COCCIDIOIDES POSADASII DE ORIGEM CLÍNICA E … · A aluna de iniciação científica, Lívia...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
RITA AMANDA CHAVES DE LIMA
COCCIDIOIDES POSADASII DE ORIGEM CLÍNICA E
AMBIENTAL: UM ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA
Fortaleza/CE
2010
2
Rita Amanda Chaves de Lima
COCCIDIOIDES POSADASII DE ORIGEM CLÍNICA E
AMBIENTAL: UM ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA
Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em
Microbiologia Médica, do Departamento de Patologia e
Medicina Legal, da Faculdade de Medicina, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Profa. Dr
a. Raimunda Sâmia Nogueira
Brilhante
Fortaleza/CE
2010
3
Rita Amanda Chaves de Lima
COCCIDIOIDES POSADASII DE ORIGEM CLÍNICA E AMBIENTAL: UM ESTUDO
DA DIVERSIDADE GENÉTICA
Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em
Microbiologia Médica, do Departamento de Patologia e Medicina
Legal, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.
Data da Defesa: ____ / ____ / ____
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________
Profa. Dra. Adriana de Queiroz Pinheiro
Faculdade de Veterinária - Universidade Estadual do Ceará
_____________________________________________________
Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira
Faculdade de Veterinária - Universidade Estadual do Ceará
____________________________________________________
Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim
Faculdade de Medicina - Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________________
Profa. Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante (Orientadora)
Faculdade de Medicina – Universidade Federal do Ceará
4
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha tão amada família.
Em especial, aos meus avós, Teodózio e Neite; meus pais,
Antônio Humberto e Ivete; e minhas irmãs, Karola e
Letícia.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vontade e coragem de querer ir sempre adiante.
A minha orientadora Profa Dra Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante por todos os
ensinamentos, conselhos e tempo despendido, que contribuíram de forma essencial para meu
amadurecimento científico. Sobretudo pelo incentivo e credibilidade depositados em mim.
Ao Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim coordenador do Mestrado em Microbiologia Médica
pela sua dedicação para o funcionamento desse mestrado
Ao Prof Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha pelo exemplo de retidão e dedicação ao laboratório
A Profa Dra Rossana de Aguiar Cordeiro pelos conhecimentos e contribuições para as
pesquisas no CEMM
Ao Prof. Dr. André Jalles Monteiro, professor Adjunto do Departamento de Matemática e
Estatística Aplicada da Universidade Federal do Ceará pelo estudo estatístico realizado nos
artigos publicados
Ao Prof. Dr. Thalles Barbosa Grangeiro pela parceria realizada entre Laboratório de Genética
da UFC e o CEMM, possibilitando a execução desta pesquisa
A Profa Anne Carolinne Bezerra Perdigão pelo auxílio imprescindível em um momento
crítico desse trabalho, proporcionando a obtenção da análise filogenética
A todos os professores do Mestrado em Microbiologia Médica – UFC, que contribuíram para
minha formação
À Banca Examinadora, por aceitar cordialmente o convite
As doutorandas Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia e Joyce Fonteles Ribeiro pela
disponibilidade incondicional, especialmente na etapa final do desenvolvimento do presente
trabalho.
A pós-doutoranda Ana Karoline Freire da Costa, pelas considerações na qualificação, mas
principalmente por estar sempre disposta a ajudar e dividir seus conhecimentos
A aluna de iniciação científica, Lívia Gurgel do Amaral Valente pela incansável
disponibilidade e auxílio no desenvolvimento dos experimentos
As alunas Marina e Suelen do laboratório de Genética Molecular da UFC pela ajuda para
realização de parte do trabalho experimental e da análise das sequências
Aos técnicos Terezinha de Jesus dos Santos Rodrigues e Daniel Teixeira Lima, pelo apoio
técnico-laboratorial para realização dos procedimentos
6
Aos amigos e colegas integrantes do CEMM, pelo agradável convívio.
Em especial, as AMIGAS do CEMM, que ao longo dos dias intermináveis de trabalho
compartilharam a alegria de um bom momento de descontração. A todas muito obrigada! Pelo
apoio, estímulo, e, sobretudo, pelo de auxilio imprescindível sem o qual grande parte desse
trabalho não teria se tornado possível.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pelo suporte
financeiro.
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“Pedras no caminho? Guardo todas,
um dia vou construir um castelo...”.
Fernando Pessoa
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RESUMO
A coccidioidomicose é uma infecção sistêmica, predominantemente pulmonar,
causada pelos fungos dimórficos e geofílicos, Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii.
No Brasil, a coccidioidomicose está associada a locais situados na zona semi-árida da região
Nordeste, considerada uma das áreas endêmicas da doença na América do Sul. Estes
patógenos consistem em espécies morfologicamente indistinguíveis, mas que exibem
diferenças moleculares peculiares. O DNA ribossômico nuclear (rDNA) de Coccidioides spp.
tem sido apontado como importante marcador molecular utilizado na identificação, taxonomia
e filogenia. Atualmente, ainda há escassez de mapas de abordagens epidemiológicas para
direcionar a correlação entre as populações de Coccidioides spp. com os surtos de
coccidioidomicose. Diante do exposto, este estudo teve por objetivo, realizar a identificação
molecular de 18 isolados clínicos e ambientais de C. posadasii, oriundos do Nordeste
brasileiro, mantidos na Micoteca do Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM),
através da técnica de PCR, bem como, analisar a diversidade genética destes isolados por
meio do seqüenciamento das regiões 18S-28S do rDNA nuclear. A identificação dos isolados
foi realizada por PCR utilizando os primers específicos Coi9-1F e Coi9-R. O sequenciamento
das regiões 18S-28S rDNA foi realizado pelo método da terminação da cadeia pelo
didesoxinucleotídeo, usando-se o kit DYEnamicTM
ET terminators cycle sequencing (GE
Healthcare). Os resultados confirmaram a identificação de todas as cepas incluídas neste
estudo, como pertencentes à espécie C. posadasii. A árvore filogenética, baseada na região
18S-28S rDNA de C. posadasii do CEMM, juntamente com sequências de Coccidioides spp.
depositadas no Genbank. revela a formação de um cluster exclusivo englobando as cepas
CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-064, CEMM 05-2-065 e CEMM 05-2-066, em um ramo
adequadamente sustentado, que aparentemente parece agrupar estes isolados segundo sua
origem geográfica. As cepas de C. posadasii apresentaram menor índice de divergência
genética nas regiões ITS1 e ITS2, quando comparadas às cepas de C. immitis A análise não
detectou diferenças entre as cepas de origem clínica e as de origem ambiental. Estudos
posteriores envolvendo a análise de marcadores de evolução mais rápida, os microssatélites,
podem fornecer evidências para determinar se os agrupamentos encontrados neste estudo são
resultantes de uma linhagem de reprodução clonal.
Palavras-chave: Coccidioides posadasii, PCR, Filogenia, 18S-28S rDNA.
9
ABSTRACT
Coccidiodomycosis is a systemic infection, predominantly pulmonary, caused by the
geophilic and dimorphic fungi, Coccidioides immitis and Coccidioides posadasii. In Brazil,
coccidioidomycosis is associated with semi-arid areas in the Northeastern region of this
country, which is considered one of the endemic areas of this disease in South America. These
pathogens are morphologically indistinguishable species, but they exhibit molecular
differences. Different molecular techniques have been described for the characterization of
these species. The nuclear ribosomal DNA (rDNA) from Coccidioides spp. has been
described as an important molecular marker for the identification, taxonomy and phylogeny.
Currently, there are still shortages of maps for epidemiological approaches in order to direct
the correlation between populations of Coccidioides spp. and the outbreaks of
coccidiomycosis. Given the above, this study aimed at performing the molecular identification
of 18 clinical and environmental isolates of C. posadasii, from Northeastern Brazil,
maintained in the fungal collection of the Specialized Medical Mycology Center (CEMM),
through PCR, as well as, to analyze the genetic diversity of these isolates by sequencing of
18S-28S regions of nuclear rDNA. The identification of the isolates was performed through
PCR, using specific primers Coi9-1F and Coi9-R. The sequencing of the 18S-28S rDNA
regions was performed through the method of chain termination by dideoxynucleotides, using
the kit DYEnamicTM
ET terminators cycle sequencing (GE Healthcare). The results confirmed
the identification of all strains included in this study as belonging to the species C. posadasii.
The phylogenetic tree based on 18S-28S rDNA region of C. posadasii from CEMM and
Coccidioides spp. from Genbank. reveals the formation of a unique cluster encompassing the
following strains CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-064, CEMM 05-2-066 and CEMM 05-2-
065, in a properly sustained branch, which apparently seems to group these isolates according
to their geographical origin. The strains of C. posadasii showed lower genetic divergence in
the ITS1 and ITS2 regions, when compared to strains of C. immitis. Analyses did not detect
differences between strains of clinical origin and those of environmental origin. Further
studies involving the analysis of fast evolving markers, such as microsatellites, can provide
evidences to determine whether the groups found in this study are derived from a lineage of
clonal reproduction.
Key-words: Coccidioides posadasii, PCR, Phylogeny, 18S-28S rDNA
10
SUMÁRIO
1. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 17
1.1 Aspectos Históricos da Coccidioidomicose ..................................................................... 17
1.2 Agente Etiológico ............................................................................................................. 18
1.3 Epidemiologia ................................................................................................................... 22
1.4 Patogenia .......................................................................................................................... 24
1.5 Aspectos clínicos .............................................................................................................. 27
1.6. Diagnóstico ...................................................................................................................... 28
1.6.1 Diagnostico laboratorial ................................................................................................ 28
1.6.2 Identificação Molecular ................................................................................................. 32
1.7 Tratamento ........................................................................................................................ 34
1.8 Teste de sensibilidade ....................................................................................................... 35
1.9 Taxonomia e filogenia molecular ..................................................................................... 37
2. PERGUNTA DE PARTIDA ............................................................................................ 41
3. HIPÓTESE ........................................................................................................................ 41
4. OBEJTIVOS ........................................................................................................................ 42
4.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 42
4.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 42
5. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 43
5.1 Microrganismos ................................................................................................................ 43
5.2 Biossegurança ................................................................................................................... 43
5.3 Caracterização molecular de cepas clínicas e ambientais de Coccidioides posadasii ..... 45
5.3.1 Extração de DNA genômico .......................................................................................... 45
5.3.2 Identificação molecular de C. posadasii por PCR específica ........................................ 46
5.3.3 Amplificação da região 18S-28S do rDNA ................................................................... 47
5.3.4 Sequenciamento de DNA .............................................................................................. 48
5.3.4.1 Sequências iniciadoras utilizadas e condições da reação de sequenciamento ............ 48
5.3.4.2 Precipitação da placa de sequenciamento e origem das sequências ........................... 48
5.3.5 Montagem das sequências consenso, alinhamento múltiplo e edição das sequências .. 49
5.3.6 Análise filogenética ....................................................................................................... 49
6. RESULTADOS ................................................................................................................. 50
6.1 Recuperação dos isolados clínicos e ambientais de C. posadasii da micoteca do CEMM
............................................................................................................................................. ...50
11
6.2 Identificação molecular dos isolados clínicos e ambientais de C. posadasii por PCR
específica ................................................................................................................................ 51
6.3 Confirmação da identificação molecular por PCR dos isolados clínicos e ambientais de C.
posadasii pela análise das sequências da região 18S-28S do rDNA ...................................... 52
6.4 Alinhamento múltiplo e análise filogenética da região 18S-28S do rDNA Amplificação da
região 18S-28S do rDNA ....................................................................................................... 53
7. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 55
8. CONCLUSÃO ................................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 63
ANEXOS ............................................................................................................................... 74
Anexo I. Protocolo para extração de DNA genômico de Coccidoides posadasii .................. 75
Anexo II. Protocolo para purificação de DNA (produtos de PCR) ........................................ 77
Anexo III. Protocolo para precipitação de DNA em placa de sequenciamento ..................... 78
Anexo IV Alinhamento múltiplo das sequências da região 18S-28S do rDNA nuclear de
isolados clínicos e ambientais de C. posadasii do Nordeste brasileiro e de isolados de C.
posadasii e C. immitis depositadas no Genbank..................................................................... 79
Anexo V. Número de acesso e descrição das amostras utilizadas para comparação e realização
das análises filogenéticas ........................................................................................................ 85
PUBLICAÇÃO ..................................................................................................................... 89
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aspecto morfológico de Coccidioides spp. a. Macromorfologia da fase filamentosa,
em ágar Sabouraud dextrose a 2%; b. Micromorfologia da fase filamentosa, mostrando
artroconídios e células disjuntoras; c. Micromorfologia da fase leveduriforme, evidenciando
uma esférula madura com numerosos endósporos. ............................................................... 20
Figura 2. Distribuição geográfica de cepas de C. immitis e C. posadasii nas Américas,
evidenciando uma árvore filogenética que divide as populações em dois grupos
reprodutivamente isolados, onde praticamente não há sobreposição nas distribuições,
sugerindo que o isolamento genético das duas espécies teve uma origem biogeográfica. A
barra de escala representa 0,1 mudanças. ............................................................................... 21
Figura 3. Mapa de distribuição das zonas endêmicas de Coccidioides spp. As áreas em
vermelho correspondem as zonas endêmicas da coccidioidomicose e a seta indica a região de
ocorrência de C. immitis, restrita a região da Califórnia, nos Estados Unidos. ...................... 23
Figura 4. Ciclo biológico de Coccidioides spp., evidenciando a fase saprofítica (1) no
ambiente e a fase parasitária (3) após a sua inalação por um hospedeiro susceptível ............ 25
Figura 5: Diagnóstico laboratorial de Coccidioides spp. a. Exame direto de escarro em
preparação com KOH 10%, mostrando uma esférula repleta de endósporos. b. Forma
parasitária de Coccidioides sp. caracterizada por esférula repleta de endósporos, em espécime
clínico de biópsia pulmonar, corado através da técnica de Gomori-Grocott.......................... 29
Figura 6. A amplificação de DNA de C. immitis e C. posadasii utilizando os primers Coi9-1F
(5’-TAC GGT GTA ATC CCG ATA CA-3’) e Coi9-1R (5’-GGT CTG AAT GAT CTG ACG
CA-3’). Coluna M: marcador de peso molecular de DNA; Coluna W: controle negativo; cepas
de C. posadasii: 1 a 7, 10, 13, 14 e 16 a 19, (634 bp); cepas de C. immitis: 8, 9, 11 , 12 e 15
(720 bp). ................................................................................................................................. 33
Figura 7. Esquema representativo da organização do cluster de genes do DNA ribossômico
nuclear, evidenciando as regiões ITS e as subunidades 18S, 5,8S e 28S. .............................. 39
13
Figura 8. Crescimento de cepas de C. posadasii na fase filamentosa, após 10 dias de
incubação a 35°C, em ágar batata. A. Aspecto macroscópico, mostrando colônias algodonosas
de cor branca; B. Reverso das colônias, mostrando pigmentação marrom difusível no meio; C.
Aspecto microscópico, evidenciando (a) artroconídios e (b) células disjuntoras. ................. 50
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose 2%, mostrando fragmentos de aproximadamente 634
pb, específico para C. posadasii. (M: marcador de peso molecular de 50 pb; 1-18:
amplificação de amostras de DNA das cepas de C. posadasii analisadas no estudo; BR:
controle negativo) ................................................................................................................... 51
Figura 10. Filograma representativo da topologia da árvore consenso baseada na região IST1,
5,8S e ITS2 do rDNA de Coccidioides spp.. .......................................................................... 54
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Procedência dos isolados clínicos e ambientais de Coccidioides posadasii incluídos
no estudo ................................................................................................................................. 44
Tabela 2. Sequências dos iniciadores Coi9-1F e Coi9-1R que amplificam um fragmento
correspondente a posição 660313 ate 661032 do contig 2.2 de C. immitis, número de acesso
AAEC02000002. .................................................................................................................... 46
Tabela 3. Cepas clínicas e ambientais de C. posadasii identificadas através de diagnóstico
molecular. ............................................................................................................................... 52
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LISTA DE ABREVIATURAS
AMB Anfotericina B
BHI Brain Heart Infusion
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CEMM Centro Especializado Em Micologia Médica
CF Complement Fixation
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CTAB Brometo de Cetiltrimetilamônio
DNA Ácido Desoxirribonucléico
EIA Enzyme Immunoassay
ETB Etambutol
FDA Food and Drug Administration
FLC Fluconazol
HE Hematoxilina-Eosina
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL Interleucina
IMDF Imunodifusão
INF-γ Interferon-gama
INH Isoniazida
iNOS inducible Nitric Oxide Synthase
ITR Itraconazol
ITS Internal Transcribed Spacer
KOH Hidróxido de Potássio
MP Máxima Parcimônia
NB3 Nível de Biossegurança 3
PAS Periodic acid-Schiff
PCR Polymerase Chain Reaction
PSZ Posaconazol
PZA Pirazinamida
rDNA Ácido Desoxirribonucléico ribossômico
RIF Rifampicina
16
RNA Ácido Ribonucléico
rRNA Ácido Ribonucléico ribossômico
SNP Single Nucleotide Polymorphism
Th-1 T-helper1
Th-2 T-helper2
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa
UFC Universidade Federal do Ceará
VRZ Voriconazol
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1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1 Aspectos históricos da Coccidioidomicose
O agente etiológico da coccidioidomicose foi observado pela primeira vez em 1892 na
cidade de Buenos Aires, Argentina, pelo estudante de medicina Alejandro Posadas que
realizou um estudo histopatológico em um paciente que exibia lesões crônicas na pele e
linfonodos (POSADAS, 1892).
O primeiro caso da doença foi descrito na Califórnia, EUA, em 1894, por Rixford,
quando descreveu o agente como um microrganismo semelhante ao descrito por Posadas. Em
1896, Rixford e Gilchrist, relacionaram a morfologia do mesmo aos protozoários da ordem
Coccidia, com os quais o agente fúngico assemelha-se na fase de esférula e denominaram o
novo agente de Coccidioides immitis (do latim: Coccidioidescoccidium; immitisnão leve).
Apenas em 1905, Ophuls e Moffit ao misturarem uma gota de pus de um paciente com
coccidioidomicose em caldo nutritivo descobriram que o microrganismo na verdade tratava-se
de um fungo e descreveram seu ciclo reprodutivo, através da observação de filamentos
fúngicos originários diretamente de endósporos liberados pela esférula (PAIXÃO et al, 2004).
Em 1932, Stewart e Meyer obtiveram o primeiro isolamento do fungo de solo
(STEWART; MEYER, 1932). Alguns anos mais tarde, Dickson e Gifford, em 1938,
denominaram a enfermidade de “coccidioidomicose” e descreveram as formas primárias e
secundárias da doença (ELIAS-COSTA; NEGRONI; GIMENO, 1985). A partir da década de
40, a doença passou a ser também observada em animais, principalmente cães, sendo relatada
tanto em animais domésticos como em silvestres (SMITH et al., 1948).
No Brasil, o primeiro caso nativo foi relatado, em 1978, por Gomes et al., em paciente
proveniente do estado da Bahia. A análise de cortes histológicos de tecidos pulmonares do
paciente demonstrou a presença de formações arredondadas com características morfológicas
do gênero Coccidioides (GOMES et al, 1978). Um ano mais tarde, Vianna et al (1979),
relatou outro caso em um paciente proveniente do Estado do Piauí, com comprovação
radiológica e histológica. Cerca de 15 anos após os primeiros achados, foi relatada a primeira
microepidemia de coccidioidomicose no Brasil, também no Estado do Piauí, oriunda da zona
rural de Oeiras. O caso ocorreu envolvendo caçadores de tatus, incluindo três pessoas, dois
adultos e um menino de dez anos, além de oito cães. Amostras de solo, coletadas no mesmo
local escavado para desentocar os tatus, permitiram o isolamento de C. posadasii. (WANKE,
1994).
18
No Ceará, em 1997, Sidrim et al, relataram quatro casos de coccidioidomicose,
relacionados a uma microepidemia no município de Aiuaba, envolvendo homens caçadores de
tatu (SIDRIM et al, 1997). Dois anos mais tarde, foi descrito no município de Independência,
Ceará, um caso de coccidioidomicose pulmonar em um paciente caçador de tatu, a
identificação do agente etiológico da doença foi realizada através de exame direto, cultura de
escarro e inoculação em camundongo (SILVA et al, 1997).
Desde então, já foram relatados vários novos casos no estado do Ceará. Em 2001,
foram registrados dois casos de coccidioidomicose pulmonar, um procedente de Boa Viagem,
em caçador de tatu, com confirmação por pesquisa direta em escarro e biópsia pulmonar post
mortem (COSTA et al, 2001), o outro do município de Solonópoles, cujo paciente apresentava
também lesões cutâneas. De 2002 a 2005, foram seis novos casos provenientes dos
municípios: Catunda, Santa Quitéria, Solonópoles, Arneiroz e Ibiapina (CORDEIRO et al.,
2010). Em dezembro de 2006, houve três casos de coccidioidomicose, também envolvendo
caçadores de tatu, na cidade de Sobral, os quais foram diagnosticados através de exame direto,
cultura e imunodifusão, com confirmação por PCR (TOGASHI et al. 2009). E mais
recentemente em 2007, foi registrada a ocorrência de mais três novos casos, dois procedentes
de Jaguaribe e um de Parambu (CORDEIRO et al., 2010).
1.2 Agente Etiológico
Desde seu primeiro relato em 1892 até 2001 a coccidioidomicose possuía apenas um
agente etiológico, o Coccidioides immitis. No entanto, os estudos sobre a variação genética
dentro desta espécie, já demonstravam que esta era constituída por dois grupos genéticos
distintos, os quais podiam ser relacionados com a origem geográfica dos isolados, quando
submetidos a tratamento com enzima de restrição, como descrito por Zimmermann et al.,
(1994). Tais resultados posteriormente confirmados, por Koufopanou et al. (1997), através da
análise genealógica de genes nucleares, correlacionou o grupo II proposto por Zimmermann et
al. (1994), com cepas restritas a Califórnia, Estados Unidos, e o grupo I com cepas isoladas
fora desta área. Desta forma, em 2002, Fisher et al., através da análise de divergências de
polimorfismos de DNA, de nove loci de marcadores do tipo microssatélites, propuseram a
divisão de Coccidioides immitis em duas espécies distintas, a nova espécie foi denominada
Coccidioides posadasii, anteriormente conhecida como Coccidioides immitis não-
californiano.
19
Atualmente, o C. immitis e o C. posadasii, agentes causadores da coccidioidomicose são
as únicas espécies incluídas no gênero Coccidioides. Este gênero pertencente à Família
Onygenacea, Ordem Onygenales, está contido na Classe Euascomycetes uma das quais
compõe o Filo Ascomycota (FISHER et al., 2002). Estes patógenos são considerados uns dos
mais virulentos e infectantes do grupo dos fungos, sendo até mesmo sugeridos como uma
potente arma biológica (DERESINSKI, 2003). Desta forma, estão incluídos entre os agentes
biológicos do Anti-terrorist and Effective Death Penalty Act, que regulamenta o transporte de
materiais infecciosos entre países (CHATURVEDI et al, 2000).
Apesar da caracterização molecular distinguir C. immitis de C. posadasii, o aspecto
morfológico das duas espécies e as manifestações clínicas da doença causada por elas, são
essencialmente idênticas (CATANZARO, 2004). Fisher et al., em 2002, também realizaram
experimentos relacionados a fisiologia das duas espécies, nos quais observaram que cepas de
Coccidioides posadasii apresentam ritmo de crescimento mais lento em meio com alta
concentração de salinidade quando comparadas com cepas de Coccidioides immitis. Ademais,
Barker et al., em 2006, observaram que cepas de C. posadasii crescem significativamente
mais rápido, a 37oC, in vitro, quando comparadas com cepas de C. immitis. Estas evidências
sugerem que devem existir outras características fenotípicas que sejam capazes de fornecer
subsídios para distinção entre estas espécies. Contudo, até o presente momento, a
identificação entre as espécies de Coccidioides, praticamente, é possível apenas através de
técnicas moleculares especializadas, como PCR (Polymerase Chain Reaction) e
sequenciamento (SABOULLE, 2007).
As espécies de Coccidioides são fungos dimórficos, que na natureza em cultura
apresentam-se sob a forma filamentosa (Figura 1a), com micélio formado por hifas finas,
hialinas e septadas, que originam artroconídios, estruturas em forma de barril, que medem de
2-4μm por 3-6µm, alternados por células estéreis, denominadas disjuntores (Figura 1b). Na
maturação, os artroconídios são liberados e os restos das células disjuntoras são vistos nas
extremidades dos artroconídios individuais (WALSH et al., 2003). Todavia, quando parasitam
um hospedeiro encontram-se sob a forma leveduriforme, conhecida por esférulas, estas
produzem um grande número de pequenos endósporos em seu interior que medem de 2-4µm
de diâmetro (Figura 1c). As esférulas quando maduras possuem paredes grossas e podem
atingir até 100µm de diâmetro (SABOULLE et al., 2007).
20
Figura 1. Aspecto morfológico de Coccidioides spp. a. Macromorfologia da fase filamentosa,
em ágar Sabouraud dextrose a 2%; b. Micromorfologia da fase filamentosa, mostrando
artroconídios e células disjuntoras; c. Micromorfologia da fase leveduriforme, evidenciando
uma esférula madura com numerosos endósporos. Fonte: Cordeiro, 2006.
Esses patógenos geofílicos se desenvolvem em solos com elevada salinidade e pH
alcalino, sendo habitualmente encontrados a uma profundidade entre 10 e 50 centímetros
abaixo da superfície (LANIADO-LABORÍN, 2007). São associados a regiões semi-áridas,
onde há áreas de elevadas temperaturas, secas recorrentes, e vegetação xerofítica pobre e
esparsa (PAIXÃO et al., 2004). Coccidioides spp. parecem não estar bem adaptados para
competição com outras espécies de fungos ou bactérias, podendo até serem inibidos, e, por
isso, a sobrevivência dos mesmos é substancialmente diminuída quanto em competição com
outros microrganismos no solo (SAUBOLLE; MCKELLAR; SUSSLAND, 2007).
Sua distribuição geográfica é restrita ao Hemisfério Oeste, correspondente região das
Américas, sendo encontrado em uma faixa entre 40o de latitude norte e sul. A espécie C.
immitis é caracterizada como restrita a região da Califórnia, Estados Unidos, enquanto a
espécie C. posadasii apresenta maior distribuição, com ocorrência nos Estados Unidos,
México, America Central e do Sul (Figura 2) (LANIADO-LABORÍN, 2007). Apesar da
caracterização geográfica destas duas espécies serem bem definidas, vários casos de
coccidioidomicose causada por C. immitis em áreas não endêmicas vem sendo descritos
(JEWELL; CHESHIER; CAGE, 2008; CASTAÑÓN-OLIVARES et. al., 2007).
21
Figura 2. Distribuição geográfica de cepas de C. immitis e C. posadasii nas Américas,
evidenciando uma árvore filogenética que divide as populações em dois grupos
reprodutivamente isolados, onde praticamente não há sobreposição nas distribuições,
sugerindo que o isolamento genético das duas espécies teve uma origem biogeográfica. A
barra de escala representa 0,1 mudanças. Fonte: Adaptado de Taylor; Fisher, 2003.
Coccidioides immitis
Coccidioides posadasii
Clado Texas / América do Sul
Brasil
Argentina
Venezuela
Arizona
Texas
México
Califórnia Central
Sudoeste Califórnia
22
O aumento no número de casos fora de zonas endêmicas é, sobretudo, associado aos
freqüentes movimentos transregional e transnacional da população (LAN et al., 2010). Mas,
embora a maioria destes casos seja relacionada a pacientes que visitaram áreas endêmicas,
alguns não apresentam história de exposição ou foram expostos apenas através de contato
com fômites provenientes destas áreas (DESAI et al., 2001). Recentemente, Lan et al. (2010),
descreveram o caso de um paciente que nunca havia visitado áreas endêmicas ou sido
expostos a materiais importados destas áreas. No histórico do paciente consta que o mesmo se
engasgou com água durante um mergulho no mar na Província de Hainan, China, não
resultando em qualquer sintoma no momento (LAN et al., 2010). Uma vez que Coccidoides
spp. são fungos de vida livre aparentemente capazes de sobreviver em água salgada
(REIDARSON et al., 1998; FAUQUIER et al., 1996; CORNELL; OSBORN; ANTRIM,
1979), esse incidente é apontado como possível fonte da infecção (LAN et al., 2010).
Em regiões não-endêmicas, observa-se um intervalo de tempo relativamente longo
desde o início dos sintomas até o diagnóstico, o que pode ser atribuído, em parte, ao baixo
índice de suspeição da infecção entre os médicos destas regiões (DESAI et al., 2010). Desta
forma, vale ressaltar, que com o crescente número de viagens entre a população, o aumento
no número de pacientes imunocomprometidos e o uso indiscriminado de drogas
imunossupressoras, a possibilidade de infecção por Coccidioides spp. deve ser considerada,
mesmo em pacientes de áreas não-endêmicas (LAN et al., 2010).
1.3 Epidemiologia
A maior incidência de casos de coccidioidomicose tem sido observada no sudoeste dos
Estados Unidos, sendo considerada como região de alta endemicidade, pois existem várias
zonas endêmicas no país, tais como, Nevada, Colorado, Arizona, Sudoeste da Califórnia,
Novo México, Oeste do Texas e partes de Utah (DIXON, 2001). Continuamente ao sudeste
dos Estados Unidos há vários focos ligados ao nordeste do México (CASTAÑÓN-
OLIVARES et al., 2004). Também existem várias outras áreas endêmicas nas demais partes
da América, tais como Guatemala, Honduras, Argentina, Paraguai, Bolívia, Colômbia e
Venezuela (Figura 3) (MORAES et al. 1998).
23
Figura 3. Mapa de distribuição das zonas endêmicas de Coccidioides spp. As áreas em
vermelho correspondem às zonas endêmicas da coccidioidomicose e a seta indica a região de
ocorrência de C. immitis, restrita à região da Califórnia, nos Estados Unidos. Fonte: Cordeiro,
2006.
No Brasil, a infecção está associada a locais situados na zona semi-árida da região
Nordeste, considerada uma das áreas endêmicas da doença na América do Sul. O mapa de
distribuição geográfica da coccidioidomicose no país inclui quatro estados: Piauí (100 casos),
Ceará (19 casos), Maranhão (6 casos) e Bahia (2 casos) (DEUS-FILHO, 2009).
No Ceará, a maioria dos casos de coccidioidomicose está relacionada à caçadas de
tatu. O tatu é uma espécie de mamífero bastante apreciado no Nordeste como alimento. Como
se trata de animais de hábitos fossoriais, os caçadores, então, a fim de capturar o animal em
suas tocas, escavam o solo, ficando suscetíveis à inalação da forma infectante do fungo, os
artroconídios, produzidos durante a fase saprofítica (PEREIRA JUNIOR; JORGE;
BAGAGLI, 2003).
24
O Coccidioides spp. já foi isolado de tecidos de tatu (EULÁLIO et al, 2000) e de cães
que participaram de caçadas a este animal (WANKE et al, 1994). Em 2001, Costa et al.,
relataram a associação entre a infecção e a escavação de tocas de tatu (Dasypus
novemcinctus), em paciente que participava de caçadas no município de Boa Viagem, Ceará.
Além disso, estudos mais recentes confirmam a importância das tocas de tatus na ecologia
deste fungo. (CORDEIRO et al., 2006a; TOGASHI et al., 2009). As tocas de outros animais,
também podem estar relacionadas com a epidemiologia da coccidioidomicose. Nos Estados
Unidos, há relatos de casos de coccidioidomicose associado ao contato com buracos de
roedores (DRUTZ; CATANZARO, 1978).
Deste modo, as atividades relacionadas ao revolvimento do solo, de modo geral,
parecem estar diretamente associadas com o desenvolvimento da coccidioidomicose (VERAS
et. al., 2003), tais como: o trabalho agrícola, caçadas de tatu, escavações arqueológicas,
construção civil, dentre outros (PAIXÃO et al, 2004). Em outras regiões, como na Califórnia,
nos Estados Unidos, além dos fatores antropogênicos, fenômenos naturais como terremotos e
fortes ventanias, também estão associados ao aumento do número de casos da doença
(TALAMANTES, 2007).
1.4 Patogenia
A coccidioidomicose é adquirida através da inalação de artroconídios, da fase
filamentosa de Coccidioides spp., os quais se dispersam facilmente no ar. No solo, os
artroconídios são liberados após autólise das células disjuntoras, segmentos estéreis
intermediários e podem seguir por dois caminhos: germinar e perpetuar o ciclo sapróbio ou
serem inalados por um hospedeiro suscetível e iniciar o ciclo parasitário (Figura 4)
(LANIADO-LABORÍN, 2006).
Nos alvéolos pulmonares, os artroconídios sofrem mudanças morfológicas e tornam-se
esférulas, estas sofrem um processo elaborado de crescimento da parede e
compartimentalização do citoplasma para formar uma multiplicidade de minúsculos
endósporos em seu interior. Estas esférulas quando maduras sofrem ruptura, liberando os
endósporos, que por sua vez, sofrem crescimento isotrópico e maturam progressivamente.
Assim, cada um dos endósporos atua como um novo agente infectante, crescendo e se
diferenciando em uma nova esférula, que é novamente capaz de produzir de 200-300
endósporos, reiniciando o ciclo parasitário (Figura 4) (HUNG; XUE; COLE, 2007).
25
Figura 4. Ciclo biológico de Coccidioides spp., evidenciando a fase saprofítica (1) no
ambiente e a fase parasitária (3) após a sua inalação por um hospedeiro susceptível. Fonte:
Adaptado de Hector; Laniado-Laborín, 2005.
A resposta inicial do hospedeiro tem como alvo o artroconídio e se caracteriza por
influxo de leucócitos polimorfonucleares, que respondem a substâncias quimiotáxicas geradas
em resposta a ativação do sistema complemento. Dentro das primeiras 72 horas, os
artroconídios são convertidos para esférulas e a resposta inflamatória muda para uma
infiltração de células mononucleares, que persiste em toda infecção acarretando a formação de
granulomas (DICAUDO, 2006). A liberação subseqüente dos endósporos do interior das
esférulas produz uma resposta transitória dos leucócitos polimorfonucleares, presumivelmente
provocada por substâncias liberadas a partir da ruptura das esférulas (CHILLER et al., 2003).
As esférulas maduras podem se evadir da fagocitose simplesmente porque são grandes demais
para serem ingeridas por neutrófilos, macrófagos e células dendríticas. Embora, os
endósporos recém-lançados de esférulas serem susceptíveis a fagocitose, os estudos in vitro,
das interações patógeno-hospedeiro sugerem que muitos sobrevivem (DRUTZ; HUPPERT,
1983).
26
O desenvolvimento da coccidioidomicose depende diretamente da interação patógeno-
hospedeiro. No hospedeiro, provas clínicas e experimentais têm demonstrado que a
participação das células T é essencial para a defesa do mesmo frente à coccidioidomicose
(HUNG; XUE; COLE, 2007). A resposta imune via T helper 1 (Th1) caracteriza-se pela
produção de interleucina (IL) -2, IL-12, fator necrose tumoral (TNF-α) e interferon gama
(IFN-γ), enquanto, na resposta via T helper 2 (Th2), há a liberação de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10
(HATTON; WEAVER, 2003). Estes dois perfis de citocinas correlacionam-se,
respectivamente, com resistência e susceptibilidade à infecção por Coccidioides spp. (COX;
MAGEE, 1998).
A capacidade de um patógeno estabelecer doença no hospedeiro está relacionada aos
fatores de virulência que são expressos pelo mesmo (CADADEVALL et al., 2006). Um dos
principais fatores de virulência de Coccidioides sp. é a produção da glicoproteína SOWgp,
identificada como um antígeno imunodominante, localizada na parede exterior da esférula,
podendo provocar resposta imune mediada tanto por células quanto por anticorpos. A
exposição do hospedeiro à SOWgp modula a resposta imune, de forma tendenciosa na via
Th2, e consequentemente, a persistência de uma resposta imune à infecção, cujo equilíbrio é
deslocado no sentido desta via, oferece uma vantagem para o patógeno por gerar o
comprometimento da imunidade celular do hospedeiro (HUNG; XUE; COLE, 2007).
Ademais, uma metaloproteinase (Mep1) secretada durante a diferenciação dos endósporos
digere a superfície celular da esférula levando a uma depleção do antígeno imunodominante
(SOWgp), impedindo o reconhecimento de endósporos livres pelo sistema imune do
hospedeiro durante a sua fase de desenvolvimento, quando estas células fúngicas são mais
vulneráveis às células fagocíticas (HUNG et al., 2005).
Outros fatores de virulência relatados incluem a indução da produção de níveis
elevados de arginase I pelo hospedeiro e urease pelo microrganismo que contribuem causando
dano nos tecidos do local de infecção. A arginase I concorre nos macrófagos com iNOS
(inducible Nitric Oxide Synthase) por um substrato em comum, a L-arginina, e, assim, reduz
concentração de óxido nítrico, levando ao aumento da síntese de ornitina e uréia no
hospedeiro. Os derivados de L-ornitina promovem o crescimento e a proliferação do
patógeno, pois gera um pool de monoaminas, que podem ser incorporadas e utilizadas pelas
células parasíticas para a síntese de poliaminas (HUNG; XUE; COLE, 2007). Hung et al., em
2007, também sugerem que alta concentração de uréia nos locais da infecção, na presença de
urease, produzida e liberada pelo patógeno, resulta na secreção de amônia contribuindo para a
alcalinização do microambiente aumentando a sobrevivência de Coccidioides sp. no ambiente
hostil do hospedeiro (HUNG; XUE; COLE, 2007).
27
Portanto, Coccidioides spp. são patógenos de sucesso, uma vez que são capazes de
estabelecer a doença em hospedeiros imunodeprimidos e imunocompetentes, podendo
infectar, além do homem uma grande variedade de animais, incluindo o cão, porco, carneiro,
gado, além de animais silvestres como coiotes, roedores, tatus, mamíferos marinhos, e, pelo
menos, algumas espécies de répteis, a exemplo das cobras (EULÁLIO et al, 2000; COSTA et
al, 2001). Assim, os mamíferos partilham uma visão comum de susceptibilidade à infecção
por Coccidioides spp., embora o desenvolvimento da doença seja variável (SHUBITZ et al.
2007).
1.5 Aspectos Clínicos
As manifestações clínicas de coccidioidomicose têm um espectro bastante amplo. A
infecção pode permanecer como uma infecção respiratória aguda e autolimitada, na maioria
dos hospedeiros expostos, mas também pode progredir em uma doença crônica e se
disseminar para outros órgãos e sistemas. (COX; MAGEE, 2004). Deste modo, a
coccidioidomicose manifesta-se sob três formas clínicas principais: forma pulmonar primária;
forma pulmonar progressiva e forma disseminada (DEUS-FILHO, 2009).
A infecção pulmonar primária é assintomática em 60% dos casos, onde os indivíduos
infectados não apresentam sintomas ou o fazem sob forma indistinguível de uma infecção de
trato respiratório superior (AVILES-SALAS; QUINTERO-CUADRA; CORNEJO-JUÁREZ,
2007). Os demais 40%, apresentam manifestações de doença respiratória aguda, cujo a
intensidade dos sintomas depende diretamente da carga infectante, variando desde um estado
gripal até um quadro de uma grave infecção respiratória inespecífica. De modo geral, os
sintomas são caracterizados por febre, tosse, dispnéia, dor torácica e quadros inespecíficos de
gripe. Essa forma da coccidioidomicose geralmente regride espontaneamente para a cura em
30-60 dias, mesmo sem tratamento antifúngico (DEUS-FILHO et al., 2009).
Em alguns casos, principalmente em pacientes diabéticos ou imunocomprometidos, a
forma pulmonar aguda não regride, evoluindo para uma pneumonia crônica. Assim, a forma
pulmonar progressiva é geralmente crônica e evolui a partir de infecções cujos sintomas não
regrediram após dois meses. Estas formas podem apresentar-se como lesões nodulares ou
cavitárias; doença pulmonar fibrocavitária; disseminação miliar pulmonar, com manifestações
clínicas e radiológicas inespecíficas (DEUS-FILHO, 2009).
A forma disseminada pode rapidamente atingir vários órgãos ou sistemas, evoluindo
de forma fatal quando não diagnosticada e tratada a tempo. No entanto, apenas
aproximadamente 1-5% dos pacientes com a forma pulmonar primária evoluem com
28
disseminação, sendo as lesões cutâneas a localização extrapulmonar mais comum. Lesões de
disseminação também são usualmente observadas em ossos, articulações, sistema nervoso
central, e no aparelho gênito-urinário (COX, MAGEE, 2004).
1.6 Diagnóstico
1.6.1 Diagnóstico Laboratorial
O isolamento em cultura de Coccidioides spp. continua a ser padrão-ouro para um
diagnóstico definitivo de coccidioidomicose. Todos os processamentos dos espécimes
suspeitos de conter Coccidioides sp. devem ser executados somente dentro de cabine de
segurança biológica e as amostras cultivadas em tubos, ao invés de placas (SUTTON, 2007).
Usualmente, concomitante ao cultivo in vitro, aplica-se o exame direto, o qual é realizado
através da observação ao microscópio óptico diretamente de espécimes clínicos, tais como,
escarro fresco, fluidos do lavado brônquico, aspirado de medula óssea, aspirados, biópsias de
lesões ósseas e de articulações, urina, linfonodos e outros espécimes semelhantes
(GALGIANI et al., 2000; LACAZ et al., 2002). A microscopia direta muitas vezes fornece
um diagnóstico rápido quando esférulas intactas ou parcialmente intactas são observadas
(Figura 5a), além disso, este procedimento tem um risco muito menor para os laboratoristas
que o isolamento em cultura (SUTTON, 2007).
29
Figura 5: Diagnóstico laboratorial de Coccidioides spp. a. Exame direto de escarro em
preparação com KOH 10%, mostrando uma esférula repleta de endósporos. b. Forma
parasitária de Coccidioides sp. caracterizada por esférula repleta de endósporos, em espécime
clínico de biópsia pulmonar, corado através da técnica de Gomori-Grocott. Fonte: Deus Filho,
2009.
Um diagnóstico preliminar através do exame direto é mais problemático quando são
vistas apenas esférulas muito pequenas (10-20µm), sem endósporos ou com poucos
endósporos em seu interior (SUTTON, 2007). Estes achados podem muitas vezes ser
confundidos com células fagocíticas, artefatos, outros patógenos fúngicos, particularmente
com os fungos dimórficos Blastomyces dermatitidis e Histoplasma capsulatum, bem como,
com leveduras do gênero Candida e Cryptococcus (SABOULLE, 2007). Vale ressaltar, que
os laboratoristas, por sua vez, devem levar sempre em consideração dados epidemiológicos
para o correto diagnóstico de tais infecções.
As espécies de Coccidioides não são particularmente exigentes e uma variedade de
meios de isolamento primário pode ser utilizada para obtenção da cultura. Os meios
micológicos comumente utilizados incluem ágar BHI (Brain Heart Infusion), ágar batata
dextrose e ágar sabouraud dextrose com ou sem cicloeximida (SABOULLE, 2007). Em
espécimes clínicos oriundos de sítios não-estéreis faz-se necessário a prevenção do
crescimento excessivo de bactérias e de fungos sapróbios de crescimento mais rápido. Alguns
antibióticos comumente adicionados aos meios de cultura para suprimir o crescimento
bacteriano incluem cloranfenicol, gentamicina, estreptomicina e penicilina. A adição de
cicloeximida inibe alguns fungos sapróbios, sendo útil como um meio seletivo, uma vez que
suporta bem o crescimento de todos os fungos dimórficos (WALSH et al., 2003).
As culturas de Coccidioides spp. são geralmente incubadas a 30oC, no entanto, a
temperatura ambiente também é adequada. Os tubos inoculados devem ser examinados
aa
b
a
30
diariamente durante os primeiros 10 dias e, semanalmente por três semanas. Raramente é
necessário manter as culturas durante mais de três semanas, salvo o caso de pacientes que se
encontravam sob tratamento com antifúngicos no momento da coleta da amostra (SUTTON,
2007).
As colônias se desenvolvem rapidamente, geralmente dentro de 3-5 dias, e são
inicialmente brancas a creme brilhante, com textura glabrosa aderindo ao meio. À medida que
amadurecem, discretos anéis concêntricos se desenvolvem e áreas filamentosas, contendo
artroconídios, tornam-se visíveis. Embora as espécies de Coccidioides sejam geralmente de
cor branca a esbranquiçada, várias outras cores têm sido observadas, variando do castanho ao
amarelo, rosa ao lilás, marrom pálido ao cinza-escuro. Para a observação da micromorfologia,
habitualmente utiliza-se o corante lactofenol azul algodão, com lamínulas devidamente
seladas (WALSH et al., 2003). Os artroconídios de Coccidoides spp. devem ser diferenciados
de alguns gêneros com artroconídios similares como Malbranchea sp., Chrysosporium sp.,
Geomyces sp. e Sporotrichum pruinosum (SUTTON, 2007).
O diagnóstico da coccidioidomicose também pode ser obtido através da identificação
fúngica em exames histopatológicos, sendo este estabelecido pela identificação do fungo em
sua fase leveduriforme. A histopatologia pode ser realizada a partir de tecidos ou líquidos de
biópsias de lesão tegumentar, pulmonar, osteoarticular, cerebral ou de outros materiais
suspeitos e em necropsia. As preparações histológicas podem ser coradas com prata
metenamina de Gomori-Grocott, como mostrado na Figura 5b, mas apesar da sensibilidade,
esta coloração pode impedir a visualização dos endósporos no interior das esférulas. Outras
colorações também têm sido utilizadas, tais como ácido periódico Schiff (PAS), hematoxilina-
eosina (HE), e ocasionalmente, o Giemsa e a coloração de Gram. Ademais, a coloração
citopatológica de Papanicolau também pode ser particularmente útil na detecção de esférulas
(SAUBOLLE; MCKELLAR; SUSSLAND, 2007).
É importante relatar que a fase filamentosa do agente etiológico da coccidioidomicose
também já foi observada em amostras clínicas de lesões granulomatosas e cavitárias crônicas
e em fluido cerebroespinhal (DOLAN et al., 1992; WAGES; HELFEND; FINKLE, 1995).
Embora artroconídios característicos não estejam normalmente associados a estes achados,
estes podem ser observados em alguns casos, contudo, a presença de hifas sem a presença
simultânea de esférulas não tem valor diagnóstico (SABOULLE, 2007).
Os testes com antígenos específicos são base de estudos epidemiológicos da
coccidioidomicose. A magnitude da resposta de anticorpos é diretamente relacionada com a
integridade do sistema imunológico do paciente e à apresentação clínica específica da
infecção. Os anticorpos não são protetores contra Coccidioides spp. mas refletem o nível de
31
atividade do organismo nos hospedeiros infectados, sendo utilizados como ferramenta auxiliar
ao diagnóstico, e sobretudo, para o prognóstico da doença (SAUBOLLE; MCKELLAR;
SUSSLAND, 2007). Deste modo, os valores obtidos nos testes sorológicos servem como
predição da resposta ao tratamento, pois quando há resposta satisfatória à terapia, os títulos de
anticorpo diminuem rapidamente, já quando os títulos dos anticorpos estão aumentando, a
terapia deve ser intensificada ou modificada (PAPPAGIANIS, 2001).
A resposta sorológica inclui a produção de anticorpos IgM e IgG. Os anticorpos IgM
tornam-se mensuráveis logo no início da fase aguda, entre a primeira e a terceira semana de
infecção. A classe de anticorpos IgG reage no final do processo infeccioso, tornando-se
mensurável em algum momento entre a segunda e a 28° semana após o início da infecção.
Esta classe pode permanecer por vários meses e geralmente está relacionada ao nível de
atividade da infecção (SABOULLE, 2007).
Algumas técnicas estão disponíveis para a medida da resposta sorológica a
coccidioidomicose na rotina laboratorial, estas incluem ensaios imunoenzimaticos (EIAs),
imunodifusão (IMDF) e fixação do complemento (CF). A técnica de fixação do complemento
detecta anticorpos tardios do tipo IgG nas formas progressivas e disseminadas, onde os títulos
desta classe de anticorpos geralmente correlacionam-se diretamente com a gravidade do caso.
A imunodifusão pode ser aplicada na detecção de anticorpos IgM e IgG, mas eles exigem
longos períodos de incubação (4 dias) para diminuir a ocorrência de falsos negativos. A IMDF
não é considerada medida quantitativa de anticorpos, mas pode ser modificada para
quantificação dos títulos, mostrando-se especialmente útil na obtenção dos títulos em soros
com atividade anticomplementar no teste de CF (SABOULLE, 2007).
Os ensaios imunoenzimáticos também estão disponíveis para a detecção de IgM e IgG,
e são aparentemente mais sensíveis do que os outros métodos, todavia, podem apresentar
menor especificidade, especialmente se apenas o teste de IgM específica for reativa. Uma
análise restrospectiva de EIA, IMDF e FC com soro de pacientes, com cultura positiva,
durante a fase aguda da doença, mostrou que a sensibilidade global dos testes imunológicos é
de apenas 82%. Portanto, a sorologia negativa não descarta a coccidioidomicose,
especialmente na fase inicial da infecção (SAUBOLLE; MCKELLAR; SUSSLAND, 2007).
Vale ressaltar, que há necessidade de testes baseados na detecção direta do organismo,
uma vez que, os títulos em pacientes imunodeprimidos podem não ser confiáveis, pois estes
são incapazes de montar uma resposta imunológica da mesma forma que os pacientes
imunocompetentes. Assim, um estudo recente mostrou resultados promissores na detecção de
antígenos específicos de Coccidoides spp. em urina por meio de EIA. Foram utilizados
anticorpos de coelho frente à galactomananas isoladas de C. posadasii e C. immitis para
32
avaliar 24 pacientes com diagnóstico prévio de coccidioidomicose, com manifestações graves
da doença, resultando na positividade de 71% dos casos avaliados. Contudo, a sensibilidade
deste ensaio em pacientes imunocompetentes e com formas mais brandas de
coccidioidomicose não é atualmente conhecida (DURKIN et al., 2008).
1.6.2 Identificação Molecular
Como exposto anteriormente, a identificação de Coccidioides spp. carrega consigo um
alto risco de contaminação acidental, sendo limitados a laboratórios especializados de
biossegurança nível 3. Por isso, um método rápido para a detecção de Coccidioides spp.
diretamente do material clínico é de grande relevância no diagnóstico e tratamento adequado
dos pacientes, além de diminuir os riscos de exposição acidental dos profissionais de
laboratório. Assim, o diagnóstico molecular, sem a necessidade do isolamento em cultura tem
sido há muito tempo esperado e muitos pesquisadores têm explorado as técnicas de detecção
de ácido nucléico para o futuro estabelecimento do diagnóstico molecular da
coccidioidomicose (BINNICKER et al., 2007).
Em 1993, Stockman et al., demonstraram uma sonda de DNA com alvo no RNA
ribossomal de Coccidioides spp. altamente sensíveis e 100% específica. Um total de 164
cepas de espécies fúngicas, relacionadas e não-relacionadas, foram testadas para definir a
especificidade, onde reações cruzadas não foram detectadas. Sandhu et al., em 1995, também
utilizaram sondas específicas de Coccidioides spp., as quais tinham por alvo a subunidade
maior do DNA ribossomal (rDNA). Porém, uma recente pesquisa no GenBank identificou a
especificidade da sonda, mas revelou também complementaridade com rDNA 28S de
Chrysosporium keratinophilum (BIALEK et al., 2005).
Atualmente, grande parte das técnicas de detecção molecular de Coccidioides spp.
baseiam-se em reações de PCR com primers específicos. O rDNA é comumente alvo destes
primers, uma vez que, centenas de cópias desta região estão presentes no genoma, o que
garante uma elevada sensibilidade (GREENE et al., 2000; LINDLEY et al., 2001). Outras
regiões também têm sido exploradas com sucesso, a exemplo da seqüência de nucleotídeos do
locus do antigen2/proline rich, antígeno específico de Coccidioides spp., utilizada em
técnicas como nested PCR e PCR em tempo real (BIALEK et al., 2004).
Umeyama et al, em 2006, demonstraram um par de primers capazes de identificar
cepas de Coccidioides, e adicionalmente, distinguir entre C. immitis e C. posadasii pela
simples comparação dos tamanhos de fragmentos amplificados em gel de agarose (Figura 6).
33
Neste estudo, foi utilizado um total de 137 isolados, de 52 espécies diferentes de fungos, e o
resultado do PCR provou não haver amplificação cruzada com os principais fungos
patogênicos relacionados, tais como Arthrographis kalrae, Chrysosporium spp., Geotrichum
candidum, Malbranchea spp., ParaCoccidioides brasiliensis, e Trichosporon asahii. Além
disso, não foi detectada amplificação cruzada com DNA humano, podendo representar
futuramente um método aplicável e útil para uso em diagnóstico clínico.
Figura 6. Amplificação de DNA de C. immitis e C. posadasii utilizando os primers Coi9-1F
(5’–TAC GGT GTA ATC CCG ATA CA-3’) e Coi9-1R (5’ –GGT CTG AAT GAT CTG
ACG CA-3’). Coluna M: marcador de peso molecular de DNA; Coluna W: controle negativo;
cepas de C. posadasii: 1 a 7, 10, 13, 14 e 16 a 19, (634 bp); cepas de C. immitis: 8, 9, 11 , 12 e
15 (720 bp). Fonte: Umeyama et al., 2006.
Ademais, outros loci como hexoquinase, glicose-sintase e 2 genes da prolina, foram
utilizados na identificação molecular de cepas clínicas de Coccidioides spp., através da
técnica de PCR em tempo real. Neste estudo, também foram obtidos resultados consistentes
na diferenciação entre as espécies C. immitis e C. posadasii, utilizando sondas para detectar
polimorfismos de base única (SNP’s) dentro destes loci (CASTAÑON-OLIVARES et al.,
2007).
Os métodos citados até agora têm sido aplicados com sucesso, mas foram
concentrados apenas na identificação de amostras isoladas em cultura. Alternativas para
diagnóstico diretamente de espécimes clínicos foram igualmente exploradas. Em 2001,
Hayden et al., utilizaram a hibridização in situ, com sondas de oligonucleotídeos para
identificar esférulas em seções de tecido incluídos em parafina. A sonda específica de C.
immitis teve uma sensibilidade de 94,3%, uma especificidade de 100% e um valor preditivo
positivo de 100%.
34
Em 2004, Johnson et al., utilizando os primers descritos anteriormente por Greene et
al. em 2000, afirmaram a detecção de Coccidioides spp. em amostras de soro humano e
murino. Porém, posteriormente uma busca no BLAST pelo primers revelou que apesar de não
haver nenhuma homologia com outros grupos fúngicos há homologias significativas a vários
genes humanos e murinos. Desta forma, o produto encontrado nas amostras de soro pode ser
resultado de amplificações cruzadas e, portanto, não é recomendado para fins diagnóstico
(BIALEK, 2005). Bialek et al., em 2004, também demonstraram que a técnica de nested PCR
proposta pelos mesmos foi capaz de amplificar DNA especifico de Coccidoides spp. em três
amostras de tecido embebidas em parafina, sabidamente positivas em microscopia. Esta
mesma técnica também teve êxito quando utilizada, em 2007, no diagnóstico de
coccidioidomicose, diretamente de uma amostra de escarro (CORDEIRO et al., 2007).
Mais recentemente, Binnicker et al. em 2007 desenvolveram primers e sondas, tendo
como alvo a região ITS2 de Coccidioides spp. para serem utilizados pela técnica de PCR em
tempo real, a partir do isolamento em cultura ou diretamente de espécimes clínicos. A análise
a partir da cultura de 40 cepas clínicas de Coccidioides spp. demonstrou 100% de
sensibilidade ao ensaio. A análise de 266 espécimes respiratórios demonstrou sensibilidade de
100% e 98,4% de especificidade para o Coccidioides spp quando comparado com a cultura.
Na análise de 66 amostras de tecido fresco obteve-se 92,9% de sensibilidade e especificidade
de 98,1%, e, por fim, a sensibilidade do teste em 148 amostras de tecido em parafina resultou
em 73,4%. Um painel de reatividade cruzada com fungos, bactérias, micobactérias e vírus
foram testados e demonstrou 100% de especificidade.
Na prática laboratorial será preciso interpretar se um resultado de PCR positivo indica
a presença viável do microrganismo relacionado à doença, ou simplesmente a detecção dos
colonizadores transitórios, ou ácido nucléico que persiste de uma infecção antiga
(BINNICKER et al., 2007). Vale ressaltar, que atualmente, a identificação molecular da
coccidioidomicose ainda funciona apenas como ferramenta complementar ao diagnóstico
laboratorial.
1.7 Tratamento
Para iniciar o tratamento da coccidioidomicose faz-se necessário o reconhecimento da
extensão da infecção e a identificação de fatores que predispõem o hospedeiro à gravidade da
doença. Visto que, pacientes com infecções pulmonares localizadas e sem fatores de risco
para complicações, muitas vezes necessitam apenas reavaliação periódica para demonstrar a
resolução espontânea de seu processo infeccioso. Por outro lado, os pacientes com ampla
35
disseminação da infecção ou que estão em alto risco de complicações devido à
imunossupressão ou a outros fatores preexistentes, requerem uma variedade de estratégias de
tratamento que podem incluir a terapia com drogas antifúngicas, intervenção cirúrgica ou a
combinação de ambas. Os tratamentos existentes para os quadros de coccidioidomicose
crônica e/ou disseminada podem ser prolongados e difíceis de tolerar, a terapia geralmente
varia de vários meses a anos de duração e, em alguns pacientes, a terapia é necessária ao
longo de sua vida supressiva, para prevenir recaídas (GALGIANI et al., 2005).
No controle das diversas infecções pulmonares causadas por fungos há um número
reduzido de drogas utilizáveis na prática clínica (MARTINEZ, 2006). Para o tratamento da
coccidioidomicose, os antifúngicos da classe dos azólicos cetoconazol, fluconazol e
itraconazol têm substituído a anfotericina B na terapêutica da maioria das infecções
pulmonares crônicas ou disseminadas, sendo utilizados especialmente em pacientes com
manifestações leves ou moderadas. Estes agentes antifúngicos também são comumente
utilizados na terapia complementar após o tratamento inicial com anfotericina B, em pacientes
com formas mais severas da doença (GALGIANI et al., 2005). Assim, devido a sua elevada
toxicidade, a anfotericina B é agora geralmente reservada para casos graves desta doença
(JOHNSON; EINSTEIN, 2007), como em pacientes com insuficiência respiratória, aqueles
com infecções de progressão rápida ou mulheres durante a gestação (GALGIANI et al.,
2005).
Atualmente, novos antifúngicos estão disponíveis e possivelmente podem ser
benéficos para o tratamento de infecções por Coccidioides sp., refratárias. Embora os
triazólicos voriconazol e posaconazol ainda não sejam aprovados pelo Food and Drug
Administration (FDA), Estados Unidos, para o tratamento da coccidioidomicose, há relatos de
casos que sugerem que o voriconazol pode ser eficaz no tratamento de alguns casos da
doença, apesar de não haver dados em infecções experimentais (CARAWAY et al., 2003;
PROIA; TENORIO, 2004). Já o posaconazol mostrou-se eficaz em um ensaio clínico pequeno
(CATANZARO et al., 2007) e em pacientes com infecções refratárias (STEVENS et al.,
2007). A equinocandina caspofungina também tem se mostrado promissora, sendo eficaz no
tratamento da coccidioidomicose experimental em modelos murinos (GONZALEZ et al.,
2001).
1.8 Testes de Sensibilidade
A necessidade de melhores drogas antifúngicas tornou-se imprescindível devido ao
aumento na incidência de infecções fúngicas graves, atribuídas tanto ao uso indiscriminado de
36
drogas citotóxicas e imunosupressoras, bem como, ao também aumento no número de
pacientes imunocomprometidos (REX et al., 1993). Atualmente, uma série de outros agentes
antifúngicos está agora disponível no campo clínico. Estes incluem novos azólicos
(voriconazol, posaconazol) e grupo de drogas inibidoras da síntese de glucanos (caspofungina,
FK463, e anidulafungina) (KAUFFMAN, 2006).
Com o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, houve um aumento nas opções
terapêuticas para o tratamento dos diferentes tipos de infecções fúngicas. Conseqüentemente,
aumentou também o interesse em métodos laboratoriais para orientar a seleção de terapia
antifúngica. A sensibilidade, in vitro, de um microrganismo frente a determinado agente
terapêutico é um dos fatores que prediz a probabilidade de que a terapia para aquela infecção
seja bem sucedida, desta forma, o teste sensibilidade é utilizado para analisar a capacidade de
um agente terapêutico frente a um determinado microrganismo in vitro, permitindo assim um
direcionamento no tratamento contra o patógeno. Diferentemente dos testes de sensibilidade
antibacteriana, os testes de sensibilidade antifúngica não preveêm a resposta terapêutica com
consideravel precisão (REX; PFALLER, 2002). Contudo, estes testes são capazes de fornecer
uma estimativa confiável da atividade relativa de dois ou mais agentes antifúngicos frente ao
microrganismo testado, além de possibilitar o monitoramento do desenvolvimento de
resistência entre uma espécie fúngica normalmente sensível e predizer o potencial terapêutico
de novos agentes récem desenvolvidos e em avaliação (MURRAY, 2010).
O Laboratory Standards Institute (CLSI) disponibiliza normas de referência para
determinação da sensibilidade a terapia antifúngica de fungos patogênicos. As normas tratam
da metodologia para seleção e preparação dos agentes antifúngicos; da interpretação e
implementação dos testes; bem como, da realização de testes de controle de qualidade, tendo
por objetivo, facilitar o acordo entre os laboratórios na determinação da sensibilidade fúngica
aos agentes antifúngicos (NCCLS, 2002). Os métodos padronizados são reproduzíveis,
sensíveis e disponíveis para utilização em laboratórios clínicos (MURRAY, 2010).
A existência de métodos padronizados facilita uma análise significativa dos estudos
publicados, evidenciando a relevância clínica de testes de sensibilidade antifúngica para
determinar uma correlação entre as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM’s), in vitro, e a
resposta clínica à terapêutica (NCCLS, 2002). Embora os testes de sensibilidade antifúngica,
in vitro, para Coccidioides spp. permaneçam não padronizados pelos laboratórios
especializados, o documento M38-A preconizado pelo CLSI tem sido bastante utilizado para
testar a forma filamentosa deste agente fúngico (GONZALEZ et al., 2002; CORDEIRO et al,
2006b; CORDEIRO et al., 2006c; CORDEIRO et al., 2009). O teste aplicado inclui
modificações no ensaio de macrodiluição em caldo, com padronização do inóculo através de
37
espectrofotometria a 95% de transmitância no comprimento de onda de 530 nm, com
incubação realizada a 35oC e resultados obtidos a partir de leituras visuais (SUTTON, 2007).
Por não existir breakpoints definidos, a sensibilidade pode ser vista como
Concentração Inibitória Mínima (CIM) ou Concentração Letal Mínima. In vitro, CIM’s acima
dos níveis de segurança, relativos à toxicidade, ou além dos níveis atingíveis no paciente
sugeriria resistência potencial (SUTTON, 2007). Embora falhas terapêuticas com fluconazol
tenham sido relatadas e, em alguns casos, parcialmente atribuídas a microrganismos
resistentes, deve-se ressaltar que pode haver uma falta de correlação entre atividade in vitro e
a eficácia clínica da coccidioidomicose (SUTTON et al., 2007).
De modo geral, as espécies de Coccidioides, in vitro, são habitualmente sensíveis a
anfotericina B (AMB), fluconazol (FLC), itraconazol (ITR), voriconazol (VRZ), posaconazol
(PSZ) (GONZALEZ et al., 2002), bem como, a equinocandinas (GONZALEZ et al., 2001).
Mas, embora estes agentes ofereçam terapias antifúngicas eficazes contra a
coccidioidomicose, infecções refratárias e recaídas, em pacientes com doença disseminada,
têm sido descritas (STEVENS et al., 2007). Ademais, a anfotericina B, considerada droga de
escolha para o tratamento dos casos mais graves de coccidioidomicose, é potencialmente
nefrotóxica (ROYCE; HANS, 2007) e apenas 50-60% dos pacientes mostram-se responsivos
ao tratamento com os azólicos fluconazol e itraconazol (GALGIANI et al., 2005)
Este cenário tem levado a investigação de novos agentes antifúngicos contra
Coccidioides spp., renovando também o interesse em combinações terapêuticas sinérgicas.
Em 2006, Cordeiro et al, demonstraram que os tuberculostáticos, isoniazida (INH), etambutol
(ETB) e rifampicina (RIF) isolados ou em combinação, tem efeito inibitório in vitro frente a
cepas de C. posadasii, provavelmente por agir na mitocôndria fúngica (CORDEIRO et al.,
2006b). Posteriormente, foi evidenciado que as seguintes combinações de drogas antifúngicas
com tuberculostátiscos, AMB + INH, KET +ETB, FLC + ETB ou pirazinamida (PZA) e VRZ
+ ETB ou PZA, apresentam efeito inibitório sinérgico frente a C. posadasii (CORDEIRO et
al., 2009).
1.9 Taxonomia e filogenia molecular
Atualmente, os métodos moleculares têm sido amplamente utilizados para estudar a
biodiversidade dos fungos. A obtenção de dados através destas técnicas revelam resultados
mais precisos relativos à taxonomia e filogenia (SHARPTON et al., 2009), uma vez que, os
métodos clássicos de identificação têm uma resolução limitada, especialmente, devido a
pouca variação morfológica entre muitos dos grupos fúngicos (DE HOOG et al., 1998).
38
A análise molecular ajuda a esclarecer as relações entre os grupos, levando ao
estabelecimento de novas relações taxonômicas, pois, torna possível detectar que alguns taxa,
na verdade, englobam uma gama de subgrupos menores, que por sua vez, são apenas
remotamente relacionados, revelando informações importantes sobre a história evolutiva do
patógeno. Assim, além da taxonomia, a filogenia é outra área de importância beneficiada
pelos métodos moleculares. Uma árvore filogenética pode ser vista como um modelo proposto
do curso da evolução. Como o processo de evolução é impulsionado em grande parte pelas
preferências ecológicas, isto pode refletir nos fatores que conferem patogenicidade ao
patógeno, e consequentemente, no padrão de adaptação ao hospedeiro. Desta forma, se
patogenicidade é um processo de várias etapas, a sua emergência provavelmente será refletida
na árvore filogenética, sob a forma de um ramo monofilético (DE HOOG et al., 1998)
Uma arvore filogenética pode expor traços moleculares fundamentais, permitindo a
identificação de linhagens geneticamente idênticas, ou semelhantes, derivadas de uma
população infecciosa comum. A caracterização de linhagens oferece uma melhor
oportunidade para dissecar a epidemiologia dos microrganismos, por meio da descrição da
organização hierárquica da estrutura das populações, informando se estas são formadas de
uma única população ou de um grande número de subpopulações geneticamente isoladas
(MCEWEN et al., 2000; BARKER et al., 2007).
Na construção de árvores filogenéticas, devido à grande quantidade de informações
nas amostras analisadas, utilizam-se os algoritmos, técnicas usadas para exercer uma dada
função ou uma atividade (TAKEZAKI; GOJOBORI, 1999). Dois diferentes tipos de
algoritmos podem ser utilizados para gerar uma árvore filogenética, os algoritmos heurísticos
e os algoritmos exatos (MIYAKI; RUSSO; PEREIRA, 2001). De modo geral, com o uso de
algoritmos heurísticos todos os táxons analisados são unidos em um único nó interno e
posteriormente, será avaliado cada par de decomposições do nó inicial. Uma variação deste
tipo de algoritmo consiste na construção de um grande número de táxons ao mesmo tempo e
depois rearranjá-los de forma a trocar as posições entre táxons vizinhos a fim de melhor
representar as filogenias possíveis. No caso dos algoritmos exatos busca-se enumerar todas as
possíveis árvores existentes para os grupos taxonômicos analisados, e posteriormente, avalia-
se qual a árvore melhor representa a situação em análise (MIYAKI; RUSSO; PEREIRA,
2001).
Um dos critérios adotados, com bastante aceitação, é o da máxima parcimônia que
consiste em inferir que a melhor árvore filogenética para um determinado grupo de táxons é
aquela que requer o menor número de transformações evolutivas, correspondendo na natureza
ao caminho de menor esforço (KITCHING et al.,1998). Outro critério também utilizado é a
39
máxima verossimilhança, que prevê um modelo probabilístico de evolução considerando
pesos aos diversos tipos de mutação e suas freqüências, identificando a árvore mais provável
que reflete os dados analisados (NEI; KUMAR, 2000; WEIR, 1996).
Vários alvos dentro do genoma de fungos têm sido avaliados, com grande parte dos
estudos moleculares atuais utilizando seqüências dentro do complexo de genes do DNA
ribossômico (rDNA) nuclear, esta seção do genoma inclui os genes 18S, 5.8S e 28S, que
codificam para RNA ribossomal (rRNA) e que têm uma seqüência de nucleotídeos
relativamente conservada entre fungos. O rDNA também inclui as áreas com sequência
variável, como a região ITS (Internal Transcribed Spacer), com variações na seqüência que
apesar de não ser traduzida em proteínas, têm um papel fundamental no desenvolvimento de
rRNA funcional (Figura 7). A amplitude das aplicações das regiões ITS mostra que estas têm
grande potencial como alvos em testes moleculares baseados na identificação de fungos,
pesquisa filogenética e tipagem molecular para estudos epidemiológicos (IWEN; HINRICHS;
RUPP, 2002).
Figura 7. Esquema representativo da organização do cluster de genes do DNA ribossômico
nuclear, evidenciando as regiões ITS e as subunidades 18S, 5,8S e 28S.
Em geral, as seqüências das regiões ITS do rDNA tornaram-se disponíveis para quase
todos os fungos recém-descritos, onde os conceitos de espécies são apoiadas por dados
moleculares. Desta forma, o rDNA é cada vez mais visto como padrão-ouro para a taxonomia
de fungos filamentosos, sendo a homologia das sequências dentro das regiões 18S, 5,8S e 28S
e as diferenças dentro das regiões ITS1 e ITS2, a base genética para a organização dos fungos
dentro de cada táxon (TINTELNOT et al., 2007).
O rDNA de C. immitis e C. posadasii tem sido apontado como importante marcador
molecular utilizado na identificação, taxonomia e filogenia destas espécies (TINTELNOT et
al., 2007). A análise da seqüência do gene 18S do rRNA das espécies de Coccidioides revela
similaridade com outros fungos dimórficos, como Histoplasma capsulatum e Blastomyces
dermatitidis, membros da ordem Onygenales (ABUODEH; GALGIANI; SCALARONE,
2002). O grupo de fungos dimórficos (Onygenales) abrange poucos gêneros, que são
compostos por um pequeno numero de espécies, sendo considerado por muitos micologistas
como o grupo que possui o maior índice de adaptação ao homem, o que pode indicar uma
longa história de especialização e adaptação ao hospedeiro (DE HOOG et al., 1998).
40
Apesar da ordem Onygenales ser caracterizada por muitas espécies de fungos que
costumam associarem-se com animais, estudos baseados no rDNA mostram que as espécies
de Coccidioides divergiram evolutivamente de fungos conhecidos como não causadores de
doença, como espécies de Uncinocarpus, Gymnoascus e Crysosporium (UNTEREINER et al.
2004). Esta observação sugere que o gênero Coccidioides adquiriu o fenótipo patogênico
recentemente. Sharpton et al. (2009), baseados em um estudo comparativo entre os genomas
de 18 taxa da ordem Onygenales, dentre eles Uncinocarpus reesii e Histoplasma capsulatum,
sugeriram que o fenótipo patogênico de Coccidioides é o resultado de mudanças adaptativas
de genes já existentes e da aquisição de pequenas quantidades de novos genes, a partir de uma
mudança na nutrição, de plantas para animais. Estes autores também propõem que C. immitis
e C. posadasii não são saprófitas do solo, permanecendo associados com o hospedeiro animal
quando este morre, no solo (SHARPTON et al., 2009).
Para o gênero Coccidioides os estudos moleculares são de grande relevância, visto
que, apenas por meio de marcadores moleculares foi possível demonstrar que o gênero é
composto de duas espécies estreitamente relacionadas, porém geneticamente isoladas. Ambas
as espécies são compostas de populações biogeograficamente distintas. A estrutura de duas
destas populações (C. immitis da Califórnia central, e C. posadasii do sul do Arizona) indica
que a recombinação genética freqüente ocorre em toda a gama geográfica de cada população,
apesar da fase sexuada nunca ter sido observada (BARKER et al., 2007).
Contudo, estudos recentes indicam que as espécies de Coccidoides possuem os genes
mating type necessários para a reprodução sexual, além disso, foi provado que os genes são
funcionais através de análises transcricionais e por um estudo de sua distribuição na
população, onde os idiomorfos compatíveis, MAT1-1 e MAT1-2, estão presentes na
população numa proporção de cerca de 1:1 como esperado dentro uma população que se
reproduz sexuadamente, corroborando com as evidências anteriores de recombinação genética
(MANDEL et al., 2007).
A genômica comparativa de representantes de populações de Coccidioides spp. pode
fornecer um conjunto de marcadores genéticos, a fim de determinar a genética de populações
destes patógenos. Atualmente, ainda há escassez de mapas de abordagens epidemiológicas
para direcionar a correlação entre as populações de Coccidioides spp. com os surtos de
coccidioidomicose. Novos estudos, dentro das populações de C. immitis e C. posadasii,
devem ser realizados para aprimorar os conhecimentos sobre a genética funcional, ecologia e
evolução destes microrganismos (BARKER et al.,2007).
41
2. PERGUNTA DE PARTIDA
1. Os isolados clínicos e ambientais de C. posadasii oriundos do Nordeste brasileiro
apresentam diversidade genética baseada nas regiões 18S-28S do DNA ribossômico
nuclear?
3. HIPÓTESE
1. Os isolados de C. posadasii exibem polimorfismo nas seqüências de nucleotídeos das
regiões 18S-28S do DNA ribossômico nuclear, podendo ser agrupados de acordo com
homologias e divergências nestas seqüências.
42
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Realizar a caracterização molecular de cepas clínicas e ambientais de C. posadasii
oriundas do Nordeste brasileiro a fim de se obter marcadores genéticos.
4.2 Objetivos Específicos
1. Obter a identificação molecular das cepas de C. posadasii mantidas na Micoteca do
Centro Especializado em Micologia Médica, por meio de reações de PCR com primers
específicos e por sequenciamento das regiões 18S-28S do rDNA nuclear;
2. Analisar a diversidade genética de C. posadasii por meio do seqüenciamento das regiões
18S-28S do rDNA nuclear.
43
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Microrganismos
Foram utilizados 18 isolados de Coccidioides posadasii (15 clínicos e três ambientais)
pertencentes à Micoteca do Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), Faculdade
de Medicina da Universidade Federal do Ceará. As cepas encontravam-se estocadas em salina
fisiológica à temperatura ambiente a 28oC ou a -20
oC em freezer. Antes da estocagem, os
isolados haviam sido identificados por meio de análise microscópica direta e em cultura. Os
isolados retirados do estoque foram repicados em ágar batata e incubados por 10 dias a 35° C.
Todos os isolados clínicos analisados são provenientes do Brasil, sendo todos os isolados de
origem ambiental procedentes de amostras de solo coletadas no município de Solonópoles,
Ceará. A origem de cada isolado de C. posadasii incluído neste estudo esta descrita na Tabela
1.
5.2 Biossegurança
Todos os procedimentos envolvendo a manipulação laboratorial das cepas foram
realizados em cabine de segurança biológica classe II em laboratório de biossegurança nível 3
(NB-3), em virtude da alta virulência desse fungo (SUTTON, 2007).
44
Tabela 1. Procedência dos isolados clínicos e ambientais de Coccidioides posadasii
incluídos no estudo
Isolados Origem Data Localidade
CEMM 01-6-085 Lavado brônquico 2003 Santa Quitéria
4°19′S 40°09′W
CEMM 01-6-087 Lavado brônquico 2002 Catunda
4°38′S 40°12′W
CEMM 01-6-088 Lavado brônquico 2003 Santa Quitéria
4°19′S 40°09′W
CEMM 01-6-089 Lavado brônquico 2001 Solonópoles
5°44′S 39°09′W
CEMM 01-6-090 Solo (toca de tatu) 2004 Solonópoles
5°44′S 39°09′W
CEMM 01-6-091 Solo (toca de tatu) 2004 Solonópoles
5°44′S 39°09′W
CEMM 01-6-092 Solo (toca de tatu) 2004 Solonópoles
5°44′S 39°09′W
CEMM 01-6-101 Lavado brônquico 2004 Solonópoles
5°44′S 39°09′W
CEMM 01-6-102 Lavado brônquico 2004 Arneiroz
6°19′S 40°09′W
CEMM 01-6-103 Escarro 1995 Aiuaba
6°34′S 40°07′W
CEMM 05-2-063 Fluido pericárdico 2005 Ibiapina
3°55′S 40°53′W
CEMM 05-2-064 Lavado brônquico 2006 Sobral
3°41′S 40°29′W
CEMM 05-2-065 Lavado brônquico 2006 Sobral
3°41′S 40°29′W
CEMM 05-2-066 Lavado brônquico 2006 Sobral
3°41′S 40°29′W
CEMM 05-2-067 Lavado brônquico 2007 Jaguaribe
5°53′S 38°37′W
CEMM 05-2-068 Lavado brônquico 2007 Jaguaribe
5°53′S 38°37′W
CEMM 05-2-069 Lavado brônquico 2006 Piauí
05º05'S 42º48'W
CEMM 05-2-070 Escarro 2007 Parambu
6°12′S 40°41′W
45
5.3 Caracterização molecular de cepas clínicas e ambientais de Coccidioides posadasii
5.3.1 Extração de DNA genômico
Para o procedimento, os 18 isolados de C. posadasii foram inicialmente cultivados em
ágar Batata a 35ºC até que fosse observado o crescimento da colônia (quatro dias em média).
Uma vez crescidas, as culturas foram inativadas pelo calor, sob vapor fluente em autoclave, a
100oC por 15 min. Para garantia do processo de inativação, uma porção da colônia foi
repicada em meio BHI em caldo e incubada a 35oC, o restante da amostra foi estocada em
freezer a -20oC. A amostra foi considerada segura para prosseguir com o isolamento de DNA
se após o período de sete dias de incubação o controle de esterilidade não apresentasse
nenhum crescimento (CASTAÑÓN-OLIVARES et al., 2007).
O DNA genômico foi extraído utilizando o detergente catiônico brometo de
cetiltrimetilamônio (CTAB) e o agente redutor betamercaptoetanol. O complexo ácido
nucléico/CTAB foi separado das proteínas desnaturadas, polissacarídeos e debris celulares
pela exposição a clorofórmio/álcool isomílico (24:1). A precipitação dos ácidos nucléicos foi
realizada utilizando álcool isopropílico 100%, em seguida, o CTAB foi removido através da
lavagem em etanol 70%. Por fim, o precipitado de DNA foi seco ao ar brevemente em
temperatura ambiente e ressuspenso em tampão TE pH 8 (TALBOT, 2001). As amostras de
DNA foram mantidas em freezer a -20oC, até o momento do uso. O protocolo para extração
de DNA genômico de C. posadasii encontra-se descrito no Anexo I.
Após a extração, as amostras de DNA foram submetidas à eletroforese em gel de
agarose a 1%, contendo brometo de etídio, com o objetivo de verificar a presença e a
integridade do DNA extraído. A corrida foi realizada em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE)
1X a 100 V por 50 minutos. Após corrida eletroforética, a presença de DNA resultante foi
visualizada sob luz UV. A concentração e a pureza do DNA nas amostras foram determinadas
pela mensuração da densidade óptica a 260 nm e 280 nm usando o espectrofotômetro
Ultrospec 1100 pro (GE Healthcare, Reino Unido).
46
5.3.2 Identificação molecular de C. posadasii por PCR específica
A identificação molecular dos isolados clínicos e ambientais incluídas neste estudo foi
realizada através da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando os iniciadores
Coi9-1F e Coi9-1R propostos por Umeyama et al., em 2006. Estes iniciadores de 20 bases
nucleótidicas amplificam um fragmento de 720 pb e 634 pb para Coccidioides immitis e C.
posadasii respectivamente, possibilitando a distinção das espécies de Coccidioides através do
tamanho do fragmento gerado. As sequências dos iniciadores utilizados são mostradas na
Tabela 2 (UMEYAMA et al., 2006).
Tabela 2. Sequências dos iniciadores Coi9-1F e Coi9-1R que amplificam um fragmento
correspondente a posição 660313 ate 661032 do contig 2.2 de C. immitis, número de
acesso AAEC02000002.
Iniciador Posições Fita Sequências (5’→ 3’)
Coi9-1F 660313 senso 5 -TACGGTGTAATC CCGATACA-3
Coi9-1R 661032 antisenso 5 -GGTCTGAATGATCTG ACGCA-3
A reação foi realizada com um volume final de 25 µL, contendo 10 µL de amostra de
DNA (na concentração 20 ng/µL), 2,5 µL de tampão de reação 10X (New England Biolabs,
UK), 1 mmol/L de MgCl2 (Invitrogen, USA), 50 pmol de cada iniciador Coi9-1F e Coi9-1R
(Invitrogen, USA), 10 mmol/L de cada desoxirribonucleotídeo e 1 U de Taq DNA polimerase
(New England Biolabs, UK).
A amplificação do DNA foi realizada em termociclador Mastercycler (Eppendorf,
USA). Primeiramente, seguiu-se a etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos,
seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30
segundos e extensão a 72ºC por 45 segundos, por fim, um ciclo de extensão final a 72ºC por 3
minutos. A visualização dos produtos amplificados foi realizada através de eletroforese em
gel de agarose 2%, contendo brometo de etídio, seguida de exposição à luz UV por meio de
um transluminador. A corrida foi realizada em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X a 100 V
por 50 minutos (UMEYAMA et al., 2006).
47
5.3.3 Amplificação da região 18S-28S do rDNA
A região 18S-28S do DNA ribosomal (18S-28S rDNA) foi amplificada in vitro através
da técnica de PCR usando os iniciadores universais ITS5 (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)
e ITS4 (AAGGAGGTGATCCAGCC), gerando amplicons de aproximadamente 640 pb. Para
amplificação, foram utilizados 2 µL de DNA (na concentração 100 ng/µL), 5 µL de tampão
de reação 5X (Green GoTaq Buffer, Promega, USA), 1,5 mmol/L de MgCl, 50 pmol de cada
iniciador ITS5 e ITS4, 10 mmol/L de cada desoxirribonucleotídeo e 1 U de Taq DNA
polimerase (GoTaq DNA polimerase, Promega, USA), totalizando uma reação com volume
final de 25 µL. Cada amostra foi submetida à PCR em quadruplicata.
A amplificação foi realizada em termociclador Mastercycler (Eppendorf, USA).
Primeiramente, seguiu-se a etapa de desnaturação inicial a 92ºC por 2 minutos, seguido por
35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 55ºC por 1 minuto e 30
segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos, por fim, um ciclo de extensão final a 72ºC por 8
minutos. Após a reação, os produtos da PCR foram armazenados em freezer a -20ºC até o
momento do uso.
A visualização dos produtos amplificados foi realizada através de eletroforese em gel
de agarose 0,8%, contendo brometo de etídio, seguida de exposição à luz UV por meio de um
transluminador. A corrida foi realizada em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X a 100 V
por 30 minutos.
Após a corrida eletroforética, as amostras de DNA amplificadas foram purificadas
utilizando o kit GFXTM
PCR DNA and gel band purification (GE Healthcare, Reino Unido),
de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. O protocolo do kit purificação é
descrito no Anexo II. Posteriormente, as amostras purificadas foram quantificadas em
espectrofotômetro pela mensuração da densidade óptica a 260 nm e 320 nm, em seguida,
diluídas em água deionizada estéril para a concentração de 12,8 ng/µL.
48
5.3.4 Sequenciamento de DNA
5.3.4.1 Sequências iniciadoras utilizadas e condições da reação de sequenciamento
Os produtos de PCR amplificados e diluídos em água deionizada estéril foram
submetidos às reações de sequenciamento pelo método da terminação da cadeia pelo
didesoxinucleotídeo (SAMBROOK et al., 1989), usando-se o kit DYEnamicTM
ET terminators
cycle sequencing (GE Healthcare, Reino Unido).
Para o sequenciamento da região 18S-28S rDNA foram utilizados os mesmos
iniciadores já descritos anteriormente para a amplificar essa região (ITS5 e ITS4). A reação de
sequenciamento foi realizada em volume final de 10 µL, onde cada poço da placa continha 5
µL de DNA da amostra, previamente purificado e diluído, 1 µL de um dos iniciadores e 4 µL
de pré-mix fornecido pelo kit. Para cada amostra de DNA a ser sequenciada, a reação foi
realizada em quadruplicata, em relação a cada um dos iniciadores utilizados.
A reação de sequenciamento foi realizada em termociclador Mastercycler (Eppendorf,
USA) em 25 ciclos de desnaturação a 95ºC por 20 segundos, anelamento a 50ºC por 15
segundos e extensão a 60ºC por 1 minuto.
5.3.4.2 Precipitação da placa de sequenciamento e origem das sequências
Após a reação de sequenciamento, os produtos foram precipitados por centrifugação
de acordo com protocolo descrito no Anexo III, para a remoção de sais e componentes do kit
não incorporados e então analisados em um sequenciador MegaBACE 1000 (Amersham
Biosciences, USA).
Os resultados gerados foram analisados pelo programa MegaBace DNA Sequencing
System disponível na própria plataforma de sequenciamento, o qual originou uma seqüência
de nucleotídeos e um eletroferograma.
49
5.3.5 Montagem das sequências consenso, alinhamento múltiplo e edição das sequências
As sequências de DNA foram analisadas em relação à qualidade e montadas com o
auxílio do pacote Phred/Phrap/Consed (EWING et al., 1998; EWING; GRENN, 1998;
GORDON et al., 1998). As sequências consenso de alta qualidade (phred > 20) foram
submetidas à busca por similaridade com sequências depositadas no GenBank, através do
programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1990). As sequências com maior similaridade foram
alinhadas usando-se o programa ClustalW (THOMPSON et al., 1997). As edições dos
alinhamentos foram realizadas manualmente, com o auxílio do programa Bioedit, versão
5.0.9. (HALL, 1999).
5.3.6 Análise filogenética
Para analisar a relação filogenética dos isolados clínicos e ambientais de C. posadasii
em estudo, bem como, a relação destas com outras cepas depositadas no banco de dados
GenBank, foram realizadas análises de agrupamentos abrangendo os métodos de distância,
máxima parcimônia e máxima verossimilhança por meio do programa MEGA4 (Molecular
Evolutionary Genetic Analysis, versão 4.1) (TAMURA et al., 2007).
50
6. RESULTADOS
6.1 Recuperação dos isolados clínicos e ambientais de Coccidoides posadasii da micoteca
do CEMM
Para recuperação das cepas, inicialmente estocadas em salina fisiológica (4 oC ou
-20
oC), foram realizadas semeaduras em ágar batata, com incubação a 35
oC. Após cinco dias, já
era possível visualizar o crescimento das colônias. Posteriormente a 10 dias de incubação, as
cepas foram re-isoladas em ágar batata, e seus aspectos macro e micromorfológicos foram
examinados (Figura 8). Colônias de cor branca, algodonosas e com reverso com pigmentação
marrom que se difunde no meio, foram observadas. Ao microscópio óptico, foram
visualizadas hifas hialinas finas e septadas, originando artroconídios intercalados por células
disjuntoras.
Figura 8. Crescimento de cepas de C. posadasii na fase filamentosa, após 10 dias de
incubação a 35°C, em ágar batata. A. Aspecto macroscópico, mostrando colônias algodonosas
de cor branca; B. Reverso das colônias, mostrando pigmentação marrom difusível no meio; C.
Aspecto microscópico, evidenciando (a) artroconídios e (b) células disjuntoras.
C
(a)
(b) C
(a)
(b) B A
51
6.2 Identificação molecular dos isolados clínicos e ambientais de C. posadasii por PCR
específica
A identificação molecular dos 18 isolados, clínicos e ambientais, de Coccidioides
incluídos neste estudo, realizada através da técnica de PCR, utilizando os iniciadores Coi9-1F
e Coi9-1R propostos por Umeyama et al., em 2006, confirmou a identificação baseada na
epidemiologia deste microrganismo. Assim, todas as cepas foram identificadas como
Coccidioides posadasii apresentando um fragmento amplificado de 634 pb visualizado em gel
de agarose (Figura 9).
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose 2%, mostrando fragmentos de aproximadamente 634
pb, específico para C. posadasii. (M: marcador de peso molecular de 50 pb; 1-18:
amplificação de amostras de DNA das cepas de C. posadasii analisadas no estudo; BR:
controle negativo)
634bp
52
6.3 Confirmação da identificação molecular por PCR dos isolados clínicos e ambientais
de C. posadasii pela análise das sequências da região 18S-28S rDNA
As sequências nucleotídicas de aproximadamente 600 pb correspondente à região 18S-
28S, obtidas através do sequenciamento de DNA, dos isolados clínicos e ambientais de C.
posadasii previamente identificados por PCR, foram submetidas à busca de similaridade no
GenBank, as quais apresentaram 100% de sequência identidade com as sequências dos genes
18S-28S rDNA de cepas de C. posadasii previamente depositadas no referido banco de dados
(Tabela 3).
Tabela 3. Cepas clínicas e ambientais de C. posadasii identificadas através de diagnóstico
molecular.
Isolados PCR específica Sequências 18S-28S rDNA
CEMM 01-6-085 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-087 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-088 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-089 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-090 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-091 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-092 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-101 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-102 PCR + C. posadasii
CEMM 01-6-103 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-063 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-064 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-065 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-066 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-067 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-068 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-069 PCR + C. posadasii
CEMM 05-2-070 PCR + C. posadasii
53
6.4 Alinhamento múltiplo e análise filogenética da região 18S-28S rDNA
As sequências nucleotídicas obtidas das regiões ITS1, 5,8S e ITS2 do rDNA nuclear
de 15 isolados de C. posadasii, incluídas no presente estudo, foram alinhadas, analisadas. Foi
encontrada, por meio do alinhamento, apenas uma diferença nucleotídica ao longo das regiões
analisadas, localizada na região ITS1. Essa diferença se caracteriza pela presença de uma
timina na posição 47, nas cepas CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-064, CEMM 05-2-065 e
CEMM 05-2-066, distinguindo-as das demais que apresentam uma citosina na referida
posição (Anexo IV). Não foram detectadas diferenças entre as cepas de origem clínica e as
cepas de origem ambiental.
Em um segundo momento, essas sequências foram comparadas com sequências
depositadas no Genbank, de 17 cepas de C. posadasii e 9 cepas de C. immitis (Anexo IV).
Através da análise do alinhamento, foram encontradas 12 posições nucleotídicas divergentes.
Destas, foram localizadas três posições na região ITS1 que diferenciam as duas espécies, são
elas: posição 37 (apresenta uma timina para C. posadasii e uma deleção para C.immitis),
posição 73 e 157 (apresenta uma citosina para C. posadasii e uma timina para C. immitis). Em
C. posadasii, na região ITS1 as posições 47, 125 e 205 apresentam transição de citosina para
timina, respectivamente, em quatro, três e uma cepa. Na região ITS2, uma cepa apresenta uma
transição de citosina para timina, na posição 498. Nos isolados de C. immitis, a região ITS1
apresenta diferenças na: posição 12 (transição de guanina para adenosina, em 1 isolado),
posição 104 (transição de citosina para timina, em 5 isolados), posição 105 (transição de
guanina para adenosina), posição 211 (apresenta inserção de uma adenosina, em 3 isolados) e
posição 212 (transversão de citosina para guanosina). A região ITS 2 apresentou uma
transição de citosina para timina, na posição 498 em 4 isolados.
Desta forma, a partir dessa análise foi gerada uma arvore filogenética consenso das
regiões ITS1, 5,8S e ITS2 do rDNA baseada em relações de distância e máxima
verossimilhança (Figura 10) A árvore mostra que todos os isolados de C. posadasii foram
agrupados em um amplo clado (bootstrap 88), onde as cepas CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-
064, CEMM 05-2-065 e CEMM 05-2-066 foram agrupadas dentro de um subclado (bootstrap
67) exclusivo. O mesmo ocorreu com as cepas AB232886, AB232885 e U18360 (bootstrap
66). As cepas de C. immitis foram divididas em dois clados distintos, o clado formado pelas
cepas EF186790, EF186788, AB232897 e AB232893, parece ser mais ancestral que os
demais (bootstrap 74).
54
CEMM 05-2-066
CEMM 05-2-064
CEMM 05-2-065
CEMM 05-2-063
AB232898 C. posadasii
EF186785 C. posadasii
AB232886 C. posadasii
AB232885 C. posadasii
U18360 C. posadasii
AB232895 C. posadasii
AB232892 C. posadasii
AB232889 C. posadasii
AB232883 C. posadasii
CEMM 01-6-092
CEMM 01-6-088
CEMM 01-6-101
CEMM 01-6-091
CEMM 01-6-103
AB232888 C. posadasii
X94142 C. posadasii
CEMM 05-2-067
CEMM 05-2-070
CEMM 05-2-068
CEMM 05-2-069
AB232901 C. posadasii
AB232900 C. posadasii
CEMM 01-6-085
CEMM 01-6-090
EF186786 C. posadasii
AB232899 C. posadasii
AB232887 C. posadasii
AB232884 C. posadasii
EF186789 C. immitis
EF186787 C. immitis
EF186783 C. immitis
AB232894 C. immitis
AB232890 C. immitis
EF186790 C. immitis
AB232893 C. immitis
EF186788 C. immitis
AB232897 C. immitis34
34
73
68
66
67
88
0.001 Figura10. Filograma representativo da topologia da árvore consenso baseada na região IST1, 5,8S e ITS2 do
rDNA de Coccidioides spp. A árvore consenso foi inferida pelo Método de Evolução Mínima (Rzhetsky; Nei,
1992), com base em 100 repetições (Felsenstein, 1985). A porcentagem de replicados das árvores em que há
associação de táxons agrupados no teste de bootstrap (100 repetições) é mostrada próxima aos ramos As
distâncias evolutivas foram calculadas utilizando o método de Máxima Verossimilhança (Tamura; Nei; Kumar,
2004). A árvore ME foi pesquisada usando o algoritmo Close-Neighbor-Interchange (CNI) (Nei; Kumar, 2000)
a um nível de pesquisa, de 3. O algoritmo Neighbor-joining (Saitou; Nei, 1987) foi usado para gerar a árvore
inicial. Todas as posições com deleções foram tratadas como dados ausentes. Houve um total de 498 posições no
conjunto final. As análises foram conduzidas em MEGA4 (Tamura et al., 2007). As sequências nucleotídicas das
regiões ITS1, 5,8S e ITS2 das cepas utilizadas foram retiradas do banco de sequências GenBank.
7. DISCUSSÃO
55
Os fungos dimórficos Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii, agentes
causadores da coccioidomicose são morfologicamente indistinguíveis, mas apresentam-se
distintos em relação à caracterização molecular e epidemiológica. Até o momento, ainda não
foram observadas diferenças na doença causada pelas espécies de Coccidioides, as quais
apresentam manifestações clínicas essencialmente idênticas, bem como, não foram
evidenciadas diferenças significativas entre seus nichos ambientais e em suas características
morfológicas (CATANZARO, 2004). No entanto, dada a comprovada separação genética e
geográfica das duas espécies, tais diferenças tendem a existir (BARKER et al., 2006).
Esta situação poderá mudar à medida que mais estudos são realizados com cada uma
das espécies. Apesar da atual necessidade da utilização de técnicas moleculares para a
distinção das duas espécies, alguns estudos relatam diferenças fisiológicas entre as mesmas,
indicando assim, que devem existir outras características fenotípicas capazes de distingui-las.
Estas diferenças podem desempenhar um importante papel na fase saprofítica do ciclo de vida
de Cocccidioides spp., refletido na distribuição das duas espécies em diferentes regiões
(SABOULLE et al., 2007).
Assim, faz-se necessária a identificação específica das cepas isoladas em diferentes
áreas geográficas para uma melhor caracterização das mesmas, uma vez que, apesar da
distribuição geográfica das espécies de Coccidioides ser bem definida, vários casos de
coccidioidomicose causada por C. immitis, fora de sua área endêmica, vem sendo descritos
(CASTAÑÓN, et. al.; 2007; JEWELL, et. al., 2008). A maioria destes casos está relacionada
a pacientes que visitaram áreas endêmicas, mas alguns não apresentam histórico de viagem
para estes locais ou foram expostos apenas através de contato com fômites provenientes dos
mesmos (LAN et al., 2010). Desta forma, a caracterização da espécie tem um grande valor
epidemiológico, auxiliando no monitoramento das infecções e contribuindo para
caracterização das populações de cada espécie.
No presente trabalho, a identificação da espécie de Coccidioides sp. foi realizada por
meio de PCR utilizando os primers Coi9-1F e Coi9-1R, descritos por Umeyama et al., (2006).
A reação de PCR resultou em um fragmento correspondente ao tamanho esperado para a
espécie C. posadasii, confirmando, assim, a identificação fenotípica e epidemiológica
realizada, com base nas características morfológicas e na origem geográfica destes isolados.
Estes primers foram descritos para distinguir as espécies C. immitis e C. posadasii
através da comparação do tamanho do amplicon, onde o fragmento de DNA amplificado de
C. posadasii. é visivelmente menor, quando comparado ao de C. immitis. Esta diferença
ocorre devido à deleção contígua de 86 pb na região correspondente em C. posadasii,
56
contribuindo para a identificação destas espécies intimamente relacionadas, de difícil
distinção (UMEYAMA et al., 2006).
Neste estudo, os isolados de origem clínica e ambiental mostraram amplificação
adequada, possibilitando a identificação de todos os isolados analisados. Estudos realizados
por Tintelnot et al., (2007) alcançaram sucesso com a utilização desses mesmos primers para
a identificação de cepas de ambas as espécies de Coccidioides, com duas exceções. Uma das
22 cepas analisadas não amplificou qualquer produto, impedindo, assim, sua identificação, e
outra cepa, cujo fragmento amplificado foi correspondente a C. posadasii foi identificada,
posteriormente, como C. immitis, através do sequenciamento da região ITS e de marcadores
do tipo microssatélite.
Desta forma, para a confirmação da veracidade dessa identificação, buscou-se analisar
os isolados, por meio do sequenciamento das regiões ITS1, 5,8S e ITS2, visto que as
sequências de genes do rRNA, disponíveis em um grande número de cópias, tem contribuído
largamente para estudos filogenéticos de identificação e de detecção de agrupamentos
taxonômicos (TINTELNOT et al., 2007). A busca de similaridade no Genbank das sequências
nucleotídicas obtidas através do sequenciamento destas regiões resultou na confirmação do
resultado obtido com PCR específico, onde todas as cepas foram identificadas como C.
posadasii, mostrando alta sensibilidade e especificidade na identificação destes isolados.
As regiões ITS1, 5,8S e ITS2 mostraram-se adequadas no desempenho do papel
proposto nos objetivos deste trabalho, uma vez que a região 5,8S possui sequências
nucleotídicas bem conservadas, mesmo entre as espécies de Coccidioides, e as regiões ITS1 e
ITS2 apresentam sequências relativamente variáveis, o que permitiu a adequada identificação
dos isolados estudados, bem como, a caracterização de agrupamentos baseados em single
nucleotide polymorphisms (SNPs).
Outros genes encontrados no genoma de Coccidioides spp. foram pesquisados e
analisados através do alinhamento de sequências nucleotídicas de cepas previamente
depositadas no Genbank (dados não mostrados). Tais genes, como o da hexoquinase
apresentaram diferenças significativas entre as duas espécies, contudo, aparentemente, são
sequências bem conservadas dentro de uma mesma espécie. Além disso, as sequências desse e
de outros genes, como quitina sintetase, quitobiase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e
antígeno 2/prolin rich, estão disponíveis apenas para um reduzido número de cepas, o que
dificultaria uma análise comparativa entre as cepas aqui estudadas e as cepas de outras regiões
geográficas.
Desta forma, as sequências nucleotídicas obtidas das regiões ITS1, 5,8S e ITS2
resultaram na construção de uma árvore filogenética, como mostrada na figura 1. Esta árvore
57
mostra 14 cepas (11 clínicas e 3 ambientais) de C. posadasii do Ceará e uma do Piauí,
agrupadas juntamente com 17 cepas de C. posadasii e 9 cepas de C. immitis depositadas no
Genbank (Anexo V). Como esperado, a árvore filogenética resultante mostra os isolados de
Coccidioides spp. organizados em dois clados principais, onde C. immitis e C. posadasii
apresentam-se em clados distintos, estando os isolados analisados neste estudo
evolutivamente agrupados com as cepas de C. posadasii depositadas no Genbank, oriundas de
diferentes regiões. Esta observação confirma que as regiões ITS1, 5,8S e ITS2 possuem
marcadores genéticos adequados, capazes de identificar corretamente estas espécies.
Os agrupamentos obtidos revelam a formação de um cluster diferenciado entre as
cepas de C. posadasii do Ceará, formado pelas cepas CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-064,
CEMM 05-2-065 e CEMM 05-2-066. Uma análise mais detalhada do alinhamento das
sequências revelou a presença de um SNP, caracterizado pela transição de uma citosina para
uma timina na posição 47 da região ITS1, nestas cepas, quando comparadas aos demais
isolados.
Segundo Barker et al. (2007), os SNPs em seqüências de DNA, comumente utilizados
como marcadores genéticos, podem ou não causar uma mudança em um aminoácido.
Considerando que as sequências das regiões ITS não são traduzidas, a ocorrência de um SNP
não tem efeito sobre a sequência de aminoácidos, sendo considerada uma mutação neutra ou
silenciosa, e, por isso, não sofre ação da seleção natural. Contudo, estes SNPs podem ser
retidos em uma população, devido ao processo evolutivo de deriva genética, e podem se
tornar marcadores capazes de caracterizar dadas populações ou espécies.
Essas observações sugerem que o agrupamento formado pelas cepas contidas nesse
clado são características de uma determinada região, uma vez que todas as cepas oriundas da
cidade de Sobral, Ceará, estão agrupadas no mesmo (TOGASHI et al., 2009). Este
agrupamento também inclui a cepa CEMM 05-2-063, oriunda de um paciente residente em
Ibiapina, município localizado na Serra de Ibiapaba, local com características ecológicas
inadequadas para o desenvolvimento do microrganismo. Contudo, o paciente possui histórico
de viagens para cidades do semi-árido cearense, incluindo Sobral, onde provavelmente
adquiriu a infecção, por se tratar de uma região reconhecidamente endêmica para
coccidioidomicose (BRILHANTE et al., 2008).
Essas cepas são provenientes de casos em indivíduos imunocompetentes que
ocorreram entre os anos de 2005 e 2006. Os isolados de Sobral são oriundos de três pacientes
envolvidos em caçadas de tatu, dentre os quais dois apresentaram acometimento pulmonar
bilateral, um deles com manifestações mais graves, exibindo dispnéia ao repouso. O terceiro
paciente apresentou comprometimento pulmonar no lobo inferior direito e, além disso,
58
desenvolveu disseminação cutânea (TOGASHI et al., 2009). O paciente de Ibiapina
apresentou pericardite coccidioidal, uma manifestação incomum da coccidioidomicose,
havendo um reduzido número de casos descritos na literatura (BRILHANTE et al., 2008).
Assim, a análise desses casos sugere que as cepas contidas neste cluster apresentam
elevada virulência, uma vez que três dos quatro pacientes observados foram gravemente
acometidos, evidenciando-se a forma disseminada da doença em dois deles. Vale ressaltar que
a forma disseminada da doença ocorre em apenas 1-5% dos casos de pacientes infectados por
Coccidioides spp., acometendo com maior freqüência indivíduos imunossuprimidos, como
pacientes com aids, linfomas ou transplantados (GALGIANI et al., 2005). Ainda assim, a
precocidade do diagnóstico dos casos de Sobral pode ter resultado em manifestações clínicas
mais brandas, quando comparados ao caso de Ibiapina, cujo diagnóstico preciso da doença
levou cerca de 9 meses para ser estabelecido.
Estudos posteriores envolvendo a análise de marcadores de evolução mais rápida,
como as regiões microssatélites, podem fornecer evidências para determinar se os
agrupamentos encontrados neste estudo são resultantes de uma linhagem de reprodução
clonal. Tal confirmação se dará por meio da observação de congruências entre alelos de
diferentes loci e, assim, os resultados de uma árvore com base em análises de qualquer dado
locus devem ser semelhantes (BARKER et al., 2007).
O clado formado pelas cepas de C. posadasii também apresenta outros subclados. Um
deles é formado pelas cepas AB232886, AB232886 e U18360, das quais as duas primeiras
tratam-se da cepa Silveira, isoladas após diferentes passagens por inoculação animal, o que
justifica seu agrupamento dentro de um mesmo cluster. A cepa U18360 é proveniente do
Canadá, mas não foi revelada a origem da aquisição da infecção. As cepas AB232895 e
AB232883 apresentam um SNP em cada, que não foram encontrados nas demais. Estas cepas
foram isoladas no Japão, mas a origem precisa das mesmas também não foi revelada. A
observação de coccidioidomicose em regiões atípicas levanta questionamentos sobre a origem
da infecção. A possibilidade de diagnóstico tardio e de reativação da doença após um período
de latência e o caráter crônico e inepescífico da doença torna difícil determinar quando e onde
o paciente foi inicialmente exposto, dificultando a identificação de focos ambientais do agente
(DESAI et al., 2010).
A árvore filogenética obtida neste estudo apresenta as cepas de C. immitis dividida em
dois clados, um dos quais se mostra mais estreitamente relacionado ao clado formado por
cepas de C. posadasii. Diante dessa observação, apesar da significativa diferença entre o
número de cepas analisadas de cada espécie, aparentemente, as cepas de C. posadasii
apresentam menor índice de divergência genética nas regiões ITS1 e ITS2, quando
59
comparadas às cepas de C. immitis. Essa evidência pode ser melhor observada pela análise do
alinhamento dessas sequências, onde as cepas de C. immitis, apresentam um maior número de
SNPs.
Este resultado corrobora com o descrito previamente na literatura, onde a análise de
multilocus revela que C. immtis apresenta diferenças significativas nas frequências alélicas
entre as suas populações, o que é evidenciado pela existência de duas populações agrupadas
em clados distintos, uma na Califórnia Central e outra no Sudoeste do Estado. Tal divergência
demonstra que a deriva genética tem ocorrido nessa população. Um padrão similar de
divergência é visto para populações de C. posadasii do Arizona, as quais são agrupadas em
um clado independente. Em contrapartida, as cepas de C. posadasii do Texas, México e da
América do Sul são agrupadas juntamente em um mesmo clado (TAYLOR; FISHER, 2003).
Desta forma, embora a análise de multilocus mostre um elevado índice de
polimorfismo dentro de populações de C. immitis e entre as populações de C. immitis e C.
posadasii, não foi evidenciada a variação genética entre os isolados de C. posadasii sul-
americanos. Além disso, foi mostrado que cepas sul-americanas apresentaram genótipos
idênticos àqueles de vários isolados de C. posadasii do Texas e do México. Parece que, ao
longo da escala de tempo considerada, a diferenciação genética não teve a chance de acumular
mutações para os genes avaliados, considerando 9 regiões microssatélites e os genes
dioxigenase, serina proteinase e quitinase (TAYLOR; FISHER, 2003). Aparentemente, tal
afirmação também é válida para as regiões ITS, uma vez que, a análise do alinhamento das
sequências incluídas no presente estudo revela poucos SNPs detectados nessas regiões.
Essa homogeneidade nos genótipos de C. posadasii está relacionada à origem e à
demografia da população de C. posadasii sul-americana. Embora tal população contenha
alelos representativos de todas as populações da América do Norte, esta apresenta frequências
alélicas mais estreitamente relacionadas às populações de C. posadasii do Texas. Tal
observação sugere que as cepas sul-americanas são descendentes recentes de uma única
população originária deste Estado norte-americano. Assim, considerando-se que a quantidade
relativa de variação genética e sua estrutura dentro de uma população contêm informações
recentes sobre a história evolutiva da mesma, estima-se que a introdução de C. posadasii na
America do Sul ocorreu nos últimos 9 – 140 mil anos, sendo recente o suficiente para que a
taxa de mutações não restaurasse a variação genética para os níveis vistos na população de
origem (FISHER et al., 2001).
A teoria genética mostra que os baixos níveis de fluxo gênico são suficientes para
homogeneizar a estrutura da população. Dessa forma, as populações que tenham sido
submetidas à rápida expansão reduziram as variações nos loci, quando comparadas a
60
populações de tamanho constante. Assim, a baixa divergência genética na população sul-
americana de C. posadasii indica que esta foi submetida a um rápido processo de migração
para essa região, em consonância com o rápido crescimento populacional do patógeno, após a
colonização da América do Sul (FISHER et al., 2001)
A compreensão da distribuição de genótipos entre populações é importante para o
acompanhamento de surtos, ajudando a determinar variações na virulência e prever a
progressão da infecção. Assim, diferentes abordagens moleculares tem sido utilizadas com
objetivo de resolver questões relativas à epidemiologia da coccidioidomicose e inferir sobre a
estrutura populacional de Coccidioides spp (NEAFSEY et al., 2010).
O primeiro trabalho referente ao estudo de populações de Coccidioides baseado em
SNPs determinou uma estrutura populacional consistente com uma espécie
predominantemente clonal, quando tratados com enzimas de restrição, evidenciando, em 13
dos 15 isolados analisados, um mesmo padrão (ZIMMERMANN et al., 1994).
No entanto, após esta publicação, outros trabalhos analisando SNPs em diferentes loci
de isolados de Coccidioides spp. foram descritos. Estes, por sua vez, determinaram o
isolamento reprodutivo entre duas populações de C. immitis, agrupadas de acordo com sua
origem geográfica, as quais foram, posteriormente, determinadas como espécies filogenéticas
diferentes. Dentre os genes estudados, vários foram caracterizados, como quitinase, quitina
sintase, protease, serina, dioxigenase, dentre outros, os quais não estão associados a um
histórico de recombinação entre as duas espécies (KOUFOPANOU et al., 1997; FISHER;
WHITE; TAYLOR, 1999).
Apesar da caracterização da divergência genética entre C. immitis e C. posadasii ter
sido bem determinada, os estudos de variações genéticas dentro das populações de cada
espécie, após a divisão das mesmas, ainda são escassos, principalmente para C. posadasii da
América do Sul. Até o momento, os surtos da doença não têm sido correlacionados a
genótipos mais virulentos resultantes da propagação de um único isolado clonal, mas causadas
por uma diversidade de genótipos. Assim, os surtos de coccidioidomicose vêm sendo
associados principalmente a fatores ambientais, tanto bióticos como abióticos (SAUBOLLE;
MCKELLAR; SUSSLAND, 2007; JEWELL et al., 2008).
Contudo, tais estudos geralmente consistem na análise de regiões microssatélites,
marcadores com taxa de evolução rápida. Desta forma, Barker et al. (2007) sugerem que
estudos com marcadores com taxa de mutação mais lenta, como as regiões ITS, poderão
potencialmente determinar a estrutura das populações de forma mais fidedigna.
Vale ressaltar, que no presente estudo, as três cepas de origem ambiental provenientes
do município de Solonópoles não apresentaram variação genética que as diferenciasse dos
61
isolados clínicos. Contudo, somente após estudos mais aprofundados do genótipo desses
isolados, será possível determinar se as cepas clínicas e ambientais isoladas na mesma região
apresentam o mesmo padrão genotípico, confirmando especificamente o reservatório
ambiental de aquisição da infecção.
Essa observação seria de grande relevância, por fornecer respostas a fatores que ainda
não foram bem determinados. Assim, os estudos envolvendo isolados ambientais são de
fundamental importância por possibilitar correlações entre um determinado genótipo isolado
de pacientes e seu local de origem, no ambiente (FISHER et al., 2002b). Uma vez que, muitas
vezes é difícil determinar quando e onde o paciente foi inicialmente exposto, fato evidenciado
em alguns isolados que tiveram suas sequencias depositadas no Genbank e que foram
utilizados neste estudo, como discutido previamente.
62
8. CONCLUSÃO
1. A identificação molecular por PCR específica utilizando os primers Coi9-1F e Coi9-1R
confirmou a identificação de C. posadasii em todos os isolados analisados neste estudo;
2. O sequenciamento automatizado das regiões ITS1, 5,8S e ITS2 do DNA ribossômico
nuclear de C. posadasii confirmam a especificidade da técnica de PCR utilizada neste
estudo para a identificação molecular da espécie;
3. A análise filogenética das regiões ITS1, 5,8S e ITS2 do DNA ribossômico nuclear
mostrou que os isolados de C. posadasii apresentam menor variabilidade genética quando
comparadas com C. immitis Os agrupamentos obtidos revelam a formação de um cluster
diferenciado entre as cepas de C. posadasii do Ceará, formado pelas cepas CEMM 05-2-
063, CEMM 05-2-064, CEMM 05-2-065 e CEMM 05-2-066, aparentemente agrupadas de
acordo com sua região de origem.
4. Este é um estudo pioneiro no conhecimento de genótipos de cepas de C. posadasii do
Ceará, tendo como perspectiva que a genotipagem destes isolados, esclareça
questionamentos sobre temas importantes, como virulência, patogenicidade e ecologia.
63
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74
ANEXOS
75
ANEXO I
Protocolo para extração de DNA genômico de Coccidoides posadasii
Procedimento:
1. Cultivar as cepas em ágar Batata e incubar durante 6 dias a 35°C.
2. Após incubação, adicionar aproximadamente 3 mL de salina fisiológica a cada colônia e raspar suavemente a superfície do micélio;
3. Transferir as suspensões fúngicas para tubos de rosca e autoclavar em vapor fluente por 20 min, para inativação;
4. Retirar uma alíquota e inocular em caldo BHI, em seguida, incubar a 35°C durante 7 dias. Estocar o restante do micélio em freezer a -
20°C até a confirmação do processo de inativação;
5. Descongelar e transferir as amostras para microtubos devidamente identificados;
6. Centrifugar a 12 000 rpm por 5 min (4°C);
7. Descartar o sobrenadante;
8. Adicionar 1 mL de CTAB (pré-aquecido a 65°C);
9. Imediatamente adicionar 10µL de β-mercaptoetanol e levar ao vórtex por 10 segundos;
10. Incubar a 65°C por 1 h, invertendo os tubos de 10 em 10 min;
11. Esperar esfriar até chegar a temperatura ambiente;
12. Adicionar 600µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1);
13. Agitar manualmente por aproximadamente 5 min;
76
14. Centrifugar a 15000 rpm por 10 min (4°C);
15. Tranferir apenas o sobrenadante para outro microtubo devidamente identificado, e descartar o microtubo anterior;
16. Repetir os passos 12 ao 15 caso o sobrenadante apresente turvação;
17. Adicionar um volume igual de álcool isopropílico
18. Incubar em gelo por 5 min;
19. Centrifugar a 12 000 rpm por 4 min (4°C);
20. Descartar o sobrenadante deixando somente o pellet;
21. Adicionar 1mL de etanol 70%, homogeneizar invertendo os microtubos algumas vezes;
22. Centrifugar a 12 000 rpm por 4 min (4oC);
23. Descartar o sobrenadante;
24. Inverter os tubos em papel toalha e deixar secar por 10 min;
25. Resuspender o pellet de DNA em 100 µL de TE (pH 8) ou H2O bidestilada;
26. Estocar em freezer a -20oC.
77
ANEXO II
Protocolo para purificação de DNA (produtos de PCR)
Kit GFXTM
PCR DNA and gel band purification (GE Healthcare, USA)
Procedimento:
1- Transferir toda a amostra de reação de PCR para um microtubo de 2 mL e adicionar 500μL de tampão de captura tipo 2, misturando bem;
2- Transferir todo o volume para um microtubo contendo a coluna do filtro e dar spin de 30 segundos na centrifuga;
3- Descartar volume do microtubo e recolocar a coluna com o filtro no mesmo;
4- Adicionar 500μL de tampão de lavagem tipo 1 na coluna e dar spin de 30 segundos;
5- Transferir coluna com filtro para um novo microtubo;
6- Adicionar 50μL de tampão de eluição e dar spin por 1 minuto;
7- Descartar filtro;
8- Estocar a -20ºC.
78
ANEXO III
Protocolo para precipitação de DNA em placa de sequenciamento
Procedimento:
1- Com o auxílio de pipeta multicanal, adicionar 20μL de isopropanol 80% em cada poço da placa de sequenciamento;
2- Agitar vigorosamente por 20 segundos em vórtex;
3- Centrifugar placa por 50 minutos a 4ºC (4000 rpm);
4- Descartar isopropanol e dar spin invertido de 5 segundos na centrífuga;
5- Adicionar 45 μL de etanol 75% em todos os poços;
6- Centrifugar por 10 minutos a 20ºC (4000 rpm);
7- Descartar etanol e dar spin invertido de 5 segundos;
8- Deixar secar até que todo o álcool evapore (em torno de 15 minutos);
9- Adicionar 10 μL de loading solution (componente do kit de sequenciamento) em todos os poços da placa;
10- Adicionar 10μL de agarose 0.12% e agitar vigorosamente em vórtex por 20 segundos;
11- Estocar a -20ºC.
79
ANEXO IV
Alinhamento múltiplo das sequências da região 18S-28S do rDNA nuclear de isolados clínicos e ambientais de C. posadasii do
Nordeste brasileiro e de isolados de C. posadasii e C. immitis depositadas no Genbank.
80
81
82
83
84
85
ANEXO V
Número de acesso e descrição das amostras utilizadas para comparação e realização das análises filogenéticas
ACESSO DESCRIÇÃO LOCAL
AB232901.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa. CEPA:
IFM 54196 Japão
AB232900.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 54195
Japão
AB232899.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 54194
Japão
AB232898.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 51112
Japão
AB232895.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 50993
Japão
AB232892.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45817
EUA
AB232889.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45813
EUA
86
ACESSO DESCRIÇÃO LOCAL
AB232888.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45812
EUA
AB232887.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45811
EUA
AB232886.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45810
EUA
AB232885.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45809
EUA
AB232884.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 4945
EUA
AB232883.1 Coccidioides posadasii genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 4935
EUA
U18360.1 Coccidioides posadasii genes do RNA ribossomal, internal transcribed spacer 1, 5.8S,e internal
transcribed spacer 2, seqüência completa.
Canadá
87
ACESSO DESCRIÇÃO
EF186786.1 Coccidioides posadasii CEPA: CBS 113846, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial;
internal transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S
sequência parcial.
Arizona,
EUA
EF186785.1 Coccidioides posadasii CEPA: CBS 113843, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial;
internal transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S
sequência parcial.
Texas, EUA
X94142.1 Coccidioides posadasii gene da região ITS Arizona,
EUA
AB232897.1 Coccidioides immitis genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 50995 Japão
AB232894.1 Coccidioides immitis genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 50992
EUA
AB232893.1 Coccidioides immitis genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: 46868
Japão
AB232890.1 Coccidioides immitis genes 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, e 28S do rRNA, sequência parcial e completa.
CEPA: IFM 45815
EUA
88
ACESSO DESCRIÇÃO LOCAL
EF186790.1 Coccidioides immitisi CEPA: CBS 113857, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial; internal
transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S sequência
parcial.
Califórnia,
EUA
EF186789.1 Coccidioides immitisi CEPA: CBS 113856, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial; internal
transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S sequência
parcial.
México
EF186788.1 Coccidioides immitisi CEPA: CBS 113852, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial; internal
transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S sequência
parcial.
México
EF186787.1 Coccidioides immitisi CEPA: CBS 113851, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial; internal
transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S sequência
parcial.
Califórnia,
EUA
EF186783.1 Coccidioides immitisi CEPA: CBS 166.51, genes do RNA ribossomal: 18S sequência parcial; internal
transcribed spacer 1, 5.8S e internal transcribed spacer 2 sequências completas e 28S sequência
parcial.
EUA
89
PUBLICAÇÃO
90
In vitro synergistic effects of antituberculous drugs plus antifungals against
Coccidioides posadasii
International Journal of Antimicrobial Agents (Qualis B1)
91