Codigos Coletas de Água (Vrq) 2 Abril

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

PR-PROJETO DE PESQUISA

DETECO DE MICROCISTINAS EM AMOSTRAS DE GUAS NATURAL E POTVEL

EMPREGANDO BIOSSENSORES AMPEROMTRICOS BASE DE FOSFATASES

Mestranda:

Laiane Arajo da Silva Souto

Orientadora:

Prof. Dra. Gilvanda Silva Nunes

So Lus - MA Maio/2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

PLANO DE PESQUISA



Pr-Projeto de pesquisa apresentado ao

Programa de Ps Graduao em

Qumica da UFMA.

______________________________________

Laiane Arajo da Silva Souto

(Mestranda)

______________________________________

Prof. Dra. Gilvanda Silva Nunes

(Orientadora)

So Lus - MA Maio/2015



Local de desenvolvimento:

Laboratrio do Ncleo de Anlise em Resduos de Pesticidas - NARP UFMA.

CCET, Bl 7, sala 307.

(98) 3272-8255.

Perodo de Execuo:

Maro de 2015 a fevereiro de 2017.

Equipe de Trabalho:

Laiane Souto - [email protected]

Fernanda Gabrielle Silva - NARP/UFMA [email protected]

Prof. Dra. Gilvanda Silva Nunes NARP/UFMA - [email protected]

Prof. Dr. Paulo Brasil Marques NARP/UFMA [email protected]

Colaboradores:

Prof. Dr. Paulo Brasil Marques NARP/UFMA [email protected]

Prof. Dr. Jean-Louis Marty Universidade de Perpignan, Frana - [email protected]

Resumo:

Ambientes aquticos eutrficos, ou seja, ricos em nutrientes oriundos sobretudo de esgotos

domsticos, favorecem a proliferao e predominncia de espcies de cianobactrias, que, por

sua vez, podem produzir diversas toxinas e liber-las no meio aqutico, e especial as

microcistinas. Geralmente, estas floraes tm grande impacto negativo nos corpos d'gua

alterando as caractersticas de qualidade, tais como odor e sabor. Alm disso, a presena das

toxinas, que no so eliminadas nos processos tradicionais de tratameto de gua, podem

causar srios problemas de sade aos homens e aos animais. Deste modo, a presena de tais

contaminantes deve ser controlada e monitorada em ambientes aquticos lnticos e na agia

potvel, sendo que normalmente as metodologias analticas empregadas para tal, baseadas em

tcnicas cromatogrficas (em especial HPLC/MS) so de elevado custo. O presente projeto

objetiva, portanto, desenvolver biossensores amperomtricos, de alta sensibilidade e baixo

custo, capazes de detectar esses contaminantes em amostras de guas natural e potvel. Para

tanto, inicialmente sero selecionadas as protenas fosfatases, como elementos de

biorreconhecimento, para construo dos biossensores, e testados diferentes procedimentos de

imobilizao enzimtica, otimizando-se em seguida o mtodo de inibio da fosfatase pelas

microcistinas, que ser o princpio de deteco destas. Os biossensores sero caracterizados,

mediante testes empregando voltametria cclica, voltametria de pulso diferencial,

cronoamperometria, alm de outras tcnicas eletroquicas, e as condies operacionais

(seleo do mediador eletroqumico, carga enzimtica, tipo e concentrao do substrato,

tempo de corrida cronoamperomtrica, pH do meio, etc) sero otimizadas para posterior

emprego dos biossensores serigrafados na anlise de microcistinas em amostras de guas

naturais (de rios e lagoas) e potvel da cidade de So Luis, MA. Este projeto representa uma

contribuio concreta ao desenvolvimento do Maranho, pois alm de possibilitar a realizao

de monitoramentos precisos, sensveis e a baixo custo, ainda poder originar tecnologias

(prottiipos analticos) com potencial de patenteabilidade e futura produo/comercializao.

1. INTRODUO

As cianobactrias, tambm conhecidas como algas azuis, so bactrias Gram-

negativas procariontes fotossintticas que so encontradas em uma variedade de habitats,

colonizando bitopos aquticos e terrestres (MANKIEWICZ et al., 2003; BRIAND et al.,

2003). Seu domnio sobre as demais espcies do ecossistema uma indicao de que elas

possuem algumas capacidades fisiolgicas especficas que lhes permitem competir de forma

muito eficiente (JAYARAJ, ANAND e RAO, 2006).

Cianobactrias produtoras de toxinas so conhecidas por cianobactrias txicas, como

algumas linhagens de Microcystis, Anabaena, Oscillatoria e Cylindrospermopsis .Os efeitos

descritos de toxicidade de cianobactrias so diversos: dermatotxicos, hepatotxicos e

neurotxicos.(FONSECA,2014).Esses organismos produzem uma grande variedade de

metablitos secundrios com funo desconhecida, dentre esses metablitos esto as

cianotoxinas, um grupo diverso de toxinas naturais, tanto do ponto de vista qumico como

toxicolgico. Pela estrutura qumica as cianotoxinas podem ser divididas em trs grandes

grupos: peptdeos cclicos, alcalides e lipopolissacardeos, dentre os pepitideos cclicos as

principais representantes so as Microcistinas.-LR (MICHELINE,2014)

A microcistina-LR uma molcula pequena, composta por sete aminocidos, com

peso molecular entre 0,9 a 1,0 k Daltons classificadas como hepatotoxinas. Os pesquisadores

da rea tm mostrado que a microcistina-LR atua inibindo enzimas intracelulares

denominadas fosfatases, que removem os grupamentos de fosfato das protenas. Isso promove

uma alterao na estrutura do esqueleto celular causando disfuno, ou seja, modifica a

arquitetura e consequentemente a funo das clulas do fgado. (AZEVEDO, 2014).

2. REFERENCIAL TERICO E JUSTIFICATIVA

Vrios mtodos de deteco tm sido utilizados atualmente na deteco/quantificao

de microcistinas, tais como a cromatografia lquida de alta eficincia acoplada

espectrometria de massas (HPLC/MS), os bioensaios envolvendo animais de laboratrios, os

testes de inibio enzimtica (via colorimetria) e os testes imunolgicos baseados em ELISA

(do ingls, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (ETCHEGARAY E BUENO, 2010; LONG

et al., 2009)

Apesar de vrias tcnicas de anlise para deteco de microcistinas tais como

bioensaio, ELISA, HPLC e LC-MS j serem utilizadas, o desenvolvimento de biossensores

abriu novas perspectivas, pois oferece uma deteco rpida e precisa, alm de alta

reprodutibilidade, sensibilidade (LEBOGANG, 2014; SINGH et al,2012). Destaca-se ainda a

e possibilidade desses aparatos virem a ser portteis, ale da miniaturizao e rapidez de

resposta (LEITE, 2012).

Biossensor um dispositivo no qual o material de origem biolgica, tais como enzima,

organela, tecido animal ou vegetal, microrganismo, antgeno ou anticorpo, cidos nucleicos,

lectina, entre outros, imobilizado junto a um transdutor adequado. (RICCARDI et. al.;

2008).O transdutor amperomtrico emprega a medida de intensidade de corrente de uma

clula eletroqumica a um potencial fixo, sendo a corrente gerada por reao redox na

superfcie sensitiva, proporcional a concentrao do analito. No biossensor cataltico a enzima

adequada, imobilizada na superfcie do eletrodo, catalisa a reao dos substratos e o

monitoramento da corrente eltrica poder ser efetuado devido a formao dos produtos ou

consumo de regente.

Geralmente um biossensor permite o uso de mtodos limpos e de baixo custo sem

precisar de pr-tratamentos morosos e de grandes volumes de amostra. O seu uso, na maioria

dos casos, no necessita de tcnicos ou especialistas podendo em alguns casos dispensar o uso

de reagentes, e aparecendo tanto como aparelhos de uso contnuo ou como descartveis

(SALGADO, 2001).

Inmeros registros de florescimentos de cianobactrias tm sido realizados no pas,

sendo que uma expressiva parcela (>50%) tem reconhecido potencial txico (YUNES et al.,

1996; 1998; MINILLO et al. 2000). Conforme SANTANNA E AZEVEDO (2000) existem,

no Brasil, cerca de 20 espcies de 14 gneros de cianobactrias que so txicas, porm, em

vrios Estados brasileiros, principalmente aqueles situados nas regies Norte, Nordeste e

Centro Oeste, os dados continuam subestimados. Assim, a contaminao por Microcistina -

LR, , um problema Ambiental e de Sade Pblica.

A utilizao de biossensores especficos para a deteco/quantificao desses

compostos levando-se em considerao o princpio da inibio da enzima fosfatase por

microcistinas, parece ser uma alternativa prtica vivel para determinaes em campo, pois

a sua utilizao simples e rpida, no necessitando de prvio tratamento da amostra.

Desta forma, esse trabalho objetiva promover a deteco de microcistinas em amostras

de guas naturais estagnadas (rios, mananciais, lagoas, etc) e de gua potvel, mediante uso

de biossensores amperomtricos, como uma forma de contribuir para o desenvolvimento de

trabalhos envolvendo monitoramentos in situ em reas contaminadas ou em reservatrios de

gua potvel.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Desenvolver biossensores amperomtricos, utilizando diferentes fosfatases como elementos

de biorreconhecimento para detectar microcistinas em amostras de guas natural e potvel.

3.2. Objetivos Especficos

-Definir as protenas fosfatases que sero utilizadas no processo, atravs da sua atividade

relativa e inibio (teste ELISA).

-Testar diferentes procedimentos de imobilizao enzimtica determinando qual o melhor

mtodo para inibir fosfatases.

- Inibir enzimas fosfatases utilizando o mtodo apropriado e previamente testado.

- Preparar e otimizar, mediante testes empregando voltametria cclica, as condies

operacionais (seleo do mediador eletroqumico, carga enzimtica, tipo e concentrao do

substrato, tempo de corrida cronoamperomtrica, pH do meio, etc) dos biossensores

serigrafados;

- Aplicar os sistemas biossensores na deteco de microcistinas em amostras de gua natural e

potvel.

4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Reagentes e Solues

Para estudo cintico da atividade enzimtica na ausncia e na presena do inibidor,

sero utilizados os seguintes materiais: p-nitrofenol (PNP) e p-nitrofenilfosfato (PNPP,

substrato cromognico) Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA); Enzimas

fosfatases obtidas comercialmente; Soluo-tampo Tris-Glicinato de sdio, 100 mM,

pH 9,5 Merck (Alemanha); Solues de NaOH a 0,1 M e 2 M; Microcistina-LR

(C49H74N10O12, PM = 995,2 g/mol, 96% pureza, solvel em DMSO, etanol ou etanol a

100%) Alxis Biochemicals (San Diego, CA, EUA) soluo estoque: 104 g/L.

Para preparao dos biossensores impressos, sero empregados: lcool polivinilico

contendo grupamentos estirilpiridnicos (PVA-SbQ, forma betana) Toyo Gosei

Kogyo Co. (Chiba, Japo); Soroalbumina bovina (BSA) Biochemical, Biochemical,

BDH Lim. (Poole, Inglaterra); Glutaraldedo a 25% Fluka Chemie (Basel, Sua).

4.2. Caracterizao Inicial dos Eletrodos Impressos

Sero selecionados eletrodos serigrafados em uma base de PVC. Os sistemas

apresentam na sua constituio trs eletrodos: de trabalho, auxiliar e de referncia (Fig. 1).

4.3. Medidas eletroqumicas

Para as anlises por voltametria cclica (CV), ser empregado o aparelho AUTOLAB

(Ecochemie BV, Utrecht, Holanda), que consiste de um sistema de aquisio de dados,

conectado a um potenciostato/galvanostato.

Figura 1. Biossensor baseado na enzima PP contendo trs eletrodos: a eletrodo de referncia Ag/AgCl; b eletrodo auxiliar de grafite; c eletrodo de trabalho contendo: TCNQ (mediador), PP(elemento de biorreconhecimento) . Contatos eltricos (d) feitos com o

potenciostato atravs de um conector apropriado.

4.4. Determinao da atividade da enzima fosfatase alcalina em soluo

O mtodo, desenvolvido por Bowers & McComb baseia-se na reao de hidrlise do:

p-nitrofenilfosfato (PNPP), catalisada pela enzima fosfatase alcalina, dando origem ao

p-nitrofenol (PNP) (Fig. ). O PNP incolor no pH do ensaio, mas em meio fortemente

alcalino (a reao enzimtica interrompida pela adio de NaOH 2 M), apresenta-se amarelo

( = 410 nm; = 18.400 M-1

. cm-1

).

Figura 2. Reao de hidrlise do p-nitrofenol, catalisada pela enzima fosfatase.

4.5. Imobilizao Enzimtica

- Sero testados 2 mtodos de imobilizao da fosfatase:

A) Imobilizao com glutaraldedo: Uma pasta sensvel ser preparada com enzima fosfatase,

glutaraldedo e tampo fosfato (pH 7,5), que ser posteriormente depositada sobre o eletrodo

de trabalho, e conjunto deixado em repouso a 4C por 24h). Em seguida, o eletrodo ser

lavado com tampo fosfato (pH 7,5) e estar pronto para avaliao.

B) Imobilizao com PVA-SbQ: sero misturados a enzima fosfatase, o PVA-SbQ e o tampo

fosfato (pH 7,5). A mistura ser homogeneizada em um agitador Vortex, e a pasta enzimtica

resultante depositada sobre o eletrodo de trabalho. Em seguida, ser aplicada luz de nenio

sobre o eletrodo de trabalho por no mnimo 18h em uma temperatura de 4C, a fim de se

realizar a fotopolimerizao da enzima. Depois disso, o biossensor ser deixado em repouso a

4C por 24h (Fig. 3).

Fig. 3. Mistura da enzima com PVA-SbQ, seguido de fotopolimerizao sob refrigerao.

4.6. Ensaios de Inibio

O substrato (fosfatase) ser adicionado ao tampo fosfato pH 7,5 e a intensidade de

corrente inicial (Io) monitorada cronoamperometricamente em um potenciostato. Aps

lavagem do biossensor, seguida de incubao deste na soluo ou na amostra de gua ou de

uma soluo dopada com o inibidor (microcistina), o biossensor ser novamente lavado e um

segundo sinal de corrente (inferior) ser registrado (I). O valor de dI ser proporcional

concentrao da toxina e a inibio relativa (IR) poder ser calculada como segue (Fig. 4)

Figura 4. Esquema do ensaio de inibio enzimtica.

4.7. Testes Eletroqumicos e Otimizao das Condies Operacionais

Sero empregadas as tcnicas voltamtricas (voltametria cclica, voltametria de pulso

diferencial, cronoamperometria, etc.) no s para caracterizar os biossensores obtidos, como

tambm para otimizar as seguites condies operacionais:

Seleo do mediador eletroqumico sero testados os mediadores ftalocianina de

cobalto (CoPC) e Meldolas Blue;

Escolha do potencial de trabalho;

Seleo da enzima e sua carga enzimtica;

Escolha do Substrato e sua concentrao;

pH do meio (faixa de trabalho tima para a enzima);

Tempo de corrida cronoamperomtrica;

Condies para inibio (carga da enzima, faixa de concentrao da microcistina,

tempo de inibio,etc).

4.8. Determinao das Figuras de Mrito

A partir da otimizao das condies anteriormente citadas, ser selecionado o

melhor sistema biossensor para deteco de microcistinas de determinadas as seguinets

figuras de mrito:

Preciso das medidas eletroqumicas utilizando o biossensor (repetibilidade e reprodutibilidade);

Faixa linear de trabalho (linearidade das concentraes da microcistina); Limiteis de deteco e de quantificao; Exatido (ndice de recuperao).

Time

Intensity

I1

Substrate

Potentiostat Recorder

Cell

Buffer

Magnetic stirring

4.9. Anlises das Amostras de gua

Sero tomadas para anlise amostras de guas natural e potvel de diferentes fontes

da cidade de So Lus, e aplicados os biossensores para microcistnas otimizados, a fim de se

determinar a presena desses contaminantes.

5. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

Ativi- dades

SEMESTRES

2015.2 2016.1 2016.2 2017.1

Bimestres

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Atividades:

1. Reviso bibliogrfica

2. Avaliao da atividade enzimtica

3. Estudo imobilizao enzimtica/seleo substrato

4. Preparo e otimizao dos biossensores

5. Testes com solues do inibidor det. figuras de mrito

(preciso e linearidade)

6. Ensaios de recuperao com solues

e guas naturais e potveis dopadas (exatido)

6. ORAMENTO

Este projeto foi previamente aprovado no Depto de Tecnologia Qumica, CCET/UFMA, e

ser todo financiado com recursos oriundos da SEMA (Contrato SEMA/FSADU 07/2014).

Itens de Custeio

Item Justificativa Valor Total (R$)

Material de consumo suprimentos para cromatografia (colunas, filtros e membranas de extrao, cartuchos, fases estacionrias, etc.), padres de subst. quimicas, padres certificados, adsorventes e vidrarias em geral

Material necessrio construo e testes dos biossensores

25.000,00

SUB-TOTAL 25.500,00

7. Coleta e testes em amostras reais

8. Estudos em ambientes naturais

empregando os biossensores

9. Elaborao de monografias dissertaes, Teses, artigos e patente(s)

10. Divulgao dos resultados em eventos cientficos

11. Depsito(s) de patente(s) no INPI

REFERNCIAS

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Codigos Coletas de Água (Vrq) 2 Abril

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