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COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA

Identificação Através de PCR dos Genes CryI de Cepas de Bacillusthuringiensis Berliner Eficientes Contra a Lagarta do Cartucho,

Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)

FERNANDO H. V,\L1CENTE. MARUTON R. BARRETO. MARIA J. Y. DE VASCONCELOS,

JOSI~ E.F. DE FIGUEIREDO E EDILSON PAIVA

. Núcleo de Biologia Aplicada, Embrapa Milho Sorgo, Caixa postal 151,35701-970, Sete Lagoas, MG.

An. Soc. Entorno!. Brasil 29( I): 147-153 (2000)

PCR Idcntification 01' Cry I Gcnes in Bacillus thuringiensis Strainsthat are Elficicnt Against Fali Armyworm Spodoptera jrugiperda

(lE. Smith) (Lcpidoptera: Noctuidae)

ABSTRACT - Fali arrnyworm, Spodoptera jrugiperda (J. E. Smith), is the mostimportant maize insect pest in Brazil and its damage can reduce yield up to34%. Thc objcctivc 01' this work was to utilize the PCR technique to IdentifyBacillus thuringiensis (B.t) strains that control S. frugiperda in maize crops.B ioassays showed that 16 strains werc very cffective against S. frugiperda, 1501' thcrn collcctcd Irom soil samples and one (T09) obtained at the InstitutePasteur. Thc DNA 01' ihcsc strains were probed with cryl general primers andtheir protcins wcre unaliscd by SDS-PAGE eletrophoresis. Ali strains presentpositive rcsults ror crvl genes. To Iurther characterize these strains, specificcryl primers were crnploycd. PCR technique showed that some strains harbourthe sarnc crvl genes. Thc only diífcrcncc was lhe amplification of an unex-pcctcd Iragmcnt 01' approxirnatcly 160bp when a mixture of cryl H and crylDspccific primcrs was uscd. Analysis by phasc contrast microscope showed thatcrystal proteins produccd by thcse strains were ali bipyramidal crystals. Also,eltrophorctic analysis 01' prorcins by SDS-PAGE showed the same protein bandingpaucrn for most 01' the strains.

KEY WORDS: Insccta, cryl genes, biocontrol, fali armyworm.

Bacilhts thuringiensis é uma hactériagram positiva que ocorre naturalmente nosolo, água. insetos mortos e ambientes ondese armazenam grãos (Lambeu & Pcfcroen,1992). Durante a fase de csporulação o B.thuringiensis produz um esporângio quecontém um endosporo e inclusões protcicascristalinas (d-endotoxinas) que são tóxicaspara um grande número ele insetos. Estas

proteínas podem perfazer até 1/3 do total deproteínas da célula (Herrnstadt et alo 1986).As delta endotoxinas são sintetizadas na formade pró-toxinas que quando ingeridas peloinseto são solubilizadas e convertidas pro-ieoliticamente em fragmentos tóxicos de apro-ximadamente 650 aminoácidos. Essesfragmentos ligam-se especificamente, e comalta afinidade, a receptores protéieos na mern-

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brana das células epiteliais do intestino,criando poros na membrana celular. Essaslesões levam ao dilatamento e lise do epitéliointestinal, causando a morte do inseto (Gill etai. 1992, Lambert & Peferoen 1992, Visseret ai. 1990, Li et ai. 1991).

As toxinas do B. th uringiensis sãocodificadas pelos genes cryI, CI},n, cl}'III,cryl V, CI}>V e cyrA. A classificação destesgenes está relacionada com a atividadebiológica dos seus produtos. Deste modo, astoxinas codificadas pelos genes cryI sãotóxicas para lepidópteros, cl},n para dípterose lepidópteros, crylfl para coleópteros, cryIVpara dípteros e cryV para nematóides (Gill etal. 1992, Koziel et aI. 1993, Cerón et ai. 1995).

O método da PCR (Polyrnerase ChainReaction - Reação da Polimerase em Cadeia)tem-se mostrado uma ferramenta poderosa nadetecção de genes com ação inseticidaespecíficos em diferentes cepas de B.thuringiensis (Carozzi et ai. 1991, Bourqueet. ai. 1993, , Ccrón et ai. 1994, Cerón et aI.1995). A PCR também tem mostrado grandepotencial na identificação de novos genes cry,como relatado por Kalman et ai. 1993, que ausou para identificar genes cryIC.

A lagarta do cartucho do milho,Spodoptera frugiperda (l.E. Smith) é uma dasprincipais pragas da cultura do milho e podecausar danos de até 34% na produção de grãos(Carvalho 1970, Cruz 1996). O controle destapraga é feito basicamente com inseticidasquímicos, sendo que o controle através do usode patógenos pode se tornar uma alternativaviável. Krieg & Langenbruch (1981) relatamque a lagarta do cartucho pode ser controladapor B. th urin giensis (sorovariedadesthuringiensis e kurstakii, mas não informama percentagem de mortalidade das larvas. Domesmo modo, Hernandez (1988) relata queB. thuringiensis var. kenyae e var. tolworthicausaram mortalidade de 100% em lagartasde S. [rugiperda, em duas doses testadas.Entretanto, Beegle & Yamamoto (1992)afirmam que Spodoptera spp. não é afetadapor B. thuringiensis do mesmo modo queoutras pragas, tais como: Trichoplusia ni eHeliothis virescens. O objetivo deste trabalho

Valicente et ai.

foi detectar dentre as cepas de B. thuringiensisque causam mortalidade acima de 75%(eficientes) em lagartas de S. frugiperda,aquelas que contenham os genes cryI, atravésda técnica da PCR.

Biensaios: A partir do isolamento debactérias que possuíam esporos e cristais deB. thuringiensis, prepararam-se suspensõescom bactérias em 5 ml de água destilada, queforam aplicadas em pedaços de dieta artifi-cial. As lagartas, juntamente com a dietainoculada, foram colocadas individualmenteem copos descartáveis de 50 ml, tampadoscom tampas de acrílico. Foram utilizadas 24lagartas, de dois a três dias de idade, criadasem laboratório, por cepa de B. thuringiensis.Avaliações, diárias, foram realizadas paraconstatação da mortalidade de lagartasinfectadas por B. thuringiensis. Durante osbioensaios, as lagartas permaneceram sobtemperatura ambiente.

As lagartas infectadas foram armazenadassob temperatura ambiente e, diariamente,avaliações foram realizadas para constataçãoda mortalidade das mesmas. Foram utilizadas24 lagartas, de dois a três dias de idade ecriadas em laboratório, por cepa de B.thuringiensis.

Cepas bacterianas: As cepas de B.t. 344,348, 426, 460, 461 A, 462 A, 474, 520 A,520 B, 566 BPR, 566 BLR, 7 A, 7 A*, 7 B I,7 B8, 701, 702, 734 e 739 foram isoladas, deamostras de solo coletadas em diversasregiões do Brasil, no laboratório de ControleBiológico do Centro Nacional de Pesquisa deMilho e Sorgo da Embrapa, localizado emSete Lagoas, MG. A cepa T09, cedida peloInstituto Pasteur (França) e as cepas HD 73 eHD 125, cedidas pela UNAM (México),foram usadas como controle.

Primers para uso em PCR: Os primersutilizados neste trabalho foram os mesmosdescritos por Cerón et ai. 1994 e Cerón et alo1995. Foram utilizados primers gerais(Carozzi et ai. 1991) para detectar genes cryle depois, para uma caracterização maisaprofundada, foram utilizados primersespecíficos para os mesmos genes, que sãoos específicos para lepidópteros.

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Preparação da amostra e PCR: As cepasde B. thuringiensis foram crescidas por 12horas em placas de Petri contendo ágarnutriente. Uma alçada de bactérias de umasimples colônia foi transferida para 100111deágua milliQ e a mistura foi deixada no freezera - 80°C por 15 minutos e imediatamente após,colocada em água fervente por 10 minutos.Após este período, 5111foram usados como aamostra de DNA na mistura. Na mistura finalde 50111para o uso no termociclador, foramusados 2,5U da cnzima Taq DNA polimerase,O,I a 0,5111de cada um dos primers usados nareação e 2,5mM de cada um dos quatrodesoxynucleosídeos trifosfatos (dNTP's). Aamplificação foi realizada em termocicladorusando uma etapa de desnaturação única (2minutos a 95°C), seguida de 30 ciclos (cadaciclo composto por uma fase de desnaturaçãoa 95°C por I min., uma de hibridação a 48°Cpor I mino e uma extensão a 72°C por I min.).A temperatura de hibridação para o primer

nal a 72°C por 5 mino Um total de 15 111decada mistura da PCR foi usado em gel deagarose a 3% em buffer 0,5 x Tris-borato, a100V por 180 a 210 mino e, coradas combrometo de etídeo.

Biensaios: Das 23 cepas utilizadas noexperimento, 15 apresentaram percentual demortalidade superior a 75% e foramconsideradas eficientes. Duas delas (734 e739), somente utilizadas nas análises deproteínas dos cristais, apresentaram 0% demortalidade quando administradas a lagartasde S. [rug ipe rda. As cepas 7A e 7 A *apresentaram percentual de mortalidademédio de 4,4%. No grupo controle, as cepasT09, T09 P foram consideradas eficientes eas cepas HD 73 e HD 125, apresentaramíndice de mortalidade de 31 e 65,2%,respectivamente (Tabela I).

Uso de primers gerais para genes eryI: Atécnica da PCR foi utilizada para detectar ascepas que continham os genes eryI. Para tal,

Tabela I. Mortalidade (%) causada por diferentes cepas de B. thuringiensis em lagartas deS. frugiperda.

Cepa Quantidade de Mortalidade Cepa Quantidade de Mortalidadelagartas (0/0) lagartas (0/0)

Inicial Mortas Inicial Mortas

344 23 22 95,6 702 4\ 40 97,6348 24 22 88,3 7 B, 19 19 100426 22 19 86,4 7 Bx 41 37 90,2460 24 24 100 734 24 00 00461 A 23 22 95,4 739 24 00 00462 A 24 24 100 7A 22 01 4,5474 24 24 100 7 A* 23 01 4,3520 A 24 18 76,6 T09 24 22 9\,7520 B 22 21 95,6 T09 P 46 46 100566 BPR 24 22 90,9 HD73 22 07 31,0566 BLR 23 20 86,9 HD 125 23 15 65,2701 30 30 100

crylAb foi de 48°C, para cryIB e cryID foi de56°C e para os primers cry IE e cry IF foi de57°C. Foi também realizado uma extensão fi-

foi usado um par de primers que continhamseqüências dos genes cryl. O tamanhoesperado dos produtos gerados pela PCR

cry/: 788 701 702 V1O

Geral272 a 290pb

IAb216 pb

IB (367 p b )1D (290 p b )

TE147pb

IF177 pb

T09 HD73 HD125 344 348 426 460 461A 462A 474 520A 5208 566bpr 7 A

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Figura 1. Géis de agarose (3%) dos produtos obtidos através da PCR com o primers geral eespecíficos para o gene cry/.

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variavam de 272 a 290 pb. Os resultados foi de 216 pb, para cryIB foi de 367 pb, paravisual izados em gel de agarose (Fig. I), cryID foi de 290 pb, para cryIE foi de 147mostraram resultado positivo para genes cryI pb, para cryIF foi de 177 pb. Conformepara as cepas 344, 348,426,460,461 A, 462A, observado na Tabela 2, as cepas 344, 426,474, 520A, 520B, 566 BPR, 7A, 7B8, T09, e 461A, 520B, T09, T09P, 7A e HDI25testemunhas HD 73 e HD 125 (Tabela 2). apresentaram amplificações positivas para os

Tabela 2. Cepas de B. thuringiensis testadas com primer geral e primers específicos paraos diferentes genes CI)'I.

Cepas cryI

Geral Ab B D E F344 + + + + +348 + +426 + + + + +460 + +461 A + + + + +462 A + + + +474 + + + +520A + +520 B + + + + +566 BPR + +566 BLR * + +701 * * * * *702 * * * * *7A + + + + +7A* * +7B, * +7Bx + +T09 + + + + +T09 P * + + + +HD73 + +HD 125 + + + + +734 * * * * * *739 * * * * * *

Cepa não testada (*)Amplificação: presente (+) e ausente (-)

Uso de primers específicos para detecçãode genes cryI: Foram usadas misturas de prim-ers para amplificar regiões específicas dosgenes cryIA a cryIF. A análise permitiuidentificar genes específicos cryI, em cadacepa de B. thuringiensis, com base notamanho do produto final da PCR para cryIAb

mesmos primers (cryIAb, cryIB, cryID ecryIE). Na figura I, observa-se, também, quea maioria da cepas apresentou resultadopositivo para cryIAb, cryIE, poucas paraCI)'IB e cryID e nenhuma para cryIF.

Houve a amplificação de um fragmento,não esperado, de aproximadamente 160 pb,

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quando foi usada a mistura dos primers cryIBe cryID (Figura I). Todas as cepas trabalhadasapresentam os genes cryIAb, cryIB, czyl D ecryIE, mas não foram encontrados os genescryIC e C/)'IF. De acordo com a literatura, osgenes cryID e CI)'IC são os mais tóxicos paralagartas de S. frugiperda (Cerón et alo 1995).Entretanto, de acordo com Bohorova et alo(1997) os genes cryID, C/yIE e cryIF são maiseficientes no controle de S. [rugip erda,resultado este obtido em bioensaios realizadosno CIMMYTIMéxico (Centro Internacionalde Melhoramento de Milho e Trigo). Aamplificação de um fragmento não específicocom cerca de 160 pares de bases, é de tamanhosuperior ao gene cryIe.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao convênioPRONEXlFINEP - Projeto: Biologia Molecu-lar e Celular no Melhoramento de MilhoTropical, pelo apoio financeiro.

Literatura Citada

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Recebido em 05/10/98. Aceito em 27/10/99.