CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO EM SORO DE QUEIJO … · As minhas amigas da graduação em...
51
NEUSA LYGIA VILARIM PEREIRA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO EM SORO DE QUEIJO CAPRINO RESULTANTE DO PROCESSO DE COAGULAÇÃO LÁCTEA ENZIMÁTICA E MISTA RECIFE, 2016
Transcript of CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO EM SORO DE QUEIJO … · As minhas amigas da graduação em...
NEUSA LYGIA VILARIM PEREIRA
CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO EM SORO DE QUEIJO
CAPRINO RESULTANTE DO PROCESSO DE COAGULAÇÃO
LÁCTEA ENZIMÁTICA E MISTA
RECIFE, 2016
NEUSA LYGIA VILARIM PEREIRA
CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO EM SORO DE QUEIJO
CAPRINO RESULTANTE DO PROCESSO DE COAGULAÇÃO
LÁCTEA ENZIMÁTICA E MISTA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal de Pernambuco, para a obtenção do título de mestre em Nutrição.
Orientadora: Profa. Dra. Margarida Angélica da Silva Vasconcelos Co-orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia R. do Egypto Queiroga
RECIFE, 2016
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária: Gláucia Cândida, CRB4-1662
P436c Pereira, Neusa Lygia Vilarim.
Concentração de àcido siálico em soro de queijo caprino resultante do processo de coagulação láctea enzimática e mista / Neusa Lygia Vilarim Pereira. – 2016.
51 f.: il. ; 30 cm. Orientadora: Margarida Angélica da Silva Vasconcelos. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco,
CCS. Programa de Pós-Graduação em Nutrição, 2016. Inclui referências. 1. Nutrição. 2. Ácido N-Acetilneuramínico. 3. Alimento Funcional. I.
Vasconcelos, Margarida Angélica da Silva (Orientadora). II. Título. 612.3 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2016-0163)
NEUSA LYGIA VILARIM PEREIRA
CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO EM SORO DE QUEIJO CAPRINO RESULTANTE DO PROCESSO DE COAGULAÇÃO LÁCTEA
ENZIMÁTICA E MISTA
Dissertação aprovada em 22/03/2016
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________ Profª. Drª. THAYZA CHRISTINA MONTENEGRO STAMFORD
Examinadora Interna
___________________________________________________________ Profª. Drª. EMMANUELA PRADO DE PAIVA AZEVEDO
Examinadora Externa !
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO –UFPE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
Reitor
Prof.º Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Vice-reitor
Prof.º Silvio Romero de Barros Marques
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Prof.º Francisco de Sousa Ramos
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Prof.º Nicodemos Teles de Pontes Filho
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Prof.ª Vânia Pinheiro Ramos
Chefe do Departamento de Nutrição
Prof.ª Alda Verônica Souza Livera
Vice-Chefe do Departamento de Nutrição
Prof.ª Juliana Maria Carrazzone Borba
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Nutrição
Prof.ª Elizabeth do Nascimento
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Nutrição
Prof.ª Margarida Angélica da Silva Vasconcelos
A minha mãe Carmen Glória, Dedico.
AGRADECIMENTOS
A Deus, primeiramente, por me ter dado a sapiência necessária para que eu pudesse executar o trabalho e driblar as adversidades. Aos meus pais, Carmen e Wallace, por todo investimento, zelo e carinho que me foi concedido para que eu pudesse chegar até aqui. A minha irmã, Nayra, por sempre acreditar em mim e por estar presente em todos os momentos importantes da minha vida. As minhas avós, Neusa e Socorro Vilarim (in memoriam), que lá do céu cuidam de mim. Ao meu namorado, Rodrigo, por me servir de exemplo, por toda paciência e por todo amo e afeto que a mim foi provido. A minha orientadora, Profa. Angélica, agradeço por toda amizade, alegria e apoio nesses dois anos de mestrado. Por me ter proporcionado grandes experiências e ensinamentos que levarei para toda vida. A minha co-orientadora, Profa. Rita, agradeço por ter acreditado em mim e por todo carinho e preocupação que teve comigo durante a pesquisa. A minha querida professora e amiga, Maria Lúcia da Conceição, que me incentivou a entrar na pesquisa, desde a graduação. Obrigada por ter aberto tantas portas. A minha amiga, Yasmim. O meu muitíssimo obrigado pelo apoio indispensável na execução deste trabalho e por toda paciência concedida a mim, sempre me ensinando e me apoiando. As minhas colegas de mestrado da área de alimentos, Natália, Bruna e Gabi, obrigada por toda companhia, foi uma satisfação estar com vocês. As companheiras Paraibanas da turma do mestrado, Larissa e Bárbara, essenciais nesses dois anos. Obrigada por termos compartilhado tantas experiências. A minha turma do mestrado em nutrição, foi uma satisfação estudar com vocês. As minhas amigas da graduação em Nutrição, principalmente ao grupo Broshtons, que tanto me diverte. As minhas amigas de infância, da escola, principalmente, Andressa, Raquel, Jordana, Rayssa, Camila e Naudiane, que sempre estiveram comigo e sempre vibraram pela minha realização. Aos amigos do Laboratório de Bromatologia, obrigada pelo dia-a-dia, pela amizade e pelo companheirismo de sempre.
Aos integrantes do CQAMOS, em especial, Profa. Emmanuela Paiva e Prof. Clayton Azevedo, pela disponibilidade e pelo apoio, indispensável, durante a execução do projeto.
Ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição (UFPE) pela oportunidade concedida para a realização do curso e por todo aprendizado. Foi uma experiência incrível.
Ao CNPq pela concessão da bolsa e auxílio financeiro para execução do projeto proposto.
Ao Setor de Caprinocultura, do Centro de Ciências Humanas, Sociais e Agrárias da Universidade Federal da Paraíba pelo fornecimento do leite caprino.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta pesquisa.
“A Grande Conquista é o resultado de pequenas vitórias que passam despercebidas. ”
Paulo Coelho
RESUMO
O ácido siálico está presente nos leites na forma de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) e ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), desempenhando uma série de benefícios à saúde humana. O soro de queijo caprino é um bioproduto da fração solúvel do leite, obtido através da coagulação da caseína. É considerado importante para a indústria de alimentos, como ingrediente, sendo responsável por 55% de todos os nutrientes do leite. Neste estudo, objetivou-se quantificar, pela primeira vez na literatura, o ácido siálico presente naturalmente no soro de queijo caprino por diferentes processos de coagulação láctea. O leite utilizado foi obtido de cabras da raça Saanen e submetidos ao processamento de coagulação enzimático e misto (enzima + cultura starter) para obtenção do soro, que foi acondicionado e congelado, sendo parte liofilizado. A identificação e quantificação do ácido siálico foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por detector de fluorescência modelo RF-20A. A concentração desse nutriente variou de 23,5 a 292,1 mg/L. Foi verificado que a coagulação enzimática preserva o ácido siálico (Neu5Gc e Neu5Ac) mais eficientemente do que a coagulação mista, pois as bactérias da cultura starter possibilitaram a redução dos nutrientes presentes no soro para desempenharem o seu metabolismo, assim o ácido siálico presente como glicoconjugado, também foi reduzido. De acordo com os resultados obtidos, pode-se concluir que o soro de queijo caprino apresenta um potencial funcional, visto que contém uma quantidade relevante do nutriente estudado.
Palavras-chaves: Ácido siálico. Alimento funcional. Coagulação láctea. Compostos bioativos.
ABSTRACT
Sialic acid is present in milk in the form of N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), performing a lot of benefits to human health. Goat cheese whey is a dairy byproduct from the soluble fraction obtained by casein coagulation. It is considered important for the food industry, as an ingredient, accounting for 55% of all milk nutrients. This study aimed to quantify the sialic acid present naturally in the goat cheese whey by different milk coagulation processes. The milk was obtained from Saanen goats and subjected to processing enzymatic and mixed coagulation (enzyme + starter culture) to obtain the whey, which was prepared and frozen, and part of it was lyophilized. The identification and quantitation of sialic acid was accomplished by High Performance Liquid Chromatography fluorescence detector RF-20A model. The sialic acid concentration ranged from 23.5 to 292.1 mg / L. It has been found that enzimatic coagulation preserves the sialic acid (Neu5Ac and Neu5Gc) more efficiently than mixed coagulation, because the bacterias of starter culture allowed the reduction of nutrients present in the whey to perform their metabolism, as well sialic acid present as glycoconjugate it was also reduced. According to the results, concluded that goat cheese whey has a functional potential, since it contains a significant quantity of the nutrient studied.
Keywords: Sialic acid. Functional food. Milk coagulation. Bioactive compounds.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Dissertação
Figura 1- Estrutura química do ácido N-glicolilneuramínico (NeuGc) e do ácido N-
acetilneuramínico(NeuAc)........................................................................................................24
Fluxograma 1: Produção soro de queijo obtido por processamento enzimático.....................30
Fluxograma 2: Produção soro de queijo obtido por processamento misto.............................31
Artigo
Figura 1. Cromatogramas de ácido siálico, com padrões e amostras de referência dos
tratamentos (T1 e T2) ......................................................................................................... 39
Figura 2. Cromatogramas dos soros (líquidos e liofilizados) de queijo caprino obtidos por
coagulação enzimática e mista ............................................................................................ 40
LISTA DE TABELAS
Artigo
Tabela 1 Valores médios da concentração de Neu5Gc, Neu5Ac e Ácido siálico total em soros
de queijo líquidos obtidos por coagulação enzimática..............................................................41
Tabela 2. Valores médios da concentração de Neu5Gc, Neu5Ac e Ácido siálico total em soros
de queijo liofilizados obtidos por coagulação enzimática e mista..............................................41
LISTA DE ABREVIAÇÃO E SIGLAS
µL Microlitro
μm Micrometro
µg/Ml Micrograma por mililitro
CCHSA Centro de Ciências Humanas Sociais e Agrárias
CCS Centro de Ciências da Saúde
CLA Conjugated Linoleic Acid
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CMP Citidina Monofosfato
CQAMOS Caracterização Química de Alimentos, Medicamentos e Suplementos
Nutricionais
dL Decilitro
DMB 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene
G Grama
G Força de gravidade
g/dL Grama por decilitro
g/L Grama por litro
g L-1 Grama por litro
g/100g Grama por cem gramas
HPAEC-PAD High-pH Anion-Exchange Chromatography with Pulsed
Amperometric Detection
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Hz Hertz
kDa Quilo Dalton
Kg Quilograma
LOD Limite de Detecção
LOQ Limite de Quantificação
M Mol
mM Milimol
mg/100g Miligrama por cem gramas
mg/L Miligrama por litro
Min Minuto
mL Mililitro
mL/min Mililitro por minuto
Mm Milímetro
mM Milimolar
mmol.L-1 Milimolar por litro
mV Milivolts
Neu5Ac Ácido N-acetilneuramínico
Neu5Gc Ácido N-glicolilneuramínico
Nm Nanometro
OS Oligossacarídeos
S Segundos
Sai Ácido siálico
SNC Sistema Nervoso Central
UFPB Universidade Federal da Paraíba
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UV Ultravioleta
°C Graus Celsius
Α Alfa
Β Beta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 18
2.1 LEITE CAPRINO .............................................................................................................. 18
2.1.1 Tipos de Coagulação do leite ........................................................................................ 19
2.2 SORO DE QUEIJO CAPRINO ......................................................................................... 21
2.3 ÁCIDO SIÁLICO .............................................................................................................. 23
3 HIPÓTESE .......................................................................................................................... 27
4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 27
4.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 27
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 27
5 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 28
5.1 AMOSTRAGEM ............................................................................................................... 28
5.2 MÉTODOS DE COAGULAÇÃO ..................................................................................... 28
5.2.2 Soro de queijo caprino por coagulação enzimática .................................................... 28
5.2.3 Soro de queijo caprino por coagulação mista ............................................................. 29
5.3 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO ....................................................................... 31
5.3.1 Reagentes ........................................................................................................................ 32
5.3.2 Separação e preparo de extrato de ácido siálico ......................................................... 32
5.3.3 Identificação do ácido siálico ........................................................................................ 32
5.3.4 Validação do método cromatográfico .......................................................................... 33
5.4 ANÁLISE ESTASTÍTICA ................................................................................................ 33
6 ESTUDO DA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO NATURALMENTE PRESENTE EM SORO DE QUEIJO CAPRINO .............................................................. 34
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 43
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 44
16
1 INTRODUÇÃO
Os caprinos desempenham um importante papel na economia rural dos países em
desenvolvimento, especialmente em áreas com condições ambientais e climáticas
desfavoráveis. Isso ocorre devido a sua capacidade de adaptação a ambientes muito diferentes
e por serem usuários de terras marginais e rurais. Nos países desenvolvidos (França, Itália,
Espanha e Grécia), são considerados como animais ecológicos e respondem satisfatoriamente
à demanda crescente dos consumidores sobre a qualidade do produto, ao bem-estar animal e ao
respeito ao meio ambiente (KALANTZOPOULOS et al., 2004; MORAND-FEHR et al., 2004;
CORNALE et al., 2014; GARCIA et al., 2014).
No Brasil, o Nordeste é responsável por 67% de toda a produção de leite de cabra no
país. Na região semiárida do Estado da Paraíba, a atividade de caprinocultura tornou-se uma
grande oportunidade econômica, principalmente no segmento de produção de leite, que é
exercida em parceria direta com a indústria da região (OLIVEIRA et al., 2011; COSTA et al.,
2010).
O leite de cabra é identificado pelo sabor característico. É consumido como uma
alternativa ao de vaca, pois é menos alergênico e possui alta digestibilidade. É considerado um
produto funcional, em virtude da sua atividade de modulação das funções fisiológicas e suas
propriedades redutoras de risco de doenças crônicas (PARK et al., 2007; GARCIA et al., 2014;
CORREIA, et al., 2006).
O soro de queijo é um bioproduto da fração solúvel do leite, contendo quantidades
expressivas de proteínas, peptídeos, lactose, vitaminas e minerais solúveis em água, que são
separados a partir da coagulação da caseína durante fabricação do queijo. A coagulação, por
sua vez pode ser enzimática, ácida e mista (JELEN, 2003; SANMARTÍN et al., 2012). A
coagulação enzimática e mista é a mais utilizada no processo de fabricação de queijos, devido,
principalmente, ao maior rendimento obtido em relação a coagulação ácida. As enzimas podem
ser oriundas de animais, vegetais e/ou de micro-organismos, que podem ser usadas
isoladamente ou misturadas entre si. Na obtenção do gel lácteo e do soro, o tipo de
processamento influencia na qualidade final do produto (AQUARONE et al., 2001).
A riqueza do soro deriva do fato de que ele é responsável por 85% a 95% em volume
do leite, do qual obtêm aproximadamente 55% de seus nutrientes, dentre os quais se destacam
os oligossacarídeos. Estes são de fundamental importância, pois possuem propriedades
prebióticas e anti-infecciosas. No leite de cabra, os oligossacarídeos são encontrados numa
concentração de 250-300 mg/L, contudo, no soro de queijo ainda é desconhecida. Muitos desses
17
oligossacarídeos contêm ácido siálico, um nome genérico para o ácido N-acetilneuramínico
(Neu5Ac) e o ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) (HERNANDEZ-LEDESMA et al., 2011;
SANMARTÍN et al., 2012; SILVEIRA et al., 2015; PARK, 2009).
Estudos indicam que o ácido siálico tem uma série de benefícios na saúde humana,
dentre eles: promover o desenvolvimento do cérebro infantil referindo-se a parte de cognição e
memória, atuar na regulação do sistema imunológico e na função intestinal agindo contra
enterotoxinas e infecções nos recém-nascidos, entre outros efeitos fisiológicos importantes
(HERNANDEZ-LEDESMA et al., 2011). Na microbiota intestinal, o ácido siálico está
envolvido na proteção contra infecções, impedindo a ligação do patógeno na mucosa intestinal
através da própria ligação com bactérias, rotavírus e toxinas (IDOTA et al., 1995; VARKI,
1993; PARKKINEN et al., 1983).
Em produtos lácteos e amostras biológicas, os resíduos de ácido siálico estão geralmente
presentes como glicoconjugados (glicoproteínas, glicolipídeos e lipopolissacarídeos) e nas
porções terminais das cadeias de glicanos, sendo raramente encontrados na forma livre (3%)
(HERNANDEZ-LEDESMA et al., 2011).
No estudo de Sousa et al., 2015, foi verificado uma concentração significante do ácido
siálico Neu5Gc e Neu5Ac no leite caprino produzido no nordeste brasileiro. Este leite é
fundamental na produção de queijos, em que no processamento é obtido um grande volume de
soro. Em virtude da escassez de estudos que relatem a concentração do ácido siálico no soro de
queijo caprino, e diante da importância funcional desse bioproduto, utilizado como ingrediente
em derivados lácteos, o presente estudo tem por objetivo de quantificar o ácido siálico (Neu5Gc
e Neu5Ac) no soro de queijo caprino obtido por coagulação enzimática e mista.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LEITE CAPRINO
Nas regiões da Europa, Oceania e América do Norte e do Sul, a produção de leite de
cabra tornou-se uma operação importante e de mercado. A indústria da produção de queijo é
fundamental em países como a França e a Itália, onde o queijo caprino é considerado como um
alimento gourmet e recebe os preços mais elevados entre as variedades de queijo. Além disso,
a cabra leiteira é um setor tradicional e fundamental da economia nacional em muitos países do
Mediterrâneo, como Espanha, Grécia, Turquia e Marrocos (SILANIKOVE et al., 2010; PARK
et al., 2007).
A habilidade da cabra de proporcionar alimentação de alta qualidade sob condições
ambientais diversas faz com que esse animal tenha um papel importante na nutrição humana
(SILANIKOVE et al., 2010). Como uma iniciativa de estimular o desenvolvimento econômico
nas áreas rurais do Brasil, o leite de cabra é vendido para o governo e usado em programas
sociais (OLIVEIRA et al., 2011).
A produção leiteira caprina ou bovina destinada ao consumo in natura ou a elaboração
de derivados é crescente na região do Nordeste brasileiro, destacando-se os Estados da Paraíba
e do Rio Grande do Norte, onde a atividade representa uma alternativa de emprego e renda para
a agricultura familiar (SILVA et al., 2011).
O leite é um alimento essencial na alimentação humana, sendo utilizado como
constituinte básico na dieta em todas as faixas etárias. Por possuir alta digestibilidade, ser fonte
de cálcio, magnésio e de proteínas de elevado valor biológico, é um dos produtos mais
completos do ponto vista nutricional (MEYRAND et al., 2013).
O crescimento do consumo do leite de cabra e seus derivados estão atrelado aos efeitos
benéficos na saúde humana reconhecidos pela comunidade científica. Ele possui odor e sabor
aceitável, podendo ser consumido como uma alternativa ao de vaca, com relevância na
alimentação infantil pelas características de hipo-alergenicidade (PARK et al., 2007; GARCIA
et al., 2014). Os seus constituintes químicos podem ser influenciados por fatores genéticos,
fisiológicos, climáticos e, principalmente, de origem alimentar (COSTA et al., 2009).
O leite de cabra ressalta-se como um alimento funcional, por ser uma fonte natural de
oligossacarídeos derivados da lactose, pela sua qualidade proteica, por sua fração lipídica e pelo
alto teor de minerais. O nível de ácidos graxos coincide-se com o do leite humano, sendo
encontrados ácidos graxos saturados e insaturados, como: oleico, linoléico, linolênico,
19
araquidônico. O linoléico, linolênico e ácido linoleico conjugado (CLA) tem ação
cardioprotetora, atuando como anti-aterogênico vascular. (HAENLEIN, 2004; HAENLEIN et
al., 2011; BUENO, 2005).
Os glóbulos de gordura com diâmetro inferiores a 3 μm garante uma maior
digestibilidade e um metabolismo lipídico eficaz, bem como, influi na textura e maciez dos seus
derivados. Os ácidos graxos de cadeia curta: capróico, caprílico e cáprico são os responsáveis
em parte, pelas características odoríferas. Uma vez que dispõe de menores micelas de caseína
e glóbulos de gordura, o leite caprino contém uma concentração mais elevada de algumas
proteínas do soro e de oligossacarídeos em comparação ao leite bovino (RAYANAL-
LJUTOVAC et al., 2011; SILANIKOVE et al., 2010).
A caseína do leite caprino contém uma quantidade superior de β-caseína (67,4%; leite
bovino: 43,3%), e quantidade inferior de α-s1 caseína, sendo 3,9% no caprino e 33,7% no
bovino (SILVA et al., 2007; TOMATAKE et al., 2006). O conteúdo de lactose é ligeiramente
inferior, embora não seja recomendado para os intolerantes (SILANIKOVE et al., 2010). Os
oligossacarídeos derivados da lactose estão em quantidades maiores neste leite em relação ao
bovino e ao ovino, o que confere uma série de benefícios à nutrição humana (KUNZ et al.,
2000; MEYRAND et al., 2013).
A qualidade do leite é de fundamental importância para a produção dos seus derivados.
Nos caprinos, a contagem de células somáticas é mais difícil de ser correlacionada com
possíveis infecções do que no caso das vacas e das ovelhas. As características podem ser
avaliadas de acordo com os parâmetros tecnológicos, sensoriais, nutricionais e sanitários. Todos
esses critérios dependem de inúmeros fatores e suas interações, que estão ligadas aos principais
componentes físico-químicos (gordura, proteína, lactose), bem como aos microcompostos
como minerais, vitaminas, colesterol e terpenos. A qualidade do leite tem uma projeção direta
no soro, obtido pela coagulação da caseína durante a fabricação de queijo. O seu
reaproveitamento tem tido proeminência em diversos estudos, devido a sua relevância
nutricional (SÁNCHEZ-MACÍAS et al., 2013; GARCÍA et al., 2014; PRAZERES et al., 2012).
2.1.1 Tipos de coagulação do leite
A coagulação do leite acontece com a mudança do estado físico, líquido para o
gelatinoso, podendo ser enzimática, ácida e mista. Cada uma dessas coagulações leva à
formação de gel lácteo com características físico-químicas e nutricionais distintas além dos
20
aspectos sensoriais. A partir disso, o queijo é produzido e o soro derivado dessa produção é
obtido (AQUARONE et al., 2001).
A coagulação enzimática e mista é a mais utilizada no processo de fabricação de queijos,
devido, principalmente, ao maior rendimento obtido em relação à coagulação ácida
(AQUARONE et al., 2001). Para o êxito da coagulação enzimática é necessário que após a
pasteurização do leite, ele seja mantido a uma temperatura entre 32 °C e 36 °C, e receba os
ingredientes: cloreto de cálcio (repor o cálcio perdido na pasteurização, e formar as pontes de
ligações peptídicas) e o coalho (enzima) para promover a lise da ligação entre os aminoácidos
105 – 106. Para a coagulação mista, além desses ingredientes, é adicionado um ácido e uma
cultura bacteriana. Na coagulação, as enzimas utilizadas podem ser oriundas de animais,
vegetais e/ou de micro-organismos, que podem ser adicionadas isoladamente ou misturadas
entre si. A junção de enzimas pode proporcionar, entre outros efeitos, um ajuste da taxa de
proteólise durante a maturação, a um nível desejado (RANI et al., 1995).
A principal enzima responsável pela coagulação da caseína é a renina, conhecida como
coalho, uma fosfoproteína de ação proteolítica presente no estômago de ruminantes jovens. Ela
atua hidrolisando ligações peptídicas da caseína, transformando-a em para-caseína que
precipita em presença de íons Ca2+ formando, então, a coalhada (PERRY, 2004). Este processo
é dependente da temperatura, do pH e do teor de cálcio do leite. A temperatura ótima de ação
do coalho é em torno de 40 °C, mas costuma-se utilizar temperaturas ligeiramente mais baixas
(aproximadamente 35 °C) para evitar que a coalhada fique muito dura. Outro método de
coagulação da caseína é o método ácido, em que se adiciona ácido (ácido lático, cítrico ou
acético) ao leite em quantidade suficiente para igualar o pH do meio ao ponto isoelétrico da
proteína (pH 4,5). Neste pH as micelas de caseína agregam-se e precipitam-se, mas o método
fornece queijos de qualidade inferior aos produzidos pelo método enzimático e misto, não
obtendo um bom rendimento na massa e no soro (PERRY, 2004).
A adição da cultura starter é fundamental na coagulação mista. Essa é uma preparação
microbiana de elevado número de células vivas ou em estado de dormência, contendo pelo
menos um tipo de micro-organismo, que é adicionada às matérias-primas e recebe esta
denominação (starter) porque iniciam a fermentação. As bactérias ácido láticas ocupam papel
central nesse processo e possuem um longo histórico de utilização segura durante a produção
de alimentos e de bebidas, incluindo diversos tipos de queijos, bebidas lácteas, iogurte. Na
coagulação do leite, para a fabricação do queijo, as mais utilizadas são as culturas mesófilas
homofermentativas constituídas principalmente de Lactococcus lactis subsp. lactis e
Lactococcus lactis subsp. cremoris. Os Lactococcus lactis subsp. lactis são levemente
21
proteolíticos, com fraca produção de gás, produzindo sabor e aroma puro, fresco e ácido ao
queijo. O Lactococcus lactis subsp. cremoris atuam como principais acidificantes e nos estágios
iniciais da maturação do queijo (LEROY et al., 2004 MADUREIRA, et al., 2011).
A qualidade do leite é de suma importância para o produto final. O leite de baixa
qualidade interfere na coagulação, impedindo-a de acontecer. Esse fator influencia no
rendimento da produção, causando além dos riscos ao consumidor, grandes prejuízos às
indústrias. Uma adequada obtenção de soro está relacionada com o sucesso da coagulação e a
qualidade do leite utilizado, visto que muitos dos nutrientes do leite estão no soro (PERRY,
2004; SANMARTÍN et al., 2012).
2.2 SORO DE QUEIJO CAPRINO
O soro de queijo é um bioproduto obtido em virtude do processo de coagulação da
caseína, durante a fabricação de queijo. Ele possui alto valor nutricional (proteínas, sais
minerais e lactose), sendo ainda hoje rejeitado pelos produtores, o que o torna um resíduo de
elevado impacto ambiental, principalmente quando eliminado em cursos de água, pois
contamina os efluentes. Considerado um produto valioso e importante, é responsável por 85 a
95% em volume e cerca de 55% de todos os nutrientes do leite. A sua utilização na composição
de diversos produtos alimentícios reduz o desperdício e geralmente, possuem um valor de
mercado mais acessível (SILVA et al., 2011; SILVEIRA et al., 2015; SANMARTÍN et al.,
2012).
A utilização do soro de queijo como componente de produtos lácteos implica um
destino mais racional deste bioproduto industrial, com um impacto benéfico sobre o ambiente.
Além disso, os produtos lácteos (produtos contendo soro de queijo em sua formulação) têm
demonstrado ser um substrato interessante para o desenvolvimento de bactérias probióticas
(CASTRO, et al., 2013).
A indústria utiliza dois tipos de soro: o doce (pH = 6-7) e o ácido (pH < 5). O soro de
queijo ou soro de leite doce é obtido na fabricação do queijo que se utiliza coalho, enquanto
que o soro ácido ou soro de caseína é obtido após a fermentação ou a adição de compostos
orgânicos ou ácidos minerais. O soro de queijo caprino tem uma composição proteica que
depende de alguns fatores: o tipo do soro (ácido ou doce), a época do ano, o tipo de alimento,
o estágio de lactação e a qualidade do processamento (HERNANDEZ-LEDESMA et al.,2011;
PANESAR et al., 2007).
22
O soro ácido tem o conteúdo de cinzas elevado e a quantidade proteica menor em relação
ao de soro doce. A coagulação ácida ocorre perto do ponto isoelétrico do pH da caseína (pH
4,6), assim, mais proteína do leite precipita. Por ter um sabor ácido e um alto teor de sal, o soro
ácido tem uso limitado. Neste tipo de soro, a concentração de cálcio é aproximadamente duas
vezes mais elevada do que é observado no soro doce. Na coagulação ácida, o cálcio coloidal
contido nas micelas de caseína é solubilizado no soro. Entretanto, o nível de lactose é mais
elevado em soro doce do que no soro ácido (PANESAR et al., 2007; CARVALHO et al., 2013;
MAWSON, 1994).
Por ser um substrato rico nutricionalmente, o soro de queijo tem um amplo
aproveitamento: componente principal ou adicional na elaboração de queijo ricota, formulação
de meios de cultura bacterianos e leveduras, produção de biomassa e fornecimento de nutrientes
para suplementos animais ou como fonte proteica. As principais proteínas presentes são:
lactoglobulina, lactalbumina. As imunoglobulinas, a albumina e as proteases-peptonas estão
presentes em concentrações menores, assim como a lactoferrina, também estando presente o
caseino-macropeptídeo (AGUIRRE-EZKAURIATZA et al., 2010; HERNANDEZ-LEDESMA
et al.,2011).
Esses nutrientes do soro caprino exercem atividades biológicas diversificadas que
influenciam na digestão, nas respostas metabólicas aos nutrientes absorvidos, no crescimento e
desenvolvimento de órgãos específicos e na resistência a doenças. A hidrólise dessas proteínas
pode fornecer peptídeos bioativos, capazes de realizar atividades biológicas específicas: anti-
hipertensivas, antimicrobiana, anti-oxidante, anti-hipercolesterolêmica, imunomoduladora
(YALCIN, 2006; HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2008; MADUREIRA et al., 2010). Podem
ser uma alternativa interessante na substituição das proteínas bovinas nos alimentos, uma vez
que esta última tem um potencial alergênico superior (SANMARTÍN et al., 2013). Ademais,
contribuem no controle do peso corporal, fornecendo sinais de saciedade que induzem na
ingestão de alimentos a curto ou longo prazo (LUHOVYY et al., 2007).
As vitaminas são componentes fisiológicos, bioquímicos, metabólicos e bioativos
presentes no leite e derivados. A maioria das vitaminas lipossolúveis está incorporada a
coalhada e a maioria das vitaminas hidrossolúveis está presente no soro. Os derivados lácteos
caprinos possuem um maior conteúdo de vitamina A em comparação aos de vaca e aos de
ovelha. Este nutriente é importante, pois modula genes envolvidos no metabolismo de ferro,
assim a anemia e o acúmulo de ferro nos tecidos podem ser evitados. A vitamina B12 e o ácido
fólico estão em baixa concentração, sendo necessário o consumo de outras fontes alimentares
23
para a obtenção destes nutrientes (HERNANDEZ-LEDESMA et al., 2011; THEODOSIOU et
al., 2010).
Nos derivados lácteos caprinos, os minerais em destaque são: Na, Ca, P, K, Mg e Cl. O
Na, o K, e o Cl são quase totalmente solúveis e disponíveis no soro de queijo. Ca, Mg, e P são
associados em proporções diferentes da suspensão coloidal de micelas de caseína, e, portanto,
estão parcialmente retidos na coalhada durante a produção de queijo (HERNANDEZ-
LEDESMA et al., 2011).
A lactose é o principal carboidrato presente nos produtos lácteos. É considerado um
valioso nutriente por favorecer a absorção intestinal de cálcio, magnésio, fósforo e da vitamina
C. Dentre os carboidratos, os oligossacarídeos presentes têm propriedades prebióticas e anti-
infeciosas, não sendo digeridos no trato gastro-intestinal. A fração ácida desses
oligossacarídeos contêm ácido siálico que são o ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) e o ácido
N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). Estes são fundamentais no desenvolvimento infantil, com
funções anti-inflamatórias, anti-adesivas, antipatogênicas e no sistema imunológico, sendo
também utilizados na suplementação em fórmulas lácteas como fontes alternativas ao leite
humano (PARK et al., 2009; MARTINEZ-FEREZ et al, 2006; RAYNAL-LJUTOVAC et al.,
2008; MEYRAND et al., 2013).
2.3 ÁCIDO SIÁLICO
A maioria dos oligossacarídeos encontrados no leite tendem a ser sialilados, consistindo
de uma estrutura principal com uma unidade de lactose na extremidade redutora e pelo menos,
uma unidade de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) na extremidade não redutora. Em
produtos lácteos e amostras biológicas, os resíduos de ácido siálico estão geralmente presentes
como glicoconjugados (glicoproteínas, glicolipídeos e lipopolissacarídeos) e nas porções
terminais das cadeias de glicanos, sendo raramente encontrados na forma livre (3%). Mesmo
em menor concentração em relação ao leite humano, o ácido siálico, naturalmente presente no
leite de todo mamífero, se destaca no leite de ruminantes por estar mais presente na alimentação
infantil e na fabricação de fórmulas lácteas. A oscilação da quantidade destes constituintes no
leite e derivados está de acordo com as diferentes raças de ruminantes, das regiões geográficas,
da nutrição do animal ou da combinação destes fatores (WANG et al., 2003; LAMARI et al.,
2002; SPICHTIG et al., 2010).
Quando o leite materno é insuficiente, os recém-nascidos necessitam receber
alimentação por meio de fórmulas infantis à base de leite bovino, o qual possui menor
24
quantidade de Neu5Ac do que o leite humano (CARLSON, 1985; SÁNCHEZ-DIAZ et
al.,1997; WANG et al., 2001b). Além disso, no leite materno, a maioria do Neu5Ac está ligada
a oligossacarídeos, enquanto que, no leite bovino, está ligada a proteínas (WANG et al., 2001a).
Tais diferenças de quantidade e qualidade podem estar relacionadas com a maior quantidade de
Neu5Ac cerebral encontrada em crianças, amamentadas com leite materno em comparação as
crianças alimentadas com fórmulas infantis (WANG et al., 2003).
Mais de cinquenta formas de ácido siálico já foram identificadas. A diversidade é
baseada no número, na posição e na combinação dos diferentes substituintes hidroxil por acetil-
, glicolil-, fosfonil-ou grupos metil, por exemplo. Duas formas são determinadas comumente:
o ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) e o ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). Destes, o
Neu5Gc está geralmente ausente nas proteínas humanas. Entretanto, a presença deste em
glicoproteínas terapêuticas pode causar uma resposta imunogênica (VARKI, 2007; PADLER-
KARAVANI et al., 2008; REINKE et al., 2009; GHADERI et al., 2010). O Neu5Gc exógeno
pode ser incorporado e metabolizado por culturas de células humanas por vias bioquímicas
específicas (BARDOR et al., 2005), sugerindo que o Neu5Gc encontrado em tecidos humanos
é de fontes dietéticas, como leite e carnes vermelhas (HEDLUND et al., 2007). A figura 01
demonstra a configuração química dos ácidos siálicos citados.
Figura 01: Estrutura química do ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc – à esquerda) e do ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac – à direita). Fonte: WANG et al., 2003.
Uma quantidade elevada de Neu5Gc no plasma está associada a alguns tipos de câncer,
uma vez que as células de tumor induzem alterações no gene que codifica o Neu5Ac, resultando
na produção de Neu5Gc pelo organismo, sendo este obtido apenas por meio da dieta.
Entretanto, há a importância de identificar estes compostos em certos tumores, pois podem
auxiliar no diagnóstico da doença (TZANAKAKIS et al., 2006; WILLISON, 2007; YIN et al.,
2006).
Os gangliosídeos são ácido siálico contendo glicoesfingolipídeos localizados no exterior
da superfície das células de mamíferos, no sistema nervoso, bem como nos glóbulos de gordura,
25
que podem agir contra enterotoxinas e infecções nos recém-nascidos (RAYNAL-LJUTOVAC
et al., 2008). Estes compostos são constituídos por uma base esfingóide ligada a um ácido graxo
por uma ligação amida (ceramida) unido a uma cadeia de oligossacarídeo de tamanho variável,
contendo uma ou mais porções de ácido siálico (LACOMBA et al., 2010).
No córtex frontal do cérebro, os gangliosídeos - constituem 10% da massa total de
lipídeos no cérebro - e as glicoproteínas desempenham um papel estrutural e funcional,
provavelmente participando de uma variedade de acontecimentos celulares, tais como o
reconhecimento de célula, contato entre as células, ligação e modulação do receptor,
propriedades imunológicas e transdução de sinais biológicos. O ácido siálico dos gangliosídios
e os íons cálcio estão envolvidos nos processos de adaptações neuronais como o de
armazenamento de informações (WANG et al., 2003). Na microbiota intestinal, o Sia está
envolvido na proteção contra infecções, impedindo a ligação do patógeno na mucosa intestinal
através da própria ligação com bactérias, rotavírus e toxinas (IDOTA et al., 1995; VARKI,
1993; PARKKINEN et al., 1983).
A ausência de ácido siálico na alimentação foi avaliada através da manipulação de
mutações genéticas, recentemente, por Yoo et al. (2015). Eles demonstraram que mutações em
ratos nos genes responsáveis pela sialilação de gangliosídeos e algumas glicoproteínas
acarretaram em expressiva desmielinização, bem como retardo no crescimento, prejuízos na
coordenação motora, distúrbios no andar, comportamento ansioso e profunda deficiência
cognitiva. Prolo, Vogel e Reimer (2009) haviam também demonstrado que o transportador
lisossomal do Sia, Sialina, é necessário para a mielinização normal no SNC, enfatizando a
importância do Sia no processo de mielinização.
No leite, o ácido N-glicolilneuramínico (NeuGc) e o ácido N-acetilneuramínico
(NeuAc) compreendem os oligossacarídeos ácidos. (MEYRAND et al., 2013). Galactose (Gal),
glicose (Glc), fucose (Fuc), N-acetilglucosamina (GlcNAc) e N-acetilgalactosamina (GalNAc)
ligados a um núcleo de lactose constituem os oligossacarídeos neutros (MEYRAND et al.,
2013). O leite caprino tem um elevado nível de oligossacarídeos ácido e neutro com perfil
semelhante ao do leite humano, ficando em segundo lugar apenas em quantidade, tendo quatro
vezes mais que o leite bovino e dez vezes mais que o leite de ovinos (BOEHM et al., 2003;
NAKAMURA et al., 2004; DADDAOUA et al., 2006).
Os oligossacarídeos ácidos contêm um ou mais resíduos de ácido siálico que são
carregados negativamente. Este é o nome comum para o ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac)
e o ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), que exercem efeitos positivos no desenvolvimento
do cérebro das crianças. Nesta porção ácida, o 3-sialil-lactose e 6-galactosil-lactose estão em
26
maior concentração. Os ácidos Neu5Ac e Neu5Gc podem ser encontrados em ruminantes,
oscilando a quantidade de acordo com a espécie, enquanto que o leite materno contém apenas
Neu5Ac (HERNANDEZ-LEDESMA et al., 2011; PARK et al., 2009; MEHRA et al., 2006;
URASHIMA et al., 2001).
A fração ácida desses compostos tem função significativa nas respostas imune-
inflamatórias, no organismo. Este processo resulta na liberação de moléculas de adesão da
superfície celular, conhecidas como selectinas, que são glicoproteínas essenciais para a
formação de complexos plaquetários de neutrófilos. Para decifrar a relação dos oligossacarídeos
com estas reações, Bode et al. (2004) demonstraram que a fração ácida dos OS compete com
glicoproteína P-selectina ligante 1 na ligação com a P-selectina, assim a formação dos
compexos plaquetários de neutrófilos são reduzidos até 20%, evitando-se consequências
deletéricas que ocasionam a destruição de tecido saudável, como ocorre no recrutamente
excessivo dos agregados celulares, na ausência da fração ácida (LARSON et al., 1989;
CARDEN et al., 2000; SCHON et al., 2002; RUDLOFF et al., 2002).
O metabolismo do Ácido Siálico foi revisado por Reinke e colaboradores (2009). O
Neu5Ac pode ser sintetizado a partir de frutose-6-fosfato (Frutose-6-P), da glicólise de
componentes dietéticos ou da N-acetilglucosamina (GlcNAc) após a degradação de glicanos
endógenos ou exógenos. Nos vertebrados e todos os mamíferos, com exceção dos seres
humanos, o Neu5Ac pode ser convertido em Neu5Gc, por uma hidroxilase específica no
retículo endoplasmático (REINKE et al., 2009).
Sialidases e sialiltransferases são as enzimas responsáveis pela remoção e adição,
respectivamente, de resíduos de Sia dos sialoconjugados e com isso, pela densidade de Sia
encontrado em diferentes regiões de tecidos e de células (LINNARTZ-GERLACH et al., 2014).
Quatro tipos de sialidases (neuraminidases) foram identificadas nos mamíferos: NEU1 –
predominantemente lisossomal, NEU2 - predominantemente citosólica, NEU3 -
predominantemente na superfície celular associada à membrana e NEU4 - predominantemente
intracelular associada a membranas. Estas são expressas em regiões diferentes dos tecidos e das
células (MIYAGI eYAMAGUCHI, 2012). Há vários tipos de sialiltransferases, se
diferenciando pelo tipo de ligação formada e pela estrutura para a qual o Sia será transferido
(LINNARTZ-GERLACH et al., 2014).
A ingestão desses compostos bioativos é importante, especialmente durante os
primeiros estágios de vida. Quando presentes na amamentação e nas fórmulas infantis
contribuem positivamente para o desenvolvimento das funções biológicas já mencionadas e
para formação neuronal, sendo indispensáveis (LACOMBA et al., 2010).
27
3 HIPÓTESE
A concentração de ácido siálico no soro de queijo caprino é influenciada pelo tipo de
coagulação láctea.
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Identificar e quantificar o ácido siálico no soro de queijo caprino obtido por coagulação
enzimática e mista (enzima + cultura starter).
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
9 Quantificar ácido siálico no soro (líquido e liofilizado) de queijo caprino obtido por
coagulação enzimática;
9 Quantificar ácido siálico no soro (líquido e liofilizado) de queijo caprino obtido por
coagulação mista;
9 Verificar a variação da concentração do ácido siálico nos soros de acordo com o tipo de
coagulação.
28
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 AMOSTRAGEM
O leite caprino in natura da raça Saanen, foi obtido do Setor de Caprinocultura do Centro
de Ciências Humanas Sociais e Agrárias (CCHSA), Campus III, Universidade Federal da
Paraíba, sendo transportado em recipiente isotérmico contendo gelo até o Laboratório de
Técnica Dietética, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Universidade
Federal da Paraíba, onde foi armazenado sob refrigeração por no máximo um dia até o momento
do processamento de coagulação para obtenção do soro de queijo. O coalho (fonte da enzima
animal - renina), assim como a cultura starter, composta por Lactococcus lactis subsp. lactis e
Lactococcus lactis subsp. cremoris (R704), foram disponibilizados pela Christian Hansen®
(Valinhos, Minas Gerais, Brasil).
Para obtenção do soro, o leite passou por dois processos de coagulação: Enzimática (T1 -
soro obtido na coagulação da caseína pela ação da enzima animal – renina) e Mista (T2 - soro
obtido na coagulação da caseína pela ação da renina + cultura starter), cada tratamento foi
realizado em triplicata. O processo de obtenção dos soros seguiu o protocolo de Garcia et al.,
2012, com as etapas de pasteurização do leite, coagulação e de dessoragem.
5.2 MÉTODOS DE COAGULAÇÃO
5.2.2 Soro de queijo caprino por coagulação enzimática (T1)
O leite foi pasteurizado a 65 °C durante 30 minutos, e logo em seguida resfriado em
banho de gelo, até atingir a temperatura de 37 °C. Adicionou-se a solução de cloreto de cálcio
(a 40%) e homogeneizou-se. Logo em seguida, dissolveu-se o coalho (coagulante liquido HÁ-
LA® do Brasil, CHR. HANSEN/ Força 1:3.000) em água mineral, sem cloro, e adicionou ao
leite, homogeneizou, deixando descansar por 40 minutos. Ao final da coagulação, realizou-se
cortes com a lira no sentido vertical e horizontal em toda a massa, mexendo-a delicadamente
durante 20 minutos até a completa separação do soro. Em seguida, o soro obtido foi
acondicionado e congelado para realização das análises. Parte do soro foi liofilizado (LT1) em
Liofilizador, modelo L-108, da marca Liotop.
29
Fluxograma 1: Produção soro de queijo obtido por processamento enzimático
5.2.2 Soro de queijo caprino por coagulação mista (T2)
O leite foi pasteurizado a 65 °C durante 30 minutos, foi resfriado em banho de gelo, até
atingir a temperatura de 37 °C. Adicionou-se uma solução de o ácido lático (85%) seguido de
homogeneização. As bactérias lácticas (R – 704/Mesófilos homofermentativos/CHR.
HANSEN) dissolvidas em um pouco de leite, foram adicionadas, homogeneizadas. Em seguida,
adicionou-se a solução de cloreto de cálcio (a 40%), homogeneizou novamente. O coalho
(coagulante liquido HÁ-LA® do Brasil, CHR. HANSEN/ Força 1:3.000) dissolvido em água
mineral, foi acrescentado ao leite, que foi novamente homogeneizado e deixado em repouso por
40 minutos. Ao final da coagulação, realizou-se cortes com a lira no sentido vertical e horizontal
30
em toda a massa, mexendo-a delicadamente 20 minutos até a completa separação do soro. Em
seguida, o soro obtido foi acondicionado e congelado para realização das análises. Parte do soro
foi liofilizado (LT2) em Liofilizador, modelo L-108, da marca Liotop.
Fluxograma 2: Produção soro de queijo obtido por processamento misto
31
5.3 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO
5.3.1 Reagentes
O ácido fórmico, o ácido acético, o hidrossulfito de sódio e o 2-mercaptoetanol (grau
HPLC) foram adquiridos a partir da Sigma-Aldrich. Os padrões para a identificação e
quantificação de ácido siálico, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac/ ≥ 98%), ácido N-
glicolilneuramínico (Neu5Gc/ ≥ 95%) e o reagente de derivatização DMB (1,2-diamino-4,5-
metilenodioxibenzeno) foram obtidos a partir da Sigma-Aldrich. O metanol (grau HPLC) foi
adquirido da Merck e a água foi obtida a partir de um sistema de purificação de água Milli-Q
(Millipore, Bedford, MA, EUA). O reagente DMB (7 mM) foi preparado em solução de ácido
acético (1,4 M) com a adição de 2-mercaptoetanol (0,75 M) e de hidrossulfito de sódio (18
mM).
5.3.2 Separação e preparo do extrato de ácido siálico
A preparação da solução para a identificação de ácido siálico nos soros de queijo seguiu
a metodologia utilizada pelo Spichtig et al. (2010), com modificação. Para balões volumétricos
distintos de 100 mL, foi transferido 10 mL do soro líquido, 0,05g do liofilizado e adicionado
50 mL de água ultrapura aquecida a 60°C e expostos em temperatura ambiente durante 10 min
com agitação. Em seguida, as soluções foram resfriadas até à temperatura ambiente e o volume
do balão foi preenchido com água ultrapura.
Dessas soluções, foram retirados 200 µL e transferidos para tubos contendo o mesmo
volume de ácido fórmico 1M, sendo submetidos a hidrólise por 2h a 80 °C para hidrólise das
ligações e liberação do ácido siálico. As amostras hidrolisadas foram resfriadas em gelo e
transferidas para Vivaspin 2 (GE Healthcare - 30 kDa) e centrifugadas por 10 min a 5000 g. A
partir do filtrado hidrolisado, foram transferidos 100 µL para tubos de ensaio, contendo o
mesmo volume do reagente DMB (1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene). A solução foi
aquecida a 80 °C por 50 minutos. As amostras derivatizadas foram resfriadas em banho de gelo
e diluídas com a adição de 800 µL de água ultrapura.
32
5.3.3 Identificação do ácido siálico
As análises das amostras derivatizadas foram realizadas utilizando um cromatógrafo
líquido – Shimadzu Prominence – composto por detector de fluorescência modelo RF-20A,
bomba quaternária modelo LC-20 AT, forno de coluna modelo CTO-20AC, auto injetor modelo
SIL-20AC. O sistema foi comandado por um controlador modelo CBM-20A e operado com
software LC Solution™ (versão 1.25). A fluorescência foi monitorada em comprimento de onda
de emissão e excitação de 448 e 373 nm, respectivamente, usando um ganho de 4x, média
sensibilidade, tempo de resposta de 1 s e taxa de amostragem de 2 Hz. A separação foi obtida
em coluna de fase reversa, de Rápida Resolução Zorbax SB-Aq (3,5 μm; 4,6 x 50 mm) da
Agilent Technologies mantida a 30 ºC. A eluição das amostras de ácido siálico derivatizadas
em DMB foi realizada em modo isocrático com fase móvel composta por mistura de
água/metanol/ácido acético (74,95:25:0,05 v/v/v) a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min.
O volume de injeção será 10 μL com tempo total de corrida de 5 min. Ao término das
corridas do dia, a coluna foi lavada com água a um fluxo de 0,5 mL/min por aproximadamente
30 min e em seguida com metanol (Merck – grau HPLC), em fluxo 0,3 mL/min durante 30 min
para preservar a coluna. Os ácidos siálicos Neu5Gc e Neu5Ac derivatizados foram eluídos com
tempo de retenção de aproximadamente 2’,5’’ e 3’,3’’, respectivamente.
A calibração foi realizada pelas soluções dos padrões de Neu5Gc e Neu5Ac e pela
solução da mistura desses dois padrões (pool) que receberam o mesmo tratamento das amostras
de soro, porém sem aquecimento durante a etapa de hidrólise. Na identificação foram utilizadas
as áreas dos picos e os tempos de retenção.
5.3.4 Validação do método cromatográfico
Nesta etapa foram realizados testes de linearidade, limite de detecção e de quantificação
de ácido siálico em amostras de soro de queijo.
A quantificação foi realizada pela curva calibração com os padrões externos usando as
áreas de pico para os cálculos. A solução de reserva de padrões Neu5Gc e Neu5Ac para curva
de calibração foi preparada em concentrações de 0,02, 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40 e 0,50 μg.mL-
1. O limite de detecção (LOD) foi definida como a menor concentração do analito, obtendo-se
uma relação de sinal-ruído de 3,3, o limite de quantificação (LOQ) foi definida como a menor
concentração do analito, obtendo-se uma relação sinal-ruído de 10 (ICH, 1994).
33
As análises de determinação de ácido siálico foram realizadas no Laboratório
Multiusuário de Caracterização Química de Alimentos, Medicamentos e Suplementos
Nutricionais – CQAMOS no Centro de Ciências da Saúde – CCS da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE).
5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As médias das concentrações dos ácidos Neu5Gc e Neu5Ac das amostras dos soros de
cada coagulação foram submetidas ao teste de Tukey no programa estatístico Sigma Stat 2.03.
Foram consideradas aceitas como significantes as diferenças em que p < 0,05 (SIGMA STAT,
2009).
34
6 ESTUDO DA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO SIÁLICO NATURALMENTE PRESENTE EM SORO DE QUEIJO CAPRINO
Introdução
O soro de queijo é um bioproduto da fração solúvel do leite, contendo quantidades
expressivas de proteínas, peptídeos, lactose, vitaminas e minerais solúveis em água, os quais
são separados a partir da coagulação da caseína durante a fabricação do queijo. Para a indústria
de alimentos, pode ser considerado um produto valioso e importante, como ingrediente
funcional, e responsável por 85 a 95% em volume e cerca de 55% de todos os nutrientes do
leite. Apesar destas características, ainda é frequentemente rejeitado pelos produtores. A sua
utilização na composição de diversos produtos alimentícios reduz o seu desperdício e,
geralmente, possuem um valor de mercado mais acessível. 1,2,3
Durante o processamento de queijos, a coagulação da caseína, para a obtenção do soro,
pode ser enzimática, ácida e mista.4,2 A coagulação enzimática e mista é a mais utilizada no
processo de fabricação de queijos, devido, principalmente, ao maior rendimento obtido em
relação à coagulação ácida. As enzimas podem ser oriundas de animais, vegetais e/ou de micro-
organismos, que podem ser usadas isoladamente, ou misturadas entre si. A utilização em
conjunto da enzima e da cultura starter configura o tratamento misto.5
O ácido siálico está presente nos leites principalmente nas formas de ácido N-
acetilneuramínico (Neu5Ac) e ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), oscilando a quantidade
de acordo com a espécie, entretanto, o leite materno contém apenas Neu5Ac. Mesmo em menor
concentração em relação ao leite humano, o ácido siálico, naturalmente presente no leite de
todo mamífero, se destaca nos leites de ruminantes, por serem aplicados na alimentação infantil
e na fabricação de fórmulas lácteas. Em derivados lácteos, a quantidade desse nutriente, além
de estar de acordo com as diferentes raças de ruminantes, a nutrição do animal e os estágios de
lactação, pode estar relacionada adicionalmente, com os tipos de produtos fabricados e seu
processamento ou a combinação destes fatores.6
O ácido siálico tem uma série de benefícios para a saúde humana, dentre eles: promover
o desenvolvimento do cérebro infantil referindo-se a parte de cognição e memória, atuar na
regulação do sistema imunológico e na função intestinal, agindo contra enterotoxinas e
infecções nos recém-nascidos, entre outros efeitos fisiológicos importantes. Em produtos
lácteos e amostras biológicas, os resíduos de ácido siálico estão geralmente presentes como
35
glicoconjugados (glicoproteínas, glicolipídeos e lipopolissacarídeos) e nas porções terminais
das cadeias de glicanos, sendo raramente encontrados na forma livre (3%).6,7
Especificamente em leite caprino, concentrações significantes de ácido siálico, Neu5Gc
e Neu5Ac, foram avaliados durante a fase de lactação.8 Este tipo de leite é utilizado para a
produção de queijos caprino, em que no processamento é obtido um grande volume de soro.
Devido à ausência de estudos que relatem a concentração do ácido siálico no soro de queijo
caprino, e diante da importância funcional desse bioproduto, utilizado na fabricação de
derivados lácteos, este estudo tem por objetivo quantificar, pela primeira vez, o ácido siálico,
Neu5Gc e Neu5Ac, naturalmente presentes no soro de queijos caprinos obtidos pelo
processamento enzimático e misto, avaliando também a sua concentração após liofilização.
Material e Métodos
Amostragem
O leite caprino in natura da raça Saanen, foi obtido do Setor de Caprinocultura do Centro
de Ciências Humanas Sociais e Agrárias (CCHSA), Campus III, Universidade Federal da
Paraíba, sendo transportado em recipiente isotérmico contendo gelo até o Laboratório de
Técnica Dietética, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Universidade
Federal da Paraíba, onde foi armazenado sob refrigeração por no máximo um dia até o momento
do processamento de coagulação para obtenção do soro de queijo. O coalho (fonte da enzima
animal - renina), assim como a cultura starter, composta por Lactococcus lactis subsp. lactis e
Lactococcus lactis subsp. cremoris (R704), foram disponibilizados pela Christian Hansen®
(Valinhos, Minas Gerais, Brasil).
Para obtenção do soro, o leite passou por dois processos de coagulação: Enzimática (T1 - soro
obtido na coagulação da caseína pela ação da enzima animal – renina) e Mista (T2 - soro obtido
na coagulação da caseína pela ação da renina + cultura starter), cada tratamento foi realizado
em triplicata. O processo de obtenção dos soros seguiu o protocolo de Garcia et al., 2012,9 com
as etapas de pasteurização do leite, coagulação e de dessoragem. Em seguida, o soro obtido foi
acondicionado e congelado para realização das análises. Parte do soro foi liofilizado em
Liofilizador, modelo L-108, da marca Liotop (LT1, LT2).
Reagentes
O ácido fórmico, o ácido acético, o hidrossulfito de sódio e o 2-mercaptoetanol
(qualidade para HPLC) foram adquiridos a partir da Sigma-Aldrich. Os padrões para a
36
identificação e quantificação de ácido siálico, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac / ≥ 98%),
ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc / ≥ 95%) e o reagente de derivatização DMB (1,2-
diamino-4,5-metilenodioxibenzeno) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich. O metanol
(qualidade para HPLC) foi adquirido da Merck e a água foi obtida a partir de uma purificação
de água do sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). O reagente DMB (7 mM) foi
preparado em solução de ácido acético (1,4 M) com a adição de 2-mercaptoetanol (0,75 M) e
de hidrossulfito de sódio (18 mM).
Procedimentos
A preparação da solução para a identificação de ácido siálico nos soros de queijo seguiu
a metodologia utilizada por Spichtig et al. (2010)6, com modificação. Para balões volumétricos
distintos de 100 mL, foram transferidos 10 mL do soro líquido, e 0,5g do liofilizado, e
adicionado 50 mL de água ultrapura, sendo aquecidos a 60 °C e expostos em temperatura
ambiente durante 10 min com agitação. Em seguida, as soluções foram resfriadas até à
temperatura ambiente e o volume do balão foi preenchido com água ultrapura. Destas soluções,
foram retirados 200 µL e transferidos para tubos contendo o mesmo volume de ácido fórmico
1 M, sendo submetidos a hidrólise por 2h a 80 °C. As amostras hidrolisadas foram resfriadas
em banho de gelo e transferidas para Vivaspin 2 (GE Healthcare - 30 kDa) e centrifugadas por
10 min a 5000 g. A partir do filtrado hidrolisado, foram transferidos 100 µL para tubos de
ensaio, contendo o mesmo volume do reagente DMB. A solução foi aquecida a 80 °C por 50
minutos. As amostras derivatizadas foram resfriadas em banho de gelo e diluídas com a adição
de 800 µL de água ultrapura.
Análises Cromatográficas
A análise no HPLC das amostras e padrões derivatizados de ácido siálico foram
realizadas num Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência da empresa Shimadzu Prominence,
operado com o software LC Solução ™ (version1.25). A eluição das amostras foi realizada
numa coluna de rápida resolução Zorbax SB – Aq (3,5 mm; 4.6_50 mm), de fase reversa, da
empresa Agilent Technologies, mantida a 30 °C. As amostras foram detectadas em
comprimento de onda de emissão e excitação de 448 e 373 nm, respectivamente, usando um
ganho de 4x, média sensibilidade, tempo de resposta de 1 s, e taxa de amostragem de 2 Hz.
A eluição das amostras de ácido siálico derivatizadas com DMB foi realizada em modo
isocrático com fase móvel composta por mistura de água/metanol/ácido acético (74,95:25:0,05
v/v/v) a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. O volume de injeção foi 10 μL com tempo total de
37
corrida de 5 min. A coluna foi lavada com água e acondicionada com metanol (Merck – grau
HPLC) ao final das análises. Os ácidos siálicos derivatizados Neu5Ac e Neu5Gc foram eluídos
com os tempos de retenção de aproximadamente 2’.5’’ e 3’.3’’, respectivamente. A curva de
calibração foi realizada utilizando os padrões de Neu5Ac e Neu5Gc tratados da mesma forma
que as amostras de soro de queijo, mas sem aquecimento durante a etapa de hidrólise.
A quantificação foi realizada pela curva calibração com os padrões externos usando as
áreas de pico para os cálculos. A solução mãe de padrões Neu5Gc e Neu5Ac para curva de
calibração foi preparada em concentrações de 0,02, 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40 e 0,50 μg.mL-1.
O limite de detecção (LOD) foi definida como a menor concentração do analito, obtendo-se
uma relação de sinal-ruído de 3,3, o limite de quantificação (LOQ) foi definida como a menor
concentração do analito, obtendo-se uma relação sinal-ruído de 10.10
A análise foi realizada no Laboratório Multiusuário de Caracterização Química de
Alimentos, Medicamentos e Suplementos Nutricionais – CQAMOS no Centro de Ciências da
Saúde – CCS da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Análise estatística
As médias das concentrações dos ácidos Neu5Gc e Neu5Ac das amostras dos soros
(líquidos e liofilizados) obtidos por tratamento enzimático e misto foram submetidas ao teste
de Tukey no programa estatístico Sigma Stat 2.03.11
Resultados e Discussão
O presente estudo quantificou pela primeira vez a concentração de ácido siálico, N-
glicolilneuramínico e N-acetilneuramínico, em soro de queijo caprino.
Os cromatogramas das soluções dos padrões de ácido siálico e das amostras de soro de
queijo caprino do presente estudo estão expressos na Figura 1. Os ácidos foram claramente
separados dos outros componentes nas amostras e com tempos de retenção semelhantes aos dos
padrões utilizados. Estes resultados se assemelham aos obtidos por Spichtig et al. (2010)6
quando determinaram ácido siálico em leite e em produtos lácteos; aos de Sousa et al. (2015)8
quando avaliaram a concentração de ácido siálico em leite caprino durante as fases de lactação
e aos de Lacomba et al. (2010)12 que também identificaram ácido siálico (Neu5Gc e Neu5Ac)
e gangliosídeos em amostras biológicas e em produtos lácteos, utilizando uma metodologia
semelhante à do presente estudo, desde o preparo da amostra, a derivatização, até a identificação
38
em HPLC. Assim, o método utilizado para a determinação de ácido siálico, naturalmente
presentes no soro de queijo caprino, apresentou eficiência analítica.
Figura 1. Cromatogramas de ácido siálico, com padrões e amostras de referência dos tratamentos (T1 e T2). (1) Neu5Gc, (2) Neu5Ac - Standards – T1 – T2 T1: soro líquido de queijo por processamento enzimático, T2: soro líquido de queijo por processamento misto.
A Figura 2 mostra os dois tipos de ácido siálico avaliados nos soros líquidos e
liofilizados, obtidos pela coagulação da caseína por processamento enzimático e misto, e a
eluição do Neu5Gc e do Neu5Ac, que são observados nos mesmos tempos de retenção em todas
as amostras. A partir dos cromatogramas, pode-se observar que os soros avaliados possuem
quantidades relevantes do nutriente abordado. Na quantificação final, as amostras liofilizadas
foram convertidas para base líquida do soro, para que todas as amostras estivessem na mesma
base durante a comparação.
39
Figura 2. Cromatogramas dos soros (líquidos e liofilizados) de queijo caprino obtidos por coagulação enzimática e mista. (1)Neu5Gc, (2) Neu5Ac. T1 (A), T2 (B), LT1 (C), LT2 (D) T1: soro líquido de queijo por processamento enzimático, T2: soro líquido de queijo por processamento misto. LT1: soro liofilizado de queijo por processamento enzimático, LT2: soro liofilizado de queijo por processamento misto.
A quantificação do Neu5Gc e Neu5Ac nas amostras foi realizada utilizando as áreas dos
picos dos padrões. A equação do cálculo para a concentração do Neu5Gc foi y = 788478x -
774021e a equação do cálculo para a concentração do Neu5Ac foi y = 424497x - 374818.
O valor de x corresponde a concentração das soluções padrões que variou de 0,02 a 0,5
µg mL-1. O limite de detecção foi 0,02 µg mL-1 e o de quantificação foi de 0,05 µg mL-1 para o
Neu5Gc e para o Neu5Ac. A metodologia aplicada obteve o coeficiente de linearidade muito
próximo a 1, r = 0,9901 para o Neu5Gc e r = 0,9903 para o Neu5Ac, o que indica forte
linearidade entre as amostras, a concentração e o tempo do padrão, salientando a eficiência do
método analítico.
40
As Tabelas 1 e 2 mostram a concentração do ácido siálico (Neu5Gc e Neu5Ac) nas
amostras dos soros de queijo. Observa-se que o soro liofilizado do queijo do tratamento
enzimático (LT1) apresentou uma melhor quantidade desses nutrientes em relação a todas as
outras amostras (LT2, T1, T2). O soro líquido do processamento enzimático (T1) apresentou
uma concentração dos Neu5Gc e Neu5Ac maior em relação ao do soro líquido do
processamento misto (T2). Da mesma forma, o soro liofilizado do processamento enzimático
(LT1) apresentou uma concentração dos Neu5Gc e Neu5Ac maior em relação ao do soro
liofilizado do processamento misto (LT2). Assim, o tipo de processamento do queijo,
enzimático ou misto, pode influenciar na quantificação desse nutriente no soro, sendo o
processamento enzimático mais eficiente para a obtenção do ácido siálico.
Tabela 1. Valores médios da concentração de Neu5Gc, Neu5Ac e Ácido siálico total em soros de queijo líquidos obtidos por coagulação enzimática e mista.
T1: soro líquido de queijo por processamento enzimático, T2: soro líquido de queijo por processamento misto. Letras distintas nas colunas (a-b) correspondem a diferença estatística significativa (p<0,05). Concentração de ácido siálico foi calculada pela soma Neu5Gc + Neu5Ac.
Tabela 2. Valores médios da concentração de Neu5Gc, Neu5Ac e Ácido siálico total em soros de queijo liofilizados obtidos por coagulação enzimática e mista.
LT1: soro liofilizado de queijo por processamento enzimático, LT2: soro liofilizado de queijo por processamento misto. As amostras liofilizadas foram convertidas para a base líquida do soro. Letras distintas nas colunas (A-B) correspondem a diferença estatística significativa (p<0,05). Concentração de ácido siálico foi calculada pela soma Neu5Gc + Neu5Ac.
A coagulação enzimática ocorre quando a enzima desestabiliza as micelas de caseína
por hidrólise da K-caseína, formando-se micelas de para-K-caseína, sendo uma fase
proteolítica. Na fase secundária, mediada pelo cálcio, micelas de para-K-caseína se agregam
Amostras Neu5Gc (mg/L) Neu5Ac (mg/L) Ácido siálico (mg/L)
T1 14,6 (±0,735)a 20,5 (±0,932)a 35,1
T2 9,2 (±1,142)b 14,3 (±1,322)b 23,5
Amostras Neu5Gc (mg/L) Neu5Ac (mg/L) Ácido siálico (mg/L)
LT1 111,0 (±3,495)A 181,1 (±11,900)A 292,1
LT2 73,2 (±5,808)B 114,4 (±5,514)B 187,6
41
em condições de repouso e temperatura superior a 20 °C, ocorrendo a coagulação do leite e a
obtenção do soro.13,14 Na coagulação mista, além da ação da enzima, houve também a ação da
cultura starter. A cultura bacteriana mesófila homofermentativa utilizada no tratamento misto
(T2, LT2) é composta por Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris.
O Lactococcus lactis subsp. lactis é levemente proteolítico, com fraca produção de gás,
produzindo sabor e aroma puro, fresco e ácido ao queijo; o Lactococcus lactis subsp. cremoris,
atua como principal acidificante e nos estágios iniciais da maturação do queijo. Para realizarem
seu metabolismo, estas bactérias também necessitam da lactose, pois realizam a glicólise.5
Acreditamos que essa cultura possibilitou a redução desses nutrientes para desempenharem a
sua função, o que foi repercutido no soro. Tendo em vista que o ácido siálico está presente como
glicoconjugado,15 houve também a redução desse nutriente.
Os soros liofilizados apresentaram um melhor rendimento do ácido siálico em relação
aos soros líquidos, tendo em vista que a secagem à frio possibilitou a concentração dos
nutrientes dos soros, apresentando uma maior quantificação. No entanto, liofilizar alimentos é
uma técnica cada vez mais utilizada, atualmente, pois durante o processo propriedades físico-
químicas e sensoriais do produto são preservadas.16
Os níveis de ácido siálico em leite humano e bovino, assim como em fórmulas para
lactentes já foram estudados anteriormente. No colostro humano, os níveis de ácido siálico
podem chegar perto de 2000 mg/L, mas reduzir para um nível de cerca de 200-300 mg/L, após
a 10ª semana de lactação. O colostro bovino também contém níveis mais elevados de ácido
siálico (~600 mg/L) em relação ao leite, mas os níveis são inferiores aos do leite humano. De
fato, alguns estudos sugerem que o total de ácido siálico no leite bovino pode ser tão baixo
quanto 10-65 mg/L.17,18,19,20 O presente estudo quantificou uma faixa de 23,5 mg/L a 292,1
mg/L de ácido siálico presente nos soros (líquidos e liofilizados) de queijo caprino. Esse
resultado é relevante quando comparados ao leite bovino, tendo em vista que o soro é um
subproduto da produção do queijo.
Useh et al. (2008)21 analisaram os níveis de ácido siálico no colostro e no leite de
ruminantes. Assim, identificaram o mesmo em leite bovino, ovino e caprino, obtendo os
valores: 17,13g/dL; 9.68 g/dL; 11.25 g/dL, respectivamente. Estas quantidades são superiores
ao encontrado neste estudo, sendo este fato previamente esperado, por se tratar de um derivado
lácteo. Quanto a concentrações de ácido siálico em produtos lácteos infantis reconstituídos,
Spichtig et al. (2010)6 encontraram valores oscilando de 65 a 288 mg/L. Este resultado se
aproxima com os do soro de queijo caprino liofilizados (LT1 e LT2), assim, podem ser
42
considerados como um ingrediente de potencial para utilização em fórmulas lácteas infantis,
devido a otimização na concentração do nutriente e maior conservação do produto.
O estudo recente de Sousa et al., 20158 analisou a concentração de ácido siálico em leite
caprino durante o período de lactação, com a mesma metodologia utilizada nas amostras de
soro deste trabalho, e obtiveram uma oscilação de 46,5 mg/100g a 12,2 mg/100g do ácido
siálico. Para Neu5Gc a variação foi de 28,80 a 7,40 mg/100g e para o Neu5Ac foi de 17,70 a
4,80 mg/100g. Estes valores são superiores aos resultados encontrados neste estudo. Os
resultados de soro de queijo caprino inferiores ao leite caprino se justificam por o soro ser um
produto derivado da produção de queijos que apresenta 55% de todos os nutrientes do leite, e
pelo fato de que no colostro a quantidade do nutriente é maior em relação ao leite e,
consequentemente, ao soro. Em virtude da presença de nutrientes como esses, ele é considerado
um produto com elevado potencial funcional,1,22 valioso e importante para a indústria de
alimentos.
O estudo sobre a concentração do ácido siálico em outras fontes lácteas é importante
devido as funções biológicas desempenhadas em diversas etapas do processo de saúde e doença
principalmente na infância.23,24 Interação celular e molecular, diferenciação e proliferação
celular, carcinogênese, proteção contra patógenos entéricos, prebiótico, ativação do sistema
imune, desenvolvimento cerebral e atuação na memória e aprendizado, são algumas das funções
relacionadas a este composto, que é obtido em maiores concentrações no leite materno,25,26,27
mas que pode ser encontrado em derivados lácteos, como o soro de queijo.
As quantidades desse nutriente obtidas neste estudo são relevantes para a indústria de
alimentos, devido ao soro de queijo corresponder a quase totalidade (85 e 95%) em volume do
leite após coagulação. A produção de queijos na indústria utiliza milhares de litros de leite, e
com isso uma elevada quantidade de soro é produzida, não sendo aproveitada
adequadamente.1,2,3
Conclusão
Este estudo apresenta nova vantagem para a utilização do soro de queijo pelas indústrias,
devido a quantidade desse importante nutriente encontrado. A coagulação enzimática preserva
o ácido siálico (Neu5Gc e Neu5Ac) mais eficientemente do que a coagulação mista. O processo
de liofilização dos soros seria a forma mais indicada para a obtenção do nutriente e para a sua
aplicação como ingrediente. Desse modo, estes elementos no soro de queijo caprino são uma
fonte potencial de compostos bioativos com efeitos benéficos para a saúde humana, podendo
ser utilizado como ingrediente funcional em alimentos.
43
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
No presente estudo, foi quantificado pela primeira vez a concentração de Ácido siálico,
N-glicolilneuramínico e N-acetilneuramínico, em soro de queijo caprino. Já foi ressaltado a
importância dessa substância na fisiologia humana, visto que proporciona uma série de
benefícios, principalmente, a saúde cognitiva infantil.
Os tipos de coagulação empregados foram os mais acessíveis e utilizados na indústria
de laticínios, durante a produção de diversos tipos de queijos. Foi confirmado que, embora o
soro seja um produto derivado desses processamentos, ele contém nutrientes funcionais, sendo
uma alternativa para ser reaproveitado. Foi destacada, neste estudo, a coagulação enzimática
como a mais eficiente na preservação do ácido siálico, sendo este tipo de coagulação a mais
empregada pelos pequenos produtores e cooperativas de leite e derivados.
O método analítico foi eficiente na separação, identificação e quantificação dos
nutrientes analisados. A liofilização dos soros mostrou-se eficaz na concentração do nutriente,
possibilitando a indústria uma nova perspectiva de realçar o valor nutricional dos produtos que
contém o Sia.
Este estudo ressalta a importância de produtos regionais na alimentação humana. O leite
de cabra do Nordeste brasileiro já é mencionado na literatura como funcional. Um de seus
derivados, o soro, que muitas vezes é considerado resíduo, também contém o mesmo nutriente
já identificado e quantificado no leite. É necessário que outros produtos lácteos a base de leite
e soro de queijo caprinos sejam analisados quanto a identificação e concentração de ácido
siálico. Estudos biológicos também são importantes para confirmar os efeitos do Sia já
mencionados na literatura.
O soro de queijo de cabra pode ser uma alternativa econômica e ecologicamente viável
para a indústria de alimentos inserir em produtos destinados à alimentação de crianças.
44
REFERÊNCIAS AGUIRRE-EZKAURIATZA, E.J; AGUILAR-YÃNÉZ, J.M.; RAMÍREZ-MEDRANO, A.; ALVAREZ, M.M. Production of probiotic biomass (Lactobacillus casei) in goat milk whey: Comparison of batch, contínuos and fed-batch cultures. Bioresouce Tecnology, v. 101, n. 8, p. 2837-2844, 2010. AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A. Biotecnologia Industrial: biotecnologia na produção de alimentos. São Paulo: Edgard Bllucger, v. 4, p. 523, 2001. BARDOR, M.; NGUYEN, D. H.; DIAZ, S.; VARKI, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 6, p. 4228–37, 2005. BODE, L.; RUDLOFF, S.; KUNZ, C.; STROBEL, S.; KLEIN, N. Human milk oligosaccharides reduce platelet-neutrophil complex formation leading to a decrease in neutrophil beta 2 integrin expression. Journal of Leukocye Biology, v. 76, n. 4, p. 820-826, 2004. BOEHM, G.; STAHL, B. Oligosaccharides. In T. Mattila, & M. Saarela (Eds.), Functional dairy products, p. 203–43, Cambridge, England: Woodhead Publishing Limited, 2003. BUENO, L.M.C. Leite de cabra – excelente alimento funcional. Revista Leite e Derivados, n. 83, p. 52-60, 2005. CARDEN, D. L.; GRANGER, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology, v. 190, n. 3, p. 255-266, 2000. CARLSON, S. E. N-acetylneuraminic acid concentrations in human milk oligosaccharides and glycoproteins during lactation. The American Journal ofClinical Nutrition, v. 41, n. 4, p. 720–726, 1985. CARVALHO, F.; PRAZERES, A.R.; RIVAS, J. Cheese whey wastewater: Characterization and treatment. Science of the Total Environment, v. 445–446, p. 385–396, 2013. CASTRO, W.F.; CRUZ, A.G.; RODRIGUES, D.; GHISELLI, G.; OLIVEIRA, C.A.F.; FARIA, J.A.F.; GODOY, H.T. Effects of different whey concentrations on physicochemical characteristics and viable counts of starter bacteria in dairy beverage supplemented with probiotics. Journal of Dairy Science, v. 96, n. 1, p. 96–100, 2013. CORREIA, R.T.P., CRUZ, V.M.F. Leite de cabra e derivados. ACOSC–Associacao dos Criadores de Ovinos e Caprinos do Sertao do Cabugi. Bulletin. 2006. CORNALE, P.; RENNA, M.; LUSSIANA, C.; BIGIB, D.; CHESSA, S.; MIMOSI, A. The grey goat of Lanzo valleys (Fiurinà): breed characteristics, genetic diversity, and quantitative-qualitative milk traits. Small Ruminant Research, v. 116, p. 1-13, 2014. COSTA, R. G.; DAL MONTE, L. B.; PIMENTA FILHO, E. C.; HOLANDA JUNIOR, E. V.; CRUZ, G. R. B. MENEZES, M. P. C. Typology and characterization of goat milk production
45
systems in the Cariris Paraibanos. Brazilian Journal of Animal Science, v. 39, n. 3, p. 656-666, 2010. COSTA, R. G.; QUEIROGA, R. C. R. E.; PEREIRA, R.A.G. Influência dos alimentos na produção e qualidade do leite de cabra. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 38, p. 307-321, 2009. DADDAOUA, A.; PUERTA, V.; REQUENA, P.; MARTINEZ-FEREZ, A.; GUADIX, E.; MEDINA, F.Goat milk oligosaccharides are anti-inflammatory in rats with hapten induced colitis. Journal of Nutrition, v. 136, n. 3, p. 672-676, 2006. GARCIA, V.; ROVIRA, S.; BOUTOIAL, K.; LOPEZ, M. B. Improvements in goat milk quality: a review. Small Ruminant Research, v. 121, n.1, p. 51-57, 2014. GARCIA, E.F., OLIVEIRA, M.E.G., MACHADO, T.A.D., QUEIROGA, R.C.R.E. & SOUZA, E.L. Development and quality of a Brazilian semi-hard goat cheese (coalho) with added probiotic lactic acid bacteria. International Journal of Food Sciences and Nutrition, v. 63, p. 947–956, 2012. GHADERI, D.; TAYLOR, R.E.; PADLER-KARAVANI, V.; DIAZ, S.; VARKI, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nature Biotechnology, v. 28, p. 863–867, 2010. HAENLEIN, G. F. W.; ANKE, M. Mineral and trace element research in goats: a review. Small Ruminant Research, v.95, n.1, p. 2-19, 2011. HAENLEIN, G.F.W. Goat milk in human nutrition. Small Ruminant Research, v. 51, n.1, p.155-163, 2004. HEDLUND, M.; TANGVORANUNTAKUL, P.; TAKEMATSU, H.; LONG, J. M.; HOUSLEY, G. D.; KOZUTSUMI, Y.; SUZUKI, A.; WYNSHAW-BORIS, A.; RYAN, A. F.; GALLO, R.; VARKI, N.; VARKI, A. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Molecular and Cellular Biology, v. 27, n. 12, p. 4340–3446, 2007.
HERNANDEZ-LEDESMA, B.; RECIO, I.; AMIGO, L. Lactoglobulin as source of bioactive peptides. Amino Acids, v. 35, n. 2, p. 257–265, 2008. HERNANDEZ-LEDESMA, B.; RAMOS, M.; GOMEZ-RUIZ, J.A. Bioactive components of ovine and caprine cheese whey. Small Ruminant Research.v.101, n. 1-3, p. 196– 204, 2011. ICH, Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), 4ver., p.1, 1994. IDOTA, T.; KAWAKAMI, H.; MURAKAMI, Y.; SUGAWARA, M. Inhibition of cholera toxin by human milk fractions and sialyllactose. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 59, n. 3, p. 417–419, 1995. JELEN, P. Whey processing: utilization and products. In: Roginski, H., Fuquay, J.W., Fox, P.F. (Eds.), Encyclopedia of dairy sciences, vol. 4. Academic Press (Elsevier Science), London, p. 2739–2745, 2003.
46
KALANTZOPOULOS, G., DUBEUF, J.-P., VALLERAND, F., PIRISI, A., CASALTA, E., LAURET,A., TRUJILLO, T. Characteristics of sheep and goat milks: qualityand hygienic factors for the sheep and goat dairy sectors. Internation Dairy Federation, n. 390, p. 17–28, 2004. KUNZ, C.; RUDLOFF, S.; BAIER, W.; KLEIN, N.; STROBEL, S. Oligosaccharides in human milk: Structural, functional and metabolic aspects. Annual Review in Nutrition, v. 20, p. 699-722, 2000. LACOMBA, R.; SALCEDO, J.; ALEGRÍA, A.; LAGARDA,M.J.; BARBERÁ,R.; MATENCIO, E. Determination of sialic acid and gangliosides in biological samples and dairy products: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 51, n. 2, p. 346–357, 2010. LAMARI, F.N.; KARAMANOS, N.K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. Journal Chromatography B, v. 781, n. 1-2, p. 3–19, 2002.
LARSON, E.; CELI, A.; GILBERT, G. E.; FURIE, B. C.; ERBAN, J. K.; BONFANTI, R. PADGEM protein: A receptor that mediates the interaction of activated platelets with neutrophils and monocytes. Cell, v. 59, p. 305-312, 1989.
LEROY, F.; DE VUYST, L. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends in Food Science & Technology, v. 15, n. 2, p. 67–78, 2004. LINNARTZ-GERLACH, B.; MATHEWS, M.; NEUMANN, H. Sensing the neuronal glycocalyx by glial sialic acid Binding immunoglobulin-like lectins. Neuroscience, v. 275, p. 113–124, 2014.
LUHOVYY, B.L., AKHAVAN, T., ANDERSON, G.H. Whey proteins in the regulation of food intake and satiety. Journal of the American College of Nutrition, v.26, n. 6 p. 704S–712S, 2007. MADUREIRA, A. R., M; AMORIM, A. M.; GOMES, M. E.; PINTADO, and F. X. MALCATA. Protective effect of whey cheese matrix on probiotic strains exposed to simulated gastrointestinal conditions. Food Reseach International. v.44, p.465–470, 2011. MADUREIRA, A.R.; TAVARES, T.; GOMES, A.M.P.; PINTADO, M.E.; MALCATA, F.X. Invited review: physiological properties of bioactive peptides obtained from whey proteins. Journal Dairy Science, v. 93, n. 2, p. 437–455, 2010. MARTINEZ-FEREZ, A.; RUDLOFF, S.; GUADIX, A.; HENKEL, A.; POHLENTZ, G.; BOZA, J. Goat’s milk as a natural source of lactose-derived oligosaccharides: isolation by membrane technology. International Dairy Journal, v. 16, n. 2, p. 173-181, 2006. MAWSON, A.J. Bioconversions for whey utilization and waste abatement. Bioresource Technology, v. 47, n. 3, p. 195–203, 1994.
47
MEHRA, R.; KELLY, P. Milk oligosaccharides: structural and technological aspects. International Dairy Journal. v.16, p. 1334–1340, 2006. MEYRAND, M.; DALLAS, D. C.; CAILLAT, H.; BOUVIER, F.; MARTIN, P.; BARILE, B. Comparison of milk oligosaccharides between goats with and without the genetic ability to synthetize αs1-casein. Small Ruminant Research, v. 113, n. 2-3, p. 411-420, 2013. MIYAGI. T.; YAMAGUCHI, K. Mammalian sialidases: physiological and pathological roles in cellular functions. Glycobiology, v. 22, n. 7, p. 880–896, 2012.
MORAND-FEHR, P., BOUTONNET, J.P., DEVENDRA, C., DUBEUF, J.P., HAENLEIN,G.F.W., HOLST, P., MOWLEM, L., CAPOTE, J. . Strategy for goat farming in the 21st century. Small Ruminant Research,v. 51, p. 175–183, 2004. NAKAMURA, T.; URASHIMA, T. The milk oligosaccharides of domestic farm animals. Trends in Glyco Science and Glyco technology, v. 16, n.88, p. 135–142, 2004. OLIVEIRA, C. J. B.; HISRICH, E. R.; MOURA, J. F. P.; GIVISIEZ, P. E. N.; COSTA, R. G.; GEBREYES, W. A. On farm risk factors associated with goat milk quality in Northeast Brazil. Small Ruminant Research, v. 98, p. 64-69, 2011. OLIVEIRA, D.L.; WILBEY, R.A.; GRANDISON, A.S.; DUARTE, L.C.; ROSEIRO, L.B. Separation of oligosaccharides from caprine milk whey, prior to prebiotic Evaluation. International Dairy Journal, v. 24, p. 102-106, 2012. PADLER-KARAVANI, V.; YU, H.; CAO, H; CHOKHAWALA, H.; KARP, F.; VARKI, N.; CHEN, X; VARKI, A. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: Potential implications for disease. Glycobiology, v. 18, n. 10, p. 818–830, 2008. PANESAR, P.S.; KENNEDY, J.F.; GANDHI, D.N.; BUNKO, K. Bioutilisation of whey for lactic acid production. Food Chemistry, v. 105, n. 1, p. 1-14, 2007. PARKKINEN, J.; FINNE, J.; ACHTMAN, M.; VAISANEN, V.; KORHONEN, T. K. Escherichia coli strains binding neuraminyl alpha 2–3 galactosides. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 111, n. 2, p. 456–461, 1983.
PARK, Y.W. Bioactive components in goat milk. In: Park, Y.W. (Ed.), Bioactive Components in Milk and Dairy Products. Wiley- Blackwell/John Wiley & Sons, Ltd. Publication, p. 43–81, 2009. PARK, Y.W., JÚAREZ, M., RAMOS, M., HAENLEIN, G.F.W. Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Research, v. 68, n. 1-2, p. 88–113. 2007. PERRY, K. S. P. Queijos: aspectos químicos, bioquímicos e microbiológicos. Quimica Nova, v. 27, n. 2, p. 293–300, 2004.
48
PRAZERES, A.R.; CARVALHO, F.; RIVAS, J. Cheese whey management: A review. Journal of Environmental Management, v. 110, n. 15 p. 48-68, 2012. PROLO, L. M.; VOGEL, H.; REIMER, R. J. The lysosomal sialic acid transporter sialin is required for normal CNS myelination. Journal of Neuroscience, v. 29, n. 49, p. 15355-15365, 2009. RANI, M.; VERMA, N. S. Changes in organoleptic quality during ripening of cheese made from cows and soya Milk blends, using microbial rennet. Food chemistry, v. 54, n. 4, p. 369 – 375. 1995. RAYNAL-LJUTOVAC, K.; LAGRIFFOUL, G.; PACCARD, P.; GUILLET, I.; CHILLARD, Y. Composition of goat and sheep milk products: an update. Small Ruminant Research, v. 79, n. 1, p. 57-72, 2008. RAYANAL-LJUTOVAC, K.; LE PAPE, M.; GABORITE, P.; BARRUCAND, P. French goat milk cheeses: an overview on their nutritional and sensorial characteristics and their impacts on consumers’ acceptance. Small Ruminant Research, v.101, n. 1-3, p. 64-72, 2011. REINKE, S. O.; LEHMER, G.; HINDERLICH, S.; REUTTER, W. Regulation and pathophysiological implications of UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase (GNE) as the key enzyme of sialic acid biosynthesis. The Journal of Biological Chemistry, v. 390, n. 7, p. 591–599, 2009.
RUDLOFF, S.; STEFAN, C.; POHLENTZ, G.; KUNZ, C. Detection of ligands for selectins in the oligosaccharide fraction of human milk. European Journal of Nutrition, v. 41, n. 2, p. 85-92, 2002. SÁNCHEZ-DIAZ, A.; RUANO, M. J.; LORENTE, F.; HUESO, P. A critical analysis of total sialic acid and sialoglycoconjugate contents of bovine milk-based infant formulas. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, v. 24, n. 4, p. 405– 10, 1997.
SÁNCHEZ-MACÍAS, D.; MORALES-DELANUEZ, A.; TORRES, A.; HERNÁNDEZ-CASTELLANO, L.E.; JIMÉNEZ-FLORES, R.; CASTRO, N.; ARGÜELLO, A. Effectsof addition of somatic cells to caprine milk on cheese quality. International Dairy Journal, v. 29, n. 2 p. 61-67, 2013. SANMARTÍN, B.; DÍAZ, O.; RODRÍGUEZ-TURIENZO, L.; COBOS, A. Composition of caprine whey protein concentrates produced by membrane technology after clarification of cheese whey. Small Ruminant Research, v. 105, n. 1-3, p. 186– 192, 2012. SANMARTÍN, B.; DÍAZ,O.; RODRÍGUEZ-TURIENZO, L.; COBOS, A. Functional properties of caprine whey protein concentrates obtained from clarified cheese whey. Small Ruminant Research, v. 110, n. 1 p. 52– 56, 2013. SCHON, M. P..;KRAHN, T.; SCHON, M.; RODRIQUEZ, M.-L.; ANTONICEK, H.; SCHULTZ, J. E. Efomycine M, a new specific inhibitor of selectin, impairs leukocyte adhesion and alleviates cutaneous inflammation. Nature Medicine, v.8, p. 366-372, 2002.
49
SIGMASTAT (programa de computador). Versão 2.03. Point Richmond (Califórnia): Comercial; 2009. SILANIKOVE, N.; LEITNER,G.; MERIN,U.; PROSSER, C.G. Recent advances in exploiting goat’s milk: Quality, safety and production aspects. Small Ruminant Research, v.89, n. 2-3 p. 110–124, 2010. SILVA, M.S.S.; FIGUEIRÊDO, R.M.F.; QUEIROZ, A.J.M.; SANTIAGO, V.M.S. Avaliação físico-química e sensorial de doces cremosos produzidos com soro de leite de cabra, leite de vaca e polpa de umbu. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.13, n. especial, p.397-410, 2011. SILVA, P. D. L.; BEZERRA, M. F.; PEDRINI, M. R. S.; MAGALHÃES, M. M. A.; CORREIA, R. T. P. Leite de cabra: aspectos produtivos e nutricionais. Revista do Instituto de LaticíniosCândidoTostes, v. 62, p.32-35, 2007. SILVEIRA, E.O.; LOPES NETO, J.H.; SILVA, L.A.; RAPOSO, A.E.S.; MAGNANI, M.; CARDARELLI, H.R. The effects of inulin combined with oligofructose and goat cheese whey on the physicochemical properties and sensory acceptance of probiotic chocolate goat dairy beverage. LWT- Food Science and Tecnology, v. 62, n. 1, p. 445-451, 2015. SOUSA, Y.R.F.; VASCONCELOS, M.A.S.; COSTA, R.G.; AZEVEDO FILHO, C.A.; PAIVA, E.P.; QUEIROGA, R.C.R.E. Sialic acid content of goat milk during lactation. Livestock Science, v. 117, p. 175-180, 2015. SPICHTIG, V.; MICHAUD, J.; AUSTIN, S. Determination of sialic acid in milks and milk-based products. Analytical Biochemistry, v. 405, n. 1, p. 28-40, 2010. THEODOSIOU M, LAUDET V, SCHUBERT M. From carrot to clinic: an overview of the retinoic acid signaling pathway. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 67, n. 9, p. 1423-45, 2010. TOMOTAKE, H.; OKUYAMA, R.; KATAGIRI, M.; FUZITA, M.; YAMATO, M.; OTA, F.; Comparison between Holstein cow’s milk and Japanese-Saanen goat’s milk in fatty acid composition, lipid digestibility and protein profile. Bioscience Biotechnology Biochemistry v.70, n. 11, p.2771-2774, 2006. TZANAKAKIS,G.N.; SYROKOU, A.; KANAKIS, I.; KARAMANOS, N. Determination and distribution of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids in culture media and cell-associated glycoconjugates from human malignant mesothelioma and adenocarcinoma cells. Biomedical Chromatography, v. 20, n.5, p. 434–439, 2006. URASHIMA, T.; SAITO, T.; NAKAMURA, T.; MESSER, M. Oligosaccharides of milk and colostrum in non-human mammals. Glycoconjugate Journal, v.18, n. 5, p. 357–371, 2001. VARKI, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology, v. 3, n. 2, p. 97–130, 1993.
VARKI, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid recognizing proteins, Nature, v. 446, p. 1023–1029, 2007.
50
WANG, B.; BRAND-MILLER, J.; MCVEAGH, P.; PETOCZ, P. Brain sialic acid concentration: comparison of breast-fed vs formula-fed infants. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, v. 10, 2001b, S-34p.
WANG, B.; BRAND-MILLER, J.; MCVEAGH, P.; PETOCZ, P. Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas. American Journal of Clinical Nutrition, v. 74, n. 4, p. 510–515, 2001a.
WANG, B.; BRAND-MILLER, J. The role and potential of sialic acid in human nutrition. European Journal of Clinical Nutrition, v. 57, p. 1351-1369, 2003. WILLISON, H.J. Gangliosides as targets for autoimmune injury to the nervous system. Journal of Neurochemistry, v. 103, n. s1, p. 143–149, 2007. YALCIN, A.S. Emerging therapeutic potential of whey proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design, v.12, n. 13, p. 1637–1643, 2006. YIN, J.; HASHIMOTO, A.; IZAWA, M.; MIYAZAKI, K.; CHEN, G. Y.; AKEMATSU, H.; KOZUTSUMI, Y.; SUZUKI, A.; FURUHATA, K.; CHENG, F.; LIN, C.; SATO, C.; KITAJIMA, K.; KANNAGI, R. Hypoxic culture induces expression of sialin, a sialic acid transporter, and cancer-associated gangliosides containing non-human sialic acid on human cancer cells. Cancer Research, v. 66, p. 2937-2945, 2006. YOO, S. W.; MOTARI, M. G.; SUSUKI, K.; PRENDERGAST, J.; MOUNTNEY, A.; HURTADO, A.; SCHNAAR, R. L. Sialylation regulates brain structure and function. The FASEB Journal, v. 29, n. 7, p. 3040-3053, 2015.
