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Universidade de Mogi das Cruzes

Maruska do Rocio Neufert Fernandes

Composto Antimicobacteriano: microencapsulamento em polímeros biodegradáveis

Mogi das Cruzes, SP 2006

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Universidade de Mogi das Cruzes

Maruska do Rocio Neufert Fernandes

Composto Antimicobacteriano:

microencapsulamento em polímeros biodegradáveis

Orientador: Prof. Dr. Nelson Durán Mogi das Cruzes, SP

2006

Dissertação apresentada a Universidade de

Mogi das Cruzes para obter o título de

Mestre pelo programa de pós-graduação em

Biotecnologia.

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“Não importa o que é o mundo, O importante são os seus sonhos.

Não importa o que você é, O importante é o que você quer ser.

Não importa onde você está, Importa pra onde você quer ir.

Não importa o porquê, O importante é o querer.

Não importam as suas mágoas, O importante mesmo são suas alegrias.

Não importa o que já passou, O passado?

Guarde na lembrança. Nunca pense em julgar. Não veja, apenas olhe.

Não escute, apenas ouça. Não toque, sinta.

Acredite naquilo que quiser. E, não adianta sonhar,

Se você não lutar. O mundo é um espelho.

Não seja só o seu reflexo. Só acreditando num futuro

Você conseguirá a paz Para alcançar seus sonhos.

Afinal, o que importa?

Você importa. Acredite em você!”

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AGRADECIMENTOS

Grata ao que foi possível viver,

Choro saudades presentes

E sorrio as lembranças passadas.

Sigo meu caminho

Com olhos repletos de sonhos.

Esta noite há de fazer-me estrela

E clareá-los dentro de mim,

Iluminar caminhos, apontar-me o norte,

Acalmar-me com a chegada do sol...

No que deixei, no que colhi,

Deixei o melhor de mim

E retive o melhor do que me foi oferecido Assim, tornamo-nos o melhor de nós.

Ontem, hoje, para sempre.

(Aila Magalhães, modificado por Maruska Neufert)

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por me mostrar o caminho certo a seguir, por ter me dado forças nos

momentos de dificuldades e segurança nos momentos de fraqueza.

Agradeço ao melhor ser humano, amiga e companheira que é a minha mãe, Yara Neufert.

Sem o seu estímulo, confiança e credibilidade, eu não teria concluído mais este percurso em

minha vida.

Agradeço com paixão, a paciência, tranqüilidade e compreensão, que o meu companheiro

Carlos Roberto (Júnior!), teve comigo durante todo o decorrer do meu Mestrado.

Agradeço grandiosamente, ao professor Nelson Durán, que acreditou no meu trabalho e

na minha índole, me proporcionando um crescimento intelectual e racional da pesquisa e da

ciência.

Agradeço com carinho, aos meus companheiros de laboratório: Ana Paula, Carolina,

Chico, Dorival, Lívia, Patrícia, Rose, Sandra, Wellington e Zaine. Todos são muitos amigos e

compreensivos e, foram prestativos quando eu precisei de ajuda para tirar dúvidas ou para

colaborar no meu trabalho.

Em especial, agradeço a Priscyla Marcato, que hoje é minha melhor amiga e excelente

profissional. Ela me acolheu em sua casa quando precisei, me acalmou nas horas difíceis e me

ajudou muito no desenvolver deste trabalho.

Agradeço as minhas companheiras de casa: Bárbara, Eliana, Azize e Letícia que

conseguiram agüentar as minhas neuroses quando eu voltava da Unicamp após um experimento

ou mesmo, enquanto escrevia a dissertação.

Agradeço aos funcionários do Instituto de Química e da Engenharia Química da Unicamp,

o Daniel, a Claúdia e o Gilson que disponibilizaram à utilização do microscópio eletrônico de

varredura, o espectrofluorímetro e a centrífuga, respectivamente.

Agradeço ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Biologia: Patrícia, Maristela,

Neto, Yasmim e o Daniel que me auxiliaram com os experimentos celulares.

Agradeço ao Instituto de Pesquisa Tecnológica – IPT (USP): a professora Dra. Maria Inês

Ré, ao Pierre e a Natália que me auxiliaram nos equipamentos de medidas do potencial zeta e

tamanho de partículas.

6

Enfim, agradeço todo o conhecimento que adquiri com essas pessoas maravilhosas citadas

acima, entre outras que, indiretamente contribuíram para o meu projeto. E, quero que saibam que,

independente do rumo que eu tomar daqui para frente, todos vocês estarão nas minhas

lembranças.

Muito obrigada pela amizade e confiança de todos.

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RESUMO

O objetivo deste trabalho foi encapsular um antibiótico hidrofílico (AH) em micropartículas

poliméricas biodegradáveis de poli (ε-caprolactona) (PCL) que atuam sobre diversas bactérias

gram-positivas e gram-negativas e principalmente, contra a tuberculose.

As micropartículas de PCL com o AH foram obtidas pelo método de dupla emulsão (a/o/a)

seguida da evaporação do solvente. O solvente utilizado na fase orgânica foi o diclorometano e o

álcool polivinílico (PVA) como surfactante na fase aquosa. Na metodologia utilizada, diversos

parâmetros foram modificados, tais como, a quantidade de surfactante, a quantidade de polímero,

o modo de adição da primeira fase na fase externa e o modo de agitação. As micropartículas

obtidas foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), potencial zeta,

tamanho médio e distribuição de tamanho de partículas. A eficiência de encapsulamento, o

rendimento das micropartículas, a atividade antimicrobiana, a liberação sustentada do antibiótico

e a citotoxicidade foram avaliados.

As micropartículas poliméricas apresentaram uma morfologia esférica e superfície lisa, com

tamanho médio entre 20 µm a 80 µm e um rendimento de 80 %. A eficiência de encapsulamento

foi de aproximadamente 2 %. O antibiótico hidrofílico, apresentou uma carga de superfície

negativa e uma baixa polidispersidade. A atividade antimicrobiana do AH livre e encapsulado em

cepas de S. aureus, apresentou a mesma eficiência, apresentando uma inibição de 5 cm. A

citotoxicidade para as células de V79, no ensaio de DNA, o AH livre apresentou uma inibição de

50 % das células com 300 µMol/L e com as micropartículas de PCL, os ensaios de incorporação

do corante vermelho neutro (VN) e a redução do sal de tetrazólio (MTT) apresentaram um

estímulo celular. Nas células de hepatócitos, as micropartículas sem e com o antibiótico, não

apresentaram citotoxicidade para os ensaios do VN e do DNA. No entanto, no ensaio de MTT, as

8

micropartículas sem e com o AH encapsulado, na concentração de 300 mMol/L apresentou uma

inibição de 90 % e 70 % das células, respectivamente. A avaliação do perfil da liberação

sustentada do AH permitiu verificar que o fármaco está dentro das micropartículas de PCL. No

teste de biodegradação, a superfície polimérica do PCL começa a apresentar uma alteração

morfológica a partir do décimo dia, sendo visível à presença de poros que irão influenciar na

liberação sustentada do AH para o meio externo.

Palavras-chaves: antibiótico hidrofílico, microencapsulamento, cápsulas, farmacologia,

polímeros.

9

ABSTRACT

The goal of this work was to encapsulate a hydrophilic antibiotic (AH) in microparticles

biodegradable polymeric of poly (ε-caprolactone) (PCL) which acts on several bacteria gram-

positive and gram-negative and mostly, against the tuberculosis.

The PCL microparticles with the hydrophilic antibiotic were obtained by the double emulsion

method (w/o/w) followed by the evaporation of the solvent. The solvent used in the organic

phase was dichloromethane and polished it poly (vinyl alcohol) (PVA) like surfactant in the

aqueous phase. In the several methodology parameters used, were modified, surfactant quantity,

the polymeric amount, the way of addition the first phase in the external phase and the agitation

way. The microparticles obtained were characterized by scanning electronic microscopy

(SEM), zeta potential, particles size average and distribution. The encapsulation efficiency, the

microparticles yield, the antimicrobial activity, the antibiotic liberation sustained and at

cytoxicity were evaluated.

The polymeric microparticles exhibited a spherical morphology and smooth surface, with

average size between 20 µm to 80 µm and a yield of 80 %. The encapsulation efficiency was to

approximately 2 %. The hydrophilic antibiotic, presented a load of negative surface and a low

polydispersity. The antimicrobial activity of the free AH and encapsulated in S. aureus, gave the

same efficiency, exhibiting an inhibition of 5 cm. For citotoxicidade to the V79 cells, in the DNA

assay, the free AH introduced an inhibition of 50 % of the cells with 300 mMol/L and with PCL

microparticles, in the neutral red (VN) and reduction of the tetrazolium salt (MTT) assays

introduced a same kind of cellular enhancement. In the hepatocytes cells, the microparticles

without and with an antibiotic did not show cytotoxicity to the VN and the DNA assays.

However, in the MTT assay, the microparticles without and with antibiotic encapsulated, in the

concentration of 300 mMol/L, introduced 90 % and 70 % of cellular inhibition, respectively. The

evaluation of the profile of the sustained liberation of the AH allowed to verify that hydrophilic

10

drug is inside PCL microparticles. In biodegradation test, PCL polymeric surface starts to present

a morphologic alteration from the tenth day, being visible the presence of pores that probably

could be improved in the liberation sustained of the AH to the external environment.

Key-words: hydrophilic antibiotic, microencapsulation, capsules, pharmacology, polymers.

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Infecções bacterianas causadas por microorganismos susceptíveis.............................34

Tabela 2. Atividade in vitro do AH contra Staphylococcus aureus ............................................ 35

Tabela 3. Principais técnicas de obtenção de micro/nanopartículas............................................. 41

Tabela 4. Alguns materiais de revestimento utilizados na microencapsulação............................ 44

Tabela 5. Resumo das variações da metodologia C ......................................................................60

Tabela 6. Potencial Zeta............................................................................................................... 83

Tabela 7. Diâmetro médio e índice de polidispersidade das micropartículas.............................. 85

Tabela 8. Comparação do diâmetro do halo formado quando o S. aureus foi exposto ao AH livre

e encapsulado em micropartículas de PCL.................................................................................... 89

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura do ácido nalixídico, protótipo para o desenvolvimento de novas

moléculas.......................................................................................................................................28

Figura 2. Dois principais métodos de síntese para a preparação de derivados do ácido

nalidíxico.......................................................................................................................................29

Figura 3. Concentração de fármaco no sítio terapêutico de ação após sua liberação através de

injeções convencionais e através de um sistema de liberação sustentada......................................38

Figura 4. Representação esquemática de micro/nanocápsulas e micro/nanoesferas poliméricas: a)

fármaco dissolvido no núcleo oleoso das micro/nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à parede

polimérica das micro/nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz polimérica das

micro/nanoesferas; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica das

micro/nanoesferas...........................................................................................................................42

Figura 5. Estrutura química dos poliésteres..................................................................................45

Figura 6. Fotografia da célula de fluxo: células de vidro conectadas a uma bomba peristáltica

através de cânulas de silicone.........................................................................................................65

Figura 7. Micrografias de micropartículas de PCL (método de nanoprecitptação, A): 250 mg de

PCL, 10 mg de AH e 1,2 % de Span 80 e 1,2 % Tween 40. Aumento de: A) x 7500, B) x 5000,

C) x 1800........................................................................................................................................71

Figura 8. Micrografias de micropartículas de PLGA (método B): 100 mg de PLGA, 2 mg de AH

e 0,5 % de Pluronic F-68. Aumento de: A) x 180, B)x 270 e C) x1300........................................71

13

Figura 9. Micrografias das micropartículas de PLGA (método C1): 250 mg de PLGA e 0,5 % de PVA.

Aumento de: A) Com 50 mg de AH x 140, B) Com 50 mg de AH x 500 e C) Sem AH x

500.................................................................................................................................................................................72

Figura 10. Micrografias das micropartículas de PHBV (método C1): 250 mg de PHBV, 50 mg

de AH e 0,5 % PVA. Aumento de: A) x 1200 e B) x 300..............................................................73

Figura 11. Micrografias das micropartículas de PCL (método C1): 250 de mg PCL e 0,5 % de

PVA. Aumento de: A) Sem AH x 1500, B) Sem AH x 330, C) Com 50 mg de AH x 200 e D)

Com 50 mg de AH x 500................................................................................................................74

Figura 12. Micrografias das micropartículas de PLGA preparadas com 250 mg de PLGA, 50 mg

de AH e 0,5 % de PVA (método C1). Aumento de: A) x 180, B) x 200 e C) x 330.....................75

Figura 13. Micrografias das micropartículas de 250 mg de PCL e 10 mg de AH (método C2).

Aumento de: A) Com Pluronic x 1600 e B) Com PVA x 500......................................................76

Figura 14. Micrografias das micropartículas de PCL preparadas com, Aumento de: A) 500 mg de

PCL e 10 mg de AH x 330 e B) 250 mg de PCL e 50 mg de AH x 180, C) 500 mg de PCL e 50

mg de AH x 200..............................................................................................................................78

Figura 15. Micrografias das micropartículas de 50 mg de PCL quando a primeira emulsão foi.

Aumento de: A) Gotejada na fase aquosa externa x 350 e B) Vertida na fase aquosa externa x

300.................................................................................................................................................79

Figura 16. Fotografia do aparelho Ultra turrax.............................................................................80

Figura 17. Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL utilizando agitação por

sonicação por sonda. Aumento de: A) Com 10 mg de AH x 300, B) Sem AH x 350 e C) Com 50

mg de AH x 100..............................................................................................................................80

Figura 18. Micrografias das micropartículas de 500 mg PCL sem o AH e utilizando agitação em

ultra turrax. Aumento de: A) x 350 e B) x 100..............................................................................81

14

Figura 19. Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL sem o AH e 0,25 % de PVA, utilizando

agitação em ultra turrax. Aumento de: A) Método C9 x 1000 e B) Método C10 x 100............................. 81

Figura 20. Micrografia das micropartículas de 500 mg de PCL e 250 mg de AH (método de

emulsão simples (o/a). Aumento de: A) x 1.500, B) x 3.000 e C) x 10.000..................................82

Figura 21. Curva analítica para a determinação da eficiência de encapsulamento do AH por

Espectrofluorimetria (λ= 292 nm)..................................................................................................86

Figura 22. Curva analítica para a determinação da liberação sustentada do AH por UV-VIS (λ= 283

nm).................................................................................................................................................87

Figura 23. Curva de liberação sustentada do AH livre e encapsulado..........................................88

Figura 24. Viabilidade celular de V-79 na análise dos alvos celulares VN, MTT e DNA. A) AH livre, B)

Micropartículas de PCL e C) Micropartículas de PCL com o AH...............................................................91

Figura 25. Viabilidade celular de hepatócitos na análise dos alvos celulares VN, MTT e DNA.

A) Micropartículas de PCL e B) Micropartículas de PCL com o AH........................................... 92

Figura 26. Micrografias da biodegradação de PLGA. Aumento de: A) 1º dia x 1000, B) Após 5

dias x 400 e C) Após 10 dias x 1500..............................................................................................93

Figura 27.. Micrografias da degradação de PCL. Aumento de: A) 1º dia x 2000, B) Após 5 dias x

400, C) Após 10 dias x 2000, D) Após 15 dias x 850, E) Após 20 dias x 100 e F) Após 30 dias x

220..................................................................................................................................................93

15

LISTA DE ABREVIATURAS

AH antibiótico hidrofílico

BK bacilo de Koch

CNI Confederação Nacional das Indústrias

DMEM meio Eagle modificado por Dulbecco

DMSO dimetil sulfóxido

DNA ácido desoxirribonucléico

DOT terapia diretamente observada

DP ácido diidroxihexadecil

EMB etambutol

FDA Food and Drug Administration

INH isoniazida

kDa quilodalton

MEV microscópio eletrônico de varredura

MIC concentração mínima inibitória

MM massa molar

MP micropartículas

MTT atividade enzimática mitocondrial

OMS Organização Mundial da Saúde

PCL poli (ε-caprolactona)

PECA polialquilcianoacrilato

PGA ácido poliglicólico

PHBV poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)

PLA ácido poliláctico

PLGA poli (lactídeo-co-glicolídeo)

PPD teste tuberculínico

PVA álcool polivinílico

PZA pirazinamida

RPM rifampicina

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SESI Serviço Social da Indústria

SFB soro fetal bovino

SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

SM estreptomicina

SPAN 80 polioxietileno de sorbitan monoleato

SUS Sistema Único de Saúde

TB tuberculose

TBMR tuberculose multirresistente

Tg temperatura de transição vítrea

Tm temperatura de ponto de fusão

TWEEN 40 polioxietileno de sorbitan monopalmitato

VN vermelho neutro

17

SUMÁRIO

1 Introdução.........................................................................................................................19

1.1 Doenças respiratórias.........................................................................................19

1.2 Tuberculose........................................................................................................19

1.2.1 Mycobacterium................................................................................................20

1.2.2 Transmissão e sintomas da TB........................................................................20

1.2.3 Diagnóstico e tratamento da TB......................................................................21

1.2.4 Dados estatísticos............................................................................................23

1.3 Fármacos............................................................................................................24

1.3.1 Fármacos no combate à Tuberculose..............................................................26

1.4 Derivados do ácido nalidíxico, uma nova e potente classe de compostos no

combate à TB.......................................................................................................... 27

1.5 Composto antitubercular e antibacteriano..........................................................29

1.5.1 Aspectos gerais................................................................................................30

1.5.2 Características.................................................................................................32

1.6 Sistemas de liberação sustentada........................................................................37

1.7 Microencapsulação.............................................................................................39

1.7.1 Micro e Nanopartículas...................................................................................41

1.8 Polímeros............................................................................................................43

1.8.1 Características de alguns polímeros biodegradáveis.......................................46

1.8.2 Aplicações das micro/nanopartículas em polímeros biodegradáveis..............48

1.9 Potencial Zeta.....................................................................................................51

1.10 Citotoxicidade..................................................................................................51

2 Objetivos..............................................................................................53 2.1 Objetivo geral.....................................................................................................53

18

2.2 Objetivos específicos..........................................................................................53

3 Materiais e Métodos....................................................................................................55 3.1 Materiais utilizados............................................................................................55

3.2 Metodologias......................................................................................................58

3.2.1 Preparação das micropartículas.......................................................................58

3.2.1. 1 Método de Nanoprecipitação A...................................................................58

3.2.1. 2 Método de Nanoprecipitação B...................................................................58

3.2.1. 3 Método de dupla emulsão (água/óleo/água) e evaporação do solvente C...59

3.2.1.4 Método de emulsão simples (óleo/ água) e evaporação do solvente D........61

3.2.2 Caracterização das micropartículas.................................................................61

3.2.2.1 Microscopia eletrônica de Varredura (MEV)...............................................61

3.2.2.2 Potencial Zeta...............................................................................................62

3.2.2.2 Tamanho médio e distribuição de tamanho das partículas...........................62

3.2.3 Atividade antimicrobiana do antibiótico hidrofílico.......................................62

3.2.4 Eficiência de encapsulamento e rendimento das micropartículas...................63

3.2.5 Avaliação da liberação sustentada do fármaco...............................................64

3.2.6 Avaliação da citotoxicidade............................................................................65

3.2.6.1 Preparo das culturas de células V79.............................................................65

3.2.6.2 Preparo das culturas de células de hepatócitos.............................................66

3.2.6.3 Tratamento das células.................................................................................67

3.2.6.4 Ensaio do Vermelho Neutro.........................................................................67

3.2.6.5 Ensaio do MTT.............................................................................................68

3.2.6.6 Ensaio do conteúdo de Ácidos Nucléicos....................................................68

3.2.7 Avaliação da biodegradação das micropartículas poliméricas........................69

4 Resultados e Discussões......................................................................70 5 Conclusões...........................................................................................95 6 Referências..........................................................................................97

19

1 INTRODUÇÃO

1.1 Doenças Respiratórias

As doenças respiratórias, particularmente, as infecções pulmonares, são responsáveis por

um alto índice de mortalidade mundial. Diversos fatores como quedas bruscas de temperatura,

aumento da poluição do ar, hábitos sedentários de vida, estresse e alimentação desequilibrada

contribuem para o aparecimento de problemas respiratórios, que atingem atualmente 30 % da

população. Dentre esses problemas, encontram-se: rinite, asma ou bronquite, enfisema pulmonar,

pneumonia, câncer do pulmão e a tuberculose. A prevenção se faz importante, uma vez que a

terapia é lenta e os microorganismos causadores de algumas dessas doenças, como no caso, a

tuberculose, apresentam grande resistência aos coquetéis antibacterianos que são caros e difíceis

de ingerir (Falkinham, 2003).

1.2 Tuberculose

A tuberculose (TB) é uma doença contagiosa grave, com relatos de médicos na Grécia e

na Roma antiga e, atualmente acredita-se que está doença já era também conhecida também no

antigo Egito, já que pesquisadores encontraram lesões de tuberculose em múmias. No entanto,

somente em 1882 a bactéria responsável pela doença, a Mycobacterium tuberculosis, foi isolada

pelo cientista alemão Robert Koch. E em sua homenagem, o bacilo ficou conhecido como o

bacilo de Koch (BK) (Souza e Vasconcelos, 2005).

20

Os trabalhos realizados por este cientista, estabeleceram definitivamente a relação

etiológica entre a tuberculose humana e o bacilo ácido-resistente – “bacilo de Koch”. Além do

tipo humano de bacilo da tuberculose (M. tuberculosis), dois outros foram posteriormente

conhecidos – o tipo bovino (M. bovis) e aviário (M. avium) (Bier, 1976).

1.2.1 Mycobacterium

Este gênero contém microorganismos parasitas, nos quais, incluem os dois principais

patógenos humanos, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, que causam

tuberculose e lepra, respectivamente. O M. tuberculosis é um aeróbio obrigatório de crescimento

lento. As células bacterianas são delgadas em forma de bastonetes ligeiramente encurvados

atingindo um tamanho de 0,3 a 0,6 µm de diâmetro e 1 a 4 µm de comprimento. A morfologia

celular pode variar de cocos a filamentos, dependendo do meio de crescimento. As micobactérias

apresentam uma resistência natural a numerosos antibacterianos por possuírem uma parede

celular completa, muito hidrofóbica, com uma permeabilidade reduzida para vários compostos,

tal qual o tratamento de TB ser realizada com antimicobacterianos específicos (Nuermberger e

Grosset, 2004; Coll, 2003; Nisengard e Newman, 1997; Bier, 1976).

1.2.2 Transmissão e sintomas da TB

A TB está associada com a falta de higiene, condições de moradia em locais aglomerados

que ocorrem nas classes sociais baixas, idade, estado hormonal, estresse e desnutrição. Fatores

genéticos também são importantes, como evidenciados, em índios americanos e esquimós. Os

21

sintomas da tuberculose são tosse crônica, febre, suor noturno, dor no tórax, anorexia e adinamia

(falta de disposição) (Souza e Vasconcelos, 2005; Chan et al., 2002; Nisengard e Newman, 1997;

Shafer e Edlin, 1996).

A TB é transmitida pelo ar e pode atingir todos os órgãos do corpo, porém como o BK se

reproduz e desenvolve rapidamente em áreas do corpo com muito oxigênio, o pulmão é o

principal órgão atingido pela doença. Se a cavidade tubercular no pulmão se torna grande o

suficiente, o microorganismo pode ganhar acesso aos vasos sanguíneos e a doença pode tornar-se

tuberculose disseminada (ou miliar) (Chan et al., 2002; Chan et al., 2000; Nisengard e Newman,

1997; Shafer e Edlin, 1996).

1.2.3 Diagnóstico e tratamento da TB

O tratamento da TB se baseia em conceitos muito distintos das demais infecções

bacterianas. O M. tuberculosis tem um tempo de geração prolongado e possui a capacidade para

entrar em períodos de latência com uma atividade metabólica limitada, o qual dificulta a ação dos

antibacterianos (Coll, 2003).

Existem populações de bacilos diferentes em função da sua localização e atividade. Por

exemplo, os bacilos presentes nas cavidades pulmonares se multiplicam de forma ativa num

ambiente aeróbio, já os bacilos encontrados no interior dos macrófagos se multiplicam em um

ambiente microaerofílico - na qual induz a latência. O M. tuberculosis pode se multiplicar nos

tecidos, local em que os antibióticos penetram facilmente e/ou se multiplicar, nas cavidades

pulmonares, locais em que os antibióticos atuam mais dificilmente. Os fármacos antituberculares

apresentam um perfil de atividade diferenciado frente a cada uma dessas localizações, portanto,

22

se faz necessário assegurar de que o tratamento prescrito seja ativo frente a todas elas (Coll,

2003).

A associação medicamentosa adequada e seu uso regular, por tempo suficiente, são os

meios necessários para evitar a resistência e a persistência bacterianas (Chan et al., 2000; Souza e

Vasconcelos, 2005).

O tratamento correto dos bacilíferos é a atividade prioritária de controle da TB, uma vez

que permite anular rapidamente as maiores fontes de infecção (Rede TB, 2004). Quando o

tratamento não é realizado corretamente, a TB resistente as multi-drogas (TBMR) são perigosas,

pois as bactérias tornam-se resistentes aos seus efeitos, isto é, elas não são eliminadas do nosso

organismo (Souza e Vasconcelos, 2005; Abdool, 2002; Chan et al., 2002; Nisengard e Newman,

1997; Shafer e Edlin, 1996).

Segundo Barroso et al. (2004), a definição internacional para a tuberculose

multirresistente (TBMR) é dada para o caso em que o bacilo é resistente à pelo menos

rifampicina e isoniazida. Portanto, as pessoas começam o tratamento tomando no mínimo quatro

diferentes fármacos e após alguns meses, o médico poderá diminuir o número de fármacos a

serem medicadas. Quando a bactéria torna-se resistente, ela faz com que o paciente tenha que

tomar a combinação de outros medicamentos (multi-fármacos), dificultando a cura. Esses

medicamentos, mesmo sendo seguros, causam alguns efeitos colaterais, como: pele amarelada,

urina escura, vômitos, perda de apetite, náusea, dificuldade para enxergar, fadiga e febre (Barroso

et al, 2004; Chan et al., 2002).

Estudos genéticos têm demonstrado que a resistência às pessoas com tuberculose se deve

a mutações cromossômicas espontâneas nos genes que codificam o alvo dos fármacos ou as

enzimas envolvidas na ativação do fármaco. Encontra-se na literatura descrições de mutações

pontuais, deleções ou inserções responsáveis pela resistência aos fármacos contra a TB. A taxa

23

para essas mutações difere para cada um dos antimicrobianos, sendo a mais elevada para

etambutol e a mais baixa para rifampicina e derivados do ácido nalidíxico. Apesar disso, não se

conhece uma alteração genética que, por si mesma, de lugar ao fenótipo de multirresistência. Este

fenótipo multirresistente se deve a aquisição seqüencial de mutações em diferentes loci de genes

independentes. Para tanto, a detecção precoce da resistência aos fármacos antituberculares se

torna essencial para o controle correto da TB resistente e, os mecanismos de resistência permite

desenvolver novas tecnologias capazes de prevenir e curar a tuberculose (Coll, 2003).

Por enquanto, a tuberculose continua sendo um grave problema de saúde pública,

especialmente em países em desenvolvimento, voltando a ocupar papel de destaque entre as

principais doenças infectocontagiosas. Muitos foram os fatores que contribuíram para isso,

destacando-se a desigualdade social, os aglomerados populacionais, os movimentos migratórios,

o envelhecimento da população, o aparecimento de cepas de bacilos resistentes aos fármacos

conhecidos e o surgimento, na década de 80, da “Síndrome de Imunodeficiência Adquirida

(SIDA)”, ou também, “AIDS” (Souza e Vasconcelos, 2005).

1.2.4 Dados estatísticos

Atualmente a tuberculose mata no mundo 3,0 milhões de pessoas por ano, mais que a

AIDS, a malária e as doenças tropicais combinadas. Estima-se que cerca de 1,7 bilhões de

indivíduos em todo o mundo estejam infectados pelo M. tuberculosis, o que corresponde a 30 %

da população mundial, sendo que em países pobres, a estimativa é que 70 % da população esteja

infectada pelo bacilo de Koch, com cerca de 2,8 milhões de mortes por TB e 7,5 milhões de

novos casos. Já nos países ricos esse número é menor que 10 %, com uma estatística anual de

24

mais de 400.000 novos casos e cerca de 40.000 mortes. Segundo a Organização Mundial da

Saúde (OMS), uma imensa tragédia poderá ocorrer nas próximas duas décadas, com quase um

bilhão de pessoas infectadas e mais de 35 milhões de mortes. O Brasil ocupa o 13º lugar no

ranking dos 22 países que concentram 80 % dos casos de TB do mundo. De acordo com os dados

oficiais do Ministério da Saúde, no Brasil existem atualmente cerca de 50 milhões de pessoas

infectadas com o bacilo de Koch, mas que não desenvolveram a doença, com contaminação de

mais de 1 milhão de pessoas a cada ano pelo contato com os doentes. Anualmente surgem no

Brasil, aproximadamente, 111 mil novos casos e ocorrem 6 mil mortes, sendo o Rio de Janeiro o

estado com maior número de casos (Souza e Vasconcelos, 2005; Chan et al., 2002; SVS, 2005).

1.3 Fármacos

A interação com os receptores celulares ou sistemas enzimáticos com um fármaco gera

uma resposta biológica. A resposta decorre de uma alteração dos processos biológicos anteriores

à administração do fármaco. A magnitude da resposta relaciona-se com a concentração que o

fármaco atinge seu local de ação. Essa concentração depende da dose administrada, da

quantidade absorvida, da distribuição no local, da velocidade de ação e da quantidade eliminada

do corpo. A constituição física e química da substância farmacêutica (solubilidade lipídica, grau

de ionização e tamanho molecular) determina, em grande parte, sua capacidade de atividade

biológica (Ansel et al., 2000).

Em geral, para que o fármaco exerça seu efeito biológico, ele precisa ser transportado

pelos líquidos corporais através das barreiras das membranas biológicas, resistir ao ataque

metabólico, penetrar em concentração adequada nos locais de ação e interagir de modo

25

específico, provocando uma alteração celular. A absorção, a distribuição, a biotransformação

(metabolismo) e a eliminação do organismo são processos dinâmicos que duram desde o

momento em que o fármaco é administrado até que toda a sua totalidade seja removida (Ansel et

al., 2000).

A terapia contra a infecção micobacteriana pode apresentar diversos efeitos colaterais,

pois a micobactéria não é suscetível a muitas classes de agentes antibacterianos e, devido à ação

lenta desta micobactéria para sucumbir aos agentes antimicrobianos, a terapia deve ser tratada

com múltiplos fármacos e por um longo período, sendo necessário monitorar a toxicidade do

fármaco, a interação e a rejeição do paciente (Yew, 1998).

A fim de melhorar a terapia contra a infecção micobacteriana deve-se compreender a

farmacocinética e a farmacodinâmica dos agentes antibacterianos utilizados (Nuermberger e

Grosset, 2004).

A medicação recomendada para um paciente que desenvolve a tuberculose pode ser feita

com a combinação de isoniazida, rifampicina, etionamida, cicloserina e derivados do ácido

nalidíxico. Os novos compostos formados a partir do ácido nalidíxico têm mostrado maior

eficiência e atividade contra a M. tuberculosis e outras infecções do sistema respiratório superior

e inferior, sistema genitourinário, obstétrico, ginecológico, na pele e nas suas estruturas (Ball,

2003 a; Croom e Goa, 2003; Hurst et al., 2002; Peng et al., 2000; Peloquin, 1999; Langtry e

Lamb, 1998; Davis e Bryson, 1994).

1.3.1 Fármacos no combate à Tuberculose

Com base na história, o primeiro antibiótico que o homem teve acesso no combate à TB

foi à penicilina, descoberta em 1928 por Alexander Fleming numa cultura do fungo Penicillium,

26

um tipo de mofo de cor verde, sendo considerado um dos maiores acontecimentos do século XX

(Souza e Vasconcelos, 2005).

Foram necessários quinze anos após a descoberta de Fleming para que Selman Waksman

descobrisse, em 1944, a estreptomicina (SM), produzida também por um microorganismo, a

bactéria Streptomices griséus, que foi o primeiro antibiótico capaz de atuar eficazmente no

combate à TB. Após a descoberta da SM, novos fármacos foram utilizados com sucesso,

destacando-se a isoniazida (INH), em 1952; a rifampicina (RPM), em 1965; o etambutol (EMB),

sintetizado em 1960, empregado somente em 1968 e a pirazinamida (PZA), sintetizada em 1936,

porém só utilizada em 1970 (Souza e Vasconcelos, 2005; Zhang, 2005)

Os fármacos comumente chamados de primeira escolha são a primeira opção no

tratamento, podendo ser empregados com sucesso na grande maioria dos pacientes e incluem a

INH, RPM, PZA e EMB. Os fármacos conhecidos como de segunda escolha são utilizados em

caso de falência dos fármacos de primeira escolha, administrando-se a SM e a etionamida, ou

devido à resistência do bacilo (Souza e Vasconcelos, 2005, Coll, 2003).

1.4 Derivados do ácido nalidíxico, uma nova e potente classe de compostos no

combate à TB

Estes derivados são atualmente uma importante classe de antimicrobianos sintéticos que

têm sido objeto de intensos estudos mundiais. Essa classe de compostos tem, atualmente,

destacada importância no combate a diferentes tipos de bactérias (Souza e Vasconcelos, 2005).

Com mais de 800 milhões de pacientes tratados, estes antimicrobianos têm indicações

terapêuticas que envolvem quase todas as infecções do corpo humano e tem permitido

27

compreender melhor a atividade estrutural dessa classe de moléculas. Este conhecimento tem

conduzido intensos esforços para a síntese de novos compostos com amplo espectro, alta

atividade intrínseca, um melhoramento no perfil farmacocinético e na publicação de mais dados

químicos, microbiológicos e clínicos. Estima-se que aproximadamente mais de 10.000 novas

moléculas dessa classe têm sido sintetizadas (Bambeke et al., 2005).

A história destas moléculas está relacionada com o ácido nalidíxico, um composto com

atividade antibacteriana, que foi sintetizada e patenteada em 1962 por Lescher et al.. A

descoberta do ácido nalidíxico (Figura 1) apresentou importantes indicações de que esta classe de

compostos poderia ser empregada no combate as infecções bacterianas. Inúmeras moléculas

foram sintetizadas e avaliadas, as quais possuem um amplo espectro de atividade contra vários

microorganismos patogênicos, em seres humanos e animais, resistentes aos aminoglicosídeos,

penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas e outros antibióticos (Souza e Vasconcelos, 2005).

Figura 1: Estrutura do ácido nalidíxico, protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas


Existem dois principais métodos descritos na literatura para a construção do anel do ácido

nalidíxico. O primeiro foi desenvolvido por químicos da Bayer AG, sendo o anel do ácido

formado pela ciclização de intermediários 3-amino-acrilatos-2-(2-halobenzoil) (Figura 2). O

outro método sintético é conhecido como ciclização de Gould-Jacobs, que é baseado na

28

ciclização térmica ou catalisada, em meio ácido, de malonatos anilinometilênicos (Figura 2).

Esses métodos sintéticos permitem a introdução de diferentes substituintes nas posições C-2, C-5,

C-6, C-7, C-8 e N-1 do anel do ácido nalidíxico e, conseqüentemente, a síntese de novos

compostos dessa classe, com o objetivo de se obter fármacos mais eficazes (Souza e

Vasconcelos, 2005).

Figura 2: Dois principais métodos de síntese para a preparação de derivados do ácido nalidíxico


Muitas moléculas dessa classe têm sido patenteadas, mas somente poucas tem sido

comercializadas e utilizadas clinicamente. Os derivados do ácido nalidíxico disponíveis

clinicamente estão classificadas dentro de quatro gerações baseadas de acordo com o espectro de

atividade de cada molécula (Bambeke et al., 2005; Ball, 2003 b).

A incorporação de um átomo de flúor no carbono 6 da molécula derivada do ácido

nalidíxico, permitiu o desenvolvimento de novos fármacos potentes contra a TB (Coll, 2003).

29

1.5 Composto Antitubercular e antibacteriano

Faz-se necessário à identificação de novos compostos antibacterianos capazes de agirem

eficazmente contra o M. tuberculosis devido à prevalência global de fármacos resistentes à TB.

Apesar de ter disponível uma terapia efetiva por mais de 50 anos, o tratamento futuro da

tuberculose dependerá, pelo menos em parte, do desenvolvimento de novos fármacos

antituberculoses, pois existem poucos agentes antimicrobianos efetivos contra o M. tuberculosis

(ativo e latente) (Ginsburg et al, 2003).

Os derivados do ácido nalidíxico fluorados são promissores agentes antimicrobianos

capazes de preencher as necessidades do tratamento no combate a tuberculose. De acordo com

Bambeke et al. (2005), derivados do ácido nalidíxico, contendo flúor na sua estrutura, possuem

um amplo espectro na atividade antimicrobiana e são recomendados nos tratamentos de infecção

do sistema respiratório, gastrointestinal e urinário, bem como nas doenças sexualmente

transmissíveis e osteomelite crônica. Em 2002, esses antibióticos contabilizaram 11 % das vendas

nos USA e a sua utilização está aumentando mundialmente (Ginsburg et al, 2003).

1.5.1 Aspectos gerais

A terapia de infecções micobacterianas é um desafio para várias reações. Entre estas,

encontram-se as micobactérias que não são susceptíveis aos atuais agentes antibacterianos

(Nuermberger e Grosset, 2004).

30

Recentemente os derivados do ácido nalidíxico têm sido apontados para várias metas,

incluindo o aumento da potência contra cocci Gram-positivas (Streptococcus pneumoniae e

anaeróbios), mantendo a potência sobre os patógenos Gram-negativos, otimizando a

farmacocinética e a farmacodinâmica (PK/PD) e diminuindo o potencial adverso do fármaco

(Davis e Bryson, 1994; Hurst et al., 2002; Ball, 2003 ab; Croom e Goa, 2003). Os efeitos

adversos ocasionados pela ação destes derivados são náuseas, diarréia, dor de cabeça, tontura e

fototoxicidade (Bertino e Fish, 2000).

Na França, o aparecimento de infecções cutâneas e tendinites, como efeitos adversos por

ingestões de algumas fluoroquinolonas foram observadas, sendo que, no Reino Unido, a tendinite

é o quinto sintoma mais comum no país. Essa desordem que ocorre no tendão (principalmente no

tendão de Aquiles) afeta mais idosos e é três vezes mais comum entre os homens. Os sintomas

aparecem dentro de 2 a 42 dias e dois terços dos casos são resolvidos dentro de 1 a 2 meses.

Contudo, períodos de hospitalização e cirurgias de reparos foram relatados segundo Bertino e

Fish (2000).

A atuação dos derivados do ácido nalidíxico ocorre ao nível de enzimas, as

topoisomerases do tipo II e, principalmente, sobre a DNA girase composta das subunidades A e

das subunidades B codificadas pelos genes gyr A e gyr B, respectivamente. Uma segunda atuação

seria pela enzima topoisomerase IV, codificada pelos genes parC e parE. O desenvolvimento de

resistência pelos derivados do ácido nalidíxico é um processo complexo que associa mutações

que afetam a DNA girase, a topoisomerase IV e proteínas de membranas que regulam a

permeabilidade e o efluxo do fármaco (Bambeke et al., 2005; Coll, 2003; Croom e Goa, 2003;

Hooper, 2001; Talan, 2001).

O antitubercular avaliado neste projeto é um antibiótico hidrofílico (AH) que tem sido

amplamente estudado em doenças respiratórias como em infecções urinárias e recentemente

31

aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de pneumonia nosocomial e prostatite bacteriana

crônica.

1.5.2 Características

O antibiótico hidrofílico (AH) é um composto sintético, administrado oralmente e

intravenosamente, com ampla atividade antibacteriana. Quimicamente, o AH é um composto

quiral carboxiquinolona. É um cristal levemente amarelado até esbranquiçado. A molécula existe

como um zwitterion (um íon com carga positiva e negativa no mesmo grupo de átomos, isto é,

são compostos anfóteros) na condição de pH no intestino delgado. Possui pKa1 = 6,27 e pKa2 =

6,81.

Solubilidade: A solubilidade do AH, em pH 0,6 até 5,8, é constante e de

aproximadamente 100 mg/mL, neste intervalo é encontrado livremente em solução. Acima de pH

5,8 a sua solubilidade aumenta rapidamente para um máximo de 272 mg/mL em pH 6,7. Acima

de pH 6,7 a sua solubilidade diminui, atingindo um mínimo de 50 mg/mL em pH 6,9.

Indicações: O AH é recomendado para agir contra um grande número de infecções,

inclusive a tuberculose. Pode ser seguro para usar em pacientes que ingerem teofilina, warfarina

ou ciclosporina. Regimes especiais de dosagens são em função do médico dependendo das

características do paciente e das normas das autoridades competentes de segurança com esses

medicamentos.

Contra-indicações: Geralmente, não é indicado para menores de 18 anos e para pessoas

que apresentem reações a outros fármacos derivados do ácido nalidíxico. É também contra-

indicado para pessoas com tendinites ou casos de rupturas de tendões associados com usos

32

anteriores de outros compostos derivados do ácido nalidíxico. Não pode ser utilizado na presença

de antiácidos já que os cátions divalentes (Mg2+, Al2+) inibem a eficiência da absorção do

fármaco. Experiências com animais indicaram que podem interferir com ossos e cartilagens em

animais jovens. Em adultos os efeitos colaterais mais comuns são náusea, diarréia, dor de cabeça

e constipação. Entretanto, o fármaco não apresenta carcinogênese e teratogênese em testes

padrões.

Modo de ação: O AH inibe a ação da enzima topoisomerase II, chamada DNA girase, e a

topoisomerase IV, nas quais são essenciais no mecanismo de replicação, transcrição e reparação

do DNA bacteriano.

Dosagem e administração: As doses orais usuais do AH são 500 mg a cada 24 horas, o

fármaco é rapidamente distribuído pelo corpo. Aproximadamente, 24 a 38 % do AH está ligado

as proteínas do plasma. A concentração do AH nos tecidos e nos fluídos corporais depois da

administração oral é semelhante ou superior àquela encontrada no plasma. Em pacientes com

disfunção renal é recomendável uma redução na dosagem.

Farmacocinética: O AH é estereoquimicamente estável nos fluídos corporais e é

rapidamente absorvido após a medicação oral. O pico de concentração no plasma geralmente é

obtido de uma a duas horas após a ingestão. A biodisponibilidade absoluta de 500 mg de dose

oral é aproximadamente de 99 %. O AH é eliminado principalmente sem mudança estrutural pela

urina. A vida média de excreção no plasma é aproximadamente de seis a oito horas após

dosagens simples ou múltiplas, dados oralmente ou intravenosa. O AH é duas vezes mais potente

do que o outro antibiótico da mesma geração, os eventos adversos foram significativamente

reduzidos e representa um antibacteriano de espectro amplo contra bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas, micobactérias e organismos anaeróbios.

33

Uso clínico: Ver na Tabela 1 a indicação do antibiótico hidrofílico estudado.

Tabela 1: Infecções bacterianas causadas por microorganismos susceptíveis.

Trato Respiratório Superior M. tuberculosis, Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, Moraxella (Branhamella)

catarralis

Trato Respiratório Inferior Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae,

or Moraxella (Branhamella) catarralis, Klebsiella

pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella

pneumophila, Mycoplasma pneumoniae

Pneumonia nosocomial Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Serratia marcescens, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus

pneumoniae

Pele e Estruturas da pele Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,

Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Streptococcus

agalactiae

Trato Urinário Enterococcus (Streptococcus) faecalis, Enterobacter

cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa

34

Resistência: métodos quantitativos são usados para determinar a concentração mínima

inibitória (MIC) do antibiótico. O MIC permite estimar a suscetibilidade de um microorganismo

com o antimicrobiano. O MIC deve ser determinado utilizando um procedimento padrão na qual

difere-se entre si dependendo do microorganismo. Estes procedimentos padrões baseiam-se em

métodos de diluição.

A resistência do AH devido a mutações espontâneas in vitro raramente ocorre (taxa de 10

–9 a 10 –10). Observar na Tabela 2, a atividade in vitro do AH contra Staphylococcus aureus .

Tabela 2: Atividade in vitro do AH contra Staphylococcus aureus .

MIC (µg/mL) Microorganismo

50 % 90 %

Staphylococcus aureus 0.250 0.500

Com os avanços biotecnológicos, a utilização de fármacos e as tecnologias atuais vêm

sendo amplamente pesquisadas para conseguir a cura e/ou o controle de doenças graves,

diminuindo de uma certa forma, os seus efeitos adversos e a mortalidade mundial. Estudos

recentes mostram pesquisas sendo realizadas com novos sistemas transportadores de fármacos,

como a microencapsulação, que é a encapsulação de substâncias em pequenas partículas,

permitindo que os fármacos não entrem em contato com o meio externo ao das partículas até o

momento em que sua ação seja necessária. Esta tecnologia envolve uma multidisciplinariedade

nas pesquisas científicas a fim de contribuir no avanço da saúde (Kumar, 2000). Formulações

com agentes terapêuticos dentro de compostos biocompatíveis, tais como: micro/nanopartículas e

sistemas micelares tem sido desenvolvidos pois esses sistemas direcionam a liberação de

princípios ativos diretamente no tecido e células desejados, aumentam a biodisponibilidade oral,

35

mantêm o efeito do princípio ativo ou gene nos tecidos, solubilizam fármacos para liberação

intravascular a aumentam a estabilidade dos agentes terapêuticos, especialmente de proteínas,

peptídeos e ácidos nucléicos contra as enzimas de degradação (nucleases e proteases). Devido ao

seu tamanho sub-micro, as partículas podem penetrar profundamente nos tecidos através dos

finos vasos capilares, atravessar a camada epitelial e serem levadas eficazmente pelas células

permitindo uma liberação sítio específica no corpo humano (Panyam e Labhasetwar, 2003).

1.6 Sistemas de liberação sustentada

É a área atual mais ativa na pesquisa utilizando polímeros biodegradáveis para o sistema

de liberação sustentada de fármacos, tais como: hormônios, esteróides, proteínas,

imunossupressores, antibióticos, antimaláricos, antifúngicos, antiinflamatórios, anestésicos entre

outros. No tratamento contra o câncer, por exemplo, a utilização de polímeros biodegradáveis no

sistema de liberação sustentada de fármacos substituiu trinta injeções diárias por somente uma

injeção mensal de fármaco. O controle da liberação de fármacos em sítios de ação específicos,

através da utilização de vetores, capazes de permitir a otimização da velocidade de cedência e do

regime de dosagem das substâncias, tem sido uma área de intensa pesquisa nos últimos anos

(Schaffazick e Guterres, 2003).

Essa tecnologia de liberação sustentada de fármacos representa uma das fronteiras da

ciência, que envolve aspectos multidisciplinares e pode contribuir muito para o avanço da saúde

humana. Os sistemas de liberação, descritos como “drug delivery systems”, possuem inúmeras

vantagens quando comparados a outros de dosagem convencional, tais como: maior eficácia

terapêutica, com liberação progressiva e controlada do fármaco (Figura 3), a partir da degradação

36

da matriz polimérica; diminuição significativa da toxicidade e maior tempo de permanência na

circulação; natureza e composição dos veículos variada sem mecanismos de instabilidade e

decomposição do fármaco (bio-inativação prematura), administração segura (sem reações

inflamatórias locais) e conveniente (menor dosagem); direcionamento a alvos específicos;

fármacos hidrofílicos e lipofílicos podem ser encapsulados (De Azevedo, 2003).

Dentre os vetores utilizados, incluem-se as micropartículas e os sistemas coloidais,

lipossomas e nanopartículas. As micro e nanopartículas têm atraído maior atenção dos

pesquisadores em relação aos lipossomas, devido às suas potencialidades terapêuticas, à maior

estabilidade nos fluídos biológicos e durante o armazenamento (Schaffazick e Guterres, 2003).

Figura 3: Concentração de fármaco no sítio terapêutico de ação após sua liberação através de injeções

convencionais e através de um sistema de liberação sustentada (Santos, 2002, modificado).

A Figura 3 mostra que dentro do corpo, o fármaco pode atingir três níveis: nível sub-

terapêutico, em que sua concentração está abaixo do nível terapêutico, nível terapêutico em que

o fármaco tem a função terapêutica e nível tóxico, em que a concentração do fármaco é tóxica.

Con

cent

raçã

o sa

nguí

nea

Tempo

Faixa Tóxica

Faixa Terapêutica

Faixa Sub-Terapêutica

Liberação sustentada

Sistema convencional

37

A Figura 3, também, mostra que o sistema de liberação sustentado de fármaco apropriado

permite que a concentração do fármaco fique dentro da concentração terapêutica desejada. No

caso do sistema convencional, as injeções do fármaco são realizadas de tempos em tempos, por

um período de 24 horas. Nesse caso, a concentração do fármaco não é estável, variando

grandemente de concentração, permanecendo somente por determinado tempo na concentração

terapêutica, decaindo ao nível sub-terapêutico, sendo então necessária outra injeção (Santos,

2002).

Dentro do sistema de liberação sustentada a liberação do fármaco pode ocorrer por

diferentes mecanismos: a) Sistemas difusivos, onde a liberação do fármaco é feita pela sua

difusão através da membrana polimérica; b) Sistemas erosivos, onde a liberação se baseia na

degradação do polímero; c) Pela combinação dos dois sistemas, onde pode ocorrer a difusão e a

biodegradação do polímero. Em ambos mecanismos, o polímero tem um papel-chave na

disponibilidade e liberação do fármaco. Esses mecanismos podem ocorrer por ação de hidrólise

ou de enzimas (Maia, 2004; Ré, 2002; Santos, 2002; Uhrich et al., 1999; Merkli et al., 1998).

A eliminação natural do polímero após a liberação total do fármaco dispensa a

intervenção cirúrgica para a remoção de implantes. Desta maneira, sistemas micro e

nanoestruturados biodegradáveis e biocompatíveis, tais como: micro e nanoesferas, micro e

nanocápsulas, têm sido amplamente desenvolvidos para o uso de liberação sustentada de

fármacos (Uhrich et al., 1999).

38

1.7 Microencapsulação

A microencapsulação é uma importante técnica para o desenvolvimento de novas

formulações, pois é capaz de aumentar a eficiência terapêutica de substâncias já utilizadas no

tratamento de várias doenças e torna possível a utilização de fármacos potencialmente tóxicos,

como antineoplásicos, antibióticos e outros (Schaffazick e Guterres, 2003; Saks e Gardner, 1997).

A microencapsulação permite converter líquidos em sólidos, modificando as propriedades

do colóide ou da superfície dos materiais, contribuindo para a proteção ambiental, o controle da

liberação dos fármacos e sua biodisponibilidade. Devido à reduzida dimensão das partículas estas

podem ser distribuídas por todo o trato gastrointestinal melhorando potencialmente a absorção do

fármaco (Lachman et al., 2001). Além disto, elas podem servir para modificar a liberação do

fármaco, mascarar o sabor e odor desagradável de alguns fármacos em comprimidos, pós ou

suspensões, permitir que num único comprimido se encontrem ingredientes quimicamente

incompatíveis, princípio que pode ser usado na preparação de cremes, pomadas, aerossoles,

supositórios, injectáveis, proteção de fármacos contra a umidade, calor e oxidação, alteração da

solubilidade e diminuição da volatilização. Este sistema também pode ser aplicado a outras áreas

farmacêuticas, como higiene pessoal, materiais de diagnósticos e componentes de equipamentos

médicos, gráfica, agricultura, indústria de alimentos, produtos domésticos entre outras podem ser

campos de aplicação de micropartículas (Lachman et al., 2001; Donbrow, 1991; Luzzi e Palmieri,

1985).

O processo de microencapsulação envolve basicamente três etapas: formação da camada

que envolve o material ativo, estabilização da cápsula formada e a liberação do conteúdo no

momento desejado a uma taxa de liberação sustentada. Este processo tem a capacidade de

39

preservar o princípio ativo em um estado finamente dividido e liberá-lo conforme a necessidade

(Uhrich et al., 1999)

Existem diversas técnicas para a obtenção das micro e/ou nanopartículas que estão

divididas em três grupos (Tabela 3). Para se obter uma boa escolha entre as técnicas existentes, os

fatores econômicos, a sensibilidade do material do núcleo ao método, o tamanho desejado da

micro/nanopartícula, as propriedades físico-químicas do núcleo e do revestimento e os

mecanismos de liberação (Shahidi e Han, 1993).

Tabela 3: Principais técnicas de obtenção de micro/nanopartículas.

Métodos Físicos Spray-drying, Spray-Chilling, Spray-Cooling,

Spray-Coating em leito fluidizado, Extrusão, Co-

cristalização, Freeze Drying

Métodos Químicos Inclusão molecular, Polimerização interfacial

Métodos Físico-químicos Coacervação (separação em fase aquosa ou em

fase orgânica), Coacervação interfacial, Lipossomas

(Fonte: Shahidi e Han, 1993).

1.7.1 Micro e Nanopartículas

Partículas com tamanho menor que 1 µm são denominadas nanopartículas ou

transportadores coloidais e são capazes de transitar livremente pelos vasos capilares sanguíneos,

sendo que, alguns atravessam as fenestras destes capilares (< 3 µm) podendo levar o princípio

ativo ao seu sítio de ação específico. Lipossomas, nanocápsulas, nanopartículas, microemulsões e

40

complexos de inclusão com ciclodextrinas podem ser considerados como transportadores

coloidais de fármacos (Chouinard et al., 1994; Brigger et al., 2002).

Partículas maiores com diâmetro da ordem de 1 a 5000 µm são denominadas

micropartículas. Os sistemas microparticulados são, na maioria das vezes, constituídos de

matrizes poliméricas, mas também podem ser obtidos utilizando proteínas, ceras ou lipídios

(Muller et al., 1997; Donbrow, 1991).

A denominação de micro e nanopartículas abrange dois tipos de estruturas diferentes:

micro/nanoesferas – o fármaco encontra-se homogeneamente disperso no interior da matriz

polimérica ou cerosa, onde não é possível identificar um núcleo diferenciado e,

micro/nanocápsulas – que constituem sistemas reservatórios, onde se identifica um núcleo

diferenciado (sólido ou líquido). O fármaco encontra-se envolvido por uma membrana (polímero)

isolando o núcleo do meio externo (Figura 4) (Schaffazick e Guterres, 2003; Brigger et al., 2002;

Andréo-Filho e Oliveira, 1999; Chouinard et al, 1994).

Figura 4: Representação esquemática de micro/nanocápsulas e micro/nanoesferas poliméricas: a) Fármaco

dissolvido no núcleo oleoso das micro/nanocápsulas; b) Fármaco adsorvido à parede polimérica das

micro/nanocápsulas; c) Fármaco retido na matriz polimérica das micro/nanoesferas; d) Fármaco adsorvido ou

disperso molecularmente na matriz polimérica das micro/nanoesferas (Fonte: Schaffazick e Guterres, 2003).

Parede Polimérica

Núcleo oleoso

Matriz Polimérica

Fármaco Fármaco

41

Os fármacos quando encapsulados no interior de partículas poliméricas não estão

prontamente disponíveis para o sistema biológico, pois o polímero tem que se dissolver ou ser

degradado para que o fármaco possa ser liberado, ou então o fármaco tem que se dissolver e/ou se

difundir através da matriz polimérica. Existem três classes de polímeros para a obtenção de

micro/nanopartículas: polímeros solúveis em água, polímeros biodegradáveis e polímeros não-

biodegradáveis. Sistemas contendo polímeros biodegradáveis permite maior controle na liberação

de fármacos (Donbrow, 1991; Dunn, 1991).

O tamanho sub-micrométrico possui inúmeras vantagens como, por exemplo, a

capacidade de penetrar com mais facilidade nos tecidos e células humanas. No entanto, esta

tecnologia apresenta algumas limitações. Não existe, por exemplo, um único processo de

microencapsulação universal que possa ser aplicado a qualquer material ou produto (Lachman et

al., 2001).

1.8 Polímeros

A escolha do polímero para o sistema de liberação controlada é extremamente importante,

pois influência na cinética de liberação do fármaco, estabilidade, toxicidade e na compatibilidade

in vivo (Ré, 2002; Picos et al., 2001; Dunn, 1991). Portanto, a seleção de um polímero adequado

faz com que em grande parte as propriedades físicas e químicas das micropartículas resultantes.

O polímero deve ser capaz de formar um filme que seja coesivo com o material do núcleo e

também, quimicamente compatível. Deve apresentar as propriedades de revestimentos desejadas,

tal como resistência, flexibilidade, impermeabilidade, propriedades ópticas e estabilidade

42

(Lachman et al., 2001). Existem vários polímeros utilizados como revestimento, na preparação de

micro e nanopartículas, como mostra a Tabela 4.

Tabela 4: Alguns materiais de revestimento utilizados na microencapsulação.

Polímeros solúveis em água Polímeros insolúveis em água

Gelatina Etilcelulose

Goma arábica Polietileno

Amido Polimetacrilato

Polivinilpirrolidona Poliamida (nylon)

Carboximetilcelulose Polietilenovinilacetato

Metilcelulose Nitrato de celulose

Hidroetilcelulose Silicones

Galactoarabinose Polilactato-co-glicolato

Álcool polivinílico

Ácido poliacrílico

Fonte: (Lachman et al., 2001).

Polímeros não biodegradáveis como, polietileno e poliuretanos, também podem formar

micro/nanopartículas. Entretanto, as partículas permanecem inalteradas no interior do organismo,

sendo eliminadas pelas fezes em caso de administração oral ou necessitando de remoção cirúrgica

(implantes). Estas partículas são utilizadas quando é necessário que elas permaneçam no

organismo por períodos prolongados, por exemplo, implantes para reposição hormonal (Dunn,

1991).

43

No entanto, sistemas contendo polímeros biodegradáveis precisam sofrer algum tipo de

reação no organismo, como o ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli (hidroxibutirato) e poli

(ε-caprolactona) que sofrem hidrólise terminal causando biodegradação (Figura 5) (Donbrow,

1991; Dunn, 1991).

Muitos são os fatores que podem afetar a degradação desses polímeros, são eles: a)

composição química; b) massa molar e sua dispersão; c) permeabilidade à água e sua

solubilidade; d) mecanismo de hidrólise; e) tipo de estrutura; f) porosidade; g) temperatura de

transição vítrea; h) características físicas (tamanho e forma); i) fatores físico-químicos (pH e

temperatura) e esterilidade (Chandra e Rustgi, 1998; Merkly et al, 1998; Brannon-Peppas, 1997).

a) PGA b) PLA c) PHB

d) PLGA

O

O

n

O

O

n

O

O

n

O

O

O

O

x y

O O

44

O O

n n

OO O

OH

H

e) PCL

Figura 5: Estrutura química dos poliésteres (Fonte: Uhrich, 1999).

1.8.1 Características de alguns polímeros

PLGA: Os homopolímeros de lactato (PLA) e glicolato (PGA) e seus copolímeros

(PLGA) são disponíveis comercialmente e são aprovados pelo FDA (USA’s Food and Drug

Administration) para a utilização em clínica humana. Possuem temperaturas de transição vítrea

(Tg) entre 36-65ºC e encontram-se no estado vítreo à temperatura ambiente. São polímeros

termoplásticos com baixo ponto de fusão (Tm). O co-polímero PLGA é menos cristalino que os

demais e a cristalinidade diminui conforme a introdução de GA na cadeia polimérica (até 70 %)

(Ré, 2002; Jain, 2000; Merkly et al, 1998).

A velocidade de degradação pode variar de acordo com a estrutura e a composição desses

polímeros. Normalmente, os co-polímeros degradam mais facilmente que os homopolímeros. O

co-polímero PLGA (50:50) degrada mais rapidamente que os demais, cerca de 60 dias. Já o

PLGA (85:15) tem maior tempo de permanência no organismo – 150 dias (Ré, 2002; Jain, 2000).

PCL: Merkli et al. (1998), perceberam a facilidade do ε-caprolactona de sofrer

polimerização por abertura do anel. A identificação do polímero (poli-ε-caprolactona) (PCL)

como “biodegradável” surgiu como resultado de estudos de pesquisadores da Union Carbide para

identificar polímeros sintéticos degradáveis por microorganismos no meio ambiente, para uso em

45

embalagens descartáveis e redução de poluição ambiental. O PCL é mais resistente à hidrólise

química e se degrada mais lentamente que o PLGA, sendo, portanto, mais adequado para a

liberação em longo prazo. Quando degradado, o PCL libera o ácido ε-hidroxicapróico que

também é inócuo no organismo, podendo ser absorvido e removido pelo metabolismo (Ré, 2002;

Merkly et al, 1998).

O PCL é um polímero semi-cristalino apresentando uma temperatura de transição vítrea

baixa. A sua cristalinidade varia conforme o seu peso molecular, por exemplo, para pesos

moleculares superiores a 100.000 Da, a cristalinidade é de 40 %, passando para 80 % quando o

peso molecular diminui para 5.000 Da (Ré, 2002).

PHBV: O homopoliéster poli (hidroxibutirato) (PHB) e o co-polímero poli (3-

hidroxibutirato-co-3-valerato) (PHBV) são biocompatíveis e podem ser degradados por

microorganismos, são menos tóxicos, pois não são sintetizados por via química e apresentam

propriedades físicas altamente reprodutíveis. Possuem menor degradabilidade que os homo e

copolímeros de lactato e glicolato devido ao elevado grau de cristalinidade. O ponto de fusão do

homopolímero PHB varia com a massa molar. Ela diminui com a inclusão de unidades de 3HV.

A temperatura de transição vítrea independe da composição do co-polímero, mas é dependente do

histórico térmico. Os co-polímeros de PHB-HV são semicristalinos e com o aumento do

conteúdo de unidades HV é possível melhorar a flexibilidade e maleabilidade do polímero. No

entanto, o PHBV ainda não é aprovado pelo FDA (Ré, 2002; Sudesh et al., 2000; Braunegg et al.,

1998).

A massa molar, cristalinidade, forma, porosidade e o local de implantação são fatores que

interferem na velocidade de degradação sob condições fisiológicas (Hammond e Liggat, 1995). A

viabilidade de polímeros em sistemas de liberação controlada de princípios ativos em aplicações

46

médicas não depende apenas da sua degradabilidade, mas também de sua biocompatibilidade.

Este termo se refere à simultânea aceitabilidade entre o polímero e o ambiente fisiológico, isto é,

o polímero pode ser implantado no tecido sem causar reação inflamatória ou rejeição, além de

não liberar produtos tóxicos para as células (Ré, 2002).

1.8.2 Aplicações das micro/nanopartículas em polímeros

biodegradáveis

A liberação sustentada de derivados do ácido nalidíxico em compostos biodegradáveis

tem sido investigado. Andreopoulos (1995), verificou in vitro, que a liberação desses compostos

em micropartículas de PLA chegou a concentração máxima após quinze dias. Esta concentração

apresentou-se adequada para tratamentos de infecções por patógenos.

Habib et al. (1999) descreveram a formulação e a avaliação de microesferas

biodegradáveis de derivados do ácido nalidíxico para eliminar infecções de bactérias de biofilmes

associadas com problemas ósseos. As microesferas de PLGA com os compostos foram obtidas

pela técnica emulsão/evaporação do solvente. Os efeitos dos parâmetros do processo, tais como:

volume de fase, concentração do estabilizante álcool polivinílico (PVA) e a viscosidade do

polímero durante a eficiência de encapsulação foram investigadas e os resultados indicaram que

várias taxas de liberação desses compostos são possíveis por alterações nas condições de

formulação.

Abazinge et al. (2000) estudaram, tanto in vitro como in vivo, as microesferas preparadas

com o antobiótico através do método de emulsão/evaporação do solvente. In vitro, as

microesferas foram liberadas dentro de um incubador e in vivo foram introduzidas

47

subcutâneamente em ratos. Verificou-se que o tamanho das micropartículas afeta a liberação do

fármaco. Micropartículas com diâmetros de 125 a 425 µm liberaram 45 % do fármaco em dois

dias. Neste mesmo período de tempo, micropartículas com diâmetros de 37 a 124 % µm

liberaram 22 % do fármaco. A concentração do antibiótico no plasma dos animais que receberam

o fármaco livre esgotou-se no final do primeiro dia, mas o antibiótico liberado das microesferas

manteve uma concentração de 0,5 µg/mL no plasma dos animais por aproximadamente três

semanas. Os resultados mostraram que as microesferas biodegradáveis com o composto podem

ser preparadas para liberar o antibiótico por três semanas.

Bahk et al (2000) estudaram a distribuição de derivados do ácido nalidíxico nos tecidos e

fluídos prostáticos de cães, após injeção prostática de microesferas biodegradáveis contendo 12

mg de fármaco e 28 mg de PLA. Eles verificaram uma concentração de liberação de 7,7 ± 3,0

µg/mL nos tecidos prostáticos e, de 2,9 a 6,1 µg/mL nos fluidos prostáticos durante quatro

semanas. Os resultados demonstram que a injeção direta das microesferas biodegradáveis de

liberação sustentada desses compostos dentro da próstata pode ser um substituto de

medicamentos para humanos no tratamento crônico da próstata.

Chawla e Amiji (2002) produziram nanopartículas de PCL encapsulando tamoxifen para

melhorar a quimioterapia do câncer de mama. As nanopartículas apresentaram-se esféricas e com

uma distribuição uniforme (250 – 300 nm).

Baran et al. (2002) produziram microcápsulas de PHBV, com baixa massa molar, pelo

método de dupla emulsão e evaporação do solvente para encapsular enzimas que atuam no

tratamento contra o câncer. Com o aumento da permeabilidade devido as microcápsulas, as

enzimas apresentaram um aumento da atividade antitumoral.

48

A encapsulação dos derivados do ácido nalidíxico em nanopartículas de

polialquilcianoacrilato (PECA) ofereceu muitas vantagens para sua aplicação biológica

aumentando sua biodisponibilidade, controlando o tempo de liberação no sangue e reduzindo a

formação de bactérias. As nanopartículas mostraram um aumento da atividade bacteriana contra

cepas de bactérias padrões da ordem de 10-50 vezes comparados com o fármaco livre (Fresta et

al., 1995). Um estudo similar foi realizado com lipossomas – fosfato ácido diidroxihexadecil

(DP) e com as mesmas cepas. A concentração celular desses compostos encontrada no lipossoma

(~190 nm) foi mais alta do que a apresentada pela nanopartícula de PECA, porém, os valores

referentes ao MIC foram menores quando comparados com os valores apresentados pelas

nanopartículas (Furneri et al., 2000).

1.9 Potencial Zeta

O potencial zeta indica o potencial elétrico (excesso de carga superficial) de superfície das

partículas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão

da dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas

presentes no meio aquoso. Em módulo, um valor de potencial zeta relativamente alto é

importante para uma boa estabilidade físico-química da suspensão coloidal, pois grandes forças

repulsivas tendem a evitar a agregação em função das colisões ocasionais de partículas

adjacentes, além disso, essa característica de superfície das partículas pode alterar a resposta

biológica do fármaco associado (Schaffazick et al., 2003).

49

1.10 Citotoxicidade

A cultura de células in vitro pode ser usada para a avaliação da toxicidade basal e da

toxicidade em órgãos-alvo. A citotoxicidade pode ser definida como a propriedade de ativação

dos mecanismos de morte celular por um composto químico, ou por uma célula mediadora

(célula T citotóxica). Estes testes in vitro são úteis na determinação da citotoxicidade basal, assim

como no estabelecimento da faixa de concentração na qual o composto apresenta atividade. O

estabelecimento da concentração onde 50 % de células são afetadas (IC50) permite comparar

quantitativamente a resposta de um mesmo composto em diferentes sistemas, ou de vários

compostos em um único sistema. Em todos estes testes, as células são cultivadas em placas com

várias concentrações da substância adicionadas ao meio de cultura. Este meio é composto por

soro e nutrientes, fatores de crescimento, e antibióticos sob temperatura adequada. Após um

período de exposição à substância-teste, procedimentos de análise são desenvolvidos, com testes

de citotoxicidade específicos (Eisenbrand et al., 2002).

Os alvos (“endpoints”) celulares dos testes de citotoxicidade são baseados,

principalmente, na perda seletiva da permeabilidade celular, na redução da função mitocondrial e

nas mudanças na morfologia e replicação celular. Cada tipo celular responde por meio de

diversos mecanismos bioquímicos à presença de diferentes compostos. Algumas dessas respostas

são comuns e podem ser utilizadas como marcadores precoces de citotoxicidade, dentre elas a

perda das funções mitocondriais (Eisenbrand et al., 2002).

Portanto, estudos in vitro fornecem importantes ferramentas para ampliar os

conhecimentos sobre os efeitos citotóxicos causados por agentes químicos e para estimar estes

efeitos em humanos. Além disso, a toxicidade é um fator limitante na liberação e consumo de

50

fármacos e, portanto, a análise de toxicidade versus atividade biológica de um composto é

fundamental para determinar sua aplicação estabelecendo-se o índice terapêutico (Freshney,

2000; Melo et al., 2000).

Para uma melhor caracterização da toxicidade de um princípio ativo, diferentes

marcadores de viabilidade celular são utilizados. Entre eles, encontra-se a incorporação do

corante vital vermelho neutro (VN), a redução do sal de tetrazólio (MTT) e a quantificação do

conteúdo de DNA (Corrêa et al., 2005). Ouédraogo et al. (2000) investigaram alguns sítios

celulares envolvidos na toxicidade de quinolonas. Entre esses sítios encontram-se alterações na

mitocôndria e principalmente, lisossomal – que é o maior sítio de localização dos derivados do

ácido nalidíxico.

51

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Preparação e caracterização de micropartículas com polímeros biodegradáveis e

encapsulamento de um composto antitubercular hidrofílico.

2.2 Objetivos específicos

♦ Preparar micropartículas poliméricas através da metodologia de nanoprecipitação utilizando

os polímeros biodegradáveis PLGA, PCL e o co-polímero PHBV.

♦ Preparar micropartículas poliméricas através da metodologia de dupla emulsão

(água/óleo/água) seguida da evaporação do solvente utilizando os polímeros biodegradáveis

PLGA, PCL e o co-polímero PHBV.

♦ Preparar micropartículas poliméricas através da metodologia de simples emulsão (óleo/água)

seguida da evaporação do solvente utilizando o polímero biodegradável PCL.

♦ Caracterizar as micropartículas quanto ao diâmetro e distribuição, a morfologia e o potencial

zeta.

♦ Verificar o rendimento das micropartículas e a eficiência de encapsulamento.

♦ Verificar a liberação do fármaco livre e encapsulado em célula de fluxo.

52

♦ Realizar o teste antibacteriano com o fármaco livre e encapsulado em cepas de

Staphylococcus aureus (ATTC 6538)

♦ Avaliar a citotoxicidade do fármaco livre e encapsulado em células de hepatócito e V79.

♦ Verificar a biodegradação das micropartículas por microscopia eletrônica de varredura.

53

3 Materiais e Métodos

3.1 Materiais utilizados

♦ Acetona (Synth)

♦ Ácido acético (Chemco)

♦ Ácido clorídrico (Nuclear)

♦ Agitador magnético (Corning)

♦ Agitador mecânico (Marconi)

♦ Agulha (25.10 mm)

♦ Álcool polivinílico (PVA) (Aldrich) MM = 30 a 70 kDa

♦ Antibiótico hidrofílico (Biolab - Brasil)

♦ Aparelho LS Particle Size Analyzer/230 (Beckman Coulter)

♦ Aparelho Malvern Zetasizer

♦ Balança analítica (Mettler AE 200)

♦ Balança semi-analítica (Mettler PJ 4000)

♦ Balões volumétricos

♦ Béqueres

♦ Bomba peristáltica (Ismatec)

♦ Célula de fluxo (Nova Ética)

♦ Centrífuga (Allegra X-22R) (Beckman Coulter)

♦ Cepa Staphylococcus aureus (ATCC 6538)

54

♦ Cloreto de metileno (Synth)

♦ Clorofórmio (Lafan)

♦ Corante Tetrazoliumblue Blue (Fluka AG, Ch-9470 Buchs)

♦ Corante vermelho neutro (Sigma)

♦ Desintegrador (modelo 301 – AC)

♦ Diclorometano (Synth)

♦ Espátula

♦ Espectrofluorímetro (Perkim Elmer LS 55)

♦ Espectrofotômetro (UV-VIS) (Du-640B)

♦ Funil de vidro

♦ Incubadora Orbital (modelo MA 83/A)

♦ Liofilizador LB 3000 TT (Terroni - Fauvel)

♦ Meio de Cultura Tryptic Glucose Yeast Agar (Plate Count Agar) (Biolife Italiana)

♦ Meio DMEM (meio Eagle modificado por Dulbecco) (Nutricell)

♦ Membrana Millipore (0,22 µm)

♦ Microplate reader (Cambridge technology – IMC)

♦ Microscópio Eletrônico de Varredura (Jeol JSM-6360LV )

♦ Monoeleato de sorbitan (Span 80) (Sigma)

♦ Poli (ε-caprolactona) (PCL) (Aldrich) MM = 65 kDa

♦ Poli (lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA) (85:15) (Aldrich) MM = 50 a 75 kDa

♦ Poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) (PHB Industrial S.A) MM = 92 kDa

55

♦ Pluronic F-68 (Aldrich) MM = 8.400 Da

♦ Polioxietileno de sorbitan monopalmitato (Tween 40) (Sigma)

♦ Polioxietileno de sorbitan monoleato (Tween 80) (Sigma)

♦ Rotaevaporador

♦ Tubos de ensaio de vidro

♦ Ultra-Sônico (Unique)

♦ Ultra Turrax (UK)

56

3.2 Metodologias

3.2.1 Preparação das micropartículas

3.2.1.1 Método de Nanoprecipitação A (Peltonen et al., 2004)

Preparou-se uma fase orgânica dissolvendo 10 mg do antibiótico hidrofílico (AH) em 60

mL de acetona contendo 250 mg de poli (ε-caprolactona) (PCL) ou poli-(lactídeo-co-glicolídeo)

(PLGA) e 1,2 % de monoeleato de sorbitan (Span 80). Já a fase aquosa foi preparada com 1,2 %

de polioxietileno de sorbitan monopalmitato (Tween 40) em 133 mL de água. A fase orgânica foi

adicionada à fase aquosa com o auxílio de um funil sob agitação mecânica de 400 rpm, durante

20 minutos. Após a formação das micropartículas, o solvente foi evaporado em um

rotaevaporador. As micropartículas foram lavadas três vezes com água destilada, centrifugadas a

10.000 rpm (30 min, T= 4º C), congeladas em nitrogênio líquido e liofilizadas.

3.2.1.2 Método de Nanoprecipitação B (Dong e Feng, 2004)

Uma solução contendo 20 mL de acetona, 100 mg de PLGA e 2 mg de AH foi adicionada

com o auxílio de um funil numa fase aquosa contendo 40 mL água e 0,5 % de Pluronic F-68 Da

sob agitação mecânica de 400 rpm, durante 20 minutos. Após este período, o solvente orgânico

foi evaporado em rotaevaporador. As micropartículas foram lavadas três vezes com água

destilada, centrifugadas a 4.000 rpm (30 min, T= 25º C), congeladas em nitrogênio líquido e

liofilizadas.

57

3.2.1.3 Método de dupla emulsão (água/óleo/água) e evaporação do solvente C (Ubrich et

al., 2004)

Uma solução de 50 mg/mL de AH foi emulsificada em uma fase orgânica contendo 10

mL de diclorometano ou clorofórmio e 250 mg de PCL, PLGA ou poli (3-hidroxibutirato-co-3-

hidroxivalerato) (PHBV) sob agitação magnética. Em seguida, esta emulsão foi adicionada em

200 mL de solução aquosa (pH 6.9) com 0,25 % de álcool polivinílico (PVA) sob agitação

mecânica a 460 rpm. (). Após a evaporação do solvente orgânico, as micropartículas foram

lavadas três vezes com água destilada, centrifugadas a 15.000 rpm (30 min, T= 4º C), congeladas

em nitrogênio líquido e liofilizadas. Vários parâmetros nesta metodologia foram alterados, como

pode ser observado na Tabela 5.

58

Tabela 5: Resumo das variações do método C.

Método Fármaco

(mg/mL)

Polímero

(mg/mL)

% Tensoativo

(m/v)

Modo de adição

da 1ª emulsão

Modo de adição da

1ª emulsão na fase

aquosa externa

C1 50 25 0,25 Vertedura Gotejamento




C5 10 50 0,25 Ultrason 60 s Vertedura

C6 10 50 0,25 Ultrason 60 s Gotejamento

C7 - 50 0,25 Vertedura Ultra Turrax

e gotejamento

C8 50 50 0,25 Ultrason 60 s Gotejamento

C9 50 50 0,5 Ultrason 60 s Vertedura

C10 50 50 0,5 Ultrason 60 s Ultra Turrax

Em todas as variações da metodologia C, a formação da 2º emulsão e evaporação do

solvente foi sob agitação mecânica a 460 rpm, com exceção da C10, que a agitação foi sob ultra-

turrax (11.000 rpm) mantido até a total evaporação do solvente orgânico.

3.2.1.4 Método de emulsão simples (óleo/água) e evaporação do solvente D (Habib et al.,

1999).

Foram adicionados 250 mg de AH em uma solução orgânica contendo 8 mL de

diclorometano e 500 mg de PCL sob agitação magnética. Em seguida, esta solução foi adicionada

59

em 25 mL de solução aquosa (pH 6.9) com 2,5 g de álcool polivinílico sob agitação mecânica a

460 rpm. Após a evaporação do solvente orgânico, as micropartículas foram lavadas três vezes

com água deionizada, centrifugadas a 15.000 rpm (30 min, T= 4º C), congeladas em nitrogênio

líquido e liofilizadas.

3.2.2 Caracterização das Micropartículas

3.2.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

As micropartículas foram caracterizadas quanto à morfologia por microscopia eletrônica

de varredura (MEV). Uma pequena quantidade de micropartículas foi adicionada a um porta-

amostra com fita de carbono e metalizado com Au/Pd por Sputtering (evaporação do metal e

deposição de uma fina camada sobre a amostra) utilizando-se um metalizador BAL-TEC. As

análises foram realizadas em um Microscópio Eletrônico de Varredura (Jeol JSM-6360LV),

utilizando-se uma tensão de aceleração de 20 KV e detectores de elétrons secundários e elétrons

retroespalhados.

3.2.2.2 Potencial Zeta

A carga superficial das partículas foi analisada pelo equipamento Malvern Zetasizer. As

micropartículas foram ressuspensas em solução de 1 mmol.L-1 de NaCl e cada amostra foi

medida 5 vezes (Maia et al., 2004).

60

3.2.2.3 Tamanho médio e distribuição de tamanho das partículas

A distribuição do tamanho das partículas foi determinada em aparelho LS Particle Size

Analyzer/230 (Beckman Coulter), que opera pelo princípio de difração de raios laser. Uma

pequena quantidade de partículas foi dispersa em Tween 80 com água destilada e analisada. O

perfil de polidispersidade (diâmetro médio e dispersão em diâmetro) foi calculado pelo índice

span, o qual foi calculado através da equação:

D0,9 – D0,1 / D0,5 ,

onde D0,1 , D0,5 e D0,9 são respectivamente os diâmetros de partículas referentes a 10, 50 e 90 %

da distribuição acumulada (Maia et al., 2004).

3.2.3 Atividade antimicrobiana do Antibiótico Hidrofílico

A atividade do antibiótico hidrofílico foi avaliada pelo método da concentração mínima

inibitória (MIC), observando-se a formação do halo de inibição (Pranoto et al., 2005). A

atividade do AH foi avaliada em meio sólido em cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 6538).

As vidrarias e o meio de cultura de Plante Count Agar foram esterilizados a 121º C por 30

minutos. Após o resfriamento do meio, adicionou-se o marcador respirométrico Tetrazoliumblue

na concentração de 20 mg/L. Em capela de fluxo laminar foram preparadas as placas, vertendo os

meios e inoculando a bactéria. Com o meio a aproximadamente 40º C, foi inoculado 3,0 x 103

UFC/mL de S. aureus e realizado a completa homogeneização da amostra. Após a solidificação

do Agar, foram feitos dois poços por placa com pipeta invertida na placa de cultura. As unidades

formadoras de colônias (UFC) foram determinadas por diluição sucessiva e plaqueamento. As

61

amostras foram feitas em duplicata. Adicionou-se em cada poço 100 µL de solução do fármaco

livre e encapsulado em micropartículas de PCL na concentração de 0,5 µg/mL (MIC). Após a

adição do fármaco, as placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37° C por 24 horas.

Após este período, mediu-se o halo de inibição por régua milimétrica.

3.2.4 Eficiência de encapsulamento e rendimento das micropartículas

A determinação da eficiência de encapsulamento foi determinada por

Espectrofluorimetria (Perkin Elmer LS 55) (fendas 5,0 nm e velocidade de varredura de 1.500

nm/min). Uma solução aquosa (pH = 4.0) contendo 1,0 µg/mL de AH foi preparada. A partir

desta solução foram feitas sucessivas diluições numa faixa de 1,0 µg/mL a 0,1 µg/mL. O

comprimento de onda utilizado foi λex = 292 nm (González et al., 2000). Em 3 mL de solução

aquosa, 30 mg de micropartículas de PCL contendo o antibiótico hidrofílico foram dispersas e

agitadas manualmente. Em seguida, uma alíquota de 2 mL de cada amostra contendo o fármaco

foi coletada e analisada no espectrofluorímetro.

O rendimento das micropartículas foi calculado através da equação (Govender et al.,

1999):

R (%) = massa da micropartícula recuperada ____ x 100

massa do polímero + massa do fármaco utilizado na formulação

62

3.2.5 Avaliação da liberação sustentada do fármaco

A determinação da liberação sustentada do antibiótico hidrofílico (AH) encapsulado foi

analisada por Espectrofotometria UV-VIS (Hitachi). O meio de dissolução foi tampão fosfato 50

mmol/L (pH 7,4). Uma curva analítica foi construída preparando-se uma solução contendo 1

mg/mL de AH e a partir desta solução foram feitas sucessivas diluições numa faixa de 10 µg/mL

a 1 µg/mL. No estudo da liberação do fármaco encapsulado foi adicionado 150 mg de

micropartículas contendo 0,104 mg de AH numa célula de fluxo (Figura 6 A). A mesma

quantidade de antibiótico hidrofílico livre foi adicionada na célula de fluxo para o estudo da

dissolução do fármaco livre. As alíquotas foram analisadas no comprimento de onda λ = 283 nm

(Obach, 2002).

O estudo da liberação sustentada do AH encapsulado foi realizado em célula de fluxo que

consiste de células de vidro de diâmetro interno de 1,8 cm conectadas a uma bomba peristáltica

através de cânulas de silicone (Figura 6 B). O meio de dissolução e as células de vidro foram

mantidos em banho termostatizado a 37 ° C. Membranas de fibra de vidro (AP25, Millipore) com

poros entre 300 e 1000 µm foram acopladas as células de vidro, a fim de impedir a passagem de

adjuvantes, para a alíquota a ser coletada. O fluxo de meio de dissolução foi de 1 mL/min e foram

coletadas alíquotas, em provetas, de tempo em tempo a analisadas por UV-VIS.

63

A B

Figura 6: Fotografia da célula de fluxo: células de vidro conectadas a uma bomba peristáltica através de cânulas de

silicone.

3.2.6 Avaliação da citotoxicidade

3.2.6.1 Preparo das culturas de células V79

As células utilizadas nos experimentos eram do tipo fibroblástico, da linhagem

estabelecida em cultura V79 clone M-8, oriunda de pulmão de Hamster Chinês (Cricetulus

griseus). Os fibroblastos foram mantidos em cultura contínua em garrafas para cultura de 25 cm2

(TPP, Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) através de repiques periódicos até

atingirem a densidade de confluência. O cultivo foi realizado em meio DMEM suplementado

com 10 % de soro fetal bovino (Nutricell), 100 UI/mL de penicilina, e 100 µg/mL de sulfato de

estreptomicina (Nutricell). A incubação foi realizada em estufa a 37 ºC sob atmosfera úmida e

contendo 5 % de CO2 (Melo et al., 2000).

Nos diferentes ensaios de citotoxicidade que avaliam a viabilidade celular, o

plaqueamento foi realizado utilizando-se placas de 24 cavidades (IWAKI, Asahi Techno Glass,

Co., Funabasi, Japan), plaqueando-se 3 x 104 células/mL em cada cavidade (100 µL/cavidade)

seguido de incubação a 37 ºC por 48 horas. O meio foi retirado 48 horas após o plaqueamento das

64

células e as culturas foram expostas durante 24 horas ao meio DMEM suplementado contendo

diferentes concentrações do antibiótico hidrofílico livre e do AH veiculado nas micropartículas

de PCL. Após 24 horas de tratamento, as culturas foram processadas de acordo com os protocolos

específicos dos testes para determinação do conteúdo de ácidos nucléicos, incorporação do

vermelho neutro e redução do MTT (Corrêa et al., 2005).

3.2.6.2 Preparo das culturas de células de hepatócitos

Os hepatócitos foram extraídos de fígado de ratos machos Wistar (200 - 250 g) usando a

técnica de perfusão em duas etapas (Guguen-Guillouzo et al., 1986) com algumas modificações.

Os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral 15 % (1,5 mL por via intraperitoneal) e

posteriormente o fígado foi perfundido com tampão Hanks por 20 minutos a 25 mL/min e

posteriormente com o mesmo tampão contendo colagenase 0,05 % e cloreto de cálcio 1 mM por

20 minutos a 15 mL/min. Os hepatócitos descolados por ação da colagenase foram ressuspensos

em meio de DMEM suplementado com 50 UI/mL de sulfato de estreptomicina, 50 µg/mL de

penicilina, 0,2 % de albumina bovina, 0,1 UI/mL de insulina bovina, 10-6 M de dexametasona, 1

% de DMSO (dimetilsulfóxido) e 10 % de soro fetal bovino. Foram plaqueadas 6 x 105 células

viáveis/mL (viabilidade avaliada pelo teste de exclusão do Azul Tripan) em placas de cultura

com 24 cavidades.

As células foram incubadas à 37 ºC sob atmosfera de 5 % de CO2 por 4 horas para que se

aderissem nas placas. Após 4 horas de incubação o meio foi trocado para remoção das células que

não aderiram e posteriormente foi adicionado meio DMEM, semelhante ao inicial com exceção

do soro fetal bovino, contendo diferentes concentrações do antibiótico hidrofílico livre e do AH

veiculado nas micropartículas de PCL, sendo as células novamente incubadas a 37 ºC em 5 % de

65

CO2 até completar às 24 horas de cultivo, tempo equivalente a 20 horas de tratamento. Após este

período de incubação o meio foi retirado e em seguida as culturas foram processadas de acordo

com os protocolos específicos para os testes de determinação do conteúdo de ácidos nucléicos,

incorporação do vermelho neutro e redução do MTT (Corrêa et al., 2005).

3.2.6.3 Tratamento das células

As células foram tratadas com soluções de antibiótico hidrofílico em meio DMEM nas

concentrações de 300 e 400 mMol/L. Em cada poço da placa foram adicionados 100 µl de

solução do fármaco hidrofílico quinolônico.

3.2.6.4 Ensaio de Vermelho Neutro (análise da integridade da membrana lisossomal)

O teste de incorporação do vermelho neutro foi realizado de acordo com o método de

Borenfreund & Puerner (1984). Após os tempos de tratamento de cada célula o meio de cultura

foi trocado por meio DMEM puro contendo 50 µg/mL de vermelho neutro, sendo as células

incubadas novamente por 4 horas a 37 ºC. Após incubação o meio com vermelho neutro foi

retirado e as células foram lavadas duas vezes com PBS- Ca++ para retirada do excesso de corante

não incorporado pelos lisossomos. A cada cavidade foram adicionados 100 µL de solução aquosa

contendo 1 % de ácido acético glacial e 50 % de etanol para fixar as células e extrair o vermelho

neutro incorporado nos lisossomas. As placas foram agitadas por 20 minutos em um agitador de

placas e as absorbâncias das soluções foram lidas a 540 nm em um Microplate Reader (Cambrige

technology –IMC).

66

3.2.6.5 Ensaio do MTT (análise da quantificação de células viáveis)

O meio de cultura com antibiótico hidrofílico foi removido e trocado por outro sem soro

contendo o corante brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazólio] (MTT) (1

mg/mL), e as células foram incubadas durante 4 horas, tempo necessário para a redução

acontecer. O meio foi retirado cuidadosamente e foi adicionado 1 mL de etanol para solubilização

do formazan (composto formado pela redução do sal de tetrazólio, capaz de demonstrar enzimas

oxidativas presentes nas células). As placas foram agitadas por 5 minutos em um agitador de

placas e a absorbância das soluções foram lidas em um Microplate reader (Cambrige technology

–IMC) a 570 nm (Denizot e Lang, 1986).

3.2.6.5 Ensaio do Conteúdo de Ácidos Nucléicos (AN)

O número de células nas cavidades controles e tratadas foram estimados através da

quantificação dos ácidos nucléicos conforme Cingi et al. (1991). Após os tempos de tratamento

de cada célula o meio foi retirado e as células foram lavadas duas vezes com tampão PBS-Ca++ e

duas vezes com etanol (todas as soluções geladas), secas ao ar e lisadas com NaOH 500 mM (100

µL/cavidade, 1 hora a 37 ºC). A absorbância da fração NaOH a 260 nm (UV-visible DU® 640B

Spectrophotometer, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, USA) foi utilizada como índice

do número de células e os resultados foram expressos com porcentagem da absorbância das

células não tratadas.

67

3.2.7 Avaliação da biodegradação das micropartículas poliméricas

Para a avaliação da degradação das micropartículas poliméricas de PCL e PLGA, foram

preparadas amostras contendo 25 mg de micropartículas que foram adicionadas em 4 mL de uma

solução 50 mM de tampão fosfato (pH = 7,4). Em seguida, elas foram acondicionadas numa

incubadora (37 º C) sob agitação constante de 120 rpm durante 30 dias. Entre intervalos de dias,

as amostras foram retiradas e centrifugadas (2 x 4500 rpm). Após as lavagens, as amostras foram

colocadas sobre um porta amostra para serem analisadas quanto à morfologia da superfície

polimérica por microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Chen et al., 1999).

68

4 Resultados e Discussões

4.1 Métodos de preparação

As micropartículas foram preparadas por diferentes metodologias e alguns parâmetros

foram modificados (conforme descritos na página 60). Como por exemplo, a influência do

tensoativo, a influência da quantidade de polímero e do fármaco, a influência do modo de adição

da primeira emulsão na fase aquosa externa e a influência da agitação, que serão discutidos

posteriormente. Os polímeros biodegradáveis utilizados foram o poli-(lactídeo-co-glicolídeo),

poli-(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) e o poli-(ε-caprolactona). Os tensoativos utilizados

foram: o álcool polivinílico (PVA), o Pluronic F-68, o monoeleato de sorbitan (Span 80) e o

polioxietileno de sorbitan monopalmitato (Tween 40).

4.1.1 Método de nanoprecipitação

Com a metodologia de nanoprecipitação (A) (Peltonem et al., 2004), descrita

anteriormente, utilizando PCL, o antibiótico hidrofílico, Span 80 e Tween 40, não se obteve

micropartículas mas apenas um aglomerado de polímero, como mostra as micrografias da Figura

7. Este aglomerado foi verificado na etapa de centrifugação (3 x 10.000 rpm, 30 min, 4º C) onde,

observou-se no fundo do tubo um aglomerado de difícil redispersão.

69

A B C

Figura 7: Micrografias de micropartículas de PCL (método de nanoprecipitação, A): 250 mg de PCL, 10 mg de AH

e 1,2 % de Span 80 e 1,2 % Tween 40. Aumento de: A) x 7500, B) x 5000, C) x 1800.

Uma vez que, com a metodologia A não se obteve micropartículas, outra metodologia foi

testada com outro tensoativo de acordo com Dong e Feng (2004). Nesta metodologia

(metodologia B) qual foram utilizados PLGA, o antibiótico hidrofílico e Pluronic F-68,

novamente não houve formação das micropartículas, como pode ser observado na Figura 8. Por

este motivo, outros métodos foram testados, como mostrados a seguir.

A B C

Figura 8: Micrografias de micropartículas de PLGA (método B): 100 mg de PLGA, 2 mg de AH e 0,25 % de

Pluronic F-68. Aumento de: A) x 180, B) x 270 e C) x 1300.

70

4.1.2 Método de dupla emulsão (água/óleo/água) e evaporação do solvente

De acordo com Lamprecht et al. (2000), a metodologia de dupla emulsão (a/o/a) seguida

da evaporação do solvente é a mais apropriada para encapsular fármacos hidrofílicos e proteínas

dentro de micro e nanopartículas. Diversos experimentos e modificações em alguns parâmetros

foram realizados como descritos anteriormente na metodologia C (Ubrich et al., 2004). Diferentes

polímeros foram testados com o intuito de escolher o melhor polímero na preparação de

micropartículas.

Inicialmente, testou-se o polímero PLGA e o antibiótico hidrofílico. Através da análise

por MEV, observou-se que as micropartículas com o AH ficaram agregadas (Figura 9 A) e

apresentaram adesão capilar (interação de maior energia entre duas superfícies) (Figura 9 B). O

tamanho médio medido por MEV das micropartículas foi de 28 µm. No entanto, as

micropartículas sem o fármaco não ficaram agregadas e o diâmetro médio medido por MEV foi

de 25 µm (Figura 9 C). Em ambas amostras o rendimento das micropartículas de PLGA foi de 45

% apresentando superfície lisa e morfologia esférica.

A B C

Figura 9: Micrografias das micropartículas de PLGA (método C1): 250 mg de PLGA e 0,25 % de PVA. Aumento

de: A) Com 50 mg de AH x 140, B) Com 50 mg de AH x 500 e C) Sem AH x 500.

71

Outro polímero testado foi o PHBV. As micropartículas de PHBV com o antibiótico

hidrofílico encapsulado, diferentemente das micropartículas de PLGA, apresentaram uma

superfície rugosa (Figura 10 A). Além disso, as micropartículas de PHBV apresentaram uma

morfologia esférica e não se observou a presença de aglomerados (Figura 10 B) sendo uma

vantagem em relação ao uso do polímero PLGA. O tamanho medido por MEV das

micropartículas foi entre 20 - 50 µm e o rendimento foi de 35 %.

A B

Figura 10: Micrografias das micropartículas de PHBV (método C1): 250 mg de PHBV, 50 mg de AH e 0,25 %

PVA. Aumento de: A) x 1200 e B) x 300.

Quando o polímero PCL foi utilizado, micropartículas sem fármaco encapsulado foram

obtidos e apresentaram uma superfície lisa e morfologia esférica (Figura 11 A e B). O tamanho

das micropartículas medido por MEV foi entre 40 – 60 µm e o rendimento foi de 37 %. Por outro

lado, as micropartículas com o AH, formaram esferas deformadas (Figura 11 C), o tamanho

medido por MEV foi entre 30 – 60 µm e o rendimento foi de 56 %. As micropartículas, também,

estavam agregadas apresentando adesão capilar (Figura 11 D).

72

A B

C D

Figura 11: Micrografias das micropartículas de PCL (método C1): 250 de mg PCL e 0,25 % de PVA. Aumento de:

A) Sem AH x 1500, B) Sem AH x 330, C) Com 50 mg de AH x 2000 e D) Com 50 mg de AH x 500.

4.1.2.1 Problemas no processo de liofilização

O processo de liofilização é utilizado para a secagem de dispersão de micropartículas

sendo a última etapa na preparação. Neste processo, a amostra é congelada em nitrogênio líquido

e em seguida a água é removida através do processo de sublimação. Ansel et al. (2000)

descreveram que qualquer alteração durante a liofilização pode afetar diretamente a formação das

micropartículas e que, neste processo, o congelamento e o descongelamento da amostra durante a

liofilização podem causar irregularidades nas partículas. Nos experimentos em que o liofilizador

apresentou problemas, descongelando e congelando novamente as amostras, o rendimento das

73

micropartículas diminuiu para 3 %, obteve-se micropartículas maiores (300 – 500 µm) e

deformações na superfície foram observadas como mostram as micrografias da Figura 12.

A B C

Figura 12: Micrografias das micropartículas de PLGA preparadas com 250 mg de PLGA, 50 mg de AH e 0,25 % de

PVA (método C1). Aumento de: A) x 180, B) x 200 e C) x 330.

Micropartículas utilizando os polímeros PLGA, PHBV e PCL foram obtidos pela

metodologia de dupla emulsão e evaporação de solvente. Entretanto, foi escolhido apenas um dos

polímeros para dar continuidade aos experimentos deste trabalho. O polímero escolhido foi o

PCL por ter um custo menor do que o PLGA, por ser aprovado pelo FDA (Food and Drug

Administration) e os resultados foram mais encorajadores. O polímero PHBV apesar de ter um

custo menor do que o PCL este não é aprovado pelo FDA sendo, portanto, não utilizado na

continuidade do trabalho.

4.1.2.2 Estudo da influência do tensoativo

Foram testados dois tensoativos, o PVA e o Pluronic F-68. Quando foi utilizado o

tensoativo Pluronic F-68 com PCL e o antibiótico hidrofílico (método C2), na qual, foram

observadas poucas micropartículas sendo que estas se apresentavam aglomeradas. Além disto,

74

muito resíduo foi observado nesta preparação que, possivelmente, seja resíduo de Pluronic F-68

(Figura 13 A). Após a centrifugação, o precipitado formava uma “camada” grossa de resíduo no

fundo do tubo de centrifugação, dificultando a lavagem das partículas. No entanto, quando foi

utilizado o tensoativo PVA as micropartículas obtidas apresentaram morfologia esférica e menos

resíduos entre as micropartículas quando comparado com o Pluronic F-68 (Figura 13 B). Este

fato pode ter ocorrido, provavelmente, devido à influência das características do solvente

orgânico com o tensoativo como, por exemplo, a polaridade, que pode afetar a quantidade de

tensoativo adsorvido na interface orgânica/aquosa (Sahoo et al., 2002). Nesta preparação

utilizando o tensoativo PVA, o rendimento foi de 45 % e as partículas tiveram um tamanho

médio medido por MEV de 20 a 55 µm. Quando aumentamos a quantidade do tensoativo PVA

(método C9) (Figura 13 C), observou-se que as micropartículas ficaram menos aglomeradas e o

rendimento das MP aumentou para 60 %. Com base nestes resultados foi utilizado apenas o

tensoativo PVA nas demais preparações das micropartículas.

A B C

Figura 13: Micrografias das micropartículas de 250 mg de PCL, 10 mg de AH (método C2). Aumento de: A) Com

0,25 % de Pluronic x 1600, B) Com 0,25 % de PVA x 500 e C) Com 500 mg de PCL, 50 mg de AH e 0,5 % PVA x

500.

75

4.1.2.3 Estudo da influência da quantidade do polímero e do fármaco

Com o objetivo de aumentar o rendimento das preparações foram alteradas as quantidades

adicionadas do polímero e do antibiótico hidrofílico. Quando a quantidade do polímero PCL foi

aumentada em 2 vezes (Figura 14 A) seguindo a metodologia C3, as micropartículas com o AH

apresentaram um tamanho médio medido por MEV entre 20 - 50 µm e um rendimento de 45 %,

não mostrando uma diferença significativa em relação ao tamanho médio apresentado pela outra

metodologia (comparado com a Figura 13 B). No entanto, a superfície das esferas apresentou

pequenos poros (Figura 14 A). Estes poros observados na superfície das micropartículas podem

influenciar na taxa de liberação do fármaco, fazendo com que este seja liberado mais rapidamente

das micropartículas poliméricas. Sendo assim, este resultado demonstra a possibilidade no

controle da liberação do fármaco.

Quando a quantidade do fármaco foi aumentada em 5 vezes (metodologia C1) o

rendimento da preparação aumentou para 56 % demonstrando uma influência da quantidade do

fármaco no rendimento. A Figura 14 B mostra as micropartículas obtidas neste experimento.

O aumento simultâneo da quantidade de polímero e do fármaco, de 250 mg para 500 mg e

de 10 mg para 50 mg, aumentou o rendimento da preparação da metodologia C4 para 78 %. As

micropartículas da metodologia C4 apresentaram-se um pouco aglomeradas e com adesão capilar

(Figura 14 C) e o tamanho médio, medido por MEV, foi entre 30 - 60 µm. Com o aumento das

concentrações do polímero e do fármaco, o rendimento das preparações aumentou,

provavelmente, devido ao aumento das massas utilizadas no método sendo por isto utilizado nos

demais experimentos 500 mg de PCL e 50 mg de AH.

76

A B C

Figura 14: Micrografias das micropartículas de PCL preparadas com 0,25 % PVA e: Aumento de: A) 500 mg de

PCL e 10 mg de AH x 330 e B) 250 mg de PCL e 50 mg de AH x 180, C) 500 mg de PCL e 50 mg de AH x 200.

4.1.2.4 Estudo da influência do modo de adição

Duas formas de adição da primeira emulsão na fase aquosa externa com PVA (0,25 %)

foram testadas. Quando a primeira emulsão (sonicada por 60 s) foi gotejada na fase aquosa

externa para formar a segunda emulsão (metodologia C6) micropartículas poliméricas com o

antibiótico hidrofílico foram obtidas (Figura 15 A) e apresentaram um tamanho médio, medido

por MEV, entre 20 a 50 µm e um rendimento de 66 %. Quando a primeira emulsão (sonicada por

60 s) foi vertida na fase aquosa externa (metodologia C5), não foi observada diferença

significativa no tamanho das micropartículas (13 a 50 µm), entretanto, as partículas

apresentaram-se mais aglomeradas (Figura 15 B) e o rendimento foi de 50 %. Portanto, para este

método de dupla emulsão e evaporação de solvente orgânico a melhor maneira de adição da

primeira emulsão na fase aquosa externa foi por gotejamento.

77

A B

Figura 15: Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL e 0,25 % de PVA, quando a primeira emulsão foi.

Aumento de: A) Gotejada na fase aquosa externa x 350 e B) Vertida na fase aquosa externa x 300.

4.1.2.5 Estudo da influência da agitação

A velocidade e o tipo de agitação são fatores que influenciam na formação das

micropartículas. Foram testados dois tipos de agitação, utilizando sonicação por sonda e ultra

turrax (Figura 16 A e B) na formação da primeira emulsão. Utilizando a agitação por sonicação

por sonda durante 60 s na formação da primeira emulsão obteve-se micropartículas de PCL com

(Figura 17 A) e sem o fármaco (Figura 17 B). Estas ficaram aglomeradas e apresentaram adesão

capilar e o tamanho médio, medido por MEV, para as micropartículas de PCL com o antibiótico

hidrofílico foi entre 13 a 50 µm e sem o AH foi entre 10 a 40 µm. O rendimento destas

preparações foi de 50 %. Quando se aumentou a quantidade de polímero e AH, as micropartículas

formadas tiveram tamanho médio medido por MEV entre 20 a 80 µm (Figura 17 C) e o

rendimento foi de 68 %, apresentando, portanto, um aumento no tamanho e no rendimento das

micropartículas.

78

A B

Figura 16: Fotografia do aparelho Ultra turrax.

A B C

Figura 17: Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL e 0,25 % PVA, utilizando agitação por sonicação

por sonda. Aumento de: A) Com 10 mg de AH x 300, B) Sem AH x 350 e C) Com 50 mg de AH x 100.

Quando foi utilizada a agitação em ultra turrax (11.000 rpm) por 5 minutos na formação

da primeira emulsão (metodologia C7) foram obtidas micropartículas de PCL sem o AH com

tamanho médio, medido por MEV, entre 30 a 60 µm (Figura 18 A) não apresentando diferença

significativa no tamanho médio das micropartículas em relação à agitação por sonicação por

sonda. Porém, a morfologia das MP foi alterada, ou seja, apresentaram-se como esferas

deformadas (Figura 18 B). Esta deformação pode ter sido causada pela alta velocidade de

79

agitação (11.000 rpm). O rendimento da preparação aumentou para 76 % demonstrando uma

influencia da agitação no rendimento de formação das partículas.

A B

Figura 18: Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL sem o AH e 0,25 % de PVA, utilizando agitação em

ultra turrax. Aumento de: A) x 350 e B) x 100.

Adicionalmente, quando a quantidade de PVA foi aumentada (médodos C9 e C10) as

micropartículas de PCL apresentaram tamanho médio, medido por MEV, entre 8 a 30 µm (Figura

19 B) e um rendimento de 80 % (Figura 19 A). Desta forma, a agitação em ultra turrax foi melhor

do que a agitação em ultrason.

A B

Figura 19: Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL sem o AH e 0,25 % de PVA, utilizando agitação em

ultra turrax. Aumento de: A) Método C9 x 1000 e B) Método C10 x 100.

80

Na tentativa de aumentar a eficiência de encapsulamento do fármaco hidrofílico (AH), o

método de emulsão simples (o/a) e evaporação do solvente (método D) foi avaliado. As

micropartículas de PCL com antibiótico produzidas apresentaram superfície lisa e esférica

(Figura 20). O tamanho médio medido por MEV foi de 860 nm a 3,52 µm e o rendimento foi de

aproximadamente 35 %. Por esta metodologia, as micropartículas apresentaram uma diminuição

no tamanho médio e uma boa polidispersidade (índice de span <2). Entretanto, não houve um

aumento significativo na eficiência de encapsulamento. A metodologia de simples emulsão e

evaporação do solvente é mais citada na literatura para encapsular fármacos lipofílicos (Pérez et

al., 2000).

A B C

Figura 20. Micrografias das micropartículas de 500 mg de PCL, 250 mg de AH e 2.5 g de PVA (método de emulsão

simples (o/a). Aumento de: A) x 1.500, B) x 3.000 e C) x 10.000.

4.2 Potencial Zeta

De acordo com Soppimath et al. (2001), o valor do potencial zeta pode ser positivo ou

negativo dependendo da natureza do polímero utilizado ou do material usado para modificar a

81

superfície da partícula. Na determinação do potencial zeta, verificou-se que independentemente

do polímero utilizado, as partículas apresentaram carga negativa e, a adição do antibiótico

hidrofílico, tornou essas partículas, menos negativas, como mostra a Tabela 6.

Tabela 6: Potencial Zeta.

Metodologia Potencial Zeta (mV) SD

C1 com PLGA, sem fármaco (a/o/a) -3,9 0,24

C1 com PLGA e fármaco (a/o/a) -5,8 0,19

C1 com PHBV, sem fármaco (a/o/a) -5,7 0,71

C1 com PHBV e fármaco (a/o/a) -12,4 2,11

C1 com PCL, sem fármaco (a/o/a) -7,1 0,91

C1 com PCL e fármaco (a/o/a) -7.8 0,58

C2 com PCL e fármaco (a/o/a) -2,1 0,44


C3 com PCL e fármaco (a/o/a) -5.4 0,89


C5 com PCL e com fármaco (a/o/a) -4.8 0,45

C6 com PCL e com fármaco (a/o/a) -4,0 1,10

C10 com PCL e com fármaco (a/o/a) -4,2 0,59

D com PCL e com fármaco (o/a)

-5,1 0,18

82

4.3 Tamanho médio e distribuição do tamanho das partículas

O tamanho médio das micropartículas obtidas por diferentes métodos foi medido pelo LS

Particle Size Analyzer e, de um modo geral, as partículas apresentaram baixa polidispersidade

(índice de span < 2) como mostra a Tabela 7. Nesta Tabela observa-se que a encapsulação do

fármaco AH com os polímeros PLGA e PHBV aumentou o tamanho das micropartículas de 26,84

± 3,12 para 26,94 ± 1,82 e de 35,25 ± 1,82 para 35,84 ± 2,07, respectivamente. Quando o

fármaco foi encapsulado com PCL (C5), as micropartículas apresentaram uma redução no

diâmetro de 34,17 ± 2,76 para 27,68 ± 3,48. No entanto, quando o ultra-turrax (11.000 rpm) foi

utilizado, conforme a metodologia C10, o diâmetro das micropartículas de PCL diminuiu para

2,52 ± 1,89, sugerindo, portanto, que o aumento da velocidade de agitação pode diminuir o

tamanho médio das micropartículas poliméricas. O diâmetro das micropartículas formadas,

conforme a metodologia D (o/a), foi de 2,52 ± 1,89 (sem o fármaco) e de 2,54 ± 1,95 com o

fármaco encapsulado.

83

Tabela 7: Diâmetro médio e índice de polidispersidade das micropartículas.

Metodologia D10 D50 D90 Estimativa do

Desvio Padrão

(SD)

Índice de

Span

C1 com PLGA,

sem AH

3,24 26,84 52,50 3,12 1,83

C1 com PLGA e

AH

4,58 26,94 35,66 2,49 1,15

C1 com PHBV,

sem AH

21,89 35,25 50,29 1,82 0,80

C1 com PHBV e

AH

12,43 35,84 62,73 2,07 1,40

C3 com PCL e

AH

2,61 31,60 57,71 19,56 1,74

C5 com PCL,

sem AH

15,19 34,17 48,50 2,76 0,97

C5 com PCL e

AH

4,62 27,68 39,86 3,48 1,27

C8 com PCL,

sem fármaco

6,84 47,66 76,86 3,42 1,46

C10 com PCL,

sem fármaco

29.91 81.20 118.3 2.57 1.08

D com PCL, sem

fármaco

0,99 2,52 5,28 1,89 1,70

D com PCL e AH 1,11 2,54 5,76 1,95 1,83

84

4.4 Eficiência de Encapsulamento

Para o cálculo da eficiência de encapsulamento foi necessário a construção de uma curva

analítica de acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária , na qual, a curva analítica

deve apresentar coeficiente de correlação r > 0,99 e precisão ≤ 2 % (Anvisa, 2003) Portanto, o

método de Espectrofluorimetria foi realizado e a curva analítica está representada na Figura 21. A

equação da reta obtida para a curva nas concentrações de 0,1 µg/mL a 1 µg/mL, diluídas a partir

de uma solução aquosa (pH = 4.0) contendo 1,0 µg/mL de AH foi y = 15,7 + 620,3x (µg/mL), o

coeficiente de determinação foi r 2= 0,991.

Figura 21: Curva analítica para a determinação da eficiência de encapsulamento do AH por Espectrofluorimetria

(λ= 292 nm).

.

A determinação da eficiência de encapsulamento através do método de

espectrofluorimetria é muito simples, sensível e exato (Hesham, 2005). Através desta curva de

calibração, foram medidas as eficiências de encapsulamento do antibiótico hidrofílico nas

micropartículas preparadas pelo método de dupla emulsão (a/o/a) (C1 a C10) e emulsão simples

(o/w) (D). A eficiência de encapsulamento em todos os experimentos foi de aproximadamente 2

%, portanto, as alterações no método de dupla emulsão (a/o/a) seguida da evaporação do solvente

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,60

100

200

300

400

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

rela

tiva

Concentração (µg/mL)

85

não influenciaram significativamente na eficiência de encapsulamento. Altas eficiências de

encapsulamento de fármacos hidrofílicos em micro/nanopartículas são difíceis de obter, pois,

podem facilmente passar para a fase externa, não permanecendo no interior das partículas. Essa

passagem pode ocorre devido às interações fracas entre o polímero e o fármaco (Peltonen et al.,

2004). E a metodologia de simples emulsão (o/a) seguida da evaporação do solvente mostrou-se

viável para diminuir o diâmetro das micropartículas poliméricas, mas também, não foi eficaz no

aumento da eficiência de encapsulamento do fármaco.

4.5 Liberação sustentada do fármaco encapsulado

Para o estudo da liberação do fármaco encapsulado, outra curva analítica foi construída

(Figura 22), pois o meio de liberação foi em tampão fosfato (pH 7,4). A partir de uma solução 50

mM de tampão fosfato (pH = 7,4) foram feitas as diluições nas concentrações de 1 µg/mL a 10

µg/mL. A equação da reta foi y = -0,026 + 56,19x (µg/mL) e o coeficiente de correlação foi r 2=

0,9965.

Figura 22: Curva analítica para a determinação da liberação sustentada do AH por UV-VIS (λ= 283 nm).

0 2 4 6 8 100,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abso

rbân

cia

Concentração (µg/mL)

86

O perfil de liberação do antibiótico hidrofílico encapsulado (metodologia C8) e da

dissolução do fármaco livre foi realizada em célula de fluxo e, a porcentagem liberada foi

calculada através da curva analítica acima. Através da análise dos perfis de liberação pode ser

verificado se o fármaco está adsorvido na partícula ou se, também, está dentro das partículas.

Quando o fármaco está adsorvido na superfície das micropartículas ocorre uma rápida liberação

do fármaco. Neste caso, o perfil da curva de liberação do fármaco encapsulado é semelhante ao

perfil da curva de dissolução do fármaco livre. Neste experimento verificou-se que há diferença

no perfil de liberação do fármaco encapsulado e da dissolução do fármaco livre indicando que o

fármaco está no interior das micropartículas (Figura 23). A curva de dissolução do fármaco livre

apresentou um “burst” nos primeiros 10 minutos liberando 80 % em 20 minutos. Já com o AH

encapsulado nas micropartículas de PCL, 50 % foi liberado em 20 minutos mantendo,

posteriormente, uma liberação sustentada até 100 minutos.

Figura 23: Perfil de liberação sustentada do AH encapsulado e da dissolução do AH livre.

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100 AH livre AH encapsulado

% L

iber

ada

Tempo (minutos)

87

4.5 Halo de inibição

A fim de verificar a atividade do antibiótico hidrofílico livre e encapsulado um teste de

suscetibilidade bacteriana foi realizado. O diâmetro do halo da cepa de Staphylococcus aureus

(ATCC 6538) foi medido após 24 horas. A concentração de fármaco utilizada para a cepa foi

baseada em relação à Concentração Mínima Inibitória (MIC) da bactéria relacionada com o AH

que, para o S. aureus é 0,5 µg/mL. O resultado do diâmetro do halo de inibição está apresentado

na Tabela 8. As micropartículas utilizadas neste experimento foram preparadas pelo método C8.

Tabela 8: Comparação do diâmetro do halo formado quando o S. aureus foi exposto ao AH livre e encapsulado

em micropartículas de PCL.

S. aureus

(0,5 µg/mL)

AH livre 5 cm

MP de PCL com AH 5 cm

As micropartículas de PCL com o AH não alteraram o diâmetro do halo formado com S.

aureus (ATCC 6538) quando comparado ao do fármaco livre. Portanto, as micropartículas de

PCL com o AH apresentaram a mesma eficiência que o fármaco livre.

88

4.6 Citotoxicidade

O estudo da citotoxicidade em células V79 para o antibiótico hidrofílico livre não

apresentou citotoxicidade para os ensaios de VN e MTT (Figura 24 A). No entanto, para o ensaio

de DNA, na concentração de 300 mMol/L, ocorreu uma inibição de 50 % das células, como

mostra a Figura 24 A.

Quando as micropartículas poliméricas de PCL foram analisadas (Figura 24 B), nenhum

dos ensaios testados apresentou citotoxicidade. No entanto, para os ensaios de VN e MTT, os

resultados apresentaram um estímulo das células. Este estímulo celular pode ter ocorrido devido à

presença do surfactante PVA que pode aumentar a permeabilidade da membrana celular,

aumentando a captura de VN para o interior da célula e estimulando um aumento no número de

lisossomas e/ou no tamanho dos mesmos. No ensaio do MTT, também houve um estímulo,

resultante, talvez de um aumento na atividade das desidrogenases mitocondriais. Esta

proliferação celular, ou seja, este estímulo celular, deve ser confirmado através da contagem das

células por microscopia óptica em câmara de Neubauer.

Quando as micropartículas de PCL com o fármaco encapsulado foram analisados (Figura

24 C), os resultados para os três ensaios analisados também não apresentaram citotoxicidade.

Com o AH encapsulado não ocorreu a inibição de 50 % das células em nenhuma das

concentrações, ao contrário do que foi verificado com o fármaco livre na concentração de 300

mMol/L, para o ensaio de DNA.

89

Controle 300 4000

20

40

60

80

100

120

140

% C

ontro

le

Concentração (mMol/L)

VN MTT DNA

Controle 300 4000

50

100

150

200

250

300

350

400

% C

ontro

le


VN MTT DNA

Controle 300 4000

20

40

60

80

100

120

140

% C

ontro

le


VN MTT DNA

A B C

Figura 24: Viabilidade celular de V-79 na análise dos alvos celulares VN, MTT e DNA. A) AH livre, B)

Micropartículas de PCL e C) Micropartículas de PCL com o AH.

Para as células de hepatócitos, o antibiótico livre, nos ensaios de VN, MTT e DNA não

foram reprodutivos (gráfico não apresentado), no entanto, não mostraram uma tendência para

apresentar citotoxicidade. Os ensaios de VN e DNA para as células de hepatócitos, as

micropartículas sem (Figura 25 A) e com o fármaco (Figura 25 B) encapsulado não apresentaram

citotoxicidade. Entretanto, no ensaio de MTT, as micropartículas sem e com o AH encapsulado,

na concentração de 300 µg/mL apresentou uma inibição de 90 % e 70 % das células,

respectivamente. No nosso grupo de pesquisa, alguns pesquisadores já observaram que o ensaio

de MTT para as células de hepatócitos (cultura de células primárias) pode apresentar uma

citotoxicidade porque o aumento da concentração das micropartículas pode diminuir a

solubilidade do composto formazan apresentando um erro de leitura das células in vitro.

90

Controle 300 4000

20

40

60

80

100

120

140

% C

ontro

le


VN MTT DNA

Controle 300 4000

20

40

60

80

100

120

140

% C

ontro

le


VN MTT DNA

A B

Figura 25: Viabilidade celular de hepatócitos na análise dos alvos celulares VN, MTT e DNA. A) Micropartículas

de PCL e B) Micropartículas de PCL com o AH.

4.7 Biodegradação das micropartículas poliméricas

Foi avaliado a degradação das micropartículas poliméricas de PCL e PLGA. Amostras

contendo 25 mg de micropartículas poliméricas foram adicionadas em 4 mL de uma solução 50

mM de tampão fosfato (pH = 7,4). Em seguida, elas foram acondicionadas numa incubadora

(37 º C) sob agitação constante de 120 rpm durante 30 dias. As micrografias apresentadas

abaixo mostram o perfil de degradação das micropartículas de PLGA (Figura 26) e PCL (Figura

27).

91

A B C

Figura 26: Micrografias da biodegradação de PLGA. Aumento de: A) 1º dia x 1000, B) Após 5 dias x 400 e C) Após

10 dias x 1500.

A B C

D E F

Figura 27. Micrografias da degradação de PCL. Aumento de: A) 1º dia x 2000, B) Após 5 dias x 400, C) Após 10

dias x 2000, D) Após 15 dias x 850, E) Após 20 dias x 100 e F) Após 30 dias x 220.

92

De acordo com Chen et al. (1999), polímeros como o PLGA e PCL, apresentam uma boa

biodegradabilidade e biocompatibilidade. O material é degradado em compostos não tóxicos e

com baixo peso molecular. O fármaco é liberado, metabolizado e absorvido pelo organismo.

Nestas micrografias observa-se que até 10 dias de incubação, a biodegradação dos polímeros

PLGA e PCL é muito baixa, podendo notar pouca diferença morfológica da superfície

polimérica. Na Figura 26 C, observa-se que a superfície da micropartícula de PLGA ficou um

pouco mais rugosa quando comparado com a micropartícula de PCL (Figura 27 C). A partir do

décimo quinto dia (Figura 27 D), as micropartículas de PCL começaram a apresentar uma

porosidade maior na superfície, tornando as micropartículas mais rugosas e/ou iniciando o

processo de biodegradação. Com trinta dias de degradação (Figura 27 F), as micropartículas já

apresentam uma superfície bastante porosa devido ao processo de biodegradação polimérica.

Através destes poros encontrados na superfície polimérica é que o antibiótico hidrofílico

encapsulado será liberado para o meio externo pelo processo de difusão e/ ou erosão da matriz

polimérica. Na literatura, encontra-se que a degradação do PCL é mais lenta do que o PLGA,

permitindo, portanto, um maior período de liberação de fármacos (Sinhá et al., 2004; Jain, 2000).

No entanto, algumas propriedades físicas podem afetar a biodegradação polimérica, como, o peso

molecular, o tamanho, a distribuição e a morfologia das micropartículas produzidas (Sinhá et al.,

2004). Os resultados obtidos devem ser complementados com mais experimentos de longa

duração (análises mensais) para uma complementação da avaliação da morfologia das

micropartículas poliméricas.

93

5 Conclusões

Os resultados obtidos demonstraram que a metodologia de nanoprecipitação não foi

reprodutível, portanto, não se apresentou viável para dar continuidade aos experimentos.

A metodologia de simples emulsão com PCL (o/a) seguida da evaporação do solvente

produziu micropartículas poliméricas com menores tamanhos e foi reprodutível, no entanto, ela

não foi apropriada para o aumento da eficiência de encapsulamento.

A metodologia de dupla emulsão com PLGA, PCL e PHBV (a/o/a) seguida da evaporação

do solvente produziu micropartículas poliméricas e foi reprodutível, sendo utilizada na

continuidade do trabalho.

As micropartículas poliméricas produzidas com o PLGA e o PCL apresentaram uma

morfologia lisa e esférica, porém, as micropartículas poliméricas de PHBV apresentaram uma

morfologia rugosa e esférica. As micropartículas poliméricas apresentaram carga superficial

negativa; baixa polidispersidade com índice de span < 2.

O rendimento das micropartículas foi entre 35 % a 80 % de acordo com as variações nos

parâmetros do método de dupla emulsão e evaporação de solvente e a eficiência de

encapsulamento do AH nas micropartículas poliméricas foi de 2 %.

Através das curvas de dissolução do fármaco AH livre e liberação do fármaco AH

encapsulado foi verificado que o fármaco está dentro das micropartículas sendo que 50 % do AH

livre foi liberada nos primeiros 5 minutos e quando encapsulado, esta mesma liberação ocorreu

em 20 minutos mantendo posteriormente uma liberação sustentada até 1 hora.

94

O antibiótico hidrofílico encapsulado apresentou mesma eficiência em relação ao fármaco

livre no teste da atividade antimicrobiana em cepas de S. aureus (ATCC 6538). No teste de

citotoxicidade, para as células V79 (ensaio de DNA), a concentração de 300 mMol/L do fármaco

livre, inibiu 50 % das células e para as micropartículas de PCL, os ensaios de VN e MTT

apresentaram um estímulo celular. Nas células de hepatócitos, os ensaios de VN e DNA não

apresentaram citotoxicidade para as micropartículas sem e com o fármaco encapsulado.

Entretanto, no ensaio de MTT, as micropartículas sem e com o AH encapsulado, na concentração

de 300 mMol/L apresentou uma inibição de 90 % e 70 % das células, respectivamente. Os testes

de citotoxicidade devem ser repetidos para uma reavaliação dos resultados.

A biodegradação do PCL é mais bem observada a partir do décimo quinto dia,

apresentando na superfície poros que depois irão liberar e influenciar no processo de liberação

sustentada do AH para o meio externo, através do processo de difusão e/ ou erosão da matriz

polimérica.

O PCL foi o polímero biodegradável selecionado, pois tem um custo menor do que o

PLGA, o que faz aumentar o interesse da indústria pelo polímero e por ser aprovado pelo FDA,

na qual o PHBV ainda não tem aprovação.

De acordo com os diferentes estudos realizados para a preparação de micropartículas de

PCL com a metodologia de dupla emulsão e evaporação de solvente, verificou-se que os

melhores parâmetros foram: a utilização do tensoativo PVA, 500 mg de PCL, 50 mg de

antibiótico hidrofílico, adição da primeira emulsão na fase aquosa externa por gotejamento e o

uso de agitação em ultra turrax na formação da primeira emulsão.

95

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