Coliformes totales, Coliformes fecales y Escherichia coli ...
Coliformes a 35
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Coliformes a 35ºC (Coliformes totais)
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Introdução
Coliformes: são microrganismos indicadores
ocorrência de contaminação
deterioração do alimento
presença de patógenos
condições inadequadas durante processamento, manipulação ou armazenamento.
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O grupo coliformes inclui bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, na forma de bastonetes gram negativos, não formadores de esporos (não sobrevivem à pasteurização)
Coliformes totais: capazes de fermentar a lactose a 30-35ºC (por isso, atualmente vem sendo chamados de coliformes a 35ºC e não mais coliformes totais). O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.
Coliformes termotolerantes ou a 45ºC: capazesde promover a fermentação a 45ºC. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam essa capacidade.
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Coliformes Totais (a 35º): Avaliar as condições higiênicas
o altas contagens: contaminação pós-processamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem.
Coliformes Termotolerantes (a 45ºC): Indicador de condições higiênico-sanitárias (contaminação de origem fecal)
o Principal representante: E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais.
o Indicar possibilidade de presença de outros patógenos entéricos.
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Devido ao fato de serem destruídos com certa facilidade pelo calor, sua contagem pode ser útil em testes de contaminações pós-processamento.
Importante: Destruídos pela pasteurização, porém quanto maior a contaminação microbiana antes do processamento, maior será sua microbiota residual
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Os coliformes metabolizam a lactose, produzindo, entre outras substâncias, ácido lático e CO2. Ácido lático: aumento da acidez
CO2 retido na massa dos queijos, dando lugar a pequenos buracos. Em excesso: estufamento precoce
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Teste presuntivo para coliformes totais: indica a presença consiste na semeadura de volumes
determinados da amostra em tubos de
caldo lactado ou com caldo Lauril
Sulfato Triptose
Teste Confirmativo para coliformes totais A partir do presuntivo: transferência de cultura de todos os tubos positivos para tubos contendo
caldo Verde Brilhante.
Teste de diferenciação: confirmação da presença de E. coli, em caldo EC e meio EMB
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Pode-se utilizar 2 métodos: método em placas
Método em tubos (NMP- Número mais provável ).
A escolha do método: número de microrganismos
disponibilidade de efetuar os métodos.
Método em placas: mais preciso
Método em tubos: mais utilizado, mais simples
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Esta técnica consiste na inoculação de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura VBB (Caldo Verde Brilhante Bile), sendo cada volume inoculado em uma série de tubos. Positivos: turvação do meio e produção de gás.
A combinação de resultados positivos e negativos
permite a obtenção de uma estimativa da
densidade das bactérias pesquisadas,
através de cálculos de probabilidade.
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Vantagens em relação a contagem em placas:
possibilidade de inocular quantidades
maiores da amostra, aumentando-se proporcionalmente o volume de meio de cultura sensibilidade maior
Permite introdução de etapas de recuperação de células injuriadas.
É uma técnica versátil, permite a enumeração de diferentes grupos ou espécies de microrganismos, apenas variando os meios de cultura utilizados e as condições de incubação.
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10mL
1mL
0,1mL
Incubar a 30ºC por 24- 48h
Os volumes podem ser ajustados de acordo com a contaminação na amostra
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A determinação em placas consiste em adicionar amostras ou diluições em placas, em profundidade, com ágar VRB (Violeta vermelho bile) observar o crescimento de colônias
Vermelho purpura, circundada por uma zona roseada.
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Coliformes a 35ºC – Metodologia segundo Standart Methods
- Tranferir 1mL das diluições em placas de petri esterilizadas;
- Adicionar, aprox., 15 mL de ágar VRB fundido, homogeneizar com movimentos em forma de “8”;
- Após a solidificação, colocar cerca de 4mL de VRB, sobrecamada;
- Após a solidificação, incubar invertidas a 32ºC/24h.
- Selecionar placas com 25 a 250 colônias e efetuar a contagem; Colônias típicas: vermelho-purpuras, circundada com zona roseada.
- Calcular o número de unidades formadoras de colônias por mililitro, (UFC/mL), multiplicando-se o numero de colônias pela diluição inoculada.
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Coliformes a 35ºC – Metodologia do NMP segundo Norma FIL-73A: 1985
- Inocular 1, 0,1 e 0,01 mL de leite em 3 séries de tubos, contendo cada tubo,10 mL de caldo VBB e um tubinho de Durhan esterilizados*;
- Homogeneizar e incubar os tubos a 30ºC/24-48h;
- Calcular o NMP através da tabela, a partir do número de tubos positivos em cada série. São positivos aqueles tubos onde se observa turvação e produção de gás.
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Grupo 1 Leite cru
Grupo 2 Leite pasteurizado
Grupo 3 Iogurte
Grupo 4 Doce de leite
10mL para 90mL de diluente Homogeneizar Diluições
Pesar 10g para 90mL de diluente Homogeneizar Diluições
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Meio VRB
1mL 1mL
Incubar: - Tubos de VBB: 35ºC/ 24h - Placas VRB: 32ºC/ 24h
Leite
Incubar a 35ºC/24-48h Teste positivo: turvação e produção de gás
Tubos positivos com VBB: passar para caldo EC
Incubar em banho-maria a 45,5ºC/24h Teste positivo: turvação e produção de gás
Tubos positivos no EC: passar para meio EMB Incubar em banho-maria a 35ºC/24h
Colônias típicas: negras com brilho metálico
Provas confirmativas: Testes bioquímicos