cultivo fibroblastos

GUSTAVO DOS SANTOS COURA

PROTOCOLO PRELIMINAR DA CULTURA DE FIBROBLASTOS DE GENGIVA HUMANA. AVALIAO DA

VIABILIDADE CELULAR E DOS POSSVEIS DANOS CAUSADOS AO DNA.

Florianpolis

2004


PROTOCOLO PRELIMINAR DA CULTURA DE FIBROBLASTOS DE GENGIVA HUMANA. AVALIAO DA VIABILIDADE CELULAR E

DOS POSSVEIS DANOS CAUSADOS AO DNA

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para a obteno do ttulo em Mestre em Odontologia, rea de concentrao: Implantodontia. Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini Co-orientadora: Prof. Dra. Cludia Maria Oliveira Simes

Florianpolis 2004


PROTOCOLO PRELIMINAR DA CULTURA DE FIBROBLASTOS DE GENGIVA HUMANA. AVALIAO DA VIABILIDADE CELULAR E

DOS POSSVEIS DANOS CAUSADOS AO DNA

Esta dissertao foi julgada adequada para obteno do ttulo de Mestre em Odontologia, opo Implantodontia, e aprovada em sua forma final pelo Colegiado do Programa de Ps-Graduao em Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianpolis, 19 de fevereiro de 2004.

Prof. Dr. Mauro Amaral Caldeira de Andrada

Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Odontologia

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini Presidente

Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior Membro

Prof. Dra. Cludia Maria Oliveira Simes Membro

FICHA CATALOGRFICA

Catalogao na fonte por Onlia S. Guimares CRB-14/071 Catalogao na fonte por: Vera Ingrid Hobold Sovernigo CRB-14/009

C858p Coura, Gustavo dos Santos Protocolo preliminar da cultura de fibroblastos de gengiva humana. Avaliao da viabilidade celular e dos possveis danos causados ao DNA / Gustavo dos Santos Coura; orientador Ricardo de Souza Magini. Florianpolis, 2003. 92f. : il. Dissertao(Mestrado) Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Cincias da Sade. Programa de Ps-Graduao em Odontologia, 2003. Inclui bibliografia. 1. Fibroblasto gengival. 2. Ensaio em cometa. 3. DNA. 4. Cultura de tecidos. I. Magini, Ricardo de Souza. II.Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Ps-Graduao em Odontologia. III. Ttulo.

CDU 616.314-089.843

DEDICATRIA

Danielle, Dani. Presente sempre ao meu lado, estimulando e tranqilizando.

Compreendeu, de corao aberto, minha busca pela sabedoria.

Seu amor inigualvel. Dividiu os momentos doces e amargos.

Voc contagiante. Te amo.

Certa vez, li:

Aos filhos, damos asas e razes Obrigado, ME.

Honestidade e carter.

Garra, muita garra. Dedicao. Obrigado, PAI.

Aos meus pais, Ceclia e Joo, por fazerem de meus sonhos

os seus.

s minhas irms, Fernanda e Marina. Quando escolhi as pessoas que me cercariam,

nos muitos momentos de nossa jornada, no tive dvidas

que vocs seriam, exatamente, como revelaram ser: AMVEIS.

Fico muito feliz pelo encontro de nossos caminhos. Muito me orgulham, minhas irms.

Aos meus amigos e familiares.

Pela aprendizagem constante que tenho no convvio com vocs.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini, pela orientao e confiana depositada em

meu trabalho. Pela oportunidade de realizar o sonho da Ps-Graduao.

Prof. Dra. Cludia Maria Oliveira Simes, co-orientadora, pelos ensinamentos

sobre cultura celular. Pela abertura de seu laboratrio para a realizao de um trabalho

conjunto.

Ao Prof. Dr. Antnio Carlos Cardoso, por aguar meu senso crtico e pela

orientao quanto aos recursos audiovisuais.

Ao Prof. Dr. Srgio Freitas, da Universidade Federal de Santa Catarina, pela

metodologia empregada para a avaliao dos dados. Ao Prof. Dr. Camilo Renn, do INPE -

So Jos dos Campos, pela realizao da estatstica em momento to oportuno.

minha irm, Fernanda dos Santos Coura, escritora nas horas vagas, pelas

sugestes na escrita desse trabalho. Michelle Soares de Andrade, brasiliense, pela reviso

realizada em um perodo to curto.

minha tia, Terezinha, secretria eficiente, pelo pronto atendimento (socorro) em

muitos momentos durante a confeco desse trabalho.

Ao amigo Nlson Dias, pela preocupao e rapidez na reviso do abstract.

Ao amigo doutorando Prof. Alberto Joo Zorta Jr., pesquisador ativo neste

trabalho. Sua contribuio foi de extrema valia. Agradeo por segurar as pontas, num

momento decisivo, para a concluso deste trabalho.

Ao amigo Dr. Ronaldo Clio Mariano, professor da disciplina de cirurgia da Escola

e Farmcia de Odontologia de Alfenas EFOA, grande incentivador da minha carreira

acadmica. Pela orientao distncia.

Ao doutorando Jos Nilo de Oliveira Freire, pela hospitalidade inicial e trabalho

profissional.

Aos colegas do Mestrado e do Doutorado, Adriana, Cimara, Dirce, Kvio, Otvio,

Bianchini, Pontual, pelo ambiente de amizade.

Ao mestrando Kvio Castro, amigo que tenho desde a Residncia no HRAC-USP de

Bauru, pela tranqilidade compartilhada durante muitos momentos desse curso de Ps-

Graduao.

Aos colegas do Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia, Alexandre, Aline,

Carla, Dani, Javier, Karina, Larissa e Mrcia pelo auxlio na logstica para a realizao

dos experimentos. As trocas contnuas de idias foram muito valiosas. Em especial, a

mestranda de Biotecnologia, Luciane Anita Savi, pela constante participao, no medindo

esforos para a concretizao deste trabalho. A sua dedicao e pacincia ajudaram a me

harmonizar com o ambiente laboratorial de cultura celular.

Ao Prof. Dr. Jos Scarso Filho, pelo auxlio nos recursos fotogrficos dessa

dissertao.

Ao amigo, Danilo Teixeira, mestrando em Dentstica, pela moradia tranqila (l no

Canto dos Aras), indispensvel para a realizao deste trabalho.

Ao amigo Andr Sakima, por me ajudar na obteno de artigos e peridicos.

s funcionrias do CEPID, Rose, Dolores, Gisela e Miriam, pelo trabalho dirio.

Aos funcionrios da Biblioteca Setorial, em especial, a Sra. Vera Sovernigo, pela

presteza.

funcionria Ana Maria, secretria da Ps-Graduao, pela eficincia.

Aos pacientes, voluntrios, tambm ansiosos pela concretizao deste trabalho.

Meus agradecimentos sinceros a todos que participaram da realizao deste trabalho.

A mente que se abre a uma nova idia

jamais voltar ao seu tamanho original.

Albert Einstein

COURA, Gustavo dos Santos. Protocolo preliminar da cultura de fibroblastos de gengiva humana. Avaliao da viabilidade celular e dos possveis danos causados ao DNA. 2004. 95f. Dissertao (Mestrado em Odontologia Opo Implantodontia) Programa de Ps-Graduao em Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis.

RESUMO

Os objetivos deste estudo foram estabelecer um protocolo preliminar de isolamento e cultivo primrio de fibroblastos gengivais humanos e conseqentemente, estabelecer uma linhagem celular; avaliar a viabilidade celular e os danos potenciais que os procedimentos precedentes poderiam causar na molcula de DNA. Uma bipsia de 20mm2 (4x5mm) de mucosa ceratinizada foi obtida da regio retromolar de um paciente saudvel, lavada com PBS (soluo salina de fosfato tamponada) e fragmentada em 15 partes menores. Aps, este material foi dividido em 5 (cinco) garrafas de cultura. A proliferao e o crescimento dos fibroblastos foram verificados atravs de microscpio invertido. Aps subconfluncia de 70%, as clulas foram tripsinizadas e as novas subculturas foram obtidas. Para os experimentos, foram usadas as clulas da 6a passagem. A viabilidade celular foi determinada atravs do teste de excluso do corante azul de Trypan. Os possveis danos que os procedimentos causariam nos DNA celulares foram avaliados pelo Ensaio do Cometa. Uma das garrafas (controle positivo) foi tratada com o agente genotxico perxido de hidrognio (200M). A viabilidade celular dos grupos-teste foi maior que 90%. Os DNAs dos fibroblastos no-tratados (grupos-teste) no apresentaram danos significativos, quando comparados com o controle positivo (teste de Tukey, p

COURA, Gustavo dos Santos. Preliminar protocol of human gingival fibroblast culture. Evaluation of cell viability and potential DNA damage. 2004. 95f. Dissertao (Mestrado em Odontologia Opo Implantodontia) Programa de Ps-Graduao em Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis.

ABSTRACT

The objectives of this study include establishing a protocol of isolation and primary culture of in vitro human gingival fibroblasts and, consequently, establish a cell lineage to evaluate cell viability and the potential DNA damage that those procedures could cause in the molecule. A 20 mm2 (4x5mm) gingiva biopsy was obtained from the retromolar region of a patient and stored for transport in a culture flask containing DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics. The biopsy was rinsed three times with PBS, sectioned in 15 smaller pieces further divided in 5 flasks using the same culture medium, which was changed twice a week. The proliferation and growth of fibroblasts was verified through microscopy. After 70% confluence, these cells were disaggregated through trypsin 0.25% and new subcultures were obtained. Cells from the sixth passage were used. Trypan Blue exclusion test was used for the evaluation of cell viability. Comet Assay was used to evaluate the damage of these procedures in the DNA fibroblasts. One of the flasks was treated with hydrogen peroxide (200M). The cell viability of the test groups was above 90%. The DNA of non-treated fibroblasts did not show significant damage when compared with positive control (Tukey test, p

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Bipsia (explante) de aproximadamente 20mm2 (4x5mm), obtida da regio retromolar. ....................................................................................................................44 Figura 2 Lavagem da amostra com PBS, com o auxlio de uma micropipeta......................48 Figura 3 Fragmentao da amostra, aproximadamente 1mm2 cada explante.......................48 Figura 4 Colocao de um explante numa garrafa de cultura. Cada uma das cinco garrafas recebeu 3 explantes....................................................................................................49 Figura 5 Utilizao da Cmara de Neubauer, com o auxlio de micropipetas, para a avaliao da viabilidade celular...............................................................................................55 Figura 6 Visualizao em microscopia de fase invertida da Cmara de Neubauer. A contagem de clulas coradas e no-coradas fornece o ndice de viabilidade celular. .............55 Figura 7 Classificao das classes de cometa, segundo Kobayashi et al. (1995), com modificaes Miyamae et al. (1998a)......................................................................................62 Figura 8 Cultura primria de fibroblastos observada ao redor dos explantes, aps 17 dias, em microscpio de fase invertida. 400X.........................................................................64 Figura 9 Cultura primria de fibroblastos observada ao redor dos explantes, aps 23 dias, em microscpio de fase invertida. 400X.........................................................................65 Figura 10 Linhagem celular de fibroblastos, obtida aps a 6a passagem, com subconfluncia de 70%, observada em microscopia de fase invertida. 400X.........................65 Figura 11 Anlise da viabilidade celular em cmaras de Neubauer (400X). As clulas no coradas so viveis, enquanto que as coradas, so clulas mortas (no viveis). Amostra do Grupo-Teste onde verificou maior quantidade de clulas viveis.......................67 Figura 12 Fotografia dos fibroblastos gengivais humanos submetidos ao Ensaio do Cometa, aumento de 200X, mostrando cometas sem cauda, classificados como classe 1, indicando a ausncia de danos celulares. (Fonte: autor). ........................................................69

Figura 13 Fotografia dos fibroblastos gengivais humanos tratados com 200M de perxido de hidrognio, submetidos ao Ensaio do Cometa, aumento de 400X, mostrando cometas mal definidos e com caudas longas, classificados como classes 4 e 5, indicando presena de danos celulares. (Fonte: autor).............................................................................69 Figura 14 Resultados da aplicao do Teste de Tukey a 1% para a separao das mdias dos escores dos danos causados ao DNA dos fibroblastos gengivais humanos sem tratamento algum (1 a 4 garrafas) e tratados com 200M de perxido de hidrognio (5 garrafa), atravs do Ensaio do Cometa. (letras iguais indicam que no h diferena estatstica significativa entre as mdias)..................................................................................71

LISTA DE ABREVIATURAS

OC - graus Celsius cm2 - centmetro quadrado M - micromolar l - microlitro ml - mililitro SFB - soro fetal bovino PSA - antibiticos/antifngico pH - potencial hidrogeninico rpm - rotaes por minuto CO2 - gs carbnico O2 - oxignio DMEM - meio de Eagle modificado por Dulbecco CEPID - Centro de Ensino e Pesquisa em Implantes Dentrios UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina min - minutos h - horas PBS - soluo salina de fosfato tamponada DNA - cido desoxirribonuclico NaHCO3 - bicarbonato de sdio HCl - cido clordrico EDTA - cido etilendinitrilotetractico sal dissdico DMSO - dimetilsulfxido H2O2 - perxido de hidrognio NaCl - cloreto de sdio NaOH - hidrxido de sdio g - grama

SUMRIO

1 INTRODUO ............................................................................................................16 2 REVISO DA LITERATURA ...................................................................................19 2.1 CULTURA CELULAR..................................................................................................19 2.2 ENGENHARIA TECIDUAL.........................................................................................23 2.3 CONSIDERAES SOBRE CITOTOXICIDADE ......................................................27 2.4 CONSIDERAES SOBRE GENOTOXICIDADE ....................................................29 2.5 ESTUDOS REALIZADOS IN VITRO COM FIBROBLASTOS ..................................33 2.6 ORIGEM DOS FIBROBLASTOS.................................................................................37 3 PROPOSIO .............................................................................................................39 3.1 OBJETIVOS GERAIS ...................................................................................................39 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .........................................................................................39 4 MATERIAL E MTODOS .........................................................................................40 4.1 MEIO DE CULTURA E REAGENTES........................................................................40 4.1.1 Meio de cultura .......................................................................................................40 4.1.2 Soro fetal bovino .....................................................................................................41 4.1.3 Antibiticos e antifngico ......................................................................................41 4.1.4 Tripsina ...................................................................................................................42 4.1.5 Soluo salina de fosfato tamponada....................................................................42 4.2 CULTIVO CELULAR ...................................................................................................43 4.2.1 Obteno da amostra .............................................................................................43 4.2.2 Desenho proposto do experimento ........................................................................45 4.2.3 Desenho do experimento realizado .......................................................................46 4.2.4 Cultura primria ....................................................................................................47 4.2.5 Linhagem celular ....................................................................................................50 4.2.5.1 Escolha da 6a passagem.......................................................................................50 4.2.6 Congelamento e descongelamento celular............................................................51 4.3 AVALIAO DA CITOTOXICIDADE.......................................................................53 4.3.1 Avaliao microscpica das alteraes celulares.................................................53 4.3.2 Avaliao da viabilidade celular atravs do mtodo de excluso do corante

azul de Trypan ........................................................................................................54 4.4 AVALIAO DA GENOTOXICIDADE ATRAVS DO ENSAIO DO COMETA ..56 4.4.1 Preparao da suspenso celular ..........................................................................56 4.4.2 Preparao dos controles .......................................................................................57

4.4.3 Preparao das lminas .........................................................................................58 4.4.3.1 Primeira camada .................................................................................................59 4.4.3.2 Segunda camada ..................................................................................................59 4.4.4 Lise celular ..............................................................................................................59 4.4.5 Tratamento alcalino e eletroforese........................................................................60 4.4.6 Neutralizao e colorao ......................................................................................60 4.4.7 Anlise dos cometas................................................................................................61 4.5 AVALIAO DOS DADOS.........................................................................................63 5 RESULTADOS .............................................................................................................64 5.1 ESTABELECIMENTO DA CULTURA PRIMRIA E DA LINHAGEM DE

FIBROBLASTOS...........................................................................................................64 5.2 AVALIAO microscpica das alteraes CELULARes ............................................66 5.3 AVALIAO DA VIABILIDADE CELULAR ...........................................................66 5.4 AVALIAO DA GENOTOXICIDADE.....................................................................68 6 DISCUSSO .................................................................................................................72 7 CONCLUSES.............................................................................................................80 REFERNCIAS ....................................................................................................................79 ANEXO...................................................................................................................................91

16

1 INTRODUO

A obteno de tecidos gengivais e periimplantares harmnicos com as necessidades

estticas, funcionais e higinicas dos indivduos o objetivo do tratamento odontolgico.

Vrias tcnicas de cirurgias plsticas periodontais e periimplantares so utilizadas para

aumentar a quantidade e a qualidade de mucosa ceratinizada, aprofundar vestbulos, recobrir

razes e/ou implantes ou conexes, criar papilas e aumentar o rebordo edntulo. Enxertos

gengivais livres ou subepiteliais so utilizados nessas terapias, contudo, necessitam-se de

tecido doador (palato, tber e reas edntulas). A limitao de tecido doador disponvel, a

possibilidade de processos lgicos, a ocorrncia de cicatrizes residuais, o risco de processos

hemorrgicos, alm da morbidade e desconforto ps-operatrios causados pela necessidade de

manipulao cirrgica de outra regio bucal, resultaram na busca por substitutos, atravs do

uso de material algeno (Alloderm, LifeCell, EUA) e da engenharia tecidual.

A engenharia tecidual, termo definido em 1987 durante o Congresso de Bioengenharia

de Washington, estabeleceu um campo multidisciplinar de estudos, que engloba

principalmente conhecimentos de engenharia de materiais e cincias biomdicas. Essa

engenharia caracteriza-se pelo desenvolvimento e manipulao de molculas, clulas, tecidos

ou rgos, utilizada para o restabelecimento da funo de partes do corpo injuriadas ou

defeituosas. Os elementos necessrios para a aplicao dos princpios da engenharia de

tecidos esto baseados na trade: (1) cultivo de clulas apropriadas (fibroblastos, osteoblastos,

17

clulas-tronco, entre outras); (2) matrizes (arcabouos, scaffolds" ou carreadores)

confeccionadas em colgeno, osso ou polmeros sintticos e; (3) adio de mediadores

solveis, como, fatores de crescimento e adesinas (UEDA et al., 2000). As estratgias da

engenharia tecidual, atravs do cultivo celular humano para aplicao clnica, esto sendo

desenvolvidas em diferentes especialidades mdicas para reposio de cartilagens, ossos,

componentes cardiovasculares e pele. (FRESHNEY, 1999; MALEKZADEH et al., 1998).

Na odontologia, Pini Prato et al. (2000) relataram o caso de uma paciente que

necessitou de procedimento cirrgico periodontal para reposio de mucosa ceratinizada

previamente reabilitao prottica. Essa deficincia foi tratada por meio de tcnicas de

engenharia tecidual, que compreenderam o cultivo primrio de fibroblastos, a partir da

remoo cirrgica de uma bipsia gengival de aproximadamente 2mm2. Esses fibroblastos

foram cultivados em uma matriz carreadora, uma membrana de cido hialurnico, que foi

transportada para o stio receptor da paciente. Os autores conseguiram xito na obteno de

mucosa ceratinizada, confirmado atravs de anlises macroscpica e histolgica. Portanto, a

possibilidade de obteno de tecido atravs da cultura de clulas, in vitro, com utilizao de

carreadores pode diminuir o trauma e o tempo cirrgico. Em 2003, Pini Prato et al.

divulgaram o sucesso da tcnica em 6 pacientes tratados atravs da engenharia de tecidos.

A aplicao da engenharia tecidual na periodontia e implantodontia com a finalidade

de substituir o uso de tecido removido de reas doadoras intrabucais pela produo, in vitro,

de um tecido com caractersticas similares, envolve, inicialmente, o estabelecimento de

protocolo de cultivo de clulas humanas. Nesse contexto, os fibroblastos, clulas residentes e

predominantes nos tecidos moles periodontais e periimplantares, so responsveis pela

produo e manuteno da matriz extracelular (TEN CATE, 1989). Portanto, o primeiro passo

para a aplicao futura da engenharia de tecidos envolvendo tecidos moles o cultivo, in

vitro, de fibroblastos gengivais humanos.

18

A segurana um dos parmetros de grande importncia no desenvolvimento de

protocolos de cultivo celular (FRESHNEY, 1990). Os testes de citotoxicidade e

genotoxicidade fornecem, respectivamente, informaes sobre viabilidade celular e possvel

alterao no DNA celular, pertinentes aos estgios iniciais de desenvolvimento de protocolos

de cultura.

Em resumo, a obteno de tecido mole para restaurar a funo, forma e esttica de

stios periodontais e periimplantares necessidade clnica e scio-econmica. Torna-se

relevante cientfica e socialmente a presente pesquisa, tendo em vista que a mesma buscou

iniciar um protocolo de cultura, in vitro, de fibroblastos humanos e, posteriormente, obter uma

linhagem celular, utilizando os meios e recursos laboratoriais disponveis na Universidade

Federal de Santa Catarina. Aps o desenvolvimento do referido protocolo e obteno da

linhagem celular, foi necessrio que os mesmos fossem testados, avaliando a viabilidade

celular e a presena de possveis alteraes do DNA. Os testes propostos, para verificao

destas variveis, so referendados cientificamente e possveis de serem aplicados no

Laboratrio de Virologia Aplicada da Universidade Federal de Santa Catarina, onde esta

pesquisa foi desenvolvida.

19

2 REVISO DA LITERATURA1

Essa pesquisa abordou o desenvolvimento de um protocolo preliminar de cultura de

fibroblastos humanos com o objetivo de aplicao futura da engenharia tecidual. Nesse

contexto, a segurana um parmetro de grande importncia; portanto, os testes de

citotoxicidade e genotoxicidade, que fornecem, respectivamente, informaes sobre a

viabilidade celular e as possveis alteraes no DNA celular so justificados. Assim,

didaticamente, a reviso da literatura foi dividida em cultura celular, engenharia tecidual,

consideraes sobre citotoxicidade e genotoxicidade e estudos envolvendo fibroblastos.

2.1 CULTURA CELULAR

A cultura de tecidos foi desenvolvida no incio do sculo passado (HARRISON, 1907;

CARREL, 1912) como um mtodo para estudo do comportamento das clulas animais,

eliminando as possibilidades de variaes sistmicas que podem acontecer em um estado

fisiolgico normal ou em condies de estresse, oriundas de um experimento. A tcnica foi

1 Baseado na NBR 10520: 2002 da ABNT.

20

elaborada inicialmente atravs da fragmentao de tecidos, crescimento e migrao celular ao

redor dos fragmentos por meio de mitoses celulares.

O termo cultura de tecidos foi usado de uma maneira abrangente, no entanto, a cultura

de tecidos inclui a cultura de rgos e de clulas. A cultura de rgos implica em uma cultura

tridimensional de tecidos desagregados que permanece com algumas ou todas as

caractersticas histolgicas daquele tecido, in vivo. A cultura celular refere-se s culturas

derivadas pela disperso de clulas retiradas de um tecido original, de uma cultura primria ou

de uma linhagem celular, pela desagregao enzimtica, mecnica ou qumica. O termo

cultura histotpica refere-se s clulas associadas em uma estrutura tridimensional, ou seja, o

crescimento de uma monocamada celular, a agregao em suspenso ou a infiltrao em uma

matriz tridimensional, como o gel de colgeno. O termo organotpico implica nesses mesmos

procedimentos, porm, utiliza clulas recombinantes de diferentes linhagens.

Harrisson (1907) escolheu os sapos como fonte de tecidos, provavelmente por

apresentarem sangue frio, assim, a incubao no seria um requisito necessrio.

Adicionalmente, a regenerao tecidual mais comum em pequenos vertebrados e isso

poderia ser vantajoso em estudos, in vitro. Embora essa tcnica pudesse reluzir uma nova

perspectiva de interesse nos estudos de cultura de tecidos, in vitro, poucos pesquisadores

seguiram esse exemplo na seleo de espcies. A cincia mdica interessava-se por animais

de sangue-quente, pois, o desenvolvimento de processos fisiolgicos e patolgicos estaria

mais prximo do ser humano. A acessibilidade de diferentes tecidos, que se comportavam

bem em culturas, fez com que o embrio de galinha fosse o material de escolha, porm, o

desenvolvimento de animais experimentais, em especial os roedores geneticamente puros,

levou essa espcie vanguarda da cultura de tecidos. Enquanto os embries de galinhas

poderiam prover uma diversidade de tipos celulares em culturas primrias, os tecidos de

roedores possuam a vantagem de fornecer linhagens celulares contnuas (EARLE, 1943). O

21

desenvolvimento da tecnologia transgnica de ratos (PEAT et al., 1992), concomitante a uma

experincia gentica bem estabelecida, difundiu o uso de roedores geneticamente puros. A

demonstrao de que tumores humanos poderiam tambm dar origem a linhagens celulares

contnuas, como as linhagens do tipo celular HeLa (GEY; COFFMAN; KUBICEK, 1952),

aumentou o interesse em cultura de tecidos humanos. O desenvolvimento da cultura de

tecidos humanos ocorreu devido a necessidade de dois ramos extremamente importantes na

pesquisa mdica: a produo de vacinas antivirais e o entendimento de neoplasias.

O estudo, in vitro, com cultura de clulas utilizado devido a facilidade de

padronizao da amostra, pois o pH, a temperatura, a presso osmtica, a tenso de CO2 e O2

podem ser controlados de maneira precisa. A caracterizao e homogeneidade da amostra

com culturas celulares idnticas, alm da economia no custo de reagentes que so utilizados

em menor quantidade, so vantagens desse tipo de estudo. As desvantagens so a necessidade

de um ambiente de trabalho assptico e de treinamento do pesquisador (FRESHNEY, 1990).

A tecnologia de cultura de tecidos foi adotada em muitas situaes rotineiras, por

exemplo: a anlise cromossmica de clulas derivadas do tero pode revelar desordens

genticas na criana que ainda est por nascer, infeces virais podem ser avaliadas

quantitativamente e qualitativamente em cultura de clulas apropriadas do hospedeiro, efeitos

txicos de frmacos e poluentes ambientais podem ser avaliados, etc. Desse modo, a cultura

celular uma tecnologia indispensvel nos ramos das cincias biolgicas, pois, fornece as

bases para o estudo da proliferao celular, diferenciao e formao de produtos em

condies cuidadosamente controladas. A tcnica de cultura celular contribuiu

significativamente na pesquisa do genoma humano e nas vias de sinalizao intra e

intercelular, que regulam a expresso gnica. A cultura celular utilizada em grande escala

para o crescimento de vrus, a produo de vacinas, o desenvolvimento de anticorpos

monoclonais, a produo de substncias farmacuticas, como hormnios, enzimas, fatores de

22

crescimento e coagulao, manipulada por tcnicas de DNA recombinante (MAcDONALD,

1990). Alm disso, os ensaios, in vitro, realizados atravs do cultivo celular em laboratrios,

podem substituir experimentos em animais, pois, o sacrifcio de animais visto atualmente

com certa inquietao. A opinio pblica e os grupos defensores dos direitos dos animais

questionam os aspectos ticos dessas pesquisas (FRESHNEY, 1999).

Outras aplicaes da cultura de tecidos incluem a cultura de clulas da epiderme

(GREEN; KEHINDE; THOMAS, 1979) e clulas endoteliais formadoras de capilares

(FOLKMAN; HAUDENSCHILD, 1980), alm do uso de enxertos autgenos e cirurgias

reconstrutivas utilizando as clulas do prprio paciente (BURT et al., 1989; DENNIS, 1992).

Indica-se, em alguns casos de queimaduras, realizar uma bipsia da derme do paciente,

propagar essas clulas em uma cultura primria e enxertar essas clulas cultivadas em

matrizes tridimensionais nas reas mais afetadas pelas queimaduras (BOYCE;

HANSBROUGH, 1988).

Na rea odontolgica, um grande nmero de estudos experimentais sobre efeitos

adversos extrados dos materiais dentrios foi publicado nas dcadas de 50, 60 e 70. Nesse

perodo, duas principais correntes na literatura podem ser distinguidas, uma conduzia estudos

animais, em que os materiais eram aplicados da forma como seriam utilizados em pacientes e

as reaes teciduais eram observadas atravs de tcnicas histolgicas. As tcnicas

experimentais envolvendo modelos animais, principalmente primatas no-humanos, foram

melhoradas pela padronizao das tcnicas histolgicas e procedimentos de avaliao

(LANGELAND et al., 1966; BAUME; HOLZ; FIORE DONNO, 1972). A segunda corrente

concentrou-se em tcnicas de cultura celular. Esses mtodos tornaram-se disponveis para a

pesquisa odontolgica durante a dcada de 1950, no Japo, e um dos pioneiros neste campo

foi H. Kawahara (KAWAHARA; SHIOTA; YAMAKAWA, 1955). Tang et al. (1999) e

23

Huang et al. (2002) avaliaram a citotoxicidade de cimentos adesivos ortodnticos em culturas,

in vitro, de fibroblastos humanos obtidos da cavidade bucal.

Nota-se que desde o desenvolvimento dessa modalidade de estudo, essa disciplina

destaca-se como um instrumento imprescindvel e integrante em diversas reas, como a

gentica molecular, a biotecnologia, a imunologia, a cirurgia, a bioengenharia e a fabricao

de produtos farmacuticos (LEON, 1993; MASTERS, 2000).

2.2 ENGENHARIA TECIDUAL

A engenharia tecidual caracteriza-se pelo desenvolvimento e manipulao de

molculas, clulas, tecidos ou rgos para o restabelecimento da funo de partes do corpo

injuriadas ou defeituosas. Atualmente, concomitante aos avanos associados na medicina de

transplantes, gentica, engenharia biomdica e na engenharia de rgos, a engenharia tecidual

oferece a possibilidade de regenerao verdadeira, essencial para as estruturas humanas

danificadas (ASSAEL, 2003). Dessa forma, as estratgias da engenharia tecidual, atravs do

cultivo celular humano para aplicao clnica, esto sendo desenvolvidas em diferentes

especialidades mdicas para reposio de cartilagens, ossos, componentes cardiovasculares e

pele. (MALEKZADEH et al., 1998).

Segundo Ueda et al. (2000), os elementos necessrios para a aplicao dos princpios

da engenharia de tecidos esto baseados na trade: (1) cultivo de clulas apropriadas

(fibroblastos, osteoblastos, clulas-tronco, entre outras); (2) matrizes (arcabouos ou

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scaffolds") confeccionadas em colgeno, osso ou polmeros sintticos e; (3) adio de

mediadores solveis, como fatores de crescimento e adesinas. As matrizes podem ter vrias

origens, como os polihidroxialcanoatos, tais como o cido poliltico, cido poligliclico, poli-

caprolactona (PEGO et al., 2003), hidrogis base de colgeno, polissacardeos, ou ambos,

tais como o alginato e a quitosana (LEE et al., 2000; PIEPER et al., 1999). As matrizes devem

apresentar integridade estrutural para que novos tecidos se desenvolvam (LEE et al., 2000;

STAMMEN et al., 2001). A engenharia tecidual aponta para o reparo de tecidos e rgos

danificados, porm, no causa respostas imunolgicas ou infeces, no necessita do uso de

cadveres e, principalmente, no mutila outras regies do paciente.

O cultivo de clulas normalmente realizado em placas ou garrafas contendo meios de

cultura que fornecem nutrientes para a viabilidade celular, in vitro. A dificuldade de

transporte das clulas para um stio receptor de um ser humano baseia-se no aspecto

bidimensional que caracteriza a cultura, devido as clulas propagadas formarem uma

monocamada nas placas ou garrafas de culturas. Os carreadores, que fornecem um aspecto

tridimensional para cultura e proliferao celular, tm sido utilizados para apoio e invaso dos

fibroblastos (ZACCHI et al., 1998).

O cultivo de fibroblastos em matrizes biocompatveis pode ser uma opo nas terapias

periodontais e periimplantares, que necessitam de aumento de tecido gengival. Grande parte

dos procedimentos cirrgicos periodontais e perimplantares reconstrutivos necessita de reas

doadoras intrabucais de tecido mole, com a remoo de tecido doador do palato, reas

edntulas, tber, ou ambas. Tais procedimentos resultam em um ps-operatrio doloroso e

aumento do tempo cirrgico (PINI PRATO et al., 2000).

A reposio do aparato periodontal atravs do cultivo celular mostra-se promissora.

Pini Prato et al. (2000) relataram o caso de uma paciente que necessitou de procedimento

25

cirrgico periodontal para reposio de mucosa ceratinizada previamente reabilitao

prottica. Essa deficincia foi tratada por meio de tcnicas de engenharia tecidual, que

compreenderam o cultivo primrio de fibroblastos, a partir da remoo cirrgica de uma

bipsia gengival de aproximadamente 2mm2. Esses fibroblastos foram cultivados em uma

matriz, uma membrana de cido hialurnico, que foi transportada para o stio receptor da

paciente. Os autores conseguiram xito na obteno de mucosa ceratinizada, confirmado

atravs de anlise macroscpica e histolgica. Portanto, a possibilidade de obteno de tecido

atravs da cultura de clulas, in vitro, com utilizao de carreadores pode diminuir o trauma e

o tempo cirrgico. Pini Prato et al. (2003) relataram o sucesso da tcnica em 6 pacientes

tratados atravs da engenharia de tecidos.

Lauer e Schimming (2001) apresentaram em seu trabalho a utilizao de enxertos de

mucosa oral atravs da engenharia de tecidos, utilizando-se clulas provenientes do palato

duro. O estudo apresentou os resultados clnicos dos procedimentos cirrgicos de enxertia de

mucosa oral em vestbulo aps resseco tumoral em 6 pacientes. Concluram, a partir de

evidncias clnicas e imuno-histolgicas, que o enxerto autgeno de mucosa oral, obtido por

meio de engenharia de tecidos, pode ser utilizado para a cobertura de feridas na cavidade oral.

Cicatrizao tecidual completa e diferenciao epitelial normal puderam ser observadas na

rea enxertada em um perodo ps-cirrgico de 6 meses.

Bordner e Grossman (2003) relataram o sucesso do uso de enxertos de mucosa em 11

pacientes, por meio de culturas autolgas de clulas da mucosa oral. Aps 3 (trs) semanas da

colocao dos enxertos de mucosa cultivada, os stios apresentaram-se ceratinizados e sem

sinais de infeco. Foi encontrada uma mucosa saudvel depois de 3 (trs) meses. Os autores

concluram que os enxertos de mucosa cultivada so teis em grandes defeitos da mucosa

oral, principalmente aps as patologias.

26

A aplicao de enxertos de mucosa oral gerada, in vitro, em defeitos da cavidade oral

(LANGDON et al., 1991), em cirurgias periimplantares (UEDA et al., 1998), em

procedimentos protticos (BORDNER; GROSSMAN, 2001) e em vestibuloplastias

(RAGHOEBAR et al., 1995) tem sido utilizada com sucesso.

A obteno de novo osso para restaurar a funo de ossos danificados, traumatizados

ou perdidos uma necessidade clnica e scio-econmica. A engenharia tecidual ssea

representa uma estratgia alternativa para a regenerao ssea. Em essncia, visa a

combinao de clulas maduras ou progenitoras com materiais, matrizes biocompatveis, ou

ambas, com ou sem apropriados fatores de crescimento, para dar incio ao reparo e

regenerao (BROWN; PORTER, 2000).

Borke e Mailhot (1998) isolaram clulas sseas intra-orais humanas durante a

preparao de stios para a instalao de implantes osseointegrados. Os autores demonstraram

a tcnica de obteno dos osteoblastos e discutiram os procedimentos para a manuteno da

cultura primria dessas clulas. Estabeleceram protocolos de caracterizao e concluram que

a utilizao de tecidos intra-orais pode ser til para a pesquisa no campo da engenharia

tecidual.

O uso de clulas-tronco osteognicas ou osteoprogenitoras para a reconstruo de

tecidos sseos uma rea de intensa pesquisa com alto potencial para o sucesso. A migrao

de clulas-tronco, derivadas da medula para stios sseos, a proliferao e a diferenciao

nesses stios teciduais locais evidenciam as possibilidades da utilizao de clulas humanas

osteoprogenitoras no tratamento de deficincias sseas (UEDA; TOHNAI; NAKAI, 2001).

Vacanti et al. (2003) isolaram clulas-tronco mesenquimais da medula ssea de 3

(trs) miniporcos Yucatan. Durante a manipulao laboratorial, suplementos osteognicos

foram adicionados. Uma matriz de polmero biodegradvel com formato de cndilo

27

mandibular foi construda. Foi possvel verificar, aps o cultivo por clulas osteoblsticas,

espessura ssea mdia de 0,3mm no interior dessas matrizes. Neste estudo preliminar, a

engenharia tecidual ssea autgena foi realizada pela combinao de polmeros

biodegradveis e clulas-tronco mesenquimais, eliminando a morbidade ps-operatria

decorrente de um acesso ao leito doador.

O presente e o futuro pertencem ao estudo e pesquisa das clulas-tronco (clulas

indiferenciadas), que permitiro a engenharia tecidual de estruturas orgnicas complexas,

como dentes, ossos alveolares e estruturas mucogengivais. Esse ser um passo importante

para a promessa da engenharia tecidual nas reconstrues verdadeiramente funcionais.

2.3 CONSIDERAES SOBRE CITOTOXICIDADE

A citotoxicidade foi definida por Nardone (1977) como o conjunto de alteraes da

homeostase celular, que leva a uma srie de modificaes que interferem na capacidade

adaptativa das clulas, bem como na sobrevivncia, reproduo e realizao de suas funes

metablicas.

Os teste de citotoxicidade, in vitro, so teis e necessrios para definir a citotoxicidade

basal, ou seja, a habilidade intrnseca de um composto causar alteraes e morte celular, como

conseqncias de dano das funes celulares bsicas (EISENBRAND et al., 2002).

28

Os ensaios freqentemente usados para avaliar a citotoxicidade baseiam-se nas

alteraes da permeabilidade celular (ex. uso de corantes vitais, tais como azul de Trypan,

preto de naftaleno, eosina, etc.), nas funes mitocondriais (ex. ensaio do MTT, XTT, etc.) e

nas alteraes da morfologia celular e da proliferao celular (ex. ensaios de proliferao

celular, ensaios clonognicos, etc.). Esses ensaios j esto estabelecidos para muitos tipos de

clulas e avaliam diferentes aspectos das funes celulares (VLIETINCK; DE BRUYNE;

VANDEN BERGHE, 1997; EISENBRAND et al., 2002).

O primeiro e o mais fcil efeito observado a avaliao microscpica das alteraes

morfolgicas ocorridas na monocamada de clulas, traduzidas pela desorganizao do tapete

celular, pelo aspecto granuloso, arredondado e/ou vacuolizado das clulas (STREISSLE;

SCHWOBEL; HEWLETT, 1981).

Outra tcnica para avaliar a citotoxicidade a mensurao da viabilidade celular

atravs do mtodo de excluso do corante azul de Trypan, que permite determinar a

integridade das membranas (WILSON, 2000). Esse corante penetra nas clulas mortas, pois

suas membranas no podem mais exclu-lo.

Helbig; Speit (1997) recomendam se trabalhar com amostras com viabilidade celular

acima de 90%, pois abaixo desse valor a citotoxicidade constitui um efeito deletrio. Para a

realizao do Ensaio do Cometa, idealmente, a viabilidade deve permanecer acima de 90%,

pois a genotoxicidade tem um significado importante quando ocorre em clulas viveis, que

foram capazes de sobreviver ao agente citotxico.

29

2.4 CONSIDERAES SOBRE GENOTOXICIDADE

Funcionalmente, os agentes genotxicos possuem a habilidade de alterar a replicao

do DNA e a transmisso gentica. Dessa forma, as medidas de genotoxicidade incluem,

principalmente, danos no DNA, mutaes e aberraes cromossmicas (COMBES, 1992).

Os ensaios de genotoxicidade, in vitro, so ferramentas sensveis para a deteco da

genotoxicidade e da potencial carcinogenicidade de agentes qumicos ou fsicos

(MCGREGOR; CASCIANO; MLLER, 2000; TICE et al., 2000; EISENBRAND et al.,

2002), podendo ser avaliadas pelos seguintes ensaios: teste de Ames (TRAORE et al., 2000;

FERRER et al., 2002), teste de microncleos (McGREGOR; CASCIANO; MLLER, 2000;

SILVA et al., 2002), Ensaio do Cometa (TICE et al., 1990; ROJAS; LOPEZ; VALVERDE,

1999; SNYDER; GREEN, 2001), entre outros.

O Ensaio do Cometa ou Single Cell Gel (SCG) Assay um mtodo de eletroforese em

microgel, utilizado para a deteco e quantificao de quebras das fitas do DNA em clulas

individuais, usando microscopia (SINGH et al., 1988; FAIRBAIRN; OLIVE; ONEIL, 1995).

Rydeberg e Johanson (1978, apud STILING; JOHANSON, 1984) foram os

primeiros a quantificar diretamente o dano no DNA de clulas individuais. Posteriormente,

stiling e Johanson (1984) melhoraram a sensibilidade da deteco de danos no DNA ao

desenvolverem uma tcnica de eletroforese em microgel, na qual as clulas eram lisadas,

misturadas com agarose e submetidas eletroforese em condies neutras, permitindo a

deteco de quebras das fitas duplas do DNA celular. O nome pelo qual o ensaio tornou-se

conhecido na literatura cientfica deve-se ao fato de que as clulas com dano aumentado no

30

DNA demonstram uma migrao aumentada do DNA cromossmico do ncleo celular em

direo ao nodo, o que resulta no formato de um cometa; a quantidade de migrao do DNA,

a intensidade da fluorescncia e o comprimento da cauda dos cometas indicam a quantidade

de dano ao DNA celular, induzido pelo agente testado (McKELVEY-MARTIN et al., 1993;

ANDERSON; YU; MCGREGOR, 1998). Singh et al. (1988) modificaram a tcnica de

stiling e Johanson, utilizando uma eletroforese alcalina (pH13), capaz de detectar quebras das fitas simples do DNA em stios lcali-lbeis (FAIRBAIRN; OLIVE; ONEIL, 1995;

ROJAS; LOPEZ; VALVERDE, 1999). Partindo-se do princpio de que a maioria dos agentes

genotxicos induz mais quebras em fitas simples do que em fitas duplas do DNA, a verso

alcalina da tcnica apresenta maior sensibilidade para a deteco da induo de danos ao

DNA (SPEIT et al., 1999; SPEIT; HARTMANN, 1999; TICE et al., 2000). Adicionalmente,

Olive; Banath; Durang (1990) desenvolveram um processo de lise celular, tambm em

condies alcalinas, seguido de eletroforese em pH ~12,3. Os mtodos de Singh et al. (1988) e

de Olive; Banath; Durang (1990) so idnticos no princpio e similares na prtica, mas o

protocolo que utiliza pH13 mostrou-se ser mais sensvel, por possibilitar a expresso mxima dos danos em fitas simples e em stios lcali-lbeis, sendo o mtodo de escolha para a

identificao de agentes genotxicos, segundo o International Workshop on Genotoxicity Test

Procedures (TICE et al., 2000).

O Ensaio do Cometa um teste de genotoxicidade que se desenvolveu rapidamente

nos ltimos anos, representando um papel importante em muitas reas (WATERS; STACK;

JACKSON, 1999; COLLINS, 2002). O nmero de pesquisadores que utiliza esse teste e o

alcance de suas aplicaes est aumentado exponencialmente, podendo o Ensaio do Cometa

ser aplicado na avaliao dos efeitos genotxicos de vrios agentes sobre clulas somticas e

germinativas in vitro e in vivo (HARTMANN; SPEIT, 1997; SNYDER; GREEN, 2001), nos

estudos de reparo do DNA (LAFFON; PSARO; MNDEZ, 2002), nas aplicaes clnicas

31

(SARDAS et al., 1998), no monitoramento humano (COLLINS et al., 1997; KAN et al.,

2002) e no biomonitoramento ambiental (STEINERT et al., 1998).

As vantagens dessa tcnica incluem: 1) sensibilidade para deteco de baixos nveis de

dano ao DNA; 2) simplicidade e baixo custo; 3) uso de pequeno nmero de clulas por

amostra; 4) coleta de dados de clulas individuais, permitindo anlises estatsticas mais

precisas; 5) virtualmente, qualquer populao de clulas eucariticas pode ser analisada; 6)

uso de pequenas quantidades do material teste, fcil aplicao e curto perodo de tempo para

concluir o experimento; 7) capacidade para avaliar o dano ao DNA de clulas no

proliferativas e, por ser um ensaio de clulas individuais, possibilidade de detectar respostas

no uniformes numa populao mista de clulas; 8) capacidade para avaliar genotoxicidade

em ensaios in vitro e in vivo (COLLINS et al., 1997; ROJAS; LOPEZ; VALVERDE, 1999;

TICE et al., 2000). A populao de clulas mais adequada depender das caractersticas da

exposio, da amostra, do acesso e do objetivo do estudo (ALBERTINI et al., 2000). Segundo

Tice et al. (1990), as nicas desvantagens so a necessidade de suspenses celulares

individuais e o fato de que pequenas amostras celulares podem no ser representativas da

populao celular total.

Devido grande diversidade de aplicaes dessa tcnica, surgiu a necessidade da

validao internacional dos seus procedimentos, a fim de que diferentes laboratrios

pudessem comparar seus resultados (OLIVE, 2002). Algumas padronizaes j esto

disponveis no International Workshop on Genotoxicity Test Procedures (TICE et al., 2000) e

no International Programme on Chemical Safety (ALBERTINI et al., 2000), os quais

recomendam alguns procedimentos para que o Ensaio do Cometa possa ser utilizado nos

estudos de genotoxicidade.

32

A sensibilidade do ensaio permite utiliz-lo como uma potente ferramenta para o

estudo de genotoxicidade, tendo em vista que aproximadamente 85% dos estudos realizados

nessa rea encontraram resultados positivos. Entretanto, so necessrios estudos

complementares para investigar a persistncia, o reparo dos danos observados e suas

correlaes com aberraes cromossmicas, mutaes ou induo da formao de

microncleos. E, mais importante, para a determinao do significado biolgico do dano ao

DNA observado pela tcnica (ROJAS; LOPEZ; VALVERDE, 1999).

A avaliao paralela dos danos causados ao DNA, realizada atravs da anlise visual e

do programa analisador de imagens computadorizado, mostrou uma clara correlao entre os

escores visuais e os computadorizados, comprovando que, embora o programa analisador de

imagens seja uma ferramenta interessante, o escore visual tambm fornece informaes

confiveis e teis para a anlise estatstica dos experimentos (COLLINS et al., 1997).

A anlise estatstica do Ensaio do Cometa deve ser realizada levando-se em

considerao a importncia biolgica dos dados obtidos, identificando-se o tamanho do efeito,

que poder ser considerado biologicamente importante, e relacionando-o com o poder

estatstico do estudo (LOVELL; THOMAS; DUBOW, 1999).

Para a utilizao do Ensaio do Cometa objetivando a avaliao de genotoxicidade,

sugere-se que sejam utilizadas, no mnimo, 4 (quatro) concentraes do material-teste,

controles negativos e positivos, sendo realizado 2 (dois) experimentos independentes

(MCKELVEY-MARTIN et al., 1993). Normalmente, utiliza-se o perxido de hidrognio

(H2O2) como controle positivo. Duas hipteses so sugeridas para explicar o dano induzido

pelo H2O2: a primeira a formao de radicais hidroxila (OH), atravs do processo de catlise

por metais de transio, tipicamente Fe+2, sendo esta reao denominada reao de Fenton

(DREHER; JUNOD, 1996); a segunda hiptese seria a habilidade dos radicais (OH.) e outras

33

espcies reativas de oxignio, que provocam estresse oxidativo, de causar danos no DNA,

atravs da ativao de uma srie de eventos metablicos celulares, permitindo a atividade de

enzimas nucleases, as quais clivam a cadeia de DNA. Ambos os mecanismos podem ocorrer

simultaneamente (HALLIWELL; ARUOMA, 1991).

Concomitante ao Ensaio do Cometa enfaticamente recomendada uma medida de

citotoxicidade (SPEIT; HARTMANN, 1999). O mtodo freqentemente utilizado o teste de

excluso pelo corante Azul de Trypan (TICE et al., 1990; SINGH et al., 1991; MIYAMAE et

al., 1998b), que segundo o International Workshop on Genotoxicity Test Procedures deve

resultar em uma viabilidade celular acima de 70%, a fim de evitar resultados falso-positivos

(ANDERSON; YU; MCGREGOR, 1998; TICE et al., 2000). Helbig e Speit (1997)

recomendam efetuar o Ensaio do Cometa, se possvel, em amostras com viabilidade celular

acima de 90%, pois a genotoxicidade tem um significado importante quando ocorre em

clulas viveis, que foram capazes de sobreviverem ao agente citotxico.

2.5 ESTUDOS REALIZADOS IN VITRO COM FIBROBLASTOS

Os fibroblastos so clulas encontradas com alta predominncia no tecido conjuntivo.

Na obteno de uma cultura celular, a partir de explantes de tecido conjuntivo, por

desagregao enzimtica ou mecnica, e mantida em meios de cultura suplementados com

soro, os fibroblastos proliferam-se rapidamente e tornam-se o tipo celular predominante. Aps

algumas passagens, geralmente, apenas os fibroblastos so as clulas proliferativas

34

sobreviventes. Uma das razes que a maioria dos meios de cultura disponveis otimiza e

favorece as linhagens celulares fibroblsticas (SATO et al., 1994).

Kent et al. (1996) avaliaram os efeitos, in vitro, do nmero de passagens de uma

cultura de fibroblastos humanos gengivais sobre a morfologia celular, viabilidade celular e

expresso de citocinas. A anlise compreendeu clulas da primeira at a dcima passagem. A

viabilidade celular permaneceu acima de 90% at a 7a passagem. Os valores obtidos na 8a, 9a

e 10a passagens foram 86%, 93% e 87%, respectivamente. Foi observado um aumento do

volume celular (tamanho celular) e um decrscimo na quantidade celular com o aumento da

idade da cultura. O estudo demonstrou a expresso de IL-1, IL-6 e IL-8 na cultura de fibroblastos humanos gengivais e a ausncia de expresso IL-1 e TNF-.

Essa mudana de volume (tamanho) celular tambm foi relatada por Pendergrass;

Angello; Norwood (1989), que avaliaram aproximadamente 70 passagens das culturas de

fibroblastos; os autores observaram volumes originais celulares de aproximadamente

2000m3, enquanto 5000m3 foram os volumes de clulas em senescncia. Alm disso, verificaram perda da capacidade proliferativa em decorrncia da idade da cultura. Isso no foi

verificado por Kent et al. (1996), no entanto, esses ltimos autores trabalharam somente at a

dcima passagem.

Almeida-Lopes (1999) desenvolveu uma linhagem de fibroblastos de gengiva humana,

propondo dois modelos de estudo in vitro um com meio de cultivo e SFB a 5% e o outro com

10% de SFB. Analisou a proliferao celular atravs da contagem do nmero de clulas

existentes antes e depois de receberem irradiao com diodos lasers, operando em diferentes

comprimentos de onda. Verificou-se que quando as clulas receberam irradiao com mesma

irradincia e fluncia, o comprimento de onda que induziu maior proliferao celular foi

aquele situado na regio do visvel. No caso onde se manteve mesma fluncia, mas diferente

35

irradincia, o melhor resultado foi obtido com radiao no infravermelho. Em ambos os casos,

os grupos irradiados apresentaram proliferao significativamente maior nos grupos

irradiados quando comparados ao controle.

Woollons et al. (1997) avaliaram os danos aos DNA celulares de fibroblastos humanos

causados por cmaras de bronzeamento (UVA e UVB) e pela exposio solar, pois a induo

de mutaes ao DNA um pr-requisito para o desenvolvimento de cnceres de pele.

Utilizando-se enzimas especficas de reparo de DNA (endonuclease T4 e endonuclease III) e

o Ensaio do Cometa, avaliou-se a ao de duas diferentes cmaras de bronzeamento

disponveis comercialmente. Ficou estabelecido que esses aparelhos produzem diferentes

tipos de dano ao DNA, associados fotocarcinognese de clulas humanas, e as evidncias

epidemiolgicas existentes confirmam o risco potencial do uso desses aparelhos de

bronzeamento artificial.

SantAnna et al. (2002) estabeleceram e caracterizaram uma linhagem contnua de

clulas derivadas de ligamento periodontal (LP) humano. Essas clulas foram obtidas atravs

da tcnica do explante de tecido removido por raspagem do tero mdio das razes de

terceiros molares extrados de 3 (trs) pacientes saudveis. Posteriormente, as clulas foram

caracterizadas atravs de microscopia ptica, padro de crescimento, testes

imunohistoqumicos, histoqumicos e enzimticos. Morfologicamente, apresentaram aspecto

fusiforme ou estrelado, compatvel com clulas fibroblsticas. Houve marcao positiva para

vimentina, osteonectina, fibronectina, sialoprotena ssea II e tenascina e negativa para

anticorpos anti-citoqueratina (AE1/AE3), actina de msculo liso e colgeno III. A presena de

ndulos mineralizados sintetizados, in vitro, pelas clulas foi confirmada pelo teste de Von

Kossa. Esses resultados, em conjunto, indicaram que as clulas cultivadas, denominadas FL2,

eram derivadas de LP e, portanto, poderiam ser utilizadas em estudos, in vitro.

36

Rossa Jnior; Martinez; Silvrio (2002) avaliaram, in vitro, o efeito da nicotina sobre a

viabilidade e a morfologia celular utilizando-se uma linhagem contnua de fibroblastos. Para

tal, foram formados dois grupos experimentais segundo a dose (0 - controle, 10g, 100g,

0,5mg, 1mg de nicotina) e o tempo de condicionamento (1h e 24h). Cada um dos 12 orifcios

de uma placa para cultura celular recebeu 2ml de meio de Eagle e 1ml de suspenso de meio

de cultura contendo aproximadamente 1x105clulas/ml. Foi, ento, acrescentada a soluo de

nicotina nas diferentes concentraes. Aps o acondicionamento com o frmaco, nos dois

perodos testados, as clulas foram coradas com Azul de Trypan a 0,4% e observadas em

microscpio de observao direta. Quanto morfologia, os resultados obtidos demonstraram,

no grupo acondicionado por 1h, que os controles apresentaram diferenas estatisticamente

significantes apenas em relao maior dose de nicotina; no entanto, foram encontradas

diferenas estatisticamente significantes entre o controle e todas as concentraes, aps 24h

de condicionamento. Quanto a viabilidade celular, um maior nmero de clulas no viveis

foi observado nas diferentes concentraes de nicotina em comparao aos controles, tanto

aps 1h quanto 24h de condicionamento (p < 0,05). Em ambos os perodos, houve uma

tendncia significativa de aumento do nmero de clulas no viveis com o aumento da dose

de nicotina (p = 0,0053; p = 0,00001 aps 1h e 24h, respectivamente). Portanto, concluiu-se

que a nicotina pode alterar in vitro a viabilidade e a morfologia de fibroblastos de forma

proporcional dose e ao tempo de exposio.

Andrighetti-Frohner (2003) avaliou a citotoxicidade e a genotoxicidade da violacena,

metablito da bactria Chromobacterium violaceum, sobre culturas de clulas VERO

(fibroblastos de rins do macaco verde da frica), clulas FRhK-4 (clulas fetais de rins de

macacos rhesus), clulas Hep-2 (clulas de carcinoma de orofaringe humana) e clulas

MA104 (fibroblastos obtidos a partir de rins embrionrios do macaco rhesus). A viabilidade

celular de seus controles negativos (onde a violacena no foi empregada) permaneceu acima

37

de 90% para todas as linhagens celulares. Os danos aos DNA celulares, determinados atravs

do Ensaio do Cometa, encontrados com o uso do perxido de hidrognio a 200m, foram de 153,33 12,81, 145,17 3,03, 142,83 5,06 e 131,33 4,63 para as clulas VERO, FRhK-4, MA104 e Hep-2, respectivamente. Os danos encontrados em seus controles negativos foram

de 12,67 1,30, 20,50 0,58, 33,33 3,76 e 23,67 6,84 para as mesmas linhagens celulares. O estudo verificou que a violacena teve efeito citotxico e genotxico,

concentrao-dependente, nas diferentes linhagens celulares.

2.6 ORIGEM DOS FIBROBLASTOS

O periodonto um tecido altamente complexo e especializado composto de tecidos

duros e moles. Os fibroblastos, clulas residentes e predominantes nos tecidos moles

periodontais, so responsveis pela produo e manuteno da matriz extracelular (TEN

CATE, 1989).

Alguns estudos sugerem a heterogeneidade dos fibroblastos presentes nesses tecidos

com fentipo nico e atividade funcional distinta (FRIES, 1994). Enquanto os fibroblastos

gengivais garantem a sntese e integridade do tecido conjuntivo gengival, os fibroblastos dos

ligamentos periodontais com funes especializadas so responsveis pela formao e

manuteno do ligamento periodontal, alm do reparo, remodelamento e regenerao do

cemento e osso alveolar adjacente, in vivo (NYMAN et al., 1982).

38

Em nossa dissertao, a escolha do cultivo de fibroblastos gengivais eliminando os

ceratincitos reside no fato demonstrado por Le et al. (1971 e 1974) de que a ceratinizao

do epitlio bucal controlada por estmulos morfogenticos do tecido conjuntivo subepitelial.

Dessa forma a cultura de fibroblastos existentes no tecido conjuntivo da mucosa ceratinizada

foi nossa primeira opo de cultivo.

39

3 PROPOSIO

3.1 OBJETIVOS GERAIS

Estabelecer um protocolo preliminar de cultura de fibroblastos de gengiva humana, oriunda de um stio bucal clinicamente saudvel (ausncia de

sangramento profundidade de sondagem).

Estabelecer uma linhagem celular a partir do cultivo primrio de fibroblastos de gengiva humana, proveniente de um stio clinicamente saudvel.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Avaliar nos fibroblastos, aps seu isolamento e cultivo in vitro:

a viabilidade celular, atravs do mtodo de excluso pelo Azul de Trypan;

as possveis alteraes no DNA celular, atravs do Ensaio do Cometas.

40

4 MATERIAL E MTODOS

Esse item foi dividido em captulos para a maior compreenso do leitor. O item 4.1

aborda os meios de cultura e reagentes freqentemente utilizados em todas as fases do

experimento. O item 4.2 engloba desde a obteno da amostra at o estabelecimento de uma

cultura primria e linhagem celular, alm de apresentar uma viso global do experimento

(itens 4.2.2 e 4.2.3). Os itens 4.3 e 4.4 detalham os testes de citotoxicidade (viabilidade

celular) e genotoxicidade (danos aos DNA celulares), respectivamente.

4.1 MEIO DE CULTURA E REAGENTES

4.1.1 Meio de cultura

O meio de cultura Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) (Sigma, Sigma

Chemical CO., EUA) foi utilizado para crescimento e manuteno das clulas. O meio de

cultura constitudo de nutrientes (vitaminas, protenas, fatores de crescimento, etc.)

necessrios para o crescimento celular e mantm o pH e a osmolaridade compatveis com a

41

viabilidade celular. A regulagem da temperatura e dos nveis de O2 e CO2 da estufa deve ser

realizada (37C e 5% de CO2), pois o CO2 influencia tambm na proliferao celular atravs

da participao na biossntese das bases pricas e pirimdicas. A atmosfera dentro da estufa

deve ser saturada com vapores d`gua a fim de prevenir a evaporao e o aumento da

osmolaridade do meio. O pH do meio permaneceu entre 7,2 - 7,4; caso necessrio, seria

ajustado com NaHCO3 (Sigma, Sigma Chemical CO., EUA) ou HCl (Sigma, Sigma Chemical

CO., EUA).

4.1.2 Soro fetal bovino

O soro fetal bovino (SFB) (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA) foi adicionado ao meio

de cultura na concentrao de 10% para permitir a manuteno e proliferao das clulas em

cultura. Para cada 100ml de meio, 10ml de SFB foi acrescentado.

4.1.3 Antibiticos e antifngico

Antibiticos e antifngico (PSA) (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA) foram

adicionados ao meio para evitar a contaminao das culturas por bactrias, fungos e

leveduras, na proporo de 1%, ou seja, para cada 100ml de meio, foi acrescentado 1ml de

penicilina/estreptomicina/anfoterecina B (10000U penicilina, 10000g estreptomicina e 25g anfoterecina B) .

42

4.1.4 Tripsina

A tripsina (Sigma, Sigma Chemical CO., EUA) uma enzima do grupo das proteases,

que catalisam reaes de quebra da cadeia polipeptdica em determinadas seqncias de

aminocidos. Esta enzima no requer a presena de co-fatores e muito utilizada em culturas

celulares, que necessitam de um suporte para se fixarem e proliferarem. Ela age, ento, sobre

as protenas que permitem a fixao das clulas no suporte, liberando-as. A tripsina deve ter

sua ao proteoltica inibida, aps o descolamento das clulas, para evitar a citlise. Esta

inibio feita atravs da adio de SFB s clulas. Nos experimentos, no momento da

formao de subculturas de culturas confluentes foi utilizada tripsina de pncreas de porco a

0,25% (tripsina: EDTA 1: 250). Volume por garrafa: 0,5ml.

4.1.5 Soluo salina de fosfato tamponada

A soluo salina de fosfato tamponada (PBS) uma mistura de sais que promove a

remoo de restos orgnicos e celulares. utilizado para a lavagem das clulas. Possui pH em

torno de 7,0. composto de 8,0g de NaCl (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA), 0,2g de KCl

(Sigma, Sigma Chemical CO., EUA), 1,44g de Na2HPO4 (Sigma, Sigma Chemical CO.,

EUA), 0,24g de KH2PO4 (Sigma, Sigma Chemical CO., EUA) em q.s.p. para 1l de gua Milli-

Q (Quimis Aparelhos Cientficos Ltda, So Paulo, Brasil).

43

4.2 CULTIVO CELULAR

4.2.1 Obteno da amostra

O material para o cultivo celular foi obtido de gengiva humana. Foi selecionado um

indivduo, sexo masculino, no fumante, 37 anos, cuja anamnese revelou estado sistmico

normal. O indivduo no relatou o uso de qualquer tipo de medicamento. O voluntrio foi

submetido a uma bipsia (explante) de aproximadamente 20mm2 (4x5mm) de mucosa

ceratinizada (epitlio e tecido conjuntivo) da regio retromolar (FIG. 1), atravs de cabo de

bisturi n 3 e lmina cirrgica n 15C, sob anestesia local, em condies de assepsia e

antissepsia compatveis ao ambiente ambulatorial. Foi indicado um procedimento periodontal

cirrgico de cunha distal neste stio doador, de modo a favorecer a higienizao do indivduo.

Antes da realizao da cirurgia, o indivduo foi informado sobre o projeto e optou por

participar do mesmo por livre e espontnea vontade, com consentimento informado (Projeto

de Pesquisa n 200/03 aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em Humanos da

Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC) (ANEXOS).

Aps coleta da amostra (explante), a mesma foi lavada em soro fisiolgico 2x,

colocada em uma garrafa de cultura de 25cm2 contendo meio DMEM, suplementado com

10% de SFB e 1% de PSA, mantido a 37C e transferida para o Laboratrio de Virologia

Aplicada da UFSC.

44

Figura 1 Bipsia (explante) de aproximadamente 20mm2 (4x5mm), obtida da regio retromolar.

45

4.2.2 Desenho proposto do experimento

Inicialmente, o fluxograma proposto para a realizao da pesquisa foi o seguinte:

Bipsia Gengival20 mm2

Remoo do tec. epitelial Fragmentao 15 explantes

(1mm2)

Diviso dos explantes. (5 garrafas de cultura)

1a Garrafa (Cultura primria)





6a passagem 6a passagem 6a passagem 6a passagem

Tratamento 2h (Apenas meio de cultura)

Tratamento (H2O2)

Tratamento (meio)

Controle Negativo

Controle Positivo

Grupo Teste

Grupo Teste

Grupo Teste

Viabilidade Celular

Viabilidade Celular

Viabilidade Celular > 90% (Aceitao e continuao experimento)

Ensaio do Cometa (3 lminas por garrafa)

Ensaio do Cometa

(3 lminas)

Ensaio do Cometa

(3 lminas)

46

4.2.3 Desenho do experimento realizado

Abaixo, segue o fluxograma do trabalho realizado.

OBS.: O grupo controle negativo foi excludo, pois a cultura primria, que no sofreu nenhuma passagem,

no forneceu quantidade suficiente de clulas para a realizao do Ensaio do Cometa.

Bipsia Gengival20 mm2

Remoo do tec. epitelial Fragmentao 15 explantes

(1mm2)

Diviso dos explantes. (5 garrafas de cultura)






6a passagem 6a passagem 6a passagem 6a passagem

Tratamento 2h (Apenas meio de cultura)

Tratamento (H2O2)

Grupo Teste

Controle Positivo

Grupo Teste

Grupo Teste

Grupo Teste

Viabilidade Celular

Viabilidade Celular > 90% (Aceitao e continuao experimento)

Ensaio do Cometa (3 lminas por garrafa)

Ensaio do Cometa

(3 lminas)

6a passagem

47

4.2.4 Cultura primria

O protocolo de cultura utilizado foi aquele proposto por Kuru et al. (1998) com

modificaes. Estas foram realizadas durante o desenvolvimento do trabalho, de acordo com

as necessidades, dificuldades e oportunidades de adoo de alteraes pertinentes. Todos os

procedimentos para a obteno do cultivo primrio de fibroblastos gengivais humanos foram

realizados sob capela de fluxo laminar (VECO, Campinas, Brasil), em temperatura ambiente,

entre 25 e 28C, em um laboratrio de segurana do tipo P2, preparado para a manipulao de

microorganismos pertencentes ao grupo de risco 2 (risco individual moderado e risco coletivo

limitado; microorganismos que podem provocar doenas no homem, com pouca

probabilidade de alto risco para os profissionais do laboratrio), assegurando maior proteo

aos pesquisadores. Todas as substncias lquidas foram quantificadas com o auxlio de

micropipetas automticas.

A amostra de 20mm2 foi lavada (FIG. 2) por 2 vezes com soluo salina de fosfato

tamponada (PBS) e, posteriormente, o tecido epitelial foi removido com o auxlio de cabo de

bisturi n 3 e lmina cirrgica n 15, em placas de Petri de 60mm de dimetro, que continham

5ml do meio de cultura. A escolha do cultivo de fibroblastos gengivais eliminando os

ceratincitos reside no fato demonstrado por Le et al. (1971 e 1974) de que a ceratinizao

do epitlio bucal controlada por estmulos morfogenticos do tecido conjuntivo subepitelial.

Aps a desepitelizao, a amostra foi fragmentada em 15 partes (explantes) de

aproximadamente 1mm2 (FIG. 3). Em cada uma das 5 (cinco) garrafas de cultura de 25cm2,

previamente pr-incubadas a 37oC, 5% de CO2 (FIG. 8) com 2ml do meio de cultura

devidamente suplementado, por 20min., para equilbrio da fase gasosa, 3 (trs) explantes

foram adicionados concomitante a colocao de mais 2ml de meio de cultura (FIG. 4). As

garrafas de cultura permaneceram invertidas por 2h na estufa a 37oC, 5% de CO2 (NUAIRE

48

US AUTOFLOW CO2 Water Jacketed Incubator, EUA) para aderncia dos explantes ao

substrato. Aps, as garrafas de cultura foram colocadas na sua posio original e checou-se o

crescimento celular, diariamente, atravs de um microscpio de fase invertida (40x a 200x,

Olympus, Japo).

Figura 2 Lavagem da amostra com PBS, com o auxlio de uma micropipeta.

Figura 3 Fragmentao da amostra, aproximadamente 1mm2 cada explante.

49

Figura 4 Colocao de um explante numa garrafa de cultura. Cada uma das cinco garrafas recebeu 3 explantes.

Quando uma subconfluncia de aproximadamente 70% foi atingida, as clulas foram

tripsinizadas (para obter individualizao celular) e essa cultura primria deu origem a uma

nova subcultura na proporo de 1:1. Na primeira passagem, os explantes foram removidos. A

subcultura, ou passagem de clulas de uma garrafa para outra, geralmente implica na

subdiviso de uma populao celular proliferativa capaz de perpetuao atravs de

estabelecimento de uma linhagem celular. O nmero de passagem significa o nmero de

vezes que uma cultura foi subcultivada.

O meio de cultura foi trocado a cada 4 (quatro) dias substituindo-se apenas metade do

contedo das garrafas de cultura, ou seja, 2ml de meio de cultura novo. A alterao da

colorao do meio de cultura, que indica atividade metablica celular e alterao de pH, foi

controlada diariamente.

50

4.2.5 Linhagem celular

A confluncia celular foi verificada em microscpio invertido, indicando modulao

da atividade mittica celular. As clulas em cultivo sofrem um fenmeno que se conhece por

inibio de contato, pois quando uma clula contata ao seu redor com outra clula e forma

uma monocamada, inibe-se o processo mittico (ALBERTS et al., 1989).

Para perpetuao dessa linhagem celular, o meio de cultura foi removido e essas

clulas foram lavadas por 2 (duas) vezes com PBS (0,2ml/cm2) e retiradas de seu substrato

pela ao da tripsina (500l), durante 5min a 37C (tripsinizao). A inativao da tripsina foi realizada pela adio de 4ml de meio de cultura (DMEM/SFB/PSA). Posteriormente, as 5

(cinco) garrafas retornaram para a estufa de CO2 onde permaneceram incubadas e monitoradas

diariamente at que nova subconfluncia fosse atingida.

Na 6a passagem, as amostras celulares foram removidas das 5 (cinco) garrafas de

cultura para anlise da viabilidade celular e danos ao DNA e as clulas remanescentes foram

congeladas para estocagem.

4.2.5.1 Escolha da 6a passagem

De acordo com Freshney (1999), linhagens celulares com poucas passagens so

instveis e necessitam de um perodo de adaptao em culturas. No caso de fibroblastos

humanos, estas culturas tornam-se estveis e consistentes aps a 5a passagem e assim

permanecem at a 35a passagem. A utilizao de clulas deve ser feita aps o perodo de

adaptao e previamente senescncia. Almeida-Lopes (1999) utilizou fibroblastos humanos

na 6a passagem em seus experimentos com o uso do laser. Huang et al. (2002) escolheram

51

clulas da 5a a 7a passagens para avaliar a citotoxicidade de cimentos adesivos ortodnticos

sobre fibroblastos gengivais enquanto que para a mesma finalidade, Tang et al. (1999) usaram

clulas da 6a passagem.

4.2.6 Congelamento e descongelamento celular

Os protocolos de congelamento e descongelamento adotados foram aqueles elaborados

por Juliane Arajo Greinert, revisados por Ryane L. Hess e Caroline Rigotto, modificados por

Cibele Marina Gaido e aprovados pela Prof. Dra. Cludia Maria Oliveira Simes, co-

orientadora deste trabalho, em 23/05/2000, utilizados no Laboratrio de Virologia Aplicada

da UFSC (Comunicao pessoal). Os passos foram os seguintes:

1) Congelamento de clulas

a) Preparar previamente o meio para congelamento em banho de gelo:

5ml de meio de crescimento

4ml de SFB (40%)

1ml de DMSO (10%)

ATENO: Dimetilsulfxido (DMSO) txico a altamente inflamvel.

b) lavar o tapete celular 3x com PBS;

c) tripsinizar as clulas, controlando o descolamento das clulas pelo

microscpio;

USAR 1,8ml por criotubo

52

d) adicionar 10ml de meio de crescimento suplementado com 10% SFB + 1%

PSA;

e) transferir a suspenso celular para o tubo de centrifuga;

f) centrifugar a 1000rpm por 3 a 5min;

g) aspirar o meio (descarte), com muito cuidado para no aspirar as clulas do

fundo do tubo;

h) adicionar rapidamente no tubo de 15ml, 3,6ml de soluo de congelamento,

homogeneizar e transferir para um criotubo (1,8ml cada a ser realizado em

banho de gelo);

i) colocar os criotubos nos Mr. Frozen, no esquecendo de checar o nvel de lcool etlico 96GL;

j) colocar o Mr Frozen no freezer (80 C), no mnimo, por 12h, e no mximo por 24h;

k) Transferir para o container de nitrognio lquido a 126 C (MVE Inc., EUA).

2) Descongelamento de clulas

a) Descongelar o criotubo em temperatura ambiente;

b) centrifugar o criotubo em velocidade de 1000rpm (350Xg) por 2min.

Desprezar o sobrenadante e ressuspender as clulas em meio de crescimento

suplementado + 10% SFB E 1% PSA;

53

c) colocar todo o contedo do microtubo em uma garrafa pequena destinada ao

cultivo das clulas;

d) adicionar o mesmo meio de crescimento: meio de cultura/PSA 1% + 10%

SFB;

e) incubar a 37C em estufa de CO2 a 5% por 1h;

f) durante o tempo de incubao as clulas formaro tapete. Aps esse perodo,

retirar cuidadosamente o meio presente e adicionar uma nova quantidade do

meio de crescimento;

g) colocar novamente na estufa de CO2.

4.3 AVALIAO DA CITOTOXICIDADE

4.3.1 Avaliao microscpica das alteraes celulares

Qualquer adversidade da cultura celular, que compreende a desorganizao do tapete

celular, bem como o aspecto granuloso e arredondado das clulas, e conseqentemente, o

aparecimento de alteraes morfolgicas celulares, foi monitorada diariamente em

microscpio de fase invertida (STREISSLE; SCHWOBEL; HEWLETT, 1981).

54

4.3.2 Avaliao da viabilidade celular atravs do mtodo de excluso do corante azul de Trypan

Diferentes tcnicas de colorao (cristal violeta, eosina, vermelho neutro, azul de

Trypan, etc.) so usualmente utilizadas para avaliar a citotoxicidade de substncias. Neste

trabalho foi utilizado o teste de excluso com o azul de Trypan (MERCK, Rio de Janeiro,

Brasil), um corante marcador para clulas mortas. Este fenmeno de permeabilidade da

membrana celular permite estimar indiretamente o grau de integridade da mesma. O

percentual de clulas no coradas representa o ndice de viabilidade celular (WILSON, 2000).

Aps a confluncia das garrafas de cultura que se encontravam na 5a passagem, todo o

meio de cultura (DMEM/SFB/PSA) foi removido e substitudo apenas por 4ml meio de

cultura DMEM, com exceo da garrafa do controle positivo, que recebeu novo meio de

cultura DMEM associado com perxido de hidrognio (ver item 4.4.2). Aps um perodo de

incubao de 2h a 37oC, as clulas foram tripsinizadas, conforme j descrito anteriormente. A

inativao da tripsina foi realizada com o acrscimo de 3ml de meio de cultura suplementado

com 10% de SFB. Foi removida uma alquota de 2ml dessa suspenso celular, de cada uma

das 5 (cinco) garrafas, e acondicionada em microtubos de 2ml. Os microtubos foram

centrifugados por 4min a 1000rpm/350Xg (Centrfuga 5410 Gertebau. Alemanha). Em

seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento (pellet) foi ressuspendido em 125l de meio de cultura DMEM. Uma nova alquota de 25l dessa nova suspenso foi homogeneizada em um novo microtubo com mais 50l do corante azul de Trypan (soluo de 0,4% em PBS) e 25l de meio de cultura. Os 100l restantes da suspenso celular foram utilizados no Ensaio do Cometa (QUADRO 1). As contagens foram realizadas em cmaras de Neubauer (FIG. 5 e

6). As clulas coradas em azul representam as clulas mortas, enquanto que as clulas que no

foram coradas representam as clulas viveis. A viabilidade celular deveria permanecer acima

55

de 90% (HELBIG; SPEIT, 1997) para que o protocolo preliminar de cultura proposto fosse

aceito e o experimento pudesse continuar.

Figura 5 Utilizao da Cmara de Neubauer, com o auxlio de micropipetas, para a avaliao da viabilidade celular.

Figura 6 Visualizao em microscopia de fase invertida da Cmara de Neubauer. A contagem de clulas coradas e no-coradas fornece o ndice de viabilidade celular.

56

4.4 AVALIAO DA GENOTOXICIDADE ATRAVS DO ENSAIO DO COMETA

Neste trabalho, foi utilizada o Ensaio do Cometa/SCGE (Single Cell Gel

Eletrophoresis), proposta por Singh et al. (1988), com algumas modificaes na preparao

das lminas propostas por Klaude et al. (1996) e Segundo as recomendaes do International

Workshop on Genotoxicity Test Procedures (TICE et al., 2000).

4.4.1 Preparao da suspenso celular

Aps a verificao da viabilidade celular, os restantes 100l daquela suspenso foram adicionados a 200l de agarose (Gibco) de baixo ponto de fuso para formar a segunda camada sobre as lminas de microscpio (ver item 4.4.3.2). Foram preparadas 4 (quatro)

lminas com 75l cada, para cada garrafa de cultura, das quais, apenas trs foram usadas para anlise (QUADRO 1).

57

Quadro 1 Fluxograma das etapas propostas para a determinao da viabilidade celular e a realizao do Ensaio do Cometa.

4.4.2 Preparao dos controles

Os controles positivo e negativo, alm de auxiliarem na verificao das condies

experimentais, funcionam como padres no estabelecimento da classificao dos danos no

DNA.

1a Garrafa (5a passagem)





- Remoo do meio de cultura (DMEM/SFB/PSA) - Colocao de meio de cultura DMEM

Tratamento (H2O2)

Alquota 2ml (microtubo)




Centrifugao por 4min a 1000rpm Desprezo do sobrenadante

Ressuspenso em 125l de meio DMEM

Incubao a 37o C, 5% de CO2 (2h)

Tripsinizao e Inativao com 3ml de meio (DMEM/SFB/PSA) (6a passagem)


Suspenso celular (25l) Viabilidade Celular

Suspenso celular (100l) Ensaio do Cometa (4 lminas)

Leitura de 3 lminas

Esquema cego

58

Como controle positivo foi utilizado o perxido de hidrognio (Nuclear, Diadema,

Brasil), que conhecido por causar danos no DNA atravs da gerao de radicais de oxignio

(ANDERSON et al., 1994). O controle positivo (H2O2) foi preparado na concentrao de

200M a partir de uma soluo a 30% de H2O2 (Nuclear), que foi ento incubada com clulas de uma das garrafas de cultura, a 37o C, durante 2h.

O controle negativo deveria ser uma garrafa de cultura que sofresse o menor estresse

possvel, ou seja, o frasco da cultura primria. Porm o frasco escolhido no ofereceu uma

quantidade de clulas suficientes para realizar o ensaio.

4.4.3 Preparao das lminas

Segundo a tcnica original de Singh et al. (1988), as lminas deveriam ser preparadas

como um sanduche de 3 (trs) camadas de agarose sobre lminas de microscpio

completamente foscas. Conforme as modificaes propostas por Klaude et al. (1996), foram

utilizadas lminas de microscpio foscas apenas numa das extremidades. A vantagem da

utilizao de lminas lisas, como descrito acima, de que no h formao de background,

to comum quando se utilizam lminas foscas, alm do que, aps a eletroforese, as lminas

podero ser secas e fixadas em metanol, o que permite a estocagem das mesmas at a anlise.

Aps colorao e anlise, as lminas podem ainda ser secas novamente e guardadas sem que

haja perda importante de material ou alterao na aparncia dos cometas.

59

4.4.3.1 Primeira camada

Lminas de microscpio, foscas apenas em uma extremidade, limpas com etanol antes

do uso, foram mergulhadas numa soluo de agarose a 1,5% em PBS livre de ons clcio e

magnsio, com ponto de fuso normal (Normal Melting Agarose, NMA, Gibco) a 56C. Aps,

o lado inferior das lminas foi limpo e as mesmas foram armazenadas a 4C. As lminas

foram codificadas na extremidade fosca.

4.4.3.2 Segunda camada

A suspenso celular (100l) previamente preparada foi dispersa em 200l de uma

soluo de agarose de baixo ponto de fuso (Low Melting Agarose, LMA, Gibco ) a 0,5% em

PBS, mantida a 37C. Imediatamente aps a mistura, essa suspenso foi disposta sobre uma

lmina previamente preparada (pr-cobertura) e, ento, coberta com uma lamnula de

24x60mm. As lminas foram deixadas sob refrigerao (4C) por 15min para a solidificao

da agarose. A partir deste momento, as lminas foram protegidas da luz com papel alumnio,

para preveno de danos adicionais ao DNA.

4.4.4 Lise celular

Aps, as lamnulas foram retiradas e as lminas foram submersas numa soluo de lise

recm-preparada e mantida a 4C, por um perodo no inferior a 1h. A soluo de lise

composta por NaCl (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA) 2,5M, EDTA (MERCK, Rio de

Janeiro, Brasil) 100 mM, Tris-HCl (Sigma, Sigma Chemical CO., EUA) 10mM. Uma soluo

de NaOH (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA) foi adicionada em q.s.p. para obter pH 10. No

60

momento do uso, acrescentou-se 10% de DMSO (Nuclear, Diadema, Brasil) e 1% de Triton

X-100 (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA). As lminas podem ser mantidas na soluo de

lise por at 30 dias.

A soluo de lise uma soluo detergente com altas concentraes de sais, que

promove a desintegrao das membranas celulares.

4.4.5 Tratamento alcalino e eletroforese

Aps a lise celular, as lminas foram submetidas ao tratamento alcalino em soluo

tampo de pH 13 (300mM de NaOH e 1mM de EDTA), previamente refrigerada, em banho

de gelo, por 30min. A corrida de eletroforese foi efetuada numa cuba horizontal disposta em

um banho de gelo, com voltagem e amperagem constantes, a 25V e 280-300 mA, por 30min.

Durante o tratamento alcalino, ocorre o relaxamento e desespirilizao dos stios de

rompimento da molcula de DNA (ROJAS; LOPEZ; VALVERDE, 1999).

4.4.6 Neutralizao e colorao

Aps a corrida eletrofortica, as lminas foram neutralizadas com uma soluo de

neutralizao (0,4M de Tris-HCl, pH 7,5) por 5min, repetindo-se o procedimento 3 (trs)

vezes.

Em seguida, as lminas foram coradas com 30l de uma soluo aquosa de brometo

de etdeo (Gibco, Gibco Industries Inc., EUA) a 20g/ml (um agente intercalante de DNA que

61

emite fluorescncia quando exposto radiao UV) e observadas ao microscpio de

epifluorescncia (Olympus BX 400), aumento de 400x, com filtro de excitao de 515-

560nm, com filtro de barreira de 590nm.

4.4.7 Anlise dos cometas

A anlise dos cometas foi realizada visualmente em esquema cego, conforme a

classificao proposta por Kobayashi et al. (1995), seguindo algumas modificaes

introduzidas por Miyamae et al. (1998b).

No microscpio de epifluorescncia foram examinadas ao acaso 50 clulas, na regio

central de cada lmina codificada e os danos foram classificados em funo da forma e do

comprimento das caudas dos cometas: classe 1, sem cauda; classe 2, cometas com pequenas

caudas (caudas com comprimento dimetro da cabea); e classe 5,

cometas mal definidos ou com cabeas pequenas (FIG. 7).

62

Figura 7 Classificao das classes de cometa, segundo Kobayashi et al. (1995), com modificaes Miyamae et al. (1998a).

Aps a classificao das clulas, cada uma pertencendo a uma das cinco classes, foi

realizado um escore visual (MIYAMAE et al., 1998a), no qual foram atribudos valores de 0

(zero), que significava ausncia de dano referente ao cometa classe 1 para ncleos intactos, a

4 (quatro), que consistia de dano mximo referente ao cometa classe 5. Dessa forma, o escore

total de 50 (cinqenta) clulas variou de zero (totalmente sem danos) a 200 (totalmente

danificadas).

63

4.5 AVALIAO DOS DADOS

O protocolo de cultura de fibroblastos gengivais humanos foi realizado em

quintuplicata na fase de cultivo primrio. As 5 (cinco) garrafas de cultura primria sofreram 6

(seis) passagens assim que atingiram a subconfluncia celular, dando origem a uma cultura

celular contnua. Foi realizada a anlise da viabilidade celu

cultivo fibroblastos

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