Identificación del gen espumante FPG1 de Saccharomyces cerevisiae y su

importancia en la elaboración del vino

Lucía Blasco OteroGrupo de Biotecnología

Universidad de Santiago de Compostela

15 géneros levaduras: Brettanomyces y su equivalentesexual Dekkera, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces,Hanseniaspora y su equivalente sexual Kloeckera,Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, Rhodotorula,Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomycesy Zygosaccharomcyes

Saccharomyces cerevisiae

Gran eficiencia fermentativa Pie de cubaCultivos de levaduras, generalmente S. cerevisiae, que han sidoseleccionados por sus características y que permiten controlarlas fermentaciones y las características finales del producto.Selección y Mejora Genética

Fermentación del vino

Espuma

Carácter organoléptico importante en vinos espumosos Perjudicial: superproducción en fases tempranas de fermentación• Pérdida de mosto.• Reducción de la capacidad del tanque de fermentación.• Ralentización o detención total de la fermentación por pérdida

de azúcares.• Pérdida de higiene.• Compromete las operaciones de mantenimiento del tanque.

Solución:• Añadir antiespumantes.• Disminuir los niveles de O2 en los cultivos de levadura.• Uso de presión• Uso de levaduras no espumantes.

EspumaProteínas espumantes en el vino

Glicoproteínas dominantes en la espumaNaturaleza hidrofóbica

Formación y estabilización de la espuma

EspumaProteínas espumantes en el vino

Invertasa vacuolar de la uva

Enzima responsable de la conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa.Muy abundante, 9 % - 14 % contenido proteico total . N-glicoproteína, 65 KDa, pI 3.9, hidrofóbica.

Manoproteínas de las levaduras

Pared celular glucanasasFermentación

Envejecimiento vinos espumosos por autolisis

EspumaGenes espumantes de levaduras

FRO1, FRO2 (Thornton, 1978)

AWA1 (Shimoi et al., 2002)

Objetivos

•Identificación del gen responsable de la producción de espuma en una cepa vínica de Saccharomyces cerevisiae

• Obtención de una cepa de Saccharomyces cerevisiae no productora de espuma

Selección de cepas espumantes de S. cerevisiae

Cepa silvestre 145 de S. cerevisiae

36 cepas

Altura (cm)

Número de cepas

0-1 101-2 192-3 63-4 34+ 1145A211

Estudio y análisis del gen responsable del carácter espumante en la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae

Identificación y secuenciación del gen FPG1

2313 pb

FPG1 (Foam Promoting Gene)

Análisis de la secuencia de la proteína Fpg1p

770 aa, 72512.22 Da, pI 4.23

Análisis de homología

Análisis de homología

Localización cromosómica del gen FPG1

SC22 ∆ho SCH2 (fpg1::FPG1-loxPKanMXloxP)

SCH2 X CSH84L (cyh2 (VII), ade2 (XV))

VII

FPG1-loxPKanMXloxP

Localización cromosómica del gen FPG1

SCH2 X CSH84L (cyh2 (VII))CSH88L (leu1 (VII))

VII, -119 cM

Marcador Numero de ascas cMPD NPD T

KanMX-cyh2 11 3 26 55

KanMX-leu1 2 10 24 -

Estudio y análisis del gen responsable del carácter espumante en la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae

Delección del gen FPG1

145A211 DHA6C (fpg1::FPG1-loxPKanMXloxP/fpg1::FPG1-loxPKanMXloxP)

DHA2-16 fpg1∆

Fenotipo

A) Crecimiento a distintas temperaturas: 15ºC (a); 23ºC (b); 30ºC (c); 37ºC (d). B) Crecimiento en presencia de sorbitol. C) Crecimiento en presencia de CalcofluorWhite.

Fenotipo

Fenotipo

Fermentaciones

Cepa Vfi Vft Vfm Pf145A211 0,042 0,012 0,027 1,19DHA2-16 0,05 0,013 0,032 1,37

Fermentaciones

Cepa Vfi Vft Vfm Pf145A211 0,042 0,012 0,027 1,19DHA2-16 0,05 0,013 0,032 1,37

Extracción e identificación de Fpg1p

A) Proteína extraída con liticasa desde la pared celular (67 kDa). B) Proteína extraída por el método post-alcali (67KDa). C) Proteína glicosilada precipitada por el método de KDS-Acetona desde el sobrenadante de la fermentación (100 KDa). a: cepa 145A211; b: cepa DHA2-16.

Estudio de la implicación de la proteína Fpg1p en el fenotipo espumante

A)145A211 vs DHA2-16. B) MI2B-pYES2 vs MI2B-pYES2FPG1. C) Recuperación del fenotipo espumante: DHA2-16 ura- pYES2-FPG1 vs 145A211, DHA2-16.

• Búsqueda del gen FPG1 en distintas cepas vínicas

• Uso de la proteína Fpg1p en vinos espumosos

Futuro