Cultivo em Larga Escala Leda Castilho -...
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24/07/12
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Ampliação de escala do cultivo de células-tronco pluripotentes empregando sistemas agitados
Leda Castilho
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) COPPE – Programa de Engenharia Química
Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares (LECC)
I Curso Teórico-Prático em Células-Tronco Pluripotentes LaNCE-UFRJ - Julho de 2012
Resumo da apresentação
n Processos biotecnológicos baseados na cultura de células de mamíferos n Produtos obtidos destes processos n Características em comum
n Ampliação de escala n Biorreatores n Modos de operação n Experiência adquirida com outras células
n Cultivo de células-tronco pluripotentes em sistemas agitados n Utilizando microcarregadores n Na forma de agregados suspensos
Processos biotecnológicos baseados em células
de mamíferos
Produtos biotecnológicos de células de mamíferos
Vacinas virais e recombinantes
Terapia gênica Células-tronco e terapias celulares
Diagnóstico (in vitro e in vivo)
Proteínas terapêuticas, incluindo
ant. monoclonais
Produtos para a saúde humana
baseados em células de mamíferos
ProteinsPolypeptides
VP 2
VP 1
VirusesCapsidsCapsidomers
DNAPlasmids
Antibiotics and othersecundary metabolites
O
N
H
N
S CH3
MeOO
H H
Products of Bio(techno)logical Origin
Examples for product specific downstream purification methodesProduct Method Additional action of the method
Plasmid DNA Alkaline lysis + detergents Protein hydrolysisProtein Mechanical cell disruption DNA splitting due to shear forces
Distinct Demands on Downstream Purification Methods
Células para terapia celular (células-tronco embionárias em frascos T (esq.) e em microcarregadores, marcadas com DAPI e OCT-4)
Vírus VLPs
Vetores
Produtos biotecnológicos de células de mamíferos
Proteínas
n Geralmente proteínas grandes e complexas n Diversas modificações pós-tradução n Muitas delas de fácil degradação
n Usadas no tratamento de várias doenças: n Esclerose múltipla (β-interferon) n Câncer (anticorpos monoclonais) n Anemia (eritropoetina, EPO) n Hemofilia (fatores VIII e IX recombinantes) n Neutropenia (estimulantes hematopoéticos: G-CSF e GM-CSF) n Doenças cardíacas (ativador de plasminogênio tecidual, t-PA)
Source: http://www.rpc.msoe.edu/cbm/smartteams/smartprojects04.php
Erythropoietin
Proteínas terapêuticas
Quiméricos ~30% murinos
Humanizados ~5-10% murinos
Murine monoclonal
antibody
Anticorpos monoclonais
Anticorpos murinos Fonte: Tamashiro e Augusto (2008)
Maranhão e Brígido (2001)
Anticorpos recombinantes
n Em especial vacinas virais n Evolução da tecnologia:
n Animais e ovos embrionados n Culturas de células primárias n Uso de linhagens estabelecidas ou de partículas pseudo-virais
Vacinas Terapias gênicas
n Objetivam corrigir defeitos genéticos bloqueando, corrigindo ou substituindo genes defeituosos
n Ex-vivo ou in-vivo
Lima et al. (2008), In: Moraes, Augusto e Castilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica. Cap. 19. Editora Roca, São Paulo.
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n Diversos vetores e alvos…
Lima et al. (2008), In: Moraes, Augusto e Castilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica. Cap. 19. Editora Roca, São Paulo.
Terapias gênicas Células-tronco e terapias celulares
n Terapias celulares: diversas já estabelecidas para restabelecer a estrutura e função de tecidos n Doenças cardíacas, queimaduras, transplantes autólogos de
medula óssea
n Células-tronco pluripotentes n Aplicações na pesquisa n Aplicações industriais (descoberta e teste de novas drogas) n Aplicações clínicas (terapias celulares)
n Desafios n Pureza n Qualidade n Consistência n Reprodutibilidade
Aplicações: Ensaios toxicológicos Descoberta de drogas Terapias celulares
Fonte: Trends in Biotechnology
Células-tronco e terapias celulares
Células-tronco e terapias celulares
n Necessidade de ampliação de escala para fornecer o produto aos consumidores
n Desafios n Manter as características das células inalteradas até escala
final de produção n Obter a qualidade do produto requerida e a produtividade do
processo necessária
107 células
1012 -1013 células
Características em comum
Formulação e envase
Cultivo
ACTIVE
INGREDIENT
PRODUTO
FINAL
Purificação
Obtenção através de um processo biotecnológico
Ampliação de escala
Biorreatores
O que é um biorreator?
n Definição mais ampla: Sistema de cultivo destinado a manter as condições adequadas para cultura de células in vitro n Engloba desde pequenos frascos até biorreatores de larga
escala
n Definição mais usada na prática: n O termo biorreator é usado para sistemas de cultivo com nível
de sofisticação que permita controle de temperatura, pH e oxigênio dissolvido
O que é um biorreator?
n Vários tipos, com diferentes características n Ambiente asséptico n Suprimento de nutrientes n Controle de temperatura n Controle de pH n Suprimento e remoção de gases para fornecimento de O2 e
injeção/remoção de CO2
n Controle de formação de espuma n Células aderentes: suporte sólido para adesão celular
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n Sistemas multifásicos n Fase sólida: células n Fase líquida: meio de cultivo n Fase gasosa: oxigenação, controle de pH
n Classificação n Heterogêneos
n A fase sólida não está distribuída uniformemente no meio líquido
n Homogêneos n A fase sólida está uniformemente
distribuída no meio líquido
Biorreatores
Linhagem CHO.K1 aderente
Linhagem CHO.K1 em suspensão
Determinante para seleção: cultivo aderente x suspensão
24h
48h
72h
0h
Cultvo de células Vero em microcarregadores para produção de vírus da febre amarela
Sistemas de cultivo estacionários
n Frascos T, placas de Petri ou multipoços n Sistemas com múltiplas placas ou múltiplas
bandejas n Para células aderentes n Ambiente heterogêneo: gradientes de
concentrações de nutrientes, O2 e metabólitos n Monitoramento de pH, pO2, etc. dificultado
Cell Factory
Cell Cube
n Intensivas em manipulação n Intensivas em mão-de-obra n Risco de contaminação mais elevado n Monitoramento dificultado n Ambiente mais homogêneo
Garrafas rotatórias (roller bottles)
Biorreatores com superfícies semi-permeáveis
n Superfícies permeáveis a nutrientes/metabólitos e/ou a O2/CO2
n Em alguns casos, compartimentalização n Em sua maioria descartáveis
i-MAb, até 3 L
mini-PERM
Biorreatores de fibras ocas
CellMax
n Para cultivos em suspensão ou em microcarregadores
frascos spinner:
Frascos agitados: tubos, spinners, erlenmeyers
Leda Castilho:
inserir filminho
n Ambiente homogêneo n Escalas intermediárias possíveis n Amostragem para monitoramento off line possível n Monitoramento on line de algumas variáveis possível tubos agitados: frascos erlenmeyer:
Frascos agitados: tubos, spinners, erlenmeyers
Leda Castilho:
inserir filminho Biorreatores do tipo tanque agitado
n Sistemas homogêneos, amostragem possível n Muito populares para operação em todas as escalas n Monitoramento e controle possíveis (pH, pO2, T…) n Operação automatizada, menores riscos de
contaminação n Sempre acompanhados de um sistema de
controle
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Biorreatores do tipo tanque agitado
Biorreatores do tipo tanque agitado
n Aço inoxidável AISI 316L (grau farmacêutico) n Rugosidade baixíssima: 0,6-0,8 Ra (0,4-1µm) eletropolimento
Biorreatores do tipo tanque agitado
Biorreatores com bolsas descartáveis: Wave
Biorreator Wave, até 1000 L
Leda Castilho:
inserir filminho Biorreatores com bolsas descartáveis: PBS Biotech
PBS80
PBS15
Biorreatores com bolsas descartáveis: Hyclone
Leda Castilho:
inserir filminho
Hyclone SUB 50 L
Modos de operação de biorreatores
Batelada Batelada alimentada Contínuo simples Perfus ão
Alimentação Suspensão de células
Perfundido Equipamento de retenção celular
Alimentação Alimen- ta ç ão
0.1
1
10
100
0 5 10 15 20 25Time (days)
Xv (1
0^6
cells
/mL)
.
Batch
Fed-batchContinuous
Perfusion
Batelada
Batelada alimentada Contínuo
Perfusão
n Cultivos contínuos n Estado estacionário: nutrientes e metabólitos permanecem em
níveis contantes n Mimetiza condições fisiológicas in vivo
Batelada x Perfusão Leda:
Redesenhar
ü Para uma dada escala de producão, diferentes volumes requeridos…
Batelada x Perfusão
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5
0
6
12
18
24
0 20 40 60 80 100Time (days)
Xv
(10^
6 ce
lls/m
L)
.
Fed-batch
Perfusion
Batelada x Perfusão n Cultivo de células rCHO em meio livre de soro (Teutocell-42)
a 37oC, 50% pO2 e 80 rpm (volume útil: 750 mL)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 3 4 5 6
Viab
ility (%)
VC
D (
10
^6
/mL)
, g
luco
se (
g/L
),
lact
ate
(g/L
), a
mm
on
ium
(m
M)
Time (days)
VCD Glucose Lactate Ammonium Viability
Experiência adquirida com outras células
n Cultivo de células rCHO em meio livre de soro (Teutocell-42) a 37oC, 50% pO2 e 80 rpm (volume útil: 750 mL)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 1 2 3 4 5 6
Am
ino
acid
co
nce
ntr
atio
n (µM
)
Time (days)
ASP GLU ASN SER GLN HIS GLY THR ARG ALA TYR MET VAL TRP PHE ILE LEU
Experiência adquirida com outras células
Quantificação de variáveis associadas aos processos
n Quantificações relevantes (µ, integral of VCD, qglc, etc.)
y = 0,2467x R² = 0,99274
0
2
4
6
8
0 10 20 30 Pro
du
ct (
arb
itra
ry
un
its/
mL)
IVC (10^6 cells.day/mL)
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 3 4 5 6
VC
D (
10
^6
/mL)
, g
lc (
g/L
),
pro
du
ct (
arb
itr.
un
its/
mL)
Time (days)
VCD Glucose Product
y = 0,3801e0,7962x R² = 0,99093
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3 4 5
VC
D (
10
^6
/mL)
Time (days)
µ=0.796d-1
=0.033h-1
tD=0.87d
qP=0.247 µu/cell/d
Cálculos análogos para outros qs
Cultivo de células-tronco pluripotentes em sistemas agitados
Trabalho conjunto do LaNCE/ICB/UFRJ e do LECC/COPPE/UFRJ
USP-1
H9
Células murinas (USP-1)
118 h
Cultura estática
100 µm
163 h
Cultivo agitado
500 µm
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 30 60 90 120Time (h)
Cel
l con
cent
ratio
n pe
r ar
ea (1
05 cel
ls/c
m2 )
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Cell concentration per
volume (10
6 cells/mL)
Cell concentration per area per volume of medium
02468
1012
0 50 100 150 200Time (h)
Cel
l con
cent
ratio
n pe
r ar
ea (1
05 cel
ls/c
m2 )
024681012 C
ell concentration per volum
e (106 cells/m
L)
Cell concentration per area per volume of medium
Cultura estática
Cultivo agitado
Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.
n Morfologia das colônias
After spinner culture (replated)
50 µm
Before spinner culture
50 µm
01234567
Mea
n ar
ea o
f col
onie
s(1
03 µm
2 )
Before spinner cultureAfter spinner culture
Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.
Células murinas
n Formação de corpos embrióides
Após
Antes
250 µm
β -tu
bulin
-III (
ecto
derm
)
Antes do cultivo em spinner
100 µm
04080
120160200
1Mea
n EB
dia
met
er (µ
m)
Before spinner culture After spinner culture
Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.
Células murinas
Após o cultivo em spinner
SOX-2 Oct-4 / SSEA-1
97.2±3.8
98.1±2.5
95.6±6.299.4±1.4
97.4±5.5/ 98.5±2.5
A B
C D
E F
SOX-2 Oct-4 / SSEA-1
97.2±3.8
98.1±2.5
95.6±6.299.4±1.4
97.4±5.5/ 98.5±2.5
A B
C D
E F
n Avaliação de marcadores de pluripotência
Bef
ore
D
uri
ng
Aft
er
Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.
Células murinas
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6
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0 30 60 90 120Time (h)
Cel
l con
cent
ratio
n pe
r ar
ea (1
06 cel
ls/c
m2 )
0.00
0.12
0.24
0.36
0.48
0.60 Cell concentration per
volume (10
6 cells/mL)
Cell concentration per area per volume of medium
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 100 200 300 400Time (h)
Cel
l con
cent
ratio
n pe
r ar
ea (1
06 cel
ls/c
m2 )
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 Cell concentration per
volume (10
6 cells/mL)
Cell concentration per area per volume of medium
Células humanas (H9)
Cultivo estático
Cultivo agitado
Fernandes et al. (2009), Braz. J. Med. Biol. Res, v. 42, p. 515-522 . Fernandes et al. (2009), Braz. J. Med. Biol. Res, v. 42, p. 515-522 .
Scale-up of human embryonic stem cells in stirred vessels
n Avaliação de marcadores de pluripotência
n Avaliação de cariótipo
n Capacidade de diferenciação: formação de corpos embrióides e avaliacão de AFP (endoderma), α-SMA (mesoderma) e nestina (ectoderma)
Fernandes et al. (2009), Braz. J. Med. Biol. Res, v. 42, p. 515-522 .
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Concentração do inóculo em spinner Serra et al. (2010)
Nível de O2 dissolvido (biorreator) Serra et al. (2010)
Nível de O2 dissolvido (biorreator) Serra et al. (2010)
SSEA-4 TRA-1-60
Perfusão (biorreator) Serra et al. (2010)
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Para quem quiser ler mais: capítulo 9 - biorreatores
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