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GUIA DE TRABALHOS LABORATORIAIS

DE

BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA MICROBIANA

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Ano Lectivo 2019/2020

Jorge H. Leitão Nuno P. Mira

(Área de Ciências Biológicas, DBE, IST)

1

ACTIVIDADE DE SUPERÓXIDO DISMUTASE E DE GLUCOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE EM Pseudomonas aeruginosa I – Introdução

A exposição celular a factores ambientais tais como valores extremos de

temperatura ou do pH, radiação ionizante, agentes químicos tóxicos, níveis

elevados de metais pesados e outras agressões, podem levar ao aparecimento

intracelular de espécies moleculares altamente reactivas contendo oxigénio,

capazes de causar danos à célula, fenómeno conhecido por stress oxidativo

(Scandalios, 1993). Algumas espécies moleculares altamente reactivas (radicais

livres) podem ainda resultar de processos metabólicos como por exemplo a

respiração aeróbia.

Fig. 1 – Factores iniciadores da formação de espécies radicalares contendo O2 e

consequentes efeitos celulares.

Quando sujeita à acção negativa de radicais livres, a célula tem que

desenvolver mecanismos que lhe permitam, de algum modo, combater essa

acção. Ao longo da evolução, numerosos mecanismos de defesa foram surgindo,

Idade

Metabolitos

Radiação

Compostos

químicos/ Poluentes

Aparecimento na célula

de radicais livres

contendo oxigénio

Lípidos

Proteínas

Ácidos nucleicos

Desorganização celular

Perda da função dos organelos

Redução da eficiência metabólica

Mutação

MORTE CELULAR

Iniciadores Efeitos moleculares

Efeitos celulares

2

entre eles mecanismos enzimáticos capazes de remover, neutralizar ou quelatar

radicais livres e intermediários oxidantes (Scandalios, 1993).

Uma das espécies radicalares contendo oxigénio é o radical anião

superóxido, capaz de inactivar muitas enzimas essenciais à célula. Esta espécie

pode ser rapidamente convertida em peróxido de hidrogénio1 e oxigénio molecular

por acção da enzima superóxido dismutase (SOD) (Fridovich, 1986; Hassett et al.,

1995) (equação 1). A enzima SOD, pela primeira vez isolada a partir de sangue de

bovino, pode ser encontrada em organismos aeróbios, anaeróbios facultativos e

anaeróbios obrigatórios (Fridovich, 1986). Todas as SODs conhecidas são

metaloenzimas multiméricas, distinguindo-se 3 tipos com base no ião metálico que

apresentam no seu centro activo: Mn-SOD, Fe-SOD e Cu/Zn-SOD.

O2.- + O2

.- + 2H+ H2O2 + O2 (1)

Outra actividade enzimática envolvida na resposta celular ao stress oxidativo

é a actividade de glucose-6-fosfato desidrogenase, importante para a manutenção

de níveis intracelulares adequados de NADH (equação 2).

G-6-P + NADP+ NADPH + 6-Fosfogluconato (2)

No presente trabalho serão determinadas as actividades específicas de SOD e de

glucose-6-fosfato desidrogenase, presentes em extractos não purificados

preparados a partir de células de variantes mucosas de Pseudomonas aeruginosa

8821M, crescidas na ausência ou na presença de 2,5 mM de CuCl2. As variantes

mucosas de P. aeruginosa apenas ocorrem em estreita associação com infecções

respiratórias crónicas de doentes com Fibrose Quística, a doença genética mais

comum na raça caucasiana (Govan e Deretic, 1996), sendo razoavelmente

conhecidos os mecanismos moleculares subjacentes à conversão da forma não

mucosa (a habitualmente encontrada na natureza) à forma mucosa

(exclusivamente isolada de secreções de doentes com FQ cronicamente

infectados), produtora de grandes quantidades do exopolissacárido aniónico

alginato (Govan e Deretic, 1996).

1 O peróxido de hidrogénio é decomposto em água e O2, por acção das actividades

enzimáticas catalase ou peroxidase, também estas envolvidas na defesa ao stress oxidativo.

3

II - Parte Experimental

- Introdução

Para a realização do presente trabalho experimental serão fornecidas

suspensões celulares congeladas de P. aeruginosa 8821M (variante altamente

mucosa produtora do exopolisaccárido alginato) (Alves et al., 1991). Estas

suspensões foram previamente preparadas a partir de culturas efectuadas em

meio LBS1 contendo ou não 2,5 mM CuCl2. As células de P. aeruginosa 8821M

foram recolhidas na fase exponencial de crescimento (DO640 = 1,0).

As suspensões celulares serão sujeitas a sonicação para libertação de

enzimas intracelulares. Os sobrenadantes obtidos após centrifugação das

suspensões sonicadas serão utilizados para determinação espectrofotométrica das

actividades enzimáticas de superóxido dismutase (SOD) e de glucose-6-fosfato

desidrogenase.

A actividade total de SOD será determinada com base na inibição da auto-

oxidação do pirogalol pela SOD. O pirogalol sofre auto-oxidação rápida

especialmente em soluções alcalinas, para valores de pH próximos de 8. A

reacção pode ser inibida em 99% pela enzima SOD, o que indica uma

dependência quase total da participação do radical superóxido O2 na reacção

(Marklund e Marklund, 1974). A reacção de auto-oxidação do pirogalol poderá ser

seguida espectrofotometricamente a 420 nm. As medições serão efectuadas

seguindo a evolução da Abs420 durante 3 minutos. Uma unidade de actividade

enzimática (1U) de SOD é definida como a quantidade de enzima capaz de inibir

em 50% a velocidade de auto-oxidação do pirogalol nas condições usadas.

A actividade de glucose-6-fosfato desidrogenase será determinada segundo

o método descrito por Lee et al. (1993), baseado na seguinte reacção:

NADP+ + G-6-P NADPH + 6-fosfogluconato (1)

1 O meio LBS consiste em meio LB suplementado com 10 g/l de glucose, 0,5 mM MgCl2 e

0,5 mM MnCl2.

G6P dh

4

Neste método o NADP é reduzido pela glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P dh),

formando-se NADPH que pode ser quantificado espectrofotometricamente a 340

nm. A enzima também é capaz de usar como co-fator o NAD+.

A actividade total de glucose-6-fosfato desidrogenase é calculada definindo uma

unidade de actividade enzimática (1 U) como a quantidade de enzima capaz de

formar 1 µmol de NADPH por minuto, nas condições usadas. A conversão do

aumento de absorvância a 340 nm para moles de NADPH formadas é efectuada

com base no coeficiente de extinção molar (340 = 6220 M-1 cm-1).

Os extractos celulares serão ainda sujeitos a fraccionamento electroforético

em gel nativo de poliacrilamida e os géis obtidos serão tratados de modo a

visualizar no gel nativo as actividades de SOD dependentes de Fe e/ou de Mn

(Clare et al., 1984), indistinguíveis espectrofotometricamente.

5

- Procedimento experimental

A. Preparação dos extractos celulares

1. Descongelar as suspensões celulares fornecidas de P. aeruginosa 8821M.

2. Proceder à desintegração celular por sonicação, aplicando a cada amostra 3

ciclos de sonicação de 30 segundos esperando 1 minuto entre cada ciclo.

Manter sempre a amostra no gelo, mesmo durante a sonicação.

3. Centrifugar as amostras 45 minutos a 15000 rpm (centrífuga refrigerada 2K 15,

rotor 12141).

4. Recolher cuidadosamente os sobrenadantes para tubos limpos, tendo o

cuidado de não perturbar os sedimentos.

5. Manter as amostras no gelo.

B. Determinação da concentração proteíca nos extractos celulares (Bradford,

1976)

1. Diluir os extractos de forma a obter soluções contendo entre 100 e 500 µg/ml

de proteína total.

2. Em tubos de ensaio de vidro adicionar 2,5 ml de reagente de Coomassie a 50

µl de extracto diluido. Efetuar ensaios em triplicado.

3. Agitar vigorosamente em vórtex e esperar cerca de 15 min.

4. Proceder à leitura da absorvância das soluções a 595 nm, das soluções

preparadas em 3., tendo o cuidado de calibrar previamente o

espectrofotómetro preparando um branco em que o volume de amostra a

analisar é substituido por água destilada.

5. Com base na recta de calibração fornecida, que relaciona a absorvância a 595

nm com a concentração de proteína, calcular a concentração de proteína nos

extractos.

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C. Determinação espectrofotométrica das actividades de SOD e glucose-6-fosfato

desidrogenase

A actividade de SOD será determinada segundo o método de Marklund e Marklund

(1974). Neste método é determinada a redução da velocidade de auto-oxidação do

pirogalol a 25°C, devida à actividade de SOD, que se traduz numa redução da

variação de absorvância a 420 nm. A actividade de glucose-6-fosfato

desidrogenase será determinada usando o método descrito por Lee et al. (1993).

C1 - Determinação da velocidade de auto-oxidação do pirogalol

Em cuvettes de 1 ml adicionar:

- 990 µl de tampão Tris.Cl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2

- 10 µl de solução de pirogalol 10 mM em HCl 10 mM

Registar o aumento da absorvância a 420 nm durante três minutos.

Obter 3 registos independentes de modo a calcular a velocidade média de

auto-oxidação do pirogalol nas condições experimentais usadas.

C2 - Determinação da actividade total de SOD presente nos extractos

Em cuvettes de 1 ml adicionar:

- 970 µl de tampão Tris Cl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2

- 20 µl de extrato celular

- 10 µl de pirogalol

Registar a absorvância a 420 nm durante 3 min. Ajustar o volume de

extracto ou pirogalol caso necessário.

Repetir o processo de modo a obter resultados em triplicado para cada

extracto a analisar.

7

C3 - Determinação da actividade de glucose-6-fosfato desidrogenase

Às duas células espectrofotométricas (reaccional e de referência) adicionar:

- 500 µl de tampão Tris 100 mM pH 7,5

- 200 µl MgCl2 25 mM

- 100 µl de NADP 5 mM

- 100 µl de extrato celular

- À célula reaccional adicionar ainda 100 µl de uma solução de glucose-

6-fosfato 10 mM que na célula de referência são substituídos por água

destilada, de forma a descontar a actividade endógena dos extractos.

Registar os valores de absorvância a 340 nm durante 2,5 minutos num

espectrofotómetro de feixe duplo. Efectuar pelo menos, 3 determinações

independentes.

8

D. Visualização das actividades enzimáticas de SOD em gel nativo de

poliacrilamida

Tendo como objectivo esclarecer o efeito da presença no meio de cultura do ião

Cu2+ na actividade das enzimas Mn-SOD e Fe-SOD, os extractos celulares

preparados como descrito em A. serão sujeitas a electroforese em gel nativo de

poliacrilamida, procedendo-se de seguida à detecção, no gel, das actividades

enzimáticas das duas enzimas. A distinção entre as formas de SOD dependentes

de Mn e Fe será efectuada com base na inibição da Fe-SOD pelo peróxido de

hidrogénio (Clare et al., 1984).

O fraccionamento electroforético dos extractos será efectuado em gel nativo de

poliacrilamida, usando um gel de separação de 10% (p/v) e um gel de

concentração de 4% (p/v), obtidos como indicado na tabela 1.

Tabela 1 - Composição do gel de separação e do gel de concentração

REAGENTES GEL DE SEPARAÇÃO GEL DE CONCENTRAÇÃO

Acrilamida 30%(p/v) 5,3 ml 0,85 ml

Tris 947 mM HCl 0,289 N, pH 8,5

4 ml -------------

Tris 158 mM Ácido fosfórico 0,256 N

pH 7,5

------------- 2 ml

Água destilada 6,5 ml 5,0 ml

TEMED 12,8 µl 2,5 µl

APS 10% (p/v) 112 µl 112 µl

Abreviaturas: TEMED, N, N, N', N'-tetrametiletilenodiamina, APS, Persulfato de amónio

A solução aquosa de persulfato de amónio 10% (p/v) é preparada imediatamente

antes de usar.

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D1 – Preparação do gel

Após montagem do aparelho de electroforese a usar (Hoeffer), verter a mistura

para o gel de separação no molde. Adicionar à parte superior da mistura cerca de

1 mm de altura de isopropanol (o oxigénio inibe a reacção de polimerização). Após

polimerização da acrilamida (cerca de 15 minutos) remover a água e verter a

mistura para o gel de concentração no molde.

Colocar o molde na tina de electroforese que contém o tampão de corrida para a

parte inferior, "lower tank buffer" (Tris 63 mM, HCl 50 mM, pH 7,5). Colocar na

parte superior o "upper tank buffer" (Tris 37,5 mM, glicina 40 mM, pH 8,9).

Colocar nos poços do gel alíquotas dos extractos celulares a analisar contendo 50

µg de proteína total [determinados com base no método de Bradford (1976), ponto

B.], às quais se adicionou 5 µl de corante de aplicação (50% p/v de sacarose,

0,1% p/v de azul de bromofenol). Carregar 2 géis em duplicado. Submeter os géis

a electroforese durante cerca de 1 hora a 100 V.

D2 – Visualização das actividades de Mn- e Fe-SOD

Mergulhar um dos géis em solução aquosa de NBT (Nitro Blue Tetrazolium,

Sigma) 2,5 mM durante 20 minutos, à temperatura ambiente e no escuro e o outro

em idênticas condições adicionando peróxido de hidrogénio à solução de NBT de

modo a obter uma concentração final de H2O2 3 mM.

Substituir a solução de NBT por solução de revelação (fosfato de potássio 36 mM,

TEMED 2,8 mM, riboflavina 2,8x10-5 M, pH 7,8). Manter o gel no escuro durante

mais 20 minutos.

Remover a solução de revelação e irradiar com luz visível (lâmpada de 60 W) até

ao aparecimento de bandas acromáticas nos géis que entretanto se tornaram

roxos (Clare et al., 1984). Durante o tempo em que o gel está exposto à luz ocorre

redução fotoquímica da riboflavina que por sua vez reduz o dioxigénio (O2) ao

anião superóxido (O2-) o qual reduz o NBT originando um composto de cor roxa.

Nos locais do gel onde se encontra a actividade de SOD esta inactiva os radicais

O2- levando ao aparecimento de bandas acromáticas num gel roxo. Guardar o gel

em ácido acético 7,5% (v/v) até ser fotografado.

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REFERÊNCIAS

Alves, MJ, et al. Temperature profiles and alginate synthesis in mucoid and non-mucoid

variants of Pseudomonas aeruginosa. Letters in Applied Microbiology 12, 244-248,

1991.

Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254,

1976.

Clare, DA et al. Effects of molecular oxygen on the detection of superoxide radical with

nitroblue tetrazolium and an activity stain for catalase. Analytical Biochemistry 140, 532-

537, 1984.

Fridovich, I. Superoxide dismutases. Advances in Enzymology 58, 62-97, 1986.

Govan, JRW, and Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid

Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews 60, 539-

574, 1996.

Hassett, DJ et al. Pseudomonas aeruginosa sodA and sodB mutants defective in

manganese- and iron-cofactored superoxide dismutase activity demonstrate the importance

of the iron-cofactored form in aerobic metabolism. Journal of Bacteriology 177, 6330-

6337, 1995.

Lee, J.-S., Y.-C. Hah, J.-H. Roe. The induction of oxidative stress in Streptomyces

coelicolor upon hydrogen peroxide treatment. Journal of General Microbiology 139,

1013-1018, 1993.

Marklund, S, and Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the

autooxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. European

Journal of Biochemistry 47, 469-474, 1974.

Perry, ACF, et al. Molecular characterization of the gor gene encoding glutathione

reductase from Pseudomonas aeruginosa. Determinants of substrate specificity among

pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductases. Molecular Microbiology 5, 163-171, 1991.

Scandalios, JG. Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology 101, 7-12,

1993.

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TP2. PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE

GRUPOS ACILO, Acp, DE Burkholderia cepacia J2315

1 – Introdução

A biossíntese de ácidos gordos tem sido intensivamente estudada em eucariontes

e procariontes. Em eucariontes e em micobactérias, as actividades enzimáticas

envolvidas nos vários passos da biossíntese de ácidos gordos encontram-se todas

juntas num complexo multienzimático, dizendo-se que a síntese é do tipo I. Em

procariontes, a biossíntese é dita do tipo II ou dissociada, pois é conduzida de

forma dissociada por cada um dos enzimas intervenientes.

O acetil-CoA é o precursor dos ácidos gordos. Em procariotas e eucariotas, a

proteína Acp (acyl carrier protein) desempenha um papel fundamental na

biossíntese de ácidos gordos, encontrando-se os intermediários da via

normalmente ligados a esta proteína.

No presente trabalho irá ser usada a proteína Acp de Burkholderia cenocepacia.

Esta espécie bacteriana pertence ao complexo Burkholderia cepacia, um conjunto

de 17 espécies muito próximas, contendo patogénios oportunistas capazes de

causar infecções respiratórias graves, particularmente em doentes com fibrose

quística (Mahenthiralingam et al., 2005; Richau et al., 2000; Leitão et al., 2010).

O gene que codifica a proteína Acp foi identificado usando uma estratégia que

envolveu a preparação de uma colecção de mutantes de B. cenocepacia J2315

por mutagénese aleatória com o plasposão pTnModOCm (Dennis and Zylstra,

1989), seguida da selecção de mutantes atenuados na sua virulência para o

nemátodo Caenorhabditis elegans (Sousa et al., 2008). Uma estratégia similar

permitiu anteriormente identificar um agrupamento de genes envolvidos na

biossíntese de exopolissacárido por bactérias do complexo Burkholderia cepacia

(Moreira et al., 2003). A digestão do DNA total do mutante B. cenocepacia SJ1

com a enzima de restrição BamHI, seguida de auto-ligação e transformação em

Escherichia coli, permitiu obter um plasmídeo recombinante contendo DNA de B.

cenocepacia J2315, cuja sequenciação revelou que o plasposão tinha

interrompido o gene acp pertencente à organização genética representada na Fig.

1. Os genes fabF, fabG, fabD e fabH codificam actividades enzimáticas de -

cetoacil-Acp sintase II, -cetoacil-ACP redutase, malonil-CoA-Acp transacilase, e

-cetoacil Acp sintase III, respectivamente. Embora não seja totalmente conhecido

12

o papel do gene plsX, pensa-se que tem um papel no metabolismo do 1-

acilglicerol-3-fosfato e, muito possivelmente, na regulação da concentração

intracelular de acil-Acp.

Fig 1 –Organização genética do agrupamento de genes fab (fatty acid biosynthesis) em B.

cenocepacia J2315. A bandeira colocada por cima do gene acp (a negro) indica a posição do

plasposão a interromper o gene acp. Adaptado de Sousa et al. (2008).

Em bactérias gram-negativas, as proteínas Acp e os seus intermediários acilados

participam ainda na síntese de ácidos gordos -hidroxilados e na síntese das

moléculas-sinal usadas em sistemas de quorum-sensing, as acilhomosserina

lactonas. A proteína Acp de B. cenocepacia é 73% identica à proteína Acp de E.

coli, mostrando-se na Fig. 2 a similaridade entre a estrutura prevista para a

proteína Acp de B. cenocepacia e a estrutura, determinada experimentalmente, da

proteína Acp de E. coli.

Fig. 2 – Estrutura das proteínas Acp de E. coli (A) e de B. cenocepacia J2315 (B). Adaptado de

Sousa et al. (2008).

No presente trabalho experimental, pretende-se purificar a proteína Acp

recombinada, contendo 6 histidinas adicionais (cauda de histidinas) na região C-

terminal. Para tal, a proteína será sobre-expressa em E. coli e purificada por

cromatografia de afinidade. Será posteriormente comprovada a sua identidade por

AA

α1

C

N

α3

α2

α4 BB

α1

C N

α3

α2

α4

α3

plsX fabH fabF acp fabG fabD

13

recurso a hibridação de western usando um anticorpo específico para a cauda de

histidinas.

2- Procedimento experimental:

a) Sobre-expressão da proteína Acp em E. coli

1- Inocular a estirpe E. coli BL21-DE3(pSAS6) em 20 ml de meio LB

suplementado com o antibiótico ampicilina (150 mg/ml).

2- Incubar 2 a 3 horas a 37ºC com agitação de 250 rpm.

3- Medir a D.O. (640 nm) dos pré-inóculos.

4- A partir dessas culturas inocular 100 ml de meio SB contendo Ampicilina

(conc 150 mg/mL) (Anexo), contendo ampicilina, de forma a que a D.O.

inicial seja de 0,1.

5- Deixar crescer a cultura a 37ºC até que a D.O. seja de 0,5

(aproximadamente 1-1.5h). Retirar uma amostra de cada cultura (volume

equivalente a 1,2/D.O. da cultura), centrifugar e ressuspender as células em

80 l de tampão de aplicação em SDS-PAGE. Colocar as amostras no gelo.

6- Induzir adicionando 0,4 mM de IPTG (isopropil--D-tiogalactósido).

7- Deixar crescer 2 h nas mesmas condições e findo este tempo retirar

igualmente amostras das culturas induzidas (volume equivalente a 1,2/D.O.),

centrifugar e ressuspender as células em 80 l de tampão de aplicação em

SDS-PAGE. Ferver todas as amostras durante 5 min e guardar a –20ºC até

posterior utilização.

8- Recolher a cultura de E. coli BL21-DE3(pSAS6), centrifugando-a 5 min a

7000 rpm (4ºC). Ressuspender o sedimento celular em 4 ml de tampão I

(tabela I), transferir para um tubo apropriado e congelar a –80ºC.

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b) Lise das células por recurso a ultrassons e purificação da proteína

recombinante por cromatografia de afinidade

1- A lise celular é efectuada por uso de ultrassons (sonicador Branson Sonifier

250). Após descongelação, o tubo contendo as células é mantido em gelo e

estas são sujeitas a 3 sonicações a 70Watts de 30s cada, intervalando cerca

de 1 min entre cada sonicação.

2- A amostra proteica é de seguida centrifugada durante 45 min a 15000 rpm e

a 4ºC. O sobrenadante é transferido para novo tubo e guardado no gelo até

se iniciar a purificação.

3- Preparar a coluna HisTrap (Amersham). Usando uma seringa, lavar a coluna

com 5 ml de água destilada, tendo o cuidado de não formar bolhas de ar.

4- Aplicar 0,5 ml de solução de NiCl2 0,1M e equilibrar de seguida a coluna com

10 ml de tampão I.

5- Aplicar a amostra proteica na coluna com a seringa e recolher o eluído.

6- Lavar a coluna com 5 ml de tampão I.

7- Aplicar 5 ml de tampão II e recolher o eluído em três fracções de 1 ml.

8- Repetir o passo 7, mas utilizando os tampões III e IV (Tabela I).

Tabela I- Soluções tampão usadas durante a purificação da proteína His-Acp.

Tampão Concentração de

Imidazole (mM)

Tampão fosfato

8x (pH 7.4)

Imidazole 2M

(pH7.4)

Água destilada

I 10 3,0 ml 0,12 ml 20,88 ml

II 50 1,0 ml 0,20 ml 6,8 ml

III 100 1,0 ml 0,40 ml 6,6 ml

IV 200 1,0 ml 0,80 ml 6,2 ml

Tampão fosfato 8x (8mM tampão fosfato; 0,4M NaCl, pH 7,4)

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c) Separação electroforética de proteínas por SDS-PAGE

1- Preparar o sistema para fazer o gel.

2- Preparar o gel de resolução (12,5% de acrilamida), juntando:

-1,25 ml de solução I (Tabela II)

-2,08 ml de solução de acrilamida

-1,64 ml de água destilada

-8 l de TEMED

-33 l de persulfato de amónia 10%

Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a solução entre as placas

de vidro e silica até uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma

camada de 1 ml de isopropanol de forma a obter uma superfície plana.

Deixar polimerizar.

3- Após polimerização remover o isopropanol com papel absorvente.

4- Preparar o gel de concentração (6% de acrilamida) juntando:

-0,4 ml de solução II (Tabela II)

-0,4 ml de solução de acrilamida

-1,2 ml de água destilada

-4 l de TEMED

-12 l de persulfato de amónia 10%

Misturar cuidadosamente, encher as placas com esta solução e colocar o

pente. Deixar polimerizar.

5- Montar o sistema de electroforese e preencher os tanques com tampão de

electroforese 1x (Tabela II)

6- Preparar as amostras para aplicação no gel, juntando 10 g (20 l) de cada

uma das fracções de purificação com 5 l de tampão da amostra. Ferver

durante 5 min.

7- Proceder à electroforese aplicando uma voltagem constante de 150 volts,

durante 1h.

8- Colocar o gel na solução corante.

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Tabela II- Soluções usadas para a electroforese de proteínas em gel de

poliacrilamida em condições desnaturantes.

SOLUÇÃO REAGENTES OBSERVAÇÕES

Tampão do gel de resolução (I) 1.5 M Tris base

0,4% SDS

pH 8,8-9,0

Tampão do gel de

concentração (II)

0,5 M Tris base

0,4% SDS

pH 6,6-6,8

Solução de acrilamida

(bisacrilamida)

30% acrilamida

0,8% bisacrilamida

Tampão de electroforese Tris-

Glicina 10x

0,25 M Tris base

1,92 M glicina

1% SDS

pH 6,6-6,8

Diluir 1:10 antes de usar

Tampão de aplicação em SDS-

PAGE

20% glicerol

4% SDS

100 mM Tris.Cl pH 6,8

0,2% azul de bromofenol

200 mM DTT

Solução corante 2 g Coomassie blue R-250

100 ml ácido acético

475 ml etanol

425 lm água

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d) Transferência de proteínas para uma membrana (western blot)

1 – Após separação electroforética, mergulhar cuidadosamente o gel em tampão

Towbin durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.

2- Preparar uma membrana de nitrocelulose (55 mm X 85 mm) e 6 folhas de papel

Whatman 3MM de igual dimensão e mergulhar em tampão Towbin durante 5

minutos.

3- Remover o gel de concentração e colocar o gel invertido sobre uma placa de

vidro, tendo o cuidado de o manter molhado com solução tampão. Colocar a

membrana por cima do gel e sobre aquela colocar 3 folhas de papel Whatman.

Remover as bolhas de ar.

4- Voltar o o conjunto, remover a placa de vidro e colocar por cima do gel 3 folhas

de papel Whatman, tendo o cuidado de remover eventuais bolhas de ar.

5 – Colocar o conjunto no aparelho Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BIO-

RAD). Remover o excesso de líquido. Efectuar a transferência durante 50 minutos a

15 volts, 250 mA.

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f) Detecção imunológica

1 – Após a transferência das proteinas para a membrana, recolher a membrana e

incubá-la durante 1 hora com 40 ml de solução de bloqueio (tampão PBS contendo

5% de leite magro em pó) à temperatura ambiente com agitação suave.

2 – Lavar a membrana 3X 5 minutos com tampão PBS contendo 0,05% Tween 20

(25 mL)

3 – Incubar durante 1 hora com agitação suave a membrana com 20 mL anticorpo

com monoclonal de rato anti- poli-histidinas conjugado com peroxidase (His-1,

Sigma-Aldrich), diluido 1:2000 em PBS 1X contendo 0,05% de Tween 20 e 0.2 g de

BSA.

4- Lavar 3 vezes (5 minutos cada) com 25 mL PBS contendo 0,05% Tween 20, de

forma a remover o excesso de anticorpo.

5 - Deixar escorrer o líquido e colocar a membrana sobre uma película de filme

aderente, com a face contendo a proteína virada para cima.

6 – Adicionar H2O2 (50 L por cada 10 mL) à solução 2 do ECL (composição 30%

H2O2 e Tris-HCl 1 M)

7 – Misturar 1 mL da solução 1 do ECL (composição 250 mM luminol; 100 mM p-

coumaric acid; 1M Tris HCl) com 1 mL da solução 2 do ECL e espalhar com cuidado

por cima da membrana. Esperar 3 minutos para corar.

8 – Ligar a câmara de detecção do sinal e monitorizar a reacção. Parar quando

apropriado.

g) Purificação da proteína Acp produzida em E. coli através de FPLC

Nesta fase do procedimento experimental iremos proceder à purificação da

proteína Acp usando colunas His-Trap mas recorrendo à utilização de um

cromatógrafo, procedimento que é vulgarmente conhecido como Fast Protein

Liquid Chromatography (FPLC). Para tal vamos recorrer a um AKTA Prime.

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1) Ligar o equipamento e conectar ao computador. Escolher a opção

Manual Run para controlar o equipamento nesta fase.

2) Passar 5 mL de água no equipamento.

3) Colocar a coluna His-Trap enroscando os dois fios.

4) Iniciar o procedimento de equilíbrio da coluna. Para tal começar por

passar 5 mL de H2O destilada e depois 8 mL de solução de tampão

START (composição idêntica à solução tampão I)(Fluxo: 1 mL/min)

5) Colocar cerca de 30 eppendorfs no suporte (será onde vão ser

recolhidas as fracções)

6) Abrir o software de apoio e abrir o método selecionado. Dar inicio ao

método (poderá ser reajustado o passo de equilíbrio).

7) Quando pedido pelo software, aplicar 1 mL de amostra usando uma

seringa de igual volume. Para aplicar a amostra mudar a posição do

cursor de aplicação para “Load Sample”. Quando estiver concluída a

injecção voltar a mudar o cursor de aplicação após pedido do sistema.

8) Modificar o fluxo do sistema de forma a canalizar a entrega nos

eppendorfs após a injecção da amostra.

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9) Referências

Mahenthiralingam, E., T.A. Urban, J. Goldberg (2005). The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nature Reviews Microbiology 3 144-156. Moreira, L.M., P.A. Videira, S.A. Sousa, J.H. Leitão, M.V. Cunha, I. Sá-Correia (2003). Identification and physical organization of the gene cluster involved in the biosynthesis of Burkholderia cepacia complex exopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications 312, 323-333. Leitão, J.H., S.A. Sousa, A.S. Ferreira, C.G. Ramos, I.N. Silva, L.M. Moreira (2010). Pathogenicity, virulence factors, and strategies to fight against Burkholderia cepacia complex pathogens and related species. Applied Microbiology and Biotechnology 87, 31-40. Richau, J. A., J.H. Leitão, M. Correia, L. Lito, M.J. Salgado, C. Barreto, P. Cescutti, I. Sá-Correia, (2000). Molecular typing and exopolysaccharide biosynthesis of Burkholderia cepacia isolates from a Portuguese cystic fibrosis center. Journal of Clinical Microbiology 38 1651-1655. Sousa, SA, C. G. Ramos, F. Almeida, L. Meirinhos-Soares, J. Wopperer, S. Schwager, L. Eberl, J. H. Leitão (2008). Burkholderia cenocepacia J2315 acyl carrier protein: a potential target for antimicrobials´ development?. Microbial Pathogenesis 45 331-336.

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ANEXO

MEIO SB: 32g/l de triptona; 20 g/l de extracto de levedura; 5 g/l de NaCl. Adicionar

água e ajustar pH o 7,5. Esterilizar em autoclave.

MARCADOR DE PESOS MOLECULARES PARA PROTEÍNAS LMW (BioRad) 97,0; 66,0; 45,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa Tampão Towbin: 48 mM Tris-base; 39 mM glicina; 0,04% (p/v) SDS; 20% metanol,

pH 8,2 – 8,4.

Tampão PBS 10X : 1,4 M NaCl; 27 mM KCl; 10 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4; pH

7,4.