COMISSÃO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR INSTITUTO DE RADIOPROTEÇÃO E DOSIMETRIA

LABORATÓRIO DE MEDIDAS IN VIVO

ESTUDO IN VIVO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO MOLIBDÊNIO-99

Raphael Sancho Sisley de Souza

Orientador: Bernardo Maranhão Dantas Co-orientador: Mario Bernardo Filho

RIO DE JANEIRO

Raphael Sancho Sisley de Souza

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ESTUDO IN VIVO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO MOLIBDÊNIO-99

Rio de Janeiro – Brasil

Instituto de Radioproteção e Dosimetria – Comissão Nacional de Energia Nuclear

Coordenação de Pós-Graduação

2009

ii

Souza, Raphael Sancho Sisley de Souza

ESTUDO IN VIVO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO MOLIBDÊNIO-99

Dissertação (mestrado) – Instituto de Radioproteção e Dosimetria

Rio de Janeiro, 2009.

Raphael Sancho Sisley de Souza

iii

O presente trabalho foi desenvolvido no Instituto de Radioproteção e Dosimetria da

Comissão Nacional de Energia Nuclear, sob orientação do Professor Dr. Bernardo

Maranhão Dantas e co-orientação da Professor Dr. Mario Bernardo Filho, com auxílios

financeiros concedidos pela CNEN e CAPES.

v

O que sabemos é uma gota;

o que nós ignoramos é um oceano.

(Isaac Newton)

vi

Esta dissertação é dedicada aos meus

pais, Marcel Sisley de Souza e Kátia

Sancho Sisley de Souza, por sempre

incentivarem meus estudos e por

serem exemplos de humildade e

perseverança frente a todas as

adversidades.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço integralmente a Deus por me permitir alcançar o conhecimento necessário

para realizar esse trabalho!

A meus pais, Marcel Sisley de Souza e Kátia Sancho Sisley de Souza, pelo apoio

financeiro, confiança, incentivo e, principalmente, pelo carinho que recebo em minha

vida. A minha irmã, Juliana Sancho Sisley de Souza, ao meu cunhado Alex Sandro

Torres de Queiroz e ao novo membro da família, meu sobrinho Eduardo Sisley de

Souza Queiroz. A toda minha família que comemorou minha vitória e acreditou no meu

sucesso.

À Adriana Moraes, minha namorada, que me ajudou com amor, carinho e compreensão.

Agradeço pela companhia e pelas palavras de incentivo.

A todos meus amigos que me incentivaram e torceram pelo êxito deste projeto,

especialmente meu grande amigo Gabriel Marinho Webler.

Aos meus orientadores Bernardo Dantas e Mario Bernardo filho, pelos ensinamentos e

por acreditarem neste projeto.

A todos meus colegas da turma de mestrado 2007: Artur, Aneli, Bárbara, Cristiny,

Delano, Juliana, Rafael, Ronaldo, Samuel e Valmiro.

Aos amigos do LABMIV do IRD, Ana Letícia Dantas, Francisco Araújo, Éder Lucena,

Bianca Ribeiro e do LRE da UERJ, Claudia, Fernanda, Cristiano, Deise, Marcela e

Scheila.

Aos amigos do IRD Mônica, Isabele, Samira, Vanessa, Paulo entre outros que, de

inúmeras maneiras, me ajudaram.

Aos Professores que me ajudaram em diversos aspectos a me moldar: Pedro, Conte,

Silvia, Tahuata, Denison, Eliane, Carlos entre outros

viii

Ao LNMRI pelo fornecimento de padrões necessários à realização deste trabalho.

Ao IPEN (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares) que cedeu gentilmente

material radioativo e kits de medicina nuclear para este estudo.

ix

RESUMO

A modificação do metabolismo padrão do 99Mo em presença de MDP poderia levar a

alterações na biocinética e dosimetria deste radionuclídeo em pacientes de medicina

nuclear. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar a influência do MDP na

biodistribuição de 99Mo. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos de seis animais

cada, sendo inoculados respectivamente com 99molibdato e 99molibdato+MDP via plexo

ocular. O estudo de biodistribuição foi realizado após 10 e 120 minutos

respectivamente. Os órgãos foram contados com detector NaI(Tl). Os valores de uptake

não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Foi realizado também um

estudo in vitro através de cromatografia planar para determinar a afinidade entre o

molibdênio e o MDP. Os resultados mostraram que o molibdênio tem baixa afinidade

tanto pela propanona quanto pela solução 0,9% de NaCl. Entretanto, o molibdênio em

presença de MDP apresentou afinidade pela solução 0,9% de NaCl e baixa afinidade

pela propanona, sugerindo ter ocorrido ligação entre o 99Mo e o MDP nas condições do

experimento.

x

ABSTRACT

The modification of 99Mo standard metabolism in the presence of MDP would alter the

biokinetics and dosimetry of this radionuclide in nuclear medicine patients. Therefore,

the objective of this work is to evaluate the influence of MDP in the biodistribution of 99Mo. Wistar rats were divided in two groups of six animals each, being inoculated

respectively 99molibdate and 99Mo+MDP via ocular plex. The biodistribution study was

carried out after 10 and 120 minutes respectively. The organs were counted with a

NaI(Tl) detector. The uptake values did not present significant differences among the

groups. An in vitro study through planar chromatography was also carried out to

determine the affinity between molybdenum and MDP. The results show that 99Mo has

low affinity to both propanone and NaCl- 0.9% solution. However, 99Mo in the presence

of MDP presented affinity to NaCl-0.9% solution and low affinity to propanone

suggesting that 99Mo was bound to MDP under the conditions of the experiment.

xi

LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 Estatística de utilização de radiofármacos no decorrer do ano de 2008,

no Hospital Universitário Pedro Ernesto e Hospital da Força Aérea do

Galeão.

3

Figura 2.1 Esquema simplificado do decaimento do molibdênio-99 (Marques et al

2001). 9

Figura 2.2 Gerador de 99Mo/99mTc produzido pelo IPEN 10

Figura 2.3

Estrutura molecular do ácido metilenodifosfônico MDP usado em

medicina nuclear. 15

Figura 2.4 Imagem de tórax anterior realizada por cintilografia planar utilizando 99mTc-MDP onde verificamos a ligação do radiofármaco com estruturas

ósseas assim como o tecido renal (Timothy et al 1991).

16

Figura 3.1 a) Tubo de vidro utilizado para medida dos órgãos nos experimentos de

biodistribuição e espectometria gama (altura: 4,3 cm; diâmetro: 1,0 cm)

e b) Esquema da cromatografia planar. 20

Figura 3.2 Imagem rato com os respectivos órgãos retirados 22

Figura 3.3 Fluxograma do experimento de biodistribuição. 23

Figura 3.4 Geometria de medição das amostras com sistema de detecção de

NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV 24

Figura 4.1 Curvas de calibração do detector NaI(Tl) 8”x 4”obtidas nas geometrias

de 2, 4, 6, 8 e 10 mL , nas distâncias de 10, 15 e 20 cm. 27

Figura 4.2 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de NaCl

0,9% 30

Figura 4.3 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de

propanona 30

Figura 4.4 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de

NaCl 0,9%. 31

Figura 4.5 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de

propanona. 31

Figura 4.6 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de

NaCl 0,9%.

32

xii

Figura 4.7 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de

propanona.

32

Figura 4.8 Atividades dos compartimentos analisados nos grupos administrados

com Molibdato (coluna cinza) e Molibdato + MDP (coluna preta). 35

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 Substâncias empregadas na biodistribuição e funções. 19

Tabela 3.2 Volumes e distâncias na analise dos órgãos biodistribuidos 25

Tabela 4.1 Radionuclídeos utilizados para calibração do sistema de detecção

NaI(Tl) 8”X4” do LABMIV 26

Tabela 4.2 Valores de R2 obtidos para cada geometria de calibração do detector

NaI(Tl) 8”X4” 28

Tabela 4.3 Equações das curvas de calibração obtidas no detector NaI(Tl) 8”X4” 29

Tabela 4.4 Massa dos órgãos dos animais utilizados nos experimentos de

biodistribuição in vivo do 99Mo

34

Tabela 4.5 Atividades específicas médias presentes nos órgãos analisados nos

grupos de animais 1 e 2

35

xiv

SUMÁRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi

LISTADE FIGURAS xii

LISTA DE TABELAS xiv

1 – INTRODUÇÃO 1

1.1 – Definição do problema 1

1.2 - Objetivo geral 3

1.3 - Objetivos específicos 3

2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS 5

2.1 - Histórico do uso de radionuclídeos em medicina 5

2.2 - Medicina nuclear 5

2.2.1 - Radionuclídeos em medicina nuclear 7

2.2.2 - Radionuclídeo tecnécio-99m (99mTc) 7

2.2.3 - Radionuclídeo Molibdênio-99 (99Mo) 8

2.2.4 - Geradores 99Mo/99m Tc 10

2.2.5 - Impurezas 10

2.2.5.1 - Impurezas Radionuclídicas 10

2.2.5.2 - Impurezas Químicas 11

2.2.5.3 - Impurezas radioquímicas 11

2.2.6 – Utilização de Radiofármacos 12

2.2.7 – Biodisponibilidade dos radiofármacos 12

2.2.8.1 – Biocinética do Molibdênio 13

2.2.8.2 - Ácido metilenodifosfônico (MDP) marcado com 99mTc 14

2.2.8.3 – Interferências na biodisponibilidade de radiofármacos 16

2.2.8.4 - Biodistribuição 16

2.3 - Cromatografia planar 17

2.4 - Detectores de Cintilação 17

2.5 - Espectrometria gama 18

3 - MATERIAIS E MÉTODOS 19

3.1 - Animal experimental 19

3.2 - Drogas e reagentes utilizados 19

3.3 - Radionuclídeo 20

xv

3.4 - Cromatografia Planar 20

3.5 - Biodistribuição do radiofármaco 21

3.6 – Sistema de detecção da Unidade de Contagem 24

3.7 – Calibração do sistema de detecção da UCCI 22

3.8 – Distâncias e Volumes dos órgãos para avaliação 24

3.9 – Análise estatística 25

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 26

4.1 - Calibração do sistema de detecção para determinação de 99mTc e 99Mo em

amostras de biodistribuição e cromatografia planar

26

4.2 - Cromatografia planar associada à espectrometria gama 29

4.3 – Biodistribuição do 99Mo in vivo 33

4.3.1 – Massas dos órgãos 33

4.3.2 - Atividades captadas pelos órgãos 34

5 – CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES 37

5.1 – Conclusões 37

5.2 – Recomendações 37

ANEXO1 - Certificado de aprovação pelo Comitê de ética da UERJ 39

ANEXO 2 – Certificado de Calibração da Fonte de 99Mo – 1 41

ANEXO 3 – Certificado de Calibração da Fonte de 99Mo – 2 44

ANEXO 4 – Bula do Fármaco MDP 46

ANEXO 5 – Certificado de Calibração do Coquetel de Radionuclídeos 49

ANEXO 6 – Artigo publicado na revista Brazilian Archives of Biology and

Tecnology

51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

xvi

1- INTRODUÇÃO

1.1 – Definição do problema

Nas últimas décadas houve um elevado crescimento do número de serviços de

medicina nuclear no Brasil, aproximando-se atualmente de 300. Nestes, o radionuclídeo

mais frequente é o tecnécio meta-estável (99mTc), utilizado em cerca de 90% dos

diagnósticos como o componente radioativo dos radiofármacos.

Entre os fatores que justificam a utilização do 99mTc pode-se citar a facilidade

de obtenção, aliado às suas propriedades físicas como meia-vida física de 6 horas,

emissão de radiação gama de baixa energia e vários números de oxidação (Nox)

possíveis, o que permite ligação com diversos compostos que alteram a sua afinidade

química, ampliando sua aplicação em diversas técnicas de diagnóstico por imagem

(Saha, 2004).

A Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN) e a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA) estabeleceram uma série de Regulamentos associados à

segurança radiológica de trabalhadores e pacientes de serviços de medicina nuclear

(CNEN, 1996; ANVISA, 2007).

Nos eluatos de 99mTc usados em medicina nuclear ocorre a presença de 99Mo

sendo este classificado como impureza radionuclídica, e tendo o limite sugerido para

este é de 0,15 kBq de 99Mo por MBq de 99mTc no eluato administrado ao paciente. Para

garantir que os radiofármacos atendam a esse critério é necessário que cada eluato seja

testado individualmente (IAEA, 2006). Um levantamento realizado por Khoury et al

(2003) mostrou que 7,4% das amostras de eluatos coletadas em serviços de medicina

nuclear de Recife/PE, Brasil apresentavam níveis de impureza radionuclídica de 99Mo

acima dos valores recomendados.

A presença de 99Mo nos eluatos resulta em uma exposição desnecessária do

paciente que realiza o exame, além de prejudicar a qualidade das imagens formadas,

podendo conduzir à necessidade de repetição do exame.

Sistemas de garantia da qualidade estão sendo discutidos com a finalidade de

melhorar a qualificação e treinamento dos envolvidos na produção e manipulação dos

radiofármacos e estabelecer uma série de rotinas básicas de segurança na verificação da

qualidade dos radiofármacos que serão administrados ao paciente, entre essas temos os

controles sobre as impurezas radionuclídicas (ANVISA, 2007).

1

Estudos realizados por Dantas et al (2005) e Silva (2007) indicaram a presença

de 99Mo em pacientes de medicina nuclear através de medidas in vivo e in vitro. Nesses

estudos, as doses associadas à incorporação do 99Mo foram calculadas supondo-se a

biocinética padrão do 99Mo descrita na publicação 30 de ICRP (1979). Ressalta-se o

fato de que até o início desse trabalho não foi disponibilizado na literatura nenhum

estudo visando verificar a influência de fármacos na biodistribuição de 99Mo. Assim, o

cálculo da dose no paciente devido à incorporação de 99Mo baseia-se em um modelo

biocinético que leva em consideração sua biodistribuição padrão no organismo (ICRP,

1993). Porém ainda não existem estudos conclusivos sobre a interferência que os

fármacos utilizados em conjunto com o 99mTc, possam causar na biodistribuição do 99Mo, assim como a avaliação da possibilidade de ligação química entre o 99Mo e estes

fármacos. Tais informações têm impacto direto no cálculo de dose interna dos pacientes

devido a incorporação de 99Mo.

Em estudo preliminar foi realizado um levantamento em dois serviços de

medicina nuclear da rede pública do município do Rio de Janeiro, referente ao número

de pacientes que realizaram exames com uso do radionuclídeo 99mTc, evidenciando

quais radiofármacos são os mais utilizados. Este levantamento compreendeu os exames

realizados no período de janeiro a dezembro de 2008 no Hospital da Força Aérea do

Galeão (HFAG) e Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE). Os dados obtidos

foram gentilmente cedidos pelos responsáveis pelos SMN sem identificação do nome do

paciente.

A Figura 1.1 apresenta o resultado do levantamento do uso de radiofármacos em

dois serviços de medicina nuclear localizados em Hospitais públicos da cidade do Rio

de Janeiro.

2

Estatistica de uso de radofármacos de 2008

0

100

200

300

400

500

600

700

MDP DTPA DMSA Pertecnetato MAA Sestamibi ECD Outras

Radiofármacos

Núm

ero

de E

xam

es

Figura 1.1 Estatística de utilização de radiofármacos no decorrer do ano de 2008, no

Hospital Universitário Pedro Ernesto e Hospital da Força Aérea do Galeão.

Foram computados 1451 exames realizados no ano de 2008. A distribuição

observada apresenta menor frequência de exames cardíacos do que os dados obtidos por

Velásques et al (2006). Esta diferença pode ser atribuída ao custo do fármaco usado

neste tipo de exame tornando-o menos frequentes em SMN da rede pública. A principal

conclusão deste levantamento é que a cintilografia óssea utilizando MDP foi o exame

mais freqüente realizado nestes serviços de medicina nuclear da rede pública na cidade

do Rio de Janeiro em 2008.

1.2 - Objetivo geral

O presente estudo visa avaliar a influência do fármaco MDP, utilizado em

medicina nuclear, na biodistribuição in vivo do molibdênio 99.

1.3 - Objetivos específicos

i) Implementar metodologia para identificação e quantificação de 99Mo em

amostras de órgãos e tecidos de ratos Wistar.

ii) Estabelecer e aplicar metodologia baseada em cromatografia planar associada

à espectrometria gama para avaliar a capacidade de ligação in vitro entre o Mo e o

MDP.

3

iii) Realizar estudos in vivo da Biodistribuição do 99Mo na forma de molibdato

em ratos Wistar

iv) Realizar estudo in vivo da Biodistribuição de 99Mo em solução de Kit de

MDP em ratos Wistar.

4

2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS

2.1 - Histórico do uso de radionuclídeos em medicina

Em 1913, a aplicação de radioisótopos em medicina teve sua origem com os

estudos realizados pelo físico George Von Hevesy. Nestes, observou-se que a

radioatividade dos elementos não alterava as suas propriedades químicas. Assim, um

elemento radioativo poderia substituir um elemento estável sem alteração das suas

reações químicas características (Levi, 1976; Harbert et al., 1996).

O físico Emilio Segré descobriu, em 1937, o tecnécio-99m que, atualmente é um

dos radionuclídeos mais utilizados em medicina nuclear (Segré, 1987).

No final dos anos 50, Hal Anger desenvolveu a primeira câmara de cintilação,

também chamada gama-câmara ou câmara Anger, que constitui um sistema de detecção

de radiação que permite registrar a distribuição espacial de um radioisótopo no interior

do corpo humano. Este método de detecção se tornou a base da medicina nuclear e do

desenvolvimento da tomografia axial computadorizada (Okuno et al., 1986; Saha,

2004).

Em 1969, os médicos David Kuhl e Roy Edwards desenvolveram outras formas

de obtenção de imagens fisiológicas: a Tomografia Computadorizada por Emissão de

Fóton Único ou SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) e a

Tomografia por Emissão de Pósitrons ou PET (Positron Emission Tomography) (Cherry

et al., 2003).

No Brasil, em 1951 foi criada, no Rio de Janeiro, a Comissão Nacional de

Energia Nuclear (CNEN) e os radionuclídeos começaram a ser empregados em 1955

(Marques et al., 2001).

2.2 - Medicina nuclear

A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza radionuclídeos in

vivo com finalidade diagnóstica (emissores de radiação gama, ou beta positiva ou que

realizem captura eletrônica) e terapêutica (emissores de radiação beta negativa). As

atividades das amostras administradas são medidas em câmara de ionização na função

do número de decaimentos radioativos por segundo, sendo expressas em Becquerel (Bq)

ou Curie (Ci) (Chandra, 1998).

5

Para minimizar a dose de radiação administrada ao paciente, o radionuclídeo

empregado em diagnóstico deve ter uma meia-vida compatível com o estudo clínico a

ser executado, emitindo radiação que seja capaz de penetração nos tecidos e energia

compatível com o sistema de detecção (Owunwanne et al., 1995).

Os radiofármacos são compostos químicos ou estruturas biológicas que

aumentam as possibilidades de utilização dos radionuclídeos. Apresentam capacidade

de causar alterações na biodistribuição dos mesmos, decorrente das alterações nas

afinidades químicas dos radionuclídeos originais (Bernardo-Filho et al, 2005).

A radiofarmácia é uma especialidade multidisciplinar exercida no serviço de

medicina nuclear e está relacionada com o armazenamento, fracionamento, diluição,

preparação, desenvolvimento, controle de qualidade e distribuição de radionuclídeos ou

moléculas marcadas para administração in vivo (Chandra, 1998).

Os exames realizados em medicina nuclear permitem avaliar tanto a morfologia

quanto a fisiologia de órgãos. As doenças são avaliadas de acordo com as variações da

biodistribuição da radioatividade nos órgãos em relação aos padrões normais

previamente estabelecidos (Saha, 2004). O rápido crescimento da medicina nuclear

contribuiu para o diagnóstico de diversas alterações orgânicas objetivando a avaliação

da eficácia da estratégia terapêutica (Ching et al., 2004; Imam, 2005).

O avanço da tecnologia de imagem tem gerado grande interesse em relação ao

avanço de equipamentos e softwares, protocolos de aquisição de imagem, interpretação

e qualificação profissional (Coleman et al., 2005).

Os produtos administrados aos pacientes devem passar por uma garantia de

qualidade regidos por documentos nacionais (ANVISA) e farmacopéias

internacionais.(ANVISA, 2007)

A obtenção de imagens na medicina nuclear incluem o SPECT que utiliza a

radiação gama (γ) emitida pelo radionuclídeo ou os raios-X emitidos no processo de

captura eletrônica (Sampson, 1999; Imam, 2005).

Essas técnicas são exploradas para estudar alterações bioquímicas como sinais

precoces de doenças, seus mecanismos, associações com estados patológicos (incluindo

câncer, doenças cerebrais, cardiovasculares, desordens mentais, dentre outros) e para

uma correlação molecular de alterações bioquímicas conduzindo ao tratamento da

doença (Imam, 2005).

6

2.2.1 - Radionuclídeos em medicina nuclear

Os nuclídeos são utilizados em medicina nuclear como fontes de radiação não

seladas marcando estruturas celulares ou moleculares denominadas radiofármacos ou

radiobiocomplexos (Harbert et al., 1996; Perkins e Frier, 1999; Bernardo-Filho et al.,

2005). A primeira etapa na preparação de radiofármacos envolve a produção dos

radionuclídeos. Existem três métodos de produção de radionuclídeos: aceleradores

nucleares, reatores nucleares e geradores (Saha, 2004).

Nos aceleradores nucleares (Ciclotrons) partículas são aceleradas e colidem com

um núcleo alvo, dando origem a reações nucleares. Através desse método de produção

são obtidos os radionuclídeos flúor-18, iodo-123, tálio-201, índio-111, gálio-67, dentre

outros, sendo esses empregados nos procedimentos de diagnóstico. Nos reatores

nucleares os radionuclídeos são obtidos por reações nucleares como resultado da

interação entre um núcleo alvo com nêutrons, como o xenônio-133 e cromo-51,

utilizados para diagnóstico e fósforo-32, estrôncio-89 e cobalto-60, utilizados em

terapia (Harbert et al., 1996; Sampson, 1999; Saha, 2004).

Nos geradores de radionuclídeo ocorre a transmutação do radionuclídeo pai

(meia-vida longa) em radionuclídeo filho (meia-vida curta). As propriedades químicas

dos radionuclídeos pai e filho devem ser distintas, de forma que possam ser facilmente

separados. São obtidos através desse método de produção os radionuclídeos tecnécio-

99m, gálio-68, cobre-62 e rubídio-82, utilizados para diagnóstico, e rênio-188, utilizado

em terapia (Harbert et al., 1996; Sampson, 1999; Saha, 2004).

A importância dos geradores de radionuclídeos reside no fato de serem facilmente

transportados e servirem como fontes de radionuclídeos em instituições distantes do

local da instalação do ciclotron ou do reator nuclear (Owunwanne et al., 1995; Perkins

& Frier, 1999; Saha, 2004).

2.2.2 - Radionuclídeo tecnécio-99m (99mTc)

O tecnécio possui número atômico 43 e pertence ao grupo VIIB ou coluna 7 da

Tabela Periódica dos Elementos. É classificado como um metal de transição que forma

complexo ligante-metal com um grande número de estruturas de interesse biomédico.

Estes são componentes formados pela ligação entre o metal (eletrófilo) e átomos ou

grupos funcionais que são capazes de doar pares de elétrons (nucleófilo). Exemplos de

7

nucleófilos formadores de complexo com tecnécio são: amina, amida, tiol, fosfina,

oxima, e isonitrila (Sampson, 1999, Imam, 2005).

Os metais de transição possuem múltiplos estados de oxidação. O 99mTc, em

particular, apresenta números de oxidação (Nox) variando de -1 a +7. Esta característica

permite que este radionuclídeo forme complexos com diferentes estruturas

(Owunwanne et al., 1995).

O 99mTc se encontra em um estado meta-estável e, por transição isomérica, passa

a tecnécio-99 (99Tc), com meia-vida de 2,1x105 anos, com emissão de um fóton com

energia de 140 keV, abundância de 87%, meia-vida de 6 horas (Owunwanne et al.,

1995).

Essas características tornam possível a aquisição de imagens de excelente

qualidade com baixas doses administradas, acarretando uma baixa exposição do

paciente e rejeitos radioativos de fácil gerenciamento e baixo impacto ambiental.

(Owunwanne et al., 1995). Todas essas características, em conjunto, são responsáveis

pela grande aceitação do 99mTc em procedimentos da medicina nuclear (Perkins & Frier,

1999; Bernardo-Filho, 1999; Schneider et al., 2002) e também em atividades de

pesquisa (Bernardo-Filho, 1999; Samnick et al., 2004).

Os radiofármacos marcados com 99mTc tornaram-se, nos últimos trinta anos,

importantes ferramentas para diagnóstico de doenças, sendo usados em exames de

rotina em busca de metástases dentre outras. Atualmente, existem diversos compostos

gerando um significante volume de exames na rotina do serviço de medicina nuclear

(Imam, 2005).

2.2.3 - Radionuclídeo Molibdênio-99 (99Mo)

O molibdênio é um elemento químico do grupo VIB ou coluna 6 da Tabela

Periódica dos Elementos, sendo classificado com um metal de transição. O isótopo99Mo

pode ser gerado pelas reações Mo(d,p)2, Mo(n, γ)2,3, Mo(n,2n)2,3, Zr(α,n)4,5 e por

produtos de fissão do urânio e tório (Edwards e Pool, 1947).

O Mo é um oligo-elemento essencial na dieta dos seres humanos, exigido para a

função de três enzimas encontradas em humanos: sulfito oxidase, xantina oxidase, e

aldeído oxidase (Bell et al 1964). Estas enzimas estão envolvidas na oxidação de sulfito

a sulfato, na produção de ácido úrico e na oxidação de aldeídos em seres humanos, mas

8

apenas a enzima sulfito oxidase é conhecida por ser indispensável ao ser humano. Estas

enzimas têm um cofator essencial comum, molibdoptenina (Turnlund et al 1995).

Indivíduos com ausência da enzima sulfito oxidase sofrem com desordens

neurológicas graves que geralmente levam à morte precoce. O molibdênio, entretanto, é

um metal tóxico em grandes quantidades. Este fato tem sido observado em muitas

espécies animais e é comum em bovinos que se alimentam em pastagens em áreas com

alta concentração de molibdênio(Rosoff and Spencer,1973). Uma alta incidência de

artropatias inflamatórias foi observada em regiões com elevadas taxas de molibdênio no

solo e alta ingestão na dieta (Turnlund et al 1995).

O primeiro estudo em seres humanos sobre o metabolismo do molibdênio como

marcador foi realizado em 1964 utilizando-se uma única injeção intravenosa do

radioisótopo 99Mo em quatro pacientes com câncer terminal. Este trabalho revelou que a

principal via de excreção do molibdênio em humanos é através do rim (Rosoff and

Spencer,1964, Turnlund et al, 1995).

Atualmente o 99Mo é utilizado em medicina nuclear como isótopo precursor do

tecnécio-99m. O 99Mo apresenta meia-vida física de 67 horas, emitindo partículas beta

negativas e fótons gama associados de 740 e 778 keV, decaindo a tecnécio de duas

formas: metaestável (99mTc) ou 99Tc com respectivas probabilidades de 86 e 14%.(figura

2.1) (Marques et al 2001).

Figura 2.1 Esquema simplificado do decaimento do molibdênio-99 (Marques et al 2001)

9

2.2.4 - Geradores 99Mo/99m Tc

O 99mTc é o radionuclídeo mais utilizado em medicina nuclear diagnóstica,

sendo obtido a partir do gerador de 99Mo/99mTc (Figura 2.2). Estes radionuclídeos se

encontram na forma de íons molibdato (99MoO4-2) e pertecnetato (99mTcO4

-). No gerador

existe uma coluna de plástico ou vidro que possui alumina (Al2O3) em seu interior.

Esta coluna contém molibdato de sódio (Na299MoO4) e pertecnetato adsorvidos.

Devido à maior afinidade do íon molibdato (99MoO4-2) pela alumina, observa-se que,

com a passagem de uma solução de cloreto de sódio 0,9%, um eluente, o 99mTcO4-, é

seletivamente eluído, permanecendo o 99MoO4-2 retido na alumina (Chattopadhyay et al,

2008). O molibdênio utilizado para a fabricação das colunas dos geradores é obtido dos

produtos de fissão do Urânio (Hou et al 2007).

Figura 2.2 Gerador de 99Mo/99mTc produzido pelo IPEN

2.2.5 - Impurezas

2.2.5.1 - Impurezas Radionuclídicas

Consistem na presença de qualquer outro radionuclídeo no eluato que não seja o

de interesse. A presença de impurezas radionuclídicas em eluatos de tecnécio pode

ocorrer devido a algum tipo de falha no gerador, promovendo o desprendimento do

10

molibdênio da coluna de alumina. Isto acarreta exposição desnecessária ao paciente sem

que ocorra um benefício clínico (Owunwanne et al., 1995; Saha, 2004;).

O limite de 99Mo em eluatos de 99mTc recomendado pela Agência Internacional

de Energia Atômica (IAEA) é de 0,55 MBq de 99Mo para cada 3,7x107 MBq de 99mTc

administrado ao paciente (IAEA, 2006).

O tempo decorrido entre a eluição do gerador e o momento da administração da

dose é relevante devido às características físico-químicas do 99Mo e do 99mTc, pois o 99Mo possui meia-vida de 66 horas, ao passo que o 99mTc de 6 horas. Assim, a

proporção de 9Mo no eluato aumenta em função do tempo (Owunwanne et al., 1995;

Saha, 2004).

Para determinar a quantidade de impurezas radionuclídicas devem ser realizados

testes de espectrometria gama para determinar a presença de energias diferentes das

previstas na literatura (Saha, 2004).

2.2.5.2 - Impurezas Químicas

São caracterizadas quando em um eluato existem outras substâncias químicas

que podem interferir no rendimento químico da reação (Saha, 2004;).

Em eluatos oriundos de colunas de 99Mo/99mTc pode ocorrer a presença de

alumina, que se desprende no momento da eluição. Este evento pode causar intoxicação

ao paciente, assim como causar alterações significativas na biodistribuição de certos

radiofármacos, tais como: 99mTc-enxofre-coloidal e 99mTc-metildifosfonato (Saha,2004).

Isto pode acarretar resultados que não refletem a realidade, prejudicando o diagnóstico e

levando à necessidade de repetição do exame (Saha, 2004;).

Este tipo de impureza pode ser verificado por meio da determinação de

coloração combinada com teste de cromatografia de camada fina, determinando-se a

presença de outros compostos químicos no eluato (Owunwanne et al., 1995).

2.2.5.3 - Impurezas radioquímicas

São definidas como quando há presença de uma ou mais formas químicas não

desejadas em um eluato. Em eluatos de 99mTc pode ocorrer a presença de tecnécio em

outras formas químicas com diferentes valores de Nox. Tais formas, quando não

apresentam valores de Nox ideais, não possuem a reatividade necessária para realização

11

de ligações químicas com os fármacos de interesse para determinados exames,

promovendo uma biodistribuição de duas fases: 99mTc-livre e 99mTc-fármaco.

Com o auxílio da cromatografia de camada fina aliada à espectrometria gama, é

possível determinar as frações de retenção dos radiofármacos conforme os rendimentos

químicos ideais para cada tipo de ligação e quantidade das mesmas para os complexos

radionuclídeo - fármaco (Saha, 2004;).

2.2.6 – Utilização de Radiofármacos

Sua utilidade depende essencialmente do comportamento químico, biológico e

farmacocinético da estrutura marcada e das características do radionuclídeo incorporado

(Okuno et al., 1986; Saha, 2004).

Um radiofármaco ou radiobiocomplexo ideal deve apresentar uma meia-vida

efetiva curta. Para a realização do exame deve possuir uma emissão eletromagnética

(raios γ ou raios-X) e localizar-se preferencialmente no tecido ou órgão desejados

(Owunwanne et al., 1995; Saha, 2004).

Os mesmos devem ser estéreis, livres de pirógenos e precisam ser submetidos a

todos os testes requeridos pelo controle de qualidade químico, físico-químico e

biológico de uma droga convencional a ser administrada em humanos (Saha, 2004).

2.2.7 – Biodisponibilidade dos radiofármacos

O comportamento biológico dos radiofármacos após serem administrados no

organismo é determinado pelas características físico-químicas do composto e pelo

estado funcional dos tecidos ou tipos celulares envolvidos (Owunwanne et al., 1995). A

distribuição biológica dos radiofármacos envolve os processos de absorção,

distribuição, metabolismo e excreção da substância (Owunwanne et al., 1995).

Outros fatores, como a ligação às proteínas plasmáticas, ligação aos constituintes

intracelulares das células sangüíneas, solubilidade relativa do radiotraçador, tamanho e

polaridade da estrutura do radiotraçador, mecanismo de transporte (ativo ou passivo),

metabolismo celular e ligação a receptores, possivelmente desempenham um papel na

fixação do radiotraçador ao órgão-alvo e em conseqüência, na sua biodistribuição

(Owunwanne et al., 1995).

12

Quando a alteração na biodisponibilidade do radiofármaco é desejada, esta

modificação pode auxiliar no diagnóstico de doenças. Entretanto, quando ela é

indesejada, este fenômeno pode estar associado à interação de drogas ou à sua

toxicidade, podendo comprometer o exame (Owunwanne et al., 1995; Gomes et al.,

2002a; Jankovic e Djokic, 2005). Além disso, um outro fator relevante é a alteração

desconhecida da biodistribuição do radiofármaco com conseqüente imprecisão no

diagnóstico ou necessidade de repetição do exame cintilográfico, expondo o paciente a

uma dose adicional e desnecessária de radiação (Gomes et al., 2002b).

2.2.8.1 – Biocinética do Molibdênio

Segundo a publicação 67 da Comissão Internacional de Proteção Radiológica

(ICRP, 1993) as informações sobre a distribuição do molibdênio estável em tecidos

humanos mostram uma concentração elevada no osso, no fígado e nos rins. A ligação

do molibdênio ao osso apresenta uma meia-vida biológica elevada (Coughtrey e

Thorne, 1983). Teste em camundongos para administração via intravenosa de 99Mo na

forma de molibdato de amônio mostrou as maiores absorções e retenções no fígado

onde apresentou retenção de 26% da atividade administrada em 1 hora e 21% após 24

horas. Outro órgão que apresentou alta retenção de 99Mo foi o rim, apresentando cerca

de 3,8 % da atividade administrada em 1 hora e 24 horas depois (Rosoff e Spencer,

1973).

A administração de molibdato de amônio em ratos revelou excreção de 74 % do

material em um período de 3 horas (Ando et al., 1989). A biodistribuição nos tecidos de

camundongos e ratos foi semelhante.

Rosoff e Spencer (1964) publicaram experimentos em seres humanos

envolvendo quatro pacientes com idades compreendidas entre os 53 a 78 anos. Foi

observado que a principal via de excreção é a urina, com urina acumulada em 24 horas e

10 dias depois de 12 e 25 % respectivamente. Cerca de 3 % da atividade administrada

foi excretada nas fezes durante este tempo.

Com base nos dados experimentais disponíveis, considera-se que a retenção de

molibdênio em seres humanos é composta de duas componentes com tempos de meia-

vida de um dia (10%) e 50 dias (90%). Isto sugere que o molibdênio é retido no

esqueleto com uma longa meia-vida (ICRP, 1979).

13

A ICRP 1979 sugere que a partir do compartimento transferência (sangue) 10%

do molibdênio seja depositado no esqueleto onde será retido com uma meia-vida

biológica de 10.000 dias. O restante da atividade é distribuído para o fígado (25%), rins

(5%) e outros tecidos (60%).

Estudos com ratos jovens mostram que o tempo de retenção é menor quando

comparado com os animais adultos. Esses dados, no entanto, não fornecem uma base

para afirmar dependência com a idade. Para efeito de cálculos são assumidos os dados

de adultos como parâmetros para todas as idades (ICRP, 1979).

Estudos sobre a biocinética do molibdênio foram realizados também através de

medidas in vivo e in vitro em cinco pacientes de serviços de medicina nuclear

submetidos a cintilografia óssea para detecção de metástases e que apresentaram

diagnóstico negativo. Foram determinados valores de doses efetivas médias de 0,82 μSv

e meia-vida efetiva de 2,3 ± 0,4 dias (Silva, 2007). Os resultados obtidos estão em

concordância com dados publicados por Giussani et al (1998) e sugerem que os valores

gerados pelo modelo teórico da ICRP 1979 superestimam a retenção do radionuclídeo

no organismo.

2.2.8.2 - Ácido metilenodifosfônico (MDP) marcado com 99mTc

O ácido metilenodifosfônico marcado com 99mTc (99mTc-MDP) tem sido usado

para obtenção de imagens ósseas, baseado na elevada afinidade do componente

fosfonatado com os cristais de hidroxiapatita e colágeno imaturo, e são dependentes da

circulação sangüínea óssea e da atividade osteoblástica (McCracken et al., 2001; Saha,

2004).

O ácido metilenodifosfônico (MDP), (Figura 2.3), é um fármaco utilizado em

medicina nuclear que apresenta afinidade pelo tecido ósseo, sendo aplicável em

cintilografia óssea quando o mesmo é ligado com o radionuclídeo 99mTc.

A marcação do MDP ao 99mTc, ocorre quando o Nox do 99mTc é reduzido de +7

para +4 ou +3 por reação de óxido-redução com o Sn+2 presente na solução na forma do

agente redutor cloreto estanoso (SnCl2). Na presença de MDP o 99mTc realiza ligações

químicas do tipo covalente simples ao mesmo.

14

Figura 2.3 Estrutura molecular do ácido metilenodifosfônico MDP usado em medicina

nuclear.

Algumas doenças podem ser diagnosticadas pelo aumento na captação do

componente fosfatado marcado com 99mTc, incluindo lesões metastáticas, doença de

Paget, fraturas, osteomielite, tumores ósseos, artrite reumatóide, lombalgia,

espondilólise e demais doenças que correspondam a modificações demonstradas na

cintilografia óssea, resultantes de condições capazes de provocar respostas inflamatórias

e conduzir à mineralização anormal (Datz 1995; Moore et al. 2003; Saha 2004).

O uso da localização e distribuição de agentes para imagens ósseas, como os

radiofármacos difosfonados marcados com 99mTc ou citrato de gálio-67 (67Ga),

oferecem um modo sensível e pontual de detectar doenças ocultas e investigar o fluxo

sangüíneo ósseo, o metabolismo e a patologia relacionada (Owunwanne et al., 1995).

A imagem “single photon emission computed tomography” tem,

progressivamente, alcançado uma importante função nos estudos de imagens de doenças

articulares, infecções, necrose avascular, crescimento ósseo, desenvolvimento de

anormalidades e efeitos causados por descarga de peso, exercícios e em outras formas

de tratamento em processos de reparos ósseos, (Figura 2.4) (McCracken et al. 2001;

Saha 2004).

15

Figura 2.4 Imagem de tórax anterior realizada por cintilografia planar utilizando 99mTc-

MDP onde verificamos a ligação do radiofármaco com estruturas ósseas assim como o

tecido renal (Timothy et al 1991).

2.2.8.3 – Interferências na biodisponibilidade de radiofármacos

A biodisponiblidade ou farmacocinética de radiofármacos pode ser alterada por

doenças (Owunwanne et al., 1995), pelo estado nutricional (Passos et al., 2002), por

uma variedade de produtos naturais ou sintéticos administrados aos pacientes

(Hesslewood & Leung, 1994) ou em animais de experimentação (Diré et al., 2003), por

procedimentos médicos invasivos e não invasivos, como radioterapia, processos

cirúrgicos, próteses, intubação, hemodiálise, dentre outros (Suga et al., 2001; Okudan et

al., 2004; Bernardo-Filho et al., 2005).

2.2.8.4 - Biodistribuição

Os estudos de biodistribuição são utilizados para controle de qualidade do lote

de preparação de radiofármacos para assegurar aos usuários sua adequação in vivo, e

determinação de retenção e eliminação. Nestes testes uma amostra do radiofármaco é

injetada em um modelo animal, sendo posteriormente sacrificados em intervalos de

tempos fixos, os órgãos dissecados e a atividade retida em cada órgão medida e

16

calculada, fornecendo, assim, uma aproximação para humanos (Owunwanne et al.,

1995).

Diversos estudos de biodistribuição são realizados com ratos da linhagem

Wistar, devido à sua aproximação com a biodistribuição humana comprovada em

experimentos anteriores para o radionuclídeo tecnécio 99m (Diré et al. 2003; Valença et

al. 2005; Souza et al., 2007).

2.3 - Cromatografia planar

A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de

uma mistura realizada através de distribuição destes componentes entre duas fases em

contato direto (Collins et al.,1995)

.

A cromatografia de camada fina é uma técnica que destrói uma pequena porção

da amostra, tendo a capacidade de separação de componentes de misturas liquido-

liquido, relacionando-se com as características de polaridade dos materiais que

compõem a mistura, possibilitando, assim, a realização de análise qualitativa da amostra

(Collins et al.,1995).

2.4 - Detectores de Cintilação

Alguns materiais são capazes de transformar a energia cinética da radiação

incidente, ou produtos gerados durante essa interação, em luz que pode ser detectável de

uma maneira que exista uma proporcionalidade entre a energia depositada e a produção

de luz. A estes materiais chamamos detectores de cintilação (Tauhata et al. 2003).

Existem materiais que podem ser usados como detectores de cintilação na forma

de cristais (cintiladores sólidos), em que a construção da rede cristalina é fundamental

para que esse fenômeno seja possível, os materiais que possuem moléculas que

envolvem a amostra e são capazes de transformar a radiação em luz (cintiladores

líquidos) (Tauhata et al., 2003).

O cristal de iodeto de sódio ativado com tálio apresenta a capacidade de emitir

luz quando seus elétrons da banda valência são excitados pela energia cinética da

radiação, migrando para a banda de condução, por meio de um salto quântico. Porém,

ao voltar para seu estado fundamental (não excitado) na rede cristalina os elétrons têm a

17

probabilidade de entrar nas bandas criadas pelo ativador, no caso o tálio (Tauhata et al.,

2003).

Regiões de bandas criadas pelo processo de ativação do cristal com tálio, até a

sua posição original, permitem a geração de energia luminosa detectável, podendo ser

contada por meio da associação deste cristal a uma válvula fotomultiplicadora. A

mesma transforma a energia luminosa em sinais elétricos com intensidade conveniente

para serem processados, permitindo que o mesmo seja captado e classificado pela

instrumentação através do módulo eletrônico (Tauhata et al., 2003; Saha, 2004).

2.5 - Espectrometria gama

A espectrometria gama é uma técnica que permite análise quantitativa e

qualitativa de um radionuclídeo emissor gama em diversos tipos de amostras. É

realizada em detectores que possuem a capacidade de diferenciar as energias de emissão

gama, como: detectores de cintilação como o NaI(Tl) e semi-condutores Germânio

Hiper Puro (HPGe), por meio do recurso do módulo eletrônico, sendo então possível

discriminar os radionuclídeos presentes na amostra (Tauhata et al., 2003).

18

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Animal experimental

Os animais utilizados neste estudo foram ratos machos (Rattus norvegicus) da

linhagem Wistar, 12 ratos, com aproximadamente quatro meses de idade e peso médio

311 ± 21 g. Os animais foram cedidos pelo biotério da Faculdade de Ciências Médicas

da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), e mantidos sob os

mesmos cuidados relativos à alimentação (ração e água ad libitum), temperatura

(22 ± 5 ºC), umidade (45-65 %) e ciclos de 12 horas claro/escuro.

O experimento e o uso dos animais foi baseado em estudo aprovado pelo comitê

de ética da Universidade do Estado do Rio de Janeiro /COBEA (Souza et al, 2007).

(ANEXO1).

3.2 - Drogas e reagentes utilizados

As substâncias empregadas no experimento de biodistribuição estão

apresentadas na Tabela 3.1:

Tabela 3.1: Substâncias empregadas na biodistribuição e funções.

Reagente / droga Função Fabricante lote validade

Heparina sóidica Anticoagulante Roche / Brasil B1042 05 / 2010

Metilenodifosfonato

de sódio

Fármaco de

medicina nuclear

IPEN / Brasil 00479 10 / 2008

Tiopentax sódico Anestésico

intraperitonial

Cristália / Brasil 07096458 09 / 2009

O anestésico Tiopentax sódico foi injetado intraperitonealmente com

concetração 6,7 %. A quantidade de material injetada em cada animal foi de 60mg/kg de

massa do animal (Souza et al., 2007).

19

3.3 - Radionuclídeo

O radionuclídeo utilizado, molibdênio-99 (99Mo) em solução estéril de

NaCl 0,9%, sob a forma de Na299MoO4, foi gentilmente cedido pelo Centro de

Radiofarmácia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares da Comissão Nacional

de Energia Nuclear e calibrado no LNMRI do IRD (ANEXOS 2 e 3).

3.4 - Cromatografia Planar

Adicionou-se 3 mL de solução de 99Mo na forma de Na299MoO4

a um Kit de

Metilenodifosfonato de sódio. A solução foi agitada ao abrigo da luz por 15 minutos em

Vortex. aliquotas da solução de Na299MoO4 e do complexo Metilenodifosfonato de

sódio + Na299MoO4 foram colocadas em papel WHATMAN 1MM servindo de fase

sólida. Cada um dos conjuntos foi posto em contato com eluentes diferentes: Propanona

e NaCl 0,9% (Anexo 4). Após atingido 10 cm a fase sólida foi cortada em pedaços de

1 cm cada e estas foram contadas no sistema de detecção de NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV

em tubos utilizados em medicina nuclear (medindo 4,3 cm de altura por 1,0 cm de

diâmetro), mostrado na Figura 3.1

a) b)

Figura 3.1 a) Tubo de vidro utilizado para medida dos órgãos nos experimentos de

biodistribuição e espectrometria gama (altura: 4,3 cm; diâmetro: 1,0 cm) e b) Esquema

da cromatografia planar.

20

3.5 - Biodistribuição do radiofármaco

Para avaliar a biodistribuição do radiofármaco Na299MoO4 e 99Mo-MDP, os

animais foram anestesiados e, posteriormente foi injetado, por via endovenosa através

do plexo venoso ocular (Diré et al., 2003) 0,3 mL de solução de Na299MoO4 (grupo 1) e

0,3 mL do radiofármaco 99Mo-MDP (grupo 2). Após respectivamente 10 e 120 minutos

da administração dos radiofármacos os animais foram sacrificados em câmara de CO2.

Os órgãos dos animais (Figura 3.2) foram isolados, identificados e pesados. Os

órgãos foram selecionados seguindo a distribuição conhecida pela ICRP 1979. Na

figura 3.3 está descrito o fluxograma experimental.

21

Figura 3.2 Imagem do rato com os respectivos órgãos retirados

As massas dos órgãos e dos animais foram determinadas em balança analítica

de precisão. A seguir os órgãos, além de uma amostra de sangue de 2mL de cada

animal, foram transferidos para tubos utilizados em medicina nuclear, conforme

mostrado na Figura 3.1a.

A Figura 3.3 apresenta o fluxograma do experimento de biodistribuição.

Figura 3.2 Imagem do Rato com os respectivos órgãos retirados

22

Ratos Wistar inoculados com

Na299MoO4

(n=6)

Ratos Wistar inoculados com

99Mo+MDP (n=6)

Pesagem dos animais

Anestesia dos animais com

Tiopentax sódico 6,7%por injeção intraperitoneal

Biodistribuição do

radiofármaco Na2

99MoO4 por 10 minutos

Biodistribuição do radiofármaco

99Mo+MDP por 120 minutos

Sacrifício e remoção dos órgãos listados na figura 3.2

Pesagem dos órgãos e embalagem dos órgãos em frascos utilizados em medicina nuclear mostrado na figura 3.1 a)

Contagem das emissões na Unidade de Contador de Corpo Inteiro

em contador de cintilação sólida de NaI(Tl) 8”x4”, conforme a figura 3.4, para cada órgão por 300 segundos de tempo vivo

corrigido pelo programa gennie2000

Cálculo das atividades pelas curvas de calibração e determinação da atividade / massa do respectivo órgão

Análise estatística

Figura 3.3 Fluxograma experimental.

23

3.6 – Sistema de detecção da Unidade de Contagem

As medidas dos órgãos e das fitas de cromatografia foram realizadas na Unidade

de Contador de Corpo Inteiro (UCCI) do Laboratório de Medidas In Vivo (LABMIV)

do Instituto de Radioproteção e Dosimetria (IRD). A UCCI é composta de blindagem de

aço com dimensões de 2,5m x 2,5m x 2,65m revestida internamente com camadas

adicionais de chumbo, cádmio e cobre. Este sistema foi originalmente projetado para a

identificação e quantificação in vivo de traços de radionuclídeos emissores de fótons

depositados em órgãos e tecidos do corpo humano (Oliveira et al, 1989).

O sistema de detecção utilizado neste experimento é composto de detector

NaI(Tl) 8”x4” conectado ao sistema de aquisição de espectro Genie2000.

3.7 – Calibração do sistema de detecção da UCCI

As curvas de calibração do detector de NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV, para as

distâncias de 10, 15 e 20 cm em volumes de 2, 4, 6, 8 e 10 mL, foram obtidas

utilizando-se um suporte de acrílico e um coquetel de fontes radioativas (57Co, 137Cs, 54Mn e 65Zn) fornecido e certificado pelo Laboratório Nacional de Metrologia das

Radiações Ionizantes (LNMRI) (ANEXO 5 e Figura 3.4). Desta forma é possível

determinar a atividade para cada órgão, utilizando-se as curvas de calibração, qual

melhor se adequa a medida, considerando-se o volume do órgão e a distância do frasco

em relação ao detector.

Figura 3.4 Geometria de medição das amostras com sistema de detecção de

NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV

24

3.8 – Distâncias e Volumes dos órgãos para avaliação

As medidas das atividades para cada órgão foram realizadas em distâncias fixas e com

os órgãos ocupando os volumes descritos na Tabela 3.2.

Tabela 3.2 Volumes e distâncias na analise dos órgãos biodistribuidos

Órgão Volume (mL) Distância (cm)

Cérebro 2 10

Tireóide 2 15

Pulmão 4 20

Coração 4 20

Fígado 10 20

Baço 4 15

Pâncreas 2 15

Testículo 4 15

Osso 10 20

Músculo 2 20

Sangue 2 20

Rim 4 20

Para distintos órgãos foram utilizadas geometrias de contagens que melhor se

adequassem a simulação do volume ocupado no frasco e a atividade do radiofármaco

presente após a biodistribuição.

3.9 – Análise estatística

As médias aritméticas e desvios padrão dos experimentos isolados foram

calculados e processados pelo programa GraphPad Instat. Os resultados foram

comparados, e os testes estatísticos escolhidos conforme as características da

distribuição dos valores da população, com nível de significância de p<0,05 (Souza et al

2007).

25

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 - Calibração do sistema de detecção para determinação de 99mTc e 99Mo em

amostras de biodistribuição e cromatografia planar

Para calibração do detector NaI(Tl) 8”x4” (Figura 4.1) foi utilizado um coquetel

de radionuclídeos contendo atividades certificadas pelo LNMRI/IRD (ANEXO 5). A

Tabela 4.1 apresenta os radionuclídeos utilizados, energias dos fótons considerados na

calibração e as respectivas intensidades.

Tabela 4.1 Características físicas dos radionuclídeos utilizados para calibração do

sistema de detecção NaI(Tl) 8”X4” do LABMIV

Radionuclídeo Energia (keV) Abundância (Attix et al. 1986)

cobalto-57 105,5 0,1360

césio-137 661,6 0,0722

manganês-54 831,0 0,0697

zinco-65 1115,4 0,0572

26

Energia x Eficiência

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

0,1200

0,1400

0,1600

0 200 400 600 800 1000 1200Energia (keV)

Efic

iênc

ia (c

pm/d

pm)

Volume 2 distância 10Volume 4 distância 10Volume 6 distância 10Volume 8 distância 10Volume 10 distância 10volume 2 distância 15volume 4 distância 15volume 6 distância 15volume 8 distância 15volume 10 distância 15volume 2 distância 20volume 4 distância 20volume 6 distância 20volume 8 distância 20volume 10 distância 20Expon. (Volume 2 distância 10)Expon. (Volume 4 distância 10)Expon. (Volume 6 distância 10)Expon. (Volume 8 distância 10)Expon. (Volume 10 distância 10)Expon. (volume 2 distância 15)Expon. (volume 4 distância 15)Expon. (volume 6 distância 15)Expon. (volume 8 distância 15)Expon. (volume 10 distância 15)Expon. (volume 2 distância 20)Expon. (volume 4 distância 20)Expon. (volume 6 distância 20)Expon. (volume 8 distância 20)Expon. (volume 10 distância 20)

Figura 4.1 Curvas de calibração do detector NaI(Tl) 8”x 4”obtidas nas geometrias de 2,

4, 6, 8 e 10 mL , nas distâncias de 10, 15 e 20 cm.

27

Tabela 4.2 Valores de R2 obtidos para cada geometria de calibração do detector

NaI(Tl) 8”X4”

Geometria e distância Coeficiente de aderência (R2)

Volume 2 mL distância 10 cm 0,967

Volume 2 mL distância 15 cm 0,891

Volume 2 mL distância 20 cm 0,988

Volume 4 mL distância 10 cm 0,962

Volume 4 mL distância 15 cm 0,973

Volume 4 mL distância 20 cm 0,980

Volume 6 mL distância 10 cm 0,964

Volume 6 mL distância 15 cm 0,967

Volume 6 mL distância 20 cm 0,978

Volume 8 mL distância 10 cm 0,958

Volume 8 mL distância 15 cm 0,970

Volume 8 mL distância 20 cm 0,983

Volume 10 mL distância 10 cm 0,961

Volume 10 mL distância 15 cm 0,970

Volume 10 mL distância 20 cm 0,974

Foi observado, (Tabela 4.2), que as curvas apresentaram desvio estatístico do

coeficiente de determinação (R2) próximo a 1 em todas as geometria e distâncias

calibradas. Em todos os casos a variação do volume nas distâncias não resultou em

alteração significativa na tendência das curvas, revelando terem pouca contribuição para

a variação da eficiência de detecção do cristal de NaI(Tl). Por outro lado, observou-se

que a distâncias entre a fonte e o detector representa o parâmetro de maior impacto na

eficiência de detecção.

As equações das curvas de calibração obtidas no UCCI/IRD estão mostradas na

tabela 4.3

28

Tabela 4.3 Equações das curvas de calibração obtidas no detector NaI(Tl) 8”X4”

Geometria distância Equação da curva

Volume 2 mL distância 10 cm y= 0,1403e-0,0009x

Volume 2 mL distância 15 cm y= 0,0886e-0,0015x

Volume 2 mL distância 20 cm y= 0,0469e-0,0008x

Volume 4 mL distância 10 cm y= 0,138e-0,0009x

Volume 4 mL distância 15 cm y= 0,0783e-0,0008x

Volume 4 mL distância 20 cm y= 0,0464e-0,0008x

Volume 6 mL distância 10 cm y= 0,1395e-0,0009x

Volume 6 mL distância 15 cm y= 0,0778e-0,0008x

Volume 6 mL distância 20 cm y= 0,0448e-0,0008x

Volume 8 mL distância 10 cm y= 0,1395e-0,0009x

Volume 8 mL distância 15 cm y= 0,0787e-0,0009x

Volume 8 mL distância 20 cm y= 0,0464e-0,0008x

Volume 10 mL distância 10 cm y= 0,1423e-0,0009x

Volume 10 mL distância 15 cm y= 0,0793e-0,0008x

Volume 10 mL distância 20 cm y= 0,0464e-0,0008x

A disponibilidade de calibrações em diferentes distâncias permite a seleção da

geometria mais adequada em função da atividade da amostra, evitando assim a

ocorrência de tempo morto do detector no caso de amostras que apresentem maiores

atividades.

4.2 - Cromatografia planar associada à espectrometria gama

Foram realizadas corridas cromatográficas planares do molibdato puro e

associado ao MDP para verificar sua interação com soluções de NaCl 0,9% e

Propanona+MDP (ANEXO 4). Os experimentos foram executados em meio sólido

utilizando fitas de papel cromatográfico Whatman 1MM. O experimento foi repetido

com 4 vezes. Posteriormente os meios sólidos foram cortados em distâncias de 1 cm. Os

resultados são apresentados a seguir.

29

Cromatografia Planar do Mo-99 em NaCl 0,9%

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Partes

Ativ

idad

e P

erce

ntua

l

Figura 4.2 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de NaCl 0,9%

Cromatografia Planar do Mo-99 em propanona

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Partes

Ativ

idad

e P

erce

ntua

l

Figura 4.3 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de propanona

As distribuições das contagens nas diferentes porções da fita cromatográfica nos

eluatos representados nas Figuras 4.3 e 4.4 revelam baixa afinidade do molibdato pelo

eluato de maior polaridade (solução de NaCl 0,9%) e maior afinidade pelo eluato de

característica menos polar (solução de propanona).

30

Cromatografia Planar do Mo-99+MDP em NaCl 0,9%

05

10152025303540

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Partes

Ativ

idad

e pe

rcen

tual

Figura 4.4 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de

NaCl 0,9%.

Cromatografia Planar do Mo-99+MDP em propanona

0102030405060708090

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Partes

Ativ

idad

e P

erce

ntua

l

Figura 4.5 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de

propanona.

As distribuições das contagens nas diferentes porções da fita cromatográfica nos

eluatos mostrados nas Figuras 4.5 e 4.6 revelam o comportamento de alta afinidade do

Molibdato com MDP pelo eluato de maior polaridade (solução de NaCl 0,9%), e menor

afinidade pelo eluato de característica menos polar (solução de propanona).

As figuras a seguir apresentam a comparação entre os resultados obtidos nos

experimentos cromatográficos.

31

Figura 4.6 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de

NaCl 0,9%.

Cromatografia Planar comparativa em propanona

0102030405060708090

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Partes

Ativ

idad

e pe

rcen

tual

Mo-99Mo-99+MDP

Figura 4.7 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de

propanona.

Os resultados mostrados nas Figuras 4.7 e 4.8 estão de acordo com o

comportamento previsto para o radiofármaco 99mTc-MDP para cromatografia de camada

fina para o eluente NaCl 0,9%, assim como para a propanona (ANEXO 4).

Os resultados da cromatografia planar para o MDP são conhecidos e já foram

descritos por Owunwanne (1995). O MDP apresenta alta afinidade por solução de

32

NaCl 0,9%. O molibdênio apresenta maior afinidade pela fase sólida (papel

cromatográfico Whatman 1MM), quando comparado à solução de NaCl 0,9%. Isto

sugere que houve uma combinação química in vitro do molibdênio com MDP pela

interação do complexo com a solução de NaCl 0,9%.

4.3 – Biodistribuição do 99Mo in vivo

A biodistribuição foi realizada utilizando dois grupos de estudo. O Grupo 1

(Controle) sofreu injeção de molibdato. Ao Grupo 2 foi administrada solução de

molibdato+MDP.

4.3.1 – Massas dos órgãos

A Tabela 4.3 apresenta as massas médias dos órgãos dos animais, para cada

grupo.

33

Tabela 4.4 - Massa dos órgãos dos animais utilizados nos experimentos de

biodistribuição in vivo do 99Mo

Massa dos órgãos (g) Órgão

Grupo 1 Grupo 2

Cérebro 1,4 ± 0,2 1,4 ± 0,2

Tireóide 0,14 ± 0,05 0,12 ± 0,02 Pulmão 2,2 ± 0,4 2,2 ± 0,2 Coração 0,98 ± 0,18 0,94 ± 0,07 Fígado 12 ± 2 10 ± 2 Baço 0,67 ± 0,08 0,62 ± 0,06 Pâncreas 0,7 ± 0,2 0,63 ± 0,06 Rim 1,04 ± 0,08 1,0 ± 0,1 Testículo 1,4 ± 0,2 1,3 ± 0,2 Osso 3,7 ± 0,6 3,1 ± 0,6 Músculo 1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,2

Aplicando-se o teste ANOVA p<0,05 realizado pelo programa GraphPad

Instat., conclui-se que os resultados mostrados na Tabela 4.4 indicam que não houve

diferença significativa entre as massas dos órgãos entre os dois grupos de animais

utilizados nos experimentos de biodistribuição (ANEXO 7).

4.3.2 - Atividades captadas pelos órgãos

Foram determinadas as atividades de cada órgão coletado no experimento de

biodistribuição para cada grupo de estudo. Os resultados foram avaliados em teste de

significância ANOVA p<0,05. As atividades específicas das médias de cada

compartimento estão apresentadas na Tabela 4.5 e na Figura 4.9 (ANEXO 8).

34

Tabela 4.5 Atividades específicas médias presentes nos órgãos analisados nos grupos de

animais 1 e 2

Atividade específicas médias dos órgãos (kBq/g) Órgãos

Grupo 1 Grupo 2

Cérebro 22 ± 6 20 ± 7

Tireóide 263 ± 96 194 ± 71

Pulmão 351 ± 57 371 ± 21

Coração 150 ± 21 161 ± 15

Fígado 2266 ± 129 2293 ± 138

Baço 680 ± 80 718 ± 86

Pâncreas 659 ± 100 750 ± 86

Rim 1129 ± 200 1052 ± 74

Testículo 78 ± 25 103 ± 39

Osso 120 ± 41 147 ± 40

Músculo 59 ± 23 46 ± 13

Gráfico comparativo entre a biodistribuição do 99-Mo e o 99-Mo+MDP

0

5000001000000

1500000

20000002500000

3000000

FÍGADO RIM

SANGUE

PANCÊASBAÇO

PULMÃO

CORAÇÃO

TIREÓIDE

OSSOS

TESTÍCULO

MÚSCULOS

CÉREBRO

Órgãos

ativ

idad

e (B

q/g)

99-Mo

99-Mo + MDP

Figura 4.8 Atividades dos compartimentos analisados nos grupos administrados com

Molibdato (coluna cinza) e Molibdato + MDP (coluna preta).

35

As atividades dos órgãos, medidos no detector NaI(Tl), e calculadas de acordo

com as respectivas curvas de calibração, foram corrigidas pelo tempo de decaimento.

Segundo teste ANOVA p<0,05 realizado pelo programa GraphPad Instat, não houve

diferença significativa entre as atividades dos órgãos dos animais dos dois grupos. Este

resultado sugere que o 99Mo associado ao MDP não mantém a ligação in vivo, que havia

sido observada no experimento in vitro ou que o molibdênio ligado ao MDP teve o

mesmo padrão de interação que o molibdênio livre.

Os resultados deste experimento estão de acordo com o modelo biocinético do

molibdênio publicado pela ICRP (1993), sugerindo que a maior fração da atividade de

molibdênio administrado por injeção é captada pelo fígado e rins.

O presente trabalho fornece suporte adicional às estimativas de dose realizadas

em recente estudo sobre a exposição interna ao 99Mo em pacientes de medicina nuclear

(Silva, 2007; Silva et al, 2008), nesse estudo, foi assumido, para o cálculo de dose

interna, que metabolismo do molibdênio é independente da presença do fármaco e segue

o modelo de biocinética disponível na literatura.

No presente trabalho observou-se que a presença de MDP na solução não

interferiu na biodistribuição do molibdênio nos órgãos estudados, não promovendo

maior dose no tecido ósseo, alvo do radiofármaco MDP-99mTc. A comparação dos

grupos tratados apenas com molibdato e o grupo molibdato+MDP não alterou

significativamente, com p<0,05, a biodistribuição do radionuclídeo em ratos Wistar em

nenhum dos compartimentos estudados. Os resultados referentes à biodisitribuição e à

cromatografia planar foram publicados na revista Brazilian Archives of Biology and

Tecnology. (ANEXO 6).

36

5 – CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

5.1 - Conclusões

• A metodologia de medição de amostras de pequeno volume, implementada através

da calibração do sistema de detecção do LABMIV/IRD, utilizando suporte com

distância variável, desenvolvido especificamente para esta aplicação, mostrou-se

adequado para este tipo de estudo, podendo ser utilizado para outros radionuclídeos

na faixa de energia de 100 a 1200 keV.

• A cromatografia planar revelou que ocorre interação in vitro do molibdênio na

forma de molibdato com o fármaco MDP, reiterando a importância de realização do

controle das impurezas radionuclídicas oriundas dos geradores 99Mo/99mTc.

• A biodistribuição do molibdato observada em ratos Wistar machos, revelou-se

coincidente com o esperado, supondo-se o comportamento metabólico sugerido pelo

modelo para humanos.

• A biodistribuição do molibdênio em solução de MDP, não apresentou modificação

na distribuição das atividades nos órgãos estudados.

5.2 - Recomendações

• Sugerimos o prosseguimento de estudos de biodistribuição para avaliar as

possibilidades de alterações na biodistribuição do 99Mo com os demais fármacos

utilizados em medicina nuclear.

• Sugerimos o prosseguimento de estudos de cromatografia utilizando outras técnicas

cromatográficas, além da usada no presente trabalho, para avaliar as possibilidades

de afinidades do 99Mo com os demais fármacos utilizados em medicina nuclear.

37

• Visando avaliar a permanência in vivo da ligação entre o 99Mo e o MDP observada

in vitro neste trabalho, recomendamos analise complementar da biodistribuição do

MDP marcado com 99Mo, utilizando o 99Mo e 32P na forma de fármaco MD32P

ligado a 99Mo.

38

ANEXO 1 – Certificado de aprovação pelo Comitê de Ética da Universidade do Estado do Rio de Janeiro

39

40

ANEXO 2 – Certificado de Calibração da Fonte de 99Mo – 1

42

43

ANEXO 3 – Certificado de Calibração da Fonte de 99Mo – 2

44

45

ANEXO 4 – Bula do Fármaco MDP

46

47

48

ANEXO 5 – Certificado de Calibração do Coquetel de Radionuclídeos

49

50

ANEXO 6 – Artigo publicado na revista Brazilian Archives of Biology and

Tecnology

51

52

53

54

55

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