DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR ENZIMÁTICO PARA … Lara.pdf · A todos os professores do curso de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLAcircNDIA

INSTITUTO DE GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA

POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM GENEacuteTICA E BIOQUIacuteMICA

Laboratoacuterio de Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia LAFIP-NANOTEC

DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR

ENZIMAacuteTICO PARA DIAGNOacuteSTICO DE LESAtildeO NO

TECIDO HEPAacuteTICO

Aluno Lara Ferreira Paraiso

Orientadora Profa Dra Ana Graci Brito Madurro

Co-orientador Prof Dr Joatildeo Marcos Madurro

Uberlacircndia - MG

2011

ii







Lara Ferreira Paraiso

Dissertaccedilatildeo apresentada ao

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em

Geneacutetica e Bioquiacutemica do Instituto

de Geneacutetica e Bioquiacutemica da

Universidade Federal de Uberlacircndia

como requisito agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo

de mestre em Geneacutetica e

Bioquiacutemica



Uberlacircndia - MG

2011

Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo na Publicaccedilatildeo (CIP)

Sistema de Bibliotecas da UFU MG Brasil

P222d

Paraiso Lara Ferreira 1986- Desenvolvimento de biossensor enzimaacutetico para diagnoacutestico de lesatildeo no tecido hepaacutetico [manuscrito] Lara Ferreira Paraiso ndash 2011 62 f il Orientadora Ana Graci Brito Madurro Dissertaccedilatildeo (mestrado) - Universidade Federal de Uberlacircndia Progra- ma de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica Inclui bibliografia

1 1 Eletroquiacutemica - Teses 2 Fiacutegado ndash doenccedilas ndash Teses 3 Biossensores - Teses I Madurro Ana Graci Brito II Universidade Federal de Uberlacircndia Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica e Bioquiacutemica III Tiacutetulo CDU 5446

iii








Comissatildeo Examinadora

Presidente Ana Graci Brito Madurro

Examinadores Roney Santos Coimbra Sheila Cristina Canobre

Data da Defesa 26 07 2011 As sugestotildees da Comissatildeo Examinadora e as Normas PGGB para o formato da DissertaccedilatildeoTese foram contempladas

________________________________ Ana Graci Brito Madurro

iv

Quando algueacutem encontra seu caminho precisa ter coragem suficiente para dar passos errados As decepccedilotildees as derrotas o desacircnimo satildeo ferramentas que Deus

utiliza para mostrar a estrada

PPaauulloo CCooeellhhoo

v

A minha matildee Ozanita e meu pai Joatildeo Carlos vocecircs satildeo

exemplos de caraacuteter dignidade luta confianccedila

humildade e feacute Por todo carinho preocupaccedilatildeo e amor

e por estarem sempre presentes

AA vvooccecircecircss aaggrraaddeeccedilccediloo ee ddeeddiiccoo aa mmiinnhhaa aalleeggrriiaa

vi

AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS

Agradeccedilo primeiramente a Deus meu Amado Pai que nunca permitiu que eu desistisse

Sempre me deu confianccedila paciecircncia e disposiccedilatildeo para trabalhar Por sempre renovar minhas

forccedilas dia apoacutes dia me dando sabedoria para alcanccedilar esta vitoacuteria

Aos meus amados pais Joatildeo Carlos e Ozanita que sempre estiveram presentes em todos os

momentos da minha vida sofrendo e torcendo por mim Obrigado por nunca medirem

esforccedilos para que meus sonhos fossem alcanccedilados por sempre acreditarem nas minhas

capacidades e por me ensinarem a dar valor nas pequenas coisas hoje sou o que sou graccedilas agrave

dedicaccedilatildeo incondicional de vocecircs

Ao meu amor Moiseacutes obrigada pelos anos de companheirismo dedicaccedilatildeo e amor Por me

amar ser meu porto-seguro meu amigo e estar junto comigo nesta caminhada

compartilhando tantos momentos de felicidade ao meu lado Obrigada por sempre me

incentivar a crescer e lutar pelos meus ideais por acreditar e sempre contribuir para meu

crescimento profissional Amo muito vocecirc

Minha irmatilde Lorenna obrigada por ser uma irmatilde presente carinhosa e amiga

Minhas amadas avoacutes Aurora e Faacutetima por serem pessoas tatildeo especiais Obrigada pelos

ensinamentos de feacute pelas oraccedilotildees e pelo carinho

A minha maravilhosa famiacutelia todos vocecircs satildeo muito importantes para mim Obrigada pelo

incentivo pela forccedila carinho e amor Amo muito vocecircs

A querida professora Ana Graci Madurro por ser uma orientadora presente que acima de

tudo acreditou no meu potencial desde o iniacutecio me ensinando eletroquiacutemica e me ajudando

em cada passo dado nesta fase da vida Obrigada professora pelos seus ensinamentos sua

paciecircncia e compreensatildeo

Ao Professor Joatildeo Marcos Madurro pelo incentivo confianccedila e pelas contribuiccedilotildees

cientiacuteficas deste trabalho

Ao meu colega de laboratoacuterio Diego Leoni Franco pelos ensinamentos dedicaccedilatildeo e

paciecircncia Meus sinceros agradecimentos por me ajudar desde o iniacutecio desta caminhada com

vii

muita disposiccedilatildeo e alegria me ensinado desde as coisas mais simples as mais complexas

Obrigada pelas soluccedilotildees encontradas que me ajudaram a seguir em frente perante aos

inuacutemeros obstaacuteculos encontrados no decorrer destes uacuteltimos 2 anos Obrigada por tudo que

fez por mim para a realizaccedilatildeo deste trabalho

A querida famiacutelia LAFIP que me recebeu de braccedilos abertos Aos colegas Ana Cristina Ana

Consuelo Diego Deusmaque Erick Heden Isabela Isabella Joseacute Manuel Leticia Lucas

Luciano Miqueacuteias Pacircmela Renata e Vinicius Vocecircs aleacutem de colegas se tornaram meus

amigos Compartilhamos diversos momentos de grande felicidade que com certeza natildeo

seratildeo esquecidos Aprendi com vocecircs o que significa trabalho em equipe obrigado agrave todos

sem exceccedilatildeo que sempre mantiveram o bom humor em todas as situaccedilotildees e tiveram

paciecircncia e disposiccedilatildeo para me ajudar Tenho um carinho especial por cada um de vocecircs e

orgulho de pertencer aacute esta famiacutelia a amizade cultivada com vocecircs permaneceraacute para sempre

A todos os professores do curso de Geneacutetica e Bioquiacutemica obrigada pelo conhecimento

compartilhado e as contribuiccedilotildees dadas para minha formaccedilatildeo

Ao Gerson Fraissat pela paciecircncia e disponibilidade sempre que precisei

A Capes pelo apoio financeiro

Aos membros da banca que aceitaram cordialmente participar e contribuir para o

aprimoramento deste trabalho

A todos vocecircs me faltam palavras para demonstrar meus sinceros agradecimentos por

contribuir de alguma forma para realizaccedilatildeo deste trabalho e para meu crescimento

profissional o MEU MUITO OBRIGADO

viii

IacuteIacuteNNDDIICCEE ABREVIATURAS x

IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1 xi


APRESENTACcedilAtildeO 1

CAPIacuteTULO 1 FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA 2

1ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO 3

2DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS

RELACIONADAS 6

3FORMAS DE DOSAGEM DE ALT 8

4BIOSSENSORES 8

41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS 11

42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO 12

5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A

CONSTRUCcedilAtildeO DE BIOSSENSORES 14

6OBJETIVOS 18

61 OBJETIVO GERAL 18

62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 18

7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28

Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified

with poly(4-aminophenol) for detection of alanine aminotransferase 28

Abstracthelliphelliphelliphelliphellip 30

1 Introduction 31

2 Experimental Section 32

21 Apparatus 32

22 Chemical 32

23 Electrode surface modification 33

24 Thermal stability of the modified electrode 33

25 Immobilization of the PyO and detection of ALT 33

ix

26 Interference studies 33

27 Bioelectrode stability 34

3 Results and Discussion 34

31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-

aminophenol) 34

32 Immobilization of PyO on the modified electrode 34

33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic

force microscopy35

34 Detection of alanine aminotransferase 35

35 Sensitivity of bioelectrode for ALT 36

36 Interference study 36

37 Electrode stability 37

4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS

AGL Aacutecidos graxos livres

4-APP 4-aminoantypirine

AA Ascorbic acid

AFM Atomic force microscopy

ALT Alanina aminotransferase

DM2 Diabetes mellitus tipo 2

EHNA Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica

FAD Flavin adenine dinucleotide

Glu Glucose

Glut Glutamate

GPT Transaminase glutacircmico piruacutevica

NASH Esteohepatite natildeo alcooacutelica

PyO Piruvato oxidase

RI Resistecircncia a insulina

SM Siacutendrome metaboacutelica

TAG Triacilgliceroacuteis

TPP Pyrophosphate

UA Uric acid

VLDL Lipoproteiacutenas de muito baixa densidade

α ndashKG α-ketoglutarate

xi

IacuteNDICE DE FIGURAS ndash CAPIacuteTULO 1

Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado 4

Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT 7

Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor 9

Figura 4 Esquema representativo dos quatro principais meacutetodos de imobilizaccedilatildeo

de biomoleacuteculas (a) Adsorccedilatildeo Fiacutesica (b) Ligaccedilatildeo Covalente (c) Oclusatildeo (d)

Ligaccedilatildeo Cruzada 14

Figura 5 Esquema mostrando vaacuterias aplicaccedilotildees conhecidas e propostas para

poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades 15


Figure 1 Stability study onto graphite electrode modified with poly(4-

aminophenol) submitted to the temperature of 8degC Cyclic voltammetries were

realized in HClO4 solution (05 molL-1) 43

Figure 2 Cyclic voltammograms of graphite electrode modified with poly-(4-

aminophenol) in absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01 molL-1)

containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1 44

Figure 3 AFM images of graphite (A) graphitepoly(4-aminophenol) (B)

graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C) 45

Figure 4 Schematic diagram displaying the enzyme and electrode reactions

involved in the ALT activity onto graphite electrode modified with poly (4-

aminophenol) PyO pyruvate oxidase ALT alanine aminotransferase 4-APP 4-

aminoantypirine 46

Figure 5 ALT detection based on graphite electrode modified with poly (4-

aminophenol) using 4-aminoantypirine as electrochemical indicator (A) Linear

voltammogram (B) Amperometric response at +024V Absence of ALT (―) and

presence of ALT (---) All detection was done in phosphate buffer pH 74 47

Figure 6 (A) Linear voltammetries of bioelectrode for alanine aminotransferase

based on pyruvate oxidase immobilized on graphite electrode modified with poly

(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in absence

or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of

xii

bioelectrode for ALT Inset Oxidation charge of 4-aminoantypirine versus

logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74 48

Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in absence (a) or presence of

interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d) ascorbic

acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100 Vs

Inset selectivity coefficient of bioelectrode 49

Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode 50

1

APRESENTACcedilAtildeO

Doenccedilas hepaacuteticas satildeo um problema de sauacutede puacuteblica visto que a taxa de

mortalidade por doenccedilas do fiacutegado e causas relacionadas estaacute crescendo

gradativamente Os fatores relacionados com este aumento incluem consumo

abusivo de bebidas alcooacutelicas e desenvolvimento de siacutendrome metaboacutelica visto

que a obesidade e as doenccedilas relacionadas afetam diretamente as funccedilotildees

hepaacuteticas

O diagnoacutestico das principais doenccedilas do fiacutegado eacute feito com base na

detecccedilatildeo da enzima alanina aminotransferase (ALT) Sua mensuraccedilatildeo pode ser

realizada utilizando diferentes teacutecnicas sendo as eletroquiacutemicas as que se

destacam O desenvolvimento de biossensores eletroquiacutemicos para diagnoacutestico

de doenccedilas eacute uma ferramenta promissora devido agraves vantagens que estes

dispositivos apresentam como miniaturizaccedilatildeo anaacutelise em tempo real alta

sensibilidade e seletividade Desta forma frente agrave importacircncia de se ter

dispositivos cada vez raacutepidos de faacutecil manuseio de baixo custo e confiaacuteveis para

detecccedilatildeo de ALT o presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor

eletroquiacutemico para anaacutelise indireta de ALT utilizando eletrodo de grafite

modificado com poli (4-aminofenol)

2

CAPIacuteTULO 1

FUNDAMENTACcedilAtildeO TEOacuteRICA

3

1 ANATOMIA E FUNCcedilOtildeES DO FIacuteGADO

O fiacutegado eacute o maior oacutergatildeo soacutelido e metabolicamente complexo do corpo

Estaacute localizado no quadrante superior direito da cavidade abdominal abaixo do

diafragma estando protegido pela caixa toraacutecica [1] Consiste de dois loacutebulos

cada um contendo outros muacuteltiplos loacutebulos e sinusoacuteides O fiacutegado recebe 75 de

sua demanda de sangue pela veia portal que traacutes sangue proveniente do

coraccedilatildeo intestino delgado estocircmago pacircncreas e baccedilo Os 25 remanescentes

satildeo de sangue arterial levado ao fiacutegado pela arteacuteria hepaacutetica [2] (Figura 1)

As ceacutelulas primaacuterias do fiacutegado satildeo os hepatoacutecitos tambeacutem conhecidos como

ceacutelulas parenquimaacuteticas que formam os loacutebulos do fiacutegado Representam 80 do

volume do fiacutegado Os outros 40 satildeo ceacutelulas natildeo parenquimaacuteticas que

constituem as ceacutelulas que revestem as paredes dos sinusoacuteides As ceacutelulas de

revestimento satildeo ceacutelulas endoteliais ceacutelulas de Kupffer e ceacutelulas estreladas [1]

Os hepatoacutecitos satildeo responsaacuteveis pelas funccedilotildees bioloacutegicas hepaacuteticas como a

metabolizaccedilatildeo de algumas substacircncias (por exemplo o aacutelcool etiacutelico e uma gama

de drogas) e pela produccedilatildeo da bile [3]

Devido agraves suas conexotildees anatocircmicas e suas funccedilotildees bioquiacutemicas o fiacutegado

exerce um papel central no metabolismo nos processos digestivos

desintoxicantes e de eliminaccedilatildeo de vaacuterias substacircncias do corpo Ele recebe

sangue venoso do intestino de modo que todos os produtos da digestatildeo mais as

drogas e outros xenobioacuteticos ingeridos passam por ele antes de entrar na

circulaccedilatildeo sistecircmica Metabolicamente eacute responsaacutevel pela siacutentese e degradaccedilatildeo

do heme na siacutentese dos aacutecidos biliares aleacutem de atuar no metabolismo dos

carboidratos lipiacutedeos e proteiacutenas [1]

A avaliaccedilatildeo das funccedilotildees do fiacutegado eacute importante para o diagnoacutestico de diversas

desordens cliacutenicas como a hepatite A B e C cirrose esteatose hepaacutetica natildeo

alcooacutelica (EHNA) hepatite induzida por drogas [4] carcinoma hepatocelular [5] e

siacutendrome metaboacutelica (SM) [6]

4

Figura 1 Visatildeo esquemaacutetica da anatomia do fiacutegado [7]

Atualmente estudos sobre mortalidade enfatizam a importacircncia das causas

relacionadas agraves doenccedilas do aparelho circulatoacuterio neoplasias malignas e causas

externas Entretanto muito pouco eacute conhecido sobre a anaacutelise das doenccedilas

hepaacuteticas que tambeacutem formam um importante agrupamento de causas de morte

[8] No Brasil por exemplo dados do ministeacuterio da sauacutede registraram um total de

751 oacutebitos e taxa de mortalidade 1778 nos estados brasileiros referente apenas

ao mecircs fevereiro de 2011 (tabela 1) [9]

Tabela 1 Dados relacionados agrave doenccedila do fiacutegado registrados em fevereiro

de 2011 nos estados brasileiros

RegiatildeoUF Internaccedilotildees Oacutebitos Taxa de Mortalidade

TOTAL

4225

751

1778

Regiatildeo Norte 264 41 1553

Regiatildeo Nordeste 1086 186 1713

Regiatildeo Sudeste 1913 381 1992

Regiatildeo Sul 749 99 1322

Regiatildeo Centro-Oeste 213 44 2066

Fonte Ministeacuterio da Sauacutede - Sistema de Informaccedilotildees Hospitalares do SUS

(SIHSUS) [9]

Inuacutemeras doenccedilas podem ocasionar lesotildees no tecido hepaacutetico De um

modo geral independente da etiologia ou grau de fibrose esta gama de

5

patologias eacute denominada hepatopatia [10] As principais hepatopatias satildeo

descritas e caracterizadas a seguir

Esteastose hepaacutetica (EH) Eacute o termo geral utilizado para caracterizar

acuacutemulo excessivo de gordura no fiacutegado Acumulam-se mais comumente

triacilgliceroacuteis (TAG) pois possuem a taxa de renovaccedilatildeo mais elevada de todos

os eacutesteres de aacutecidos graxos hepaacuteticos Nesta patologia a captaccedilatildeo hepaacutetica de

aacutecidos graxos livres (AGL) do tecido adiposo e da dieta eacute desimpedida enquanto

que o descarte dos AGL por meio de oxidaccedilatildeo esterificaccedilatildeo e secreccedilatildeo de

proteiacutenas de muito baixa densidade (VLDL) estaacute limitado A origem da esteatose

pode estar relacionada ou natildeo com o uso abusivo de aacutelcool Quando natildeo estaacute

relacionada a origem e os fatores que contribuem para o seu desenvolvimento

incluem resistecircncia a insulina (IR) [1112] obesidade [13] diabetes mellitus tipo 2

(DM2) [14] e fatores geneacuteticos [15]

Esteatose hepaacutetica natildeo alcooacutelica (EHNA) Eacute a doenccedila de fiacutegado mais

comum nos Estados Unidos e possivelmente do mundo atingindo proporccedilotildees de

epidemia [16] Eacute definida como acumulo de gordura no fiacutegado acima de 5-10 do

peso em indiviacuteduos que natildeo consomem quantidades significativas de aacutelcool e

natildeo possuem evidecircncias laboratoriais de auto-imunidade viacuterus doenccedila hepaacutetica

induzida por toxinas ou erros inatos do metabolismo [14] Pacientes com EHNA

geralmente apresentam niacuteveis elevados de alanina aminotransferase (ALT)

hepatomegalia inflamaccedilatildeo e necrose [11]

Esteatohepatite natildeo alcooacutelica (NASH) Egrave o quadro cliacutenico evoluiacutedo da

EHNA O fiacutegado de pacientes com NASH apresenta um grau elevado de

inflamaccedilatildeo estresse oxidativo disfunccedilatildeo mitocondrial necrose e fibrose A

predisposiccedilatildeo de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular se torna bastante

proeminente em pacientes com NASH [15]

Hepatopatia alcooacutelica Compreende um espectro de siacutendromes cliacutenicas e

alteraccedilotildees patoloacutegicas no fiacutegado provocadas pela ingestatildeo de aacutelcool variando do

acuacutemulo simples de gorduras neutras nos hepatoacutecitos (esteatose hepaacutetica

alcooacutelica) ateacute cirrose e carcinoma hepatocelular Natildeo existe uma dose de

ingestatildeo de aacutelcool precisa que iraacute acarretar o desenvolvimento de doenccedila

hepaacutetica alcooacutelica Contudo dos consumidores de aacutelcool agrave longo prazo 90-100

6

desenvolveratildeo EH poreacutem apenas 10-35 desenvolveratildeo hepatite alcooacutelica e 8-

20 desenvolveratildeo cirrose alcooacutelica [17]

Hepatite alcooacutelica Inclui a alteraccedilatildeo gordurosa macrovesicular mais uma

resposta inflamatoacuteria difusa agrave lesatildeo e necrose (frequumlentemente focal) uma cirrose

estabelecida tambeacutem pode estar presente A hepatite alcooacutelica com seus

infiltrados celulares inflamatoacuterios difusos e necrose eacute vista frequumlentemente como

o estaacutegio intermediaacuterio entre a esteatose hepaacutetica e a cirrose [18]

Cirrose A cirrose natildeo eacute uma doenccedila independente mas eacute a condiccedilatildeo

terminal de outras doenccedilas do fiacutegado causadas pelo viacuterus da hepatite aacutelcool

desordens metaboacutelicas colesterase desordens circulatoacuterias autoimunidade

substacircncias toacutexicas drogas infecccedilotildees diferentes das relacionadas com a hepatite

viral doenccedilas congecircnitas e razotildees desconhecidas que natildeo tecircm cura e progridem

cronicamente [19]

Carcinoma hepatocelular Eacute o cacircncer de fiacutegado que surgiu de

hepatoacutecitos Eacute o quinto cacircncer de maior ocorrecircncia mundial e o terceiro no ranking

de mortalidade [20] A cirrose eacute o maior fator de risco para seu desenvolvimento

outras causas podem estar relacionadas dentre elas cirrose descompensada

hepatites virais NASH DM2 e fatores geneacuteticos [21]

A forma mais precisa de diagnoacutestico das doenccedilas hepaacuteticas eacute por meio da

avaliaccedilatildeo por biopsia do oacutergatildeo lesionado geralmente natildeo indicada por ser um

meacutetodo agressivo A anaacutelise sanguiacutenea principalmente a quantificaccedilatildeo das

enzimas hepaacuteticas com destaque para as transaminases eacute um meacutetodo confiaacutevel

e relevante para diagnosticar estas patologias

2 DIAGNOacuteSTICO DAS HEPATOPATIAS E DOENCcedilAS RELACIONADAS

As estrateacutegias mais eficientes para a detecccedilatildeo das hepatopatias satildeo

baseadas no ensaio para quantificaccedilatildeo das transaminases denominadas

aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ou transaminase

glutacircmico piruacutevica (ALTGPT) em amostras de sangue Embora ambas

transaminases apresentem concentraccedilotildees elevadas no soro sempre que os

processos patoloacutegicos afetam a integridade da ceacutelula hepaacutetica a ALT eacute a enzima

7

mais especiacutefica do fiacutegado pois a AST eacute encontrada em maiores proporccedilotildees em

outras ceacutelulas aleacutem disso sua atividade manteacutem-se elevada durante mais tempo

comparado com a AST [22]

A principal fonte de ALT eacute o fiacutegado mas tambeacutem pode ser encontrado em

menores quantidades nos rins coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e pacircncreas [23] No

fiacutegado localiza-se no citoplasma (90) e na mitococircndria (10) A ALT catalisa a

transferecircncia do grupo amina da alanina para o alfa-cetoglutarato com formaccedilatildeo

de piruvato e glutamato [24] (Figura 2)

Figura 2 Reaccedilatildeo de transaminaccedilatildeo catalisada pela ALT

Pequenas alteraccedilotildees nos niacuteveis de ALT satildeo encontradas nas hepatites

crocircnicas (especialmente hepatite C e NASH) e uma elevaccedilatildeo mais acentuada eacute

encontrada nas hepatites alcooacutelica e agudas virais [25] Alteraccedilotildees plasmaacuteticas

tambeacutem satildeo observadas no soro de pacientes com cirrose necrose hepaacutetica

colestase isquemia hepaacutetica tumor hepaacutetico drogas hepatotoacutexicas icteriacutecia

obstrutiva miosite e pancreatite [17] Recentes estudos demonstraram que niacuteveis

alterados de ALT tambeacutem estatildeo associados agrave obesidade IR DM2 e outras

doenccedilas relacionadas agrave SM [10-13]

Em circunstacircncias normais a ALT encontra-se dentro das ceacutelulas

hepaacuteticas contudo na incidecircncia de uma lesatildeo ou injuacuteria ocorre rompimento

destas ceacutelulas causando um extravasamento desta enzima para o sangue

resultando em um aumento significativo nas concentraccedilotildees seacutericas desta enzima

[26]

8

Dessa forma a ALT aleacutem de ser uma importante ferramenta para

diagnoacutestico das hepatopatias e grau de lesatildeo hepaacutetica a sua mensuraccedilatildeo jaacute eacute

utilizada para diagnosticar outras doenccedilas metaboacutelicas devido agrave forte relaccedilatildeo

existente com as mesmas

3 FORMAS DE DOSAGEM DE ALT

A concentraccedilatildeo normal no sangue de ALT eacute de 5 ndash 40UL-1 no sangue e no

plasma respectivamente No entanto quando o oacutergatildeo esta doente ou danificado

os niacuteveis de ALT podem aumentar mais de 50 vezes acima do niacutevel normal

sendo uma elevaccedilatildeo moderada entre 96-240 UL-1 e alta entre 240-960 UL-1 [27]

As principais estrateacutegias para a detecccedilatildeo de ALT incluem teacutecnicas

espectrofotomeacutetricas quimioluminescentes cromatograacuteficas fluorecentes aleacutem

de radioquiacutemicas e eletroquiacutemicas [2825] Das teacutecnicas convencionais como a

espectrofotometria haacute certas desvantagens como a anaacutelise da amostra ser

realizada em laboratoacuterios cliacutenicos requerindo reagentes complexos caros e matildeo-

de-obra especializada [29] Assim uma maior atenccedilatildeo tem sido dada nos uacuteltimos

anos agraves teacutecnicas eletroquiacutemicas que normalmente satildeo baseadas em dispositivos

minituarizados com uso de pequenas quantidades de amostra procedimentos

simples e altamente sensiacuteveis com grau elevado de especificiade e confiabilidade

nos dados obtidos Biossensores eletroquiacutemicos satildeo exemplos de dispositivos

com essas vantagens

4 BIOSSENSORES

Durante os uacuteltimos 20 anos a pesquisa e desenvolvimento global no

campo de sensores tem crescido exponencialmente em termos de investimento

financeiro publicaccedilotildees na literatura e nuacutemero de pesquisadores ativos [30] Um

sensor quiacutemico eacute um dispositivo que transforma uma informaccedilatildeo quiacutemica

variando desde a concentraccedilatildeo especiacutefica de um componente da amostra ateacute a

anaacutelise de sua composiccedilatildeo total em um sinal analiacutetico [31]

O termo biossensor refere-se a um dispositivo analiacutetico que contecircm um

material bioloacutegico sensiacutevel imobilizado tal como enzimas anticorposantiacutegenos

DNA bacteacuterias tecidos etc interligado a um transdutor responsaacutevel por

9

identificar e converter um sinal baseado nas alteraccedilotildees bioloacutegicas em um sinal

quantitativo diretamente proporcional a concentraccedilatildeo do analito [32]

Tais dispositivos satildeo importantes ferramentas analiacuteticas utilizadas para

diagnoacutestico cliacutenico [28] na detecccedilatildeo de faacutermacos resiacuteduos ambientais [33]

controle e qualidade da aacutegua e de alimentos [34] controle de doenccedilas na

induacutestria de bebidas [35] dentre outras Oferecem diversas vantagens sobre os

meacutetodos existentes tais como menos tempo de anaacutelise baixo custo

miniaturizaccedilatildeo elevada seletividade e sensibilidade [28] e capacidade de

detecccedilatildeo em tempo-real que eacute desejado na anaacutelise cliacutenica e biomeacutedica

particularmente em diagnoacutesticos proacuteximos aos pacientes onde o teste deve ser

raacutepido e um pequeno volume de amostras eacute requerido [3637]

Sendo assim os sensores baseados em biomoleacuteculas contribuem para o

estabelecimento das teacutecnicas analiacuteticas representando uma nova ferramenta

para a determinaccedilatildeo de analitos (glicose ureacuteia lactato colesterol DNA

antiacutegenos anticorpos) em fluidos corpoacutereos como o sangue [3038]

Uma gama de configuraccedilotildees destes dispositivos confere grande

versatilidade no desenvolvimento dos biossensores dependendo das

caracteriacutesticas do elemento bioloacutegico e do transdutor utilizado A figura 3

demonstra o esquema representativo de um biossensor

Figura 3 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do biossensor [39]

O tipo de transduccedilatildeo de sinal estaacute diretamente relacionado agrave caracteriacutestica

fiacutesica ou quiacutemica do produto gerado pelo componente bioloacutegico [4041] Dentre os

transdutores um dos mais utilizados para a construccedilatildeo de biossensores eacute o

eletroquiacutemico Dentre as diversas teacutecnicas utilizando esse transdutor a voltametria

10

ciacuteclica tem se mostrado eficaz Esta teacutecnica mensura a corrente produzida pelos

processos de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo que ocorrem na superfiacutecie de um eletrodo atraveacutes

de variaccedilatildeo de potencial A resposta obtida eacute proporcional agrave concentraccedilatildeo do

analito [28]

Os transdutores eletroquiacutemicos comumente utilizados na construccedilatildeo dos

biossensores satildeo os eletrodos condutores Dos diversos materiais empregados

como ouro platina carbono viacutetreo destaca-se o uso de carbono grafite devido as

suas vantagens tais como baixo custo monitoramento on site faacutecil manuseio e

grandes possibilidades de modificaccedilatildeo da superfiacutecie

O material bioloacutegico a ser imobilizado na superfiacutecie do transdutor eacute

denominado camada de bioreconhecimento Dependendo da natureza deste

material pode ser dividida em duas grandes classes Os biocatalisadores

(enzimas microrganismos materiais teciduais) e os bioligantes (anticorpos

aacutecidos nucleacuteicos lectinas) [34]

Uma forma de classificar os biossensores eacute pelo tipo de moleacutecula que eacute

imobilizada na superficie do transdutor De tal maneira os biossensores satildeo

divididos em Enzimaacuteticos Genossensores Imunossensores e

Microbioloacutegicos O princiacutepio de funcionamento de cada um dos respectivos

biossensores pode ser entendido da seguinte maneira

Enzimaacuteticos baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de enzimas tendo seu princiacutepio de

funcionamento baseado na atividade especiacutefica sobre um composto (substrato)

ou uma determinada classe de compostos O funcionamento desses biossensores

pode tambeacutem envolver a inibiccedilatildeo da enzima pelos referidos compostos afetando

a quantidade de substrato consumido ou produto gerado ou pelo monitoramento

direto da espeacutecie eletroativa geradaconsumida na cataacutelise enzimaacutetica [3442]

Genossensores baseiam-se na imobilizaccedilatildeo de fragmentos de DNA ou

oligonucleotiacutedeos A chamada simples fita (ssDNA) apoacutes interaccedilatildeo com alvo

complementar regenera a dupla fita (dsDNA) num processo denominado de

hibridizaccedilatildeo Este sinal pode ser detectado diretamente pela oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo

das bases nitrogenadas do DNA que pode ser auxiliado pelo uso de mediadores

reduzindo o potencial de reaccedilatildeo como compostos a base de cobalto ou rutecircnio

[43] A detecccedilatildeo pode ser indireta pelo uso de indicadores como brometo de

11

etiacutedio azul de metileno que possuem afinidades diferentes por sistemas contendo

simples e duplas fitas [44]

Imunossensores baseiam-se no uso de um anticorpo que reage

especificamente com uma substacircncia (antiacutegeno) a ser testada A imobilizaccedilatildeo do

receptor (por exemplo antiacutegeno) sobre um substrato eacute conveniente para

aplicaccedilotildees de reconhecimento biomolecular para detecccedilatildeo da moleacutecula alvo (por

exemplo anticorpo) presente na soluccedilatildeo A especificidade da interaccedilatildeo antiacutegeno-

anticorpo permite o desenvolvimento de imunossensores para diagnoacutesticos

cliacutenicos monitoramento ambiental dentre outros [34]

Microbioloacutegicos consiste na imobilizaccedilatildeo de ceacutelulas microbioloacutegicas sobre o

transdutor O princiacutepio de operaccedilatildeo destes biossensores eacute baseado no uso das

funccedilotildees metaboacutelicas e respiratoacuterias do microorganismo para detectar um analito

que seja o substrato ou um inibidor destes processos Lei e colaboradores [45]

reportaram algumas das recentes aplicaccedilotildees dos biossensores microbioloacutegicos no

monitoramento ambiental e para o uso em alimentos fermentaccedilatildeo e campos

similares

41 BIOSSENSORES ENZIMAacuteTICOS

Biossensores enzimaacuteticos estatildeo atraindo atenccedilatildeo generalizada na aacuterea

cliacutenica ambiental e biotecnoloacutegica Trata-se de um dispositivo que combina

sensibilidade e seletividade de uma enzima com um transdutor Para alcanccedilar

elevada sensibilidade raacutepido tempo de resposta e estabilidade quiacutemica dos

materiais responsaacuteveis pelo reconhecimento meacutetodos de imobilizaccedilatildeo e

estabilizaccedilatildeo adequados para a enzima e o mediador devem ser explorados [46-

48]

Sabe-se que enzimas satildeo estruturas complexas que possuem grupos

cataliacuteticos e muitas vezes requerem cofatores especiacuteficos ou coenzimas para

desempenhar cataacutelises bioquiacutemicas [49] Todas as enzimas possuem centros

ativos Neste local processam-se as reaccedilotildees especiacuteficas com determinados

substratos Esse centro ativo eacute geralmente constituiacutedo de resiacuteduos de

aminoaacutecidos de uma cadeia de proteiacutena e um grupo natildeo-proteacuteico sendo

responsaacutevel pela atividade bioloacutegica Algumas dependem somente da sua proacutepria

12

estrutura proteacuteica (apoenzima) para exercer sua atividade enquanto outras

necessitam tambeacutem de um ou mais componentes natildeo-proteacuteicos chamados de

cofatores que podem ser iacuteons metaacutelicos (metaloenzimas) ou moleacuteculas orgacircnicas

(coenzimas) ou ambos O complexo cataliticamente ativo enzima-cofator eacute

denominado de holoenzima [5051]

Alguns biossensores satildeo encontrados na literatura para mensuraccedilatildeo de ALT

diversas estrateacutegias satildeo propostas mas a maioria utilizando sistemas complexos

envolvendo transdutores de alto custo como ouro e platina [5253] De forma que

dispositivos mais adequados simples e de baixo custo satildeo necessaacuterios

Este trabalho propotildee o desenvolvimento de um biossensor para a medida de

ALT de acordo com as reaccedilotildees 1 2 e 3 indicadas abaixo

L-alanina+α-cetoglutarato piruvato+L-glutamato (1)

Piruvato+O2 +fosfato acetilfosfato +CO2+H2O2 (2)

H2O2 + 4-APP(red) 4-APP(ox) + H2O (3)

42 TEacuteCNICAS DE IMOBILIZACcedilAtildeO

As teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo de biomoleacuteculas mais utilizadas satildeo as de

formaccedilatildeo de ligaccedilatildeo covalente e adsorccedilatildeo [54] Outros processos como os de

ligaccedilatildeo cruzada (cross-linking) e oclusatildeo (entrapment) tambeacutem satildeo utilizados

[5556] Podemos destacar as caracteriacutesticas de cada procedimento como

Adsorccedilatildeo fiacutesica baseia-se na formaccedilatildeo de forccedilas atrativas de Van der

Waals ligaccedilotildees de hidrogecircnio e complexos de transiccedilatildeo de eleacutetrons entre as

biomoleacuteculas e o eletrodo Este meacutetodo natildeo exige qualquer modificaccedilatildeo quiacutemica

PyO

ALT

13

causando menos dano a biomoleacutecula e possui a vantagem da simplicidade

requerendo apenas uma soluccedilatildeo contendo o componente bioloacutegico [5758]

Ligaccedilatildeo covalente esta teacutecnica baseia-se na reaccedilatildeo entre grupos funcionais

terminais da biomoleacutecula natildeo essenciais agrave atividade bioloacutegica e grupos reativos

da superfiacutecie do transdutor dentre as diversas superfiacutecies pode-se ter um filme

polimeacuterico Embora esta teacutecnica possua a vantagem de dificilmente o componente

bioloacutegico se desprender da matriz de suporte eacute extremamente relevante que seus

siacutetios bioloacutegicos sejam preservados [5960]

Oclusatildeo esta teacutecnica eacute utilizada quando o componente bioloacutegico eacute preparado

em conjunto com o produto de modificaccedilatildeo da superfiacutecie do eletrodo deixando

assim as biomoleacuteculas aprisionadas Normalmente esta camada de modificaccedilatildeo eacute

separada da soluccedilatildeo teste por uma membrana semipermeaacutevel de forma a

retardar a lixiviaccedilatildeo do componente bioloacutegico O processo de interaccedilatildeo pode ser

puramente fiacutesico ou envolver ligaccedilotildees covalentes [54]

Ligaccedilatildeo Cruzada baseia-se na imobilizaccedilatildeo como resultado da reaccedilatildeo do

componente bioloacutegico com um agente bifuncional em que se formam as ligaccedilotildees

covalentes intermoleculares [6162] Os reagentes que permitem o uso desta

teacutecnica contecircm grupos reativos terminais especiacuteficos para os grupos funcionais

(por exemplo aminas) que se encontram nas outras moleacuteculas a imobilizar

A resposta das moleacuteculas imobilizadas depende da aacuterea superficial

porosidade caraacuteter hidrofiacutelico da matriz imobilizada condiccedilotildees de reaccedilatildeo e

metodologia escolhida para a imobilizaccedilatildeo De uma forma esquemaacutetica as

diferentes formas de imobilizaccedilatildeo encontram-se representadas na Figura 4

14



Ligaccedilatildeo Cruzada [54]

Juntamente com as teacutecnicas de imobilizaccedilatildeo que satildeo utilizadas para

melhorar a interaccedilatildeo entre os componentes do biossensor existem

procedimentos que promovem melhores interaccedilotildees e consequentemente

melhores repostas analiacuteticas como eacute o caso da utilizaccedilatildeo de poliacutemeros

condutores

5 UTILIZACcedilAtildeO DE POLIacuteMEROS CONDUTORES PARA A CONSTRUCcedilAtildeO

DE BIOSSENSORES

Os poliacutemeros satildeo parte integrante da nossa existecircncia e tudo que nos

rodeia desde os blocos baacutesicos de construccedilatildeo aos constituintes da vida como

proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos e polissacariacutedeos que satildeo polimeacuteros [27] Podem ser

definidos como compostos de origem natural ou sinteacutetica com alta massa molar

formados pela repeticcedilatildeo de um grande nuacutemero de unidades quiacutemicas

(monocircmeros) unidas entre si por ligaccedilotildees covalentes Existem poliacutemeros

orgacircnicos e inorgacircnicos ambos sendo importantes comercialmente [63]

15

Umas das propriedades mais importantes dos poliacutemeros eacute a capacidade de

comportarem-se como excelentes isolantes eleacutetricos Contudo nas trecircs uacuteltimas

deacutecadas uma nova classe de poliacutemeros orgacircnicos tem sido desenvolvida cuja

importacircncia estaacute relacionada agrave possibilidade de conduzir eletricidade [64] Os

membros desta nova classe de materiais chamados de ldquometais sinteacuteticosrdquo

possuem uma caracteriacutestica em comum longos sistemas π conjugados ao longo

da cadeia responsaacuteveis por uma condutividade eleacutetrica intriacutenseca O interesse

evidente eacute combinar em um mesmo material as propriedades eleacutetricas de um

semicondutor ou metal com as vantagens de um poliacutemero [65]

Inuacutemeras aplicaccedilotildees tecnoloacutegicas tecircm sido propostas e desenvolvidas para

poliacutemeros condutores devido principalmente agraves suas propriedades de

condutividade e eletroquiacutemicas de oxi-reduccedilatildeo A figura 5 ilustra algumas

aplicaccedilotildees conhecidas e outras propostas para os poliacutemeros condutores em

funccedilatildeo das suas propriedades [66]


poliacutemeros condutores em funccedilatildeo das suas propriedades [66]

Duas maneiras satildeo comumente utilizadas para tornar o poliacutemero condutor

por meio de processo fiacutesico ou dopagem eletrocircnica No processo fiacutesico ocorre

apenas uma mistura fiacutesica de um poliacutemero natildeo-condutor com um material

condutor como por exemplo um metal ou poacute de grafite distribuiacutedo atraveacutes do

material [67] Jaacute a dopagem eletrocircnica eacute um procedimento de adiccedilatildeo de

16

ldquoimpurezasrdquo quiacutemicas a um elemento semicondutor para transformaacute-lo num

elemento mais condutor poreacutem de forma controlada [68]

O funcionamento da dopagem eacute baseado no princiacutepio de semiconduccedilatildeo A

capacidade do semicondutor de transportar corrente eleacutetrica pode ser ampliada

pela adiccedilatildeo de eleacutetrons na banda de conduccedilatildeo um semicondutor tipo n (negativo)

e pela remoccedilatildeo de eleacutetrons da banda de valecircncia um semicondutor tipo p

(positivo) [69] Na dopagem dos poliacutemeros as ldquoimpurezasrdquo satildeo introduzidas nas

cadeias fazendo a interaccedilatildeo gerar deformaccedilotildees e ldquodefeitos carregadosrdquo

localizados responsaacuteveis pelo aumento na condutividade [70]

Um meacutetodo de tornar o poliacutemero condutor eacute por meio de

eletropolimerizaccedilatildeo [71] Neste tipo de processo o poliacutemero em formaccedilatildeo na

superfiacutecie de um eletrodo eacute dopado pelo eletroacutelito suporte presente na soluccedilatildeo

Este material apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis que contribui para a sua

crescente utilizaccedilatildeo no desenvolvimento de biossensores dentre as quais se

destacam facilidade no controle de formaccedilatildeo (quantidade espessura do

material) estabilidade ao ambiente e em soluccedilotildees aquosas condutividade eleacutetrica

e proteccedilatildeo do eletrodo de adsorccedilatildeo de analitos natildeo especiacuteficos A presenccedila de

grupos funcionalizados em sua estrutura eacute um dos principais interesses na

construccedilatildeo de um biossensor pois pode promover uma melhor interaccedilatildeo com a

sonda (camada de bioreconhecimento) a ser imobilizada sobre o transdutor [72]

Poliacutemeros formados dessa maneira satildeo normalmente chamados de filmes

polimeacutericos devido agrave fina espessura que pode ser construiacuteda sobre os eletrodos

Derivados de monocircmeros aromaacuteticos funcionalizados eletrodepositados em

eletrodos condutores tem sido uma das principais atividades do Laboratoacuterio de

Filmes Polimeacutericos e Nanotecnologia (LAFIPNanotec) Dentre eles estatildeo o

estudo de eletropolimerizaccedilatildeo de 4-aminofenol [73] 3-aminofenol [74] e tiramina

[75] estudos de imobilizaccedilatildeo de bases nitrogenadas de DNA sobre aminofenoacuteis

[76-78] e 4-metoxi-fenetilamina [79] estudo da eletropolimerizaccedilatildeo e imobilizaccedilatildeo

de estruturas de DNA utilizando acido 4-hidroxi-fenilaceacutetico [8081] e aacutecido 3-

hidroxi-fenilaceacutetico [82]

Filme polimeacuterico derivado 4-aminofenol eletrodepositado sobre eletrodo de

grafite apresenta caracteriacutesticas favoraacuteveis para sua aplicaccedilatildeo no

17

desenvolvimento de biossensores [73] contudo poucos estudos satildeo encontrados

na literatura com este propoacutesito

18

6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL

Desenvolvimento de biossensor eletroquiacutemico para detecccedilatildeo indireta de

alanina aminotransferase utilizando superfiacutecie de carbono grafite modificado com

filme polimeacuterico derivado de 4-aminofenol

62 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Modificaccedilatildeo eletroquiacutemica de eletrodos de carbono de grafite com poliacutemero

derivado de 4-aminofenol

Avaliaccedilatildeo da estabilidade eletroquiacutemica do filme polimeacuterico

Imobilizaccedilatildeo da enzima piruvato oxidase sobre a superfiacutecie do eletrodo

modificado com filme polimeacuterico

Detecccedilatildeo indireta de ALT por monitoramento do pico de oxidaccedilatildeo do mediador

4-aminoantipirina (4-APP)

Estudo da sensibilidade e seletividade do biossensor produzido

Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica da superfiacutecie

19

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graphite electrodes modified with polytyraminerdquo Journal of Materials

Science432008 475-482

76 Ferreira LF Boodts JFC Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoGold

electrodes modified with poly (4-aminophenol) incorporation of

nitrogenated bases and an oligonucleotiderdquo Polymer International 57

2008 644-650

77 Ferreira LF Vieira SN Filho LRG Brito-Madurro AG Madurro

JM ldquoImmobilization of purine bases in poly-4-aminophenol matrixrdquo

Journal of Materials Science 422007 3238-3243

78 Franco DL Afonso AS Ferreira LF Goncalves RA Boodts JFC

Brito-Madurro AG Madurro JM ldquoElectrodes modified with

polyaminophenols Immobilization of purines and pyrimidinesrdquo Polymer

Engineering and Science 482008 2043-2050

79 Silva FB Vieira SN Filho LRG Boodts JFC Brito-Madurro AG

Madurro JM ldquoElectrochemical Investigation of Oligonucleotide-D9A

Hybridization on Poly (4-Methoxyphenethylamine)rdquo International Journal of

Molecular Science 2008 1173-1188

27

80 Silva TAR Ferreira L F Boodts JFC Eiras SP Brito-Madurro

AG Madurro JM ldquoPoly(4-hydroxyphenylacetic acid) a new material for

immobilization of biomoleculesrdquo Polymer Engineering and Science48

2008 1963-1970

81 Silva TAR Ferreira LF Souza LM Filho LRG Brito-Madurro

AGMadurroJM ldquoNew approach to immobilization and specific-sequence

detection ofnucleic acids based on poly(4-hydroxyphenylacetic acid)rdquo

Materials Science ampEngineering C Biomimetic Materials Sensors and

Systems 292009 539-545

82 OliveiraRML Vieira SN Alves HC Franca EG Franco DL

Ferreira LFBrito-MadurroAG Madurro JMrdquoElectrochemical and

morphological studies of an electroactive material derived from 3-

hydroxyphenylacetic acid a new matrix for oligonucleotide hybridizationrdquo


28

CAPIacuteTULO 2

Immobilization of pyruvate oxidase onto graphite electrode modified with poly(4-

aminophenol) for detection of alanine aminotransferase

O capiacutetulo II estaacute de acordo com as normas da revista Bioelectrochemistry

(httpwwwelseviercomwpsfindjournaldescriptioncws_home504080descriptio

ndescription)

29



Lara F Paraiacuteso1 Isabella B Guerra2 Diego L Franco2

Joatildeo M Madurro2 Ana G Brito-Madurro1

1 Institute of Genetics and Biochemistry Federal University of Uberlacircndia

Uberlacircndia Brazil

2 Institute of Chemistry Federal University of Uberlacircndia Uberlacircndia Brazil

Author to whom correspondence should be addressed Tel +55 34 32182203

Fax +55 3432182203 E-mail agbritoiqufuufubr

30

Abstract

High concentrations of alanine aminotransferase (ALT) in human serum indicate

hepatic disorders This paper reports a new procedure for ALT determination using

pyruvate oxidase (PyO) immobilized onto graphite electrode modified with poly(4-

aminophenol) and 4-aminoantypirine as an indicator of enzymatic system The

characterization of the resulting bioelectrode was performed using atomic force

microscopy (AFM) techniques AFM images indicate that the enzyme was

successfully incorporated onto the modified graphite electrode The bioelectrode

obtained showed attractive characteristics such as a short response time (about

200 s) a low detection limit to ALT (0003UL) and good stability (95 of response

after 4 weeks)

The combination of enzymatic assay for ALT and modified electrode with poly(4-

aminophenol) is a promising approach towards the development of a diagnosis kit

for hepatic disease using electrochemical detection

Keywords Alanine aminotransferase modified electrode pyruvate oxydase

poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction

Liver diseases are a growing public health problem that affects million

people worldwide [1 2] The evaluation of hepatic function is important for the

diagnosis of a number of clinical disorders such as hepatitis A B C cirrhosis

steatosis and hepatitis induced by drug [3] The measurement of alanine

aminotransferase (ALT) in blood is frequently used [4-8] to determine these

diseases or only to evaluate the liver function

ALT is found primarily in the liver and kidneys with smaller amounts in the

heart and in skeletal muscles [9-11] It has a catalytic activity of reversible

conversion of alanine and α-ketoglutarate (α-KG) to pyruvate and glutamate

Under normal circumstances this enzyme resides within the cells of the liver but

when the liver is injured it is spilt into the blood Elevated levels of ALT are a

signal of liver damage such as hepatitis and jaundice [12] Recent studies found

alteration in ALT concentrations in individuals with metabolic syndrome [13 14]

insulin resistance [15] diabetes mellitus and obesity [16] revealing that the

measurement of this enzyme concentration is an important tool for the diagnosis of

these diseases too Normal levels of ALT are 5 and 40 UL-1 respectively in blood

and serum following severe liver damage ALT levels increase to gt50 times the

normal level with moderate elevation at 96ndash240 ULminus1 and high elevation at 240ndash

960 ULminus1 [17]

Some of the main detection strategies such as colorimetry

chemiluminescence chromatography and electrochemical techniques have been

employed for ALT determination [17] Methodologies based on conventional

spectrophotometric assay which are routinely performed in clinical laboratories

require complex reagents are costly and require trained operators Therefore

there is a recent growing demand for the development of healthcare devices and

electrochemical sensors that have proven advantages for such applications [18]

A number of biosensors for ALT monitoring have been reported using

electrode without modification or on modified platforms [19] based on the

glutamate oxidase [20-23] and pyruvate oxidase (PyO) [2] using indirect on

electrochemical detection with mediators [24-26] Most of these devices were

developed using expensive transducers such as gold [22] and platinum [24]

32

Electrodes electrochemically modified by polymeric films offer advantages

in the construction of biosensors helping in the interaction of the analyte with the

target and increasing the electric conductivity [27] The development of polymeric

films using 4-aminophenol have already been reported [28-31] however no study

using poly(4-aminophenol) as matrix for immobilization of pyruvate oxidase aiming

at the detection of alanine aminotransferase is found in the literature In this way

we report the development of an electrochemical bioelectrode for ALT detection

based on pyruvate oxidase immobilized on graphite surface modified with 4-

aminophenol using 4-aminoantypirine (4-APP) as mediator

2 Experimental Section

21 Apparatus

All electrochemical experiments were carried out using a potentiostat CH

Instruments model 760 C connected to a serial output program Surface

morphology was assessed through atomic force microscopy (AFM) (Shimadzu

SPM 9600)

22 Chemical

All reagents used were of analytical grade The monomer 4-aminophenol

and α-ketoglutarate were purchased from Acros Organics L-alanine was obtained

from VETEC 4-aminoantypirine (4-APP) sodium pyruvate thiamine

pyrophosphate (TPP) flavin adenine dinucleotide (FAD) porcine heart alanine

aminotransferase (EC 2612) and bacterial pyruvate oxidase (EC1233) were

purchased from Sigma

Electrochemical polymerization was performed in a three-compartment cell

using a potentiostat from CH Instruments model 420A A graphite disk (6 mm

diameter 999995) from Alfa Aesar was used as working electrode A platinum

plate was used as counter electrode All potentials refer to a silversilver chloride

reference electrode (AgAgCl KCl 30 M) Ultra high purity water (Master System

Gehaka Brazil) was used for the preparation of all solutions

33

23 Electrode surface modification

Prior to the electropolymerization the bare graphite electrode was

mechanically polished with alumina (03 microm) slurry ultrasonicated washed with

deionized water and dried in the air 4-Aminophenol solution was deaerated with

ultra pure nitrogen for ca 45 minutes prior to electropolymerization The monomer

4-aminophenol was electropolymerized on graphite electrode through continuous

cycling of the potential according to Vieira and col [31] After the

electropolymerization the modified electrode was rinsed with deionized water to

remove non-reacting monomers

24 Thermal stability of the modified electrode

The thermal stability of the graphite electrode modified with poly(4-

aminophenol) was evaluated The modified electrodes were maintained at 8 plusmn 1

degC and analyzed by cyclic voltammetry in 05 molL-1 HClO4 solution between

+00 V to +10 V vs AgAgCl every 5 days

25 Immobilization of the PyO and detection of ALT

For the pre-conditioning cleaning and polarization of the surface of the

graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) it was subjected to

successive potential scans from 0 to +10 V vs SCE in phosphate buffer 01M

until the voltammograms remained constant After 15 μL of PyO (2 U ml-1) and 6

microL TPP (30 mM) were dropped onto the electrode The electrode was dried at

room temperature and then kept under dry conditions at 4 C before use For the

detection of ALT 10 microL of substrates (alanine 01 M and α-KG 001 M) 15 microL of

4-APP (10 mM) were used during the detections conducted at 37 degC for

25 minutes

26 Interference studies

Common substances found in serum or urine were studied for the

evaluation of the possible interfering effects 1 mgdL uric acid (UA) 1mM

glutamate (Glut) 1mM glucose (Glu) or 36 mgdL ascorbic acid (AA) was added

to ALT 0003 UL All experiments were performed at 37oC

34

27 Bioelectrode stability

To evaluate the biosensor stability the modified electrodes containing PyO

were stored at 8 ordmC protected from light and oxygen during 30 days

3 Results and Discussion

31 Stability studies of the electrode modified with poly(4-aminophenol)

Studies of electrodeposition and characterization of polymers derived from

4-aminophenol have been described by our group [28 29 31] but no study of the

stability in function of low temperature has been reported Figure 1 shows the

stability of graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) during 30 days

at 8C

The electrode modified with polymer film submitted to low temperature

(8oC) during 30 days kept about 75 of its electroactivity indicating maintenance

of the structure of the polymer after this treatment

32 Immobilization of PyO on the modified electrode

One way to demonstrate the adsorption of a biomolecule on the surface of

transducer is conducting studies using electroactive complexes such as redox pair

potassium ferrocyanideferricyanide (negative probe) and hexaammineruthenium

chloride (positive probe) [32 33]

In order to evaluate the charge-transfer properties on the surface of the

modified electrodes cyclic voltammetry technique was employed using

K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6 as redox probe (Fig 2) Piruvate Oxydase was immobilized

onto graphite electrode modified with poly(4-aminophenol) After immobilization

the modified electrode containing the enzyme was evaluated in the presence of

the redox probes

Figure 2 shows a small decrease in the current values of the redox couple

in the modified electrode in presence of PyO (Fig 2b) indicating that the enzyme

35

was immobilized on the surface of the electrode reducing the electron transfer of

the redox couple to the electrode

33 Morphological characterization of the bioelectrode using atomic force

microscopy

AFM measurements were carried out to characterize the morphological

changes of the electrode modified with or without biomolecules Fig 3 shows

representative 2D and 3D AFM images of these surfaces

Images of bare graphite graphitepoly(4-aminophenol) graphitepoly(4-

aminophenol)PyO presents roughness values of 312 nm 1133 nm 306 nm

respectively The surface of graphitepoly(4-aminophenol) is rougher than the bare

electrode That provides a significant increase of the electrode surface area

interesting for immobilization of a greater number of biomolecules The roughness

of modified graphite decreases after immobilization of PyO being observed

formation of numerous clusters indicating that the enzyme was successfully

incorporated on the modified graphite electrode in accordance with the

voltammetric studies (see Fig2)

34 Detection of alanine aminotransferase

The modified electrode with polymeric film containing PyO was utilized for

the detection of ALT using 4-aminoantypirine as indicator of enzymatic reaction

(Fig 4)

The biocatalyst scheme to evaluate ALT is illustrated in Fig 4 The enzyme

ALT in the presence of L-alanine and -Ketoglutarate produces pyruvate which

is a substrate for the second enzyme pyruvate oxidase The pyruvate can be

converted to H2O2 oxidizing 4-APP and leading to a decrease in current for 4-

APP The quantity of 4-APPox produced is directly proportional to the amount of

ALT The system proposed is compatible with the results obtained in the Fig 5

Linear voltammetry (Fig 5A) realized onto graphite electrode modified with poly(4-

aminophenol)PyO shows that the presence of ALT causes decrease in the current

oxidation of 4-APP This decrease is associated with the consumption of 4-APP by

36

competitive chemical reaction with H2O2 decreasing the availability of 4-APP to

the oxidation in the electrode and consequently decreasing the oxidation current

These results are consistent with the amperometric response obtained in the

presence or absence of ALT (Fig 5B) where a decrease in the charge values was

obtained for the bioelectrode in the presence of ALT (565C) compared with the

bioelectrode in the absence of ALT (619 C) Also it was determined by

chronoamperometry that the response time was less than 200s when the current

was stable (Figure 5B)

35 Sensitivity of bioelectrode for ALT

The bioelectrode was evaluated using samples of ALT prepared in buffer

phosphate monitoring 4-APP through linear voltammetry (Fig 6)

Since ALT produces H2O2 that oxidizes 4-APP the enzymatic activity can

be determined from the decrease in the current oxidation values in the

bioelectrode (Fig 6A) Fig 6B shows the oxidation charge of 4-APP in function of

the variation of ALT quantity The sensitivity determined from the semi-logarithmic

plot was 0003 UL (correlation coefficient r = 0998) for ALT over a range of

00003UL to 3UL


In the analysis of biological fluids background signals due to physiological

levels of electroactive species such as ascorbic acid and uric acid create

selectivity challenges [24] Effect of some common interferents in ALT

determination such as uric acid glutamate glucose ascorbic acid on the poly(4-

aminophenol)PyO bioelectrode response has been studied (Fig 7)

Selectivity coefficient (SC) of the bioelectrode for each interferent was

calculated using the equation SC = Ic+iIc where Ic+i and Ic are the bioelectrode

response for ALT (0003UL) in the presence and absence of each interferent

respectively [34] The results obtained indicate that the response of the

37

bioelectrode is not significantly affected in the presence of such interferents

indicating high selectivity towards the determination of ALT

37 Electrode stability

The storage stability of biosensors is a critical feature in the context of

potential pharmaceutical and industrial applications [35] Fig 8 depicts the stability

of the bioelectrode for ALT stored in dry state

Figure 8 indicates that the biosensor response was still 97 of the initial

value after 30 days of storage (8oC) This result was considered as an indication

that the microenvironment of the modified electrode was a stable platform for PyO

immobilization preventing its leaching and preserving its stability and biological

activity

4 Conclusion

The present work describes the development of a new ALT biosensor

obtained by immobilization of pyruvate oxidase onto poly(4-aminophenol) matrix

Poly (4-aminophenol) electrodeposited onto graphite electrode presented

high stability during 30 days in the conditions of the biosensor storage

Electrochemical techniques confirmed the PyO immobilization and ALT

detection on the modified surface AFM images confirmed the modifications in the

surface after the immobilization or ALT detection The material produced shows a

favorable effect onto a bioactivity of the immobilized PyO in a 30-day storage The

detection limit obtained was 0003 UL-1 and interferences studies showed high

selectivity of bioelectrode and fast response

The system is very promising for the clinical requirements for measurement

of abnormal elevation of ALT in serum with potential application in point-of-care in

diagnostic and home use

Acknowledgments

The authors are grateful for the financial support from Conselho Nacional

de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) Fundaccedilatildeo de Amparo agrave

38

Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Coordenaccedilatildeo de

Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) Also we would like to

thank teacher Abilio Borghi for the review of the English manuscript

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(2005) 99-107

43

Legend for figures



realized in HClO4 solution (05 molL-1)

44


aminophenol) in the absence (a) or presence of PyO (b) in KCl solution (01

molL-1) containing K3Fe(CN)6 (5 mmolL-1) K4Fe(CN)6 (5 mmolL-1) 100 mVs-1

45


graphitepoly(4-aminophenol)PyO (C)

46




aminoantypirine

47




presence of ALT (---) All the detection was performed in phosphate buffer pH 74

48



(4-aminophenol) and 4-aminoantypirine as electrochemical indicator in the

absence or presence of different concentrations of ALT (B) Calibration curves of


logarithmic concentration of ALT Electrolyte phosphate buffer pH 74

49

Figure 7 Linear voltammograms of ALT detection in the absence (a) or presence

of interferents uric acid 1mgdL (b) glutamate 1mM (c) glucose 1mM (d)

ascorbic acid 36 mgdL (e) Eletrolyte phosphate buffer (01 molL-1) pH 74 100

Vs Inset selectivity coefficient of bioelectrode

50

Figure 8 Operational stability of the ALT bioelectrode

ii








Dissertaccedilatildeo apresentada ao

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em

Geneacutetica e Bioquiacutemica do Instituto

de Geneacutetica e Bioquiacutemica da

Universidade Federal de Uberlacircndia

como requisito agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo

de mestre em Geneacutetica e

Bioquiacutemica



Uberlacircndia - MG

2011



P222d



iii













iv




v






vi




























vii






















viii








RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








12























PyO

ALT

13
























14








condutores


DE BIOSSENSORES








15






















16

































17



18

6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

20




Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

22








Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

24



5520-5528











127 (2) 2004 496-497









307-316





359

25







5946-4814-9904-C5946E01232683 Acesso em 17 maio 2011


2007 1-5












2011





Chemistry 220(1) 1987 67-82





26














Science432008 475-482




2008 644-650












27




2008 1963-1970





Systems 292009 539-545






28

CAPIacuteTULO 2





ndescription)

29










30

Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







40












Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

41














Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

43

Legend for figures




44




45



46




aminoantypirine

47





48







49





50




P222d



iii













iv




v






vi




























vii






















viii








RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








12























PyO

ALT

13
























14








condutores


DE BIOSSENSORES








15






















16

































17



18

6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

20




Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

22








Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









307-316





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5946-4814-9904-C5946E01232683 Acesso em 17 maio 2011


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Chemistry 220(1) 1987 67-82





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Science432008 475-482




2008 644-650












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2008 1963-1970





Systems 292009 539-545






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CAPIacuteTULO 2





ndescription)

29










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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







40












Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

41














Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




44




45



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aminoantypirine

47





48







49





50


iii













iv




v






vi




























vii






















viii








RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























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analito [28]





























11
















similares








48]








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PyO

ALT

13
























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condutores


DE BIOSSENSORES








15






















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17



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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

20




Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









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Chemistry 220(1) 1987 67-82





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Science432008 475-482




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Systems 292009 539-545






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CAPIacuteTULO 2





ndescription)

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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






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at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

41














Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




44




45



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aminoantypirine

47





48







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iv




v






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vii






















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RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























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TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








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PyO

ALT

13
























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condutores


DE BIOSSENSORES








15






















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17



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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









307-316





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Chemistry 220(1) 1987 67-82





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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

41














Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




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Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




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aminoantypirine

47





48







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v






vi




























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RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























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TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























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analito [28]





























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similares








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PyO

ALT

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condutores


DE BIOSSENSORES








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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














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7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




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39 2008 110-114




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1-6











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1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





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(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









307-316





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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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25 minutes






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at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




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Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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aminoantypirine

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RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























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TOTAL

4225

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(SIHSUS) [9]



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cronicamente [19]


















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com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










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analito [28]





























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similares








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PyO

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condutores


DE BIOSSENSORES








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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














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7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




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1-6











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1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









307-316





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Chemistry 220(1) 1987 67-82





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Science432008 475-482




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Systems 292009 539-545






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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

41














Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




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Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




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aminoantypirine

47





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vii






















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RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









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1







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CAPIacuteTULO 1


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TOTAL

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(SIHSUS) [9]



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cronicamente [19]


















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com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










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analito [28]





























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similares








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PyO

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condutores


DE BIOSSENSORES








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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














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7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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24



5520-5528











127 (2) 2004 496-497









307-316





359

25







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2007 1-5












2011





Chemistry 220(1) 1987 67-82





26














Science432008 475-482




2008 644-650












27




2008 1963-1970





Systems 292009 539-545






28

CAPIacuteTULO 2





ndescription)

29










30

Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







40












Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

41














Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

43

Legend for figures




44




45



46




aminoantypirine

47





48







49





50


viii








RELACIONADAS 6


4BIOSSENSORES 8





6OBJETIVOS 18



7REFEREcircNCIAS 19

CAPIacuteTULO 2 28




1 Introduction 31


21 Apparatus 32

22 Chemical 32




ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








12























PyO

ALT

13
























14








condutores


DE BIOSSENSORES








15






















16

































17



18

6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

20




Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

22








Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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127 (2) 2004 496-497









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Systems 292009 539-545






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CAPIacuteTULO 2





ndescription)

29










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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

43

Legend for figures




44




45



46




aminoantypirine

47





48







49





50


ix





aminophenol) 34



force microscopy35





4 Conclusion 37

Acknowledgments 37

References 38

x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








12























PyO

ALT

13
























14








condutores


DE BIOSSENSORES








15






















16

































17



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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





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(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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127 (2) 2004 496-497









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CAPIacuteTULO 2





ndescription)

29










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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







40












Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




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Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




44




45



46




aminoantypirine

47





48







49





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x

ABREVIATURAS



AA Ascorbic acid






Glu Glucose

Glut Glutamate







TPP Pyrophosphate

UA Uric acid



xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








12























PyO

ALT

13
























14








condutores


DE BIOSSENSORES








15






















16

































17



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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




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1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





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(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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127 (2) 2004 496-497









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CAPIacuteTULO 2





ndescription)

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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




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Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




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aminoantypirine

47





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xi






















aminoantypirine 46









xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























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TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























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similares








48]








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PyO

ALT

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condutores


DE BIOSSENSORES








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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














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7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











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1-6



46-58





2003 365-371



















1832

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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





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(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

31

1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













32











21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













33
























25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











37











activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




44




45



46




aminoantypirine

47





48







49





50


xii








1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























4












TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








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PyO

ALT

13
























14








condutores


DE BIOSSENSORES








15






















16

































17



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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














19

7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




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1-6











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1-6



46-58





2003 365-371



















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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





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(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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25 minutes






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at 8C














the redox probes



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microscopy
















(Fig 4)










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00003UL to 3UL











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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




42



Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



(2005) 99-107

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Legend for figures




44




45



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aminoantypirine

47





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49





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1







hepaacuteticas












2

CAPIacuteTULO 1


3





























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TOTAL

4225

751

1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















[26]

8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























10




analito [28]





























11
















similares








48]








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PyO

ALT

13
























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condutores


DE BIOSSENSORES








15






















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18

6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














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7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




39 2008 110-114




2008 1935-1944



1-6











21



1-6



46-58





2003 365-371



















1832

22








Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





23


(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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127 (2) 2004 496-497









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Chemistry 220(1) 1987 67-82





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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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25 minutes






34










at 8C














the redox probes



35




microscopy
















(Fig 4)










36

















00003UL to 3UL











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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







2928




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Acta 53 (2008) 6202-6208







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(2005) 99-107

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Legend for figures




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aminoantypirine

47





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2

CAPIacuteTULO 1


3





























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TOTAL

4225

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1778







(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















7






















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8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










9

























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analito [28]





























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similares








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PyO

ALT

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condutores


DE BIOSSENSORES








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6 OBJETIVOS

61 OBJETIVO GERAL














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7 REFEREcircNCIAS
















Acta 2008 397 82-86









2011

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Lab41(1)2005 29-36




20(4) 2008 275-279




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1-6



46-58





2003 365-371



















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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



2004 1-11





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(2) 200341-69



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2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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5520-5528











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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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at 8C














the redox probes



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microscopy
















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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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131ndash133






115 (1998) 1105-1110










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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







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Acta 53 (2008) 6202-6208







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Legend for figures




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aminoantypirine

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3





























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TOTAL

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(SIHSUS) [9]



5

































6













cronicamente [19]


















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8




















com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










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analito [28]





























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similares








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DE BIOSSENSORES








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Acta 2008 397 82-86









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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



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(2) 200341-69



256



1035


2008 606-623



Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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the redox probes



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microscopy
















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00003UL to 3UL











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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



38




References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













39


131ndash133






115 (1998) 1105-1110










(2008) 82ndash86







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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Mater Sci 42 (2007) 3238-3243







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Acta 53 (2008) 6202-6208







(2011) 3037ndash3043



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aminoantypirine

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TOTAL

4225

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1778







(SIHSUS) [9]



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cronicamente [19]


















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com essas vantagens

4 BIOSSENSORES










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similares








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PyO

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DE BIOSSENSORES








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Acta 2008 397 82-86









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46-58





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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






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2004 1-11





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(2) 200341-69



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Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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127 (2) 2004 496-497









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Abstract










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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




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22 Chemical













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the redox probes



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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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131ndash133






115 (1998) 1105-1110










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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



5528

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Acta 53 (2008) 6202-6208







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20(4) 2008 275-279




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46-58





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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






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2004 1-11





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(2) 200341-69



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Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











181

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5520-5528











127 (2) 2004 496-497









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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















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the redox probes



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Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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115 (1998) 1105-1110










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Biotechnol 42 (1995) 45-52



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Acta 53 (2008) 6202-6208







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Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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1 Introduction



















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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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1 Introduction



















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the redox probes



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activity

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Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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115 (1998) 1105-1110










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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



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Acta 53 (2008) 6202-6208







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20(4) 2008 275-279




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1-6











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2003 365-371



















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Polyhedron 27 (7) 2008 1860-1866












B102 2004179-194






364-369



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(2) 200341-69



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Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



25(6) 20021012-1021











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5946-4814-9904-C5946E01232683 Acesso em 17 maio 2011


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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










after 4 weeks)





poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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the redox probes



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microscopy
















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activity

4 Conclusion














Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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115 (1998) 1105-1110










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Biotechnol 42 (1995) 45-52



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aminoantypirine

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similares








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Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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115 (1998) 1105-1110










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Biotechnol 42 (1995) 45-52



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similares








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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















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21 Apparatus




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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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Acta 53 (2008) 6202-6208







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1 Introduction



















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References





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1 Introduction



















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References





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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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115 (1998) 1105-1110










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Chim Acta 353 (1997) 319-323








Biotechnol 42 (1995) 45-52



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Acta 53 (2008) 6202-6208







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Chimica Acta 335(3) 1996 239-243


Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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1 Introduction



















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activity

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Acknowledgments



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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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115 (1998) 1105-1110










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Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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1 Introduction



















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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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1 Introduction



















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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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References





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Chimica Acta 568(2) 2006 200-210



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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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Science432008 475-482




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CAPIacuteTULO 2





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Abstract










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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




SPM 9600)

22 Chemical













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the redox probes



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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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poly(4-aminophenol)

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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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21 Apparatus




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References





(2003) 365-371



20 (2005) 2140ndash2144













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1 Introduction



















960 ULminus1 [17]













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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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1 Introduction



















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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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1 Introduction



















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References





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References





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20 (2005) 2140ndash2144













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1 Introduction



















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References





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References





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References





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