Curvas de calibração e quantificação de proteínas

Bioquímica ISegunda Aula Prática: Curva de calibração e quantificação de proteínas.

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Sumário

1. OBJETIVOS...................................................................................................................................2

2. INTRODUÇÃO..............................................................................................................................2

2.1 – Métodos Fotocolorimétricos............................................................................................................2

2.2 – Leis da fotometria............................................................................................................................3

2.3 – Método do biureto para determinação de proteínas.........................................................................5

2.4 – Proteínas presentes no leite..............................................................................................................5

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.......................................................................................6

3.1 – Materiais e reagentes.......................................................................................................................6

3.2 – Parte experimental...........................................................................................................................6

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................................................................7

4.1 – Precipitação da caseína....................................................................................................................7

4.2 – Proteínas do filtrado e Proteínas totais e Soluções padrão..............................................................7

4.3 – Medidas no espectrofotômetro........................................................................................................8

4.5 – Determinação da porcentagem de caseína.....................................................................................12

5. CONCLUSÃO...............................................................................................................................13


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1. OBJETIVOS

A seguinte aula prática tem como objetivo elaborar as curvas de calibração e

sensibilidade de um método fotocolorimétrico a partir da resolução de cálculos de diluições e

concentrações. Relacionar o método fotocolorimétrico com situações nas quais ele pode ser

aplicado, tendo como exemplo a dosagem de proteínas do leite pelo método da reação do

biureto.

2. INTRODUÇÃO

2.1 – Métodos Fotocolorimétricos

O método fotocolorimétrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substâncias

biológicas. Neste método são utilizadas reações que resultam em soluções coloridas. A

intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo

dosada. Em conseqüência desta proporcionalidade, é possível dosar substâncias em soluções

de concentração desconhecida (amostra), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta

substância à intensidade da cor produzida pela mesma substância em outra solução onde a

concentração é previamente determinada (padrão).

A diferença de coloração é muitas vezes imperceptível a olho nu. A medida da

intensidade de cor é efetuada por instrumentos denominados fotocolorímetros ou

espectrofotômetros. Estes instrumentos possuem uma fonte de luz branca, filtros coloridos

(fotocolorímetro), prismas ou retículos de difração (espectrofotômetro), através dos quais

pode ser feita a seleção do comprimento de onda (λ), e um sistema onde a intensidade da luz é

detectada, transformada em corrente elétrica, amplificada e medida.

Ao incidir um feixe de luz sobre uma solução corada, verifica-se que a intensidade de

luz que emerge da solução (I), é menor que a intensidade de luz incidente nesta solução (Io).

A diferença entre a intensidade de luz de incide e a intensidade de luz que atravessa a solução

corada pode ser medida e expressa pelo coeficiente obtido através da divisão da intensidade

da luz emergente (I) pela intensidade da luz incidente (Io). Este coeficiente é chamado de

transmitância (T). Por sua vez, mede-se a intensidade de luz absorvida por uma solução

corada pela redução da medida da intensidade de luz transmitida. A medida de absorção é

chamada de absorbância (A) ou extinção (E), logo A e T são inversamente proporcionais.

> concentração > intensidade de cor > Absorbância < Transmitância

A relação entre e concentração da substância e a absorbância é chamada de fator de

calibração (FC). Fc = C/A.


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A concentração de uma substância em uma determinada amostra pode ser determinada

através da comparação da intensidade da cor obtida nesta amostra com a intensidade da cor

produzida em uma solução padrão aplicando uma regra de três. Para evitar erros de aferição,

não é utilizado um único padrão para realizar a comparação. É realizada uma série de

determinações com concentrações crescentes da solução padrão, medindo as suas respectivas

absorbâncias, a curva padrão. É calculado o fator de calibração para cada solução padrão e é

feita uma média destes fatores, o fator de calibração médio (FCM).

Os métodos fotocolorimétricos encontram grande aplicação em bioquímica sendo

utilizados preferencialmente em relação a outros métodos, sempre que apresentarem grau de

exatidão desejado, uma vez que permitem medidas rápidas e sensíveis. A sensibilidade é

particularmente importante na determinação de pequenas quantidades de metabólitos e outras

substâncias presentes em materiais biológicos.

2.2 – Leis da fotometria

O princípio básico da fotometria é baseado no fato de que: partículas dispersas ou

dissolvidas em uma solução interferem seletivamente com um raio de luz que passa através

desta solução. Esta interferência depende dos seguintes fatores:

Cor do composto ou do tipo de ligação química presente;

Tamanho da partícula;

Transparência da solução;

Combinação dos fatores acima.

Deste modo, as partículas podem absorver e transmitir parte do espectro, dependendo

da sua concentração, da sua natureza química e/ou da sua cor.

Se pudermos medir o total de luz que incide (Io) sobre a solução de uma determinada

substância e o total da luz transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substância absorveu

(absorbância: A)

A seguinte formulação pode ser feita:

Transmissão = It / Io (luz transmitida / luz incidente).

Observe que o termo transmissão tem aplicação limitada, uma vez que, a It é Io menos

a luz que é absorvida não só pela substância que se deseja medir, mas também pelo solvente,

pelo material da cubeta e por outras substâncias aí existentes. Assim, It é a luz transmitida

após as absorções pela substância de interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito,

admite-se It =1 (100% de Transmitância) a luz transmitida após Io atravessar a cubeta

contendo uma solução denominada branco. Este branco contém todos os componentes do


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meio, exceto a substância a ser medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o

fototubo (fotocélula), a Transmitância = 0, ou seja, não há luz transmitida a ser medida.

Na prática, a transmitância (T), que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100%

(com o branco na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de

densidade óptica (D.O.) ou absorbância (A), termo mais aceito atualmente, que corresponde

ao logaritmo do inverso da transmitância:

A = log 1/T

A absorbância é, desta forma, medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0).

A relação da A com a concentração da substância pode ser compreendida pelas Leis de

Lambert-Beer: a absorbância de uma solução é proporcional à concentração da substância na

solução e à distância percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a solução (caminho óptico):

A = ε. l.c,

onde: ε = coeficiente extinção molar, que é constante para cada substância, e definido

como a absorbância (A) de uma solução l molar da substância em um determinado

comprimento de onda (λ), numa cubeta de caminho óptico l = l cm (largura da cubeta) e c =

à concentração da solução.

Observe, portanto, que a absorbância é uma função linear da concentração. Assim,

para uma mesma substância, considerando-se o caminho óptico constante, a A é diretamente

proporcional à concentração desta substância. No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem

sempre são obedecidas. Algumas desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como:

mudança na natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das

soluções, etc. Também as presenças de ácidos, bases e sais na solução podem contribuir para

essas desobediências, por estarem mais completamente dissociados, à medida que aumenta a

diluição, visto que absorção da luz pelos íons é diferente daquela apresentada pelas moléculas

não ionizadas. Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, deve-se trabalhar com

soluções mais diluídas e construir, previamente, uma curva padrão, em que são usadas

concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise, e verificar as absorbâncias

no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico adequado.

Desta forma, teremos os limites de concentração nos quais a solução obedece às Leis

de Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o emprego da curva padrão, podemos,

também, determinar a concentração de uma solução problema. O comprimento de onda (λ)

usado para a obtenção da curva padrão é obtido pela preparação do espectro de absorção da

substância em estudo e é, normalmente, o λ onde a absorbância para a substância apresenta o

valor máximo.


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2.3 – Método do biureto para determinação de proteínas

As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de

Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificações do mesmo.

O reagente de biureto é um reagente analítico formado por hidróxido de potássio (KOH)

e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O).

Este reagente de coloração azul torna-se violeta na presença de proteínas, e muda para rosa

quando combinado com polipeptídios de cadeia curta. O hidróxido de potássio não participa

na reação, mas meramente provê um meio alcalino no qual a reação ocorre.

O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado

planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma

em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentarem em seis

vezes a sensibilidade do método do biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada

para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios

analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método.

O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas

totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangüíneo, líquido cérebro espinhal

(líqüor), urina, alimentos, saliva, leite, fibrinogênio e tecido animal

As proteínas apresentam muitas ligações peptídicas, quando tratadas com o Reagente

de Biureto, produzem uma coloração cuja intensidade obedece a Lei de Lambert-Beer. Esta

Lei estabelece que a absorbância de uma solução aumente à medida que aumenta a

concentração de partículas absorventes.

2.4 – Proteínas presentes no leite

As principais proteínas do leite são a caseína, a b-lactoglobulina e a a-lactoalbumina.

Os cinco tipos de caseínas (fosfoproteínas) representam 85% das proteínas do leite, o restante

é constituído pela b-lactoglobulina e a-lactoalbumina.

Outras proteínas, como, por exemplo, as enzimas, as imunoglobulinas e os hormônios,

são encontrados em pequenas quantidades. Tanto a b-lactoglobulina como a a-lactoalbumina

são nutricionalmente melhores que a caseína, devido ao maior conteúdo de aminoácidos

essenciais, como lisina, metionina e triptofano.

A caseína, principal proteína do leite, é um exemplo de proteína nutriente do tipo

fosfoproteína encontrada no leite fresco. Quando coagulada com renina é chamada de

"paracaseína" (caseína de coalho) e, quando coagulada através da redução de pH (utilização

http://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://pt.wikipedia.org/wiki/Tartarato_de_s%C3%B3dio_e_pot%C3%A1ssio

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Biureto&action=edit&redlink=1


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de ácidos) é chamada "caseína ácida". A caseína não coagula com o calor. É precipitada pelos

ácidos ou pela renina, uma enzima proteolítica produzida no estômago dos vitelos (bezerros)

recém-nascidos (também é produzida por alguns tipos de plantas e micróbios). A enzima

tripsina hidrolisa a peptona retirando o fosfato.

A caseína contém um número razoavelmente alto de peptídeos de prolina que não

interagem. Não apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Como conseqüência apresenta

relativamente pouca estrutura secundária ou estrutura terciária, não formando estruturas

globulares. Por isso não pode desnaturar. É relativamente hidrofóbica, tornando-se pouco

solúvel em água. Encontra-se no leite como uma suspensão de partículas de caseína (micelas

de caseína), de modo que a região hidrófoba (apolar) fica no interior e a região hidrófila

(polar) na superfície exposto a água. As caseínas das micelas se prendem juntas por íons de

cálcio e interações hidrofóbicas.

O ponto isoelétrico da caseína é 4.6. É o valor de pH onde as cargas elétricas dos

aminoácidos se igualam e se anulam e então ela precipita (coagulação ácida). A proteína

purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras,

prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de

sódio e acetato de sódio.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 – Materiais e reagentes

2 pipetas graduadas de 10 mL;

1 pipeta graduada de 5 mL;

5 pipetas graduadas de 2 mL;

1 pipeta graduada de 1 mL;

2 peras;

Solução padrão de proteínas 5 mg/mL;

HCl 2% v/v;

Reagente do biureto;

Papel indicado de pH;

Papel de filtro qualitativo;

Leite desnatado longa vida;

Béquer 50 mL;

Tubos de ensaio;

Estante;


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Caneta hidrográfica;

Água destilada.

3.2 – Parte experimental

3.2.1 – Precipitação isoelétrica da caseína

Em um béquer de 50 mL colocou-se 10 mL de água destilada e juntou-se 10 mL de

leite longa vida desnatado. Com uma pipeta de 2 mL adicionou-se, gota a gota, HCl (2%) com

agitação até coagular o leite (ponto isoelétrico). Com o auxilio de um papel indicador, mediu-

se o pH e anotou-se o volume de HCl gasto. Após sedimentação do precipitado, filtrou-se a

solução com um papel de filtro para a dosagem das proteínas que não precipitaram nas

condições acima (amostra PF = tubo 7)

3.2.2 – Diluição do leite para dosagem de proteínas totais

Diluiu-se 0,5 mL de leite em 9,5 mL água à temperatura ambiente (proporção 1:20) e

obteve-se a PT, correspondente ao tubo 8.

3.2.3 – Curva de Calibração e dosagem de proteína

Pipetou-se os valores estipulados de água, proteína padrão e reagente do biureto em

cada tubo de ensaio, conforme a Tabela 1. Para dar maior confiabilidade nas diluições,

utilizamos um agitador de tubos e os deixamos em repouso por 10 minutos. Após, fizemos a

leitura no espectrofotômetro, lendo a absorbância em 540 nm.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Neste experimento, tem-se um exemplo da aplicação da fotocolorimetria. Para tanto se

fez o fracionamento das proteínas do leite e sua dosagem pelo Método do Biureto. Assim com

a utilização da fotocolorimetria foi possível quantificar as proteínas do leite.

4.1 – Precipitação da caseína

Para a precipitação da caseína, adicionou-se 1,3 mL de ácido clorídrico

No preparo da amostra titulada como Pf (filtrado: proteínas lactoalbumina +

lactoglobulinas) aferiu-se o pH no momento inicial da coagulação do leite pela adição do

HCl, isto porque segundo a literatura, o ponto isoelétrico da caseína (proteína a ser separada

neste procedimento) é exatamente em pH 4,6. E, portanto o quão próximo deste ponto, melhor


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será a precipitação desta proteína e assim o filtrado conterá apenas as proteínas desejadas.

Desta forma, foram adicionados 1,3mL de HCl e o pH foi medido e encontrou-se entre 4 e 5.

Um fator importante para obtermos uma melhor amostra foi a utilização do leite

desnatado longa vida, pois não pode haver turbidez na amostra que pode causar interferência

na leitura do equipamento, o que possivelmente aconteceria com o uso de um leite integral,

devido a grande quantidade de gordura.

4.2 – Proteínas do filtrado e Proteínas totais e Soluções padrão

Para o preparo destas amostras, Pf e Pt, foi necessário fazem uma diluição sendo:

Pf diluído em 1:2 (C real = C calculado x 2)

PT diluído em 1:20 (C real = C calculado x 20)

Isto porque, a lei de Lambert-Beer e valida somente para soluções relativamente

diluídas, uma vez que acima de certas concentrações a relação entre a absorbância e a

concentração deixa de ser linear, tornando viável a analise da absorbância das amostras no

equipamento.

Para a determinação da concentração das amostras Pf e Pt pelo método

fotocolorimétrico utilizou-se a relação que permite calcular esta a partir da medida de

absorbância de uma solução padrão, cuja concentração é conhecida. Utilizou-se uma solução

padrão com diferentes concentrações (Tabela 1) e foi traçada a curva de calibração em que no

eixo das abscissas estão às concentrações e nas ordenadas às respectivas absorbâncias

(Gráfico 01).

Assim, devido às concentrações de proteínas nos tubos e da reação destas com o

reagente do biureto, pode observar um gradiente de coloração em que:

O tubo 1 (branco), contendo apenas água e a solução do biureto, possuía uma

coloração azulada e foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro,

Do tubo 2 ao 6, com o aumento da concentração de proteínas, observou um gradiente

da cor lilás.

Os tubos 7 e 8 apresentaram coloração lilás intermediaria as dos tubos 2 ao 6.

Tabela 1 – Composição dos tubos - determinação da curva de calibração.

Branco Curva de calibração Pf Pt

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

Padrão de proteína (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 0


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Amostra (mL) 0 0 0 0 0 0 1,0 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0

Reagente do biureto (mL) 5

4.3 – Medidas no espectrofotômetro.

Nesta pratica estavam disponíveis dois equipamentos, fotocolorímetro e

espectrofotômetro. As medidas foram efetuadas no espectrofotômetro por possível selecionar

exatamente o comprimento de onda adequado, no caso 540nm.

Nas medidas de absorbâncias das soluções padrão e das amostras (Pf e Pt) alguns

cuidados foram tomados afim de obter um melhor resultado:

O aparelho foi zerado com o tubo 1 (branco, ou seja concentração 0 de proteínas) e a

leitura do branco fez-se entra cada dois tubos para assegurar que o equipamento

continuasse calibrado.

Fez-se a limpeza externa da cubeta em todas as medidas com papel higiênico, a fim de

não afetar o valor da absorbância registrada pelo espectrofotômetro.

Como este equipamento é utiliza apenas uma cubeta por vez, entre todas as trocas de

soluções, fez-se a lavagem das cubetas principalmente quando se trocava uma solução

de concentração maior para o branco na calibração.

4.4 – Determinação da concentração de Pf e Pt

Após as medidas das soluções padrão e amostras, para a determinação da concentração

temos os resultados relacionados na tabela abaixo.

Tabela 2 – Dados da análise dos tubos de ensaio no espectrofotômetro.

Branco Curva de calibração Pf Pt

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

Absorbância 0 0,036 0,072 0,107 0,141 0,191 0,136 0,091

[ ] (mg/mL) 0 1 2 3 4 5 ? ?

Com esses dados foi possível construir a curva de calibração que está representada no

gráfico abaixo.


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Gráfico 01 – Curva de calibração - absorbância versus concentração de proteínas

Com a análise do gráfico foi possível fazer algumas constatações:

Na curva de calibração obteve-se uma reta entre os limites de concentração de cada

uma das soluções padrão, portanto obedecem a Lei de Lambert-Beer.

A curva padrão obtida está de acordo com o esperado, ou seja, apresentou uma relação

diretamente proporcional entre as absorbâncias e concentrações das soluções padrão.

Esta porção linear englobou a maioria dos pontos, o que garante um limite bom de

sensibilidade do método. Desta forma, se os valores de concentração encontrados para

Pf e Pt, pela extrapolação dos dados de absorbância na reta, estiver entre os pontos

será um valor confiável, pois está dentro da sensibilidade do método.

Como a curva de calibração foi obtida com êxito, então é possível determinar de forma

precisa as concentrações de Pf e Pt.

Para esta determinação fez uso do gráfico da Curva de calibração, ao incluir os dados

de absorbância de Pf e Pt e extrapolar esses valores na curva e por conseguinte no eixo de

concentração obteve-se o gráfico 2 e os valores de concentração de Pt é 2,51 mg/ml e Pf é 3,7

mg/mL, aproximadamente.


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Gráfico 02 – Determinação da concentração de Pt e Pf

Para confirmar esses valores, ainda com o auxilio do gráfico, fez-se uso de algumas

relações:

Fator de conversão.

De acordo com a literatura, a partir dos valores de absorbância e concentração de cada

uma das soluções padrão, pode-se calcular um Fator de Calibração e como são vários padrões

determinou-se o Fator de Calibração Médio a partir de:

FC = concentração padrão / absorbância padrão

FCM = Σ FC / nº de FC

Tubo 01 (branco) FC = 0,

C = 0, absorbância = 0

Tubo 02 FC = 1 / 0,036

FC = 27,778

Tubo 03 FC = 2 / 0,072

FC = 27,778

Tubo 04 FC = 3 / 0,107

FC = 28,037

Tubo 05 FC = 4 / 0,141

FC = 28,369

Tubo 06 FC = 5 / 0,191

FC = 26,178

Portanto,

FCM = 138,14 / 5

FCM = 27,628


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Tabela 3 – Valores de FC e FCM

Branco Curva de calibração

Tubos 1 2 3 4 5 6

FC 0 27,778 27,778 28,037 28,369 26,178

FCM 27,628

E com esses valores, a determinação da concentração de Pf e Pt é feita pela relação:

[amostra] = Absorbância da amostra x FCM

Pf – Tubo 07 [ ] = 0,136 x 27,628

[ ] = 3,757 mg/mL

Pt – Tubo 08 [ ] = 0,091 x 27,628

[ ] = 2,514 mg/mL

Lei de Lambert-Beer

Ainda é possível determinar o valor da concentração por outra relação:

ABS = k . C

Lei de Lambert-Beer: absorbância é linearmente proporcional a concentração.

Está equação é associada ao gráfico obtido e corresponde a uma equação da reta

reduzida que passa pela origem, ou seja:

Equação da reta reduzida: y = ax + b

a = coeficiente angular

x = valor da concentração

y = valor da absorbância

b = coeficiente linear (valor que a curva toca no eixo y, neste caso é igual a 0, pois o

gráfico passa pela origem do plano cartesiano).

Voltando na lei de Lambert-Beer,

y = ax ABS = k [ ]

Em que k é corresponde a x (coeficiente angular) e este coeficiente é determinado por:

y b – y a / x b – x a

ou ABS b – ABS a / [ ] b – [ ] a

Assim, pelo gráfico escolheram-se os valores que estavam precisamente em cima da

reta, ou seja, valores do tubo 2 e 4:

k = 0,107 – 0,036 / 3 – 1

k = 0,0355

Finalmente, os valores da concentração de Pf e Pt são determinados:

ABS = k [ ] [ ] = ABS / k


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Pf – Tubo 07 [ ] = 0,136 / 0,0355

[ ] = 3,831 mg/mL

Pt – Tubo 08 [ ] = 0,091 / 0,0355

[ ] = 2,563 mg/mL

Tabela 4 – Valores de concentração de Pt e Pf

Pela extrapolação

do gráfico

Pelo Fator de

Calibração Médio

Pela Lei de

Lambert-Beer

Pf 3,7 mg/ml 3,757 mg/mL 3,831 mg/mL

Pt 2,51 mg/ml 2,514 mg/mL 2,563 mg/mL

Observa-se que existem algumas divergências dos valores pelos diferentes métodos de

determinação da concentração, devido a erros de leitura, aproximações entre outros

indeterminados, mas todos se encontraram na mesma faixa e, portanto são considerados

confiáveis.

4.5 – Determinação da porcentagem de caseína

Os valores da concentração utilizados para Pf e Pt foram os obtidos pelo FCM, por ser

um valor intermediário aos outros dois métodos utilizados.

Entretanto esse valor de concentração não é o real, pois foram feitas diluições, assim é

necessário fazer as correções:

Pf diluído em 1:2 (C real = C calculado x 2)

C real = 3,757 x 2

C real = 7,514 mg/ml

PT diluído em 1:20 (C real = C calculado x 20)

C real = 2,514 x 20

C real = 50,28 mg/ml

E para a determinação da concentração de caseína,

C caseína = C real Pt – C real Pf

C caseína = 50,28 – 7,514

C caseína = 42,766 mg/mL

E para a determinação da % de caseína,

% caseína = (C caseína / C real Pt) x 100


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% caseína = (42,766 / 50,28) x 100

% caseína = 85,06%

5. CONCLUSÃO

Nesta prática pode-se observar que com o aumento da concentração de proteínas, há,

também, um aumento no valor da absorbância medida no espectrofotômetro na faixa de 540

nm.

Através dos resultados obtidos através do espectrofotômetro, foi possível calcular as

curvas de calibração. Em toda leitura deve haver um tubo considerado o branco, onde não há

o material de estudo, e nos demais tubos a concentração do material aumenta gradativamente,

gerando um gradiente.

Os cálculos apresentados têm como objetivo mostrar a concentração de caseína

presente no material estudado, que foi retirada através da ação do ácido clorídrico. Uma

relação pode ser descrita para para mostrar a concentração da caseína: Tubo 8 – Tubo 7 (PT –

PF). Notamos que a porcentagem de caseína encontrada está de acordo com a literatura, o que

indica que, apesar de erros laboratoriais, o experimento mostrou boa confiabilidade.

6. REFERENCIAS

As proteínas do leite. Disponível em <http://www.pratiqueleite.com.br/article.php?recid= 2787>. Acessado em 23/03/11

Determinação do ponto isoelétrico da caseína. Disponível em <http://analgesi.co.cc/html/ t26482.html>. Acessado em 24/03/11

Espectrofotometria, conceitos. Disponível em <http://www.ufrgs.br/leo/site_espec /conceito.html>. Acessado em 24/03/11

Roteiros de aulas práticas. UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, INSTITUTO DE BIOLOGIA, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR. Disponível em <http://www.uff.br/gcm/GCM/graduacao_arquivos/Apostila.pdf>. Acessado em 24/03/11

ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos Métodos existentes. Revista Química


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Nova, v. 21, n. 6, p.787-793, junho de 1998. Disponível em http://www.scielo.br /pdf/qn/v21n6/2914.pdf>. Acessado em 23/03/11

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