Congresso Brasileiro de Hematologia, Hemoterapia e Terapia...

Congresso Brasileiro de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular (HEMO 2016)

Programa Educacional: Imuno-hematologia/ Immunohematology

Coordenadora: Lílian Maria de Castilho

Florianópolis, 10 de Novembro de 2016

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Declaramos não haver

conflito de interesse

nesta apresentação.

Causas de discrepâncias entre os resultados da fenotipagem e

genotipagem eritrocitária

Vitor Mendonça AlvesUniversidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)

Hemocentro Regional de Uberaba/

Fundação Hemominas

INTRODUÇÃOAntígenos eritrocitários

4(NOVARETTI, 2007)

Estruturas na membrana da hemácia, com natureza proteica, glicoproteica ou glicolipídica e podendo

induzir uma resposta imune.

INTRODUÇÃOAntígenos eritrocitários

• Mais de 300 antígenos em 35 sistemas;• ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MNS, Diego, P1PK, Lewis e

Lutheran.

• Novo sistema (36º): Augustine (AUG).

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(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015; DANIELS et al., 2015)

(http://www.isbtweb.org/)

Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea (ISBT)

Reação Transfusional Hemolítica

• Uma das causas mais frequentes de óbito relacionado à transfusão sanguínea, segundo relatos do Food and DrugAdministration (FDA, 2014).

6

www.cremesp.org.br www.hemoce.ce.gov.br

Fenotipagem eritrocitária estendida

• Definição do perfil fenotípico para diversos antígenos eritrocitários;

• Aplicada de forma rotineira em vários hemocentros do país.

7http://www.diamed.com.br/

Fenotipagem eritrocitária estendida

8Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html.

Fenotipagem eritrocitáriaLimitações

• Presença de hemácias oriundas de doadores na circulação do receptor, em caso de transfusão recente (em até três meses antes da realização do teste);

• Alguns antissoros comerciais para a detecção e identificação de antígenos eritrocitários menos conhecidos possuem custo elevado e raramente estão disponíveis no mercado.

9(AVENT, 2008; CASTILHO et al., 2002; DENOMME; FLEGEL, 2008;

ROZMAN; DOVC; GASSNER, 2000)

Fenotipagem eritrocitária Limitações

• Hemácias revestidas por anticorpos eritrocitários, podendo levar a resultados falso positivos.

10(CASTILHO et al., 2002; MARTINS, M. L. et al., 2009)

Genotipagem eritrocitária

• Extração e quantificação de DNA dos leucócitos;

• Identificação e amplificação de genes de interesse;

• Reação em Cadeia da Polimerase ou Reação de Amplificação em Cadeia (PCR).

11(FLEGEL, 2007;

ROZMAN; DOVC; GASSNER, 2000)

(http://situado.net/)

(http:// www.gmotesting.com)


• PCR (AS, Multiplex, RFLP);

• PCR em tempo real;

• BeadChip (automatizada, em larga escala).

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(http://www.fleury.com.br/medicos/educacao-medica/manuais/manual-hematologia/pages/pcr.aspx)

(http://www.lifa-core.de/applications/epigenetics)

(http://www.nature.com/gim/journal/v6/n5/fig_tab/gim200457f1.html)

(Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM))


• DNA extraído de leucócitos de indivíduos com várias transfusões recentes pode ser utilizado para a determinação de seu genótipo eritrocitário, sem risco de microquimerismo;

• A quantidade de DNA leucocitário do próprio paciente excede a oriunda dos doadores.

13(CASTILHO et al., 2002; FLEGEL, 2007; REID et al., 2000;

ROZMAN; DOVC; GASSNER, 2000; WENK; CHIAFARI, 1997)


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Ainda não tem sido adotado de forma rotineira na maioria dos serviços de hemoterapia,

especialmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil.

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Fenótipo e genótipo eritrocitário

discrepantes

Hemácias revestidas por anticorpos

• Em pacientes politransfundidos:

• (I) Anemia Hemolítica Autoimune (AHAI): autoanticorpos sensibilizam as hemácias do paciente;

• (II) Reações transfusionais: o aloanticorpo do receptor sensibiliza as hemácias provenientes do doador ou anticorpos transfundidos deste se fixam aos eritrócitos do receptor;

16(CASTILHO; PELLEGRINO JUNIOR; REID, 2015)

http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.



• (III) Interações de medicamentos ou complexos droga-anticorpo com as hemácias do paciente;

• (IV) Hipergamaglobulinemia: imunoglobulinas inespecíficas são adsorvidas às hemácias circulantes;





• (V) Síndrome do linfócito passageiro: anticorpos transitórios produzidos pelos linfócitos do doador de um órgão transplantado revestem os eritrócitos do receptor.




• Em neonatos:

• Doença Hemolítica Perinatal (DHPN) ou Doença Hemolítica do Feto e Recém-Nascido (DHFRN):aloanticorpos maternos atravessam a placenta e se fixam às hemácias fetais antígeno-positivas.




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Resultados falso-positivos na

fenotipagem eritrocitária.


21Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html.

Teste da Antiglobulina Direta (TAD)

• Paciente com síndrome mielodisplásica

• Fenotipagem: Fy(a+b+) (Cartão ID-LISS/Coombs – DiaMed/BioRad);• Teste da Antiglobulina Direta (TAD) ou Coombs Direto (CD):

pos.

22Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da

Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

Fya e Fyb - Controle neg.

Paciente Coombs Direto –Controle neg.

• Genotipagem: PCR-RFLP; agarose 2%; enzima BanI



Ctles. (FY*A/FY*A; FY*A/FY*B; FY*B/FY*B)

Paciente (FY*A/FY*A)

Vermelho (FY*A - 210 pb); Azul (FY*B - 306 pb)

Pacientes com transfusão recente de hemácias

• Presença de hemácias oriundas do doador na circulação do receptor;

• Resultados falso-positivos ou inconclusivos na fenotipagem.

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Paciente com anemia aplásicaFenotipagem: Rh (C?c+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)

Ctle. neg. Ctle. pos. Paciente

• Genotipagem: PCR-Multiplex; Agarose 2%

26Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

Ctles. (RHD pos./RHCE*CC; RHD pos./RHCE*Cc; RHD neg./RHCE*cc)

Vermelho – RHD (498 e 95 pb); Verde - RHC (320 pb); Azul - RHc (177 pb)

Paciente (RHD*pos.; RHCE*Cc)

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Paciente com Linfoma não-HodkingFenotipagem: Jk(a?b+)Cartão ID-DiaClon Anti-Jka e Anti-Jkb (DiaMed/BioRad)

Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

Ctle. pos. Ctle. neg. Paciente

• Genotipagem: PCR-RFLP; agarose 3,5%; enzima MnlI

28Fonte: Laboratório de Pesquisa da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

Ctles. (JK*A/JK*A; JK*A/JK*B; JK*B/JK*B

Vermelho – JK*A (82 pb); Azul – JK*A e JK*B (103 e 82 pb); Verde – JK*B (103 pb)

Paciente(JK*A/JK*B)

Antígeno RhD fraco

• Enfraquecimento da expressão do antígeno RhD;

• Pesquisa deste fenótipo deve ser realizada em todos os doadores de sangue RhD negativos;

• Após identificação: os mesmos são classificados como RhD positivos e suas hemácias não podem ser transfundidas para pacientes RhD negativos.

29(CASTILHO, 2007; FLEGEL, 2007)

Antígeno RhD fraco

• Mais de 80 tipos diferentes identificados;

• Tipos 1, 2 e 3 – mais comuns;

• Encontrado em 0,2 a 1% dos caucasianos europeus e americanos.

30(ORZINSKA et al., 2013; SANDLER et al., 2015)

Antígeno RhD fraco• Mutações de ponto – substituições de aminoácidos

(transmembrana e intramembrana);

31Vermelho – RhD fraco

(FLEGEL, 2007)

Antígeno RhD fraco

• Detecção:

• Teste da Antiglobulina Indireta (TAI) ou Métodos Moleculares.

32(CASTILHO, 2007; FLEGEL, 2007)

33

Fonte: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html.

Teste da Antiglobulina Indireta (TAI)

Antígeno RhD fraco

• Genotipagem: RHD pos.;• Fenotipagem (em alguns casos): RhD neg.

• Antissoros de rotina podem não detectar o antígeno RhD fracamente expresso;

• Detecção fenotípica: antissoros monoclonais mais sensíveis.

34

(CASTILHO, 2007; FLEGEL, 2007; MORAES-SOUZA; ALVES, 2015; ORZINSKA et al., 2013; POLIN et al., 2009; SCHMIDT et al., 2015)

Antígeno RhD fraco

• Schmidt et al. (2015):

• 4897 doadores de diferentes regiões de Minas Gerais;

• Todos previamente tipados como RhD neg. (TAI): clones MS-26 e TH-18;

• 70 (1,43%): positividade fraca com soro anti-D ESD1.

35(Rev Bras Hematol Hemoter. 2015;37(5):302–5)

Antígeno RhD fraco

• Schmidt et al. (2015):

• 70 (1,43%): positividade fraca com soro anti-D ESD1;

• 39: submetidas a análise molecular RHD (PCR-Multiplex, PCR-SSP e BeadChip);

• 19: detecção de diferentes variantes RHD (BeadChip);• 20: nenhuma variante detectada (BeadChip), porém todos

os éxons RHD amplificados (PCR-Multiplex).

36(Rev Bras Hematol Hemoter. 2015;37(5):302–5)

Antígeno RhD fraco

37(Transfus Med. 2014;24(1):60–1)

Costa et al. (2014)

520 doadores de São Paulo classificados previamente como RhD negativos.

18 (3,4%): RHD pos. (análise molecular).

Antígeno RhD fraco

38(Transfus Med. 2014;24(1):60–1)

Costa et al. (2014)

4 (22,22%): TAI negativo com 11 soros anti-D (incluindo ESD1).

18: RHD pos. (análise molecular).

14 (77,78%): Positividade fraca ou muito fraca: cinco soros anti-D;Reação negativa: seis soros anti-D.

Pseudogene RHD (RHDψ)

• Comum em negros;

• Genotipagem: RHD pos.;

• Fenotipagem (em alguns casos): RhD neg.

39(SINGLETON et al., 2000)


• Inserção de 37 pb no éxon 4 do gene RHD;

• Mutação nonsense (sem sentido): surgimento de um stop

codon ou códon de parada prematuro;

• Término da tradução proteica no éxon 6;

• Consequência: poderá não haver a expressão do antígeno

D na membrana da hemácia e o indivíduo será fenotipado

como RhD negativo.

40(SINGLETON et al., 2000)


• Singleton et al. (2000): 82 negros africanos e 54 negros

americanos com fenótipo RhD negativo;

• RHDψ:

• 66% dos africanos e 24% dos americanos;

• Deleção total do gene RHD:

• 54% dos americanos e 18,29% dos africanos;

• Gene híbrido (RHD-CE-D):

• 22% dos americanos e 15,71% dos africanos.

41(Blood, 2000; 95(1): 12-18)

• Singleton et al. (2000):

• 98 amostras randômicas de negros da África do Sul (95 RhD positivas e 3 RhD negativas);

• RHD*Ψ: presente em 14 destas amostras.

42


(Blood, 2000; 95(1): 12-18)

Mutação na região GATA-1 (Sistema Duffy)

• 67% dos negros africanos;• Muito rara em caucasianos;

• FY*B: mutação em um sítio de ligação para o fator de transcrição eritroide-específico GATA-1, na região promotora do gene Duffy (FY);

• Mutação (-67 t>c): provoca uma desregulação no referido sítio.

43(MENY, 2010)

Mutação na região GATA-1 (Sistema Duffy)

• Genotipagem: FY*B/FY*B;• GATA-67c/c;• Fenotipagem: Fy(a-b-).

• Genotipagem: FY*B/FY*B;• GATA-67t/c;• Fenotipagem: Fy(a-b+).

• Genotipagem: FY*A/FY*B;• GATA-67t/c;• Fenotipagem: Fy(a+b-).

44(DANIELS, 2005; MENY, 2010)

Antígeno Fyb fraco (Fyx) (Sistema Duffy)

• Antígeno que reage fracamente com anticorpos anti-Fyb;

• Pode ser detectado somente por técnicas sorológicas de adsorção e eluição;

• Técnicas nem sempre são eficazes na sua identificação.

45(JENS; PAGLIARINI; NOVARETTI, 2005)

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Causas menos frequentes ou raras

de discrepância

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Antígeno C (sistema Rh)

Paciente com anemia falciformeFenotipagem: Rh(C+c+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)


48

Antígeno C (sistema Rh)Genotipagem: PCR-Multiplex; Agarose 2%


Paciente (RHD pos.; RHCE*cc) (2x)

Ctles. (RHD neg./RHCE*cc; RHD pos./RHCE*CC; RHD pos./RHCE*Cc)

• Paciente sem transfusão recente de hemácias;

• TAD negativo;

• Amostra de DNA encaminhada ao Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Universidade Estadual de Campinas-SP (UNICAMP).

49


• Análise por BeadChip (wRHCE 2.1 BeadChip);

• Indivíduo portador do genótipo: RHCE(C)ces/ RHCE*ce48C, 733G,1006T;

• Variante do antígeno C e do antígeno e.

50


• RHCE*cc; Rh(C+c+):• Discrepância já relatada em indivíduos negros; • Origem: variação no gene RHD (r´s ou Cdes) – gene

RHD-CE-D;• Codificação de um polipeptídeo Rh que expressa o

antígeno C e leva a uma ausência do íntron 2 do alelo RHC;

• O alelo RHC não é identificado na genotipagem; porém, a pesquisa fenotípica do antígeno C é positiva.

51


(TAX et al., 2002)

• RHCE*cc; Rh(C+c+):

• Relato: Pacientes portadores de r’s ou Cdes que desenvolveram aloanticorpos anti-C.

52


(LOMAS et al., 1994)

• Variante rara do antígeno E (sistema Rh);

• Encontrado em caucasianos, com frequência inferior a 0,1%;

• Entretanto, com vários relatos na literatura.

53

Antígeno Ew (E fraco)

(BUGERT et al., 2009; DÖSCHER et al., 2009; GREENWALT, SANGER, 1955; GROBEL, CARDY, 1971; HENKE, KASULKE, 1976; KAITA, LEWIS, CHOWN, 1964;

STROBEL et al., 2004; WINTER, MILKOVICH, KONUGRES, 1966)

54



Paciente com anemia falciformeFenotipagem (1º teste): Rh(E?e+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)

Ctle. pos. Ctle. neg. Paciente

55



Paciente com anemia falciformeFenotipagem (2º teste): Rh(E-e+)(Cartão ID-DiaClon Rh-subgrupos + K – DiaMed-BioRad)

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Genotipagem: PCR-RFLP; Agarose 3,5%

Paciente(RHCE*Ee - 2x)Vermelho (RHE - 115 pb); Verde (RHE e RHe - 115 e 152 pb);

Azul (RHe - 152 pb)

Ctles. (RHCE*EE; RHCE*Ee; RHCE*ee)

• Paciente não havia recebido transfusões de hemácias nos 12 meses anteriores à coleta;

• Amostra de DNA encaminhada ao Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Universidade Estadual de Campinas-SP (UNICAMP).

57


• Sequenciamento do gene RHCE:• Presença de três polimorfismos: 361A>T, 380C>T e

383G>A, compatíveis com o genótipo RHCE*cE.15.02/RHCE*CE.

58


Fonte: Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

59


(Transfusion 2004; 44: 407-09)

Strobel et al., 2004: caso de aloimunização anti-E

em um paciente E+w que havia recebido hemácias E

positivas.

Outras causas de discrepância

• Antígeno Del (sistema Rh)

• Genotipagem: RHD pos.;

• Fenotipagem: RhD neg.

60(WAGNER; FROHMAJER; FLEGEL, 2001)


• Antígeno Cw (sistema Rh)

• Tipagem sorológica com anticorpos anti-Cw.

61(CALLENDER; RACE,1946)


• Indivíduos Rhnull (D-C-c-E-e-)

• Genes RHD e RHCE normais;

• Mutação no gene RHAG – ausência da proteína RhAG.

62(AGRE, CARTRON, 1991; CARTRON, AGRE, 1993)


• Alterações no eritrócito com destruição antigênica (DNA é mais estável que hemácias);

• Baixa qualidade dos antissoros na fenotipagem;

• DNA de qualidade ruim ou em baixa quantidade;

• Inibidores do DNA – amplificação fraca ou ausente.

63(PEYRARD, 2015)

CONCLUSÕES

• Várias causas de discrepâncias entre os resultadosda fenotipagem e genotipagem eritrocitária se devema limitações da fenotipagem:

• Hemácias revestidas por anticorpos – TAD positivo;

• Transfusão recente de concentrado de hemácias;

• Ausência de alguns antissoros no mercado.

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CONCLUSÕES

• Causas menos frequentes ou raras de discrepâncias (antígenos C e E – sistema Rh)

• Pacientes não haviam recebido transfusões recentes;• TAD negativo;• Fenotipagem, mesmo com suas limitações, também é

importante;• Genotipagem e fenotipagem devem ser utilizados como

métodos complementares.• Realização de técnicas moleculares adicionais:

Beadchip, sequenciamento do DNA.

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66

MUITOOBRIGADO!

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