CÂNCER DE COLO UTERINO - DIFICULDADES E …...MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTOS UNIVERSIDADE...

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTOS UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

Siderley de Souza Carneiro

CÂNCER DE COLO UTERINO - DIFICULDADES E NOVAS PERSPECTIVAS NO DIAGNÓSTICO DAS LESÕES PRECURSORAS

Orientador: Prof Dr. Joaquim Caetano de Almeida Netto Co-orientadora: Profa. Dra. Marise Amaral Rebouças Moreira

Dissertação de Mestrado

Goiânia – GO, 2003

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

Siderley de Souza Carneiro

CÂNCER DE COLO UTERINO - DIFICULDADES E NOVAS PERSPECTIVAS NO DIAGNÓSTICO DAS LESÕES PRECURSORAS

Orientador: Prof Dr. Joaquim Caetano de Almeida Netto Co-orientadora: Profa. Dra. Marise Amaral Rebouças Moreira

Dissertação submetida ao CPGMT/IPTESP/UFG como requisito parcial para obtenção do grau de mestre na área de concentração de Doenças Infecciosas e

Parasitárias

Goiânia – GO, 2003

Dedico a Deus, que em sua palavra me sustentou. “Os jovens se cansam e se fatigam, e os moços de exaustos caem, Mas os que esperam no Senhor renovam as suas forças, sobem com asas como águias, correm e não se cansam, caminham e não se fatigam.” Isaías, 40; 30-31

Também a minha mulher e meu filho pela paciência e incentivo, aos meus pais pelo apoio e dedicação

Agradecimentos

À Profa. Dra. Marise Amaral Rebouças Moreira, pelo apoio diário, na redação e inúmeras correções dos manuscritos. Ao Dr. Joaquim Caetano de Almeida Netto, pela maneira tranqüila com que dirige o trabalho até que os objetivos sejam atingidos. Ao Dr. Venâncio Avancini Alves, que realizou toda a imunohistoquímica do trabalho em seu serviço. Ao professor William R. J. Schaper (professor Bill) pela correção do texto em Inglês. À professoras doutoras Mariane Martins Araújo Stefani, Marise Amaral Rebouças Moreira e Regina Bringel Araújo Martins, pelas valiosas correções e sugestões por ocasião da qualificação da tese. À Fátima, Conceição, Ivanilde, Ana Kárita e Rosane, pela grande contribuíção no corte e coloração de lâminas, localizando blocos e em várias outras atividades.

ÍNDICE

Resumo 1

Abstract 2

Justificativa Apresentação

3 4

Artigo 1 – HPV e câncer do colo uterino Resumo Introdução O HPV Tipos de HPV HPV como agente etiológico do câncer cervical Mecanismos de oncogênese e o HPV Diagnóstico laboratorial da infecção por HPV e câncer cervical Diagnóstico precoce e estratégias de prevenção do câncer cervical Diagnóstico clínico baseado em técnicas de visualização Diagnóstico histopatológico e suas limitações Vacina O novo Papanicolaou Conclusão Abstract Referências bibliográficas

6 7 8 11 11 13 16 17 21 22 23 25 27 29 31

Artigo 2 - Hybrid Capture versus histopathologic diagnosis of cervical lesions in a routine clinical setting - Improving diagnostic accuracy with p16ink4 and MIB-1

Resumo Summary Introduction Material and Methods Results Discussion References

47 48 49 51 54 56 65

Considerações finais Referências bibliográficas

68 69

ÍNDICE DE TABELAS, QUADROS E FIGURAS

Artigo 1 – HPV e câncer do colo uterino

Quadro 1 - Características das principais técnicas de biologia molecular para diagnóstico de infecção por HPV.

Figura 1 - O genoma do HPV 16

30 10

Artigo 2 - Hybrid Capture versus histopathologic diagnosis of cervical lesions in a routine clinical setting - Improving diagnostic accuracy with p16ink4 and MIB-1

Table 1 - Histological diagnoses correlated with hybrid capture results. Table 2 - p16ink4 immunohistochemistry and histologic diagnoses. Table 3 - p16ink4 immunohistochemistry and Hybrid capture results in cases with IC. Table 4 - MIB-1 immunohistochemistry and histologic diagnoses. Figure 1 - Biopsy showing slight nuclear enlargement and perinuclear halos. No unquestionable change that could allow a diagnosis of LGSIL (a). P16ink4 was positive in one area of the biopsy(b). This case was positive for HR-HPV.

60 61 62 63 64

RESUMO

O câncer de colo uterino é um dos bons exemplos em oncologia, de

neoplasia prevenível, pela favorável combinação: órgão acessível e longo

período pré-invasor da neoplasia. Grandes programas de triagem populacional

e tratamento das lesões precursoras levaram a drástica redução na incidência

dessa neoplasia. Mesmo assim, o câncer cervical representa ainda cerca de

12% de todos os tumores femininos. Além da citologia, há várias

possibilidades de diagnóstico precoce, baseadas na pesquisa viral, por técnicas

como a captura híbrida. Da mesma forma, o conhecimento crescente a respeito

da oncogênese viral vem fornecendo oportunidades excelentes para aplicação

de novos marcadores a espécimes de biópsia e citologia. Entre eles têm

destaque o p16ink4, a ciclina E e o MIB-1. A vantagem desses marcadores

sobre a detecção viral resulta de sua capacidade de indicar transformação

celular produzida pelos oncogenes virais. Na segunda parte do presente

trabalho, os marcadores p16ink4 e MIB-1 foram aplicados em uma série de

biópsias e os resultados confirmaram a sua grande utilidade na elucidação

diagnóstica em casos de dúvida, dessa forma aumentando a sensibilidade da

biópsia. Em casos de lesões pre-neoplásicas em que a pesquisa viral foi

negativa, a positividade para esses marcadores corroborou o diagnóstico

histológico de lesão de alto grau, afastando a possibilidade de fatores de

confusão, como regenereção epitelial. Por outro lado, em casos cuja biópsia

apresentava alterações discretas, isuficientes para um diagnóstico de lesão pré-

neoplásica, a positividade para o p16ink4 teve forte correlação com o resultado

de pesquisa positiva para HPV do grupo de alto risco.

1

ABSTRACT

Cervical cancer is a good example in oncology of a preventable neoplasm.

This is the result of a favorable combination of an accessible target organ and

a relatively long pre-invasive period. Large screening programs resulted in

drastic reduction of cervical cancer incidence. However, it still comprises

12% of female cancers. Aside cytology, there are many other tests that allow

an early diagnosis, especially those based on molecular biology. Accordingly,

the growing knowledge of the oncogenic mechanisms provide excellent

opportunities for development of new markers the can be applied on biopsy

and cytology specimens, including p16ink4 and MIB-1. Their advantage over

viral detection results from their capacity of indicating cellular transformation

induced by viral oncogenes and not only viral presence. As part of this work,

p16ink4 and MIB-1 were applied in a series of biopsies and the results

confirmed their great utility allowing a more accurate diagnosis in cases of

difficulty and increasing the sensitivity of biopsy. In cases of pre-neoplastic

lesions in which the viral test was negative, positivity for these ruled out the

possibility of overdiagnosing a reactive lesion as a high-grade lesion. In cases

in which the biopsy showed slight changes, insufficient for a diagnosis of an

intraepithelial lesion, p16ink4 positivity had a strong correlation with a positive

viral test for high-risk HPV.

2

JUSTIFICATIVA O câncer do colo uterino é uma neoplasia ainda bastante freqüente em todo o

mundo, sendo a segunda mais freqüente em mulheres no Brasil, atrás apenas

do câncer de mama (Curado 2000). Diferente da grande maioria das

neoplasias, o câncer cervical tem um agente etiológico reconhecido – o

papilomavírus humano (HPV) (Walboomers et al. 1999, Munoz 2000). Além

disso, o processo neoplásico até o surgimento da doença invasora, percorre um

caminho, na maioria das vezes longo e relativamente bem conhecido (Stoler

2000). Esse processo começa com a infecção viral, que, em uma pequena

parcela dos casos, se torna persistente e, em alguns desses, pode levar a uma

transformação celular, traduzida por alterações morfológicas (nessas células

transformadas) que são reconhecidas na citologia e em material de biópsia

como lesões pré-neoplásicas. O tempo entre o surgimento das lesões pré-

neoplásicas e o desenvolvimento da neoplasia invasora pode variar bastante.

Embora na maior parte dos casos seja de poucos anos, em alguns casos pode

chegar a décadas (Crum 2000).

Diante desse quadro poder-se-ia imaginar que dispomos de elementos

suficientes para atingir um nível de controle eficaz do câncer cervical.

Entretanto, a realidade é ainda bastante diferente. Embora nos países

desenvolvidos amplos programas de prevenção, baseados em triagem

citológica e tratamento das lesões pré-neoplásicas, tenham reduzido

drasticamente a incidência dessa neoplasia, ela ainda leva à morte milhares de

mulheres todos os anos, sobretudo nos países em desenvolvimento. Como

agravante, uma pequena parcela dessas mulheres é submetida a exames

citológicos periódicos (Koss 1989). Paradoxalmente, entre outros fatores, a

redução do número de casos de câncer tornou mais evidente a limitação da

3

citologia, uma vez que se provou ser falsa a idéia difundida de que a

realização do exame de prevenção periódico garantiria total segurança de

ausência de câncer. Ganharam então grande enfoque os falsos-negativos da

citologia, que podem chegar a 20% para um único exame citológico. Isso,

entretanto não leva em conta que cada exame anual é um evento isolado. Em

conseqüência, em uma população alvo apropriada, o risco de se perder uma

alteração grave em três exames anuais consecutivos é de aproximadamente

1% (Stoler 2000).

APRESENTAÇÃO

No primeiro artigo, a história da prevenção do câncer cervical é rapidamente

lembrada, desde a introdução do método citológico pelo Dr. Georges

Papanicolaou, nos anos 20, até a descoberta do HPV como agente etiológico

nos anos 80. São apontadas ainda as conseqüências que o conhecimento de

uma etiologia viral têm gerado no desenvolvimento de novas técnicas para o

diagnóstico precoce e são discutidos os principais pontos de dificuldade

diagnóstica e as limitações dos principais métodos diagnósticos disponíveis.

O segundo artigo avaliou uma dessas novas técnicas, a captura híbrida (CH),

que é um teste de biologia molecular de alta sensibilidade para detecção do

HPV, comparando os seus resultados com os achados histopatológicos. Ao

mesmo tempo, marcadores imunohistoquímicos (p16ink4 e MIB-1) foram

empregados em algumas dessas biópsias, com a finalidade de avaliar a sua

importância, principalmente nos casos de dificuldade diagnóstica e naqueles

em que houve discordância entre os resultados da biópsia e da pesquisa viral.

Foi observada uma sensibilidade menor da CH, nas condições do trabalho.

4

Um dos principais fatores associados a essa menor sensibilidade foi o fato de,

em alguns dos casos, a CH ter sido realizada após a biópsia. Os marcadores

imunohistoquímicos, p16ink4 e MIB-1, mostraram-se úteis nos casos de lesão

de alto grau negativos para HPV de alto-risco, tendo sido positivos em todos

os 3 casos em que esses marcadores foram empregados. Esse fato é de

importância, uma vez que lesões de alto grau podem ser de difícil diagnóstico

diferencial com alterações regenerativas, atrofia e/ou inflamação (Jovanovic et

al. 1995, De Vet et al. 1990-1992). O p16ink4 mostrou-se valioso ainda em

casos com alterações discretas na biópsia. Nesses casos, a positividade para

esse marcador apresentou forte correlação com positividade para HPV de alto-

risco na CH.

5

HPV e câncer do colo uterino*

Siderley de Souza Carneiro1, Marise Amaral Rebouças Moreira2 e Joaquim

Caetano de Almeida Netto3

Resumo

O câncer de colo uterino é um dos raros exemplos, de neoplasia

prevenível. Desde a década de 20, quando o Dr. Georges Papanicolaou criou a

citologia, amplos programas de triagem populacional e tratamento de lesões

precursoras, levaram a drástica redução na incidência dessa neoplasia. Esse

avanço, todavia, não foi suficiente para impedir que o câncer de colo uterino

represente ainda cerca de 12% de todos os tumores femininos. A existência de

agente etiológico viral bem definido, o HPV (papilomavirus humano) e o

grande avanço recente da biologia molecular, têm proporcionado novas

possibilidades de diagnóstico precoce, baseado na pesquisa viral, por novas

técnicas como a captura híbrida. Também bastante promissora é a

possibilidade de desenvolvimento de uma vacina anti-HPV eficaz, para os

próximos anos.

* Submetido à Revista de Patologia Tropical para publicação.

Unitermos: Câncer de colo uterino. papilomavirus humano. Oncogênese.

Prevenção e controle.

1 - Mestrando em Medicina Tropical, do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da

UFG-GO.

2. Professora Doutora, Chefe do Departamento de Patologia e Imagenologia da FM-UFG.

3. Professor Doutor, do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical IPTSP - UFG.

Endereço para correspondência: Av. Tocantins, 1293, Setor Aeroporto, CEP 75075-100

Goiânia - Goiás - Brasil

6

INTRODUÇÃO

O câncer de colo uterino é uma neoplasia que ainda apresenta um

impacto devastador em todo o mundo (12% de todos os tumores femininos),

com uma incidência de mais de 500.000 casos anuais [85], situando-se em

segundo lugar como câncer mais fatal, ainda é o mais importante em alguns

países em desenvolvimento. Em vários países, inclusive no Brasil, o

carcinoma de colo uterino deixou de ser o câncer mais freqüente (posição

ocupada pelo carcinoma mamário) graças à implantação de programas de

prevenção baseados na triagem citológica em massa da população e

tratamento das lesões precursoras (Instituto Nacional do Câncer – INCA

2002).

Em Goiânia o carcinoma mamário ultrapassou em freqüência o câncer

cervical a partir de 1992 [21]. De acordo com os dados mais recentes

disponíveis, o coeficiente de incidência bruto de câncer de colo uterino em

1997 foi de 19,47 por 100.000 habitantes, tendo sido responsável por 69

mortes no mesmo ano [21].

A grande maioria dos cânceres cervicais é representada por carcinomas

escamosos. Dentre os carcinomas não escamosos (CNE), os principais tipos

são adenocarcinomas, tumores de colisão (adenocarcinoma associado a

carcinoma escamoso) e carcinomas adenoescamosos [14, 90]. Os CNE em

Goiás nos últimos 15 anos têm mantido uma freqüência constante de 12% dos

carcinomas de colo operados no Hospital Araújo Jorge (hospital de câncer), o

que representa aproximadamente um caso novo a cada 20 dias (Moreira,

comunicação pessoal).

7

O câncer cervical tem algumas características peculiares em relação a

outros tipos de neoplasia. A primeira delas é o fato de ser uma doença de

longa evolução, podendo ser detectada em fases precoces, antes de apresentar

todas as propriedades que definem o fenótipo maligno (invasão e metástase)

[20, 85]. A segunda característica é a existência de um agente etiológico

infeccioso conhecido, o papilomavírus humano (HPV) [58, 96]. Essas

peculiaridades proporcionam oportunidade única em relação à prevenção

dessa doença. A citologia vaginal (Papanicolaou) é um dos recursos mais

importantes já disponibilizados em medicina preventiva. Este teste foi criado

pelo médico grego Georges Papanicolaou, e é considerado um dos avanços

mais significativos no controle de câncer, tendo contribuído para reduzir em

mais de 70%, em alguns países, a mortalidade por câncer de colo uterino [37].

É um método simples e de baixo custo, capaz de diagnosticar as lesões

precursoras do câncer cervical, as quais podem ser tratadas e eliminadas antes

de evoluir para neoplasia invasora [95]. A existência de um agente etiológico

viral implica também na possibilidade de aplicação de outros métodos

diagnósticos específicos, baseados na pesquisa de DNA viral [86], bem como

na perspectiva do desenvolvimento de uma vacina [46].

O HPV

O HPV possui como genoma uma molécula de DNA de fita dupla,

circular, com aproximadamente 8000 nucleotídeos. É um vírus pequeno, com

cerca de 55 nm de diâmetro [82].

O genoma viral apresenta oito a dez genes e uma região não codificante

(NCR – non-coding region). Duas proteínas que compõem o capsídeo são

8

codificadas por genes das chamadas regiões tardias, L1(“L”do Inglês Late) a

principal e L2 a secundária. A região E (“E”do Inglês early) apresenta os

genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7 que codificam as respectivas proteínas (Fig. 1)

[11] .

Os papillomavirus infectam apenas os humanos. O vírus exibe também

tropismo tecidual, infectando quase exclusivamente epitélios escamosos,

como a pele e as mucosas [93].

Quando o HPV é transmitido, ele entra nas células epiteliais pela camada

basal e produz duas categorias de alterações epiteliais que são importantes

para a classificação diagnóstica. A primeira alteração é o efeito citopático

viral, ou coilocitose, que ocorre nas células maduras, terminalmente

diferenciadas e incapazes de se dividir. Esse efeito é resultado da ocorrência

do ciclo de replicação viral, e é facilitado pela maturação epitelial. A segunda

alteração é uma anormalidade no crescimento e diferenciação celulares, que

tem origem nas células basais e parabasais, com capacidade de multiplicação

[20].

9

Figura 1. O genoma do HPV 16 [93].

Os genomas de HPV podem ser encontrados como epissomos no núcleo

de células infectadas, que não apresentam alterações morfológicas. Entretanto,

em algumas lesões de baixo grau e na maioria das lesões de alto grau,

incluindo câncer, os genomas de HPV são integrados ao da célula hospedeira

[50]. A ruptura da região E1-E2 resulta em expressão aumentada e

estabilização dos transcritos de E6 e E7 e é necessária para a integração do

genoma viral [41].

10

Tipos de HPV

Somente quando técnicas de biologia molecular tornaram-se disponíveis,

os diferentes tipos de HPV puderam ser identificados. Estes diferem não

apenas em suas seqüências genômicas, mas também pelas manifestações

clínicas que produzem. Alguns tipos têm maior tendência para infectar a pele

e outros as mucosas; apenas um limitado número é considerado como de

potencial oncogênico [11].

Em 1995, no “Workshop” internacional sobre HPV, foi definido o

critério atualmente aceito para caracterização de novos tipos de HPV. Uma

diferença maior que 10% na região L1 do genoma permite a classificação de

um tipo diferente de HPV [5, 48]

Até hoje mais de 120 tipos de HPV foram identificados [34]. Apesar do

grande número de tipos virais, apenas um limitado número (cerca de 40) é

considerado como de importância, por infectar o trato anogenital e ser

encontrado em carcinomas. Os principais vírus nessa categoria são os tipos 16,

18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59 e 69, considerados de alto risco para

câncer cervical. Os tipos 6 e 11 são encontrados em verrugas genitais

(condiloma acuminado), constituindo o grupo considerado de baixo risco [48]

HPV como agente etiológico do câncer cervical

É antiga a idéia de que o câncer cervical esteja associado a agentes

infecciosos, uma vez que, epidemiologicamente, a doença comporta-se como

sexualmente transmissível. Um dos primeiros agentes infecciosos implicados

foi a trichomonas vaginalis [77], isso na década de 60. Nos anos 70 o vírus do

11

herpes simples foi considerado um carcinogênico cervical [4]. No final da

década de 70, início dos anos 80, o HPV começou a ser incriminado na gênese

do câncer de colo uterino, em parte devido ao surgimento de técnicas de

biologia molecular que permitiram sua identificação [53, 89].

Em 1995, a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC),

reconheceu que havia evidências suficientes para categorizar os HPVs tipo 16

e 18 como carcinogênicos humanos, sendo as evidências existentes ainda

insuficientes para se concluir a respeito de outros subtipos de HPV [58]. O

Estudo Biológico Internacional em Câncer Cervical, realizado em 1999, que

utilizou material coletado em 22 países, relatou uma prevalência mundial de

93% de HPV nos cânceres cervicais invasores. O estudo afirma ainda que a

negatividade de 7% dos casos poderia ter sido decorrente tanto da ausência de

HPV, quanto de resultado falso negativo dos testes. Quando a reação em

cadeia de polimerase (PCR) foi realizada nos casos em que havia disponível

material congelado do câncer cervical, a positividade para HPV-DNA foi de

99,7%. Esse dado permitiu que se afirmasse que o HPV é, definitivamente, um

agente necessário para a carcinogênese cervical [96].

A infecção por HPV é bastante freqüente em mulheres com menos de 25

anos. Na grande maioria, porém, o vírus é eliminado em uma média de 8

meses. Essa eliminação é conseqüência da resposta imunológica que também

leva à regressão espontânea de mais de 80% das lesões de baixo grau em

menos de 2 anos. Em alguns casos, entretanto, o vírus persiste e é a

persistência viral o fator isolado mais importante relacionado a progressão da

infecção para lesão de alto grau [69]. Mesmo assim, apenas uma fração das

pacientes com infecção persistente pelo HPV desenvolve câncer cervical,

indicando que o vírus sozinho, sem a participação de outros fatores (co-

fatores) não é suficiente para causar câncer do colo uterino. Entre esses co-

12

fatores incluem-se: multiparidade [59], tabagismo [3, 54], uso de

anticoncepcionais [75], deficiências nutricionais, co-infecção por chlamydia

trachomatis [76] e outros.

Mecanismos de oncogênese e o HPV

As células cancerosas, crescem de maneira desregulada, em

conseqüência da aquisição seqüencial de mutações somáticas em genes que

controlam o crescimento e a diferenciação celulares ou que mantêm a

integridade do genoma [19]. As mutações podem ser produzidas por agentes

ambientais (radiação e produtos químicos) ou por elementos produzidos

durante o metabolismo celular normal (radicais livres derivados do oxigênio).

Embora o mecanismo mais comum de mutagênese provavelmente esteja

relacionado com erros espontâneos na replicação e reparo do DNA, a maioria

desses erros não tem conseqüência importante. Por sua vez, os agentes que

produzem mutações em genes regulatórios são potencialmente

carcinogenéticos. Esses genes, que são os principais envolvidos na patogenia

do câncer, são os oncogenes, genes supressores de tumores (anti-

oncogenes) e genes que regulam a apoptose [71].

Oncogenes são derivados de proto-oncogenes, genes celulares que

promovem o crescimento e o desenvolvimento normais. Quando, por

exemplo, uma seqüência de DNA viral é inserida próximo ao proto-oncogene,

ele pode ser convertido em um oncogene celular. O produto de um oncogene é

a oncoproteína. As oncoproteínas são semelhantes ao produto normal dos

proto-oncogenes, exceto por não terem papel regulatório importante e por sua

produção não depender de fatores celulares ou outros sinais externos, não

13

sendo assim controlada por mecanismos de retroalimentação [9]. Alguns

exemplos de oncogenes são as ciclinas e as cinases dependentes de ciclinas,

que são proteínas que estimulam a progressão do ciclo celular [19].

Enquanto os proto-oncogenes codificam proteínas que promovem

crescimento, os anti-oncogenes têm ação antagônica, sendo responsáveis por

interromper o crescimento celular. Exemplos dessa categoria são o gene do

retinoblastoma e o gene p53 (o mais freqüente alvo de alteração genética em

tumores humanos) [66]. A perda de função desses genes é um evento essencial

na oncogênese humana. O gene do retinoblastoma codifica uma proteína

(pRb) que constitui uma barreira no ciclo celular, na passagem da fase G1 para

a fase S [106]. Já o p53 é responsável pelo policiamento constante da célula,

aumentando rapidamente a expressão da proteína p53 quando há agressão ao

material genético, estimulando a expressão de uma série de genes que

medeiam tanto a paralisação do ciclo celular, como a indução da apoptose e o

reparo do DNA [66].

Por último, entre os genes que regulam a apoptose, destacam-se os

genes bcl-2, c-myc e bax. O bcl-2 inibe a apoptose, enquanto o bax e o c-myc

a estimulam [26, 66, 100].

A ação oncogênica dos HPVs de alto risco é decorrente da síntese de

algumas proteínas, que são chamadas oncoproteínas virais, com destaque para

E6 e E7. A oncoproteína E5 parece não ter papel na oncogênese humana, uma

vez que não é expressa nos tumores, devido à ruptura do genoma viral, quando

ele se torna integrado aos cromossomas celulares. Apesar disso, as ações

celulares da proteína E5 podem ser fundamentais na preparação para a

transformação celular, quando então as funções das proteínas E6 e E7,

tornam-se mais importantes [52]. Essas duas oncoproteínas possuem

atividades estimuladoras de crescimento e de transformação celular,

14

interferindo com a ação de alguns dos genes citados anteriormente. As

proteínas E6 e E7 são consistentemente expressas em células malignas de

canceres cervicais que carregam HPV-DNA. Elas são capazes de imortalizar

células humanas, agindo cooperativamente ou mesmo individualmente [57,

107].

A proteína E6 tem a capacidade de ligar-se à proteína p53, degradando-a

e assim desempenhando ação anti-apoptótica [27]. Ela também pode levar a

instabilidade cromossômica e potencializar a integração de DNA viral e a

mutagenicidade [36, 98]. Já a proteína E7 tem capacidade de ligar-se à

proteína do retinoblastoma, inativando-a e liberando a ação do E2F, que é

ativador de promotores de genes que codificam sinais positivos de

crescimento celular, como c-myc e n-myc [32]. O resultado é a liberação da

ação estimuladora dos produtos desses genes sobre a progressão do ciclo

celular. A E7 também é capaz de ativar a transcrição do E2F de maneira

independente da proteína do retinoblastoma e de ativar as ciclinas E e A [40],

além de poder levar a super-expressão das proteínas p16 [43] e p73 [10].

Outra possível ação da proteína E7 seria a de inibir, em camundongos, a ação

de células T CD8+ [91], contra células epiteliais infectadas. De fato, o HPV

parece ter uma grande capacidade de evitar ou subverter a resposta imune do

hospedeiro [92].

Apesar de todos os avanços no conhecimento, a patogênese molecular do

câncer causado pelos HPVs de alto risco ainda não é completamente

conhecida. Muitas lacunas no conhecimento devem ser preenchidas até a

completa elucidação dos mecanismos de oncogênese do HPV.

15

Diagnóstico laboratorial da infecção por HPV e câncer cervical

A grande importância de se diagnosticar a infecção por HPV decorre, de

seu papel, hoje reconhecido, como agente etiológico do câncer cervical. Dessa

forma, o diagnóstico da infecção não pode ser separado do diagnóstico da

neoplasia. Esse diagnóstico pode ser feito clinicamente, naqueles poucos casos

em que a infecção produz lesões macroscópicas, como o condiloma em um

extremo, e o carcinoma invasor no outro. Os principais métodos laboratoriais

disponíveis são a citologia, a histopatologia e os métodos de biologia

molecular. A imunohistoquímica e a sorologia têm pouca aplicação na prática

clínica atualmente [12].

Quando o Dr. Georges Papanicolaou criou a citologia, no final da década

de 20, seu objetivo era apenas avaliar as alterações endócrinas no trato genital

feminino [84]. O primeiro diagnóstico citológico de câncer foi feito, por

acaso, em 1925, em uma funcionária do “New York Women’s Hospital” [63].

Naquela época, ele não podia imaginar o enorme potencial do método que

acabara de criar. Esse método permite, além do diagnóstico de câncer, a

identificação do efeito citopático do HPV (coilocitose) e, ainda, o que é mais

importante, das transformações celulares pré-neoplásicas causadas pelos

HPVs oncogênicos. Como o HPV é encontrado em praticamente todos os

casos de carcinoma ou de lesões pré-neoplásicas, um diagnóstico citológico de

carcinoma ou de lesão intra-epitelial significa, também, em um diagnóstico de

infecção por HPV [105].

A histopatologia permite um diagnóstico preciso das lesões pré-

neoplásicas. Existem, entretanto, lesões de difícil interpretação. Essas são

principalmente as que exibem alterações discretas, ou que se apresentam

associadas a atrofia ou regeneração epitelial [42, 67].

16

Além desses métodos convencionais, há vários métodos de biologia

molecular disponíveis como “Southern blotting”, “dot blot”, hibridização “in

situ” com filtro (FISH), hibridização “in situ’, PCR e captura híbrida. Os dois

últimos apresentam alta sensibilidade e especificidade, embora a PCR

apresente ainda problemas em relação à padronização da técnica e à

automação (Quadro I). Por permitirem a tipagem viral, essas técnicas têm

contribuído muito na identificação dos tipos virais considerados de alto risco,

ou seja, aqueles encontrados em carcinomas [87]. A captura híbrida é capaz

ainda de determinar a carga viral. Uma alta carga viral é associada a maior

risco de desenvolvimento de lesão intraepitelial e câncer [87].

Diagnóstico precoce e estratégias de prevenção do câncer cervical

Não existem dúvidas de que programas de prevenção bem organizados,

baseados em citologia, têm sido efetivos em reduzir a incidência de câncer

cervical e a mortalidade dele advinda. Há um potencial de redução de

incidência de 60-90%, em 3 anos após o início da triagem e tratamento das

lesões pré-neoplásicas [1, 22, 72]. Todavia, o grande sucesso e a drástica

redução da incidência do câncer cervical, trouxeram consigo uma

conseqüência paradoxal. Passaram a merecer a atenção, não apenas do meio

médico, mas também da imprensa leiga, os casos falsos negativos da citologia

[45]. Há relatos de 47% de cânceres invasores em mulheres com triagem

citológica aparentemente adequada [72]. Uma redução ainda maior na

incidência da doença provavelmente requeira a adoção de um conjunto de

17

medidas que possibilitem uma identificação mais acurada das lesões

precursoras.

A eficiência dos métodos de biologia molecular e sua conveniência,

levaram muitos a considerar seriamente sua utilização (principalmente a

captura híbrida) em programas de prevenção de câncer cervical, até mesmo

com potencial para substituir a triagem citológica [47]. A favor dessa opinião

estão relatos de que a detecção de HPV-DNA em pacientes com citologia

normal, principalmente a infecção persistente por HPV do grupo de alto risco,

estaria associada a um risco relativo aumentado de câncer cervical, em relação

a controles com citologia e HPV-DNA negativos [97, 103]. Uma carga viral

elevada estaria associada a um risco maior de lesões intraepiteliais [87].

Estudos epidemiológicos demonstram que um teste positivo para HPV-DNA

de alto-risco é o fator de risco independente mais poderoso para o

desenvolvimento de lesões intraepiteliais e câncer invasor [49]. Os dados

indicam que um teste de HPV negativo, com sensibilidade adequada, colocaria

a paciente em um risco tão baixo que a triagem citológica não seria justificada

[31]. A captura híbrida teria a capacidade de fornecer essa segurança uma vez

que tem sensibilidade e valor preditivo negativo próximos de 100% e valor

preditivo positivo de 66,7% [49].

É certo que os métodos de biologia molecular são úteis no diagnóstico

precoce e na prevenção do câncer cervical. Seu papel, entretanto ainda está

por ser definido. Várias considerações a esse respeito devem ser feitas. Uma

delas é a de que, se por um lado, o HPV é encontrado em todos os carcinomas

e lesões precursoras, a prevalência geral do vírus na população é bastante alta

(cerca de 20% nos Estados Unidos) [85], sendo HPVs do grupo de alto risco

encontrados em até 14% de mulheres normais, ou seja, nas que não se

encontra carcinoma nem lesão pré neoplásica; portanto, se nosso objetivo final

18

é o diagnóstico de lesões pré-neoplásicas (lesões de alto grau), e não o de

infecção viral, a aplicação em massa de testes como a captura híbrida, implica

em se obter uma taxa bastante alta de falsos positivos, na medida em que

detecta até 14% de pacientes com vírus mas sem lesão [13, 47]. Essas

pacientes, além de sofrerem com o estigma de um diagnóstico de doença

sexualmente transmissível, com risco para câncer, poderiam ser levadas a

procedimentos diagnósticos e terapêuticos desnecessários, como a colposcopia

[31].

Em estudo realizado na cidade de São Paulo em 1998, incluindo 1.430

mulheres, a prevalência de HPV foi de 13,8%, pela técnica de PCR [28]. A

prevalência varia muito de acordo com a idade. Em mulheres jovens e

sexualmente ativas, HPV-DNA pode ser encontrado em até 70% das pacientes

[39]. Nessas, a maioria das infecções é transitória, nem sempre levando ao

desenvolvimento de lesões intraepiteliais e raramente levando a infecção

persistente [88, 99]. A partir dos 35 anos, a prevalência de lesões de alto grau

se reduz. Por sua vez, após os 50 anos a prevalência de infecção por HPV é

baixa. Nessa faixa etária, todavia, há alguns fatores que contribuem para

aumentar a taxa de falsos negativos da citologia [37, 49].

As propostas de utilização racional da pesquisa viral na prevenção do

câncer cervical devem levar em consideração esses fatores e, talvez, eleger

populações e situações específicas em que a citologia e a pesquisa viral

possam ser usadas em conjunto. Dentre as várias propostas estão aquelas mais

radicais, que propõem a adoção da pesquisa viral como o método único de

triagem [13, 47], até aquelas que sugerem o seu uso como método auxiliar nos

casos de dúvida na interpretação do exame citológico [6, 18] ou em mulheres

com lesões de baixo grau, direcionando à colposcopia apenas aquelas com

vírus do grupo de alto risco [2, 74].

19

Pacientes com um diagnóstico citológico de atipias escamosas de

significado indeterminado (ASCUS), são freqüentemente referidas à

colposcopia. A pesquisa viral poderia ser usada eficientemente para

encaminhar à colposcopia apenas aquelas pacientes que tivessem teste

positivo (HPV do grupo de alto risco) [78, 94] . Segundo o atual consenso, a

conduta preconizada para as pacientes com ASCUS na citologia depende de

como o teste for sub-categorizado, ou seja, células escamosas atípicas de

significado indeterminado (ASC-US), ou células escamosas atípicas não sendo

possível afastar lesão de alto grau (ASC-H). Mulheres com ASC-US,

poderiam ser conduzidas mediante um programa que consiste na coleta de

duas citologias repetidas, colposcopia imediata ou teste de DNA, sendo esse o

preferido, caso a citologia líquida tenha sido o método de triagem usado. As

pacientes com ASC-H, lesão de baixo ou alto grau, devem ser imediatamente

referidas à colposcopia [101]. Existem ainda alterações citológicas menores,

como a paraqueratose, que não são suficientes para um diagnóstico de lesão de

baixo grau, nem se enquadram nos critérios de ASC-US, mas têm sido

relacionadas a um maior índice de lesões de baixo grau na biópsia [104]. A

pesquisa viral poderia ser aplicada, auxiliando na elucidação desses casos, que

são freqüentes na prática diária.

Um trabalho com metodologia de simulação em computador, com base

em dados da história natural do câncer cervical, concluiu que o máximo em

ganho de anos de vida com o menor custo seria conseguido combinando-se

triagem por pesquisa viral e citologia a cada 2 anos, sem limite superior de

idade. Esse mesmo trabalho afirma ainda que se o preço da captura híbrida

fosse reduzido a U$5, ela passaria a ser o método de eleição [51]. Um

problema em relação ao mesmo trabalho, foi o fato de ter considerado o

20

diagnóstico de ASCUS como negativo, o que reduz bastante a sensibilidade da

citologia, favorecendo ao mesmo tempo a pesquisa viral.

Diagnóstico clínico baseado em técnicas de visualização

Há vários métodos propostos para auxiliarem na triagem do câncer

cervical, com a finalidade de diminuir o número de falsos negativos pela

citologia. Entre esses estão, desde os mais simples como a inspeção visual

direta (IVD), até métodos complexos capazes de melhorar a visualização

direta do colo como a cervicografia, ou métodos biofísicos como a sonda polar

(polarprobe) [68].

A IVD consiste em lavar o colo uterino com uma solução de ácido

acético (vinagre) e então inspecioná-lo a olho nu, ou com uma lente de

aumento, na tentativa de identificar áreas aceto-brancas, que freqüentemente

correspondem a lesões intraepiteliais. Esse método está sendo avaliado como

uma alternativa à citologia em regiões com baixos recursos financeiros.

Alguns trabalhos têm mostrado uma sensibilidade semelhante à da citologia,

mas com baixa especificidade [102]. A cervicografia é uma fotografia

padronizada do colo uterino, que fornece duas imagens que são analisadas em

centros de referência por colposcopistas especializados. Os estudos que a

avaliaram apontam sensibilidade maior que a da citologia [17, 62]. Outro

método de visualização direta é a especuloscopia. Essa é uma variação da

colposcopia que combina a aplicação de ácido acético e uma luz

quimioluminescente azul-branca, para exame do colo. Há relatos de que

associada à citologia, a especuloscopia aumente a detecção de lesões cervicais

[8]. A sonda polar (polarprobe) é um dispositivo portátil optoeloetrônico, que

diferencia tecidos com base em suas características elétricas e ópticas. O

21

dispositivo é aplicado diretamente ao colo e a leitura é feita com o auxilio de

um computador portátil [68]. Há poucos trabalhos disponíveis mas que

apontam razoável concordância com a colpohistologia [16, 79].

O diagnóstico histológico e suas limitações

A histologia é considerada a base para o tratamento e seguimento de

alterações identificadas pela citologia, além de representar o padrão ouro nos

estudos de patologia cervical. Entretanto, vários fatores contribuem para a

ocorrência de variações diagnósticas entre observadores, principalmente nos

casos com alterações mais discretas [65]. Em um estudo de 124 espécimes de

biópsia, avaliadas por 5 patologistas, o diagnóstico variou de benigno a

displasia em 52% dos casos [33]. Alguns dos fatores que contribuem para essa

variação são a aplicação inconsistente de critérios diagnósticos e a existência

de alterações que simulam lesões pré-neoplásicas glandulares e escamosas

[24, 25, 70]. Tem sido proposta a utilização de marcadores biológicos: Ki-67,

ciclina E e p16ink4 [65, 73], para auxiliar na classificação das lesões cervicais

pré-neoplásicas e sua distinção das alterações epiteliais não neoplásicas. Esses

marcadores têm como vantagem sobre a detecção viral o fato de apontarem

transformação celular e não apenas infectação viral. O antígeno de

proliferação celular Ki-67, identificado pelo anticorpo MIB-1, é capaz de

realçar células em atividade de replicação. Ele é normalmente expresso em

células das camadas basal e parabasal do epitélio escamoso. Em epitélios

displásicos, entretanto, pode haver células positivas em camadas mais

superficiais [65]. Por sua vez, a super-expressão do p16ink4 (um inibidor de

cinase dependente da ciclina) parece ser um bom marcador de ativação

22

desregulada induzida pelos oncogenes E6-E7 do HPV [43]. A oncoproteína

E7 inativa o pRb, que é inibidor da transcrição do gene p16ink4 , levando assim

a sua super-expressão [44]. A utilização desses marcadores pode ser de grande

utilidade, nos casos de dúvida diagnóstica, com vantagens sobre a detecção

viral por métodos como a CH, que, se usada com essa finalidade, teria que ser

colhida após a realização da biópsia. No trabalho que avaliou a concordância

entre os resultados da CH e de biópsias (segundo artigo dessa dissertação), o

principal fator associado à CH negativa em pacientes com diagnóstico

histológico de LIE, foi o fato de o material para a CH ser colhido após a

realização da biópsia. A detecção viral por PCR não teria essa limitação, por

poder ser aplicada ao material do bloco de parafina. Seu custo, todavia, é

bastante superior ao dos marcadores imunohistoquímicos.

Vacina

Uma vacina anti-HPV eficaz, virtualmente eliminaria a necessidade de

um programa de triagem citológica ou por outros métodos. Esse seria um

exemplo único na medicina de vacina contra câncer. Um dos fatores limitantes

para o desenvolvimento de tal vacina era a falta de uma fonte abundante de

antígenos virais, uma vez que não há um sistema apropriado de se cultivar o

HPV. Hoje, entretanto, através de métodos recombinantes são produzidas as

proteínas L1 e L2 do capsídeo viral [15, 29, 30, 38, 56]. Embora todas as

proteínas virais tenham potencial para serem usadas em uma vacina, essas

duas seriam capazes de evocar a produção de anticorpos neutralizantes. Uma

vacina composta pela proteína principal L1 do capsídeo viral está atualmente

em teste (fase I e II).

23

Recentemente foi encontrada, em doadores de sangue saudáveis, alta

freqüência de células T-helper de memória específicas para a proteína E2 do

HPV, sugerindo que um “boosting” dessa imunidade poderia ser usado com

finalidades terapêuticas ou preventivas [23].

Vacinas baseadas nas oncoproteínas E6 e E7 provaram ser imunogênicas,

mas a sua eficácia não pode ainda ser demonstrada em ensaios clínicos [81].

Vacinas baseadas nessas proteínas tem a finalidade de induzir resposta imune

citotóxica CD8+ que lisa células infectadas ou suprime expressão de RNA

viral. Em um estudo pré-clínico, modelos de tumores expressando HPV 16

foram eliminados com uma vacina baseada em peptídios longos derivados da

proteína E7 [108].

Uma vacina contra o HPV 16 foi testada em um grupo de 2.392 mulheres

jovens nos Estados Unidos. Metade das pacientes recebeu a vacina e a outra

metade placebo. Entre as mulheres que receberam apenas placebo, a

incidência de infecção persistente pelo HPV 16 foi de 3,8 por 100

mulheres/ano, enquanto que no grupo que recebeu a vacina a incidência foi 0

(eficácia de 100%) [46].

Esses avanços e o grande esforço que ainda vem sendo empreendido,

indicam que o desenvolvimento de uma vacina anti-HPV pode ser uma

perspectiva real em um futuro próximo. Caso isso se concretize, poder-se-á

considerar seriamente a possibilidade de que um dia o câncer de colo uterino

seja erradicado.

24

O novo Papanicolaou

O exame de Papanicolaou permanece praticamente sem inovações

técnicas desde sua introdução, apesar de tentativas de melhora da técnica

citológica, como: o uso de produtos que causam despolimerização química do

muco cervical [83]; um método de sedimentação por velocidade [61] ou outro

por lavagem em pulso [60]. Há cerca de dez anos, surgiu a técnica da citologia

baseada em meio líquido, em que o material colhido com uma escova é

colocado em um líquido preservativo. Uma monocamada de células é então

depositada na lâmina a partir de uma suspensão. O esfregaço preparado por

essa técnica teria melhor representatividade, com menos material de fundo na

lâmina, o que facilitaria a avaliação. Tudo isso tornaria a análise mais

confiável e rápida por parte do pessoal do laboratório [35]. Entre os produtos

atualmente disponíveis no mercado estão: AutoCytePrep, CYTOSCREEN,

LABONORD, ThinPrep e Dna Citoliq.

A citologia líquida tem ganhado cada vez mais espaço, sendo utilizada

em larga escala em alguns centros. Sua avaliação, entretanto, em comparação

com a citologia convencional, ainda é motivo de discussão, com seus

defensores fervorosos e os céticos [55]. A citologia é um método de triagem

de câncer cervical. O melhor parâmetro para avaliação de uma nova técnica de

triagem de câncer, seria estabelecer se a mesma é capaz de levar a redução da

incidência, morbidade e/ou mortalidade pela neoplasia. Se essas informações

ainda não estão disponíveis, então outras podem ser utilizadas, como melhora

na sensibilidade, com detecção de mais lesões precursoras. Isso, entretanto, só

levaria a melhora das medidas de resultado anteriormente citadas, se a

detecção adicional resultar em tratamento precoce, em um intervalo que

25

reduza a incidência, a morbidade e/ou a mortalidade. Não pode ser

automaticamente inferido que detecção mais precoce resulte em melhora nas

medidas de resultado [64]. Outros fatores a serem considerados são a melhora

na especificidade (que diminuiria a necessidade de repetição dos testes) e a

diminuição no tempo de exame das lâminas.

Não há ainda na literatura estudos randomizados que incluam o câncer

invasor ou a mortalidade como parâmetros de avaliação [64]. A maioria dos

estudos compara a sensibilidade da citologia em meio líquido com a

convencional, usando a avaliação histológica como padrão ouro. Existem,

entretanto, algumas evidências de que a citologia líquida possa reduzir a

proporção de espécimes inadequados, melhorar a sensibilidade do teste e

reduza o seu tempo de interpretação [80]. Os estudos usando modelos em

computador, sugerem que a citologia líquida, por essas vantagens acima

referidas, possa contribuir para o diagnóstico precoce e assim reduzir a

incidência de câncer invasor [64]. Esse método oferece ainda a possibilidade

de utilização de marcadores como o p16ink4 ao material citológico nos casos de

dificuldade diagnóstica [7].

26

Conclusão

O conhecimento a respeito do câncer de colo uterino e de seu agente

etiológico, o HPV, avançou de maneira impressionante nos últimos anos,

principalmente em decorrência da utilização de técnicas de biologia

molecular. Entretanto, um exame simples, barato e com mais de 50 anos - a

citologia - permanece como o principal avanço até hoje, no combate a essa

doença, tendo reduzido dramaticamente sua incidência e mortalidade.

Infelizmente, não foi suficiente para eliminá-la. Entretanto, a maior parte dos

cânceres cervicais nos Estados Unidos não ocorre em mulheres que realizam

citologias periódicas, como parte de um programa de prevenção regular. Por

esse motivo, mesmo naquele país, a utilização de métodos de triagem mais

sensíveis, ou mesmo a melhora da sensibilidade da citologia, teria efeito

limitado e apenas sobre essa parcela menor da população [85]. Em países

como o Brasil, uma fração ainda menor da população é adequadamente triada.

Dessa maneira, os recursos escassos destinados aos programas de prevenção,

talvez fossem melhor aproveitados se destinados à triagem da população pela

citologia convencional, que é ainda o método mais barato e de comprovada

eficácia na redução da mortalidade advinda do câncer cervical (por permitir o

tratamento das lesões pré-neoplásicas). Já o emprego em massa de testes de

biologia molecular, em uma população como a do Brasil, provavelmente

retornaria um número tão grande de resultados positivos, que a sua

investigação diagnóstica consumiria boa parte dos recursos disponíveis à

saúde pública. Cumpre ressaltar que, em uma grande parcela das pacientes

com teste de detecção viral positivo e que, por esse motivo, forem submetidas

a todo o processo de investigação diagnóstica (citologia, colposcopia e

biópsia, por exemplo), nenhuma lesão seria encontrada. A citologia em meio

27

líquido poderá ser uma alternativa excelente, caso sua técnica seja barateada.

Ela tem como uma de suas vantagens unir o melhor das duas técnicas,

permitindo a realização da CH e de marcadores imunohistoquímicos (como o

p16ink4) nos casos de dúvida na interpretação citológica, sem a necessidade de

nova coleta.

O diagnóstico histopatológico das lesões pré-neoplásicas, que é a

principal referência para a orientação da conduta terapêutica e representa o

padrão ouro em estudos que avaliam outros métodos diagnósticos, apresenta

dificuldades na interpretação para as quais nem sempre os patologistas e

outros especialistas estão alertas. Nessas situações de dificuldade, o emprego

de marcadores imunohistoquímicos, como o p16ink4 e o Ki-67 (MIB-1),

poderia aumentar a acurácia diagnóstica do exame histopatológico.

Por outro lado, o desenvolvimento de uma vacina contra o HPV é uma

perspectiva real para os próximos anos, o que seria um marco na história do

combate ao câncer, estando as populações mais pobres certamente entre as

mais beneficiadas.

28

Abstract

Cervical cancer is a good example in oncology, of a preventable

neoplasm. Since 1920, when Dr. Georges Papanicolaou created cytology,

large screening programs largely reduced its incidence. Even though, cervical

cancer still represents 12% of all female tumors. The well established viral

etiology (HPV - human papillomavirus) and the great advances in molecular

biology, provide new possibilities of better and earlier diagnosis through viral

detection, by techniques such as hybrid capture. Very promising is the anti-

HPV vaccine, a new weapon expected for the next coming years.

29

Quadro I: Características das principais técnicas de biologia molecular

para diagnóstico de infecção por HPV.

Baixa sensibilidade e/ou especificidade:

♦ Hibridização “in situ”

♦ FISH

♦ Dot Blot

♦ Captura híbrida I

Execução complexa e/ou baixo potencial para execução automatizada:

♦ Hibridização “in situ”

♦ FISH

♦ Southern blot

♦ Captura híbrida I

Alta sensibilidade e especificidade:

♦ PCR

♦ Captura híbrida II

Adequada para aplicação automatizada e em larga escala:

♦ PCR (primers de consenso)

♦ Captura híbrida II

30

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46

Hybrid Capture versus histopathologic diagnosis of cervical lesions in a routine clinical setting - Improving diagnostic accuracy with p16ink4 and MIB-1*

*Submetido à revista Archives of Pathology and Laboratory Medicine para publicação.

RESUMO O diagnóstico histológico das lesões intraepiteliais cervicais escamosas (LIE)

não é normalmente considerado um desafio diagnóstico de importância em

patologia cirúrgica. Estudos, entretanto, têm demonstrado baixos níveis de

concordância entre patologistas, especialmente no diagnóstico de lesões de

baixo grau.

No presente estudo, a concordância entre a captura híbrida (CH) e o

diagnóstico histológico em 162 casos de um laboratório de patologia cervical

foi avaliada. Imunohistoquímica para MIB-1 e p16ink4 foi realizada em 68

desses casos, com a finalidade de se avaliar como o emprego desses

anticorpos poderia melhorar a acurácia diagnóstica.

A CH foi positiva para HPV de alto risco (HPV-AR) em 82,4% (28/34) LIE

de alto grau, taxa essa menor que os 99,0% esperados. O p16ink4 e MIB-1

foram positivos em todas as 3 lesões de alto grau com CH negativa, em que

esses marcadores foram empregados. A CH foi positiva em 34,0% (16/47) dos

casos em um grupo com alterações histológicas insuficientes para um

diagnóstico de LIE. Nessas, a positividade para p16ink4 mostrou forte

correlação com positividade para HPV de alto risco, com 80,0% dos casos

positivos para esse marcador sendo também HPV-AR positivos (p=0,02).

A concordância entre CH e o diagnóstico histológico pode ser mais baixa na

rotina clínica do que aquela observada em condições experimentais

47

controladas. Em algumas situações, como em lesões intraepiteliais de alto grau

negativas para HPV-AR, uma coloração positiva para p16ink4 e MIB-1 pode

ajudar a eliminar dúvidas a respeito do diagnóstico correto, especialmente

naqueles casos em que alterações regenerativas e/ou atrofia são consideradas

como diagnóstico diferencial. Uma outra situação em que o uso de p16ink4

provou-se valioso foi nos casos com alterações discretas, insuficientes para

um diagnóstico de LIE. Neste grupo, positividade para p16ink4 mostrou forte

correlação com CH positiva para HPV de alto-risco.

SUMMARY Histological diagnosis of squamous intraepithelial lesions (SIL) is not usually

considered a major diagnostic challenge in surgical pathology. This

confidence is not warranted by studies that show low rates of agreement

among diagnoses of pathologists, especially in low-grade lesions.

In this study, concordance between hybrid capture (HC) and histopathological

diagnosis for 162 cases from a routine laboratory of histopathology was

assessed. Immunostains for p16ink4 and MIB-1 were performed in 68 of these

cases to verify to what extent the use of these markers could help reach a more

accurate histologic diagnosis.

Hybrid capture was positive for high-risk HPV (HR-HPV) in 82.4% (28/34)

high-grade SIL (HGSIL), which was lower than the 99% reported in the

literature. P16ink4 and MIB-1 were positive in all 3 HR-HPV negative HGSIL

in which these stains were performed. In a group of cases with slight

histologic changes, non-diagnostic of SIL, 34.0% (16/47) were HR-HPV

positive. In this group, p16ink4 positivity was strongly correlated with HR-

48

HPV, with 80% (4/5) of p16ink4 positive cases being also HR-HPV positive

(p= 0.02).

In conclusion, concordance between HC and histologic diagnosis in a routine

clinical setting can be lower than in controlled study conditions. In certain

situations, such as HR-HPV negative HGSIL, a positive stain for p16ink4 and

MIB-1 can help dismiss any question about the correct histologic diagnosis.

This could be of major importance in cases in which reactive and/or atrophic

changes are considered as differentials. Another situation where p16ink4 proved

to be valuable was in cases with mild, non-diagnostic, histologic changes. In

this group, p16ink4 positivity was strongly related to HR-HPV.

INTRODUCTION

Although usually considered a gold standard in studies that evaluate cytology,

colposcopy and even molecular biology tests, histologic diagnosis of

squamous intraepithelial lesions (SIL) is far from being straightforward 1, 3, 11.

Indeed, most low grade and high-grade intraepithelial lesions pose no

diagnostic challenge. However, diagnostic accuracy starts to decrease in cases

with slight changes, the borderline cases between normal and low grade

intraepithelial lesions (mild dysplasia, CIN I), or in the presence of atrophy 4

and/or regenerative changes that could lead to overdiagnosis of high grade

lesions 3, 4, 4. Before the introduction of highly sensitive molecular biology

tests for human papillomavirus (HPV) detection, such as polymerase chain

reaction (PCR) and hybrid capture (HC), the issue of accuracy in histologic

diagnosis could be evaluated only in terms of agreement among pathologists

when the only standard would be that of consensus 12. Hybrid capture was

introduced in 1995 7, 3, 5, as a rapid liquid hybridization assay, designed to

49

detect 14 HPV types, divided into high-risk and low-risk groups. Its sensitivity

for HR-HPV in high-grade SIL (HGSIL) varied from 71 to 93% and the

positive predictive value was around 17,8% 4. A second generation HC was

introduced few years later that was capable of detecting four additional viral

types and giving more reliable results. This technique is called Hybrid capture

II and its reported sensitivity is close to 99% for HR-HPV in HGSIL 9.

Despite its excellent sensitivity, higher than that of cytology for HPV

infection, HC cannot distinguish among the positives, those that have high-

grade lesions. It is also well known that a proportion of patients ranging from

4 to 25% are positive for HR-HPV but have normal cytology, colposcopy and

histology 14.

Considering this, what should then be the implication in daily practice of a

positive HPV HC test in the interpretation of biopsies showing the doubtful

changes mentioned above? Should one lean towards a diagnosis of high-grade

lesion in a difficult case with reactive-like atypical changes in the biopsy and a

positive HC? What are the reactions of both patients and clinicians in face of a

positive biopsy and a negative HC?

Over the past few years, immunohistochemical markers, such as p16ink4 and

MIB-1 (Ki-67), have been evaluated, the results indicating them as useful

tools for improving histologic accuracy. Their advantage over viral detection

is the fact of reflecting “viral behavior” more than its mere presence 1, 7.

Histological diagnosis of SIL is based on the cellular consequences of viral

oncogene expression that results in alteration in the nuclear DNA content and

epithelial maturational changes. The overexpression of p16ink4 seems to be a

good marker of deregulated HR-HPV E6-E7 oncogene activation, especially

when seen in basal/parabasal cell layers of the epithelium. Indeed, the great

utility of this marker comes exactly from this potential of pointing out cells

50

that may be already “virus-transformed” and not only “virus-infected” 11, 17.

High-grade cervical lesions express p16ink4 which is easily detected by a

monoclonal antibody, whereas normal, nondysplastic cervical epithelia do not.

MIB-1 antibody detects the Ki-67 antigen which is capable of highlighting

cells with active DNA replication 1. It is normally expressed in proliferating

cells from the basal and parabasal layers of cervical mucosa. Dysplastic

epithelia show MIB-1 positive cells at higher epithelial layers 2.

The indication for a viral test in our geographical area has not yet been

standardized, varying according to personal criteria of each clinician. As

already mentioned, it is not infrequent in daily practice to have a normal

biopsy and a HC showing HR-HPV. As a result, in this clinical setting

disagreement between HC and a biopsy could be even higher than rates

reported in the literature. In this study we assess the concordance between HC

and colposcopically guided biopsies from a routine service and evaluate how

the use of P16ink4 and MIB-1 could improve accuracy of the histologic

diagnosis and help to clarify cases of discordance.

MATERIAL AND METHODS

Case selection

A computer search was performed in the files of a routine service

histopathological laboratory in order to select cases that had biopsy and HC

performed. Interval between HC and biopsy could not exceed 6 months.

Biopsy samples were selected from an archive of formalin-fixed, paraffin-

embedded cervical tissues. A total of 162 cases were found meeting these

criteria. Cytology results were assessed, when available. Biopsies dated from

1995 to 2002. From all samples, hematoxylin and eosin (H&E) stained

51

sections were available for study. According to the original histological

diagnosis, the specimens were classified as normal (NL), low-grade squamous

intraepithelial lesion (LGSIL), high-grade squamous intraepithelial lesion

(HGSIL), as done by keating et al.7 A fourth category was included, with

cases whose original diagnosis was not conclusive. This group was composed

of biopsies with mild changes (such as perinuclear halos, nuclear

hyperchromasia, cariomegaly and occasional binucleation), which were not

sufficient for a definite diagnosis of an intraepithelial lesion, but were also not

considered normal. These were called indefinite changes (IC).

Hybrid capture

The Digene Hybrid capture II test was done in 83 cases. This technique

differentiates between: LR-HPV (6, 11, 42, 43, 44) and HR-HPV strains (16,

18, 31, 33, 35, 38, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) without identifying one

specific type. In all the tests performed after September, 1997, this technique

was applied.

Hybrid capture I was performed in 79 cases. HC I is less sensitive than HC II

and does not detect HPV 38, 58, 59 and 68.

Immunohistochemistry

A total of 68 cases were used in the immunohistochemical study. Inclusion

was based on tissue availability. In 2 of the cases there was tissue available

only for p16ink4 immunostaining. Serial sections (4 µm thick) of formalin-

fixed, paraffin-embedded biopsy samples were cut, immersed in xylene to

remove paraffin and then rehydrated through graded alcohol. An additional

section was stained with H&E to assure the presence of squamous epithelium.

52

Interpretation of immunostains was done without knowledge of HC results or

previous histologic diagnosis. Positive and negative controls were stained.

p16ink4

Staining for P16ink4 was performed using commercially available p16ink4 /

MTS1 (Mitotic Inhibitor / Suppressor Protein) monoclonal antibody (clone:

16PO4 Labvision – Neomarkers) at 1/200 concentration, after microwave

pretreatment in citrate buffer. Application of the primary antibody was

followed by incubation with biotinilated goat anti-mouse IgG and

streptavidin-biotin-peroxidase complex. Results were interpreted as positive

when diffuse cytoplasmic staining was observed. Weakly diffuse staining was

considered as negative.

MIB-1

Identification of the Ki-67 antigen was performed using the anti-Ki67

monoclonal antibody, clone MIB-1 (Immunotech, Marseille, France) at a

concentration of 1/100. Application of the primary antibody was followed by

incubation with biotinilated goat anti-mouse IgG and streptavidin-biotin-

peroxidase complex. Results were interpreted as positive when 2 or more cells

from the two upper thirds of the epithelium showed strong nuclear staining, as

in Pirog et al.1

Statistical analysis

Chi square tests were performed, when appropriate, with the Epi Info

(computer program), Version 6, Atlanta: Centers for Disease Control and

Prevention; 1994.

53

RESULTS

Of the 162 cases, histologic diagnoses were: HGSIL N=34, LGSIL N=69, IC

N=47 and NL N=12. Average ages for patients with HGSIL, LGSIL, IC and

NL were: 33, 32.1, 33.6 and 39.4 respectively. On the average, HC had been

performed 12 days after a biopsy showing the most relevant histologic

changes.

One hundred and nine cases had previous cytologic results available. In 51 the

diagnosis was ASCUS (atypical squamous cells of undetermined

significance); 12 dysplasia; 5 HGSIL; 14 LGSIL; 26 normal and 1 AGUS

(atypical glandular cells of undetermined significance). Thirty of the IC cases

had a cytologic result available. ASCUS was the most frequent diagnosis

(N=15), followed by NL (N=10) and LGSIL (N=3).

Hybrid capture and histologic diagnosis

Correlation of histologic diagnoses with HC results is presented in Table 1.

Only 82.4% of the HGSIL were HR-HPV positive (HC I and II). If only HC-II

results are considered, sensitivity raises to 85.7%.

On the other hand, 34% and 33.3% of the IC and NL respectively, were HR-

HPV positive. There was also a great number of LGSIL cases which were

positive for HR-HPV.

The performance of HC after the biopsy interfered with positivity rates when

LGSIL and HGSIL were evaluated together. Negativity for HPV was 42.6%

(23/54) and 22.4% (11/49) among those in which HC was done after and

before the biopsy respectively (p= 0.03).

54

P16ink4 Immunohistochemistry

Immunohistochemistry for P16ink4 was performed in 68 cases, whose

histologic diagnoses were distributed as: HGSIL, n=11; LGSIL, n=21; NL,

n=12 and IC, n=24. Correlation between immunohistochemistry results and

histologic diagnosis is presented in Table 2. Eight of 11 HGSIL (72%) were

P16ink4 positive. However, only 28.6% (6/21) LGSIL were P16ink4 positive,

similar to the IC in which 20.8% (5/24) were positive and NL, 33.3% (4/12)

positive. P16ink4 Immunohistochemistry was performed in 3 HR-HPV negative

HGSIL and all were positive.

Of the 24 cases with IC, 5 were positive for P16ink4 (Fig. 1). Most important, 4

of these 5 positive cases (80.0%) had also a positive HC for HR HPV (Table

3). Despite the small number of cases, this difference reached statistical

significance (p= 0.02). Thirteen of the 24 cases had a cytologic result

available, with ASCUS being the most frequent diagnosis (N=9), followed by

NL (N=3), and LGSIL (N=1).

MIB-1 Immunohistochemistry

A total of 66 cases were stained for MIB-1 and the results are summarized in

Table 4. Most of the positive cases consisted of HGSIL. In this group 81.8%

(9 /11) were MIB-1 positive, similar to the 82.4% sensitivity observed for HC.

However, among LGSIL, MIB-1 sensitivity was lower (40.0%) in comparison

to HC (56.5%). Conversely, 8.3% (1/12) of the normal cases and 13.0% (3

/23) IC were MIB-1 positive.

MIB-1 immunohistochemistry was performed in 3 HR-HPV negative HGSIL

and all were positive.

55

DISCUSSION

Hybrid capture is acknowledged among gynecologists as a test whose

sensitivity approaches 100%. This high expectation is readily transmitted on

to the patients. However, such high sensitivity may not be true in routine

practice conditions. Thus, when a patient receives a negative HC result after a

biopsy that had shown HGSIL or, inversely, when HC is positive for HPV-

DNA and the biopsy is negative, they immediately question their physicians.

On the other hand, physicians are not always aware of the possibility that such

results can happen without representing a laboratory error. The overall

sensitivity for HGSIL observed in our study was 82.4%. Even when only HC

II results were considered, sensitivity was 85.7%. However this lower

sensitivity observed was not surprising due to the characteristics of the

material used, which included routine cases rather than specimens collected as

part of a controlled research protocol. In fact, this study design really intended

to verify concordance between HC and biopsy in a routine clinical setting. The

diagnosis of HGSIL was confirmed in the 6 negative cases after histologic

review. However, one case had HC performed 150 days after a biopsy, which

could have been the cause of its negative HC result.

In fact, the time lag between the biopsy and HC is one of the variables that

could have been a source of disagreement in this study. Negativity among

HGSIL and LGSIL cases whose HC was done after the biopsy was 42.6%

(23/54) and 22.4% (11/49) in those in which it was done before (p= 0.03).

The chance of a patient with SIL to have a positive HC was 2.54 (CI = 1.00 -

2.89) times greater if HC was performed before the biopsy. These findings

are not surprising, since a biopsy done before HC may eliminate the dysplastic

56

area and/or induce an immunologic response that could end up in viral

clearance.

On the other hand, 33.3% of cases with normal biopsies had a positive HC for

HR-HPV, while the usually reported rate is around 18% 4. The numbers are

similar for the group of IC (34.0%). A recent study reported a HC positivity

rate of 38.8% in ASCUS cases with negative colposcopy and biopsy 3. This

study however did not specify if only HR-HPV positivity was considered. One

possible explanation for the high rates encountered in our study is the fact that

the studied group was composed of patients who had an indication for being

submitted to a biopsy (usually an altered pap smear). This makes our group of

patients more similar to the ASCUS patients than to the general population.

Besides, in most of the patients, colposcopically guided biopsies, and not cone

biopsies, were evaluated so that it cannot be completely ruled out that some of

these patients actually had a HGSIL that had been missed by colposcopy.

The reported rate of HGSIL that are positive for p16ink4 is over 90% 7, while in

this study only 72% HGSIL were p16ink4 positive. There is also a reported

correlation between p16ink4–staining in LGSIL and HR-HPV 11. However, this

was not observed in the present study with only 50% of p16ink4 positive LGSIL

being HR-HPV positive. This discrepancy could not be attributed to the lower

sensitivity of HC observed, since only 30% (3/10) of LGSIL that were HR-

HPV positive showed p16ink4 staining.

Agreement among pathologists with respect to histopathological diagnosis is

frequently low, especially when the histological changes are less severe. The

group of cases that were called IC in this study represents cases in which the

discordance level can be especially high, since it is composed of biopsies

showing slight, unspecific changes. We should not overemphasize that this

group does not represent a diagnostic category, but is a group of cases that, on

57

routine practice, received a diagnosis that was “not normal” but also “not

SIL”. It was in this group that p16ink4 could have been most helpful since

80.0% (4/5) p16ink4 positive cases were positive for HR HPV.

MIB-1 was positive in 81% (9/11) HGSIL, more than the 72% observed for

p16ink4. Despite this slightly higher sensitivity for HGSIL, MIB-1 positivity in

IC cases was not significantly associated with a positive HC result, as opposed

to that verified for p16ink4. However, MIB-1 is reported in the literature to

improve diagnostic accuracy of LGSIL and to have high sensitivity and

specificity rates for this diagnosis 1. In at least one case of the IC group, MIB-

1 was positive and highlighted an area showing changes that could upgrade

the diagnosis to LGSIL. In the same case p16ink4 was negative. Combined,

p16ink4 and MIB-1 detected 71.14% (5/7) HR-HPV positive IC cases.

Immunohistochemistry for both p16ink4 and MIB-1 was positive in all 3 HR-

HPV negative HGSIL tested, including one case in which histologic diagnosis

was difficult, due to associated reactive changes. In these cases the positive

Immunohistochemistry results were clearly useful to dismiss any diagnostic

doubt.

The results also indicate that the recommendation for a clinician to perform a

HC in face of a biopsy that showed unspecific squamous atypia, in order to

favor or rule out a SIL, may not be accurate. Since one of the main factors

found to be associated with a negative HC was to have performed the test after

a biopsy, applying a biomarker instead, should be probably the most suitable

approach.

In conclusion, HC when routinely performed can have a higher rate of

discordance with the histologic diagnoses. Although Immunohistochemistry

showed a lower sensitivity than HC for HGSIL, it can be helpful in some

situations such as in biopsies showing slight changes that do not meet

58

histologic criteria for a diagnosis of SIL in which a positive p16ink4 staining

was found to be strongly related to a positive HR-HPV test. There are studies

reporting HC positivity rates similar to those verified in this study among

patients with normal biopsies. However, these studies did not use p16ink4,

which could have highlighted small altered areas in some cases, improving

diagnostic accuracy. Another potential use for immunohistochemistry is in the

differential diagnosis of immature, reactive or atrophic lesions, which include

HGSIL.

59

TABLE 1. Histological diagnoses correlated with hybrid capture results.

HGSIL LGSIL IC NL

HR HPV pos 28 (82.4%) 36 (52.2%) 16 (34.0%) 4 (33.3%) N=84 (51.8%)

HR HPV neg 6 (17.6%) 33 (47.8%) 31 (66.0%) 8 (66.7%) N=78 (48.2%)

34 (20.9%) 69 (42.5%) 47 (29.0%) 12 (7.6%) N=162 (100%)

HGSIL= High grade squamous intraepithelial lesion

LGSIL= Low grade squamous intraepithelial lesion

IC= indefinite changes

NL= Normal

HR HPV pos= High risk HPV positive

HR HPV neg= High risk HPV negative

60

TABLE 2. p16ink4 immunohistochemistry and histologic diagnoses.

p16ink4 HGSIL LGSIL IC NL

Negative 3 (27.3%) 15 (71.4%) 19 (79.2%) 8 (66.7%) N= 45 (66.2%)

Positive 8 (72.7%) 6 (28.6%) 5 (20.8%) 4 (33.3%) N= 23 (33.8%)

Total 11 (16.1%) 21 (30.8%) 24 (35.2%) 12 (17.9%) N= 68 (100%)




NL= Normal

61

TABLE 3. p16ink4 immunohistochemistry and Hybrid capture results in

cases with IC.

Hybrid capture p16ink4 Negative P16ink4 Positive

HR HPV pos 3 (15.8%) 4 (80.0%) N=7 (29.1%)

HR HPV neg 16 (84.2%) 1 (20.0%) N=17 (70.9%)

Total 19 (79.1%) 5 (20.9%) N=24 (100%)

HR HPV pos= High risk HPV positive

HR HPV neg= High risk HPV negative

62

TABLE 4. MIB-1 immunohistochemistry and histologic diagnoses.

HGSIL LGSIL IC NL

Negative 2 (18.2%) 12 (60.0%) 20 (87.0%) 11 (91.7%) N=45 (68.2%)

Positive 9 (81.8%) 8 (40.0%) 3 (13.0%) 1 (8.3%) N=21 (31.8%)

Total 11 (16.6%) 20 (30.3%) 23 (34.8%) 12 (18.3%) N=66 (100%)




NL= Normal

63

Figure 1. This biopsy shows slight nuclear enlargement and perinuclear halos. No unquestionable change that could allow a diagnosis of LGSIL (a). P16ink4 was positive in one area of the biopsy(b). This case was positive for HR-HPV.

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67

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Por várias décadas a citologia (teste de Papanicolaou) foi a única arma de que

dispúnhamos na luta contra o câncer de colo uterino. Entretanto, têm surgido

nos últimos anos numerosos recursos novos com a finalidade, principalmente

de melhorar a sensibilidade diagnóstica (Clavel et al. 1998). Embora algumas

dessas técnicas prestem-se apenas a interesses comerciais de grandes

indústrias, que se utilizam da propaganda para questionar a importância do

valioso e eficiente “teste de Papanicolaou”, muitas delas serão extremamente

valiosas se conseguirmos definir bem o seu papel nos programas de

prevenção. Para isso é necessário que haja uma abordagem que vise a tirar

proveito das vantagens que cada método oferece, integrando o seu uso. Isso

requer árdua pesquisa, estudos populacionais em grande escala, que tenham

como objetivo final dados sobre redução de mortalidade. Embora as respostas

possam levar décadas, as perspectivas são boas e os dados existentes apontam

que a citologia e a pesquisa viral combinadas, podem conseguir reduzir ainda

mais a incidência e mortalidade por câncer cervical (Cuzick et al. 2000).

A pesquisa em câncer cervical têm, na maioria das vezes, o diagnóstico

histológico como padrão ouro. Por sua vez esse não é isento de limitações e

dificuldades de interpretação, bem como de grande influência da

subjetividade, podendo resultar em altos níveis de discordância entre

diagnósticos de diferentes patologistas. Isso ocorre principalmente nas lesões

menos graves ou na vigência de atrofia e/ou alterações inflamatórias e

regenerativas (De Vet et al. 1990-1992). O emprego de marcadores

imunohistoquímicos, como o p16ink4 e o MIB-1, entre outros, pode melhorar

68

sobremaneira a acurácia diagnóstica, nessas situações de dificuldade (Grenko

et al. 2000, Keating et al. 2001, Pirog et al. 2002).

Uma outra promissora linha de pesquisa busca o desenvolvimento de uma

vacina anti-HPV, o que seria um grande passo em direção ao que poderia

representar a inédita erradicação de um tipo de câncer (Koutsky et al. 2002).

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