., 2012).

3.2.7 Estudos de estabilidade

Para a realização do estudo de estabilidade das formulações (ANVISA,

2005), as mesmas foram preparadas conforme descrito anteriormente e

acondicionadas em frascos de vidro âmbar, com tampa de polietileno de alta

densidade com lacre e devidamente identificadas. A suspensão de NPs foi

avaliada em três condições distintas:

Estabilidade acelerada: as amostras foram submetidas a condições

forçadas de temperatura e umidade ao serem armazenadas em câmara climática

com temperatura de 40 ± 2oC e umidade relativa (UR) de 75% ± 5%; as análises

foram realizadas a cada 15 dias (tempos 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias);


Estabilidade à 25ºC (temperatura ambiente): as amostras foram

submetidas à temperatura de 25oC; as análises foram realizadas a cada 5 dias

(tempos 0, 5, 10, 15, 20 e 30 dias);

Estabilidade à 2-4ºC (geladeira): as amostras foram submetidas à

temperatura de 2-4 oC; as análises foram realizadas a cada 5 dias (tempos 0, 5,

10, 15, 20 e 30 dias);

As análises das formulações foram realizadas em intervalos de tempo

determinados e os resultados foram comparados àqueles obtidos no momento

zero. A suspensão de NPs foi avaliada quando ao TP, concentração de fármaco e

aspecto visual.

3.2.8 Avaliação do perfil de liberação in vitro

O estudo do perfil de liberação foi realizado utilizando-se a suspensão de

NPs obtidas pelo método da DEES a partir da metodologia CLAE previamente

apresentada. Os experimentos foram feitos a partir da utilização de sacos de

diálise 33 mm (Membrana de acetato de celulose; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA,

MO) com cerca de 25 cm2 de área. Cerca de 10 mL da suspensão de NPs foi

acondicionado em sacos de diálise, previamente hidratados e devidamente

fechados. Os sacos foram imersos em tubos falcon de 50 mL contendo 30 mL do

meio receptor selecionado de forma que estes permanecessem completamente

submersos.

Os tubos falcon foram colocados dentro de um bécher em banho-maria a

37°C contendo 10 mL de uma solução de nipagin 2% e 190 mL de água

destilada, a fim de se evitar a proliferação de microorganismos. O sistema foi

mantido a esta temperatura e sob agitação constante durante um mês. O

experimento foi realizado em duplicata.

Alíquotas de 1,5 mL foram retiradas em intervalos de tempo pré-

determinados, seguida da reposição da mesma quantidade de meio.


Posteriormente, as amostras foram filtradas para vial e avaliadas por CLAE. A

partir das concentrações obtidas foi construído um gráfico do perfil de liberação

das partículas (DE ABREU et al., 2016).

Para a avaliação da cinética de liberação do IP, os resultados de liber

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