Curso BMP5748 Parasitologia Molecular

Objetivos do curso

Estrutura do curso:

13.9. Replicação (Genes 8/9/10): Componentes e funcionamento.Clássico: Kinetoplast replication Englund, Cell(http://dx.doi.org/10.1016/0092-8674(78)90310-0)T. cruzi replication complex: Calderano et al. Nucleus 2011(http://dx.crossref.org/10.4161%2Fnucl.2.2.15134)

15.9. Apicoplast origin identification (Molecular & Biochemical Parasitology 139 (2005) 99–106).Nuclear-encoded DnaJ homologue of Plasmodium falciparum interacts with replication ori of the apicoplast genome. (Molecular Microbiology (2010) 75(4), 942–956)

20.9. Toolbox: RNAi, bases moleculares e aplicações em estudos funcionaisWang et al. Topoisomerase 2 knockdown (EMBO J 20 (17), p 4674-4683)Splicing (Genes8/9/10): Componentes e funcionamento.

22.9. Transsplicing Murphy et al. Cell 47, 517-525Special Sm core complex functions in assembly of the U2 small nuclear ribonucleoprotein of Trypanosoma brucei. Eucaryotic Cell, 8(8), 1228-1234.

27.9. Transcrição (Genes 8/9/10): Fatores, funcionamentoTranscrição VSP Giardia (doi:10.1038/nature07585)Transcrição var Plasmodium (EMBO J 17(18) 5418-5426)

29.9. Toolbox: Microarrays e ChIP on ChipTranscrição VSA T brucei (http://www.nature.com/nature/journal/v414/n6865/full/414759a.html)Interdependencia transcrição de familias multigenicas (Molecular Microbiology (2009) 73(6), 1171–1185)

4.10. Toolbox: Next generation DNA sequencing: 454 e ILUMINARNA seq paper (Nucleic Acids Res. 2011 May;39(9):3820-35)ApiAP2 paper (PNAS June 17, 2008 vol. 105 no. 24 8393-8398)

6.10. Posttranscriptional expression control:DOZI paper: Science 313, 667 (2006); Goldenberg paper P bodies: FEBS Journal 277 (2010) 3415–3426.

11.10. prova final

Clonagem de plasmídeos

1. Desenhe uma estratégia para subclonar o gene da corismato síntase no vetor de expressão pGEX correto

CGCTGGATCCCAATGACCTGG... ...GATTGACTCGAGGTC

Procure os mapas do pGEX na web

GAAAATGGAGAAAATACATGTAGTGAAGAATCTAAAAACTATTGTGCATGTGTGAAAGTATGGTTAGAAAAAAAGAAAAATGAATGGGATCAAATAAAAAAACATTTTAAAGATCGAAAATCGGATGATGGTGATACTGTTGTGTCTAAAGTTAGAAATTTCTTGGAGACCTTGATACCTCGAATTGCTCCTAAAAAAAATAATGGAGAAGTTACAGAATTAAGTGATTTAGAAAAGTCACTTGGATGTAATTGCGCTGGGAGAGCAGAAAATAGTAAAGAAGATGAAAAAGAAGATGTTGTTCTATGTTTGCTCACAAAGCTTGAAGATAAAGCAAACAAGTGTAAAGAAGACCAAAAACCTAATGGCGAAAACCAAGCACAAACGTGTGAAAAATCCGCCCCCGTTGAAGACGAAGACGATGAACCCCTTGAAGAGGAAAACCCAGTTACACAACCGAACATTTGTCCGAAAGTGGAAACAACAGAAGAAACAGTGGATGAAGGCAAGTGTGAAGAAGACACAGTCACTCCTAGTCTTGGACCCAAAGATGATAGTGAAAAAGATGAAAAAAAAGAGGAAAATAGTGAAGACACAACGGCAGCAGAAGGAGAAGAAAATGGTGCTCCTGGATCTAGTGGCACACCTCCACCTCCCCCTGCGGCGCCTCCATCAACCCCAGCAAAAACAAAAGAAAGCAAAAAACCAAAATCAACAAAAAAACCTCGAATCAAAACCCTTAATGTATTGGACCACCCCGCTGTCATACCCGCCCTCATGTCTTCTACCATCATGTGGAGTATTGGTATTGGTTTTGCTACATTCACTTATTTTTATCTAAAGAAAAAAACCAAATCATCTGTTCGAAAT

1. Desenha PCR primers para amplificar a maioria da seguinte sequência omitindo a parte que codifica para o motivo transmembrana “FTYFYL”. Inclua sítios de restrição adequados para subclonagem em pGEX4T1 (para posterior expressão como fusão com GST).

2. De que gene se trata?

Tarefa 13.9.2011

Tarefa 15.9.

Fusion-PCR

Insere o epítopo YENDIEKKI no ponto indicado do gene abaixo mediante PCR de fusão e subclone o produto final em pcDNA3.1. O seu orientador deu gDNA do organismo, dinheiro para comprar 4 oligos e BamH1 e Xho1 (plus Taq pol etc.)

1 atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 61 ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 121 tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 181 tcaccaacct cctgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 241 atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 301 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatctt caaccaccag cacgggacca 361 tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc 421 aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcggaaaa 481 ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 541 cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 601 tgggggccaa gtctgtacag catctggagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt 661 gtctttgggt atacatttaa

Aqui.

Tarefa 27.9.Desenvolva uma estrategia para montar um vetor para testar RNAi constitutivo em Plasmodium no vetor pDCdXho1, utilizando o fragmento do gene hexokinase clonado em vetores A e B mostrados.

Inserir aqui

Vetor A

Vetor B

Bgl2 BamH1

EcoR1Sma1

Pst1

Xba1

Sph1 Sal1Bgl2

Nde1EcoRV

Pst1

Tarefa 29.9.2011Abaixo está mostrado um vetor de recombinação dupla em Plasmodium. A partir desse, monte um plasmideo para knockout do gene PF14_0511 (achar em www.plasmodb.org). Feliz com seu trabalho anterior e com verba nova, seu chefe permitiu a compra de oligos e pode usar qq enzima de restrição. Note que as modificações no vetor devem ser nos lugares indicados com *.

**

Tarefa 4.10.2011Crie um vetor com dois marcadores de resistência (hDHFR e BSD) a partirdos vetores abaixo. Na sua estratégia, considere o tamanho de fragmentos a serem excisados de um vetor (mesmo tamanho do fragmento restante do vetor ao excisar?)