DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O MONOTERPENO … · acima de tudo, sempre acreditou em mim e me...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO CIÊNCIAS DA SAÚDE E
BIOLÓGICAS
Milla Gabriela Belarmino Dantas
DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O
MONOTERPENO BORNEOL E DE UM MÉTODO
PARA PRODUÇÃO DE INFLAMAÇÃO
MUSCULOESQUELÉTICA EM RATOS
Petrolina-PE
2015
11
Trabalho apresentado à Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Petrolina, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências, com ênfase na linha de pesquisa: “Biodiversidade, Tecnologia e Recursos Naturais”. Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida Co-orientador: Prof. Dr. Ferdinando Oliveira Carvalho
MILLA GABRIELA BELARMINO DANTAS
DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O
MONOTERPENO BORNEOL E DE UM MÉTODO PARA
PRODUÇÃO DE INFLAMAÇÃO MUSCULOESQUELÉTICA
EM RATOS
Petrolina-PE
2015
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A Deus, por permitir a realização deste trabalho.
Aos meus Pais Zelia Belarmino Dantas e
Jachson Cardoso Dantas pela dedicação de uma
vida em prol dos meus estudos.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me permitir chegar até aqui com saúde,
preenchendo minha vida durante todos estes anos com sabedoria e discernimento
para trilhar da melhor forma este caminho, e por ser minha fortaleza nos momentos
difíceis.
Agradeço à Universidade Federal do Vale do São Francisco, pelo espaço e
material cedido para minha formação como profissional e mestre.
Ao Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde e Biológicas, e a todos
os Professores pelos conhecimentos compartilhados, contribuindo na minha
formação.
Ao meu orientador, professor Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida
por quem eu tenho uma imensa admiração e respeito pelo pesquisador e pessoa que
é, eu agradeço por ter aceitado me acompanhar e orientar nesta jornada, por toda
dedicação na orientação, conhecimento repassado e paciência nos momentos de
angústia e ansiedade, serei eternamente grata!
Ao meu co-orientador, professor Dr. Ferdinando Oliveira Carvalho, por todo
apoio e incentivo acadêmico, tanto como orientanda como enquanto professora
substituta e colegas de trabalho.
A todos do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME)
por todo apoio, em especial à Juliane Cabral, que antes mesmo da minha entrada no
mestrado já torcia por mim, e foi uma grande inspiração durante toda minha
caminhada.
Ao pessoal do biotério, Leonardo, Gabriela, Helenildo e Jean, que sempre me
receberam muito bem, e que cuidaram dos animais com toda dedicação.
A Silvio Alan, técnico do laboratório de farmacotécnica e colega de mestrado,
que mesmo sempre atarefado, colaborou em toda a parte farmacotécnica do
experimento, desde a produção até os testes com o gel.
À professora Dra. Maria Helena Tavares de Matos, que aceitou colaborar com
este estudo, permitindo-me realizar a preparação histológica em seu laboratório onde
sempre fui muito bem acolhida.
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A todos do grupo de Biotecnologia Aplicada ao Desenvolvimento de Folículos
Ovarianos (BIOFOV) da UNIVASF, por me acolherem sempre de forma gentil em seu
laboratório, em especial a Msc. Vanessa Raquel Pinto de Barros, por toda paciência
e dedicação no preparo das lâminas e companhia nos longos dias de preparo
histológico.
A todos os colegas que de alguma forma contribuíram para a realização deste
estudo: Camila Mahara, Rayana Costa, Reginaldo Nascimento, Luiz Gabriel,
Eduardo Numata, Eveline Menezes, Júnior Benevides, Amanda Mira e Erica
Lavor, agradeço a parceria na realização dos experimentos.
Ao professor Dr. Ricardo Santana de Lima o qual me ensinou a realizar as
análises histológicas.
Ao professor Dr. Humberto de Sousa Fontoura da Universidade Estadual de
Goiás, o qual me acolheu gentilmente em seu laboratório na UEG onde fizemos o
treinamento para desenvolvimento do método de produção de lesão dos animais.
A todos os meus colegas do mestrado, em especial aqueles que durante estes
anos criaram acima de tudo um vínculo de amizade e tornaram essa caminhada ainda
mais agradável.
Aos meus amigos de longa data, pelo apoio e compreensão com minha
ausência nos momentos em que me dediquei inteiramente à pesquisa.
Ao meu amigo, mestre e eterno orientador, Dr. Paulo Adriano Schwingel, que
me acompanha desde o período de iniciação científica na Universidade de
Pernambuco durante minha graduação, e tornou-se além de tudo um amigo, que
acima de tudo, sempre acreditou em mim e me ensinou os primeiros passos da
carreira científica e docente.
Aos meus colegas do trabalho: Natália Soares, Luciano Soares, Ezer Lima e
João Paulo, os quais acompanharam minhas angústias e alegrias de perto.
Aos meus pais, Zelia Belarmino Dantas e Jachson Cardoso Dantas, que
sempre colocaram os estudos como prioridade na minha casa, cuidaram da minha
educação com dedicação e sempre me deixaram livre para que eu pudesse trilhar o
meu destino e ir atrás dos meus sonhos.
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Ao meu irmão Pedro Henrique Belarmino Dantas e toda minha família que me
acompanharam de perto e sempre acreditaram nos meus sonhos e apoiando minhas
decisões.
E por fim, agradeço a cada um dos animais que doaram suas vidas para a
concretização deste estudo.
A todos, o meu muito obrigada!
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Ó Mestre, Fazei que eu procure mais Consolar, que ser consolado;
compreender, que ser compreendido; amar, que ser amado.
Pois é dando que se recebe, é perdoando que se é perdoado,
e é morrendo que se vive para a vida eterna.
- São Francisco de Assis
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RESUMO
O borneol é um monoterpeno que possui efeitos analgésico e anti-inflamatório comprovado em aplicações orais e intraperitoneais, entretanto seus efeitos em administrações tópica e transdérmica ainda são desconhecidos. Para análise de substâncias administradas por tais vias, diferentes métodos de produção de inflamação musculoesquelética são comumente empregados na literatura. Entretanto, a disparidade entre tais métodos podem resultar em lesões com severidade e resposta inflamatória variadas. O presente estudo teve como objetivos: desenvolver um gel na concentração de 5% do monoterpeno borneol (GB5), e avaliar sua estabilidade a partir de testes físico-químicos e análises macroscópicas após oito meses de formulação; e avaliar o efeito de um método para produção de contusão no gastrocnêmio de ratos, a partir de análise morfológica do tecido musculoesquelético, comparando a resposta inflamatória produzida por diferentes impactos. Para a formulação do gel, a proporção de 5% de borneol foi incorporado em gel carbopol. O GB5 desenvolvido foi armazenado em temperatura ambiente por oito meses, após esse período foi submetido a avaliações macroscópicas e testes físico-químicos. O GB5 teve sua estabilidade testada quanto ao seu aspecto, pH, condutividade e viscosidade imediatamente antes e após um teste de congelamento e descongelamento de duração de 12 dias. Os dados obtidos antes e após o teste foram comparados por teste t pareado com p <0,05. Para análise do método de produção de lesão, doze ratas Wistar foram divididas em quatro grupos. A lesão foi gerada por 324 g de ferro liberado de alturas pré-determinadas para cada grupo (30, 45, 60 e 70 cm). Nas análises do GB5, o mesmo permaneceu com características macroscópicas estáveis após oito meses de sua formulação, o pH variou entre 3,95 ± 0,01 e 3,83 ±0,03 e a condutividade entre 186,15 ± 0,35 e 171,3 ± 1,27 mV antes e após 12 dias de ciclo, não apresentando diferença estatística. Da mesma forma, a viscosidade do GB5 manteve-se semelhante, diminuindo de acordo com o aumento da força de cisalhamento empregada. Na análise do tecido musculoesquelético, a resposta à lesão variou conforme a altura da queda da massa sobre o músculo, de forma que apenas o grupo que sofreu impacto a partir de 70 cm respondeu com processo inflamatório uniforme e severo, enquanto que os grupos de 30, 45 e 60 cm apresentaram processo inflamatório em apenas algumas regiões do tecido, com infiltrado entre leve e moderado. Desta forma, pode-se concluir que o GB5 desenvolvido é estável quanto aos aspectos físico-químicos e macroscópicos mesmo após oito meses de preparo, e submetido a variações extremas de temperatura, apresentando valores considerados adequados para o uso sobre a pele, e podendo ser futuramente avaliado quanto aos efeitos analgésico e anti-inflamatório por via tópica ou transdérmica. O método de liberação de 324 g de massa a partir 70 cm de altura sobre o músculo gastrocnêmio de ratos parece ser o mais adequado para a produção de contusão muscular nestes animais, por apresentar após 72 h de lesão um infiltrado inflamatório importante.
Palavras-chave: Géis. Inflamação. Músculo Esquelético. Terpenos.
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ABSTRACT
The borneol is a monoterpene which has analgesic and anti-inflammatory effects demonstrated in oral and intraperitoneal applications. However, its effects on topical and transdermal administration is still unknown. For analyzing substances administered by such routes, different methods for production of inflammation are commonly used in the literature. However, the disparity between these methods may show different severities of injury and levels of inflammatory response. This study aimed to develop a gel with 5% concentration of borneol monoterpene (BG5), and assess its stability from physical-chemical tests and macroscopic analysis after eight months of formulation; and from morphological examination of the musculoskeletal tissue, assessing the effect of a contusion method for production in rat gastrocnemius, comparing inflammatory response produced by different impacts. For the formulation of the gel, 5% borneol was incorporated in carbopol gel. The BG5 developed was stored at room temperature for eight months, after this period underwent macroscopic evaluations and physical-chemical testing. The BG5 had been tested for stability as for their appearance, pH, conductivity and viscosity before and after the 12 days of freezing and thawing test, the data obtained before and after the test were compared by paired t-test with p <0.05 . For analysis of injury production method twelve female Wistar rats were divided into four groups. The lesion was generated by 324 g of was dropped from a different predetermined heights for each group (30, 45, 60 and 70 cm). The findings of BG5, it remained stable with macroscopic characteristics after eight months of its formulation, the pH ranged from 3.95 ± 0.01 and 3.83 ± 0.03 and a conductivity between 186.15 ± 0.35 and 171.3 ± 1.27 mV before and after 12-day cycle, with no significant statistical difference. Similarly, the viscosity of BG5 remained similar, decreasing according to the increase in the shear force employed. In the analysis of musculoskeletal tissue in response to injury varied according to the mass of the drop height on the muscle, so that only the group which was affected from 70 cm responded with uniform and severe inflammation, whereas the groups 30, 45 and 60 cm showed inflammation in a few regions of the tissue infiltrated with mild and moderate. Thus, it can be concluded that the BG5 developed is stable as the physico-chemical and macroscopic aspects even after eight months of preparation, and subjected to extreme temperature variations, with values considered appropriate for use on the skin, and may be further tested for its analgesic and anti-inflammatory effect by topical or transdermal delivery. Furthermore, the method with mass of 324 g that dropped from 70 cm height on the gastrocnemius muscle of rats seems to be the most suitable for the production of muscle injury in these animals for 72 hours after, showing an important inflammatory infiltrate. Key-words: Gels. Inflammation. Skeletal Muscle. Terpenes.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química do borneol. .................................................................... 35
Figura 2. Material utilizado para a preparação do gel carbopol. ................................ 47
Figura 3. Borneol (A) e gel carbol (B). ....................................................................... 48
Figura 4. Preparação do gel com concentração de 5% de borneol. .......................... 48
Figura 5. Demonstração dos animais em seus recintos durante período de adaptação.
.................................................................................................................................. 53
Figura 6. Administração de quetamina e xilazina pela via Intraperitoneal. ................ 54
Figura 7. Mensuração do diâmetro da pata do rato pós-lesão. ................................. 55
Figura 8. Avaliação da circunferência do membro posterior esquerdo com fita métrica
antes da lesão. .......................................................................................................... 55
Figura 9. Distribuição dos animais por grupo para produção de contusão muscular.
.................................................................................................................................. 56
Figura 10. Equipamento para produção de contusão com aberturas a 30,45, 60 e 70
cm de altura. .............................................................................................................. 57
Figura 11. Haste de metal com massa de 324g, utilizada para produção do impacto.
.................................................................................................................................. 58
Figura 12. Animal anestesiado e posicionado para realização do trauma contuso no
MID. ........................................................................................................................... 59
Figura 13. Músculos gastrocnêmio direito e esquerdo dissecados para análise
histológica após 72h de lesão. .................................................................................. 60
Figura 14. Aspecto do GB5 após oito meses de desenvolvimento e testes de
estabilidade. .............................................................................................................. 63
Figura 15. Efeito da velocidade de corte na viscosidade do gel carbopol e do gel
borneol 5% antes e após o ciclo de congelamento e descongelamento. .................. 65
Figura 16. Tecido musculoesquelético do músculo posterior controle, com fibras e
núcleos íntegros, evidenciando aspecto normal do músculo gastrocnêmio; objetiva de
10 X (A e B), coloração: HE. ..................................................................................... 66
Figura 17. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio
lesionado do grupo de 30 cm, com ausência de sinais de processo inflamatório (A) e
discreto aumento do número de células inflamatórias no meio intersticial, denotando
pequenos focos de infiltrado inflamatório (setas) e edema entre as fibras (B), objetiva
10 X. E= edema, coloração: HE. ............................................................................... 67
20
Figura 18. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio
lesionado dos animais do grupo de 45 cm, com focos de infiltração discretos no local
indicado pela seta (A) e um aumento claro da celularidade intersticial com infiltração,
células inflamatórias aderidas as fibras musculares (indicado pelas setas em
diferentes regiões do tecido), e edema entre as fibras (B), objetiva de 10 X. E = Edema,
coloração: HE. ........................................................................................................... 68
Figura 19. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio
lesionado do grupo de 60 cm. Observa-se neste grupo uma lesão variável com regiões
sem resposta inflamatória aparente (A), e regiões com infiltrados perivasculares de
tamanho variado dispersos pelo interstício, podendo ser notado também um aumento
da celularidade intersticial em algumas regiões indicadas por setas (A, B, C, D),
objetiva de 4 X(A) e 10 X(B, C, D, coloração: HE. .................................................... 69
Figura 20. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio
lesionado dos animais do grupo de 70 cm. Neste grupo pode-se observar lesão severa
com distribuição mais ampla e uniforme. Aumento de 4 X (A) evidenciando a presença
do infiltrado em toda região analisada. Intenso infiltrado inflamatório disperso pelo
interstício (seta figura B) e edema indicado pela letra E, (nas figuras B, C e D),
aderência das células inflamatórias às fibras lesadas indicadas por seta na figura D, e
áreas de necrose tecidual (C), coloração: HE. .......................................................... 70
21
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Resultados da avaliação da estabilidade preliminar do gel de borneol 5%
antes e após o teste de congelamento e descongelamento........................................64
22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
® Marca registrada
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FGF Fator de crescimento fibroblástico
g Gramas
GC Gel de carbopol
GCB5 Gel de carbopol com borneol a 5%
HE Hematoxilina eosina
HGF Fator de crescimento de hepatócitos
IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina 1
M Molar
mL Mililitro
NaOH Hidróxido de sódio
ºC Grau Celsius
pH Potencial hidrogênio
rpm Rotações por minuto
TNFα Fator de necrose tumoral alfa
VEGF Fator de crescimento endotélio vascular
μg Micrograma
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 25
2.OBJETIVOS ........................................................................................................... 29
2.1 Objetivo geral ............................................................................................... 30
2.2 Objetivos específicos: .................................................................................. 30
3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................. 31
3.1 Desenvolvimento de formulações para tratamentos tópicos e transdérmicos . 32
3.2 Géis .................................................................................................................. 33
3.3 Carbopol® ........................................................................................................ 34
3.4 Monoterpeno borneol ....................................................................................... 34
3.5 Tecido muscular estriado esquelético .............................................................. 36
3.6 Lesões no tecido muscular estriado esquelético .............................................. 38
3.7 Resposta inflamatória do tecido muscular estriado esquelético à contusão ... 38
3.8 Métodos de produção de lesão muscular em modelos animais ....................... 41
4.PARTE ................................................................................................................... 45
EXPERIMENTAL – I .................................................................................................. 45
4.1 Materiais........................................................................................................... 46
4.2 Preparação da formulação em gel do borneol ................................................. 46
4.3 Estudo de estabilidade do gel de borneol 5% .................................................. 49
4.3.1 Análise macroscópica da formulação ............................................................ 49
4.3.2 Ciclo congelamento e descongelamento....................................................... 49
4.3.3 Teste da centrifugação .................................................................................. 50
4.3.4 Determinação do pH ..................................................................................... 50
4.3.5 Análise de condutividade .............................................................................. 50
4.3.6 Teste de viscosidade .................................................................................... 50
4.4 Análise estatística ............................................................................................ 51
5. PARTE EXPERIMENTAL – II ................................................................................ 52
24
5.1 Animais ............................................................................................................ 53
5.2 Preparo dos animais ........................................................................................ 54
5.3 Divisão dos grupos para produção de lesão .................................................... 56
5.4 Equipamento para lesão muscular ................................................................... 56
5.5 Obtenção da lesão muscular............................................................................ 58
5.6 Análise histológica ........................................................................................... 59
5.7 Análise estatística ........................................................................................ 61
6. RESULTADOS ...................................................................................................... 62
6.1 Características macroscópicas do gel do borneol 5% ...................................... 63
6.2 Avaliação de pH e condutividade ..................................................................... 64
6.3 Medidas da viscosidade ................................................................................... 65
6.4 Análise macroscópica do músculo gastrocnêmio pós contusão ...................... 65
6.5 Análises microscópicas dos músculos gastrocnêmios submetidos à lesão ..... 66
7.DISCUSSÃO .......................................................................................................... 72
8. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 78
9. PERSCPECTIVAS FUTURAS .............................................................................. 80
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 82
APÊNDICE ................................................................................................................ 96
ANEXOS ................................................................................................................ 110
25
1. INTRODUÇÃO
26
1 INTRODUÇÃO
O borneol (C10H18O) é um monoterpeno bicíclico oxigenado presente nos óleos
essenciais de várias plantas e comumente utilizado na medicina tradicional chinesa e
indiana (LU et al., 2011). Este metabólito secundário está presente em mais de 63
produtos à base de plantas medicinais (CHEN et al., 2011), sendo amplamente
utilizado para tratar febre, aftas, acidente vascular encefálico e patologias nos olhos e
ouvidos (HATTORI, 2000; FARMACOPÉIA CHINESA, 2010). Algumas doenças
cerebrovasculares têm seu tratamento baseado no uso do borneol, que além de efeito
sedativo e anticonvulsivo, apresenta efeitos neuroprotetores (LIU et al., 2011).
Quando administrado com outros fármacos, o borneol acelera a distribuição dos
medicamentos no tecido cerebral (CHAI; PAN; LI, 2009), melhora a biodisponibilidade
de drogas, e acelera a passagem dos fármacos na barreira hematoencefálica (CAI et
al., 2008; LU et al., 2012; YUA et al., 2013; ZHANG et al., 2015). A ação do borneol
na potencialização da ação dos compostos no cérebro é superior quando este
composto é administrado por via intravenosa, bem como intranasal (ZHAO et al.,
2012). Do mesmo modo, a administração por via oral e intraperitoneal do borneol em
ratos e camundongos tem comprovado seu efeito como agente antibacteriano,
analgésico e anti-inflamatório, podendo ser utilizado também no tratamento de dor
crônica (CANDAN et al., 2003; ALMEIDA et al., 2013; JIANG et al., 2015), todavia, os
efeitos deste monoterpeno através de administrações tópicas e transdérmicas ainda
não são relatados.
A utilização de medicamentos em formulações para administração tópica como
géis e pomadas, são muitas vezes requeridas para tratamento de diversas lesões
cutâneas e musculares, como queimaduras e eritemas, processos de cicatrização,
além de efeitos analgésico e anti-inflamatório em lesões musculoesqueléticas
(SCHÄFER-KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007; SILVA et al., 2010; KUEHL,
2010; LIONBERGER; BRENNAN, 2010). O uso de fármacos que possibilitam a
administração por via cutânea, seja com aplicação direta ou com auxílio de técnicas
que aceleram a permeação dos mesmos, como a fonoforese e a iontoforese (MARRO
et al., 2002), e que atuem no processo álgico e inflamatório, especialmente na lesão
musculoesquelética, tem crescido consideravelmente, e diversos estudos avaliam o
efeito de géis, pomadas e extratos de plantas no tratamento agudo destas lesões
(YANG et al., 2005; ALFREDO et al., 2008; ABREU et al., 2013; PARK et al., 2014).
27
Isto se dá porque dentre as lesões sofridas por atletas profissionais, as lesões
musculares apresentam ampla incidência, representando aproximadamente 30% das
lesões sofridas nos desportos (JUNGE et al., 2006; EKSTRAND, HÄGGLUND,
WALDÉN, 2011). Tais lesões são, na sua maioria, decorrentes de traumas mecânicos
(JARVINEN et al., 2007) e podem ocorrer por ruptura, onde a fibra muscular e a fáscia
são afetadas, ou lesões onde apenas as fibras musculares e miofibrilas são
danificadas, não afetando os tecidos conjuntivos basais de forma significativa. As
lesões geradas por cargas em cisalhamento são as mais frequentes, sendo elas as
contusões, distensões ou lacerações, e vão variar de acordo com o mecanismo de
lesão, ocorrendo com mais frequência nos membros inferiores (ASTUR et al., 2014;
BRATLAND-SANDA; SUNDGOT-BORGEN; MYKLEBUST, 2015).
A contusão representa aproximadamente 90% das lesões musculares nos
esportes (JARVINEN et al., 2000), e ocorre quando um músculo é ferido por uma força
de compressão significativa gerando impacto de alta energia, que rapidamente
comprime tecidos locais, como um golpe direto, sendo este um mecanismo comum
em esportes de contato (JARVIEN et al., 2007; SMITH et al., 2008; KHATTAK et al.,
2010). A fim de replicar as lesões musculoesqueléticas resultantes de trauma,
principalmente para em seguida testar o efeito de algum fármaco, alguns modelos de
produção de lesão em animais são propostos na literatura, entretanto, a severidade
da lesão gerada por estes dispositivos pode variar em cada estudo devido aos
mecanismos utilizados para a produção do trauma (SOUZA; GOTTFRIED, 2013).
Os modelos de produção de lesão buscam simular o mecanismo que ocorre na
prática, principalmente nos esportes de contato (MCBRIER et al., 2009). Alguns
modelos utilizando a queda de uma massa sobre o músculo de animais já têm sido
relatados na literatura, nos quais uma massa específica desliza até contatar
diretamente o músculo do animal, sendo normalmente o gastrocnêmio o músculo mais
utilizado para estas avaliações (CRISCO et al., 1994, 1996; AMBROSIO et al., 2010;
PUNTEL et al., 2011; ABREU et al., 2013).
Esta técnica replica o mecanismo de lesão original, comumente observada na
prática clínica, e tem sido utilizada em estudos que avaliam a lesão inflamatória aguda
e em ensaios que testam medicamentos e tratamentos neste tipo de lesão (WILKIN et
al., 2004; MCBRIER et al., 2007; SILVEIRA et al., 2010; SHU et al., 2012), entretanto,
não há ainda na literatura um consenso sobre o mecanismo de lesão, fazendo com
que os estudos apresentem uma relativa discrepância em relação às cargas utilizadas
28
e às alturas de queda da massa sobre o membro, consequentemente, a resposta
inflamatória desenvolvida nos animais varia de acordo com a força do impacto gerada
sobre a musculatura (SOUZA; GOTTFRIED, 2013).
Desta forma, considerando a importância da aplicação de métodos fidedignos
que garantam a avaliação do efeito de tratamentos anti-inflamatórios à base de gel, o
presente estudo buscou, por meio de uma abordagem interdisciplinar, desenvolver a
formulação de gel do borneol, avaliando sua estabilidade e propriedades físico-
químicas, para em estudos futuros testá-lo pela via tópica ou transdérmica em lesão
musculoesquelética aqui também estudadas. E avaliar através de análise morfológica
do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio de ratos, um modelo experimental de
produção de contusão muscular que seja adequado para o desencadeamento do
processo de inflamação musculoesquelética em ratos.
29
2.OBJETIVOS
30
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Desenvolver um gel contendo o monoterpeno oxigenado (borneol) e avaliar sua
estabilidade, propriedades macroscópicas e físico-químicas; e estudar métodos de
produção de lesão musculoesquelética em ratos a partir de análise morfológica do
músculo gastrocnêmio após 72 h de lesão instalada.
2.2 Objetivos específicos:
- Desenvolver um gel com concentração de 5% do monoterpeno borneol (GB5).
- Descrever as características do GB5 através de análise macroscópica.
- Avaliar as propriedades físico-químicas do GB5: pH, condutividade e viscosidade
antes e após ciclo de congelamento e descongelamento de 12 dias.
- Avaliar macroscopicamente o processo inflamatório agudo no membro posterior
direito após trauma contuso.
- Comparar e descrever as variáveis histopatológicas do músculo gastrocnêmio
72 h após a produção de contusão muscular, produzida por diferentes alturas de
queda de massa (30, 45, 60 e 70 cm).
- Contribuir com o estudo do borneol na literatura.
- Desenvolver método para produção de contusão muscular em ratos, baseado na
resposta inflamatória aguda.
- Contribuir para os estudos de contusão muscular e tratamento muscular na
farmacologia e fisioterapia.
31
3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
32
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Desenvolvimento de formulações para tratamentos tópicos e transdérmicos
A administração de fármacos por via tópica e transdérmica são métodos atrativos
para tratamentos locais e sistêmicos comumente utilizada de forma eficaz no
tratamento de doenças dermatológicas e em processos inflamatórios que afetam o
tecido musculoesquelético (GLAVAS-DODOV et al., 2003; MITKARIA et al., 2010;
KAUR; GULERI, 2013). Quando administradas sobre a pele, as drogas podem
apresentar uma melhor absorção local, sendo essa uma vantagem em comparação a
tratamentos convencionais por via oral (GLAVAS-DODOV et al., 2003; RUPAL et al.,
2010).
A administração tópica contorna o metabolismo de primeira passagem, evita a
irritação do trato gastrointestinal, os riscos da terapia intravenosa e os riscos
associados às condições variadas de absorção, como mudanças de pH, presença de
enzimas e tempo de esvaziamento gástrico. Além disso, a biodisponibilidade do
fármaco é aumentada, facilitando sua atuação diretamente no local de ação
(SHARMA; PAWAR; JAIN, 2012; BHASHA et al., 2013).
Uma grande variedade de formas de dosagem farmacêutica pode ser utilizada
no sistema de entrega das drogas tópicas, dentre elas, os géis, cremes e pomadas
são os mais utilizados, seguidos de sprays e preparações líquidas (GISBY; BRYANT,
2000; VERMA et al., 2013). A utilização de gel como meio de entrega na administração
tópica pode aumentar o tempo de resistência da droga na pele, melhorar o
fornecimento e liberação da substância e aumentar o tempo de permanência no local
da aplicação (KARADZOVSKA et al., 2013). Entretanto, vários fatores do fármaco e
da pele podem afetar a absorção, como a espessura, temperatura, grau de hidratação
e limpeza da pele, concentração de lipídios, número de folículos pilosos, função das
glândulas sudoríparas, raça, pH na superfície da pele e integridade do estrato córneo
(WOKOVICH et al., 2006).
Com isso, além da busca por formulações de uso tópico, as formulações
transdérmicas são desenvolvidas como estratégia para o transporte de diversas
classes de fármacos, tanto hidrofílicos quanto lipofílicos, representando uma
33
alternativa para superar aspectos relacionados às características farmacocinéticas e
farmacodinâmicas de diversos medicamentos quando utilizados por outras vias, e
estimulando a penetração do fármaco sobre o tecido (TEICHMANN et al., 2007;
BADRAN et al., 2009).
3.2 Géis
Os géis são sistemas em estado intermediário de matéria possuindo
propriedades sólidas e líquidas, sendo portanto, semissólidos compostos por
partículas inorgânicas ou macromoléculas orgânicas, principalmente polímeros,
naturais ou sintéticos, que formam uma matriz tridimensional ao longo de um meio de
dispersão líquido ou hidrofílico (ALVAREZ-LORENZO; CONCHEIRO, 2001;
ROYCHOWDHURY et al., 2012). A rigidez do gel é dada pela rede formada pelo
entrelaçamento das partículas do agente de gelificação, e a natureza destas partículas
determina a estrutura e propriedades do gel (UCHE, 2013).
Para a formulação de um gel alguns polímeros podem ser utilizados, entre eles
as gomas naturais, materiais sintéticos e semissintéticos, e os carpobol®, sendo
preparados por fusão ou por procedimento especial que pode ser requerido pelas
características de geleificação do gelante (LACHMAN et al., 2001). A viscosidade da
formulação é dada por essas substâncias, sendo o carbopol o polímero mais utilizado.
Os géis são considerados veículos adequados para a administração tópica de
fármacos por não serem pegajosos, não demandar muita energia durante a
formulação, serem estáveis e apresentar valor estético (NORRIS, 2005).
Os géis podem ser classificados em hidrofóbicos ou hidrofílicos. Os géis
hidrofóbicos normalmente possuem bases constituídas de parafina líquida como
polietileno e são também chamados de oleogéis. Já os géis hidrofílicos,
(hidrossolúveis ou hidrogéis) são constituídos em sua base de água, propilenoglicol
ou glicerol. Estes, por sua vez, são mais utilizados em produtos cosméticos e
dermatológicos por não serem gordurosos, apresentarem um bom espalhamento e
veicularem ativos hidrossolúveis (GENNARO, 2004).
34
3.3 Carbopol®
O Carbopol® é formado por ácido acrílico de alto peso molecular (variação de 2
a 30 x 106) com ligação cruzada e fornecido como ácido livre. É comumente utilizado
em formulações farmacêuticas líquidas ou semissólidas como géis, suspensões e
emulsões, sendo empregado na fase aquosa dos géis (BONACUINA; MARTELLI;
PALMIERI, 2004; CORREA et. al., 2005). O Carbopol® 940 apresenta o maior efeito
espessante dentre as resinas de Carbopol®, sendo o mais utilizado para produzir géis
cristalinos e brilhantes. Também vantajoso em comparação com os demais géis, por
apresentar um bom comportamento reológico, e permanecem por um período de
tempo maior no local administrado (MERCLIN et al., 2004).
O Carbopol® é normalmente estável quando exposto a variações extremas de
temperatura, e apresenta máxima transparência e viscosidade com o pH 7, embora a
faixa de pH 4 a 5,5 também seja considerada adequada para tais características
(ISLAM et al., 2004; FERREIRA, 2008). Além disso, os géis de carbômeros possuem
bom comportamento de fluidez, compatibilidade com muitos excipientes e ativos,
características organolépticas consideradas excelentes e alta viscosidade com baixa
concentração, por isso, tais géis apresentam uma ampla aplicação na área
dermatológica e farmacêutica (ISLAM et al., 2004; BONACUINA; MARTELLI;
PALMIERI, 2004).
3.4 Monoterpeno borneol
Os terpenos ou terpenoides são metabólitos secundários e formam uma
diversificada classe de produtos naturais, podendo ser isolados a partir de uma
variedade de organismos. Algumas aplicações médicas e atividades biológicas são
atribuídas a muitos destes produtos (CHERNEVA et al., 2012). Dentre a diversificada
classe de metabólitos secundários, os monoterpenos são componentes primários de
óleos essenciais e representam um grupo de terpenos e compostos orgânicos cuja
estrutura básica consiste em duas unidades de ligações de isopreno que são
formados por uma base 5-carbono (C5) cada (BAKKALI et al., 2008).
Muitas ervas medicinais têm seus efeitos associados à presença dos
monoterpenos (ABU-DARWISH et al., 2015; CALDAS et al., 2015, THAN et al., 2015),
35
e algumas propriedades farmacológicas destes produtos, como efeito antioxidante,
analgésico e cardiovascular, já são relatadas na literatura (SANTOS et al., 2011;
GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS JÚNIOR, 2013).
O borneol (C10H18O) (Figura 1) é um álcool monoterpenoide bicíclico presente
nos óleos essenciais de numerosas plantas medicinais e tem sido utilizado na
medicina tradicional chinesa e indiana (LU et al., 2011), além de ser utilizado na
indústria de alimentos, especiarias aromáticas e preparo de materiais químicos.
Segundo a farmacopeia da China (2010), o borneol é um componente importante
presente em mais de 63 produtos à base de plantas medicinais (CHEN et al., 2011),
além disso, é aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) como um seguro
aromatizador de alimentos (SHEN et al., 2011).
Figura 1. Estrutura química do borneol.
Fonte: CHERNEVA et al., 2012.
O borneol é caracterizado por possui sabor amargo, propriedade de
arrefecimento e ser pungente, e está presente nos óleos essenciais de muitas plantas
medicinais sendo comumente prescrito pela medicina tradicional chinesa para
doenças do coração, baço e pulmão. Também é amplamente utilizado para tratar
doenças febris, aftas, acidente vascular encefálico, doenças dos olhos, dores de
garganta e problemas de ouvido (FARMACOPÉIA CHINESA, 2010), além de ser
utilizado na anestesia e analgesia na medicina tradicional chinesa e japonesa (LIN et
al., 2006; JIANG et al., 2015).
É estimado que de 10 a 100 toneladas métricas de borneol são utilizadas por
ano, além do uso na medicina, o borneol também tem sido utilizado em cosméticos
36
decorativos, perfumes finos, xampus, sabonetes, e outros produtos de higiene
pessoal, devido à sua fragrância, bem como em produtos não-cosméticos como
detergentes e produtos de limpeza (BHATIA; LETIZIA; API, 2008).
Até meados da década de 50 o borneol natural era comumente importado na
China para utilização na medicina tradicional chinesa. Depois de 1949, devido a uma
escassez de recursos e o alto preço do borneol natural, o mesmo começou a ser
gradualmente substituído pelo borneol sintético (XIAO-FEI et al., 2008).
Com isso, duas formas de borneol podem ser encontradas: o borneol sintético e
o borneol natural. O borneol sintético (BS) consiste em d-borneol e isoborneol,
enquanto o borneol natural apenas d-borneol. O borneol natural é considerado seguro
para consumo, pois não inibe a medula óssea nem induz micronúcleos de glóbulos
vermelhos. Desta forma, em preparações da medicina chinesa é recomendada a
utilização do borneol natural como fonte segura (HU; JIANG; LING, 2006).
O isoborneol, presente no borneol sintético estimula atividade mucosa e
hepatotoxicidade (LU et al.,2011), enquanto estudos provam que o borneol natural (d-
borneol) pode melhorar a biodisponibilidade oral de algumas drogas por modular a
permeabilidade da mucosa intestinal e acelera a distribuição de medicamentos no
tecido cerebral pelo aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica e
melhorar a biodisponibilidade de drogas neste tecido (ZHOU et al., 2010; LU et al.,
2012; YUA et al., 2013 ZHANG et al., 2015).
O borneol tanto natural quanto sintético também tem ação antibacteriana,
analgésica e anti-inflamatória comprovada em aplicações orais e intraperitoneais em
ratos e camundongos, podendo ser utilizado também no tratamento de dor crônica
(CANDAN et al., 2003; ALMEIDA et al., 2013; JIANG et al., 2015), entretanto, ainda
não há relatos na literatura do efeito anti-inflamatório do borneol sobre tecido
musculoesquelético, assim como seu efeito em aplicações tópicas.
3.5 Tecido muscular estriado esquelético
O tecido musculoesquelético é versátil, heterogêneo e complexo, formado por
células multinucleadas que se originam da fusão de mioblastos e organizam-se em
feixes de aspecto cilíndrico e alongado com até 30 cm, e estriações transversais. As
células deste tecido são as chamadas fibras musculares, as quais apresentam
37
características específicas, de modo que os componentes destas células recebem
nomes diferentes das demais células do corpo. Desta forma, o citoplasma é chamado
de sarcoplasma, o retículo endoplasmático de retículo sarcoplasmático e a membrana
citoplasmática de sarcolema. Tais células apresentam mionúcleos localizados na
região periférica da fibra em contato com o sarcolema (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
2013).
As fibras musculares são constituídas morfologicamente pelo conjunto de
sarcômeros, que são as unidades contráteis do músculo (KAWIAK et al., 2006). Cada
sarcômero é formado por várias proteínas, das quais se destacam as proteínas
contráteis miosina e actina. O conjunto de sarcômeros forma uma fibra muscular, a
qual é revestida por uma camada de tecido conjuntivo chamado endomísio. O
conjunto de fibras forma o feixe muscular, ou fascículo, o qual é agrupado e revestido
por uma outra camada de tecido conjuntivo chamada perimísio e o grupo de fascículos
são mantidos unidos com seus vasos sanguíneos e tecido nervoso por uma terceira
camada de tecido conjuntivo denominada epimísio. Finalmente, o conjunto de
fascículos forma o músculo que é então revestido pela fáscia muscular (BERNE et al.,
2004).
A fáscia é um tecido conjuntivo denso e resistente que recobre todo o músculo
e estende-se até o osso, formando o tendão, cuja função é fixar o músculo ao osso,
de forma que a força exercida pela contração da fibra muscular e seus sarcômeros
seja transmitida para a articulação e o movimento seja gerado. Esta disposição dos
tecidos conjuntivos que revestem desde a fibra muscular até o conjunto de músculos,
mantêm a organização estrutural do músculo e permite que as forças produzidas por
ele sejam transmitidas para outras estruturas, como os tendões e ligamentos, além de
influenciar na distribuição de vasos sanguíneos e linfáticos (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2013).
As fibras musculares que compõem o tecido musculoesquelético são
consideradas células estáveis, por serem resistentes à morte. Tal fato normalmente
está associado à presença de lesões musculares, as quais podem ocorrer a partir do
exercício físico, estímulos tóxicos, doenças degenerativas e/ou genéticas ou lesões
mecânicas (FRANCO et al., 2015). Por ser um dos tecidos mais abundantes no corpo
humano, o tecido musculoesquelético é constantemente exposto a vários tipos de
lesão (ASTUR et al., 2014).
38
3.6 Lesões no tecido muscular estriado esquelético
Os atletas de desporto, principalmente aqueles envolvidos em esportes de
contato como nas artes marciais, futebol, handebol, entre outros, estão comumente
expostos ao risco de lesões. As lesões musculares representam aproximadamente
30% das lesões sofridas nos desportos (JUNGE et al., 2006; EKSTRAND,
HÄGGLUND, WALDÉN, 2011). Normalmente tais lesões são ocasionadas por
traumas mecânicos, os quais podem ser classificados como contusão, distensão ou
laceração (JARVINEN et al., 2007). Destas, as contusões musculares são
responsáveis por aproximadamente 90% das lesões musculares nos esportes,
(JARVINEN et al., 2000), sendo o tipo de lesão mais comum em atletas de artes
marciais mistas (MMA) (RAINEY, 2009). Tais lesões muitas vezes impossibilitam que
o sujeito lesado participe de treinos ou competições, podendo desta forma
comprometer o desempenho do atleta (JUNGE et al., 2006).
As lesões mecânicas envolvem normalmente a interrupção do tecido conjuntivo,
podendo levar à necrose da fibra muscular, presença de hematomas e inflamação
(JARVINEN et al., 2007; QUINTERO et al., 2009). Após uma lesão mecânica, o
processo de reparação do tecido lesionado é semelhante na maioria dos casos, de
forma que o tecido musculoesquelético se recupera em um processo sequencial,
exibindo eventos celulares e moleculares característicos e já bem descritos na
literatura (MEHALLO et al., 2006; QUINTERO et al., 2009; FILIPPIN et al., 2011;
CAROSIO et al., 2011). Tais eventos são conhecidos no processo inflamatório típico
e o tratamento para estas lesões está mais associado à gravidade da lesão do que ao
tipo de lesão sofrida (JARVINEN et al., 2005).
3.7 Resposta inflamatória do tecido muscular estriado esquelético à contusão
O músculo esquelético quando lesionado apresenta uma série de processos
que estão interligados e são considerados tempo-dependentes, tais processos são
divididos em três fases: degeneração, reparação e remodelação (MEHALLO et al.,
2006; JARVINEN et al., 2007; FILIPPIN et al., 2009). A inflamação do músculo
acompanha o processo de recuperação do tecido lesado evoluindo até garantir uma
regeneração ideal para o retorno da função (JARVINEN et al., 2000). Entretanto,
quando esta resposta ocorre de forma exacerbada, a regeneração muscular pode ser
39
prejudicada, dificultando a recuperação funcional do músculo (TIDBALL; VILLALTA,
2010).
A fase degenerativa inicia-se com a ruptura do sarcolema, quando alguma força
excessiva provoca a ruptura muscular e necrose das miofibrilas. O rompimento
provoca o aumento nos níveis séricos de proteínas musculares dependentes de
cálcio, o influxo de cálcio extracelular e ativação de fosfolipases (KAWIAK et al., 2006;
GREFTE et al., 2007; QUINTERO et al., 2009). A proteína creatina quinase (CK), que
normalmente é restrita ao citosol da fibra muscular, sinaliza a presença de inflamação
por ser normalmente encontrada após estresse mecânico ou doenças degenerativas
em amostras de sangue de humanos e modelos animais (BRANCACCIO; MAFFULI;
LIMONGELLI, 2007; SARI et al., 2008).
A lesão no tecido musculoesquelético inicia-se com a destruição da ferida do
músculo, através do rompimento do sarcolema, influxo de cálcio extracelular e
ativação das proteases e fosfolipases dependentes de cálcio, que em última análise
induz a necrose cálcio-dependente, sua degeneração e danos às miofibrilas. Também
leva à ruptura dos vasos sanguíneos, e células inflamatórias simultaneamente
acessam o sítio da lesão. Nas fibras lesionadas, a resposta inflamatória é ampliada
pela liberação hormonal de células satélites e miofibrilas necrosadas (BUTTERFIELD;
HERZOG, 2006; GREFTE et al., 2007).
As primeiras células imunológicas a chegar são os neutrófilos, seguidos dos
macrófagos, sendo ambos os responsáveis pela resposta inflamatória no local da
lesão muscular (BRICKSON et al., 2001; CHARGE; RUDNICKI, 2004; TIDBALL,
2005). Do mesmo modo, os linfócitos T e as citocinas são responsáveis por regular a
reparação e fibrose muscular (DUMKE; LEES, 2011; MANN et al., 2011). As células
inflamatórias circulares são atraídas pelos sinais quimiotáticos produzidos e liberados
pelos macrófagos, como as citocinas, fator de crescimento e outros (JARVINEN et al.,
2005)
Um grande número de fatores de crescimento e citocinas são expressos na lesão
musculoesquelética, como o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de
crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1)
e o fator de crescimento endotélio vascular (VEGF). O fator de necrose tumoral alfa
(TNFα) também participa da reparação do músculo esquelético lesionado, e sua
inativação pode resultar em perda de força do músculo que está em recuperação
(TURNER; BADYLAK, 2011).
40
Na fase aguda da lesão musculoesquelética, os neutrófilos são os
polimoformonucleares mais abundantes no local da lesão, os quais são
posteriormente substituídos por monócitos que se transformam em macrófagos
engajados na proteólise e fagocitose do material. Os neutrófilos, através da liberação
de citocinas pró-inflamatórias, destroem o tecido danificado por fagocitose (SMITH et
al., 2008), liberando células citotóxicas que geram substâncias reativas de oxigênio,
as quais destroem o tecido necrótico. Entretanto, tais substâncias podem exacerbar o
processo inflamatório e gerar danos às miofibrilas saudáveis (BRICKSON et al., 2001;
TOUMI; BEST, 2003; BUTTERFIELD et al., 2006; TOUMI;GUYER; BEST, 2006).
Os macrófagos aparecem normalmente dois dias após a lesão, sendo
provenientes dos capilares localizados no tecido muscular em torno da lesão e do
epimísio e perimísio. Este período coincide com a diminuição do número de
neutrófilos, a qual ocorre rapidamente até cinco dias após a lesão (SHEN et al., 2008;
CHAZAUD et al., 2009).
A fase de reparo e remodelamento inicia-se alguns dias após a lesão, com a
diminuição da fase degenerativa. Esta nova etapa envolve o processo de regeneração
das fibras musculares lesadas, angiogênese e a formação de uma cicatriz do tecido
fibroso que são um pré-requisito ideal para a recuperação da função contrátil do
músculo (JARVINEN et al., 2005; WANG et al., 2009; CAROSIO et al., 2011).
As células satélites ativadas em resposta ao trauma são encontradas sob a
lâmina basal de cada fibra muscular e garantem às miofibrilas a capacidade
regenerativa. Essas células quando ativadas, proliferam-se e diferenciam-se em
fibroblastos que se fundem às células satélites vizinhas ou às fibras musculares
remanescentes da lesão para gerar novas fibras musculares (CICILIOT;
SCHIAFFINO, 2010; JARVINEN et al., 2005). Os fibroblastos secretam proteínas
importantes para a reparação do tecido musculoesquelético, incluindo os colágenos
de tipo I e II, fibronectina, elastina, proteoglicanos, lamina e fatores de crescimento
(MANN et al., 2011; LI et al., 2013).
No entanto, a proliferação excessiva de matriz extracelular e a ativação dos
fibroblastos podem levar ao desenvolvimento de fibrose muscular, acarretando em
recuperação incompleta das células e alterando as características mecânicas do
músculo, como elasticidade e força (KAARIAINEN et al., 2000; WANG et al., 2009). A
fibrose é caracterizada pelo acúmulo de matrizes extracelulares e colágeno e embora
41
sua origem não seja bem compreendida, é normalmente induzida por lesões crônicas
dos tecidos conjuntivos que envolvem os músculos (UEZUMI et al., 2011).
As fases degenerativa e regenerativa são semelhantes em diferentes tipos de
músculos lesados, entretanto, a amplitude cinética de cada uma pode variar de acordo
com o músculo lesionado ou do modelo animal utilizado. Para compreender melhor
cada etapa do processo inflamatório e criar mecanismos de intervenção na ação
inflamatória, sejam farmacológicos ou fisioterapêuticos, modelos animais com
produção de inflamação no tecido musculoesquelético têm sidos propostos na
literatura (CHARGE; RUDNICK, 2004).
3.8 Métodos de produção de lesão muscular em modelos animais
Considerando a elevada prevalência de lesões musculoesqueléticas entre
atletas e população em geral, alguns pesquisadores da área médica, buscam meios
de facilitar o tratamento dos indivíduos, reduzir o período do processo inflamatório, e
evitar as possíveis complicações decorrentes de um processo inflamatório
demasiadamente prolongado.
As contusões musculares ocorrem quando o tecido é exposto a uma força de
compressão rápida e forte (JARVINEN et al., 2007) e são os tipos mais comuns de
lesões que acometem o tecido musculoesquelético (SMITH et al., 2008; KHATTAK et
al., 2010), levando à formação de hematoma dentro do músculo (KARY, 2010),
gerando dor ao repouso, dor ao movimento, e restrição da amplitude de movimento,
podendo estes sintomas se apresentarem de forma isolada ou concomitante
(JARVINEN et al., 2005).
Visando o breve retorno funcional da musculatura lesionada, métodos como
massagem de ar comprimido, aplicação de medicamentos anti-inflamatórios por via
oral ou tópica e aplicação de ultrassom terapêutico para acelerar a entrada dos
fármacos no local de ação a partir do método da fonoforese têm sido investigados na
literatura (DEANE; GREGORY; MARS, 2013; ABREU et al., 2013, GARG;
CORONAAN; WALTERS, 2015). Entretanto, para que a resposta dos métodos seja
avaliada de forma fidedigna, é necessária uma análise morfológica do tecido lesionado
e a resposta deste ao método testado. Para isso, seria preciso a realização de biópsia
muscular nos sujeitos, todavia, este método não é muito aceitável entre os atletas já
42
lesionados, e seria contra o princípios éticos gerar lesão em sujeitos saudáveis a fim
de comprovar o efeito de tais técnicas.
Com isso, diversos modelos experimentais de produção de lesão
musculoesquelética mecânica têm sido propostos na literatura, entre eles, os modelos
com aplicação de contusão muscular são os mais relatados, onde uma determinada
massa é solta sobre determinada altura no músculo que se pretende avaliar (CRISCO
et al., 1996; MINAMOTO; GRAZZIANO; SALVINI, 1999; MCBRIER et al., 2009;
PUNTEL et al., 2011). Para isso, alguns estudos utilizam coelhos, cobaias, macacos
e ratos, entre outros modelos experimentais. Os experimentos com os ratos são os
mais relatados na literatura, e o músculo mais avaliado tem sido o músculo
gastrocnêmio (CRISCO et al., 1996; KAMI; SENBA, 2002; WILKIN et al., 2004;
MARKERT et al., 2005; MCBRIER et al., 2007, 2009; SILVEIRA et al., 2010; PUNTEL
et al., 2011; FILIPPIN et al., 2011), pois a maioria das contusões em humanos ocorrem
na parte posterior da perna (JARVINEN et al., 2005; KARY, 2010). Além disso, a
predileção por este músculo pode ser justificada por se tratar de um músculo
superficial e que contêm dois tipos de fibras musculares (WANG; KERNELL, 2000),
uma vantagem em relação a outros modelos utilizados que apresentam uma
predominância de apenas um tipo de fibra muscular, como os músculos sóleo, tibial
anterior e extensor longo dos dedos (WANG; KERNELL, 2000; OTA et al., 2011;).
Os estudos que realizam modelos de contusão muscular em animais buscam
compreender as respostas histológicas deste tecido quando exposto a lesões em
humanos. A avaliação qualitativa ou quantitativa do efeito de medicamentos anti-
inflamatórios ou modalidades de intervenções da fisioterapia, necessita de estudos
comparativos que forneçam um modelo de lesão que seja reprodutível, estabeleça as
mudanças que ocorrem na morfologia associada à lesão, em um determinado
momento durante a recuperação do tecido, e quantifique tais alterações de maneira
que seja possível uma comparação entre diferentes tratamentos.
A avaliação de possíveis métodos de tratamento para lesões, ou métodos
facilitadores do processo de regeneração muscular são as principais causas para a
aplicação dos modelos de produção de lesão musculoesquelética, entre essas
causas, a avaliação do efeito do ultrassom (WILKIN et al., 2004; MCBRIER et al.,
2007; SILVEIRA et al., 2010; SHU et al., 2012), exercício (AMBROSIO et al., 2010;
KHATTAK et al., 2010), frio (PUNTEL et al., 2011; TAKAGI et al., 2011), laser terapia
(RIZZI et al., 2006; LUO et al., 2012) e medicamentos anti-inflamatórios seja por via
43
oral ou com associação ao ultrassom. Estes modelos também são aplicados para
avaliação do processo de regeneração e influência de fatores de crescimento sobre o
músculo lesado (ZIMOWSKA et al., 2009; FAN et al., 2013; LI et al., 2013;).
Na maioria dos estudos, a análise microscópica do tecido lesionado revela a
destruição das miofibrilas e necrose com ruptura da membrana basal, além disso há
hemorragia e presença de células inflamatórias como os neutrófilos e macrófagos,
caracterizando um processo inflamatório típico de fibra muscular (MINAMOTO;
GRAZZIANO; SALVINI, 1999; MINAMOTO; BRUNHO; SALVINI, 2001, WILKIN et al.,
2004; NOZAKI et al., 2008).
Para chegar a essas análises, a maioria dos estudos utiliza um modelo de
contusão por impacto direto, sem penetração na pele. A lesão nestes casos é
provocada pela queda de uma massa metálica através de um tubo guia, e a massa é
liberada de uma altura previamente estabelecida sobre a região do ventre muscular a
ser ferido (CRISCO et al., 1994; 1996; MINAMOTO; GRAZZIANO; SALVINI, 1999;
AMBROSIO et al., 2010; PUNTEL et al., 2011). Outros estudos porém utilizam o
esmagamento do músculo como modelo, entretanto este método é mais invasivo, pois
o ventre muscular é exposto através de técnica cirúrgica e posteriormente lesionado
com esmagamento de suas fibras (GHALY; MARSH, 2010; TAKAGI et al., 2011;
WINKLER et al., 2011). Entretanto, esse modelo não é compatível com a contusão
que ocorre entre os seres humanos, pois na maioria das vezes a contusão é gerada
por uma força compressiva súbita, sem que haja penetração no ventre muscular
(JARVINEN et al., 2005).
Alguns estudos a fim de definir um protocolo para produção de contusão
muscular que seja aplicável e permita a comparação entre diferentes tratamentos já
têm sido relatados na literatura, entre eles, um dos fatores analisados é a frequência
em que o músculo é exposto à lesão (MINAMOTO;GRAZZIANO; SALVINI, 1999), bem
como outros fatores relacionados ao modelo de lesão, como a intensidade da lesão,
a qual pode variar com mudanças no peso da massa derrubada sobre o músculo, bem
como a altura em que esta é liberada (MCBRIER et al., 2009).
No entanto, esses estudos ainda usam diferentes massas e diferentes alturas de
queda, gerando consequentemente impactos de energia cinética variada, de forma
que os tecidos analisados nestes estudos oferecem respostas distintas por se
tratarem de lesões de diferentes gravidades (RIZZI et al., 2006; FILIPPIN et al., 2011).
Mesmo em estudos que analisam a mesma espécie de animal e o mesmo músculo,
44
as variações metodológicas encontradas quanto ao alcance e impacto produzido
sobre a musculatura são consideráveis, podendo chegar até ao dobro (SOUZA;
GOTTFRIED, 2013).
45
4.PARTE EXPERIMENTAL – I
46
4 PARTE EXPERIMENTAL I
4.1 Materiais
O borneol foi adquirido pela de Sigma-Aldrich®, enquanto que os demais materiais,
Carbopol 940, EDTA, metilparabeno e trietanolamina, foram adquiridos a partir da Via
Farma®.
4.2 Preparação da formulação em gel do borneol
O gel de base e o gel borneol foram desenvolvidos no laboratório de
farmacotécnica da UNIVASF, no qual foram utilizados 10 g de carbopol® 940 na
proporção de 1%, 70 g de propilenoglicol na proporção de 7%, 1 g de
metilparabeno/nipagin na porção de 0,1%, 1 g de EDTA (0,1%) e 918 mL de água
deionizada qsp para 1 g na proporção de 91,8% (Figura 2).
O propilenoglicol (PPG) (umectante) é um álcool diol de fluido viscoso, incolor,
higroscópico e inodoro, presente em uma grande quantidade de produtos que entram
em contato com a pele humana, tais como medicamentos de aplicação tópica,
dermatológica, cosméticos e material de limpeza e apresenta atividade
antimicrobiana, atuando na prevenção contra contaminações microbiológicas de
formulações cosméticas. Além disso, atua na solubilização e dispersão de diversos
ingredientes tais como ativos, extratos vegetais, proteínas, vitaminas, aminoácidos,
colágenos, conservantes, filtros solares, essências, corantes, pigmentos, entre outros
(GOTTSCHALCK; MCEWEN, 2004).
O metilparabeno é um agente antimicrobiano utilizado como conservante em
cosméticos e também conhecido pela marca Nipagin®. É um éster derivado do ácido
p-hidroxibenzoico pertencendo à classe dos parabenos e apresenta um amplo
espectro de ação antimicrobiana, sendo efetivo contra bactérias gram-positivas, gram-
negativas, leveduras e fungos. Além disso, apresenta baixa toxidez. O metilparabeno
possui uma boa solubilidade em etanol e propilenoglicol, entretanto é pouco solúvel
em água, tendo sua solubilidade aumentada com o aumento da temperatura
(GOTTSCHALCK; MCEWEN, 2004).
Inicialmente foi feita a pesagem dos componentes com auxílio de uma balança
analítica. Em seguida foi realizada a mistura do carbopol na água, adicionando nipagin
e o propilenoglicol. Essa mistura permaneceu em repouso por 24 horas, tendo em
47
seguida seus componentes mixados até a obtenção do aspecto de gel. Para isso, foi
utilizada a agitação das partículas por meio do ultrassom e aquecimento com chapa
quente.
No segundo dia após a mixagem e obtenção do aspecto de gel, a correção do
pH do gel foi conduzida adicionando 3 mL de trietanolamina até alcançar um pH entre
5 e 5,5. Em seguida, o gel foi embalado em um pote de plástico e mantido em
temperatura ambiente por uma semana.
Após uma semana de repouso do gel base, as partículas de borneol
correspondentes à concentração de 5% para o gel foram diluídas e acrescentadas à
base (Figuras 3 e 4). Em seguida, o gel com o borneol foi armazenado em pote de
vidro e conservado em temperatura ambiente, obtendo uma coloração transparente e
odor característico do borneol. O GB5 permaneceu sob temperatura ambiente por um
período de oito meses.
Fonte: Autoria própria.
Figura 2. Material utilizado para a preparação do gel carbopol.
48
Fonte: Autoria própria.
Fonte: Autoria própria.
A
B
Figura 3. Borneol (A) e gel carbol (B).
Figura 4. Preparação do gel com concentração de 5% de borneol.
49
4.3 Estudo de estabilidade do gel de borneol 5%
Antes de iniciar o estudo de estabilidade, o GB5 foi submetido ao teste de
centrifugação. A centrifugação foi realizada utilizando-se 10 g da amostra, a qual foi
centrifugada (Centribio, modelo 80-2B) a 3.000 rpm durante 30 minutos a fim de
detectar qualquer sinal de instabilidade, como separação espontânea em duas fases
(gel e líquido). Em seguida, foi realizado o teste de estabilidade preliminar analisando
parâmetros organolépticos (aspecto, cor e odor) e físico-químicos (pH, condutividade
e viscosidade).
4.3.1 Análise macroscópica da formulação
Após manipulação do gel a amostra foi analisada quanto às características
organolépticas, a fim de identificar qualquer instabilidade, alteração da cor ou
separação de fases. A comparação visual da amostra com o gel base permite a
análise da cor, aspecto e odor, e foi realizada em cerca de 10 g da amostra
acondicionados em frascos iguais. A fonte de luz empregada foi a luz branca, natural,
de modo que a amostra pudesse ser avaliada criteriosamente com iluminação
adequada comparada antes e após a centrifugação.
4.3.2 Ciclo congelamento e descongelamento
A amostra do GB5 foi submetida ao teste do ciclo congelamento e
descongelamento, mediante variações extremas de temperatura. O teste foi realizado
no período de 12 dias com 6 ciclos alternados de 24 h a 40 ± 2 ºC e 24 h a 5 ± 2 ºC
em estufa e refrigerador, respectivamente (LIMA et al., 2008; ANVISA, 2014). As
análises dos parâmetros organolépticos (aspecto, cor e odor), valor de pH,
condutividade e viscosidade foram realizadas antes e após os ciclos. Depois deste
período, as amostras foram submetidas também ao teste de centrifugação (Centrífuga
– Centribio® ) com 3.000 rpm durante 30 min, a fim de identificar sinal de instabilidade.
50
4.3.3 Teste da centrifugação
Para a realização do teste de centrifugação, 5 g da formulação foi adicionada em
tubo de ensaio cônico, sendo em seguida levada à centrífuga para realização do teste.
Na centrifugação, a amostra do gel foi submetida a um ciclo de 3000 rpm durante 30
minutos à temperatura ambiente. A centrifugação foi realizada com a centrífuga
Centribio® (Modelo 80-2B) e a amostra avaliada considerando a separação de fases.
4.3.4 Determinação do pH
A análise de pH do gel foi realizada em pHmetro de bancada digital
(MSTecnopon equip. Especiais LTDA) calibrado previamente com as soluções
determinadas pelo próprio equipamento (tampão de pH 7 e 4). A verificação do pH foi
realizada em triplicata com o eletrodo inserido diretamente no GB5.
4.3.5 Análise de condutividade
Para avaliação da condutividade do gel, o mesmo equipamento que verificou o
pH foi utilizado (MSTecnopon equip. Especiais LTDA). As medidas de condutividade
foram dadas em milivolt (mV), e a mensuração da condutividade foi realizada em
triplicata.
4.3.6 Teste de viscosidade
Para avaliação da viscosidade foi empregado o viscosímetro rotativo micro
processado (Quimis, modelo Q-860M21). Aproximadamente 30 g de GB5 foi utilizada
de forma suficiente para manter a haste do sistema imerso na amostra e padronizou
o “spindle 2”, em seis velocidades (10, 20, 30, 40, 50 e 60 rpm) o que permite medir
eletronicamente a força de torção já convertida em viscosidade. Todas as análises
foram realizadas em triplicata.
51
4.4 Análise estatística
A formulação do GB5 foi testada em triplicata, e a análise estatística foi realizada
em duplicata. A fim de verificar o efeito do teste de estabilidade acelerada com o ciclo
de congelamento e descongelamento, foi utilizado o teste t de Student com o software
Graph Pad Prism versão 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA), com nível
de significância de p <0,05.
52
5. PARTE EXPERIMENTAL – II
53
5 PARTE EXPERIMENTAL II
5.1 Animais
Foram utilizados nesta pesquisa 12 ratas Wistar, albinas, com idade aproximada
de 90 dias, com peso de 223,58 ± 9,19 gramas, todas provenientes do biotério setorial
da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) (Figura 5). Os animais
foram colocados dois dias antes no ambiente onde o experimento seria realizado, para
adaptação ao meio. Foram mantidos em gaiolas coletivas de plástico, permanecendo
com temperatura média de 21 ± 2 °C, em ciclo claro/escuro de 12 horas, entre às 6 h
e 18 h, em ambiente higienizado e com livre acesso à ração específica para espécie,
e água. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos
de experimentação animal, sendo aprovados pela Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da Universidade Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF sob
o número 0006/110414.
Fonte: Autoria própria.
Figura 5. Demonstração dos animais em seus recintos durante período de adaptação.
54
5.2 Preparo dos animais
Os experimentos com os animais foram realizados no laboratório de cirurgia e
experimentação da UNIVASF. Após o período de adaptação os animais foram
distribuídos em quatro grupos, (Grupo 1 = 30 cm; Grupo 2 = 45 cm; Grupo 3 = 60 cm;
Grupo 4 = 70 cm). Cada animal foi inicialmente pesado, e em seguida foi feita a
administração de ketamina e xilazina (80 e 10 mg/kg de peso corporal,
respectivamente) diluída em 1 mL de solução salina e aplicada por via intraperitoneal
(Figura 6).
Figura 6. Administração de quetamina e xilazina pela via Intraperitoneal.
Após a administração do anestésico, os membros posteriores dos animais foram
tricotomizados bilateralmente e em seguida foi feita a mensuração dos seus diâmetros
com o auxílio de um paquímetro digital (Figura 7) e a circunferência da região medial
do ventre muscular foi avaliada por perimetria com o auxílio de fita métrica (Cescorf®)
Fonte: Autoria própria.
55
(Figura 8). Todas as medidas foram realizadas anteriormente à lesão e 72 h após a
lesão, antes da eutanásia.
Fonte: Autoria própria.
Fonte: Autoria própria.
Figura 7. Mensuração do diâmetro da pata do rato pós-lesão.
Figura 8. Avaliação da circunferência do membro posterior esquerdo com fita métrica antes da lesão.
56
5.3 Divisão dos grupos para produção de lesão
Os animais foram distribuídos em quatro grupos de três animais cada, o grupo 1
recebeu o impacto com queda da massa a 30 cm de altura, o grupo 2 com 45 cm, o
grupo 3 com 60 cm e o grupo 4 teve o membro lesionado com altura de queda de 70
cm. Cada animal recebeu o impacto apenas no membro posterior direito, o qual foi
realizado uma única vez com o animal anestesiado.
Figura 9. Distribuição dos animais por grupo para produção de contusão muscular.
Fonte: Autoria própria.
5.4 Equipamento para lesão muscular
Para obtenção da lesão muscular foi utilizado um equipamento adaptado,
baseado no estudo de Abreu e colaboradores (2013), o qual continha uma base de
suporte de ferro nas dimensões de 20 x 12 cm, com uma haste de metal fixa de 60
cm, dando suporte a um tubo eletroduto de PVC 3/4 de 135 cm de altura e 8 mm de
diâmetro, o qual foi preso à haste de metal por fitas adesivas. No tubo, foram
marcadas quatro alturas diferentes, 30, 45, 60 e 70 cm, e em cada altura foi feita uma
pequena abertura para facilitar o controle do deslizamento de uma haste de ferro de
324 g que ficava solta dentro do tubo (Figura 9).
Animais (N=12)
Grupo 1 (n=3)
Lesão 30 cm
Grupo 2 (n=3)
Lesão 45 cm
Grupo 3 (n=3)
Lesão 60 cm
Grupo 4 (n=3)
Lesão 70 cm
57
A haste de ferro no interior do tubo (Figura 10) ficava fixa na altura determinada
presa por uma chave, e imediatamente após a retirada da chave, deslizava até atingir
o membro posterior direito. Desta forma, pode-se obter quatro quedas com a mesma
massa, com a energia cinética das quedas variadas. O cálculo da energia cinética foi
realizado pela fórmula Ec = m.g.h, onde m é a massa da haste, g é a ação da
gravidade, e h corresponde à altura de queda da massa. Desta forma, foram obtidas
A = Base de suporte de ferro; seta amarela = haste de metal fixa dando suporte ao cano de PVC; seta preta = cano com aberturas demarcadas para passagem da haste móvel no seu interior.
A
Fonte: Autoria própria.
Figura 10. Equipamento para produção de contusão com aberturas a 30,45, 60 e 70 cm de altura.
58
as energias cinéticas de 0,970 J; 1,455 J; 1,940 J; 2,2634 J, para as alturas de 30, 45,
60 e 70 cm, respectivamente.
5.5 Obtenção da lesão muscular
Após a administração da anestesia e tricotomia digital dos membros posteriores,
os animais foram posicionados em decúbito ventral sobre a mesa. Uma extensão da
pata com o movimento de dorsiflexão foi realizado de forma passiva pelo pesquisador
no MPD do animal, a fim de posicionar o gastrocnêmio em posição de alongamento.
Desta forma, o músculo gastrocnêmio era atingido por uma massa de 324 g que foi
liberada nas alturas de 30, 45, 60 e 70 cm, conforme o grupo testado. Todos os
animais receberam apenas um impacto, o qual foi realizado somente sobre o MPD,
tendo o MPE como controle interno.
Fonte: Autoria própria.
Figura 11. Haste de metal com massa de 324g, utilizada para produção do
impacto.
59
Fonte: Autoria própria.
5.6 Análise histológica
Após 72 horas de lesão, os animais foram anestesiados e eutanasiados. A
eutanásia foi realizada com uma dose letal de 20 mg/ 100 g de pentobarbital sódico
por via intraperitoneal. Após a eutanásia, os MP dos animais foram dissecados, sendo
feita a retirada do músculo gastrocnêmio medial e lateral bilateralmente em todo seu
comprimento. O músculo retirado foi em seguida depositado em recipiente com
formalina a 10% em PBS onde permaneceu por 24 horas, sendo sem seguida
depositado em álcool 70%.
Fonte: Autoria própria.
Figura 12. Animal anestesiado e posicionado para realização do trauma
contuso no MID.
60
A fim de preparar o tecido na parafina para realização dos cortes histológicos,
as peças passaram por um processo que consistiu em: álcool 80%, 90%, 95% cada
um por uma hora, seguidos de mais uma hora em três álcoois a 100%. Além disso, as
peças permaneceram por mais 1 hora e 30 minutos no xilol, de forma que a cada meia
hora este xilol era trocado. Em seguida, o tecido foi embebido por três tipos de parafina
permanecendo 30 minutos em cada, estando desta forma prontos para a realização
dos cortes.
Os cortes do tecido na parafina foram realizados no laboratório de histologia do
campus de ciências agrárias da UNIVASF, onde foram realizados cortes com 4 μm,
os quais foram corados com hematoxilina-eosina para análise histológica. A área
representativa foi selecionada para análise histológica qualitativa da resposta
inflamatória celular com objetivas de 4x e 10x, a área representativa foi fotografada e
posteriormente foi feita a análise das imagens obtidas. Todas as análises foram feitas
por um único examinador.
A= músculo gastrocnêmio esquerdo do animal 2 do grupo 1; B= músculo gastrocnêmio direito do animal 2 do grupo 1.
A B
Fonte: Autoria própria.
Figura 13. Músculos gastrocnêmio direito e esquerdo dissecados para análise
histológica após 72h de lesão.
61
5.7 Análise estatística
Os valores da circunferência e diâmetro da região medial do ventre muscular do
gastrocnêmio foram analisadas através teste t de Student com o software Graph Pad
Prism versão 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA), adotando-se um nível
de significância estatística de p <0,05.
62
6. RESULTADOS
63
6 RESULTADOS
6.1 Características macroscópicas do gel do borneol 5%
A formulação do GB5 foi avaliada quanto às suas características e qualidades
macroscópicas, como cor, aspecto e aroma. A formulação desenvolvida apresentou
uma textura lisa, transparente, aspecto homogêneo e aroma característico do borneol.
As características macroscópicas do GB5 mantiveram-se semelhantes mesmo após
oito meses do desenvolvimento, e não houve diferença no aspecto da GB5 após o
ciclo de congelamento-descongelamento. A figura 14 apresenta o aspecto do gel após
os testes.
Fonte: Autoria própria.
Figura 14. Aspecto do GB5 após oito meses de desenvolvimento e testes de estabilidade.
64
6.2 Avaliação de pH e condutividade
Os valores de pH, condutividade, aspecto macroscópico e resposta à
centrifugação do GB5 antes e após o teste de congelamento e descongelamento
estão apresentados na tabela 1. Não foi verificada diferença estatística nos valores de
pH e condutividade analisados antes e após o teste.
Tabela 1 - Resultados da avaliação da estabilidade preliminar do gel de borneol 5%
antes e após o teste de congelamento e descongelamento.
Amostra Aspecto pH Condutividade Centrifugação
GB 5 Pré
Homogêneo,
Translúcido,
Incolor
3,95 ± 0,01 186,15 ± 0,35 mV Sem separação
de fases.
GB 5 Pós
Homogêneo,
Translúcido,
Incolor
3,83 ± 0,03 171,3 ± 1,27 mV Sem separação
de fases.
Fonte: Autoria própria.
65
6.3 Medidas da viscosidade
A figura 15 apresenta o comportamento do gel base de carbopol e do GB5 os
quais tiveram sua viscosidade testada em seis momentos com 10, 20, 30, 40, 50 e 60
rpm.
Figura 15. Efeito da velocidade de corte na viscosidade do gel carbopol e do gel borneol 5% antes e após o ciclo de congelamento e descongelamento.
A viscosidade destes géis diminuiu com o aumento da taxa de cisalhamento,
apresentando-se com fluxo não-Newtoniano. Não houve diferença estatística entre os
valores de viscosidade dos géis de borneol com o gel carbopol, e entre as formulações
de GB5 após o teste de congelamento e descongelamento.
6.4 Análise macroscópica do músculo gastrocnêmio pós contusão
Na avaliação macroscópica do aspecto dos músculos gastrocnêmios, foi
identificada uma discreta alteração na coloração do músculo lesionado dos animais
apenas nos grupos de 60 e 70 cm, caracterizando aumento de circulação local. As
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 10 20 30 40 50 60 70
GB5 Antes GB5 depois CG
Fonte: Autoria própria.
66
medidas de circunferência e diâmetro da pata, realizadas a fim de identificar
quantitativamente a presença de edema, não apresentaram diferença significativa
entre as mensurações realizadas antes da lesão e após 72 h de lesão, bem como não
houve diferença entre as medidas da pata lesionada com a pata controle.
6.5 Análises microscópicas dos músculos gastrocnêmios submetidos à lesão
Nas análises microscópicas dos músculos lesados, foi realizada uma análise
histológica qualitativa comparando ao aspecto do tecido da musculatura contralateral,
a qual foi utilizada como controle. Na análise microscópica dos músculos controle, não
foram observados sinais de inflamação, a fibra muscular apresentou-se de forma
íntegra, com características morfológicas normais (Figura 16).
O impacto da massa de 324 g deslizando a 30 cm de altura no membro posterior
direito não apresentou uniformidade em sua análise histológica, de forma que em
algumas regiões a análise com aumento de 10 X não permitiu identificar sinais de
processo inflamatório, enquanto que outras áreas do mesmo tecido apresentaram
Fonte: Autoria própria.
50µ
m
A
50µm
B
Figura 16. Tecido musculoesquelético do músculo posterior controle, com fibras e núcleos íntegros, evidenciando aspecto normal do músculo gastrocnêmio; objetiva de 10 X (A e B), coloração: HE.
67
sinais leves de inflamação com presença de edema e discreto infiltrado inflamatório
(Figura 17).
Do mesmo modo, os animais dos grupos de 45 cm e 60 cm também
responderam à lesão de forma variada, com presença de infiltrado inflamatório não
uniforme, com regiões do tecido sem lesão aparente, e outras com resposta
inflamatória moderada, sinalizada por aumento da celularidade intersticial e células
inflamatórias aderidas às fibras musculares (figuras 18 e 19).
50µm 50µm
E
E
Fonte: Autoria própria.
B A
Figura 17. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado
do grupo de 30 cm, com ausência de sinais de processo inflamatório (A) e discreto aumento do número de células inflamatórias no meio intersticial, denotando pequenos focos de infiltrado inflamatório (setas) e edema entre as fibras (B), objetiva 10 X. E= edema, coloração: HE.
68
50µm 50µm
E
E
B A
Fonte: Autoria própria.
Figura 18. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado
dos animais do grupo de 45 cm, com focos de infiltração discretos no local indicado pela seta (A) e um aumento claro da celularidade intersticial com infiltração, células inflamatórias aderidas as fibras musculares (indicado pelas setas em diferentes regiões do tecido), e edema entre as fibras (B), objetiva de 10 X. E = Edema, coloração: HE.
69
A figura 20 apresenta a resposta do tecido 72 horas após a lesão provocada no
grupo de 70 cm. Neste grupo, diferente dos demais, a resposta inflamatória
apresentou-se com aspecto uniforme, com sinais de infiltrado inflamatório em todas
as regiões do tecido, onde pode-se observar uma lesão mais intensa, com células
inflamatórias em quase todas as regiões do tecido, além de edema e necrose de fibras
musculares.
50µm 50µm
50µm 50µm
A B
Fonte: Autoria própria.
D C
Figura 19. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado do grupo de 60 cm. Observa-se neste grupo uma lesão variável com regiões sem resposta inflamatória aparente (A), e regiões com infiltrados perivasculares de tamanho variado dispersos pelo interstício, podendo ser notado também um aumento da celularidade intersticial em algumas regiões indicadas por setas (A, B, C, D), objetiva de 4 X(A) e 10 X(B, C, D, coloração: HE.
70
A comparação qualitativa por inspeção microscópica e análise de fotos do
tecido musculoesquelético dos animais de cada grupo demonstra que quanto maior a
altura da queda da massa sobre o músculo maior a resposta inflamatória, embora nos
grupos de 30, 45 e 60 cm a resposta à lesão foi variada, com regiões do tecido sem
sinais aparentes de lesão e regiões com lesão de leve a moderada. Apenas o impacto
D
50µm 50µm
50µm 50µm
Fonte: Autoria própria.
A B
C
E
E
E
D
Figura 20. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado dos animais do grupo de 70 cm. Neste grupo pode-se observar lesão severa com distribuição mais ampla e uniforme. Aumento de 4 X (A) evidenciando a presença do infiltrado em toda região analisada. Intenso infiltrado inflamatório disperso pelo interstício (seta figura B) e edema indicado pela letra E, (nas figuras B, C e D), aderência das células inflamatórias às fibras lesadas indicadas por seta na figura D, e áreas de necrose tecidual (C), coloração: HE.
71
provocado no grupo de 70 cm gerou uma lesão uniforme e com resposta inflamatória
mais acentuada, podendo ser classificada como uma lesão severa, quando
comparada com aquelas com demais combinação de altura.
72
7.DISCUSSÃO
73
7 DISCUSSÃO
A ação anti-inflamatória de alguns fármacos vem sendo estudada desde muito
tempo, a fim de atribuir a produtos naturais ou sintéticos a redução do período da
resposta inflamatória e seus efeitos indesejados (TIDBALL, 2005; ABREU et al.,
2013). Entretanto, quando esta intervenção se volta para as lesões
musculoesqueléticas, é necessária uma abordagem interdisciplinar com cooperação
de profissionais de diferentes áreas. O método empregado para a produção de lesão
muscular em modelos animais pode ser utilizado tanto para testes farmacológicos,
como para avaliar o efeito de procedimentos fisioterápicos, como a crioterapia,
massagem, fonoforese e outros (DEANE; GREGORY; MARS, 2013; ABREU et al.,
2013, GARG; CORONAAN; WALTERS, 2015).
O presente estudo, na busca de uma abordagem interdisciplinar que embase
uma avaliação futura de um gel produzido à base do borneol, objetivou desenvolver o
gel e avaliar suas características físico-químicas, as quais avaliam se a fórmula
desenvolvida apresenta boas condições para uso, também analisando sua resistência
a fatores externos observando possíveis alterações em sua composição, as quais, se
presentes, colocariam em risco a garantia dos efeitos farmacológicos do produto.
Além disso, considerando a extensa variação na literatura na determinação de
um método adequado para a produção de contusão muscular em modelo animal de
ratos, foi realizada uma análise histológica das fibras musculares do músculo
submetido à lesão, a fim de identificar de que forma o tecido responderia a diferentes
lesões geradas por diferentes alturas de compressão de massa sobre o músculo.
Desta forma, pode-se realizar o teste da substância desenvolvida, seja com aplicação
tópica, com auxílio de massagem ou ainda aplicação de fonoforese, sem risco de
submeter animais a procedimentos desconfortáveis que gerem resposta inflamatória
insuficiente para atribuir ação anti-inflamatória a qualquer método testado, ou lesões
exacerbadas que gerem respostas indesejadas como possíveis fraturas.
O gel do borneol foi avaliado macroscopicamente logo após a sua formulação,
oito meses após a formulação e novamente após a realização dos testes de
estabilidade acelerada, podendo-se a partir desta análise, classificar o gel quanto às
suas características e qualidades considerando a cor, aspecto e aroma.
O GB5 desenvolvido apresentou uma textura lisa e de cor transparente, aspecto
homogêneo e odor característico do borneol. Tais características do GB5 foram
74
observadas logo após a conclusão da sua formulação e as mesmas mantiveram-se
semelhantes após oito meses de armazenamento do gel em temperatura ambiente e
luz natural. Da mesma forma, após a realização dos testes de estabilidade acelerada,
nenhuma mudança macroscópica foi observada. Desta forma, observa-se que os
aspectos macroscópicos do gel desenvolvido apresentam grande capacidade de se
manterem estáveis mesmo após considerável período após sua formulação.
Nas análises físico-químicas, nenhum dos parâmetros avaliados do GB5
apresentou-se diferente estatisticamente após o teste de estabilidade acelerada, com
o ciclo de 12 dias de congelamento e descongelamento da fórmula, onde a mesma foi
exposta a temperaturas extremas, alterando entre estufa e refrigerador por 12 dias,
onde permanecia em cada temperatura por 24 horas. Os valores de pH do GB5
variaram entre 3,95 ± 0,01 e 3,83 ± 0,03. Tais valores com pH ácido já eram
esperados, já que o gel base de carbopol® foi formulado com um pH entre 5 e 5,5, por
serem estes, valores ideais para a obtenção de uma boa viscosidade e clareza do gel
(ISLAM et al., 2004). Além disso, o borneol também é considerado uma substância de
pH ácido (XIAO-FEI et al., 2008).
Este valor de pH apresentado pela formulação do GB5 não é considerável como
irritante para a pele, podendo ser utilizado em aplicações tópicas. Nas análises de
condutividade da formulação do GB5 também não houve alteração com os testes, não
sendo constatada diferença estatística nos seus valores entre as mensurações
realizadas antes e após ciclo de congelamento e descongelamento.
Para as formulações tópicas analgésicas e anti-inflamatórias, uma das
características mais importantes é a consistência da substância, por ser em grande
escala aplicada às camadas finas da pele, de modo que a viscosidade do gel
desempenha um papel importante no controle de permeação do fármaco. Geralmente
a viscosidade das formulações de gel reflete a coerência da fórmula (SHINDE;
POKHARKAR; MODANI, 2012).
Nos géis analisados, a viscosidade apresentou relação inversa ao aumento da
taxa de cisalhamento, apresentando desta forma um fluxo não newtoniano, este
comportamento esteve presente nestes géis devido à sua baixa resistência ao fluxo
quando aplicado em condições de cisalhamento elevadas (BOUSMINA, 1999). O
comportamento pseudoplástico da formulação do GB5 está ligado à diminuição da
viscosidade e associado à característica de alta espalhabilidade de formulações,
devido à diminuição da viscosidade quando se aplica força determinada, e ao mesmo
75
tempo tem a propriedade de permanecer no local de aplicação, sem escorrer
(CARVALHO et al., 2010).
Desta forma, a formulação de um gel à base de carpobol, com concentração de
5% do monoterpeno borneol, mostrou-se homogênea e estável, sendo resistente a
longo período de armazenamento e testes de estabilidade acelerada, apresentando
pH, condutividade e viscosidade adequadas para aplicações sobre a pele.
O GB5 formulado no presente estudo pode apresentar efeitos cutâneos ou
resultados sobre o tecido musculoesquelético, visto que o monoterpeno borneol
apresenta efeito anti-inflamatório comprovado na musculatura lisa de animais, e
através de outras vias de administração (ALMEIDA et al., 2013; JIANG et al., 2015).
Entretanto, para que este efeito seja comprovado, se faz necessária a aplicação de
um modelo que possa garantir que o tecido analisado produzirá uma resposta
inflamatória considerável, e servir de suporte para a comprovação da ação da
substância. Por isso, um modelo para produção de contusão muscular já utilizado na
literatura, com a queda de determinada massa sobre a musculatura, foi utilizado neste
estudo, de forma que a variável avaliada foi a altura da queda da massa.
McBrier e colaboradores (2009) em seu estudo também avaliaram as variações
da resposta muscular à lesão produzida por diferentes alturas, entretanto os autores
optaram por determinar o nível da lesão produzida por avaliação de ressonância
magnética. Quando a carga (267 g) foi aplicada a 40 cm e 50 cm, a lesão foi
considerada leve a moderada, quando a altura foi de 60 cm, a resposta passou de
moderada a grave, e apenas a altura de 70 cm apresentou um prejuízo severo,
entretanto, nesta altura os pesquisadores relataram a presença de fratura de tíbia e
fíbula, o que no presente estudo, mesmo utilizando alturas semelhantes e uma massa
maior, não foi identificada nenhum tipo de fratura.
Apesar deste estudo ter mostrado a importância da altura na determinação do
nível da lesão, os autores não avaliaram a resposta microscópica do infiltrado
inflamatório presente no tecido musculoesquelético, sendo toda análise realizada por
ressonância magnética. Embora tal análise seja válida para classificação da lesão, a
maioria dos estudos que utilizam métodos semelhantes para comprovar a eficácia de
fármacos com potencial anti-inflamatório, se baseiam em comparações qualitativas ou
quantitativas do tecido, através de inspeção microscópica da área lesada (FACIO;
MINAMOTO, 2006; ABREU, 2013; DEANE; GREGORY; MARS, 2013).
76
O modelo de contusão não penetrante deve considerar também o formato da
massa empregada para induzir o trauma, pois a área de contato da massa sobre o
músculo pode influenciar na resposta desencadeada (SOUZA; GOTTFRIED, 2013).
Alguns autores utilizaram de massa em forma de bola (NOZAKI et al., 2008;
AMBROSIO et al., 2010; KHATTAK et al., 2010; OTA et al., 2011; LI et al., 2013),
enquanto outros utilizam em forma de cilindro (CRISCO et al., 1996; KAMI; SENBA,
2002), ou não descrevem a forma da massa (WILKIN et al., 2004; MCBRIER et al.,
2007; SILVEIRA et al., 2010; FILIPPIN et al., 2011; LUO et al., 2012; SHU et al., 2012).
A massa utilizada no presente estudo, embora de formato cilíndrico, apresentava
uma base plana que recobria toda região do ventre do músculo gastrocnêmio das
ratas, e embora alguns estudos relatem que a aplicação de uma massa plana gere
uma lesão mais uniforme que a massa em forma esférica, por esta segunda gerar uma
menor área de contato (SMITH et al., 2008), apenas a altura de 70 cm respondeu à
lesão com infiltrado uniforme, sendo que nas demais alturas testadas, a resposta
apresentou-se variada entre leve e moderada, foi desuniforme, com o tecido
apresentando áreas sem lesão aparente e ausência de infiltrado inflamatório.
Abreu e colaboradores (2013), provocaram uma lesão muscular e comprovaram
o efeito anti-inflamatório do gel de Lychnophora pinaster após lesão aguda provocada
no musculo gastrocnêmio de ratos. A lesão desencadeada foi produzida por massa
de 300 g a 30 cm de altura do MPD dos ratos, entretanto, no presente estudo, a
aplicação de metodologia semelhante apresentou um infiltrado discreto, com áreas do
tecido sem sinais de inflamação.
Minamoto e colaboradores (1999) analisaram o músculo sóleo de rato após
contusões simples e recorrentes, utilizando uma massa de 204 g solta a 16 cm na
região posterior do MP de 32 ratos, e através de análise histológica foi verificado sinais
abundantes de danos agudos no músculo lesionado, e mudanças importantes na
morfologia do tecido. Em outro estudo, Minamoto e Salvini (2002) analisaram e
compararam a morfologia do tibial anterior submetidos à lesão gerada por um único
impacto ou por contusões periódicas. Neste estudo entretanto, o método empregado
foi composto por outras variáveis para a produção da lesão, sendo utilizada uma
massa de 200 g soltas a 36 cm.
Em um estudo buscando verificar os efeitos do ultrassom terapêutico nas
propriedades mecânicas do músculo de ratos após contusão, os autores induziram o
trauma mecânico com a aplicação de 200 g de massa a 30 cm. Contudo os autores
77
não analisaram a resposta histológica do tecido (MATHEUS et al., 2008). Esta
discrepância entre o método empregado para produção de lesão por contusão em
ratos, com variação de carga, altura e energia cinética empregada é constatada na
literatura (SOUZA; GOTTFRIED, 2013). Outros estudos também buscam o
desenvolvimento e validação de métodos para produção de contusão muscular em
coelhos (DEANE et al., 2013).
A partir destas análises deve-se atentar para o método de escolha no momento
da produção da lesão no teste de uma nova substância, visto que a resposta da
musculatura mesmo utilizando o mesmo modelo animal, com as mesmas
características, idade e ausência de treinamento, apresenta-se de forma variável, pois
embora todos os estudos utilizem modelos de controle, a atribuição do efeito de
qualquer tipo de tratamento pode estar atrelada a não-resposta do tecido, e não ao
efeito do tratamento testado.
No presente estudo, apenas a lesão de 70 cm apresentou um processo
inflamatório severo e uniforme. Nas demais alturas de queda testadas, a resposta
inflamatória pode ser classificada entre leve e moderada, e apresenta regiões do
tecido com ausência de sinais inflamatórios, por outro lado, diferente do estudo de
McBrier (2009), no presente estudo não houve casos de fratura óssea.
O trauma mecânico induzido na musculatura a fim de produzir contusão
muscular em ratos é aplicado em diversos estudos, os quais utilizam-se destes
métodos para testar ações farmacológicas anti-inflamatórias. Entretanto, como foi
possível observar, mesmo na musculatura em que o impacto foi causado, a lesão
provocada por 30, 45 e 60 cm apresentou na análise histológica regiões sem sinais
consistentes de resposta inflamatória. Com isso, os estudos que analisam a ação de
fármacos no processo inflamatório causado por trauma mecânico devem se voltar com
mais cuidado para o método de escolha para produção da lesão, de modo que a
associação entre o estado aparente do tecido e o efeito obtido a partir da substância
testada, seja realizada de forma fidedigna.
78
8. CONCLUSÃO
79
8 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos a partir deste estudo, concluiu-se que
borneol pode ser incorporado com sucesso na formulação do gel de carbopol. O gel
do borneol na concentração de 5% analisado após oito meses de sua produção e
armazenamento em temperatura ambiente, apresentou valores consideravelmente
bons para pH, condutividade, viscosidade e estabilidade, quando analisado antes e
após 12 dias no ciclo de congelamento e descongelamento. Na análise do método
para produção de contusão muscular em ratos, todos os protocolos adotados
estimularam a resposta inflamatória muscular, entretanto, o método da queda de uma
massa de 324 g a partir de 70 cm de altura parece ser o mais adequado para estudos
que buscam avaliar efeito de substâncias que atuem no processo inflamatório, devido
a este protocolo o tecido musculoesquelético ter apresentado uma lesão uniforme com
intenso infiltrado inflamatório.
80
9. PERSPECTIVAS FUTURAS
81
9 PERSPECTIVAS FUTURAS
O presente estudo teve como objetivo desenvolver a avaliar um gel à base do
borneol, e testar um método de produção de lesão musculoesquelética em ratos, com
a finalidade de embasar uma futura investigação, permitindo que a mesma produza
resultados fidedignos sobre o efeito anti-inflamatório do gel do borneol no tecido
musculoesquelético de rato, visto que os testes realizados com o gel garantem a
segurança de sua aplicação em testes in vivo. Pôde-se sugerir que o gel desenvolvido
pode ser uma alternativa promissora para o tratamento tópico ou transdérmico, pois
apresentou-se como uma formulação estável e com características físico-químicas
adequadas para sua aplicação sobre a pele. Com isso, espera-se que ao aplicar o
método de produção de contusão testado, os efeitos do gel sobre a tecido
musculoesquelético de ratos possam ser analisado em estudos futuros.
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96
APÊNDICE
97
APÊNDICE A – ARTIGO
ARTIGO:
Development and evaluation of stability of a formulation containing
the monoterpene borneol
98
Artigo submetido à:
Revista: The Scientific World Journal - ISSN 1537-744X
Título: Development and evaluation of stability of a formulation containing the
monoterpene borneol
Autores: Milla Gabriela Belarmino Dantas, Silvio Alan Gonçalves Bomfim Reis,
Camila Mahara Dias Damasceno, Larissa Araújo Rolim, Pedro José Rolim Neto,
Ferdinando Oliveira Carvalho e Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.
99
Development and evaluation of stability of a formulation
containing the monoterpene borneol
Milla Gabriela Belarmino Dantas,1 Silvio Alan Gonçalves Bomfim Reis,1 Camila
Mahara Dias Damasceno,1 Larissa Araújo Rolim,1 Pedro José Rolim Neto,2
Ferdinando Oliveira Carvalho,3 Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida1,*
1Center for Studies and Research of Medicinal Plants, Federal University of Vale do São
Francisco, 56.304-205 Petrolina, Pernambuco, Brazil.
2Federal University of Pernambuco, 50.670-901, Recife, Pernambuco, Brazil.
3Federal University of Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.
*Correspondence should be addressed to Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida;
The current study was designed to develop a topical gel formulation containing the
monoterpene borneol using carbopol as gel base and to evaluate its stability. The
prepared formulation was subjected to physical characterization and physical-
chemistry assessment. The gel was prepared from carbopol gel and 5% of borneol.
The prepared gel was subjected to pharmacotechnical test evaluated for its pH,
viscosity, conductivity, spreadability, centrifugation test and accelerated stability with
freezing-thaw cycle. The borneol was successfully incorporated into the carbopol gel
formulation. Borneol gel (BG5) showed good stability after eight months of its
development and after 12 days in the freeze-thaw cycle, not show statistics differences
in pH value, conductivity, and viscosity before and after test. Furthermore, the
formulation showed a good spreadability. Therefore, it was concluded that the
formulation could be very promising alternative for the topical or transdermal treatment
of skin diseases.
100
1. Introduction
The topical delivery of drugs is an attractive method for local and systemic treatments
and is commonly used in the treatment of inflammatory conditions like dermatological
diseases and musculoskeletal injuries [1, 2, 3]. Topical application has many
advantages over the conventional dosage forms, especially to avoid some serious
systemic adverse effects [4].
When the drug is delivered topically it can penetrate deeper into skin and hence
give better absorption [2, 5]. Topical preparation prevent the metabolism of drug in the
liver, avoid gastrointestinal disorders and the risks and inconveniences of intravenous
therapy and avoid the risks associated to the varied conditions of absorption, like pH
changes, presence of enzymes and gastric emptying time. Furthermore, the
bioavailability of the drug is increased and its action occurs directly at the action site
[6, 7].
A wide variety of pharmaceutical dosage forms can be used in the delivery system
for topical drugs. The most used are gels, creams and ointments, followed by sprays
and liquid preparations [8, 9]. The delivery topical with gels can increase the resistance
time of the drug on the skin and improve the delivery and release of the substance by
increasing the residence time at the injection site [10]. Furthermore, transdermal
delivery of some drugs such as nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) using
gel is proven effective for a variety of clinical conditions [11].
Borneol (C10H18O) is a bicyclic monoterpenoid alcohol commonly used in traditional
Chinese and Indian medicine and is found in more than 60 products based on
medicinal plants [12, 13, 14]. The borneol is extracted from the essential oil of various
medicinal plants and has the ability to accelerate the opening of the blood-brain barrier
and increase the bioavailability of drugs in the brain tissue [15, 16]. It has antibacterial,
101
analgesic and anti-inflammatory action proven in studies that used oral and
intraperitoneal applications of this monoterpene in mice [17, 18].
Although the easy borneol penetration into the nervous tissue is reported, and it is
a potent analgesic and anti-inflammatory, there are no reports in the literature about
borneol penetration of the skin and your topical or transdermal effect. Therefore, the
aim of this study was to develop an effective, stable topical gel containing borneol 5%
(BG5).
2. Materials and methods
2.1 Materials. The borneol was purchased from Sigma-Aldrich®, carbopol 940,
E.D.T.A, methylparaben and triethanolamine were purchased from Via Farma®.
2.2 Preparation of Borneol Gel. The exact amount of carbopol 940 (1%), propylene
glycol (7%) and methylparaben (0.1%) was dispersed in distilled water. The carbopol
dispersion was kept in rest for 24 hours to allow for the complete swelling. Then the
blended carbopol was mixed with continuous stirring, ultrassom and hot plate to form
gel aspect. Dispersion obtained was neutralized with required quantity of
triethanolamine for obtain pH 5.0 to 5.5. The carbopol gel was remained in a plastic jar
for a week at room temperature. Then, a concentration corresponding to 5% of borneol
was diluted with propylene glycol and added to the carbopol gel. The BG5 was stored
in a glass jar and kept at room temperature for 8 months for physical and chemistry
analysis.
2.3 Macroscopic Analysis of Formulation. The prepared BG5 formulation was
inspected visually for your color, homogeneity, consistency and spreadability. The
102
clarity was determined by using the natural light and all the macroscopic analysis were
realized comparing with carbopol gel.
2.4 Accelerated Stability and Physico-Chemical Analysis of Borneol Gel. The BG5 was
submitted to accelerated stability tests. The gel was kept at room temperature (20-25
°C) for evaluation to color, odor, pH, viscosity and conductivity. For analysis the
resistance to freeze-thaw cycle, the BG5 was kept at a temperature of 4 °C and 40 °C
for 12 days. The tests were performed eight months after the production of the
formulation. Each test was done in triplicate with samples of 30 grams each.
2.5 Freeze-thaw Cycle. The BG5 sample was subjected to freeze and thaw cycle, the
test was performed in 12 days with six cycles. In each cycle, the substance remained
in a particular temperature for a period of 24 hours. The temperature in the refrigerator
was 5 ± 2 °C and 40 °C in the greenhouse.
2.6 Centrifugation Test. To perform the centrifugation test, 10 g of formulation was
added in a tapered test tube. In centrifugation, the sample gel was subjected to a cycle
of 3000 rpm for 30 minutes at room temperature. Centrifugation was performed with
Model Centribio® 80-2B equipment.
2.7 Spreadability. The spreadability of the BG5 was measured by spreading of 0.5 g
of the gel on a circle of 2 cm diameter premarked on a glass plate and then a second
glass plate was employed. Half kilogram of weight was permitted to rest on the upper
glass plate for 5 min [19, 20].The diameter of the circle after spreading of the gel was
determined.
103
2.8 Conductivity and pH Analysis. The pH and conductivity of BG5 formulation were
determined by using digital pH meter (MSTecnopon equip. Special LTDA). The glass
electrode was calibrated with the solutions determined for the equipment (pH of 4.00
and 7.00), and the conductivity measurement was done in millivolts (mV). The
preparation was left for about 15 min for attaining equilibrium while measuring. The
analysis of pH and conductivity of formulation were done in triplicate and average
values were calculated.
2.9 Viscosity Study. The viscosity measurement of the borneol gel was performed with
a Viscometer (Quimis® MOD 0860M21). The gel was rotated at 10, 20, 30, 40, 50 and
60 rotations per minute. At each speed, the corresponding dial reading was noted.
2.10 Statistical Analysis. The BG5 formulation was tested in triplicate, and each
analysis were duplicated. Effect of formulation variables after freeze-thaw cycle were
tested for significance by using Student’s t‐test using Graph Pad Prism software‐5
version (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA) and were considered the p
values < 0.05.
3. Results and Discussion
The borneol gel formulation was assessed for its macroscopic characteristics and
qualities such as color, aspect, and aroma. The borneol gel formulation have a smooth
texture and white color transparent and homogeneous, and characteristic odor of
borneol extract. The BG5 characteristics were remained similar eight months after
104
development and there was no difference in aspect of BG5 between before and after
freeze–thaw cycle.
The pH values of the BG5 were found to be in the range from 3.95 ± 0.01 to
3.83 ± 0.03, which was expected since the carbopol gel was formulated with a pH
between 5 and 5.5 because these are values sufficient to obtain a good viscosity and
clarity of the gel [21]. Furthermore, the borneol is also considered acidic [22]. This pH
value showed that the BG5 probably would not produce skin irritation. The conductivity
values of BG5 also remained stable, it was not verified statistical difference in pH
values and conductivity before and after freezing thaw cycle. Hence, the prepared
borneol gel is suitable for topical application. The table 1 shows the physical and
chemical values of BG5 before and after twelve days of the freeze and thaw cycle.
TABLE 1: Results of evaluation of the preliminary stability of borneol gel 5% before
and after the freeze–thaw cycle.
Sample Appearance pH Conductivity Centrifugation
BG 5% Before
Homogeneous,
Transparent,
Incolor
3.95 ± 0.01 186.15 ± 0.35
mV
No noticeable
instability in the
formulation.
BG5 %
After
Homogeneous,
Transparent,
Incolor
3.83 ± 0.03 171.3 ± 1.27
mV
No noticeable
instability in the
formulation.
Values are mean ± standard deviation.
The spreadability of BG5 was considered high by having a low spread of time.
The therapeutic efficacy of gels depends on their spread. The gel spreading helps in
the uniform application of the gel to the skin, so the prepared gels must have a good
spreadability and satisfy the ideal quality in topical application. Furthermore, this is
considered an important factor in patient compliance to treatment.
105
The consistency of the substance is one of the most important features to
analgesic and anti-inflammatory topical formulations due to being applied to the thin
layers of the skin, so that the gel viscosity plays an important role in controlling of drug
permeation. The figure 1 shows the behavior of carbopol gels and BG5 that had a
viscosity tested at six times with 10, 20, 30, 40, 50 and 60 rpm.
FIGURE 1: Effect of shear rate on the viscosity of borneol gel 5% (BG5 %) before
and after the freeze-thaw cycle and carbopol® (CG) gel formulation.
Generally, the viscosity gel formulations reflects consistency [19]. The viscosity
of these gels decreases with increasing rate of shear, showing with non-Newtonian
flow (shear thinning), this behavior is preferred due to its low flow resistance when
applied at high shear conditions [23]. This viscosity decreases with possible
pseudoplastic behavior observed in the formulation of BG5, confirms the characteristic
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 10 20 30 40 50 60 70
BG5% Before BG5% Afther CG
106
of high spreadability due to the decrease in viscosity when applying certain force, and
at the same time has the property of remaining at the application site without drain [24].
4. Conclusions
According to the results obtained from this study, it was concluded that borneol was
successfully incorporated into the carbopol gel formulation. Borneol gel showed good
pH value, conductivity, viscosity, spreadability and stability before and after the 12 days
in the freeze-thaw cycle. Therefore, it was concluded that the formulation could be very
promising alternative for the topical or transdermal treatment. However, further
preclinical, clinical and long-term stability studies should be required.
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110
ANEXOS
111
ANEXO A – Aprovação do Comitê de Ética e Deontologia em Estudos e
Pesquisas – CEDEP, Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA / UNIVASF
112
ANEXO B – Carta de Submissão do Artigo