DÉBORA NUNES MARTINS BUENO Conexões aferentes e …
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DÉBORA NUNES MARTINS BUENO “Conexões aferentes e eferentes do núcleo interpeduncular com enfoque especial para os circuitos entre a habênula, o núcleo interpeduncular e os núcleos da rafe” Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Humana do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutora em Ciências. São Paulo 2018
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DÉBORA NUNES MARTINS BUENO
“Conexões aferentes e eferentes do núcleo interpeduncular com
enfoque especial para os circuitos entre a habênula, o núcleo
interpeduncular e os núcleos da rafe”
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Humana do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de
Doutora em Ciências.
São Paulo
2018
DÉBORA NUNES MARTINS BUENO
“Conexões aferentes e eferentes do núcleo interpeduncular com
enfoque especial para os circuitos entre a habênula, o núcleo
interpeduncular e os núcleos da rafe”
Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Humana do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de
Doutora em Ciências.
Área de concentração: Fisiologia Humana
Orientador: Prof. Dr. Martin Andreas Metzger
Versão Original
São Paulo
2018
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Candidato(a): Débora Nunes Martins Bueno Título da Tese: Conexões aferentes e eferentes do núcleo interpeduncular com enfoque especial para os circuitos entre a habênula, o núcleo interpeduncular e os núcleos da rafe Orientador: Martin Andreas Metzger A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado/Tese de
Doutorado, em sessão pública realizada a ........./......../.........., considerou o(a) candidato(a):
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Presidente: Assinatura: ...............................................................................
Nome: ......................................................................................
Instituição: ................................................................................
Dedico este trabalho ao meu amado esposo
AGRADECIMENTOS
Inicialmente agradeço ao meu orientador Martin, por ter me acolhido no laboratório, pela
confiança e pelo ensinamento.
Agradeço também ao José Donato, pela oportunidade de trabalhar em alguns de seus projetos.
Aos colegas do Laboratório de Neuroanatomia Funcional, que compartilharam o
conhecimento de técnicas para a realização de muitas etapas deste trabalho, muito obrigada a
todos vocês pelo profissionalismo e em alguns momentos o companheirismo.
À Aninha, pelo carinho, por sua dedicação a todo momento, pelo apoio e incentivo antes de
iniciar e durante a minha trajetória na pós-graduação.
Aos professores da Banca de Qualificação, Newton, Thiago e Tatiana pelas valiosas
contribuições que enriqueceram este trabalho.
Ao meu amado esposo, meu companheiro e melhor amigo que esteve ao meu lado a todo o
momento me motivando e logo teremos a alegria de compartilhar nosso amor pela nossa
pequena Pandora. Deus me abençoou muito ao colocar você em minha vida.
À minha querida e amada mãe, meu exemplo de superação, crescimento e sucesso. Sou
eternamente grata a você pelo amor incondicional de pai e mãe, por me incentivar a crescer e
por sempre ter acreditado que eu alcançaria os meus sonhos.
Aos meus irmãos Raquel e Gustavo, sem vocês na minha vida nada teria graça, obrigada por
estarem sempre ao meu lado, mesmo longe estamos perto.
Às minhas tias e primos que mesmo longe conseguimos ficar em dia com as mensagens do
grupo de zapzap. Vocês são muito importantes para mim!
Aos meus sobrinhos Bruna, Eloísa, Elena, Maria Eduarda, Antônio Henrique, Augusto,
Benjamin e minha afilhadinha Helena, amo muito vocês e sempre morro de saudade, obrigada
por me fazerem tão feliz!
À minha segunda família, meu presente de casamento, sou muito grata a vocês pelo carinho e
pelas orações.
À Deus agradeço todos os dias por ter me escolhido para a vida. Pois mesmo a vida com
tantas tribulações, esforços, cansaço ainda assim sigo na vida encontrando alegria, pois quem
é meu escudo e onde deposito minha alegria em viver é Nele. “Ele é o meu Deus, o meu
refúgio, a minha fortaleza, e Nele confiarei” Sl 91:2.
À CAPES e FAPESP pelo auxílio financeiro, a todos que contribuíram direta ou indiretamente
para a realização deste trabalho.
Muito obrigada a todos!
RESUMO
Bueno, DNM. Conexões aferentes e eferentes do núcleo interpeduncular com enfoque
especial para os circuitos entre a habênula, o núcleo interpeduncular e os núcleos da
rafe. 2018. 92 f. Tese (Doutorado em Ciências). Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018.
A habênula é uma estrutura epitalâmica diferenciada em dois complexos nucleares, a
habênula medial (MHb) e a habênula lateral (LHb). Recentemente, a MHb junto com seu alvo
principal, o núcleo interpeduncular (IP), foram identificados como estruturas chaves
envolvidas na mediação dos efeitos aversivos da nicotina. Contudo, estruturas intimamente
interligadas com o eixo MHb-IP, como o núcleo mediano (MnR), a parte caudal do núcleo
dorsal da rafe (DRC), e o núcleo tegmental laterodorsal (LDTg) podem contribuir para os
efeitos comportamentais da nicotina. As conexões aferentes e eferentes do IP, até agora, não
foram sistematicamente investigadas com traçadores sensíveis. Assim, realizamos injeções de
traçadores retrógrados ou anterógrados em diferentes subdivisões do IP, no MnR, ou LDTg e
também examinamos a assinatura neuroquímica de algumas das mais proeminentes aferências
dessas três estruturas através da combinação de rastreamento retrógrada com métodos de
imunofluorescência e hibridização in situ. Além de receber entradas topograficamente
organizadas da MHb e também da LHb, observamos que o IP está principalmente interligado
de forma recíproca com estruturas da linha média, incluindo o MnR/DRC, o núcleo incerto, o
núcleo supramamilar, o septo e o LDTg. As conexões bidirecionais entre o IP e o MnR assim
como as entradas do LDTg para o IP provaram de ser principalmente GABAérgicas. Com
respeito a uma possível topografia das saídas do IP, todos os subnúcleos do IP deram origem a
projeções descendentes, enquanto as suas projeções ascendentes, incluindo projeções focais
para o hipocampo ventral, o septo ventrolateral, e a LHb originaram da região dorsocaudal do
IP. Nossos resultados indicam que o IP está intimamente associado a uma rede de estruturas
da linha média, todos eles considerados moduladores chave da atividade teta do hipocampo.
Assim, o IP forma um elo que liga MHb e LHb com esta rede e com o hipocampo. Além
disso, as proeminentes interconexões predominantemente GABAérgicas entre IP e MnR,
assim como IP e LDTg, suportam um papel chave dessas vias bidirecionais na resposta
comportamental à nicotina.
Palavras chave: Habênula medial. Núcleos da rafe. Hipocampo. Nicotina. Aversão.
ABSTRACT
Bueno, DNM. Afferent and efferent connections of the interpeduncular nucleus, with
special reference to the circuits linking the habenula, interpeduncular nucleus, and
raphe nuclei. 2018. 92 p. Ph. D. Thesis (Human Physiology). Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018.
The habenula is an epithalamic structure differentiated into two nuclear complexes,
medial (MHb) and lateral habenula (LHb). Recently, MHb together with its primary target,
the interpeduncular nucleus (IP), have been identified as major players in mediating the
aversive effects of nicotine. However, structures downstream of the MHb-IP axis, including
the median (MnR), caudal dorsal raphe nucleus (DRC), and the laterodorsal tegmental
nucleus (LDTg), may contribute to the behavioral effects of nicotine. The afferent and efferent
connections of the IP have hitherto not been systematically investigated with sensitive tracers.
Thus, we placed injections of retrograde or anterograde tracers into different IP subdivisions,
the MnR, or LDTg and additionally examined the transmitter phenotype of some major IP and
MnR afferents by combining retrograde tract tracing with immunofluorescence and in situ
hybridization techniques. Besides receiving topographically organized inputs from MHb and
also LHb, we found that the main theme of IP connectivity are strong reciprocal
interconnections with midline structures, including the MnR/DRC, nucleus incertus,
supramammillary nucleus, septum, and LDTg. The bidirectional connections between IP and
MnR and the LDTg inputs to the IP proved to be mostly GABAergic. Regarding a possible
topography of IP outputs, all IP subnuclei gave rise to descending projections, whereas
ascending projections, including focal projections to the ventral hippocampus, ventrolateral
septum, and LHb mostly originated from the dorsocaudal IP. Our findings indicate that IP is
closely associated to a distributed network of midline structures, all of them considered key
modulators of hippocampal theta activity. Thus, IP forms a node that links MHb and LHb with
this network and the hippocampus. Moreover, the rich predominantly GABAergic
interconnections between IP and MnR, as well as IP and LDTg, support a cardinal role of
these bidirectional pathways in the behavioral response to nicotine.
Key words: Medial habenula. Raphe nuclei. Hippocampus. Nicotine. Aversion.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama esquemático mostrando as principais conexões da habênula ................... 19
Figura 2. Locais de injeção de PHA-L no IP ............................................................................ 38
Figura 3. Desenhos esquemáticos de neurônios impregnados de PHA-L no IP....................... 39
Figura 4. Desenhos esquemáticos de axônios anterogradamente marcados ............................ 40
Figura 5. Fotomicrografias ilustrando a marcação de PHA-L no septo, na habênula lateral e no
hipocampo ................................................................................................................................ 42
Figura 6. Fotomicrografia ilustrando marcação de PHA-L nos núcleos dorsal da rafe............ 43
Figura 7. Fotomicrografias ilustrando a marcação de PHA-L no núcleo incerto ..................... 44
Figura 8. Fotomicrografias ilustrando injeções de CTb no IP .................................................. 53
Figura 9. Desenhos esquemáticos de neurônios retrogradamente marcados ............................ 54
Figura 10. Fotomicrografias ilustrando marcação de CTb no septo, prosencéfalo basal e no
núcleo supramamilar................................................................................................................. 56
Figura 11. Fotomicrografias ilustrando a marcação de CTb no núcleo dorsal da rafe ............. 57
Figura 12. Fotomicrografias ilustrando a marcação de CTb no núcleo incerto ....................... 58
Figura 13. Fotomicrografias ilustrando a assinatura neuroquímica dos neurônios no DR e
LDTg que se projetam para o IP ............................................................................................... 59
Figura 14. Fotomicrografias ilustrando a assinatura neuroquímica dos neurônios no
DRC/MnR que se projetam para o IP ....................................................................................... 60
Figura 15. Fotomicrografias ilustrando marcação de CTb e PHA-L resultantes de injeções no
MnR/PMnR .............................................................................................................................. 61
Figura 16. Fotomicrografia ilustrando marcação de CTb e PHA-L na Hb resultantes de
injeções no LDTg..................................................................................................................... 62
Figura 17. Fotomicrografia ilustrando marcação de CTb e PHA-L no IP resultantes de
injeções no LDTg..................................................................................................................... 63
Figura 18. Diagrama esquemático mostrando as principais conexões aferentes e eferentes da
Hb e IP...................................................................................................................................... 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Casos usados para análise. ........................................................................................ 25
Tabela 2. Lista de anticorpos primários usados ........................................................................ 27
Tabela 3. Lista de anticorpos secundários usados .................................................................... 28
Tabela 4. Quantificação de GAD no MnR................................................................................ 52
Tabela 5. Quantificação de ChAT no LDTg ............................................................................. 52
Tabela 6. Quantificação de GAD no LDTg .............................................................................. 52
Tabela 7. Quantificação de GAD no IP .................................................................................... 52
ABREVIAÇÕES
3N núcleo oculomotor
4V quarto ventrículo
5-HT serotonina
ac comissura anterior
Aq aqueduto
BAC núcleo intersticial da comissura anterior
BST núcleo intersticial da estria terminal
CA1 campo hipocampal CA1
CA2 campo hipocampal CA2
Cg2 córtex do cíngulo 2
CPu caudado putâmem
ChAT enzima colina acetiltransferase
cp pedúnculo cerebral
CTb subunidade b da cólera-toxina
DBB núcleo da banda diagonal de Broca
DLPAG parte dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal
DMTg área tegmental dorsomedial
DR núcleo dorsal da rafe
DRC núcleo dorsal da rafe, parte caudal
DRD núcleo dorsal da rafe, parte dorsal
DRDC DRD, cerne
DRDCe DRD, parte central
DRDSh DRD, concha
DRL núcleo dorsal da rafe, parte lateral
DRR núcleo dorsal da rafe, parte rostral
DRV núcleo dorsal da rafe, parte ventral
DTgP núcleo tegmental dorsal, parte pericentral
f fórnix
fi fimbria do hipocampo
fr fascículo retroflexo
GPi globo pálido, segmento interno
HDB núcleo horizontal da banda diagonal
HIpD hipocampo, parte dorsal
HIpV hipocampo, parte ventral
IL córtex infralímbico
IP núcleo interpeduncular
IPA IP, subnúcleo apical
IPC IP, subnúcleo central
IPDL IP, subnúcleo dorsolateral
IPDM IP, subnúcleo dorsomedial
IPI IP, subnúcleo intermédio
IPL IP, subnúcleo lateral IPR IP, subnúcleo rostral
LC locus coeruleus
LDTg núcleo tegmental laterodorsal
LDTgV núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral
LH hipotálamo lateral
LHb habênula lateral
LHbL habênula lateral, parte lateral
LHbM habênula lateral, parte medial
LHbMPc LHbM, subnúcleo parvocelular
LSV núcleo septal lateral, parte ventral
LPAG substância cinzenta periaquedutal, parte lateral
LPO núcleo pré-optico lateral
LV ventrículo lateral
MCPO núcleo pré-optico, parte magnocelular
MHb habênula medial
MHbD MHb, parte dorsal
MHbS MHb, subnúcleo superior
MHbV MHb, parte ventral
MHbVc MHbV, subnúcleo central
MHbVl MHbV, subnúcleo lateral
MHbVm MHbV, subnúcleo medial
ml lemnisco medial
mlf fascículo longitudinal medial
MM núcleo mamilar medial, parte medial
MnR núcleo mediano da rafe
mp pedúnculo mamilar
MPA area pré-optica medial
MPO núcleo pré-optico medial
MS septo medial
MS/DB complexo septo medial/banda diagonal
NI núcleo incerto
NIc núcleo incerto, parte compacta
NId núcleo incerto, parte difusa
NTS núcleo do trato solitário
PDTg núcleo tegmental, parte posterodorsal
PeFLH hipotálamo lateral, parte perifornicial
PHA-L Phaseolus vulgaris leucoaglutinina
PL córtex pré-límbico
PHD área hipotalâmica posterior, parte dorsal
PLH hipotálamo lateral, parte peduncular
PMnR núcleo paramediano da rafe
PnO do núcleo pontino reticular, parte oral
PT núcleo paratenial do tálamo
PVP núcleo paraventricular do tálamo, parte posterior
RMTg núcleo tegmental rostromedial
S septo
scp pedúnculo cerebelar superior
SFi núcleo septofimbrial
SHy núcleo septohipotalâmico
sm estria medular
SNc substância negra, parte compacta
SNR substância negra, parte reticular
Sph núcleo esferóide
SuM núcleo supramamilar
SuML núcleo supramamilar, parte lateral
SuMM núcleo supramamilar, parte medial
TS núcleo septal triangular
VGLUT3 transportador de glutamato do tipo 3
VLPAG substância cinzeta periaquetudal, parte ventrolateral
VTA área tegmental ventral
xscp decussação do pedúnculo cerebelar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
1.1 Núcleo interpeduncular ................................................................................................ 16
1.2 Complexo habenular ..................................................................................................... 17
1.3 Funções da Hb ............................................................................................................... 19
1.4. Papel do eixo MHb-IP na mediação dos efeitos aversivos da nicotina.................... 21
2 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 23
2.1 Objetivos específicos ..................................................................................................... 23
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 24
3.1 Animais .......................................................................................................................... 24
3.2. Experimentos de rastreamento retrógrado e anterógrado ...................................... 24
3.3 Perfusão e microtomia .................................................................................................. 25
3.4 Caracterizações dos anticorpos e controles imunoistoquímicos ............................... 26
3.5 Anticorpos ...................................................................................................................... 27
3.6 Marcações de imunoperoxidase ................................................................................... 29
3.7 Marcações duplas de imunofluorescência .................................................................. 29
3.8 Hibridização in situ com 35S combinado com Imunoistoquímica para CTb ........... 30
3.9 Análise de dados ............................................................................................................ 31
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 34
4.1 Experimentos de rastreamento anterógrado .............................................................. 34
4.1.1 Projeções ascendentes do IP .................................................................................... 34
4.1.2 Projeções descendentes do IP .................................................................................. 36
4.2 Experimentos de rastreamento retrógrado ................................................................ 45
4.2.1 Entradas prosencefálicas para o IP ......................................................................... 45
4.2.2 Entradas mesopontinas para o IP ............................................................................ 47
4.3 Assinatura neuroquímica das projeções do MnR e LDTg para o IP ....................... 48
4.4 Conexões do MnR com o IP e Hb ................................................................................ 49
4.5 Conexões do LDTg com o IP e Hb ............................................................................... 50
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 64
5.1 Considerações metodológicas ....................................................................................... 65
5.2 Comparações gerais dos nossos resultados com aquelas de estudos anteriores ...... 66
5.3 O IP como elo entre as duas divisões da habênula e o hipocampo ........................... 67
5.4 O IP como uma parte associada de uma rede de estruturas da linha média
envolvido no controle do ritmo teta do hipocampo.......................................................... 69
5.5 Topografia das projeções entre o IP e o DR ............................................................... 72
5.6 Organização dos circuitos entre Hb, IP e MnR/DRC e LDTg considerações
funcionais ............................................................................................................................. 73
REFERÊNCIAS1 .................................................................................................................... 77
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Núcleo interpeduncular
O núcleo interpeduncular (IP) está localizado na linha média ventral do
istmo/rombencéfalo (LORENTE-CÁNOVAS et al., 2012). Os dois terços rostrais do IP são
cercados por diferentes subregiões da área tegmental ventral (VTA), enquanto o polo
dorsocaudal do IP é localizado adjacente ao núcleo mediano da rafe (MnR). O IP é uma
estrutura altamente complexa composta por vários subnúcleos. A base de critérios
citoarquitetônicos e neuroquímicos pelo menos sete subnúcleos são distinguidos dentro do IP,
três núcleos localizados na linha média, sendo denominados apical, rostral e central (IPA,
IPR, IPC), e quatro subnúcleos bilaterais, denominados subnúcleo dorsolateral, dorsomedial,
lateral e intermédio (IPDL, IPDM, IPL, IPI; LENN; HAMILL, 1984; GROENEWEGEN et
al., 1986).
A conectividade e assinatura neuroquímica do IP foram bastante exploradas durante os
anos oitenta do século passado. O IP é o principal, e provavelmente único, alvo da habênula
medial (MHb). As massivas entradas da MHb percorrem o fascículo retroflexo (fr) e
terminam de uma maneira bastante peculiar no IP (HERKENHAM; NAUTA; 1979;
SUTHERLAND, 1982; KIM; 2009). A intrigante topografia e assinatura neuroquímica dessas
entradas tem sido descritas detalhadamente em ratos (CONTESTABILE et al., 1987) e
camundongos (QIN; LUO, 2009; HSU et al., 2013; GARDON et al 2014; QUINA et al.,
2017). Assim, os axônios que originam da parte dorsal da MHb (MHbD) usam glutamato e
substância P como neurotransmissor e inervam seletivamente o IPL e o teto dorsal do IP,
enquanto os axônios oriundos da parte ventral da MHb (MHbV) co-liberam glutamato e
acetilcolina nos restantes subnúcleos do IP (REN et al., 2011; FRAHM et al., 2015). Ademais,
a maioria dos axônios oriundos da MHb atravessa o IP várias vezes num plano horizontal
antes de terminar ipsilateralmente (HERKENHAM; NAUTA, 1979; KIM, 2009). Com
relação a sua própria neuroquímica, o IP contém essencialmente neurônios GABAérgicos,
além de uma minoria de neurônios glutamatérgicos (QUINA et al., 2017). Outros estudos
pioneiros usando técnicas de imunoistoquímica e rastreamento neural (CONTESTABILE;
FLUMERFELT, 1981; GROENEWEGEN et al., 1986; SHIBATA; SUZUKI;
MATSUSHITA, 1986) revelaram que o IP não somente recebe proeminentes entradas
colinérgicas oriundas da MHb, mas também descreveram robustas conexões recíprocas com
outras estruturas mesopontinas da linha média ou próximo dela, incluindo o MnR , o núcleo
17
dorsal da rafe (DR), o núcleo incerto (NI; GOTO; SWANSON; CANTERAS, 2001; RYAN et
al., 2011) e o núcleo tegmental laterodorsal (LDTg).
Em relação as suas funções, o IP foi contextualizado como um dos principais alvos do
sistema de condução diencefálica dorsal (DDC; SUTHERLAND, 1982). O DDC é altamente
conversado durante a evolução (STEPHENSON-JONES et al., 2012; ROBERTSON et al.,
2014) e abrange a estria medular (sm), os dois complexos nucleares da Hb (MHb e LHb), e o
fr. O DCC foi contextualizado de regular particularmente o fluxo de informações entre
estruturas do telencéfalo “límbico”, como o septo, o segmento interno do globo pálido e o
hipotálamo lateral, com grupamentos monoaminérgicos do mesencéfalo e tegmento
mesopontino, e assim integrar processos cognitivos com processos emocionais e sensoriais
(SUTHERLAND, 1982; ELLISON, 1994).
1.2 Complexo habenular
A habênula (Hb) é o componente central do DDC e está localizado no teto do terceiro
ventrículo, na região póstero-medial do tálamo dorsal. A Hb é uma estrutura
filogeneticamente antiga, cujas projeções e assinatura neuroquímica são altamente
conservadas durante a evolução (AMO et al., 2010; STEPHENSON-JONES et al., 2012; DE
CARVALHO et al., 2014). Enquanto em lampreias, peixes, anfíbios e répteis a Hb apresenta
uma pronunciada assimetria esquerda-direita, em mamíferos a Hb é uma estrutura bilateral
praticamente simétrica (BIANCO; WILSON, 2009; AIZAWA, 2013). A Hb é subdividida em
dois complexos nucleares principais, habênula medial (MHb) e habênula lateral (LHb). Em
virtude de conexões aferentes e eferentes distintas (HERKENHAM; NAUTA, 1977, 1979;
GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012), a LHb é ainda subdividida em duas partes
principais, a LHb medial (LHbM) e lateral (LHbL). Baseados nos critérios citoarquitetônico,
citoquímico e ultraestrutural, no total quinze subnúcleos foram distinguidos na Hb, sendo
cinco na MHb, LHbM e LHbL, respectivamente (ANDRES; VON DURING; VEH, 1999;
GEISLER; ANDRES; VEH, 2003; AIZAWA et al., 2012; WAGNER; STROH; VEH, 2014). A
maioria das suas aferências chegam à MHb e LHb através da estria medular enquanto a via de
saída das projeções eferentes desses complexos nucleares é feita pelo fascículo retroflexo
(HERKENHAM; NAUTA, 1977, 1979).
Apesar das principais aferências e eferências da LHb e MHb serem conduzidas pelo DCC,
LHb e MHb apresentam um perfil de conexões bastante segregadas e uma assinatura
neuroquímica diferenciada (ANTOLIN-FONTES et al., 2015; ZAHM; ROOT, 2017). Assim,
a MHb recebe a grande maioria das suas entradas de distintas regiões do septo caudal, como o
18
septo triangular, o septo fimbrial e o núcleo da banda diagonal (HERKENHAM; NAUTA,
1977; QIN; LUO, 2009; YAMAGUCHI et al., 2013), enquanto ela tem o IP como
provavelmente único alvo (VISWANATH et al., 2014). As entradas da LHb são mais
diversificadas, sendo que LHbM e LHbL recebem aferências razoavelmente segregadas
(HERKENHAM; NAUTA, 1979; PROULX; HIKOSAKA; MALINOW, 2014). Deste modo,
aferências telencefálicas para a LHbM emergem do córtex pré-frontal, do pálido ventral, do
septo, da região da banda diagonal e sobretudo de um vasto território do hipotálamo, se
estendo da área pré-óptica até o hipotálamo lateral (HERKENHAM; NAUTA, 1977;
KOWSKI et al., 2008; KIM; LEE, 2012; LI et al., 2011; YETNIKOFF et al., 2015). Ademais,
a maioria, mas não todas (por exemplo, DEL-FAVA et al., 2007) entradas dos principais
grupamentos monoaminérgicas e colinérgicos do mesencéfalo inervam preferencialmente a
LHbM (ZAHM; ROOT, 2017; METZGER; BUENO; LIMA, 2017). Enquanto isso, a LHbL,
além de receber também aferências do hipotálamo, é principalmente inervada pelo núcleo
entopeduncular (EP; HERKENHAM e NAUTA; 1977), o homólogo do segmento interno do
globo pálido de primatas.
Como já contextualizado por Sutherland (1982), a grande maioria das eferências da LHb
são direcionadas para importantes grupamentos monoaminérgicos, colinérgicos e
GABAérgicos da ponte e do mesencéfalo, incluindo grupamentos rostrais da rafe (DR,
MnR/PMnR), a VTA, o LDTg, o núcleo tegmental rostromedial (RMTg) e NI
(HERKENHAM; NAUTA, 1979; ARAKI; MCGEER; KIMURA, 1988; CORNWALL;
COOPER; PHILLIPSON, 1990; GOTO; SWANSON; CANTERAS, 2001; JHOU et al.,
2009a; KIM, 2009; HONG et al., 2011; GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012; SEGO et
al., 2014; QUINA et al., 2015). Além dessas saídas primordiais, a LHb ainda emite escassas
projeções para áreas talâmicas, hipotalâmicas e regiões do septo ventrolateral
(HERKENHAM; NAUTA, 1979; ARAKI; MCGEER; KIMURA, 1988). De novo, as
eferências da LHbM e LHbL parecem bastante segregadas, com as projeções para os
grupamentos serotonérgicos, dopaminérgicos e colinérgicos originando sobretudo da LHbM
(HERKENHAM; NAUTA, 1979; CORNWALL; COOPER; PHILLIPSON, 1990;
GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012; SEGO et al., 2014). Em contraste, o RMTg
(JHOU et al., 2009a, b), um núcleo relé puramente GABAérgico (PERROTTI et al., 2005)
localizado no tegmento rostromedial, é o principal alvo da LHbL. O RMTg, por sua vez, ficou
conhecido por também robustamente inervar a VTA, o DR e o LDTg (BALCITA-PEDICINO
et al., 2011; LAVEZZI; PARSELY; ZAHM, 2012; GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012;
SEGO et al., 2014). Visto que a LHb é uma estrutura quase puramente glutamatérgica
19
(BRINSCHWITZ et al., 2010), isso significa que LHbM e LHbL podem modular a atividade
de grupamentos serotonérgicos, dopaminérgicos e colinérgicos numa maneira bidirecional por
vias paralelas e segregadas (GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012, SEGO et al.; 2014;
METZGER; BUENO; LIMA, 2017).
Figura 1. Diagrama esquemático modificado de Gonçalves, Sego e Metzger (2012) mostrando alguns das mais
proeminentes conexões aferentes e eferentes da Hb e fotomicrografia da expressão da enzima colina
acetiltransferase (ChAT) em um camundongo geneticamente modificado destacando a posição do núcleo
interpeduncular (IP) e da MHb (modificado de FRAHM et al. 2015).
1.3 Funções da Hb
Até pouco tempo atrás, as exatas funções da Hb permaneceram relativamente obscuras e a
Hb foi implicada em funções tão diversas, como a regulação do sono, comportamento
maternal e regulação dos ritmos circadianos (BIANCO; WILSON, 2009; HIKOSAKA, 2010).
Porém, atualmente existem claras evidências que a Hb é, sobretudo, um componente-chave de
um circuito anti-recompensa implicado no processamento de estímulos aversivos, variando de
estímulos nocivos até a perda de recompensas esperadas (HIKOSAKA, 2010; SHELTON et
al., 2012; PROULX; HIKOSAKA; MALINOW, 2014). Até o momento, a maioria das
investigações focou as funções e conexões da LHb e, especificamente, seu papel na
codificação de frustrações e no subsequente controle inibitório de grupamentos
monoaminérgicos (LECOURTIER; DEFRANCESCO; MOGHADDAM, 2008; LAMMEL et
al.; 2012). Possíveis funções da LHb foram investigadas sistematicamente numa série de
estudos eletrofisiológicos inovadoras realizados em macacos (MATSUMOTO; HIKOSAKA,
20
2007, 2009). Esses estudos esclareceram que os neurônios da LHb são excitados por
estímulos aversivos ou a omissão de recompensas, enquanto recompensas, como sinais que
predizem recompensas, inibem os mesmos neurônios. Em humanos, a participação da LHb no
processamento de estímulos aversivos foi relevada em elegantes estudos de imagem
mostrando de maneira consistente que a LHb é seletivamente ativada por desfechos negativos
(ULLSPERGER; VON CRAMON, 2003; SHEPARD; HOLCOMB; GOLD, 2006). Em
consonância com um possível papel chave na codificação de eventos aversivos, estudos em
animais (CALDECOTT-HAZARD; MAZZIOTTA; PHELPS, 1988; AMAT et al., 2001) e
humanos (MORRIS et al., 1999; SHEPARD; HOLCOMB; GOLD, 2006) apontaram que a
hiperatividade da LHb é um fator importante em distúrbios do tipo depressivo (YANG et al.,
2018; NUNO-PEREZ et al., 2018). Além disso, embora não haja projeções diretas entre a
LHb e o hipocampo, foi recentemente demonstrado que uma LHb intacta é crítica para a
codificação e resgate da memória espacial (GOUTAGNY et al., 2013; MATHIS et al., 2015),
bem como para regular as oscilações teta do hipocampo (AIZAWA et al., 2013). Recentes
estudos também apontam para um papel determinante da LHb na flexibilidade
comportamental (BAKER; MIZUMORI, 2017) e adição a distintas drogas de abuso (JHOU et
al., 2013; LECCA; MEYE; MAMELI, 2014; SHAH et al., 2017; FAKHOURY, 2018).
Em contraste, até recentemente muito pouco se soube sobre as funções e a circuitaria da
MHb (para revisão ver, BIANCO; WILSON, 2009; VISWANATH et al., 2014). Mesmo
apresentando um perfil de conexões bastante segregadas e uma assinatura neuroquímica
diferenciada (ANTOLIN-FONTES et al., 2015; ZAHM; ROOT, 2017), aumentam as
evidências que LHb e MHb exercem algumas funções importantes parecidas, Assim, como a
LHb, a MHb tem sido implicada em distúrbios do tipo depressivo (SHUMAKE; EDWARDS;
GONZALEZ-LIMA, 2003), em mecanismos de aversão (SORIA-GÓMEZ et al., 2015), e na
regulação do medo e da ansiedade (OKAMOTO; AGETSUMA; AIZAWA, 2012;
YAMAGUCHI et al., 2013; ZHANG et al., 2016). Também foram descritas variações diárias
na atividade eletrofisiológica dos neurônios da MHb (SAKHI et al., 2014a), indicando que, de
novo semelhante à LHb (SAKHI et al., 2014b; BAÑO-OTÁLORA; PIGGINS, 2017), a MHb
está envolvida na regulação de ritmos circadianos. Mais importante, um papel fisiológico
central tem sido atribuído recentemente para o eixo MHb-IP na resposta do cérebro à nicotina
(JACKSON et al., 2015; FOWLER, 2017).
21
1.4. Papel do eixo MHb-IP na mediação dos efeitos aversivos da nicotina
Depois de décadas de relativa negligência, o interesse no eixo MHb-IP ressurgiu quando
diversos estudos apontaram para o eixo MHb/IP como estruturas chaves de um circuito
envolvido na mediação dos efeitos aversivos, bem como dos sintomas somáticos da retirada
da nicotina (SALAS et al., 2009; para revisão ver, DE BIASI; DANI, 2011; FOWLER;
KENNY, 2014; ANTOLIN-FONTES et al., 2015; MCLAUGHLIN; DANI; DE BIASI,
2017). Assim, a eliminação ou super-expressão de receptores nicotínicos de acetilcolina
(nAChRs) na MHb de camundongos geneticamente modificados tem sido mostrado suficiente
para modular o consumo de nicotina e a atividade neural no eixo MHb-IP (FOWLER et al.,
2011; FRAHM et al., 2011). Particularmente as subunidades α3, β4, e α5 são atualmente
consideradas essenciais por desempenhar um papel-chave na mediação das propriedades
aversivas da nicotina (GÖRLICH et al., 2013; para revisão ver, BALDWIN; ALANIS;
SALAS, 2011; LESLIE; MOJICA; REYNAGA, 2013). De forma notável, essas três
subunidades são expressas de maneira abundante e bastante seletiva na MHb e/ou IP (SHIH et
al., 2014). Além disso, estudos genéticos de larga escala em humanos mostraram que o risco
de desenvolver dependência de nicotina mais que dobra em indivíduos com duas cópias do
alelo CHRNA5. Junto com CHRNA3 e CHRNB4, o CHRNA5 faz parte de um cluster de
genes de risco do cromossomo 15 que codifica exatamente as subunidades α3/β4 e α5 dos
nAChRs e variações nesse cluster estão também associados ao risco elevado de desenvolver
doença pulmonar obstrutiva crônica e câncer de pulmão (BIERUT et al., 2007, 2008;
SACCONE et al., 2007). Entretanto, também foram identificados em camundongos
geneticamente modificados alguns dos mecanismos pelo quais distintos nAChRs medeiam
respostas chave para nicotina. Esses mecanismos incluem a facilitação da liberação de
glutamato no IP pelos axônios originados na MHb (FRAHM et al., 2015), assim como a
regulação da atividade marca-passo dos neurônios colinérgicos na MHb (GÖRLICH et al.,
2013). No IP, Zhao-Shea et al. (2013) mostraram que principalmente neurônios GABAérgicos
são ativados depois da retirada da nicotina e que a estimulação ótica de neurônios
GABAérgicos do IP elícita os sintomas somáticos da abstinência de nicotina.
No entanto, há evidências crescentes de que alguns dos alvos principais do IP, como o
MnR, a parte caudal do núcleo dorsal da rafe (DRC) e o LDTg contribuem para distintos
efeitos comportamentais da nicotina. Assim, foi demonstrado que a importante subunidade α5
dos nAChRs é mais robustamente expressa no IP que na MHb, inclusive em neurônios do IP
que se projetam para o MnR (HSU et al., 2013). Ademais, neurônios GABAérgicos no IP e
22
MnR provavelmente participam na regulação da ansiedade durante a retira da nicotina
(ZHAO-SHEA et al., 2013; 2015). Ao mesmo tempo, o MnR e o DRC são considerados
estruturas-chave envolvidas na regulação da ansiedade (DEAKIN; GRAEFF, 1991;
ANDRADE et al., 2013; PAUL; LOWRY, 2013), tornando-os candidatos promissores para a
mediação do aumento da ansiedade, um dos sintomas afetivos mais comuns da abstinência de
nicotina.
No interim desde os estudos pioneiros sobre a conectividade do IP, novos núcleos foram
delineados ou núcleos existentes têm sido descrito de ser composto de distintas sub-regiões
funcionais, levando a novos conceitos sobre a estrutura e função de áreas específicas do
cérebro (ver, GEISLER; ZAHM, 2005). O primeiro fato se aplica para o NI, que foi somente
delineado de forma convincente por Goto, Swanson e Canteras (2001) e Olucha-Bordonau et
al. (2003). Além disso, nos últimos anos tem-se estabelecido que o complexo habênular (Hb)
(ANDRES; VON DURING; VEH, 1999; GEISLER; ANDRES; VEH, 2003; AIZAWA et al.,
2012; WAGNER; STROH; VEH, 2014) e os núcleos da rafe (COMMONS; CONNOLLEY;
VALENTINO, 2003; HIOKI et al., 2010; CALIZO et al., 2011; SEGO et al., 2014) são
estruturas altamente heterogêneas compostas por várias sub-regiões contendo populações
neuronais distintas. Assim, foi mostrado que, distintos distritos do DR e MnR contém além de
neurônios serotonérgicos, uma grande quantidade de neurônios que expressam ou co-
expressam GABA, dopamina e glutamato (HIOKI et al., 2010; SEGO et al., 2014). No IP,
Zhao-Shea et al. (2013) mostraram que principalmente neurônios GABAérgicos são ativados
depois da retirada da nicotina e que a estimulação ótica de neurônios GABAérgicos do IP
elícita os sintomas somáticos da abstinência de nicotina.
Todos os estudos existentes de mapeamento neural das conexões do IP utilizaram
traçadores pouco sensíveis e só detalharam pontualmente a neuroquímica das vias
investigadas. Assim, considerando a só recentemente reconhecida importância biológica do
eixo habênula-IP na resposta do cérebro à nicotina, o principal objetivo do presente trabalho
foi reexaminar em detalhe as conexões aferentes e eferentes do IP assim como a assinatura
neuroquímica de alguns das suas conexões principais. Ênfase especial foi dada para os
circuitos entre a habênula, o núcleo interpeduncular, os núcleos da rafe e o tegmento pontino.
23
2 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do presente projeto foi investigar em detalhe, através de métodos de
rastreamento neural combinados com métodos de imunoistoquímica e hibridização in situ, as
conexões aferentes e eferentes do núcleo interpeduncular (IP) assim como a assinatura
neuroquímica de algumas de suas mais proeminentes saídas e entradas. Ênfase especial foi
dada para os circuitos entre a habênula, o núcleo interpeduncular, os núcleos da rafe e o
tegmento dorsal.
2.1 Objetivos específicos
Com o objetivo de explorar em detalhe as conexões neurais do núcleo interpeduncular e os
circuitos que foram recentemente implicados no controle da ingestão de nicotina exploramos
os seguintes objetivos específicos:
- Investigamos e mapeamos num contexto subnuclear, as eferências do IP através de
injeções do traçador PHA-L em diferentes distritos do IP.
- Investigamos e mapeamos num contexto subnuclear, as aferências do IP através de
injeções do traçador CTb em diferentes distritos do IP.
- Investigamos, através de uma combinação metódica de injeções do traçador retrógrado
CTb no IP com métodos de imunofluorescência, a assinatura neuroquímica das entradas que o
IP recebe da MHb, do DR/MnR e do LDTg.
- Investigamos, através de uma combinação metódica de injeções do traçador retrógrado
CTb no IP ou na MnR/PMnR com métodos de hibridação in situ, uma possível assinatura
GABAérgica das projeções recíprocas entre IP e MnR/PMnR, assim como das aferências do
LDTg para o IP.
24
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Os experimentos foram realizados em ratos adultos albinos (Rattus norvegicus) da
linhagem Wistar, com peso entre 210 a 250 g, criados no Biotério do Instituto de Ciências
Biomédicas I – USP, mantidos sob temperatura constante (21±2ºC), iluminação em ciclo de
12 horas e água e ração ad libitum. Todos os procedimentos seguiram o protocolo aprovado
pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do ICB – USP (Protocolo nº 153/2012) e
os princípios adotados pelo Conselho Nacional de Segurança Alimentar e Nutricional
(CONSEA) e pelo “Guia de Uso de Animais em Pesquisas” do National Institutes of Health
(NIH publicação No. 80-23, revisão 1996).
3.2. Experimentos de rastreamento retrógrado e anterógrado
Os animais foram profundamente anestesiados pela administração subcutânea de um
coquetel anestésico contendo xilazina (Syntec; 0,05 mg/100 g de peso corporal) e ketamina
(Syntec; 0,09 mg/100 g de peso corporal). Depois de anestesiados os ratos foram
posicionados num instrumento estereotáxico Kopf. Foi realizada tricotomia na região craniana
e pequenas trepanações foram feitos com uma broca odontológica. Através deste orifício,
pipetas de vidro com diâmetro interno de 10 a 15 μm previamente confeccionadas em
estirador de pipetas (Kopf, California) foram inseridas no tecido cerebral. Foram utilizados
neste estudo o traçador anterógrado Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L, Vector
Laboratories, Burlingame, CA, 2.5 % em 0,01M tampão fosfato, PB) e o traçador retrógrado a
subunidade b da cólera-toxina (CTb low salt; List Biological Lab, Campell, CA, 1 % em água
destilada). Os dois traçadores foram depositados através de injeções iontoforéticas. Um
primeiro grupo de ratos recebeu injeções unilaterais de CTb em diferentes distritos do IP. O
segundo grupo recebeu injeções unilaterais de PHA-L no IP e um terceiro grupo recebeu
injeções de CTb e/ou PHA-L no MnR ou LDTg (Tabela 1). Os traçadores foram injetados por
meio de uma corrente elétrica positiva pulsada (10 segundos “on”/10 segundos “off”) de 4 μA
no caso de PHA-L e 5 μA no caso de CTb. Em dois ratos que receberam injeções de PHA-L
no MnR (RD33, RD34) e em todos os casos com injeções de PHA-L no LDTg, PHA-L foi
injetado como descrito acima exceto que uma corrente positiva contínua foi usada. As
coordenadas estereotáxicas para as injeções foram inicialmente adquiridas através do atlas de
Paxinos e Watson (2007), para o IP (AP: 5,5 mm; ML: 0,0 mm; DV: -8,5 mm), MnR (AP: 7,1
mm; ML: 0,0 mm; DV: -7,6 mm) e LDTg (AP: 8,0 mm; ML: -0,7 mm; DV: -6,2 mm), e
refinadas empiricamente de acordo com nossas injeções anteriores. Após a injeção, a
25
micropipeta foi mantida em posição por pelo menos 1 minuto e uma corrente negativa foi
aplicada para minimizar o fluxo retrógrado de traçador pelo rastro da pipeta.
Observação: Uma parte dos casos analisados no presente estudo foi constituída por casos de
um acervo de encéfalos de nosso laboratório que já receberam injeções de CTb ou PHA-L em
alguns dos alvos desse estudo anteriormente. Esses encéfalos já foram cortados para outros
estudos e as séries de cortes foram armazenadas em solução anti-congelante. Para minimizar o
número de animais sacrificados, analisamos esses casos e paralelamente injetamos novos
casos.
Traçadores e local de injeção Total
n = 29 Casos analisados
PHA-L – IP 5 RL41, RL42, RL47, RL48, RL49
PHA-L – MnR 6 RL57, RD24, RD25, RD30, RD33, RD34
PHA-L – LDTg 3 RD52, RD65, RD75
CTb – IP 7 R89, RL39, RL40, RL62, RL63, RL67, RL68
CTb – MnR 5 RD4, RD10, RD11, RD29, RD32
CTb – LDTg 3 RD55, RD67, RD68
Tabela 1. Casos usados para análise.
3.3 Perfusão e microtomia
Após uma sobrevida de 7 dias (CTb) ou 10 dias (PHA-L) os ratos foram
profundamente anestesiados através de injeção intraperitoneal de um coquetel xilazina e
cetamina de acordo com o peso corpóreo, e então, foram perfundidos transcardiacamente com
100 ml de solução de salina a 0,9%, seguida de uma solução de 500 ml de formaldeído a 4%
(adquirido a partir de paraformaldeídeo aquecido a 60-65°C) em tampão fosfato de sódio (PB)
a 4°C. Os encéfalos foram então removidos do crânio e pós-fixados por 2 horas.
Os casos que foram usados para rastreamento anterógrado, os encéfalos foram
armazenados overnight a 4°C em uma solução de crioproteção de 0,02M KPBS, pH 7,3.
Então, no dia seguinte os encéfalos foram seccionados no plano coronal em micrótomo de
congelamento (espessura 40 μm), e coletados em 4 séries em solução anti-congelante. Em
todos os casos, uma das séries dos cortes foi colecionada em solução de azida de sódio a
26
0,02% em tampão fosfato de potássio (KPBS) e corada com tionina (Sigma) para a avaliação
dos limites das injeções e das regiões imunomarcadas.
No entanto, para os casos de combinação de rastreamento retrógrado com métodos de
hibridação in situ, os procedimentos adotados foram em condições de livres de RNase, pois
uma parte dos cortes foi posteriormente usado para experimentos de hibridização in situ (ver
3.8). Logo, os encéfalos removidos do crânio, foram pós-fixados por 2 horas e guardados
overnight a 4°C em 0,1M PB, pH 7,4, preparado com água tratada com dietil pirocarbonato
(DEPC). A todo momento desde procedimento houve um cuidado para que todas as soluções
utilizadas nesta metodologia estivessem em condições livres de RNase. Os encéfalos foram
seccionados no plano coronal em micrótomo de congelamento (espessura 40 μm), e coletados
em 4 séries em uma solução anti-congelante livre de RNase.
Em geral, uma das séries foi processada pelo método de imunoperoxidase para CTb ou
PHA-L. Nos ratos que receberam injeções de CTb ou PHA-L no IP, uma outra série de cortes
do tegmento mesopontino foi processado pela técnica de dupla– ou tripla imunofluorescência.
Outra série de cortes de 5 ratos com injeções de CTb no IP (n = 3) ou MnR (n = 2) foi
processado para hibridização in situ para GAD67, VGLUT2 e/ou VGLUT3. Finalmente, uma
série adicional foi corada com tionina, para servir como referência citoarquitetônica.
3.4 Caracterizações dos anticorpos e controles imunoistoquímicos
Todos os anticorpos primários utilizados no presente estudo (Tabela 2) foram
previamente caracterizados e testados para definição de sua especificidade (para detalhes, ver
SEGO et al., 2014). O anticorpo feito em cabra contra CTb (List, #104) foi obtido a partir da
purificação da toxina do vibrião da cólera, que não é fisiologicamente encontrado no
organismo. O anticorpo feito em coelho contra PHA-L (DAKO, Carpinteria, CA, #B275) foi
produzido pela hiperimunização de ratos com lectina purificada, que também não é
encontrada no organismo de mamífero. É importante mencionar que cortes de encéfalos que
não receberam injeções de PHA-L ou CTb não mostraram imunorreatividade, quando
reagidos com os respectivos anticorpos primários contra PHA-L ou CTb. As concentrações
ideais de cada anticorpo foram individualmente determinadas. A especificidade dos anticorpos
secundários foi comprovada pela ausência de marcação específica em cortes dos encéfalos de
animais que não receberam injeção de traçador ou em cortes dos encéfalos de animais que
receberam injeção de traçador.
27
3.5 Anticorpos
Todos os anticorpos primários que foram usados no presente estudo (ver Tabela 2) já
foram utilizados em estudos prévios e suas especificidades reveladas no cérebro de rato por
análise por Western Blot e em experimentos de pré-incubação com seu imunógeno. Todos os
anticorpos primários e secundários (ver Tabela 3), também já foram testados em nosso
laboratório e suas diluições já foram determinadas previamente.
Antígeno Imunogênio Empresa Diluições
IPe IF
5-HT
Serotonina acoplada a
albumina de soro bovino
(BSA) com
paraformaldeído
Immunostar, (Hudson, WI),
#200800, produzido em coelho,
policlonal
1:40.000
ChAT
Enzima colina
acetiltransferase de
placenta humana
Millipore (Temecula, CA),
AB144P, produzido em cabra,
policlonal
1:400
CTb Toxina purificada do
Vibrião da cólera
List Laboratories, INC,
(Burlingame, CA),
#104, produzido em cabra,
policlonal
1:10.000 1:10.000
CTb Toxina purificada do
Vibrião da cólera
Abcam, (Cambridge, MA),
#ab35988, produzido em
camundongo, monoclonal
1:1.000
GluA4 Peptídeo sintético do rato
GLUA4 (aa 871-883)
Millipore, (Temecula, CA),
AB1508, produzido em coelho,
policlonal
1:400
PHA-L Lectina purificada do
Phaseolus vulgaris
DAKO, (Carpinteria, CA),
#B275, produzido em coelho,
policlonal
1:5.000 1:2.500
PHA-L Lectina purificada do
Phaseolus vulgaris
Vector, (Burlingame, CA),
#AS2224, produzido em cabra,
policlonal
1:2.500
VGLUT3 Peptídeo sintético do rato
VGLUT3 (aa 569-588)
Millipore, (Temecula, CA),
#AB5421, produzido em
porquinho da índia, policlonal
1:2.000
Tabela 2. Lista de anticorpos primários usados. Abreviações: 5-HT, serotonina; ChAT, colina acetiltransferase;
CTb, subunidade b da cólera-toxina; IF, imunofluorescência; IPe, imunoperoxidase; PHA-L, Phaseolus vulgaris
leucoaglutinina; VGLUT3, transportador de glutamato do tipo 3.
28
Conjugado
com
Anti- Produzido em Empresa
Diluições
IPe IF
Biotina Coelho Cabra
Vector #BA-1000 1:200
Biotina Cabra Burro Jackson (West Grove, PA),
#705-065-147 1:4.000
Alexa488 Coelho Burro
Jackson, #711-546-152 1:500
Alexa594 Cabra Burro
Jackson, #705-586-147 1:500
Alexa488 Porquinho da
índia
Burro Jackson, #706-546-148 1:500
Tabela 3. Lista de anticorpos secundários usados. Abreviações: IF, imunofluorescência; IPe, imunoperoxidase.
29
3.6 Marcações de imunoperoxidase
Em geral, a maioria das etapas de lavagem e incubação foram realizadas em cortes
com livre flutuação em temperatura ambiente. Os cortes foram pré-tratados com 1%
boroidreto de sódio (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) em PB (10 minutos), seguido de
lavagem em PB e pré-incubação em 1% H2O2 em PB contendo 10% metanol (10 –15
minutos). Os cortes foram então lavados 3 vezes em PB e em seguida pré-incubados durante
30 minutos em PB contendo soro normal a 2% (Jackson) proveniente da espécie em qual foi
gerado o anticorpo secundário. Os cortes foram depois incubados durante 72 horas a 4°C com
soluções dos respectivos anticorpos primários (ver Tabela 2) diluídos em PB contendo soro
normal a 1% proveniente da espécie em qual foi gerado o anticorpo secundário e Triton X-
100 a 0,3%.
Os cortes foram lavados novamente em PB e depois incubados durante 2 horas nos
respectivos anticorpos secundários biotinilados (ver Tabela 3). Após lavagens em PB, os
cortes foram incubados por 2 horas em um kit ABC (ABC Elite Kit, Vector Laboratories,
Burlingame, CA). Depois de outras lavagens em PB, o produto da reação de peroxidase foi
visibilizado pelo procedimento de glicose oxidase (ITOH et al., 1979) e o 3,3’-
diamenobenzidine (DAB) tetrahidrocloreto sem metal como cromógeno (para demais
detalhes, veja SHAMMAH-LAGNADO et al.,1999). Após uma última lavagem em PB, os
cortes foram montados em lâminas gelatinizadas. Para intensificação da marcação, as lâminas
foram finalmente mergulhadas em uma solução de tetróxido de ósmio a 0,05% por um
período de 15 a 20 segundos e depois desidratadas em concentrações crescentes de etanol,
transferidos para xilol e cobertas com DPX (Sigma).
Tanto CTb (LUPPI et al., 1990) quanto PHA-L (GERFEN; SAWCHENKO, 1984)
foram processados pelos métodos de imunoperoxidase (IPe), como descrito acima. Somente
os passos de pré-incubação no tetraborato de sódio e no H2O2 foram omitidos. No caso do
PHA-L, a solução bloqueadora com soro normal a 2% foi omitida e os cortes foram incubados
diretamente na solução do anticorpo primário em PB, contendo leite desnatado a 10% (Nestlé)
e Triton X-100 a 0,3%.
3.7 Marcações duplas de imunofluorescência
Através da técnica de imunofluorescência (IF) foram realizadas as seguintes
marcações duplas de imunofluorescência: 1) anti-CTb/anti-serotonina (5-HT) ou 2) anti-
CTb/anti-transportador vesicular de glutamato do tipo 3 (VGLUT3), afim de esclarecer uma
30
possível assinatura serotonérgica/glutamatérgica dos neurônios do DR ou MnR que se
projetam para o IP ou 3) anti-CTb/anti-ezima colina acetiltransferase (ChAT) para esclarecer a
porcentagem dos neurônios colinérgicos no LDTg e na MHb.
Em geral, as etapas de lavagem e incubação foram realizadas em cortes imersos em
solução a temperatura ambiente. Os cortes foram lavados por 3 vezes em PB e depois foram
pré-incubados em 1% H2O2 em PB contendo 10% álcool metílico por 30 minutos, seguido de
mais lavagens em PB. Então, os cortes foram pré-incubados durante 30 minutos em PB
contendo soro normal de burro a 2% (Jackson). Os cortes foram incubados durante 72 horas a
4°C num “coquetel” de dois anticorpos primários (ver Tabela 2) em PB, contendo soro normal
de burro a 1% e Triton X-100 a 0,3%.
Foram usadas as combinações de anti-coelho Alexa 488/anti-cabra Alexa 594 ou anti-
coelho Alexa594/anti-porquinho da índia Alexa488 (ver Tabela 3). Após lavagens finais em
0,05M Tris-HCL, os cortes foram montados em lâminas microscópicas gelatinizados,
cobertos com lamínulas usando uma solução “slow-fade” (Molecular Probes) e finalmente
selados com esmalte de unha. Vários grupos controles foram realizados, incluindo a omissão
de um, dois ou três anticorpos primários, omissão de um dois ou três anticorpos secundários e
troca dos fluoróforos relacionados para os diferentes marcadores. Todos estes procedimentos
controles resultaram na prevista marcação fluorescente simples ou duplas ou nos casos de
omissão de três anticorpos primários, na ausência total de marcação de fluorescência.
3.8 Hibridização in situ com 35S combinado com Imunoistoquímica para CTb
Para investigar a distribuição do mRNA do GAD-67-kDA, VGLUT2, e VGLUT3,
uma série de cortes com extensão do tálamo até o tegmento mesopontino foi processado pela
técnica de hibridização in situ (HIS). Foi tomado cuidado para que todas as soluções
utilizadas nesta metodologia estivessem livres de RNase ou tivessem sido preparadas a partir
de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e auto-clavadas. Cortes de cérebros de ratos
que receberam anteriormente injeções de CTb no IP ou MnR foram lavados com DEPC-PBS,
pH 7,0 por uma hora, seguido por incubação em boridreto de sódio (Sigma) em DEPC-PBS
por 15 minutos. Secções foram então incubadas por 10 minutos em anidro acético 0,25%
(Merck, Darmstadt, Germany) em 0,1M de trietanolamina. Para gerar ribosondas antisense
35S-marcadas para GAD-67kDA, VGLUT2 ou VGLUT3, plasmídeos foram linearizados pela
digestão pelo Sal1 e sujeitos a transcrição in vitro pela T3 polimerase de acordo com
protocolos do fabricante (Promega). A sonda anti-sense 35S-marcada para GAD-67kDA foi
gerada a partir de referências de cDNA como descrito previamente (ELIAS et al., 2001). Os
31
plasmídeos contendo o DNA do GAD67 foram gentilmente fornecidos pelos Drs. N.
Tillakaratne e J. C. Bittencourt (Universidade da Califórnia, Los Angeles, CA, USA, e
Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil). A ribosonda anti-sense 35S-marcadas para
VGLUT2 foi gerada a partir de referências de cDNA como descrito previamente (DONATO
JR. et al., 2010). Ela compreende as posições 2154 a 2526 do número de acesso
NM_080853.3 do GenBank, incluindo partes dos éxons 11 e 12 do gene Slc17a6. A ribosonda
anti-sense 35S-marcadas para VGLUT3 corresponde as posições 392 a 591 do número de
acesso NM_182959.3 do GenBank, incluindo partes dos éxons 1 e 2 do gene Slc17a8.
As sondas de cRNA foram diluídas para 106 cpm/ml em solução de hibridização e
aplicada nos cortes. A solução de hibridização consistiu de 50% formamida, 10 mM Tris-HCl
(Fisher Scientific, Fair Lawn, NY), 0,01% DNA de esperma de salmão cisalhada, 0,01%
RNAt de levedura (Sigma), 0,05% RNA total de levedura (Sigma), 10mM de ditiotreitol
(Amresco, Solon, OH), 10% de sulfato de dextrano, 0,3M NaCl, 1mM ácido
etilenodiaminetracético (EDTA, pH 8,0) e 1x solução de Denhart (Sigma). Os cortes foram
hibridizados por 16 horas à 56ºC. No dia seguinte, os tecidos foram lavados quatro vezes em
cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) e foram incubados em RNase A à 0,002% (Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany) diluído em 0,5M NaCl, 10mM Tris-HCL. pH 8,0, e 1mM
de EDTA por 30 minutos à 37ºC. Os cortes foram submetidos a uma lavagem em 0,1x SSC
por 60 minutos em 55ºC. Subsequentemente, os cortes foram incubados no anticorpo anti-
CTb por 48 horas como descrito acima, usando DAB como cromógeno. Os cortes foram
montados em lâminas SuperFrost Plus (Fisher Scientific) e desidratados em concentrações de
etanol crescentes. Depois da secagem, os cortes foram colocados em um filme cassete de
raios-X BMR-2 (Kodak, Rochester, NY) por 2 dias. Os cortes foram mergulhados em
emulsão fotográfica NTB2 (Kodak), guardados em um recipiente para secagem, em caixas
envolvidas por papel alumínio a 4ºC por 16-20 dias. As lâminas foram reveladas com
revelador D-19 (Kodak), e desidratadas, deslipidificadas com xilol e cobertas com DPX e
lamínula.
3.9 Análise de dados
Os cortes marcados pelas técnicas de IPe ou pela combinação metódica de IPe/HIS
foram examinados ao microscópio óptico de campo claro e escuro com microscópio Zeiss
Axioimager A1 (Zeiss, Muenchen, Alemanha). Os cortes marcados pela técnica de IF foram
examinados com o mesmo microscópio sob iluminação de epifluorescência. Fotomicrografias
digitais foram adquiridas usando uma câmera Zeiss Axiocam HRc (Zeiss). As imagens dos
32
cortes de dupla- ou tripla IF foram adquiridas e analisadas com uso do software Axiovision
(Zeiss), que permite a aquisição de imagens de diferentes canais de fluorescência e uma
superposição subsequente destas imagens. Este software também foi usado para contagem de
eventos e medidas.
A distribuição global das marcações anterógradas e retrógradas dos casos
representativos foram mapeados usando o programa de desenho AutoCad R13 e uma câmera
lúcida acoplada a um microscópio Diaplan (Leitz, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e
situada frente à um monitor (Pivot 1700, Portrait Display Labs.). A quantificação de células
simplesmente marcados para CTb ou duplamente marcados para ChAT/CTb em cortes
processados para dupla–imunofluorescência para ChAT/CTb foi realizada com o auxílio do
software Axiovision (Zeiss, versão 4.8. 2). A identificação e a quantificação de neurônios
simples ou duplamente marcados foram realizadas em imagens num formato de 1388 x 1040
pixels, adquiridas com objetiva de 20x. Somente corpos celulares nitidamente em foco foram
considerados para análise e classificados como simples- ou duplamente marcados. Devido à
escassez de neurônios retrogradamente marcados na parte ventral do LDTg (LDTgV), as
contagens das células foram restritas ao LDTg. Todos os neurônios dentro do LDTg que
exibiram um corpo celular bem marcado e em foco foram considerados para análise, plotados
eletronicamente e classificadas como simples- ou duplamente marcado. Esta análise foi
realizada em 3 animais em 3-4 cortes ao longo do eixo rostrocaudal do LDTg, com intervalo
nos cortes de 160 m.
Os cortes processados pela técnica de HIS seguido pela imunoistoquímica para CTb
foram examinados tanto sob iluminação de campo claro quanto escuro com um microscópio
Zeiss Axioimager A1 (Zeiss). A quantificação das células CTb contendo mRNA de GAD67 no
IP, MnR/PMnR, e LDTg foi realizada em 2 animais que tiveram injeções de CTb no
MnR/PMnR (RD4, RD11) e em 3 animais com injeções de CTb no IP (RL63, RL67, RL68).
Para esse propósito, fotomicrografias abrangendo o IP, o MnR/PMnR ou o LDTg em toda a
sua extensão foram capturadas sob iluminação de campo claro com objetiva de 20x e
fotomontagens foram montadas utilizando o software Adobe Photoshop (versão 7.0; Adobe
Systems Inc., Mountain View, CA). Estruturas de interesse foram circunscritas nas imagens e
células simplesmente marcados para CTb ou duplamente marcadas para CTb/GAD67 foram
plotadas eletronicamente com o software Axiovision. Esta análise foi realizada em 2-4 cortes
ao longo do eixo rostrocaudal das estruturas de interesse, com intervalo entre os cortes de 160
m. Considerando que a penetração dos anticorpos primários e secundários para CTb foi
muito maior que aquela das partículas de prata indicativo para mRNA, somente neurônios
33
CTb+ em foco na superfície do corte foram considerados para análise. Neurônios CTb+ foram
considerados como duplamente marcados, quando a densidade das partículas de prata acima
do corpo celular foi mais que três vezes maior (> 10 partículas de prata por neurônio) que os
níveis de fundo. As fotomicrografias foram processadas e montadas com o programa Adobe
Photoshop (Versão 7.0). O equilíbrio de cor, contraste e brilho das imagens foram ajustados
de maneira variável. O programa Canvas (ACD Systems, Victoria, Canada, Version 9,0) foi
utilizado para desenhos feitos em cima de fotomicrografias e esquemas.
A nomenclatura utilizada no presente estudo é baseada no atlas de Paxinos e Watson
(2007) a menos que especificado de outra forma. Aderimos à nomenclatura recentemente
proposta por Wagner, Stroh e Veh (2014) para os diferentes subnúcleos do complexo da MHb
de ratos e camundongo. Estes autores descreveram cinco subnúcleos dentro da MHb que
correspondem bem com aqueles anteriormente descrito por Aizawa et al. (2012) em ratos.
Para os subnúcleos do complexo da LHb, foi utilizada a nomenclatura previamente
estabelecida por Andres, Von During e Veh (1999) no rato (ver também GEISLER; ANDRES;
VEH, 2003). No que diz respeito às subdivisões do IP, adotamos a nomenclatura de Lenn e
Hamill (1984), exemplificado em muito mais detalhes por Groenewegen et al. (1986). Assim,
nós distinguimos os subnúcleos do IP rostral (IPR), central (IPC) e apical (IPA), todos eles
não pareado. Além disso, existem quatro subnúcleos emparelhados bilateralmente, o IP
intermediário (IPI), lateral (IPL), dorsolateral (IPDL) e dorsomedial (IPDM). Com exceção do
IPA, que pode ser considerado como uma extensão caudodorsal do IP, estes subnúcleos estão
representados na Figura 2A. Esta figura ilustra um corte coronal do IP marcado pelo método
de imunoperoxidase para a subunidade do receptor AMPA GluA4, que identificamos
casualmente com um marcador válido para delinear os subnúcleos do IP. No que diz respeito
às subdivisões do DR adotamos a nomenclatura utilizada por Hioki et al. (2010) e ainda
distinguimos uma sub-região adicional, o DRD central (DRDCe), descrito recentemente por
Sego et al. (2014). Seguindo a descrição de Goto, Swanson e Canteras (2001), dividimos o NI
em uma parte compacta (NIC) e uma parte difusa (NID). No atlas de Paxinos e Watson
(2007), as duas partes emparelhadas dessa região característica da linha média que fica
localizada no chão do quarto ventrículo, são referidos como núcleo O e parte cinzenta central
alfa, respectivamente.
34
4. RESULTADOS
4.1 Experimentos de rastreamento anterógrado
4.1.1 Projeções ascendentes do IP
As injeções de PHA-L no IP foram destinadas a diferentes níveis ao longo do eixo
rostrocaudal do IP central. Todas as 5 injeções de PHA-L analisadas no presente estudo
(RL41, RL42, RL47, RL48, RL49) foram confinadas ao IP e não contaminaram a área
tegmental ventral (VTA) ou qualquer outra região adjacente. As injeções tiveram uma
aparência bastante semelhante com um centro contendo um número variável de neurônios
PHA-L impregnados e um halo difuso ao redor. De forma interessante, as injeções de PHA-L
no IP tenderam de estar confinado a subnúcleos específicos do IP, poupando os subnúcleos
adjacentes em sua maior parte ou totalmente (Figura 2, 3). É importante ressaltar que regiões
corticais e estriatais, assim como os núcleos intralaminares do tálamo foram livres de
marcação de PHA-L seguido de nossas injeções no IP. Esse fato exclui qualquer contaminação
substancial de estruturas adjacentes, como a VTA e o MnR pelas nossas injeções.
O caso RL42 (Figura 2B) foi escolhido para representar melhor as eferências do IP. A
distribuição da marcação anterógrada, neste caso, é ilustrada na figura 4. Este caso teve uma
injeção grande de PHA-L centrada no IPR, envolvendo caudalmente também o IPA. Alguns
neurônios impregnados com PHA-L foram encontrados no IPC, IPI, IPDL e IPDM, enquanto
não teve envolvimento do IPL nessa injeção.
A maioria dos axônios ascendentes saiu do IP bilateralmente perto do subnúcleo
dorsolateral formando feixes ao redor do pólo rostral do IP. Os axônios PHA-L+, em seguida,
tornaram-se menos organizados e seguiram em direção rostral por múltiplos trajetos. Um dos
principais ramos de axônios ascendentes seguiu o fascículo retroflexo, depois bifurcou-se,
cercou o corpo mamilar e finalmente formou um proeminente campo terminal no núcleo
supramamilar (SuM). As divisões laterais assim como a parte medial do SuM foram
robustamente inervadas por axônios PHA-L+, exibindo muitas ramificações terminais.
Portanto, em alguns níveis do SuM esta inervação apareceu levemente assimétrica (Figura
4H). Dorsal ao SuM, feixes de axônios PHA-L+ visando como alvo o pólo caudal da LHb
ascenderam entre o fascículo retroflexo e o ventrículo lateral. Na LHb, encontramos uma
robusta marcação de PHA-L principalmente confinado a parte medial da LHb (LHbM) que
evitou de forma bem visível o subnúcleo parvocelular (Figura 5B). No terço rostral da LHb,
axônios e terminais PHA-L+ tornaram-se mais homogeneamente distribuídos. Em contraste,
35
exceto poucos axônios ocasionais, tipicamente encontrados ao longo da divisa entre LHb e
MHb, a MHb estava desprovida de axônios PHA-L+. Alguns axônios foram observados
entrando na estria terminal e um pequeno campo terminal ocupou um distrito entre a parte
mais rostral do núcleo talâmico mediodorsal e o núcleo talâmico paratenial (Figura 4E). Um
outro pequeno campo terminal talâmico, provavelmente formado por axônios ascendendo ao
lado do trato mamilo-talâmico, estava localizada no núcleo talâmico submédio.
Outra parte considerável dos axônios oriundos do IP ascenderam no feixe
prosencefálico medial. Assim, muitos axônios de passagem, mas também pequenos campos
terminais foram observados na parte peduncular do hipotálamo lateral. Alguns destes axônios
percorreram medialmente e formaram campos terminais locais em uma região hipotalâmica
englobando, sobretudo o hipotálamo lateral perifornicial e o núcleo hipotalâmico posterior
(Figura 4F, G). Um grande contingente de axônios de passagem continua a percorrer em
direção rostral, primeiro ao lado do fórnice atravessando a parte peduncular do hipotálamo
lateral (Figura 4E) e em seguida a área pré-óptica lateral (Figura 4D). Uma parte destes
axônios formou campos terminais locais na área pré-óptica medial (Figura 4D, E). Portanto, a
maioria deles continuou ascendendo entre o fórnice e a estria medular ou penetrando no
fórnice visando finalmente o complexo septal e o hipocampo, respectivamente. Entrando no
septo, a maior parte dos axônios PHA-L+ atravessou o núcleo septo-hipotalâmico, que
também exibiu campos terminais proeminentes. A parte ventral do núcleo septal lateral (LSV)
foi uma das regiões prosencefálicas mais robustamente marcadas e foi ocupada por um grande
contingente de axônios PHA-L+, a maioria deles sendo altamente varicosas (Figuras 4A-C,
5A). No entanto, a inervação do LSV por axônios oriundos do IP não foi homogênea. A
marcação de PHA-L foi mais densa e bastante focal na parte caudal do LSV em um nível
onde ocorre o cruzamento da comissura anterior (Figura 4C). Em níveis mais rostrais do LSV
(Figura 4A, B), os axônios PHA-L+ apresentam-se associados ao ventrículo lateral e muitos
deles estendem-se dorsalmente na parte intermédia do núcleo septal lateral que era a estrutura
cerebral mais rostral contendo quantidades consideráveis de axônios PHA-L+. Notavelmente,
com exceção de alguns axônios ascendentes, o septo medial estava quase desprovido de
axônios PHA-L+. Outro campo terminal bastante robusto foi observado no hipocampo. De
forma interessante, a marcação no hipocampo foi principalmente restrita ao seu pólo
temporal/ventral, com a maior parte da marcação encontrada no campo CA1 do hipocampo
ventral ou em torno, da camada granular do giro dentado (Figura 5C).
É importante ressaltar que a maior parte das projeções ascendentes descritas acima,
foram detectadas somente nos dois casos (RL42, RL48), em que a injeção envolveu em um
36
grau substancial a metade dorsocaudal do IP (ou seja, os subnúcleos IPA, assim como a parte
caudal do IPR e IPDM). Em contraste, as projeções ascendentes do IP estavam quase
completamente ausentes nos casos, em que a injeção estava principalmente confinada à parte
central do IP ventral, ou seja, aos subnúcleos IPI e IPC (casos RL47, RL49) ou à parte rostral
do IPR (RL41). Isto se tornou particularmente evidente, comparando a marcação resultante
das injeções de PHA-L nos casos RL 48 (Figura 2C) e RL 47 (Figura 2D). Estes dois casos
tiveram grandes injeções de PHA-L centradas no IPI que apareceram na primeira vista
bastante semelhantes. No entanto, a injeção no caso RL48 também envolveu o IPR, IPDM,
IPA e a metade caudal do IPL, resultando em uma marcação robusta no septo, hipocampo e
hipotálamo, semelhante ao padrão descrito acima no caso RL42. Em contraste, todas estas
projeções ascendentes eram quase ausentes no caso RL47, em que a injeção foi confinada ao
IPI/IPC.
4.1.2 Projeções descendentes do IP
É importante ressaltar que todas as projeções descendentes descritas aqui, para o caso
RL42 foram observadas em todos os outros casos com injeções de PHA-L no IP. No nível do
local de injeção, os axônios PHA-L+ espalharam-se fora do IP em todas as direções. A
maioria desses axônios percorreu bilateralmente em direção dorsal, evitando o núcleo
interfascicular e o núcleo rostral linear da rafe e juntaram-se em feixes antes de entrar na
substância cinzenta periaquedutal. Na substância cinzenta periaquedutal axônios ascendentes
e também alguns campos terminais locais, foram observados sobretudo nas colunas
dorsolateral e lateral (Figura 4I). Mais caudal, axônios PHA-L+ saíram da parte caudal do IP
subindo em feixes percorrendo medialmente o MnR ou lateralmente o PMnR (Figura 4J). Em
níveis rostrais ao longo do MnR/PMnR, axônios PHA-L+ de grande calibre e espessura lisa
foram misturados com axônios formando campos terminais locais. Em direção caudal, esse
padrão foi substituído por uma densa rede homogênea de axônios PHA-L+, formando campos
terminais em todas as partes do MnR (Figuras 4J-L, 6B) enquanto o PMnR somente exibiu
poucos axônios PHA-L+.
O núcleo dorsal da rafe (DR) foi inervado de forma visivelmente heterogênea (Figura
6). Assim, a densidade das projeções oriundas do IP foi apenas escassa a moderada na parte
rostral e médio-rostrocaudal do DR (Figuras 4J, K, 6A). Além disso, nesses níveis, a maior
parte dos axônios e terminais PHA-L+ foi confinada às asas laterais do DR, que contêm
sobretudo neurônios GABAérgicos (HIOKI et al., 2010). Em contraste, o DRC apresentou
uma marcação de PHA-L bastante densa (Figuras 4L, 6B). Através da dupla
37
imunofluorescência para PHA-L e 5-HT, encontramos muitos terminais PHA-L+ fazendo
contatos com neurônios 5-HT+ (Figura 6C).
Mais caudalmente, uma robusta marcação de PHA-L ocupa o chão do quarto
ventrículo e a região do LDTg, enquanto o núcleo tegmental póstero-dorsal e o lócus
coeruleus apresentam-se desprovidos de marcação anterógrada (Figuras 4L, M, 7). Em torno
de cerca 9 mm posterior ao Bregma, a robusta marcação de PHA-L no DRC foi primeiro
acompanhado lateralmente e ainda mais caudal substituído por uma marcação de PHA-L
extremamente densa em outra região da linha média, o NI. Ao lado do MnR e do DRC, o NIc
se destacou como um dos alvos principais do IP, enquanto a inervação axonal do NId
lateralmente adjacente foi considerável menos densa (Figuras 4M, N, 7).
38
Figura 2. A-D: Locais de injeção de PHA-L no IP. Fotomicrografias ilustrando subdivisões do núcleo
interpeduncular (IP) em um nível médio-rostrocaudal desse núcleo através da imunomarcação para GluA4 (A) e
três locais de injeção de PHA-L representativos no IP (B-D). Nota-se que as injeções de PHA-L no IP tendem a
ser confinadas a subnúcleos específicos do IP, evitando parcialmente ou totalmente os subnúcleos adjacentes (por
exemplo, o IPL no caso RL42 e IPL, IPDL e IPR no caso RL47). Escala da barra = 100 µm em A (aplica-se a A-
D).
39
Figura 3. A-E: Desenhos esquemáticos de neurônios impregnados por PHA-L no IP. São ilustrados três níveis
ao longo do eixo rostrocaudal do IP em cinco casos individuais. Cada ponto representa um neurônio impregnado.
Repare que os limites dos subnúcleos do IP só foram representados quando foram facilmente identificáveis. Uma
fotomicrografia do local de injeção dos casos RL42, RL47 e RL48 é fornecida na Figura 2.
40
Figura 4. A-N: Desenhos esquemáticos de axônios anterogradamente marcados resultantes de uma injeção de
PHA-L centralizada na parte dorsocaudal do IP (caso RL42, Figura 2B). As secções são ordenadas de rostral para
caudal e a injeção é indicada em preto em I. Para as abreviaturas, ver a lista.
41
Figura 4. A-N. Continuação.
42
Figura 5. A-C: Fotomicrografias ilustrando a marcação de PHA-L no septo (A), na habênula lateral (B) e no
hipocampo (C). A marcação é resultante de uma injeção de PHA-L centralizada no IP (caso RL48; Figura 2C).
Repare a marcação densa e focal na parte ventral do núcleo septal lateral (LSV, inserção em A), na LHb e na arte
ventral do campo CA1 do hipocampo (inserção em C). Em B, note a ausência de marcação na MHb e LHbMPc.
Para abreviaturas, ver a lista. Escala da barra = 200 µm em A, B; C; 20 µm nas imagens inseridas.
43
Figura 6. Fotomicrografia de campo escuro ilustrando marcação de PHA-L em níveis médio-rostrocaudal (A) e
caudal (B) do núcleo dorsal da rafe. Nota-se em A que a maior parte dos axônios PHA-L+ são encontrados no
DRL, e em B a densa rede de axônios PHA-L+ formando campos terminais cobrindo em todo o MnR e DRC. Os
asteriscos marcam o mesmo sítio nas fotografias de baixa e alta resolução. C: Dupla-imunofluorescência para 5-
HT (verde) e PHA-L (magenta) no DRC. As setas apontam para os terminais PHA-L+ formando aposições com
corpos celulares de neurônios 5-HT+. Para abreviaturas, ver a lista. Escala da barra = 150 µm em A (aplica-se
para A, B); 50 µm em C; 10 µm na imagem inserida em B.
44
Figura 7. A-E: Fotomicrografias de campo escuro (A-C) e campo claro (D, E) ilustrando a marcação de PHA-L
em três níveis rostrocaudal consecutivas através do núcleo incerto (NI). A marcação é resultante de uma injeção
de PHA-L centrada na parte dorsocaudal do IP (caso RL42; Figura 2B). Note em D e E que os axônios PHA-L+
no NIc exibem extensivas ramificações e botões sinápticos sugestivos de um campo terminal. Os asteriscos
marcam o mesmo sítio nas fotografias de baixa e alta resolução. Para abreviaturas, ver a lista. Escala da barra =
200 µm em A (aplica-se para A-C); 100 µm em D; 25 µm em E.
45
4.2 Experimentos de rastreamento retrógrado
4.2.1 Entradas prosencefálicas para o IP
Em geral, as nossas injeções de CTb foram tipicamente depositadas no IPR central
(Figura 8). Até agora 7 casos do acervo com injeções de CTb foram analisados. Em todos os
casos, as injeções foram essencialmente restritas ao IP sem contaminar outras estruturas
adjacentes. As injeções apresentaram um centro mais escuro rodeado por um halo periférico.
Embora as injeções se distinguiram com relação à posição de seu centro ao longo do eixo
rostrocaudal do IP, o depósito do traçador em 5 dos casos preencheu quase todo o IP (casos
R89, RL39, RL63, RL67, RL68). Porém, no caso RL40, o depósito da injeção de CTb foi
quase confinado ao subnúcleo IPR na metade dorsal do IP, sem contaminar os subnúcleos
IPL, IPI e IPC na metade ventral (Figura 8B). Em contraste no caso RL62, o depósito de CTb
foi quase confinado ao IPI, IPC e IPL na parte ventral do IP (Figura 8C). Em geral, nossas
injeções no IP resultaram em um padrão de marcação retrógrada bastante consistente. No
entanto, na MHb, cada injeção no IP resultou em um padrão singular de marcação, dando
mais uma prova para a organização topográfica intrigante das projeções da MHb para o IP.
Entre os casos com injeções no IP, o caso R89 foi escolhido como padrão para representar as
aferências para o IP. Este caso apresenta uma injeção de CTb grande, centrada na parte rostral
do IPR com o depósito do traçador praticamente preenchendo a maior parte do IP, exceto sua
região mais lateral (Figura 8A). A distribuição da marcação retrógrada, deste caso, é mostrada
na figura 9. A menos que indicado, a marcação retrógrada após injeções no IP foi
essencialmente bilateral. Para relacionar a marcação retrógrada diferenciada encontrada na
MHb com os locais de injeção, vamos descrever inicialmente a marcação na Hb.
No epitálamo, a MHb destacou-se como a estrutura prosencefálica mais densamente
marcada. No caso R89 e nos outros quatro casos, em que a injeção envolveu a maior parte do
IP, todos os três subnúcleos ventrais da MHb (MHbVl, MHbVc, MHbVm) foram ocupados
por neurônios CTb+ (Figura 8D). Alguns neurônios CTb+ foram também observados na LHb,
a maior parte deles em subnúcleos da LHbM. Além disso, foram encontrados poucos
neurônios CTb+ espalhados nos dois subnúcleos da parte dorsal da MHb, o MHbS e MHbD.
No caso RL40, em qual a injeção não envolveu os subnúcleos ventrais do IP, o subnúcleo
ventromedial da MHb (MHbVm) estava quase desprovido de marcação (Figura 8E). Por outro
lado, no caso RL62 em qual havia somente um pequeno depósito de CTb essencialmente
restrito aos subnúcleos IPL, IPI e IPC da parte ventral do IP, a marcação na MHb ficou
completamente confinada ao MHbVm. Além disso, RL62 foi o único caso, em que a LHb não
46
apresentou neurônios retrogradamente marcados (Figura 8F). Observamos nos cortes
revelados pela técnica de dupla imunofluorescência para CTb/ChAT que uma grande maioria,
mas não todos, os neurônios CTb+ na parte ventral da MHb foram duplamente marcados para
ChAT (Figura 8G-J). Em contraste, exceto poucos neurônios espalhados próximo do ponta
dorsal da habênula, todos os neurônios CTb+ na parte dorsal da MHb e na LHb medial foram
ChAT-.
No córtex, um número moderado de neurônios CTb+ foi observado nas subdivisões
pré-límbica e infra-límbica do córtex pré-frontal (Figura 9A), bem como num agrupamento
característico localizado imediatamente dorsal do pólo rostral do núcleo accumbens (ver,
YETNIKOFF et al., 2015). Além disso, houve uma marcação fraca no córtex cingulado que
diminui em direção caudal. O estriado dorsal e ventral, inclusive o núcleo accumbens, foram
desprovidos de neurônios CTb+, claramente indicando que as nossas injeções não envolveram
de forma substancial a área tegmental ventral (VTA). Uma quantidade considerável de
neurônios CTb+ foi observada ao longo de todo o eixo rostrocaudal do núcleo horizontal da
banda diagonal (HDB), com a maior parte dos neurônios retrogradamente marcados
consistindo de neurônios não colinérgicos (Figura 9B-D). Em níveis caudais do HDB a
marcação retrógrada se espalhou lateralmente para o núcleo pré-óptico magnocelular. O septo
destacou-se como outra fonte importante de entrada para o IP, com a maioria da marcação
retrógrada confinada ao núcleo septofimbrial (Figuras 9C; 10A). Além disso, poucos
neurônios dispersos foram encontrados no núcleo septo hipotalâmico e no septo ventrolateral.
O tálamo apresentou-se desprovido de marcação retrógrada, com exceção de poucos
neurônios CTb+ espalhados no núcleo paraventricular.
No hipotálamo, a marcação retrógrada apresentou-se muito fraca em regiões do
hipotálamo rostral, incluindo todas as partes da área pré-óptica (Figuras 9D; 10B). Foi
observada uma marcação somente discreta no núcleo paraventricular do hipotálamo. Entradas
fracas até moderadas originaram de uma região hipotalâmica que se estendeu do núcleo
posterior do hipotálamo medial passando dorsalmente sobre o fórnix e chegando lateralmente
à parte peduncular do hipotálamo lateral (Figura 9E, F).
O SuM destacou-se como outra importante fonte de entradas para o IP, contendo um
número elevado de neurônios retrogradamente marcados em todas as suas subdivisões
(Figuras 9G, H; 10C). Analisamos também cortes do SuM de dois ratos (RL63, RL68), que
foram duplamente marcados para CTb por imunoistoquímica e pelo mRNA de VGLUT2
através do método de hibridização in situ. Observamos aglomerações de prata indicativos de
mRNA de VGLUT2 acumulados sobre a maioria das células CTb+ no SuM (Figura 10D).
47
4.2.2 Entradas mesopontinas para o IP
No mesencéfalo rostral, alguns neurônios CTb+ podem ser observados na VTA, na parte
medial da substância negra compacta e na parte dorsal da substância cinzenta periaquedutal
(Figura 9I). Mais caudal, um grupamento característico de neurônios CTb+ foi confinado a
porção ventrolateral da substância cinzenta periaquedutal (VLPAG; Figuras 9J, K; 11A).
Alguns neurônios dispersos foram encontrados na formação reticular mesencefálica, no
campo retrorubral, ou embutidos na decussação do pedúnculo cerebelar e no lemnisco medial.
Além disso, poucos neurônios CTb+ apareceram na parte dorsocaudal do IP e na região
supralemniscal que contém o grupamento serotonérgico B9 (Figura 9J). Caudalmente, a
marcação na VLPAG persistiu e poucos neurônios CTb+ surgiram no DR (Figura 9L).
A marcação no DR exibiu um gradiente de densidade acentuada, com a marcação
retrógrada aumentando de maneira gradual em direção caudal. Assim, somente poucos
neurônios CTb+ dispersos, foram observados nas sub-regiões ventral e dorsal do DR (Figura
11A, B). Mais caudal, um grupamento característico de neurônios CTb+ surgiu nas asas
laterais (Figura 11B). Em direção caudal a densidade de neurônios CTb+ nas asas laterais
aumenta gradualmente (Figura 11C). O DRC finalmente exibiu uma marcação retrógrada
bastante robusta (Figura 11D).
O MnR, ao lado do LDTg e NI constitui uma das principais fontes de entrada para o
IP. No MnR, um grande número de neurônios CTb+ foi distribuído homogeneamente ao
longo de toda sua extensão rostrocaudal (Figura 9K-N, 14A). O núcleo paramediano da rafe
(PMnR) foi consistentemente marcado, mas continha menos neurônios que o MnR. O LDTg
se destacou por ter uma marcação retrógrada muito robusta que se estende desde o seu pólo
rostral para a sua porção mais caudal (Figuras 9N, O; 12A, B). Em contraste, poucos
neurônios foram encontrados na parte ventral do LDTg, bem como no núcleo tegmental
pedunculopontino. O núcleo tegmental póstero-dorsal estava quase livre de marcação em seu
nível rostral, mas continha alguns neurônios CTb+ em sua porção caudal. Uma marcação
retrógrada intensa foi encontrada no pequeno núcleo esferóide. Além disso, uma marcação
retrógrada robusta foi distribuída em todo o locus coeruleus (Figuras 9O; 12A-C).
Na parte compacta do núcleo incerto (NIc) foi observado uma marcação retrógrada
muito densa ao longo de toda sua extensão rostrocaudal, enquanto a marcação na sua parte
difusa (NId) se mostrou consideravelmente mais fraca (Figura 12). O NIc e o NId podem ser
facilmente reconhecidos em cortes corado pela técnica de Nissl (Figura 12D) como estruturas
acompanhando bilateralmente a linha média em um nível rostrocaudal onde os neurônios 5-
48
HT+ tornam-se cada vez mais escassos (Figura 12F). Ainda mais caudalmente, alguns
neurônios CTb+ foram observados no núcleo interpósito da rafe e na parte dorsal do núcleo
subcoeruleus. É importante mencionar que estruturas como o DRC, MnR, LDTg e NI não
somente apresentaram uma robusta marcação de CTb retrógrada, mas também uma difusa
marcação de CTb anterógrada.
4.3 Assinatura neuroquímica das projeções do MnR e LDTg para o IP
Entretanto é bastante esclarecido que o DR e MnR/PMnR contêm além dos
neurotransmissores clássicos 5-HT e GABA, também grandes populações de neurônios com
uma assinatura neuroquímica mista serotoninérgica/glutamatérgica ou puramente
glutamatérgica (HIOKI et al., 2010; SEGO et al., 2014). Além disso, tem sido descrito
projeções não-serotoninérgicas do DR e do MnR para estruturas específicas, tais como o
hipocampo (AZNAR; QIAN; KNUDSEN, 2004; SZÖNYI et al., 2016) e VTA (QI et al.,
2014). Assim, a fim de especificar a exata assinatura neuroquímica dos neurônios do DR e
MnR/PMnR que se projetam para o IP, nós combinamos a detecção imunoistoquímica de CTb
com métodos de imunofluorescência para 5-HT e/ou VGLUT3 e também com a hibridização
in situ para GAD67 ou VGLUT3.
Em níveis rostrais/médio-rostrocaudais através do DR, neurônios duplamente
marcados para CTb/5-HT, bem como CTb/VGLUT3 foram completamente ausentes. Assim,
em cortes triplamente marcados para CTb/VGLUT3/5-HT, todos os neurônios CTb+ foram
restritos nas asas laterais do DR e simples marcados (Figura 13A). Ao combinar o
rastreamento retrógrado com CTb através do IP com a hibridização in situ para GAD67, nós
observamos que quase todos, se não todos, os neurônios CTb+ no DRL exibiram aglomerados
de partículas de prata indicativos de mRNA de GAD67 (Figura 13B).
Mais caudal, observou-se que o DRC continha poucos neurônios duplamente
marcados para CTb/5-HT (Figura 14A) e muito raramente também neurônios triplamente
marcados para CTb/5-HT/VGLUT3. Ventralmente no MnR, neurônios duplamente marcados
para CTb/5-HT ou CTb/VGLUT3 também provaram ser bastante escassos. Conforme
demostrado pelas técnicas de dupla imunofluorescência para 5-HT/VGLUT3 ou pela
combinação do rastreamento retrógrado com CTb através do IP com a técnica de hibridização
in situ para mRNA de VGLUT3, os poucos neurônios duplamente marcados para
CTb/VGLUT3 foram tipicamente encontrados perto do polo ventral do MnR (Figura 14B).
Em seguida, analisamos cortes do MnR/PMnR duplamente marcados para CTb e mRNA de
GAD67 em 2 ratos (RL67, RL68) que tiveram injeções de CTb na parte rostral do IPR.
49
Observamos que mais de 68% (84 de 122 neurônios) dos neurônios CTb+ no IP também
exibiram aglomerados de partículas de prata indicativos de mRNA de GAD67 (Tabela 4,
Figura 14, C, D).
O LDTg é conhecido como outra fonte principal de entradas do IP (CONTESTABILE;
FLUMERFELT, 1981; GROENEWEGEN et al., 1986; LIMA et al., 2017; QUINA et al.,
2017) e compreende proeminentes subpopulações de neurônios colinérgicos, glutamatérgicos
e GABAérgicos (WANG; MORALES, 2009). No entanto, a exata assinatura neuroquímica
das projeções do LDTg para o IP permanece desconhecido. Para esclarecer, se o LDTg pode
proporcionar, além da MHb, outra entrada colinérgica em grande escala para o IP,
combinamos primeiro rastreamento retrógrado com CTb através do IP com a marcação de
imunofluorescência para ChAT. A semi-quantificação dessa marcação em 3 animais revelou
que uma boa parte dos neurônios CTb+ no LDTg (28.07% ± 3.36%) foi duplamente marcado
para ChAT (Tabela 5). Em seguida, analisamos cortes do LDTg duplamente marcados para
CTb e mRNA de GAD67 em 3 animais (RL63, RL67, RL68) com injeções de CTb centradas
no IPR rostral. Um exame cuidadoso desses cortes revelou que quase dois terços das células
CTb+ no LDTg continha aglomerados de partículas de prata indicativos de mRNA de GAD67
(Tabela 6).
4.4 Conexões do MnR com o IP e Hb
Especificamente para detalhar as projeções recíprocas entre o MnR e a Hb, bem como
entre o MnR e o IP, injeções de CTb (Figura 15A) e PHA-L (Figura 15B) foram feitas em
diferentes níveis ao longo do eixo rostrocaudal do MnR. As injeções de CTb analisadas no
presente estudo (RD4, RD10, RD11, RD29, RD32), variaram em tamanho, mas foram todas
confinadas ao MnR e PMnR adjacente com leve contaminação do núcleo ventral tegmental de
Gudden (VTg) em dois casos. Em geral, as injeções CTb no MnR/PMnR resultaram em uma
marcação retrógrada bastante robusta na LHb, enquanto que a MHb estava quase desprovida
de células CTb+. Além disso, confirmamos dados anteriores de rastreamento anterógrado do
nosso grupo (GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012; SEGO et al., 2014), mostrando que a
maior parte dos neurônios CTb+ na LHb foi confinada a LHbM, com alguns neurônios CTb+
adicionais presentes na LHbL. Afim de verificar se as projeções da LHb para o MnR/PMnR
são predominantemente glutamatérgicas, nós analisamos em seguida cortes da LHb de 2
animais (RD4, RD11) com injeções de CTb no MnR/PMnR que foram duplamente marcados
para CTb e mRNA de VGLUT2. Quase todas as células CTb+ observadas na LHb exibiram
aglomerados de grãos de prata indicativos de mRNA de VGLUT2 (Figura 15C).
50
Em geral, as injeções de CTb no MnR ou PMnR produziram marcação retrógrada
intensa no IP abrangendo todo seu eixo rostrocaudal. Todos os subnúcleos do IP continham
neurônios CTb+, como o IPR, IPDL, IPDM e a metade lateral do IPL tipicamente exibindo
uma marcação mais proeminente. Em contraste, a marcação retrógrada de CTb foi na maioria
dos casos mais fraca na metade medial do IPL, no IPC e no IPI (Figura 15D). Nos casos com
uma injeção assimétrica de CTb no MnR/PMnR, tornou-se claro, que a projeção do IPDL para
o MnR/PMnR é predominantemente contralateral. Além disso, a marcação retrógrada de CTb
no IP foi tipicamente acompanhada de uma marcação anterógrada difusa de CTb, que se
mostrou particularmente densa no IPC. Em seguida, analisamos cortes do IP em 2 animais
(RD4, RD11) com injeções de CTb no MnR/PMnR que foram duplamente marcados para
CTb e mRNA de GAD67. A análise desses cortes sob a óptica de campo claro revelou que
mais de 55% (130 de 236) das células CTb+ em foco na superfície do tecido do IP continham
mRNA de GAD67 (Tabela 7). A metade medial do IPL (Figura 15F) claramente se destacou
por conter a maior proporção de neurônios duplamente marcados.
Por fim, analisamos as projeções do MnR para o IP e a Hb em 5 casos com injeções de
PHA-L no MnR/PMnR. Nossa descrição baseia-se principalmente em 2 casos (RD33 e RD34)
com injeções de PHA-L centradas no MnR que resultaram em uma marcação anterógrada
bastante intensa no IP e Hb. Curiosamente, os axônios vindos do MnR formaram campos
terminais densos em subnúcleos do IP, diferentes daqueles que proeminentemente inervam o
MnR (Figura 15G, compare com a Figura 15D). Assim, os axônios do MnR apresentaram
como alvo preferencial o IPC e o IPI, sendo que estes subnúcleos do IP continham uma
marcação retrógrada relativamente fraca, após injeções de CTb no MnR. Por outro lado, o
IPDM e IPL eram quase desprovidos de marcação de PHA-L, mas normalmente exibiam uma
marcação retrógrada de CTb robusta seguidos de injeções no MnR. Além disso, a marcação
de PHA-L foi mais proeminente nos dois terços caudais do IP comparado a seu terço rostral
em qual o IPR foi quase completamente desprovido de axônios PHA-L+. Na Hb, um
proeminente campo terminal ocupou a LHbM com alguns axônios adicionais observadas na
LHbL (Figura 15E). Muito raramente, observamos axônios PHA-L+ se estendendo para a
MHb. Finalmente, a porção septal do hipocampo localizado dorsal da Hb foi robustamente
inervado por axônios PHA-L+ (Figura 15E).
4.5 Conexões do LDTg com o IP e Hb
Especificamente para detalhar as projeções recíprocas entre o LDTg e a Hb, bem como
entre o LDTg e o IP, injeções de CTb (Figura 16A, 17A) e PHA-L (Figura 17B) foram feitas
51
em diferentes níveis ao longo do eixo rostrocaudal do LDTg. Todas as injeções de CTb no
LDTg analisadas no presente estudo (RD55, RD67, RD68) envolveram principalmente a sua
divisão dorsal. Em geral, as injeções de CTb no LDTg resultaram em uma marcação
retrógrada bastante robusta na LHb, enquanto que somente ocasionalmente um neurônio
CTb+ foi achado na MHb (Figura 16B). Semelhante dos casos com injeção do CTb no MnR,
a grande maioria dos neurônios CTb+ resultantes de injeções no LDTg foi confinada a
LHbM, com alguns neurônios CTb+ adicionais presentes na LHbL e ao redor do fr (Figura.
16B).
As injeções de CTb no LDTg também produziram marcação retrógrada intensa no IP
abrangendo todo seu eixo rostrocaudal (Figura 17A, C, E). Notavelmente, a marcação de CTb
no IP foi bilateral e altamente lateralizado. Assim na porção rostral do IP, a mais intensa
marcação retrógrada foi encontrada predominantemente no lado ipsilateral numa faixa lateral
do IPR (Figura 17A), recentemente denominado núcleo interpeduncular rostrolateral (IPRL;
QUINA et al., 2017). Em contraste, em níveis mais caudais do IP, o IPDL contralateral foi o
subnúcleo mais fortemente marcado, apresentando um número de neurônios
consideravelmente maior que o IPDL ipsilateral (Figura 17C, E). Além disso, populações
menores de neurônios CTb+ foram encontrados no IPL ipsilateral, no IPR e IPC, e
bilateralmente no IPDM. De novo, a marcação retrógrada de CTb no IP foi tipicamente
acompanhada de uma marcação anterógrada difusa de CTb, que se mostrou particularmente
densa no IPDL e IPL contralateral.
Por fim, analisamos as projeções do LDTg para o IP e a Hb em 3 casos com injeções
de PHA-L no LDTg (RD52, RD65, RD75). Nesses casos, a injeção foi centrada, ou na parte
central (RD52), ou na parte ventral (RD65) do LDTg caudal, e na parte ventral do LDTg
rostral (RD75). Todas essas injeções deram origem a uma marcação somente moderada na
LHb (Figura 16D) e em uma marcação anterógrada densa e bastante focal no IP (Figura 17B,
D, F). Assim, um campo terminal muito denso foi confinado ao IPDL contralateral, enquanto
o IPDL ipsilateral continha somente poucos axônios PHA-L+ (Figura 17B, D). Ademais, um
contingente menor de axônios PHA-L+ foi observado no IPL.
52
CTb CTb e GAD
Casos n n %
RL 67 65 44 67,69
RL 68 57 40 70,18
Total 122 84 68,85
Tabela 4. Quantificação de GAD no MnR. Análise dos casos com injeção de CTb localizada no IP, utilizando a
técnica de hibridização in situ.
CTb CTb e ChAT
Casos n n %
RL 39 164 49 36,7
RL 67 109 24 22,01
RL 68 90 23 25,5
Total 363 96 28,07
Tabela 5. Quantificação de ChAT no LDTg. Análise dos casos com injeção de CTb localizada no IP, utilizando a
técnica de imunofluorescência.
CTb CTb e GAD
Casos n n %
RL 63 82 49 59,76
RL 67 138 97 70,29
RL 68 104 68 65,38
Total 324 214 66,05
Tabela 6. Quantificação de GAD no LDTg. Análise dos casos com injeção de CTb localizada no IP, utilizando a
técnica de hibridização in situ.
CTb CTb e GAD
Casos n n %
RD 04 150 89 59,33
RD 11 86 41 47,67
Total 236 130 55,08
Tabela 7. Quantificação de GAD no IP. Análise dos casos com injeção de CTb localizada no MnR, utilizando a
técnica de hibridização in situ.
53
Figura 8. A-F: Fotomicrografias da marcação de imunoperoxidase ilustrando injeções de CTb, centrado no IPR
rostral (caso R89; A) ou na parte dorsal (caso RL40; B) ou ventral (caso RL62; C) do IP central, assim como a
marcação retrógrada resultante na habênula (D-F). Note que a injeção no caso R89 resulta em marcação nos três
subnúcleos da MHbV e também na LHbM. Em contraste as injeções menores nos casos RL40 e RL62 resultaram
em um padrão mais seletivo com a marcação restrita a MHbVc/MHBVl (caso RL40) ou MHbVm (caso RL62),
respectivamente. G-J: Fotomicrografias da marcação de dupla imunofluorescência para CTb (verde) e ChAT
(magenta) na habênula, mostrando os dois canais sobrepostas no caso R89 (G), e os dois canais separados assim
como sobrepostas no caso RL62 (H-J). Repare que a maioria dos neurônios CTb+ na parte ventral da MHb
(MHbV) que é enriquecida em ChAT, são duplamente marcados. Escala da barra = 100 µm em A (aplica para A-
C); 150 µm em D (aplica para D-G); 50 µm em H (aplica para H-J).
54
Figura 9. A-P. Desenhos esquemáticos de neurônios retrogradamente marcados resultantes de uma grande
injeção de CTb centrada no IPR rostral (caso R89; Figura 8A). Cada neurônio retrogradamente marcado é
representado por um ponto. As secções são ordenadas de rostral para caudal e a injeção é indicada em preto em I.
Para abreviaturas, ver lista.
55
Figura 9. A-P. Continuação.
56
Figura 10. A-C: Fotomicrografias ilustrando marcação de CTb no septo (A), prosencéfalo basal (B) e no núcleo
supramamilar (SuM; C). A marcação é resultante de uma injeção de CTb centralizada no IP dorsocaudal (caso
RL39, mostrado na imagem inserida em B). Note em A a robusta marcação anterógrada de CTb no septo
ventrolateral (LSV) e em B a quase ausência de marcação retrógrada nos núcleos pré-óptico lateral e medial
(LPO, MPO). Repare também que os neurônios CTb+ na HDB são não-colinérgicos (imagem inserida em B). D:
Fotomicrografia de alta resolução da marcação de CTb e VGLUT2 no SuML. A marcação de CTb é resultante de
uma injeção de CTb no IP rostral (caso RL63, mostrado na imagem inserida). Repare que os agregados de grãos
de prata indicativos de mRNA de VGLUT2 são acumulados sobre a maioria dos neurônios CTb+ (setas apontam
para exemplos). Escala da barra = 200 µm em A (aplica-se a A, B); 250 µm em C; 25 µm em D; 100 µm nas
imagens inseridas.
57
Figura 11. A-D: Fotomicrografias ilustrando a marcação de CTb em quatro níveis consecutivos ao longo do eixo
rostrocaudal do núcleo dorsal da rafe (DR). A marcação de CTb resulta de uma injeção de CTb no IPR rostral
(caso R89; Figura 8A). Repare o proeminente gradiente rostrocaudal na densidade dos elementos CTb+ no DR,
com a marcação retrógrada e anterógrada aumentado em direção caudal. Escala da barra = 100 µm em A (aplica
para A – D).
58
Figura 12. A-C: Fotomicrografias de campo claro ilustrando a marcação de CTb em três níveis consecutivos ao
longo do eixo rostrocaudal do tegmento dorsal. A marcação é resultante de uma injeção de CTb centrada no IPR
rostral (caso R89; Figura 8A). Note a proeminente marcação retrógrada no NIc e no núcleo tegmental
laterodorsal (LDTg). D: Corte corado pela técnica de Nissl ilustrando a citoarquitetura em um nível rostrocaudal
entre A e B. E: Dupla imunofluorescência para 5-HT (verde) e CTb (magenta) a partir de um nível em um nível
rostrocaudal entre C e E. Repare a escassez de neurônios 5-HT+ nesse nível. Escala da barra = 200 µm em A
(aplica para A – C), 100 µm em D; 50 µm E.
59
Figura 13. Fotomicrografia de tripla-imunofluorescência para CTb (vermelho), VGLUT3 (verde), e 5-HT (azul)
no DR (A) e ChAT (vermelho), CTb (verde) e 5-HT (azul) no DRC e LDTg (C). A marcação de CTb é resultante
de uma injeção de CTb centrada na parte dorsocaudal do IP (caso RL39; inserção na Figura 10B). Repare em A
que neurônios CTb+ no DR estão principalmente restritos ao DRL e são todos não-serotoninérgicos/não-
glutamatérgicos. Repare em C que muitos neurônios CTb+ no LDTg são colinérgicos (exemplos indicados por
setas). Fotomicrografias da marcação de CTb e mRNA de GAD67 no DR (B) e LDTg (D). As setas apontam
para exemplos de neurônios CTb+ que expressam GAD67 e os asteriscos marcam o mesmo sítio nas fotografias
de baixa e alta resolução. Escala da barra = 100 µm em A, B, C; 20 µm nas inserções.
60
Figura 14. A, B: Fotomicrografias ilustrando marcações de dupla imunofluorescência para 5-HT (verde) e CTb
(magenta, A) ou VGLUT3 (verde) e CTb (magenta, B) no DRC/MnR. A marcação de CTb em A é resultante de
uma injeção na parte rostral do IPR (caso R89; Figura 8A) e aquela em B de uma injeção centralizada na parte
dorsocaudal do IP (caso RL39; Figura 10B). Repare que apenas poucos neurônios CTb+ no DRC/MnR são
duplamente marcados para 5-HT (setas em A) ou VGLUT3 (pontas de seta em B). A imagem inserida em B
ilustra um exemplo de um neurônio duplamente marcado para CTb e VGLUT3 mRNA. C, D: Fotomicrografias
da marcação de CTb e GAD67 mRNA no MnR/PMnR. A marcação de CTb é resultante de uma injeção na parte
rostral do IPR (caso RL 68; imagem inserida). Repare que os agregados de grãos de prata indicativos de mRNA
de GAD67 são acumulados sobre muitos dos neurônios CTb+ (exemplos indicados pelas setas). Os asteriscos
indicam o mesmo sítio nas fotografias de baixa e alta resolução. Escala da barra = 150 µm em A; 20 µm em B;
100 µm em C e na inserção; 25 µm em D.
61
Figura 15. Fotomicrografias ilustrando marcação de CTb e PHA-L resultantes de injeções no MnR/PMnR. A, B:
Injeções representativas de CTb (A) ou PHA-L (B) no MnR/PMnR. C: Marcação de CTb e mRNA de VGLUT2
na Hb. Repare que a maioria dos neurônios CTb+ se encontram na LHbM e contêm mRNA de VGLUT2
(imagem inserida). D, F: Marcação de CTb (D) e CTb/ transcrito do GAD67 (F) no IP. Repare que grãos de
prata são acumulados sobre quase todos os neurônios CTb+ no IPL. E, G: Marcação de PHA-L na
LHb/hipocampo (E) e no IP (G). Repare em E que a maioria dos axônios vindos do MnR estão confinados à
LHbM. Observe em G, comparando com D, que a marcação de PHA-L no IP evita os subnúcleos IPDM e IPL,
que contêm uma marcação retrógrada robusta seguidos de injeções de CTb no MnR. Escala da barra = 500 µm
em A (aplica-se a A, B); 150 µm em C (aplica-se a C, D, E, G); 25 µm em F e 10 µm nas imagens inseridas.
62
Figura 16. Fotomicrografias ilustrando a marcação de CTb (B) e PHA-L (D) na Hb resultantes de injeções de
CTb (A) ou PHA-L (C) no LDTg. Repare em A que a injeção de CTb é centrada na parte dorsal do LDTg
caudal, enquanto em C a injeção de PHA-L é centrado na parte ventral do LDTg rostral. Repare em C que a
maioria dos neurônios CTb+ resultantes de injeções no LDTg se encontram na LHbM, com alguns neurônios
CTb+ adicionais presentes na LHbL e ao redor do fr. Note em D que os axônios PHA-L+ inervam uma região
mais lateral do LHbM que aquela que dá origem as projeções para a LHb. Escala da barra = 200 µm em A
(aplica para A – D).
63
Figura 17. Fotomicrografias ilustrando marcação de CTb (A, C, E) e PHA-L (B, D, F) em três níveis
consecutivos ao longo do eixo rostrocaudal do IP. A, B (imagens inseridas): Injeções de CTb (A) ou PHA-L (B)
no LDTg que deram origem a marcação mostrado em A-F. Repare que a projeções entre IP e LDTg são
altamente lateralizados. Assim, a marcação retrógrada de CTb mais intensa é encontrada numa faixa lateral do
IPR ipsilateral (indicado por asterisco branco em A), enquanto no lado contralateral se destaca a intensa
marcação no IPDL (indicado por asterisco preto em B). Note também a intensa marcação focal de terminais
PHA-L+ no IPDL contralateral (B, D, inserção em D) enquanto o IPDL ipsilateral contém somente poucos
axônios PHA-L+. Escala da barra = 200 µm em A (aplica-se para A – F) e 100 µm nas imagens inseridas em A e
B, e 10 µm em D.
64
5 DISCUSSÃO
No presente estudo, investigamos através de traçadores anterógrado e retrógrado
combinado com técnicas de imunoistoquímica e hibridização in situ as conexões aferentes e
eferentes do IP, bem como a assinatura neuroquímica de algumas de suas principais entradas e
saídas. Os principais resultados do nosso estudo são mostrados em resumo na Figura 18. Em
geral, verificamos que todos os subnúcleos do IP contribuem para as projeções descendentes
do IP, tendo como alvos principais o MnR, o DRC, o NI, e o LDTg, enquanto as projeções
ascendentes do IP para o SuM, a LHb, o LSV, e o hipocampo ventral são principalmente
oriundas da parte dorsocaudal do IP. Resumindo, os nossos resultados sublinham que além de
receber uma entrada dominante da MHb, a principal característica das conexões do IP são
robustas interligações recíprocas com uma rede de núcleos da linha média. Essas estruturas
incluem o MnR, o NI, o SuM e o septo, todas consideradas estruturas-chave na regulação da
atividade teta do hipocampo. Além disso, observamos que as fortes conexões bidirecionais
entre o IP e o MnR são na sua maioria oriundas de neurônios GABAérgicos e que as
projeções do MnR são sobretudo direcionadas a subnúcleos do IP, diferentes daqueles que
emitem as mais proeminentes saídas para o MnR. Finalmente, revelamos que as projeções do
LDTg para o IP são predominantemente GABAérgicas e colinérgicas. Nossos resultados serão
discutidos dando referência a um papel funcional do IP 1.) como núcleo relé entre as duas
divisões principais da habênula e o hipocampo, 2.) como uma região associada a uma rede de
estruturas da linha média envolvida no controle do ritmo teta do hipocampo e 3.) com respeito
a importância das interconexões do IP com o MnR e LDTg para a resposta comportamental à
nicotina.
65
Figura 18. Diagrama esquemático das principais conexões aferentes e eferentes da Hb e IP, destacando as fortes
conexões recíprocas do IP com estruturas consideradas moduladoras-chave da atividade teta hipocampal
(indicada por letras azuis). Este diagrama é baseado em conexões exploradas neste estudo ou estudos anteriores
do nosso grupo (linhas sólidas) e dados da literatura (linhas tracejadas). Observe que o diagrama é altamente
simplificado. Assim, algumas das conexões aqui descritas como unilaterais são bidirecionais e existem ricas
interconexões entre a maioria das estruturas mesopontinas e mesencefálicas incluídas nesse diagrama. Por razões
de simplicidade, essas conexões não são mostradas. Observe também que enquanto as projeções da LHbM para
o tegmento pontino e os núcleos da rafe são todas glutamatérgicas, as projeções de volta dessas estruturas para a
LHb muitas vezes exibem uma assinatura neuroquímica mista e ainda não completamente determinada. Esquema
parcialmente adaptado de Hikosaka (2010), Gonçalves, Sego e Metzger (2012), Lima et al. (2017). Para
abreviações, veja a lista.
5.1 Considerações metodológicas
Uma limitação inerente para a interpretação dos resultados de um estudo de
rastreamento neural é o potencial de captação e transporte dos traçadores neuronais
retrógrados e anterógrados por fibras de passagem lesadas que passam pelos locais de
injeções (CLIFFER; GIESLER, 1988; LUPPI et al., 1995). A necrose acentuada no local de
injeção tem sido considerada como a principal causa de captação do traçador por fibras de
passagem (DADO et al., 1990; LUPPI et al., 1995). No entanto, o IP é um núcleo bem
delimitado contido numa cápsula, e não é atravessado por outros proeminentes tratos de
fibras. Além disso, no presente estudo, PHA-L e CTb na maioria dos casos, foram injetados
por iontoforese usando corrente pulsada, a fim de minimizar o desenvolvimento de calor e
consequente dano tecidual próximo as pontas das pipetas (LUPPI et al., 1990). Todavia, não
podemos excluir totalmente que alguma captação de PHA-L ou CTb tenha ocorrido por fibras
de passagem lesadas.
66
Um problema metodológico severo foi observado em nossos experimentos
combinados de rastreamento retrógrado com CTb com hibridização in situ usando sondas
radioativas. Assim em algumas regiões, como o DRC e o NI encontramos uma robusta
marcação retrógrada de CTb sendo fortemente misturados com uma também densa marcação
anterógrada de CTb. Isso muitas vezes tornou inviável de reconhecer sem dúvida limites
celulares e assim atribuir as aglomerações de prata resultantes das hibridizações a distintos
neurônios CTb+. Por exemplo, no NI foram detectados vários neurônios CTb+ exibindo
aglomerados de grãos de prata indicativos de mRNA de GAD67 ou VGLUT2. Porém, devido
ao fato descrito acima, não foi possível de realizar uma análise sistemática das células
duplamente marcadas nessas regiões.
5.2 Comparações gerais dos nossos resultados com aquelas de estudos anteriores
Os resultados obtidos até o presente momento estão de acordo com os resultados de
estudos pioneiros de rastreamento neural que examinaram as conexões aferentes
(CONTESTABILE; FLUMERFELT, 1981; SHIBATA; SUZUKI; MATSUSHITA, 1986) e
eferentes do IP (GROENEWEGEN et al., 1986). No entanto, desde então, novos núcleos têm
sido descritos ou núcleos existentes foram subdivididos em compartimentos funcionalmente
distintos, levando a novos conceitos sobre a estrutura e função de diversas regiões do cérebro
(ver, GEISLER; ZAHM, 2005). A afirmação inicial se aplica ao NI, que foi somente delineada
de forma convincente por Goto, Swanson e Canteras (2001) e Olucha-Bordonau et al. (2003).
Além disso, atualmente existe amplo consenso que a Hb (ANDRES; VON DURING; VEH,
1999; GEISLER; ANDRES; VEH, 2003; AIZAWA et al., 2012; WAGNER; STROH; VEH,
2014) e os núcleos da rafe (COMMONS; CONNOLLEY; VALENTINO, 2003; HIOKI et al.,
2010; CALIZO et al., 2011; SEGO et al., 2014) são estruturas altamente heterogêneas,
compostos por várias sub-regiões contendo populações neuronais distintas. Assim, uma vez
que os núcleos da rafe, a Hb e o NI são pilares da conectividade do IP e são os focos deste
estudo, os nossos resultados contribuem com novos aspectos importantes aos estudos
pioneiros citados acima.
Em contraste com a descrição clássica de Groenewegen et al. (1986), que utilizaram
aminoácidos radioativos ou conjugado aglutinina do germe de trigo-peroxidase do rábano
silvestre (WGA-HRP) como traçadores anterógrados, o uso de PHA-L nos permitiu de
distinguir claramente entre campos terminais e fibras de passagem. Ademais, algumas de
nossas injeções de PHA-L ou CTb foram pequenas o suficiente de propiciar conclusões bem
fundamentadas sobre a topografia de algumas entradas e saídas do IP. Por exemplo, as
67
projeções da MHb para o IP têm sido descritas em bastante detalhe através de estudos de
rastreamento neural (CONTESTABILE; FLUMERFELT, 1981; KIM, 2009),
imunoistoquímica (CONTESTABILE et al., 1987) ou distintos ensaios em camundongos
geneticamente modificados (QUINA et al., 2009; REN et al., 2011; HSU et al., 2013, 2014;
BROMS et al., 2014; SHIH et al., 2014; FRAHM et al., 2015). Em conjunto, esses estudos
destacaram que, enquanto que o IPL e o teto dorsal do IP são na primeira linha inervados por
neurônios da MHbD usando glutamato e substância P, todo o restante do IP é inervado por
neurônios da MHbV que co-liberam glutamato e acetilcolina (para uma revisão ver,
ANTOLIN-FONTES et al., 2015). No entanto, apesar da riqueza de informações sobre as
projeções diferenciadas da MHbD e MHbV para o IP, pouco se sabe sobre as projeções
específicas dos distintos subnúcleos, recentemente delineados dentro da MHbD e MHbV
(AIZAWA et al., 2012; WAGNER; STROH; VEH, 2014). A este respeito, nossos resultados
de rastreamento retrógrado demonstram que os subnúcleos IPC e IPI na parte ventral do IP
são seletivamente inervados pela MHbVm, enquanto a MHbVc e MHbVl inervam
principalmente o grupo dorsal dos subnúcleos do IP.
5.3 O IP como elo entre as duas divisões da habênula e o hipocampo
É importante ressaltar que nossos resultados de rastreamento anterógrado especificam
que as projeções ascendentes do IP são quase exclusivamente oriundas da parte dorsocaudal
do IP, formando proeminentes campos terminais focais no SuM, na LHbM, no LSV e no
hipocampo ventral. A primeira observação está conforme com os resultados de estudos
anteriores de rastreamento retrógrado, indicando que a maior parte dos neurônios
retrogradamente marcados resultantes de injeções no hipocampo ou no septo foram restritas
ao IPA, com muito poucos neurônios adicionais encontrados no IPL (GROENEWEGEN;
STEINBUSCH, 1984; MONTONE; FASS; HAMILL, 1988). No que diz respeito à estudos
anteriores de rastreamento anterógrado, o SuM e o LSV já foram descritos como alvos
importantes do IP por Groenewegen et al. (1986), enquanto somente projeções mínimas do IP
para a LHb e o hipocampo ventral têm sido descritas. Porém, as projeções do IP para a LHb e
o hipocampo ventral podem ser altamente relevantes, uma vez que proporcionam uma via de
ligação indireta entre a MHb e a LHb, e também entre a Hb e o hipocampo. Embora, que uma
parte dos axônios da MHb atravessam a LHb (KIM; CHANG, 2005), conexões intrínsecas
entre MHb e LHb nunca foram demonstradas de forma convincente. Nossos resultados
indicam que o IP pode ser um elo pelo qual informação vinda da MHb é transmitida para a
LHb. Por sua vez, conforme com nossos dados atuais de rastreamento retrógrado, vários
68
estudos de rastreamento anterógrado (KIM, 2009; GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012;
QUINA et al., 2015) têm demonstrado uma entrada bastante focal da LHbM para o IP. Assim,
nossos dados providenciam mais evidências para uma alça de retroalimentação entre a LHbM
e o IP e também sugerem que informações vindas da MHb e da LHbM podem ser acopladas e
integradas no IP.
Os resultados de vários estudos evidenciaram que a LHb é funcionalmente acoplada ao
hipocampo dorsal e também sugerem um envolvimento da LHb no processamento da
memória espacial (LECOURTIER; NEIJT; KELLY, 2004; GOUTAGNY et al., 2013;
MATHIS et al., 2015). Além disso, estudos recentes revelaram um elevado grau de sincronia
entre a LHb e o hipocampo dorsal e revelaram que lesões da LHb reduzem as oscilações teta
do hipocampo (AIZAWA et al., 2013; GOUTAGNY et al., 2013). No entanto, até o momento
nenhuma ligação direta entre Hb e hipocampo tem sido mostrado, ficando obscuro como a
LHb pode modular a atividade hipocampal. A saída direta do IP para o hipocampo
demonstrado aqui, indica que o IP pode ser um dos relés pelo qual informações vindas da
MHb e LHb podem chegar ao hipocampo. No entanto, é bem conhecido que o processamento
da memória espacial ocorre preferencialmente no hipocampo dorsal (MOSER; MOSER;
ANDERSEN, 1993; ROYER et al., 2010), enquanto o hipocampo ventral está mais
relacionado ao estresse, a emoção e ao afeto (FANSELOW; DONG, 2010; O'LEARY;
CRYAN, 2014). Assim, é sugestivo especular que a função da projeção focal do IP para o
hipocampo ventral seria de transmitir informações sobre eventos aversivos processadas na
LHb, e também na MHb, para o hipocampo. Conforme com isso, os resultados de um estudo
recente de rastreamento retrógrado transsináptico mostraram que a MHb é ligada através de
uma via bi-sináptica com o hipocampo ventral, provavelmente através de um relé na parte
dorsal do IP (OHARA et al., 2013).
Por outro lado, é bastante aceitável que a LHb pode influenciar o processamento da
memória espacial e a atividade teta do hipocampo, indiretamente através do MnR. De acordo
com isto, foram mostradas projeções focais diretas da LHbM para o MnR (BEHZADI et al.,
1990; SEGO et al., 2014), que por sua vez, inerva principalmente o hipocampo dorsal
(VERTES; FORTIN; CRANE, 1999). Além disso, foi demonstrado por Aizawa et al. (2013)
que o efeito inibitório de lesões na LHb sobre as oscilações teta do hipocampo depende de um
MnR intacto. Ademais, nesse estudo, a maior parte dos neurônios da LHb com atividade
síncrona foi encontrado na LHbM. Ao todo, nossos dados ilustram como informações vindas
da LHb e MHb podem ser transmitidas para o hipocampo. Eles ainda reforçam que a LHbM
69
possui um conjunto de conexões diferenciadas comparada à LHbL (HERKENHAM; NAUTA,
1977; GONÇALVES; SEGO; METZGER, 2012; SEGO et al., 2014).
5.4 O IP como uma parte associada de uma rede de estruturas da linha média envolvido
no controle do ritmo teta do hipocampo
A atividade teta do hipocampo (4-12 Hz) é um dos ritmos mais regulares do cérebro
que pode ser facilmente registrada no eletroencefalograma durante a atividade locomotora
voluntária, estados cerebrais associadas ao alerta, e durante o sono REM. A atividade teta é
controlada por uma rede neuronal que se estende do tronco cerebral para o prosencéfalo, com
a parte oral do núcleo reticular pontino (PNO), o SuM e o complexo septo medial/núcleo da
banda diagonal (MS/DB) consideradas peças chaves para a indução, e o MnR para a
interrupção do ritmo teta (para revisão ver, VINOGRADOVA, 1995; VERTES; KOCSIS,
1997; PAN; MCNAUGHTON, 2004; ORZEŁ-GRYGLEWSKA; MATULEWICZ;
JURKOWLANIEC, 2015). Embora os mecanismos exatos ainda não estejam bem
esclarecidos, há indícios de que as oscilações teta desempenham um papel importante em
processos de neuroplasticidade hipocampal, subjacentes a funções de memória e orientação
espacial (HUERTA; LISMAN, 1993; BUZSÁKI, 2002; HASSELMO, 2005; HASSELMO;
STERN, 2014). Porém, até o momento, existem somente relatos isolados na literatura que
ligam o eixo MHb/IP com a modulação da atividade teta. Assim, tem sido demonstrado que
lesões do FR (VALJAKKA et al., 1998) e perda de um fator de transcrição no IP (FUNATO et
al., 2010) reduzem as fases REM do sono e modulam a banda da atividade teta.
De forma importante, nossos resultados obtidos sublinham que o IP é robustamente
interligado de forma recíproca com estruturas tradicionalmente consideradas como
reguladores-chave da atividade teta do hipocampo, tais como o SuM, MS/DB e MnR. Além
disso, eles demonstram ligações bilaterais entre o IP e estruturas que só recentemente foram
reconhecidas como moduladores do ritmo teta, como o NI (NUÑEZ et al., 2006; MA et al.,
2009; MARTÍNEZ-BELLVER et al., 2015) e a LHb (AIZAWA et al., 2013; GOUTAGNY et
al., 2013). Ao todo, isso sugere um papel mais amplo do IP na modulação do ritmo teta do que
anteriormente relatado que deve em estudos futuros também sendo investigado através de
técnicas farmacológicas e eletrofisiológicas.
Conexões recíprocas do IP com o SuM já foram descritas anteriormente (SHIBATA;
SUZUKI; MATSUSHITA, 1986; GROENEWEGEN et al., 1986). Nós mostramos aqui que a
maioria dos neurônios que se projetam do SuM para o IP exibem um fenótipo glutamatérgico.
Entretanto, são necessários estudos mais profundas para detalhar o exato fenótipo das
70
projeções do SuM para o IP, uma vez que foi demonstrado que os axônios do SuM que
inervam o hipocampo apresentam um fenótipo GABAérgico, glutamatérgico ou misto
(SOUSSI et al., 2010). Nossos dados de rastreamento anterógrados indicam que o IPA
contribui mais para as projeções do IP para o SuM. Esse achado está bem alinhado com os
dados de Kiss et al. (2002), que descreveram que os neurônios retrogradamente marcados
resultantes de injeções no SuM, foram em sua maioria confinados ao IPA.
Nossos resultados obtidos com traçadores anterógrados em relação às projeções do IP
para o septo são mais difíceis de conciliar com um papel do IP na modulação do ritmo teta,
uma vez que encontramos a marcação anterógrada concentrada no LSV e não no MS/DB, que
é tradicionalmente visto como a principal região marca-passo da atividade teta hipocampal
(PETSCHE; STUMPF; GOGOLAK, 1962). No entanto, foi proposto que não apenas o
MS/DB, mas toda a rede neural que liga o hipocampo com o septo medial e lateral seja
envolvido na gênese do ritmo teta (NERAD; MCNAUGHTON, 2006). Assim, estudos
anteriores mostraram que as saídas septais para a MHb são primariamente oriundas do septo
posterior (SPERLÁGH et al., 1998; YAMAGUCHI et al., 2013). Os dados do presente estudo
mostrando projeções focais do IP para o LSV, indicam a existência de um tipo de circuito de
retroalimentação, ligando a MHb através do IP com o septo. De forma notável, o septo lateral
é tradicionalmente visto como uma parte importante dos circuitos envolvidos na sinalização
de eventos aversivos no cérebro (SHEEHAN; CHAMBERS; RUSSELL, 2004) e tem sido
mostrado funcionalmente ligado a Hb (MIRRIONE et al. 2014) e hipocampo ventral
(CALFA; BUSSOLINO; MOLINA, 2007). Confirmamos os achados de estudos de
rastreamento retrógrado anteriores (CONTESTABILE e FLUMERFELT, 1981; SHIBATA;
SUZUKI; MATSUSHITA, 1986), descrevendo uma entrada robusta direta do MS/DB para o
IP. No entanto, em contraste com estudos anteriores (por exemplo, ALBANESE;
CASTAGNA; ALTAVISTA, 1985), descobrimos que a grande maioria dos neurônios que se
projetam do IP para o MS/DB são não-colinérgicos. Essa discrepância pode ser devido ao fato
de que a acetilcolinesterase, que é muito menos específica que a ChAT, foi usada como
marcador para um fenótipo colinérgico nesses estudos anteriores. Mais uma vez, o fenótipo
exato do neurotransmissor usado pelas projeções do MS/DB ainda precisa ser esclarecido.
Nossos achados também fortemente enfatizam que conexões recíprocas com o NI é
outra característica marcante da conectividade do IP. Conexões bidirecionais entre IP e NI já
foram documentadas em estudos anteriores de rastreamento neural (HAMILL;
JACOBOWITZ, 1984; GROENEWEGEN et al. 1986; SHIBATA; SUZUKI; MATSUSHITA,
1986). No entanto, naquela época, o NI ainda não era muito caracterizado e diferenciado de
71
outras estruturas circundantes do tegmento dorsal. Assim, nos relatos de Hamill e Jacobowitz,
(1984) e Shibata, Suzuki e Matsushita (1986), o NI foi, provavelmente, confundido com o
núcleo esferoide. Funcional e anatomicamente, o NI está altamente integrado em circuitos que
regulam a ativação cerebral e a motivação (GOTO; SWANSON; CANTERAS, 2001;
OLUCHA-BORDONAU et al., 2003; SANCHEZ-PEREZ et al., 2015). É importante ressaltar
que nossos achados sublinham que o IP, o NI (GROENEWEGEN et al. 1986; SHIBATA;
SUZUKI; MATSUSHITA, 1986), e o MnR, (BEHZADI et al., 1990; VERTES; FORTIN;
CRANE, 1999) apresentam um conjunto semelhante de conexões robustas bilaterais com
núcleos-chave envolvidos na indução do ritmo teta, como o SuM e MS/DB. Embora, no caso
do septo, as projeções do IP para essa estrutura sejam diferentes daquelas oriundas do NI e
MnR, uma vez que os axônios do IP inervam principalmente o LSV, enquanto o MnR
(VERTES; FORTIN; CRANE, 1999) e o NI (GOTO; SWANSON; CANTERAS, 2001)
projetam com maior destaque para o MS. Estudos combinando lesões, registros
eletrofisiológicas (NUÑEZ et al., 2006), e rastreamento neural (TERUEL-MARTÍ et al.,
2008) caracterizaram o NI como um elo entre o PnO e o MS/DB. Devido a este conjunto
único de conexões, NI é considerado uma estrutura relé que integra a ativação
comportamental com o ritmo teta hipocampal (RYAN et al., 2011; MA; GUNDLACH, 2015;
MARTÍNEZ-BELLVER et al., 2015). No entanto, tem sido proposto que o NI não está
envolvido apenas na ativação comportamental, mas também na esquiva ativa, com entradas
do IP e do MnR exercendo influência inibitória sobre o NI (GOTO; SWANSON;
CANTERAS, 2001). A LHb é considerada uma estrutura chave envolvida na esquiva ativa
(HIKOSAKA, 2010; STAMATAKIS; STUBER, 2012). Visto que o NI recebe entradas
robustas diretas da LHbM (GOTO; SWANSON; CANTERAS, 2001), a entrada maciça do IP
para o NI pode fornecer informações adicionais de valência negativa para o NI, indiretamente
através do eixo do septo caudal/MHb/IP. Esta informação pode então ser integrada no NI para
evitar, de forma adaptativa, riscos potenciais (ver também, AMO et al., 2014).
No geral, o caráter bidirecional distinto das conexões do IP com estruturas como o NI,
MnR, SuM e septo, bem como as ricas interconexões recíprocas entre os últimos (por
exemplo, VERTES, 1988, 1992; VERTES; FORTIN; CRANE, 1999; GOTO; SWANSON;
CANTERAS, 2001), fortemente suportam uma hipótese recentemente postulado por Sanchez-
Perez et al. (2015, p. 565). Esclarecendo as conexões bilaterais entre NI e septo, esses autores
concluíram que: “Processos neurais e os comportamentos associados, iniciados ou modulados
por mudanças no ritmo teta do hipocampo, dependem provavelmente de conexões recíprocas
72
entre vias ascendentes e descendentes, em vez da regulação unidirecional através do septo
medial”.
5.5 Topografia das projeções entre o IP e o DR
O DR e MnR já foram descritos em estudos anteriores como sendo importantes fontes
de entradas (CONTESTABILE e FLUMERFELT, 1981; SHIBATA; SUZUKI;
MATSUSHITA, 1986), bem como os principais alvos (GROENEWEGEN et al., 1986) do IP.
No entanto, a exata topografia e assinatura neuroquímica das conexões recíprocas entre o IP e
DR permaneceram largamente inexploradas. Destacamos aqui a existência de um gradiente
nítido rostro-caudal em relação à densidade de marcação das conexões bidirecionais entre o IP
e DR, destacando o DRC como principal fonte e alvo do IP. De acordo com isso,
Groenewegen et al. (1986) já descreveram o DRC como a sub-região do DR, sendo mais
fortemente marcado após injeções de traçador anterógrado no IP.
É importante ressaltar que as conexões diferenciais do DRC descritas aqui fornecem
evidências substanciais adicionais de que o DRC é consideravelmente distinto dos dois terços
rostrais do DR (ver também, GONÇALVES et al., 2009; GONÇALVES; SEGO; METZGER,
2012; SEGO et al., 2014). A este respeito, com base em uma análise de dados publicados na
internet (Allen Institute for BrainScience. Allen Mouse Brain Connectivity Atlas [Inter-net].
Disponível em: http://connectivity.brain-map.org/;RRID:nlx_146253) (Oh et al., 2014)
mostrando que o DRC compartilha mais conexões com o MnR do que com o DR, Commons
(2015, 2016) propôs recentemente que faz mais sentido afiliar o DRC (grupamento B6) com o
MnR (grupamento B8) do que com o DR rostral (grupamento B7). Em sintonia com isso,
agora há claras evidências de que o DR e MnR inervam (VERTES; FORTIN; CRANE, 1999;
MUZERELLE et al., 2016), e também recebem projeções (OGAWA et al., 2014; POLLAK
DOROCIC et al., 2014), de um conjunto diferencial de estruturas cerebrais. Além disso,
também em termos de origem embrionária, o DRC está mais relacionado com o MnR do que
com o DR rostral (ALONSO et al., 2013). Argumentando que o DRC e a MnR estão
intimamente ligados à LHbM (BEHZADI et al., 1990; SEGO et al., 2014), Commons (2015)
propôs que ambas fazem parte de circuitos que influenciam o grau de excitação e processos de
aprendizagem, particularmente sob condições aversivas.
Em geral, nossos resultados corroboram bem com essas suposições, detalhando
que ambos, o DRC e o MnR, comparado a parte rostral do DR, exibem conexões bilaterais
muito mais robustas com o IP. Além disso, nossos resultados indicam que informações
aversivas podem ser transmitidas para o MnR/DRC também através do eixo MHb/IP. No
73
entanto, resta esclarecer se, em termos hodológicos, há uma transição brusca entre o DR
rostral e o DRC ou, como indicado pelos nossos resultados, uma transição gradual ao longo
do eixo rostrocaudal do DR.
Nós também especificamos que nos dois terços rostrais do DR, os neurônios que
aferentam o IP, consistem exclusivamente de neurônios GABAérgicos localizados no DRL.
De forma recíproca, nessa porção rostral do DR, a maioria dos axônios oriundos do IP tem
também o DRL como principal alvo. De forma notável, foi demonstrado que neurônios
serotoninérgicos e GABAérgicos do DRL são ativados pela nicotina aguda (ver Figura 8 em
SPERLING; COMMONS, 2011) e que circuitos GABAérgicos no DRL são seletivamente
alterados seguido estresse social (CRAWFORD; RAHMAN; BECK, 2013). Ao todo, nossos
achados fornecem novas evidências de que o DR é uma estrutura altamente heterogênea
composta de várias sub-regiões que contém subpopulações neuronais distintas que diferem
em relação a sua assinatura neuroquímica, suas projeções, e propriedades eletrofisiológicas
(para exemplo, COMMONS; CONNOLLEY; VALENTINO, 2003; HIOKI et al., 2010;
CALIZO et al., 2011; HALE; LOWRY, 2011, para mais citações ver, SEGO et al., 2014).
5.6 Organização dos circuitos entre Hb, IP e MnR/DRC e LDTg considerações
funcionais
Existe atualmente amplo consenso de que o eixo MHb-IP desempenha um papel chave
na mediação das propriedades aversivas da nicotina e comportamentos de abstinência (para
revisões, ver ANTOLIN-FONTES et al., 2015; FOWLER; KENNY, 2014; JACKSON et al.,
2015). Assim, nAChRs distintos provaram mediar as principais respostas à nicotina por meio
de mecanismos que incluem a facilitação pré-sináptica da liberação de glutamato pelos
axônios MHb no IP (FRAHM et al., 2015), e a regulação da atividade do marcapasso dos
neurônios colinérgico na MHbV (GÖRLICH et al., 2013), que são notavelmente capazes de
co-liberar acetilcolina e glutamato no IP através de diferentes modos de transmissão (REN et
al., 2011).
Porém, enquanto é bem documentado que as manifestações somáticas de abstinência
de nicotina são primariamente mediadas pelo eixo MHb-IP (SALAS et al., 2009; ZHAO-
SHEA et al., 2013), muito menos se sabe sobre as estruturas que contribuem para as
consequências afetivas da retirada da nicotina, incluindo o aumento da ansiedade (DAMAJ;
KAO; MARTIN, 2003; JACKSON et al., 2015). Candidatos promissores apontados em nosso
trabalho como alvos principais do IP, são o MnR/DRC e o LDTg. O MnR e DRC foram
apontados em experimentos farmacológicos/comportamentais, usando o marcador de
74
atividade neural c-Fos como aqueles distritos da rafe seletivamente envolvidos na regulação
da ansiedade (SPIACCI; COIMBRA; ZANGROSSI, 2012; ANDRADE et al., 2013).
Conforme com isso, vários estudos genéticos em peixes zebras (AGETSUMA et al., 2010;
AMO et al., 2014) e camundongos (YAMAGUCHI et al., 2013; SORIA-GÓMEZ et al., 2015;
ZHANG et al., 2016) implicaram recentemente o eixo MHb-IP, e também o eixo LHb-MnR,
na regulação da ansiedade e do medo. Assim, embora MHb e LHb exibam um conjunto de
conexões bastante diferenciada, esses estudos fornecem evidências adicionais que ambos os
complexos nucleares da Hb desempenham um papel importante na regulação do
comportamento (BENARROCH, 2015) e estão particularmente envolvidos no enfrentamento
de condições aversivas (AMO et al., 2014; ZHANG et al., 2016).
Com relação ao IP, Zhao-Shea et al. (2013) revelaram que principalmente seus
neurônios GABAérgicos são ativados durante a retirada da nicotina. Evidências adicionais
para um papel importante de mecanismos GABAérgicos na retirada da nicotina foram
fornecidos por Hsu et al. (2013), mostrando que a subunidade 5 de nAChR é fortemente
expressa em um subgrupo de neurônios GABAérgicos no IP, alguns deles projetando para o
MnR e também em populações neuronais GABAérgicas nas principais regiões alvos do IP
incluindo o MnR/DRC. Assim, em absoluta concordância com essas descobertas recentes e
um papel potencial para a alça IP-MnR na mediação dos efeitos ansiolíticos da nicotina, nós
determinamos em nosso trabalho que, tanto no IP quanto no MnR, principalmente neurônios
GABAérgicos dão origem às robustas conexões bidirecionais entre eles. Ademais, nossos
resultados em relação à diversidade de neurotransmissores no DR e MnR/PMnR, incluindo a
abundância de neurônios GABAérgicos observada no MnR/PMnR, estão bem de acordo com
descrições recentes na literatura (HIOKI et al., 2010; SOS et al., 2017, para uma discussão
detalhada sobre essa diversidade, ver SEGO et al., 2014).
Em relação às interconexões do IP com o LDTg, nossos dados são perfeitamente em
acordo com um recente estudo de rastreamento viral de Quina et al. (2017). Assim como esse
estudo, nós mostramos que o as projeções entre IP e LDTg exibem uma lateralização
intrigante e envolvem principalmente o IPDL contralateral e a parte dorsal do IPR.
Notavelmente, Wolfman et al. (2018) recentemente revelaram em um elegante estudo
optogenético que o LDTg também participa nos efeitos aversivos da nicotina. Assim, esses
autores demonstraram que as projeções do IP para o LDTg são GABAérgicas e que a
estimulação optogénetica dessa via elícita comportamento de esquiva. Ademais, somente altas
doses de nicotina ativam a via IP – LDTg e provocam respostas aversivas, fortemente
indicando que essa via especificamente contribua na mediação dos efeitos aversivos da
75
nicotina. Em nosso estudo, mostramos que a via do LDTg para o IP é predominantemente
GABAérgica (cerca 66%), mas também contém uma considerável componente colinérgica
(cerca 28%). Junto com os resultados de Wolfman et al. (2018) isso indica que com no caso
das vias bilaterais entre IP e MnR, a conexão recíproca entre IP e LDTg também é
principalmente GABAérgica. O componente colinérgico da via LDTg – IP, indica que o
LDTg ao lado da MHb contribui para a inervação colinérgica do IP, e talvez assim como a via
LDTg – VTA (LAMMEL et al., 2012; STEIDL et al., 2017) para processos de plasticidade
associada a mecanismos de recompensa.
No momento, podemos apenas especular sobre um potencial significado funcional das
alças GABAérgicas de retroalimentação entre o IP e MnR assim como IP e LDTg. Existem
mais exemplos de projeções GABAérgicas bidirecionais de longo alcance (revisado em
CAPUTI et al., 2013), sendo a mais proeminente a alça GABAérgica que liga o septo com o
hipocampo. Foi proposto que a atividade em tal tipo de circuito levaria à desinibição das
células excitatórias nas áreas-alvos (FREUND; ANTAL, 1988; TOTH; BORHEGYI;
FREUND, 1993), e também, temporalmente, para uma atividade oscilatória coordenada
(CAPUTI et al., 2013). Para esclarecer parâmetros importantes como a assinatura
neuroquímica dos neurônios alvos na alça IP-MnR e o grau de sincronia exibido por IP e MnR
sob diferentes condições, são necessários futuros estudos eletrofisiológicos e também de
microscopia imunoeletrônica. Além disso, o fato de que o MnR também recebe entradas
excitatórios diretas da LHbM (BEHZADI et al., 1990), que por sua vez recebe entradas do
septo lateral, da área pré-óptica lateral e do pálido ventral (HERKENHAM e NAUTA, 1977;
YETNIKOFF et al., 2015), implica que o MnR tem acesso a informações adicionais
relacionadas a mecanismos de recompensa ou aversão através da LHbM.
Ao todo, nossos achados providenciam importantes novos detalhes em relação a um
sistema complexo de vias paralelas e topograficamente organizadas que ligam MHb e LHb
com MnR/DRC, LDTg e NI, tanto bi-sinapticamente através do IP; ou LHb também por
projeções diretas principalmente oriundas da LHbM. (GONÇALVES; SEGO; METZGER,
2012; GOTO; SWANSON; CANTERAS, 2001; HERKENHAM e NAUTA, 1979; KIM,
2009; SEGO et al., 2014, LIMA et al., 2017). Além disso, eles comprovam que distintas
subdivisões da MHb (MHbD, MHbV), LHb (LHbM, LHbL) e do IP fazem parte de vias
segregadas que foram recentemente implicadas em funções comportamentais distintas (HSU
et al., 2014; PROULX; HIKOSAKA; MALINOW, 2014; YAMAGUCHI et al., 2013), com
um papel fundamental na dependência da nicotina atribuída ao eixo IP-MHbV central
(FRAHM et al., 2015). Em conjunto, nossos achados destacam circuitos entre Hb, IP e
76
MnR/DRC que são altamente preservadas durante a evolução e podem ser acima de tudo
relevante na supressão/ativação comportamental e, especificamente, nos mecanismos de
reatividade emocional à nicotina.
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