Coloracaodegram Varias Tecnicas[1]

Prof. Dra. Andra E. M. Stinghen Disciplina Fundamentos de Microbiologia

Maro 2009

COLORAO DE GRAM (FONTE: Colorao de Gram: Como fazer, interpretar e padronizar. STINGHEN, A. E. M.; ALBINI, C. A. ; SOUZA, A. P. H. M, 2002)

1 TCNICA DE CONFECO DOS ESFREGAOS

No cotidiano utilizam-se diferentes formas j consagradas pelo uso para realizao dos esfregaos, entretanto alguns cuidados bsicos devem ser tomados para obter-se uma lmina adequada. As figuras a seguir ilustram as diversas maneiras recomendadas para confeco do esfregao a partir de diferentes amostras clnicas

Figura 1 - Preparao de esfregao a partir de amostras coletadas com swab.

FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995

O Swab deve ser rolado para frente e para trs, a fim de depositar uma fina camada do material sobre a lmina.


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Figura 2 Preparao de esfregao a partir de materiais espessos ou semi-slidos.


Na preparao de esfregaos de materiais espessos ou semi-slidos, como por exemplo fezes, pode-se utilizar um swab, para auxiliar para espalhar o material de maneira homognea sobre a lmina.

Figura 3 Preparo de esfregaos a partir de amostras espessas, granulares ou mucides

Colocar a amostra sobre a superfcie da lmina

Colocar uma segunda lmina sobre a primeira contendo o material


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Pressionar o material, e rolar as duas lminas uma contra a outra

Puxar as duas lminas para espalhar


Figura 4 Preparo de esfregaos a partir de amostras lquidas


Esfregaos de materiais lquidos podem ser preparados depositando-se uma gota do material ou do sedimento ressuspenso sobre a lmina em um circulo previamente demarcado. Este procedimento aplica-se a materiais como urina e LCR.


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Figura 5 Esfregaos a partir de amostras concentradas por citocentrfugao.


Se o depsito for muito espesso na rea delimitada, uma poro do material pode ser posteriormente espalhado com auxlio de um palito de madeira para obter uma rea mais delgada.

2 FIXAO DO ESFREGAO

Os esfregaos devem ser fixados ao calor ou com metanol

Fixao pelo calor:

- Secar os esfregaos ao ar em uma superfcie plana ou coloc-los a 60 C em um secador de lminas at que sequem por completo: - Se o esfregao secar ao ar, passar duas a trs vezes pela chama, tomando cuidado para evitar distores, pelo superaquecimento; - Deixar esfriar o esfregao antes de corar.

OBS: Quando amostra muito sanguinolenta, a qualidade dos esfregaos pode ser melhorada cobrindo-os com gua destilada durante cinco minutos aps secar e fixar chama. Aps enxaguar e corar pelo mtodo habitual; os eritrcitos sero lisados e eliminados deixando um fundo mais claro (GARDNER e PROVINE, 1978).


Maro 2009 Fixao pelo Metanol:

A fixao por metanol previne a lise de eritrcitos e resulta em um fundo limpo. Tambm previne que esfregaos de materiais lquidos lmpidos sejam retirados da lmina. - Deixar os esfregaos secarem ao ar em uma superfcie plana; - Cobrir o material com metanol, por aproximadamente 1 minuto; - Retirar o excesso de metanol sem lavar a lmina e deixar secar ao ar; - No usar calor antes de corar.

3 VARIAES DA TCNICA DE COLORAO DE GRAM

Mtodo de Gram clssico

A colorao clssica de Gram foi originalmente desenvolvida por Christian Gram em 1884, conforme consta em anexo. O trabalho original empregava marrom de Bismarck ou Vesuvina como corante de fundo. Descrevemos a seguir a formulao mais similar original consagrada em nosso meio conforme BIER (1985).

As solues utilizadas nesta metodologia esto descritas a seguir.

CRISTAL VIOLETA FENICADA Cristal violeta............................................................1 g lcool a 95..............................................................10 ml Fenol fundido............................................................2 g gua destilada..........................................................100 ml

LUGOL Iodo metlico............................................................1 g Iodeto de potssio.....................................................2 g gua destilada..........................................................300 ml

FUCSINA BSICA Fucsina bsica..........................................................0,1 ou 0,2 g gua destilada.........................................................100 ml

a) Cobrir o esfregao por 1 minuto com soluo fenicada de cristal violeta; b) Escorrer o corante e cobrir o esfregao, durante 1 minuto com soluo de lugol fraco; c) Lavar em gua corrente; d) Descorar com lcool 95 GL, at o descorante fluir lmpido; e) Cobrir o esfregao com soluo de fucsina bsica por 30 segundos.

Modificao de Hucker

A colorao de Gram modificado por Hucker em 1921 amplamente utilizada na rotina, e segundo alguns autores permite uma melhor diferenciao dos microrganismos


Maro 2009 (ISENBERG, 1992). Consiste na utilizao de uma soluo de violeta de metila acrescida de uma soluo a 1% de oxalato de amnio, com funo de fixao. O descorante utilizado pode ser etanol 95GL, acetona ou lcool-acetona, e a sua escolha ir interferir no tempo de descolorao. As solues utilizadas nesta modificao esto descritas a seguir (MINISTRIO DA SADE, 1997).

CRISTAL VIOLETA: Soluo A Violeta de metila...........................................................2 g lcool etlico (99,5 GL)..............................................100 ml lcool metlico (99,57 GL)...........................................100 ml

Soluo B Oxalato de amnio.......................................................4g gua destilada.............................................................400 ml

Misturar as solues A e B. Deixar em repouso a temperatura ambiente por 24 horas ao abrigo da luz. Filtrar antes de usar e estocar em frasco escuro.

LUGOL Iodeto de potssio.........................................................4,5 g Iodo metlico................................................................3,0 g gua destilada...............................................................450 ml

Misturas o iodeto na gua at completa dissoluo, acrescentar o iodo metlico e misturar at dissolver completamente. Antes de usar diluir a 1/20 com gua destilada.

SAFRANINA Safranina........................................................................2,5 g gua destilada...............................................................500 ml

Misturar bem at completa dissoluo.

a) Cobrir o esfregao com soluo de violeta de metila por 15 segundos; b) Adicionar igual quantidade de gua sobre a lmina. Deixar agir por mais 45 segundos;

CUIDADO: Lavagem excessiva nesta etapa pode carrear o cristal violeta das clulas gram positivas. c) Escorrer o corante e lavar em gua corrente; d) Cobrir a lmina com soluo de lugol diludo (1/20) e deixar agir por aproximadamente 1 minuto; e) Escorrer o lugol e lavar em gua corrente; f) Descorar com lcool, deixando fluir lentamente sobre a lmina, at o descorante fluir claro. CUIDADO: Ajuste o tempo de descolorao espessura do esfregao. g) Lavar em gua corrente h) Cobrir a lmina com safranina e deixar agir por 30 segundos;


Maro 2009 i) Lavar em gua corrente; j) Retirar o excesso de gua e deixar a lmina secar ao ar, ou com auxlio de um papel absorvente; j. Examinar o esfregao ao microscpio tico em objetiva de imerso (1000 X).

Contra colorao com carbolfucsina ou fucsina bsica:

Esta modificao recomendada para detectar microrganismos gram negativos fracamente corados. O procedimento similar ao modificao de Hucker, exceto que o descorante recomendado etanol a 95% e o corante de fundo a carbolfucsina ou fucsina bsica a 0,8%, cujas frmulas esto descritas a seguir (ISENBERG, 1992).

CARBOL FUCSINA Soluo A Fucsina bsica...............................................................0,3 g Etanol 95%....................................................................10 ml

Soluo B Cristais de fenol fundido.................................................5 ml gua destilada.................................................................95 ml

Dissolver a fucsina em etanol em frasco de vidro mbar (soluo A). Adicionar o fenol gua destilada em um frasco separado (soluo B). Misturar a soluo B A, filtrar antes de usar, e estocar em frasco escuro a temperatura ambiente.

FUCSINA BSICA 0,8% Fucsina bsica..................................................................0,8 g gua destilada.................................................................100 ml

Colocar a fucsina em um frasco de vidro mbar. Adicionar gua vagarosamente, misturando bem aps cada adio, para dissolver a fucsina. Estocar a temperatura ambiente.

Modificao de KOPELOFF

Esta modificao recomendada para melhor visualizao e diferenciao de bactrias anaerbias que so facilmente muito descorados. As solues utilizadas esto descritas a seguir (ISENBERG, 1992).

CRISTAL VIOLETA ALCALINO Soluo A Cristal violeta....................................................................10g gua destilada...................................................................1000 ml

Dissolver em frasco de vidro e estocar em frasco com tampa de vidro temperatura ambiente.


Maro 2009 Soluo B Bicarbonato de sdio.........................................................50 g gua destilada...................................................................1000 ml

Disssolver em frasco de vidro e estocar em temperatura ambiente.

SOLUO DE IODO (Modificao de KOPELOFF) Hidrxido de sdio............................................................4 g Cristais de iodo..................................................................20 g Iodeto de potssio..............................................................1 g gua destilada...................................................................1000 ml

Dissolver o NaOH em 25 ml de gua destilada em um frasco de vidro mbar. Adicionar o iodo e o iodeto de potssio e dissolver bem. Gradualmente adicionar o restante da gua, misturando bem, aps cada adio.

DESCORANTE lcool 95%........................................................................700 ml Acetona..............................................................................300 ml

Mistura em frasco de vidro mbar e estocar temperatura ambiente.

SAFRANINA Safranina O.........................................................................20 g Etanol 95 %..........................................................................100 ml gua destilada.....................................................................1000 ml

Em um frasco de vidro adicionar etanol em quantidade suficiente para dissolver a safranina (aproximadamente 50 ml). Adicionar gua destilada e estocar temperatura ambiente.

a) Cobrir o esfregao previamente fixado com a soluo A, adicionar aproximadamente 5 gotas da soluo B. Deixar agir por 2 a 3 minutos, sem deixar a lmina secar; b) Lavar a lmina delicadamente com o LUGOL

c) Aplicar aps novo LUGOL por 2 minutos; d) Segurar a lmina em posio inclinada e aplicar o descorante; e) Enxaguar imediatamente com gua corrente; f) Contra corar com safranina de Kopeloff por 30 segundos; g) Retirar o excesso em gua corrente e secar ao ar. h) Examinar ao microscpio tico em objetiva de imerso.


Maro 2009 4 CONTROLE DE QUALIDADE

O controle de qualidade uma atividade essencial na rotina diria. Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da colorao de Gram, necessrio utilizar cepas bacterianas padro, gram positivas e gram negativas, alm de observar freqentemente o aspecto dos reagentes utilizados.

Aspecto dos reagentes

Verificar o aspecto das solues diariamente. Caso haja precipitao de algum dos reagentes, deve-se proceder a filtrao. A evaporao pode interferir na eficcia dos reagentes, se no utilizados com freqncia; a troca deve ser efetuada.

Uso de cepas controle Quando um novo lote de corantes for preparado ou adquirido, realizar esfregaos de cepas padro como: S. pyogenes (ATCC 19615), E. coli (ATCC 25922). O resultado esperado :

- Bacilos Gram Negativos - rosa - Cocos Gram Positivos - violeta escuro

Uma alternativa a este mtodo, quando no se dispe das cepas padro pode ser realizada corando-se um esfregao de raspado da mucosa bucal, que dever conter organismos gram positivos e gram negativos, assim como clulas epiteliais (GARDNER e PROVINE; 1978). Nos exames bacterioscpicos com material contendo leuccitos e clulas epiteliais, extremamente importante observar a colorao nuclear e citoplasmatica. A colorao de Gram adequada resultar na observao dos ncleos corados em vermelho e citoplasma corado em rseo. Uma tendendo para o violeta indicar que a descolorao no foi suficiente.

Limitaes da colorao de Gram

inestimvel o auxlio efetivo da colorao de Gram no diagnstico microbiolgico, entretanto em algumas situaes contra indicada a sua utilizao, como por exemplo, na pesquisa de estruturas bacterianas como cpsulas e esporos, ou na pesquisa de micobactrias e fungos filamentosos.

Alguns microrganismos gram positivos em cultivos superiores a vinte e quatro horas podem se apresentar gram negativos. Microrganismos que sofreram ao de determinados antimicrobianos podem apresentar-se falsamente gram negativos; a recproca no verdadeira. Convm lembrar que a maioria das interpretaes equvocas de esfregaos corados pelo Gram devem-se a falhas na preparao da lmina, como um esfregao demasiado espesso, excessiva fixao pelo calor, ou descolorao insuficiente ou prolongada (GARDNER e PROVINE, 1978).

O achado de microrganismos vermelhos prximos a elementos celulares corados fortemente como gram positivos em uma parte mais espessa do esfregao, confirma que se tratam de organismos gram negativos e que no so bactrias gram positivas descoradas em excesso.


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Cuidados - Inspecionar diariamente os corantes, os quais devem ser estocados a temperatura

ambiente em local sem variaes bruscas de temperatura, a fim de se evitar precipitao, e ao abrigo da luz;

- Comparar os resultados finais da morfologia pelo Gram com a cultura, caso resultados diferentes do esperado forem obtidos, revisar tanto a colorao quanto a cultura.

OBS: Nem todos os microrganismos corados pelo Gram podem ser cultivveis. Lminas de referncia so teis para comparao e treinamento.

5 DESCRIO MORFOLGICA

Exemplos de maneiras de caracterizar morfologicamente os microrganismos mais encontrados:

- Cocos gram positivos - Cocos gram positivos em cadeias (sugestivos de estreptococos) - Cocos gram positivos agrupados (sugestivos de estafilococos) - Cocos gram positivos aos pares - Diplococos gram positivos lanceolados e/ou capsulados (sugestivos de pneumococos) - Cocobacilos gram positivos - Bacilos gram positivos - Bacilos gram positivos sugestivos de Dderlein - Bacilos gram positivos esporulados - Bacilos gram positivos filamentosos - Bacilos gram positivos corineformes - Cocobacilos gram variveis (sugestivos de Gardnerella spp.) - Cocos gram negativos - Diplococos gram negativos intra e/ou extracelulares (sugestivos de Neisseria spp.) - Bacilos gram negativos - Bacilos gram negativos curvos (sugestivos de Mobiluncus spp.) - Bacilos gram negativos atpicos sugestivos de microbiota anaerbia - Bacilos gram negativos espiralados - Bacilos gram negativos pleomrficos (sugestivos de Haemophilus spp.) - Cocobacilos gram negativos - Clulas leveduriformes (com ou sem pseudo-hifas) - Filamentos ramificados gram positivos (sugestivos de actinomicetos) - Associao fuso espiralar


Maro 2009 6 ANEXO

Artigo original sobre a colorao de Gram

Considerando a valiosa contribuio ao estudo da Microbiologia mdica humana, prestada pelo fsico e mdico dinamarqus Hans Christian Joachin Gram (1853-1938), apresentamos a seguir o artigo original sobre a tcnica de colorao que recebeu seu nome e at hoje utilizada em grande parte dos laboratrios de Microbiologia.

Gram, C. Ueber die isolirte Farbung der Schizomyceten in Schnitt-und Trockenprparaten. Fortschritte der Medicin, v. 2, p. 185-189, 1884.

"(I WISH TO THANK HERR DR. RIESS, Director of the General Hospital of Berlin for the facilities and equipment to perform the following studies).

The differential staining method Koch and Ehrlich for tubercle bacilli gives very excellent results either with or without counter-staining, since the bacilli stand out very clearly due to the contrast effect.

It would be very desirable if a similar method for the differential staining of other Schizomycetes were available which could be used routinely by the microscopist.

My studies-as associate of Herr Dr. Friedlander in the morgue of the city hospital in Berlin-have attempted to demonstrate cocci m tlssue sections of lungs of those who have died of pneumonia as well as in experimental animals. As Friedlander has already mentioned briefly in his paper on the micrococci of pneumonia, I have discovered by experimentation a procedure for the differential staining of pneumococci. In my procedure the nucleus and other tissue elements remain unstained, while the cocci are strongly stained. This makes them much easier to locate than previously, since in ordinary preparations from pneumonia patients, where such a large amount of exudate occurs, they are impossible to see.

Further studies on the usefulness of this method for other Schizomycetes has gradually shown that this method is an almost general method for all tissue sections and dried preparations....

For staining the ordinary aniline-gentian violet solution of Ehrlich is used. The appropriate sections must be carried up to absolute alcohol and taken from this directly into the dye solution. They should remain in the dye for 1-3 minutes (except tubercle

bacilli, which should remain as usual 12-24 hours). Then they are placed in a solution of iodine-potassium iodide in water (iodine 1.0 part, potassium iodide 2.0 parts, water 300.0 parts) with or without a light rinse with alcohol and allowed to remain there for 1-


Maro 2009 3 minutes. During this time, a precipitate forms, and the previously dark blue-violet sections now become dark purple-red. (Footnote: This purple-red color is not soluble in water but dissolves very easily in alcohol. The chemical studies will be continued at a later time.) They are then placed in absolute alcohol until they are completely decolorized. It is well to change the alcohol once or twice during this step. Then the sections are cleared as usual in clove oil, in which the rest of the dye is dissolved. The nucleus and fundamental tissue is stained only a light yellow (from the iodine) while the Schizomycetes, if any are present in the preparation, are an intense blue (often almost black). The intensity of the staining has not been equaled by any of the current staining methods. This presents another great advantage of our method. It is possible after the decolorization in alcohol to place the sections for a moment in a weak solution of bismarck brown or vesunne, and then dehydrate again with alcohol, in order to achieve a counterstain. The nucleus will appear brown, while the Schizomycetes will remain blue.

In this way it is possible to prepare doubly-stained preparations that are just as excellent as those of the tubercle bacillus made after the method of Koch and Ehrlich. Permanent preparations in Canada balsam-xylene or gelatine-glycerol ren~ain unchanged after 4 months.

This method is very quick and easy. The whole procedure takes only a quarter-hour, and the preparations can remain many days in clove oil without the Schizomycete cells becoming decolorized.

It is also useful for dried preparations. It is performed exactly as for tissue sections, except that one treats the cover slip just like a section.

I have tried many times different aniline dyes (rubine-aniline, fuchsinaniline and simple gentian violet solution), but without success. In addition, tincture of iodine or potassium iodide solution, as opposed to iodinepotassium iodide solution, are also ineffective, since the Schizomycetes then are also decolorized. When the sections are treated with water or dilute alcohol, the results are variable

I. After iodine treatment, the following forms of Schizomycetes are not decolorized by alcohol.

(a) The coccus of bronchial pneumonia ( 19 cases).

(b) Pyogenic Schizomycetes (9 cases)

(c) Cocci of a liver abscess . . . (1 case)

(d) Cocci and small bacilli in circumscriptive infiltration of the lungs ( 1 case). . . .

(e) Cocci of osteomyelitis (2 cases).

(f) Cocci of suppurative arthritis following scarlet fever ( 1 case)


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(g) Cocci of suppurative nephritis following cystitis (3 cases)

(h) Cocci of multiple brain abscesses following empyema (2 cases)

i. Cocci of erysipelas ( 1 case)

(k) Tubercle bacilli (5 cases)

(1) Anthrax bacilli (3 cases) (in mice ) .

(m) Putrefactive Schizomycetes (bacilli and cocci)....

II. The following forms of Schizomycetes are decolorized in alcohol after iodine treatment.

(a) 1 case of bronchial pneumonia with cocci that formed cap

(b) 1 case of bronchial pneumonia with cocci that did not form capsules.

(c) Typhoid bacilli (5 cases) are decolorizcd either with or without iodine treatment very easily by alcohol. I have attempted to leave the sections in the dye for as long as 24 hours but without any better results.

Iwould like to make one closing remark. The behavior of the cell nucleus and the Schizomycetes to aniline dyes in other methods are almost identical, whereas with the present staining method a very distinct difference IS visible.

Studies- on Schizomycetes have been significantly improved by the use of this method. It is because of this that I publish my results, although I am well aware that they are brief and with many gaps. It is to be hoped that this method will also be useful in the hands of other workers.

Editor's note. I would like to testify that I have found the Gram method to be one of the best and for many cases the best method which I have ever used for staining Schizomycetes."


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