DESENVOLVIMENTO DE UM NOVO TESTE DE GENOTIPAGEM DO ALELO RHDψ

POR PCR EM TEMPO REAL

Sistema Rh

Importância clínica: Reação Transfusional; Doença Hemolítica do Recém-nascido

Diferentes fenótipos: D positivo, D negativo, D fraco, D parcial

Fenótipo RhD negativo

Caracterizado pela ausência do antígeno D na superfície eritrocitária 17% da população europeia

8% da população africana

17,3% dos doadores da sangue da Fundação Hemominas

Bases genéticas do fenótipo RhD negativo

Várias bases genéticas já foram descritas, sendo as mais comuns:

Deleção completa do gene RHD

Gene híbrido

RHD pseudogene

RHD pseudogene 66% dos africanos RhD negativo (Singleton et al, 2000)

15% dos afroamericanos RhD negativo (Singleton et al, 2000)

11% dos brasileiros RhD negativo (Rodrigues et al, 2002)

Genotipagem do alelo RHDψ é necessária para inferência do fenótipo RhD

Métodos clássicos de genotipagem RHD (PCR convencional): exige etapas pós-PCR

Método PCR RHD multiplex- Maaskant-van Wijk et al, 1998Método SSP-PCR RHDψ - Singleton et al, 2000

PCR em tempo real – mais sensível e rápida, não necessita de etapas pós-PCR

Exemplos de aplicação da PCR em tempo real à imunohematologia eritrocitária: - Genotipagem RHD fetal a partir do plasma materno - Genotipagem em pacientes e em doadores de sangue para detecção do gene RHD

Persiste a necessidade de determinação do alelo RHDψ

O objetivo do presente estudo foi padronizar um método de genotipagem do alelo RHDψ utilizando a PCR em tempo real (TaqMan).

Foi desenvolvida uma reação visando a amplificação simultânea e específica do alelo RHDψ e do exon 5 do gene RHD selvagem.

Primers desenhados com o software Primer 3Plus para amplificação específica do gene RHD

Sondas: desenhadas usando o software Primer Express FAM – exon 5 do gene RHD selvagemVIC – alelo RHDψ

Resultados

RHDψ : Amplificação de um fragmento de 212 pb apenas para as amostras portadoras do alelo RHDψ com limite de detecção de 1ng para amostras contendo uma cópia do gene. RHD exon 5: Amplificação do exon 5, detectada pela amplificação de um fragmento de 82 pb foi observada em todas as amostras RhD positivo com limite de detecção de 1 pg.

Amostra homo/hemizigotapara RHDψ

Amostra heterozigota para RHDψ e RHD

Amostra RHD positiva sem RHDψ

Amostras RhD negativo portadoras do alelo RHDψ (n=37):Ct médio de 27 (SD=0,9) para RHDψ , Ct médio de 37 (SD=1,6) para o exon 5

Amostras RhD positivo (n=10):Ct médio de 23 (SD=2,8) para o exon 5

Amostra heterozigota para o alelo RHDψ (n=1):Ct médio de 29 para RHDψ, Ct médio de 23 para o exon 5

Critério para definição da presença do alelo RHDψ

RHDψ em homozigose: Ct RHDψ < Ct exon 5RHDψ em heterozigose: Ct RHDψ > Ct exon 5RHDψ negativo: amplificação apenas do exon 5

Valores de Ct na PCR em tempo real com amplificação simultânea de regiões específicas do RHDψ e do exon 5 do gene RHD.

Discussão

Foi possível estabelecer critérios para inferência de fenótipos RHDψ em hemi e homozigose ou em heterozigose.

Os resultados apontam que o novo teste permite a detecção específica do alelo RHDψe tem a vantagem de ser mais rápido, por eliminar a necessidade das etapas pós-PCR, além de permitir saber se esse alelo encontra-se em heterozigose com um outro alelo RHD.

O teste será validado com um maior número de amostras para que possa ser implementado.

Considerando-se a grande complexidade do sistema Rh, o teste representa mais uma ferramenta a ser acrescentada ao conjunto de testes para auxiliar na genotipagem RHD.

Apoio financeiro

Maria Clara Fernandes da Silva Malta – bióloga, PhD. Núcleo de Inovação Tecnológica, Fundação Hemominas Poliane de Cássia Gonçalves – bióloga. Bolsista de Apoio Técnico, FAPEMIGMarina Lobato Martins – bióloga, PhD. Gerência de Desenvolvimento Técnico Científico, Fundação Hemominas

Equipe