CLAUDIA FABIANA JOCA DE ARRUDA

Avaliação das variações de espessura de epitélio em queilite actínica

comparadas ao grau de displasia epitelial e à expressão imuno-histoquímica

da proteína p53 mutada

São Paulo

2013

CLAUDIA FABIANA JOCA DE ARRUDA

Avaliação das variações de espessura de epitélio em queilite actínica

comparadas ao grau de displasia epitelial e à expressão imuno-histoquímica

da proteína p53 mutada

Versão Corrigida

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, para obter o título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Patologia Bucal. Orientadora: Profa. Dra. Marília Trierveiler Martins

São Paulo

2013

Arruda CFJ. Avaliação das variações de espessura de epitélio em queilite actínica comparadas ao grau de displasia epitelial e à expressão imuno-histoquímica da proteína p53 mutada. Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Patologia Bucal.

Aprovado em: / /2013

Banca Examinadora

Prof(a). Dr(a).______________________________________________________

Instituição: ________________________Julgamento: ______________________

Prof(a). Dr(a).______________________________________________________

Instituição: ________________________Julgamento: ______________________

Prof(a). Dr(a).______________________________________________________

Instituição: ________________________Julgamento: ______________________

Dedico este trabalho às 5 pessoas mais importantes da minha vida: Pedro,

Terezinha, Kátia, Darwin e Alexandre.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Marília Trierveiler Martins por ter me aceitado como orientada,

pela paciência de me ensinar algo novo a cada dia e por ser uma excelente

orientadora, sempre com muita dedicação e profissionalismo, o que me ajudou a

desenvolver este trabalho.

À Profa Dra Karem López Ortega, pelos conhecimentos transmitidos e pela

importante ajuda prestada com relação à análise estatística.

A todos os professores da disciplina de Patologia Bucal da FOUSP, pelos

ensinamentos.

Ao Prof. Dr. Celso Augusto Lemos Jr., pelos conhecimentos transmitidos e

pelas belas imagens clínicas cedidas.

A todos os professores da disciplina de Estomatologia Clínica da FOUSP,

pelos ensinamentos.

À colega Gabriela Sanchez Nagata pela ajuda com desenvolvimento da

minha dissertação, especialmente na parte laboratorial, contribuindo com auxílio na

técnica de imuno-histoquímica e com o micrótomo.

À colega Renata Caramez que também me auxiliou com a técnica de imuno-

histoquímica.

Aos técnicos do laboratório Juvani, Elisa e Adriana pela ajuda.

Às funcionárias da Patologia Bucal, Zilda, Néia e Nair, pela boa vontade em

sempre ajudar.

Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos de mestrado.

Às minhas amigas da pós-graduação, Daniela Assis do Vale, Lara Gimenez e

Juliana Seo, pela amizade.

A todos os meus colegas de pós-graduação, especialmente Fernanda, Nelise

e Bruno, pelo companheirismo.

A meu pai Pedro, mãe Terezinha, irmã Kátia e irmão Darwin pelo incentivo,

suporte, amizade e pelo amor.

Ao meu marido Alexandre pela paciência, amizade e pelo amor.

Ao meu Deus por me dar forças e coragem a cada dia.

“Nunca se afaste de seus sonhos, pois se eles se forem, você

continuará vivendo, mas terá deixado de existir”

(Charles Chaplin)

RESUMO

Arruda CFJ. Avaliação das variações de espessura de epitélio em queilite actínica comparadas ao grau de displasia epitelial e à expressão imuno-histoquímica da proteína p53 mutada [dissertação]. São Paulo: Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia; 2013. Versão corrigida.

O carcinoma epidermoide de lábio é precedido por uma desordem potencialmente

maligna, a queilite actínica. Histologicamente o epitélio da lesão é caracterizado pela

presença de hiperqueratose ou hiperparaqueratose, presença de displasia epitelial

e, muitas vezes, pela presença de variações de espessura de epitélio, sendo estas a

acantose e a atrofia. O desenvolvimento da queilite actínica está ligado a exposição

excessiva a luz solar que contém radiação UV, esta pode produzir mutações com

assinatura UV no DNA através de um fenômeno conhecido como fotocarcinogênese.

As mutações com assinatura UV estão presentes no gene supressor de tumor TP53,

quando este gene se encontra mutado, muitas vezes, ele codifica uma proteína que

sofre um dobramento e exibe uma conformação específica. Esta pesquisa pretendeu

determinar, à partir de 458 casos de queilite actínica, a porcentagem de casos que

apresentaram espessura normal de epitélio, acantose ou atrofia, relacionando os

graus de displasia epitelial, segundo o sistema da OMS e o sistema binário e

também relacionar estas variações de espessura com a presença de proteína p53

mutada através de análise imuno-histoquímica. O que se observou foi que 20,31%

dos casos apresentavam espessura normal de epitélio, 38,65% apresentavam

acantose e 41,05% apresentavam atrofia. Não houve relevância estatística quando a

variação de espessura foi comparada com a proteína p53 mutada. Concluiu-se que

há uma dificuldade real em determinar quais queilites actínicas evoluirão para uma

lesão maligna, por tanto, o acompanhamento clínico desses pacientes tem caráter

essencial.

Palavras-chave: Queilite actínica, p53 mutada, fotocarcinogênese, prevenção

ABSTRACT

Arruda CFJ. Evaluation of epithelial thickness variations in actinic cheilitis compared to the degree of epithelial dysplasia and immunohistochemical expression of mutated p53 protein [dissertation]. São Paulo: Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia; 2013. Versão corrigida.

Squamous cell carcinoma of the lip is preceded by a potentially malignant disorder,

the actinic cheilitis. Histologically the lesion is characterized by the presence of

hyperkeratosis or hyperparakeratosis, the presence of dysplasia, and often, the

presence of variations in thickness of the epithelium, which is acanthosis or atrophy.

The development of actinic cheilitis is linked to the excessive exposure to sunlight

containing UV radiation, this can produce UV signature mutations through the

photocarcinogenesis. UV signature mutations are present in the tumor supressor

gene TP53, when this gene is mutated, often it encodes a protein that undergoes

bending and displays a specific conformation. This research intended to determine,

from 458 cases of actinic cheilitis, the percentage of the cases whitch had normal

thickness of the epithelium, acanthosis or atrophy and relate to the degree of

dysplasia, and relates them to the presence of mutated p53 protein through

immunohistochemical analysis. There was noted that 20.31% of cases showed

normal thickness of the epithelium, 38.65% had acanthosis and 41.05% had atrophy.

There was no statistical significance when the thickness variation was compared to

the mutated p53, it was concluded that there is a real difficulty to determining which

actinic cheilitis evolve to a malignant lesion, and therefore, clinical monitoring of

these patients is of essential nature.

Keywords: actinic cheilitis, mutated p53, photocarcinogenesis, prevention

LISTA DE FIGURAS

Figura 4.1 - Medição feita no epitélio da região do vermelhão de lábio apresentando espessura normal..................................................................................28

Figura 5.1 - Aspecto histológico das variações de espessura de epitélio de queilite

actínica. A) Fragmento exibindo espessura normal de epitélio; B) Neste corte é observada uma lesão apresentando acantose; C) Neste espécime observa-se a ocorrência de atrofia epitelial; D) Por último, pode-se observar um fragmento exibindo atrofia epitelial extrema. Hematoxilina e eosina. Aumento de 10x no original...................................................................................................34

Figura 5.2 - Marcação imuno-histoquímica para a proteína p53 mutada. A) Marcação para p53 mutada em queilite actínica exibindo células positivas, principalmente na camada basal (aumento de 10x no original); B) Marcação positiva da proteína p53 mutada observada em maior aumento (40x no original).................................................................................................38

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1 - Caracterização da amostra de cortes histológicos contendo apenas epitélio de vermelhão de lábio apresentando espessura nomal...........27

Tabela 4.2 - Apresentação das lâminas contendo áreas de vermelhão de lábio

normal que apresentam espessura de epitélio normal e que foram utilizadas para a obtenção do valor da medida desse epitélio. Média das medidas individuais, média das médias obtidas e desvio padrão...................................................................................................29

Tabela 5.1 - Distribuição dos casos do estudo de acordo com as variações de

espessura de epitélio e os dois sistemas de graduação de displasia epitelial. Nesta análise foram consideradas as espessuras: normal, acantose e atrofia apenas..................................................................................................35

Tabela 5.2 - Distribuição dos casos do estudo de acordo com as variações de

espessura de epitélio e os dois sistemas de graduação de displasia epitelial. Nesta análise foram consideradas as espessuras: normal, acantose, atrofia e atrofia extrema.................................................................................................36

LISTA DE GRÁFICOS

Grafico 5.1 - Porcentagem de casos de variações de espessura de epitélio positivos e negativos para a proteína p53 mutada...................................................37

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

UV ultravioleta

DNA ácido desoxirribonucleico

TP53 gene proteína tumoral p53

p53 proteína p53

cm centímetro

nm nanômetro

C citosina

T timina

kDa quilodalton

OMS Organização mundial da saúde

G1 gap 1

S síntese

µm micrometro

NaCl cloreto de sódio

mM micromolar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 13

2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 15

2.1 Carcinoma epidermoide de lábio ................................................................ 15

2.2 Queilite actínica .......................................................................................... 17

2.3 Fotocarcinogênese ..................................................................................... 21

2.4 Gene TP53 ................................................................................................. 22

3 PROPOSIÇÃO .............................................................................................. 25

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 26

4.1 Casos e amostras teciduais ....................................................................... 26

4.2 Análise morfológica .................................................................................... 26

4.2.1 Determinação da espessura normal do epitélio do vermelhão do lábio....27

4.2.2 Variações da espessura .......................................................................... 29

4.3 Imuno-histoquímica .................................................................................... 30

4.4 Forma de análise dos resultados ............................................................... 31

4.5 Análise estatística ...................................................................................... 32

5 RESULTADOS .............................................................................................. 33

5.1 Casuística ................................................................................................... 33

5.2 Variação de espessura de epitélio e displasia epitelial .............................. 33

5.3 Imuno-histoquímica .................................................................................... 37

6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 39

7 CONCLUSÃO ............................................................................................... 45

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 46

ANEXO ............................................................................................................ 52

13

1 INTRODUÇÃO

A luz solar é essencial para a vida humana na Terra, entretanto, sabemos que

ela contém radiação ultravioleta (UV) e que essa radiação pode ser nociva aos seres

vivos, -- dentre eles o ser humano --, pois ela é capaz de provocar alterações no

DNA1.

Muitas dessas alterações causadas pela radiação UV podem levar ao

surgimento de neoplasias malignas nos tecidos atingidos. A pele e os olhos são os

órgãos que mais recebem essa radiação, mas, existe uma área de transição entre a

pele e a mucosa oral que também costuma ser lesada, essa região é conhecida

como vermelhão do lábio2.

As neoplasias malignas causadas pela radiação UV que acometem a pele e o

vermelhão de lábio costumam ser precedidas por desordens potencialmente

malignas, no caso do vermelhão de lábio, essa desordem é denominada queilite

actínica, que também é causada pela luz solar3.

Na clínica, a queilite actínica se apresenta, inicialmente, como um lábio

ressecado e tem progressão lenta3, 21. As principais características histológicas do

epitélio dessa lesão são a presença de hiperqueratose ou hiperparaqueratose, a

presença de displasia epitelial e, muitas vezes, a presença de variação de

espessura de epitélio que podem ser a acantose ou a atrofia22.

Já foram notadas alterações causadas pela radiação UV no gene humano

TP5340, que é um gene supressor de tumor que codifica a proteína p53 responsável

pela manutenção da estabilidade genômica42, 47. Quando esse gene se encontra

mutado, na maior parte dos casos, ele codifica uma proteína que sofre uma torção e

expõe uma região de 5 aminoácidos, ou seja, a proteína mutada, quase sempre,

apresenta uma conformação específica55.

Existe um anticorpo anti-proteína p53 do clone PAb240 cujo epítopo é esta

região de cinco aminoácidos que fica exposta na proteína mutada, por isso, esse

clone é específico para a proteína p53 mutada51.

14

Como nosso país é tropical, sabe-se que a incidência de luz solar recebida

todos os anos é bem alta e por isso, é de grande importância o estudo e o

conhecimento das lesões por ela causadas4. Além disso, a determinação de quais

pacientes portadores dessas desordens potencialmente malignas têm uma

probabilidade real de desenvolverem lesões malignas, é essencial para uma

intervenção precoce e eficaz, pois o carcinoma epidermoide de lábio, apesar de

apresentar um prognóstico melhor que o carcinoma epidermoide intraoral5, pode

causar uma grande mutilação em face e com isso causar graves consequências à

vida do paciente que apresenta perda estética e dificuldades funcionais, levando o

paciente a uma diminunição de qualidade de vida6.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Carcinoma epidermoide de lábio

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), câncer é um crescimento

incontrolado de células que pode afetar qualquer parte do corpo. Esse crescimento

invade tecidos vizinhos e pode promover metástases em locais distantes7. Do ponto

de vista genético, o câncer é a finalização de um processo evolutivo no qual células

normais se tornam células malignas através de alterações genéticas ou epigenéticas

cumulativas8.

As neoplasias malignas localizadas no vermelhão do lábio correspondem a

15% de todas as neoplasias malignas da região de cabeça e pescoço, somando

25% de todos os cânceres que acometem a cavidade oral. O tipo histológico mais

comum de neoplasia maligna que acomete tanto o vermelhão de lábio quanto a

região de cabeça e pescoço como um todo é o carcinoma epidermoide9. Essa

neoplasia está relacionada à exposição crônica e excessiva à radiação ultravioleta

(UV) do sol e sendo o Brasil um país tropical, acaba recebendo uma grande

quantidade de insolação, o que faz com que esta neoplasia assuma uma grande

importância, sendo relativamente comum em nosso país4,10.

O carcinoma epidermoide de lábio ocorre mais frequentemente em indivíduos

de pele clara, do sexo masculino, acima de 50 anos de idade e que costumam ficar

expostos à luz solar por um longo período de tempo11,12.

Já foi observado que, no Brasil, a proporção de pessoas que desenvolvem a

lesão levando em conta o sexo do indivíduo é de cinco homens para cada mulher,

sendo que, para esses homens, a média de idade para diagnóstico da lesão é de

58,8 anos4.

A lesão é rara em negros, em indivíduos abaixo de 40 anos e também é rara

em crianças, exceto quando portadoras de xerodermia pigmentosa9.

16

O aspecto clínico do carcinoma epidermoide de lábio é variado, podendo

apresentar-se como lesão exofítica ou endofítica. Entretanto, sua apresentação mais

comum consiste em uma lesão ulcerada de bordas elevadas e endurecidas12. A

lesão acomete mais comumente o lábio inferior, mas pode ocorrer no lábio superior,

situação na qual costuma ser mais agressiva12. Metástases linfáticas cervicais são

relatadas nessa neoplasia maligna, podendo ocorrer em aproximadamente 6 a 12%

dos casos9.

Histologicamente, o carcinoma epidermoide é caracterizado por apresentar

ilhas e cordões de células epiteliais atípicas que invadem o tecido conjuntivo da

lâmina própria, podendo, ainda, ocorrer formação de áreas de queratinização

individual ou pérolas de queratina no interior dessas ilhas. As células neoplásicas

apresentam alterações morfológicas como hipercromatismo nuclear, alteração na

proporção núcleo/citoplasma, pleomorfismo celular e nuclear, entre outras, além de

apresentar aumento no número de figuras de mitose e mitoses atípicas. Também é

possível se observar a presença de degeneração basofílica das fibras colágenas no

tecido conjuntivo da lesão13. Mais que dois terços desses carcinomas epidermoides

que acometem o vermelhão de lábio apresentam-se bem diferenciados9.

O diagnóstico da lesão é obtido facilmente por meio do exame clínico regional

e da realização de biópsia, pois por localizar-se na região de vermelhão de lábio, a

lesão é facilmente visualizada tanto pelo paciente quanto pelo proficional de saúde.

O tratamento de escolha da lesão é o cirúrgico, com remoção completa da lesão

com margem de segurança12, sendo que as técnicas utilizadas podem ser a simples

excisão tridimensional em cunha ou em “W”, ou a excisão tridimensional com

reconstrução plástica imediata com rotação de retalho pediculado uni ou bilateral, no

caso de lesões maiores que dois centímetros9.

Sabe-se que o diagnóstico precoce resulta em um prognóstico favorável, com

índice de sobrevida maior que 90% em cinco anos,12 e que comparados aos

carcinomas epidermoides intraorais, o carcinoma epidermoide de lábio apresenta um

melhor prognóstico, um índice baixo de metástase em linfonodos regionais e menor

taxa de mortalidade14. Entretanto, quando ocorrem metástases ou recidivas, o

prognóstico costuma ser desfavorável15. A invasão local do tumor pode contribuir

17

para um procedimento cirúrgico extenso, resultando em perda de estética e perda de

qualidade de vida6.

Diversos cânceres são precedidos por desordens potencialmente malignas, e

o carcinoma epidermoide de lábio é um deles, sendo precedido pela queilite

actínica3, que é uma lesão cujo desenvolvimento também está intimamente

associado à exposição crônica e excessiva à radiação UV do sol2.

2.2 Queilite actínica

O termo “desordem potencialmente maligna” sugere que uma determinada

lesão apresente potencial de evoluir para uma neoplasia maligna, embora não seja

uma certeza de que evoluirá16.

Algumas das desordens potencialmente malignas que mais comumente

acometem a cavidade oral são a leucoplasia, a eritroplasia e a queilite actínica16.

Acredita-se que a queilite actínica anteceda, virtualmente, todos os casos de

carcinoma epidermoide de lábio3 e é considerada a correspondente em lábio da

queratose actínica, lesão que acomete a pele e atua como um marcador prognóstico

do aumento de risco de ocorrência de câncer de pele não melanoma17. Sabe-se

também que, assim como nas lesões em pele, os carcinomas epidermoides de lábio

derivados de lesões de queilite actínica apresentam um melhor prognóstico,

entretanto, esta lesão apresenta um pior prognóstico que o carcinoma epidermoide

de pele18.

A queilite actínica costuma ocorrer, mais frequentemente, em pacientes do

sexo masculino19 com idades entre 40 e 80 anos, afetando quase que

exclusivamente o vermelhão do lábio inferior20 de indivíduos que trabalham sob o

sol, ou que apresentam o hábito de passar bastante tempo expostos à luz solar. A

maioria dos pacientes possui pele clara, com efélides e apresentam queimaduras

solares com facilidade19,20.

18

Inicialmente, a queilite actínica se apresenta, como um lábio com aparência

seca, discretamente rachado e indolor. A lesão apresenta um desenvolvimento lento

e, por conta disso, muitas vezes ela é vista como característica comum do avanço

da idade, o que pode dificultar o seu processo de diagnóstico3,21.

Conforme o processo avança, o vermelhão do lábio inferior pode se

apresentar com um aspecto bastante ressecado, mostrando áreas com fendas

profundas e um aspecto descamativo2. A coloração do lábio pode se tornar

esbranquiçada ou apresentar manchas e pode ocorrer a formação de placas

queratóticas, perda da distinção entre vermelhão de lábio e pele e, em alguns casos,

podem ocorrer áreas ulceradas2,21, sendo relatada, por vezes, a sensação de

queimação3. Quando se realiza palpação da lesão, tem-se descrito que a sensação

percebida é a da luva sendo esfregada em uma lixa fina21.

As características histopatológicas mais comuns da queilite actínica são a

hiperqueratose ou hiperparaqueratose, a displasia epitelial e as variações de

espessura de epitélio, sendo estas, a acantose e a atrofia22. A acantose é

caracterizada pelo espessamento da camada espinhosa do epitélio, já a atrofia

epitelial apresenta-se como uma diminuição no número de camadas do epitélio, com

a consequente diminuição da espessura desse epitélio23. Tanto acantose, quanto

atrofia são achados frequentes em lesões de queilite actínca3,24,25. Em um estudo

realizado em uma população brasileira, notou-se que em um grupo de 29 espécimes

observados, mais que a metade apresentava variação de espessura de epitélio25.

A displasia epitelial é caracterizada pelo somatório das várias atipias

encontradas, como o aumento do número de figuras de mitose, a perda de

polaridade das células da camada basal, o aumento da proporção

núcleo/citoplasma, presença de mais de uma camada de células com aparência de

células basais, estratificação epitelial irregular, projeções epiteliais em forma de

gota, figuras de mitose atípicas, hipercromatismo nuclear, pleomorfismo celular e

nuclear, núcleos aumentados, perda de aderência entre as células e áreas de

queratinização individual22.

No tecido conjuntivo, próximo ao epitélio, pode-se observar a degeneração

basofílica das fibras elásticas e colágenas (elastose solar), além de infiltrado

inflamatório crônico e vasodilatação 22.

19

A análise das alterações arquiteturais e citológicas leva à graduação da

displasia epitelial na queilite actínica, que pode apresentar desde graus mais leves

até graus mais intensos21. Esses graus de displasia epitelial têm sido utilizados para

calcular o prognóstico dos pacientes e definir o tratamento. Existem vários sistemas

de classificação dos graus de displasia epitelial, entretanto, não são considerados

sistemas precisos26,27.

O sistema de classificação proposto pela OMS divide os graus de displasia

epitelial em discreta, moderada e intensa a partir da observação de 16 critérios que

envolvem alterações arquiteturais e citológicas. As alterações arquiteturais são:

estruturação epitelial irregular, perda de polaridade das células do estrato basal,

projeções epiteliais em forma de gota, aumento do número de figuras de mitose,

mitoses altas, queratinização individual e presença de pérolas de queratina. As

alterações citológicas são: variação anormal do tamanho do núcleo, pleomorfismo

nuclear, variação anormal do tamanho da célula, pleomorfismo celular, proporção

núcleo/citoplasma aumentada, aumento do tamanho do núcleo, mitoses atípicas,

número e tamanho de núcleos aumentados e hipercromatismo28.

Na displasia epitelial discreta, as alterações arquiteturais e atipias celulares

limitam-se ao terço inferior do epitélio; na displasia moderada essas alterações se

estendem pelos dois terços inferiores do epitélio; e na displasia intensa são notadas

alterações arquiteturais e citológicas em mais que dois terços do epitélio. Entretanto,

se ocorrem muitas atipias celulares, considera-se que a displasia é intensa mesmo

não atingindo mais que os dois terços inferiores do epitélio28.

Um sistema de classificação dos graus de displasia epitelial mais

recentemente proposto é o sistema binário, que foi proposto por Kujan et al.. Este

sistema divide as lesões em lesões de baixo ou alto risco, utilizando-se da avaliação

das alterações arquiteturais e citológicas propostas pela OMS. Segundo esse

sistema, são consideradas lesões de alto risco aquelas que apresentam mais que 4

alterações arquiteturais e 5 alterações citológicas e lesões de baixo risco aquelas

que apresentam menos de 4 alterações arquiteturais e menos de 5 alterações

citológicas. É importante salientar que esses sistemas foram propostos para as

desordens potencialmente malignas intraorais e que sua validade ainda não foi

testada para a queilite actínica29.

20

Existem diversos tipos de tratamentos para a queilite actínica, sendo que

alguns podem ser mais agressivos que outros30,31,32. A vermelhectomia é o método

terapêutico mais agressivo empregado para o tratamento da lesão, consistindo na

remoção total do lábio acometido, podendo variar na espessura do tecido que deve

ser removido. Esta técnica é muito eficaz para o tratamento da queilite actínica, no

entanto, este procedimento costuma levar a um grande comprometimento estético,

além de poder causar parestesia permanente no local, cicatrizes e perda de

contorno dos lábios, entre outras várias complicações 30,33.

A cirurgia com laser de dióxido de carbono também pode ser utilizada para

tratar a queilite actínica. A técnica consiste em aumentar a temperatura da água

contida no interior das células pela aplicação do laser na região, o que causa o

rompimento dessas células33.

O uso tópico de quimioterápicos como o 5-fluororacil31 e o imiquimod32

também pode ser utilizado para o tratamento da queilite actínica, no entanto, são

mais comumente utilizados no tratamento de queratose actínica de pele. Estes

agentes podem causar grande desconforto aos pacientes tornando a terapia muito

pouco utilizada33.

A crioterapia consiste na aplicação tópica de um agente congelante,

normalmente o nitrogênio liquido, que é mais utilizado para lesões pequenas33.

Um tratamento que surgiu mais recentemente é a terapia fotodinâmica. Esta

técnica consiste na utilização de uma fonte de luz e um agente fotossensibilizante

que é ativado e produz radicais livres de oxigênio que desestabilizam as membranas

celulares e as organelas, induzindo a morte celular. Entretanto, o tratamento não

tem se mostrado um método muito eficaz. Existem, ainda, outros métodos para o

tratamento de queilite actínica que não serão discutidos33.

Apesar das diversas possibilidades de tratamentos, como citado acima, a

prevenção é a melhor forma de evitar os danos causados pela exposição excessiva

à luz solar. Deve-se controlar o tempo de exposição solar e fazer-se uso de

protetores solares e de barreiras físicas quando se fica exposto a luz solar para

evitar os efeitos dela agindo diretamente nos tecidos biológicos34.

21

2.3 Fotocarcinogênese

Conforme já foi dito, o principal fator para o desenvolvimento da queilite

actínica e do carcinoma epidermoide de lábio é a exposição excessiva à luz solar,

pois esta possui radiação UV, que pode causar alterações genéticas nos tecidos

vivos2. Esse processo de transformação maligna que o tecido sofre é conhecido

como fotocarcinogênese e representa a soma de eventos bioquímicos simultâneos e

sequenciais que, em última instância, resultam no surgimento de uma neoplasia

maligna1.

A radiação UV é considerada um carcinógeno completo, pois ela altera,

permanentemente, genes responsáveis pela iniciação, promoção e progressão

neoplásica1. A dose de radiação, o tempo de exposição e o comprimento de onda

(UVA ou UVB) estão intimamente ligados a esse desenvolvimento35. Sabe-se que a

radiação UVA é o tipo de radiação solar de maior incidência em nosso planeta,

sendo que seu comprimento de onda está compreendido entre 320 e 400 nm36. Já a

radiação UVB, das que atingem a superfície terrestre, é a mais nociva para os

tecidos biológicos, e apresenta comprimento de onda entre 280 a 320 nm 37,36. A

UVB pode ser absorvida por proteínas e ácidos nucleicos, o que pode levar a sérios

danos em tecidos biológicos1. Mas, apesar disso, sabe-se que a radiação UVA

também contribui para o desenvolvimento de neoplasias malignas38.

Para poder ter ação nos tecidos biológicos, a radiação UVB necessita ser

absorvida por um cromóforo celular, que pode traduzir a radiação solar em um sinal

bioquímico. O DNA genômico é o melhor cromóforo para a radiação UVB39.

Quando a radiação é absorvida pelo DNA de queratinócitos, ocorre a

formação de uma ligação covalente entre duas bases pirimidinas consecutivas

(citosina-timina – C-T, ou citosina-citosina – C-C) , constituindo os fotoprodutos

dímero de pirimidina ciclobutano e pirimidina (6-4) pirimidona. Caso esses dímeros

não sejam reparados na molécula de DNA do queratinócito, no momento de sua

replicação, a enzima DNA polimerase não reconhece a ligação covalente e insere

duas bases adenina no pareamento com essas bases nitrogenadas que possuem

22

essa ligação covalente. Com isso, na próxima replicação, as bases adeninas serão

pareadas com as bases timinas e, com isso, T passa a ocupar o lugar de C, ou seja,

ocorre a substituição dos locais da base pirimidina C para T ou CC para TT. Esse

tipo de mutação é conhecido como mutação com assinatura UV, pois a radiação UV

é a única fonte conhecida como causadora desse tipo específico de mutação40.

2.4 Gene TP53

O gene humano TP53 tem sido associado à fotocarcinogênese1 e já foi

observado, em carcinoma epidermoide de pele, que mutações com a assinatura UV

estão presentes nesse gene40. Os genes supressores de tumor, como o TP53,

codificam proteínas que têm a importante função de controlar o ciclo celular, a

replicação do DNA e a divisão celular. Com esta função suprimem o crescimento

celular descontrolado, inibindo a formação de neoplasias, por exemplo41.

O TP53 é o gene supressor de tumor mais amplamente estudado até

hoje42,43,44. Ele está localizado no braço curto do cromossomo 1745 e é conhecido

como o guardião do genoma humano46, e foi observado pela primeira vez em

197942,43,44. Este gene codifica uma fosfoproteína nuclear com peso molecular de 53

kDa45 que atua na regulação do ciclo celular, na regulação da apoptose e na

reparação do DNA, garantindo a manutenção da estabilidade genômica42,47.

A proteína p53 está presente como um tetrâmero que se acumula no

citoplasma celular durante a fase G1 do ciclo celular e migra para o núcleo da célula

no começo da fase S45. O aumento da quantidade da proteína p53 está relacionado

à interrupção do ciclo celular e este evento pode levar à morte programada da célula

(apoptose)48.

Existem algumas vias pelas quais o gene TP53 pode ser ativado. São elas: a

ativação por danos ao DNA, a via desencadeada por sinais aberrantes de

crescimento e a induzida por medicamentos quimioterápicos, inibidores de proteína

quinase e radiação UV. Todas essas vias levam à inibição do processo de

23

degradação da proteína p53, o que causa o aumento na concentração celular dessa

proteína41.

Esse aumento permite que a proteína exerça a função de fator de transcrição,

ligando-se a determinadas cadeias de DNA e ativando a expressão gênica41,

impedindo a divisão da célula danificada por meio da estimulação da expressão de

CDKN1A (p21/WAF1), que inibe as CDKs (quinases ciclina-dependentes) que são

importantes reguladoras do ciclo celular, promovendo, assim, uma parada na

progressão do ciclo celular na fase G1. Desta forma, ela permite a conclusão do

processo de reparação genômica, fazendo com que as vias de reparação celular

removam possíveis lesões no DNA antes do início de sua síntese e da mitose da

célula41,42,47. Quando não é possível reparar o dano causado ao DNA da célula, a

proteína induz eventos que levam à morte programada da célula (apoptose)48,49.

Já foi demonstrado que, em muitos cânceres humanos, a proteína p53 não

funciona corretamente, o que, em geral, ocorre porque o gene TP53 se encontra

mutado41. As mutações com troca de sentido que acometem o TP53 alteram a

função normal da proteína resultando, na sua maioria, em uma proteína com função

alterada, que claramente contribui no processo de formação de neoplasias

malignas49. A inativação desse gene pode ser causada por mutações pontuais,

deleções ou por mutações insersionais45.

Segundo estudos, mutações em TP53 podem ser notadas em 19% das

desordens potencialmente malignas de boca (incluem-se lesões com displasia

epitelial discreta e epitélio adjacente a neoplasias malignas de cabeça e pescoço), o

que sugere que a mutação no TP53 pode ser um evento inicial na carcinogênese

oral. Já está bem estabelecido que a maioria dos carcinomas epidermoides de boca

apresentam mutação no gene TP5350,51.

Uma alta expressão da proteína p53 foi observada em queratose actínica de

pele, o que pode indicar que esteja ligada à exposição à radiação solar e que pode

ser um evento inicial na evolução dessa lesão para um carcinoma epidermoide de

pele52.

Quando o gene TP53 está mutado, ele codifica uma proteína que, na maior

parte das vezes, sofre uma torção e expõe uma região de cinco aminoácidos, dessa

24

forma, a proteína mutante apresenta uma conformação distinta da sua forma

nativa55. É grande o número de estudos envolvendo a técnica de imuno-histoquímica

para detecção da proteína p53 em diferentes lesões e existe um número elevado de

anticorpos anti-proteína p53 comercialmente disponíveis. Entretanto, muitos não

apresentam especificidade para a proteína p53 mutada, reconhecendo tanto a forma

nativa quanto a mutada51. A forma nativa da proteína p53 apresenta uma duração

muito curta, sua meia-vida dura entre 5 e 6 minutos, porém a proteína na forma

mutada se apresenta estável, com meia-vida de várias horas e os trabalhos usam

desta informação para sugerir que apositiviadade para estes anticorpos revelem a

presença da proteína mutada56.

O anticorpo anti-proteína p53 do clone PAb240 identifica apenas proteína na

sua forma mutada51, pois é específico para um epítopo de cinco aminoácidos que

surge na alteração conformacional sofrida pela molécula55.

25

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo deste trabalho foi analisar a variação de espessura epitelial em

casos de queilite actínica e determinar se há relação entre a espessura do epitélio e

o grau de displasia epitelial. Também foi objetivo deste trabalho analisar se há

relação entre a espessura do epitélio e a presença de proteína p53 mutada.

26

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Casos e amostras teciduais

Antes do seu início, este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Odontologia da USP, sob parecer 179717 (Anexo A).

Os casos deste estudo foram selecionados de uma amostra de 458 queilites

actínicas utilizada em estudo prévio de nosso grupo. Todos os casos foram

diagnosticados no Serviço de Patologia Cirúrgica da Faculdade de Odontologia da

USP e as amostras teciduais encontravam-se fixadas em formol e emblocadas em

parafina. Para a análise morfológica foram utilizadas lâminas histológicas coradas

por hematoxilina e eosina que foram recuperadas dos arquivos do Serviço.

Foram também utilizados 12 cortes histológicos contendo epitélio do

vermelhão do lábio de aspecto normal, considerados como controle do trabalho.

A graduação histológica das displasias epiteliais já havia sido feita para o

estudo anterior, tendo sido utilizadas duas graduações diferentes: a proposta pela

Organização Mundial da Saúde (OMS) e a binária22.

4.2 Análise morfológica

Para a análise morfológica dos casos de queilite actínica estudados, foram

utilizados cortes de 5 μm estendidos sobre lâminas de vidro e corados pelo método

da hematoxilina e eosina que foram examinados ao microscópio de luz.

27

4.2.1 Determinação da espessura normal do epitélio do vermelhão do lábio

Para a classificação da variação de espessura de epitélio nos casos de

queilite actínica, foi necessária a determinação de um valor considerado como

espessura normal do epitélio da região. Para tanto, 12 cortes histológicos contendo

fragmento de epitélio do vermelhão do lábio e sem outras alterações que sugerissem

a incidência crônica de radiação solar, foram analisados com o auxílio do

fotomicroscópio Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EUA) e do software

AxioVision V4.8 (Carl Zeiss), as informações clínicas com relação a cada amostra

tecidual utilizada como controle se encontram na tabela 4.1. Após a aquisição de

uma imagem digital de cada um dos cortes histológicos com o uso da objetiva de 10

aumentos, foram feitas medições da espessura em três áreas do epitélio. Iniciou-se

com a escolha da região central e, a seguir duas áreas equidistantes. A figura 4.1

ilustra o método de aquisição das medidas. Neste trabalho a camada córnea não foi

considerada no cálculo da espessura do epitélio, tanto nesta medição para

determinação de uma espessura normal do epitélio do vermelhão do lábio, quanto

na avaliação dos casos de queilite actínica. Isto deveu-se à grande variação que

esta camada apresenta já observada em trabalhos anteriores22,25.

Tabela 4.1 - Caracterização da amostra de cortes histológicos contendo apenas epitélio de vermelhão de lábio apresentando espessura nomal

Casos Sexo Cor da pele Idade Localização

1 Masculino Negra 55 Lábio superior

2 Masculino Negra 58 Lábio inferior

3 Feminino Branca 75 4 Feminino Outra 51 Lábio inferior

5 Feminino Branca 58 Lábio inferior

6 Feminino Amarela 32 Lábio inferior

7 Feminino Branca 86 Lábio inferior

8 Masculino Branca 42 Lábio inferior

9 Feminino Branca 10 Lábio inferior

10 Feminino Branca 09 Lábio inferior

11 Masculino Branca 43 Lábio inferior

12 Feminino Branca 55 Lábio inferior

28

Figura 4.1 - Medição feita no epitélio da região do vermelhão de lábio apresentando espessura normal

29

Após a obtenção dos valores foi calculada a média para cada um dos cortes e

a média entre todos os cortes avaliados. A tabela 4.2 mostra os valores obtidos.

Tabela 4.2 - Apresentação das lâminas contendo áreas de vermelhão de lábio sem lesão que

apresentam espessura de epitélio normal e que foram utilizadas para a obtenção do valor da medida desse epitélio. Média das medidas individuais, média das médias obtidas e desvio padrão

Casos 1ª medida 2ª medida 3ª medida médias Desv. Padrão

Medidas

1 196,2 266,7 311,9 258,3 58,31

2 250,6 253,6 227,4 243,8 14,31

3 321,0 410,5 318,0 349,8 52,59

4 321,0 338,1 315,0 324,7 11,99

5 248,5 254,6 328,0 277,1 44,25

6 358,2 404,5 387,4 383,4 23,41

7 219,4 243,5 264,6 242,5 22,66

8 368,3 333,1 336,1 345,8 19,50

9 376,3 375,3 315,0 355,5 35,15

10 339,1 361,2 344,1 348,2 11,61

11 408,5 404,5 387,4 400,1 11,22

12 376,3 327,0 310,9 338,1 34,07

Media Total 322,27

Desvio Padrão Total 53,77

4.2.2 Variações da espessura

Para este trabalho, os 458 casos do estudo foram classificados como

exibindo: epitélio de espessura normal, acantose ou atrofia. Foi considerada como

acantose uma espessura epitelial de pelo menos uma vez e meia a espessura do

epitélio normal da região do vermelhão do lábio. Atrofia foi considerada quando o

epitélio exibia espessura igual ou menor que a metade da espessura normal do

epitélio do vermelhão do lábio. A definição da espessura do epitélio para cada um

dos casos foi realizada apenas com avaliação visual, sem que fosse necessária a

medição para cada um isoladamente. Isso se deveu a características das alterações

em si, que normalmente são bastante evidentes. Entretanto, sempre que houve

dúvida, realizou-se a medição no mesmo sistema explicado no item anterior. Dos

458 casos do estudo, 15 (3,27%) foram avaliados desta maneira.

30

Em uma segunda análise, foi observado que dentre os casos de atrofia,

existiam alguns que exibiam epitélio constituído por poucas camadas de células,

tipicamente quatro a seis camadas, estes casos foram separados da atrofia e

considerados como um outro grupo denominado atrofia extrema22. Em cortes não

homogêneos considerou-se a característica predominante para o epitélio nas zonas

identificadas como tipicamente de queilite actínica (displasia epitelial associada à

elastose solar na lâmina própria).

4.3 Imuno-histoquímica

Após a etapa anterior, foram selecionados 20 casos de cada um dos grupos

(espessura normal de epitélio, acantose, atrofia epitelial e atrofia epitelial extrema),

para que fossem submetidos à técnica de imuno-histoquímica para evidenciação da

proteína p53 mutada.

Os blocos de parafina contendo as lesões que foram selecionadas foram

recuperados dos arquivos do Serviço e novos cortes histológicos, com a espessura

de 3 µm, foram obtidos com o auxílio de um micrótomo e estendidos em lâminas

previamente tratadas pelo organosilano (3-aminopropyltriethoxysilane, DAKO) que

foi utilizado com o intuito de aumentar a adesividade dos cortes nas lâminas.

Em seguida, os cortes passaram por um processo de desparafinização que

consistiu em um banho de xilol por 30 minutos, seguido por um segundo banho de

xilol por 20 minutos, ambos em temperatura ambiente. O processo seguinte foi a

reidratação em cadeia descendente de etanóis (absoluto, 95%, 90%, 85%, 80%) em

banhos de 5 minutos cada e um banho em hidróxido de amônio 10% em solução de

etanol 95 ºC para remoção do pigmento formólico. As lâminas foram lavadas em

água destilada por 5 minutos e foi realizado o tratamento de recuperação antigênica,

utilizando-se solução de EDTA (1mM), pH 9,0, em banho úmido aquecido a 95ºC,

durante 30 minutos. Após nova lavagem das lâminas em água destilada por 10

minutos foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena tecidual em solução na

proporção 1:1 de peróxido de hidrogênio a 6% e metanol, que foi realizado em 2

31

banhos de 15 minutos cada. Após lavagem em água destilada por mais 5 minutos,

as lâminas passaram por 3 banhos de 5 minutos com a solução tampão da reação

TRIS (TRIS 50mM, NaCl 150mM), pH7,6.

A seguir os cortes passaram pela incubação do anticorpo primário anti-p53

(clone PAb 240, Abcam, Cambridge, MA, EUA) que foi diluído em solução de TRIS

(TRIS 50mM, NaCl 150mM), pH7,6, acrescida de albumina bovina a 1% na

proporção de 1:500. O anticorpo foi incubado por 18 horas a 4ºC.

Após essa etapa, foi realizada a incubação do anticorpo de ligação

biotinilado e do complexo terciário por meio do uso do sistema LSAB plus (DAKO,

Carpinteria, CA, USA). Ambos foram incubados por 30 minutos a temperatura

ambiente. Entre as etapas, os cortes foram lavados na solução tampão em três

banhos de 5 minutos cada.

A diaminobenzidina (Liquid DAB plus, DAKO) foi o cromógeno da reação e foi

incubado por 10 minutos e, após nova lavagem em solução tampão, os cortes foram

contracorados com hematoxilina de Mayer, desidratados em cadeia ascendentes de

etanol, diafanizados em xilol e as lâminas montadas em resina Permount (Fischer

Scientific, Waltham, MA, EUA) e protegidas por lamínulas para observação ao

microscópio de luz.

Foram consideradas positivas as células que exibiram coloração acastanhada

nuclear. Devido ao significado biológico da mutação do gene TP53, a presença de

qualquer número de células com marcação nuclear determinou aquele caso como

positivo para presença da proteína p53 mutada.

4.4 Forma de análise dos resultados

Após obtenção dos resultados, as variações de espessura do epitélio foram

comparadas com os dois sistemas de graduação de displasia epitelial (OMS e

binário). Foram feitas duas análises:

32

a primeira que considerou as espessuras: normal, acantose e atrofia;

a segunda que considerou as espessuras: nomal, acantose, atrofia e

atrofia extrema.

Os resultados da imuno-histoquímica para a presença da proteína p53

mutada também foram comparados à ocorrência das diferentes espessuras epiteliais

na queilite actínica.

4.5 Análise estatística

Para a análise estatística da comparação das variações de espessura de

epitélio com os graus de displasia, segundo o sistema da OMS e o sistema binário,

foi utilizado o teste estatístico Z.

Para a obtenção da significância estatística entre as variações de espessura

de epitélio e a expressão da proteína p53 mutada foi realizado o teste estatístico de

Kruskal-Wallis, com auxilío do software Epi InfoTM versão 3.5.4.

O nível de significância adotado foi de 0,05 para todas as análises

estatísticas.

33

5 RESULTADOS

5.1 Casuística

Para este trabalho foram utilizados 458 casos de lesões diagnosticadas como

queilite actínica que foram enviadas para o Serviço de Patologia Cirúrgica da

Faculdade de Odontologia da USP e que foram utilizadas em um estudo anterior de

nosso grupo22. As displasias epiteliais dos 458 casos já haviam sido graduadas

utilizando o sistema da Organização Mundial da Saúde (OMS)28 e o sistema

binário29. Dos casos estudados 173 (37,77%) foram considerados como displasia

discreta, 210 (45,85%) como moderada e 75 (16,38%) como intensa, segundo o

sistema da OMS28 e 366 (79,91%) foram considerados como de baixo risco e 92

(20,09%) como de alto risco segundo o sistema binário29 de graduação de displasias

epiteliais.

5.2 Variação de espessura de epitélio e displasia epitelial

Conforme dito em Material e Métodos, a espessura foi avaliada de duas

formas diferentes. Na primeira análise, os casos foram considerados como

apresentando epitélio de espessura normal, acantose ou atrofia. Na segunda análise

os casos com atrofia foram divididos em apresentando predominantemente atrofia

ou atrofia extrema.

A figura 5.1 exemplifica cada uma das variações epiteliais consideradas para

este estudo.

34

35

Dos 458 casos de queilite actínica estudados 93 (20,31%) apresentavam

predominantemente espessura epitelial normal, 177 (38,65%) apresentavam

acantose e 188 (41,04%) apresentavam atrofia. Dos 188 casos classificados com

atrofia, 28 (14,89%) apresentavam atrofia extrema.

A tabela 5.1 apresenta os resultados para as variações de espessura de

epitélio relacionando esses achados com os graus de displasia segundo o sistema

da OMS e o sistema binário. Na tabela 5.2 são mostrados os resultados

considerando a atrofia extrema.

Tabela 5.1 - Distribuição dos casos do estudo de acordo com as variações de espessura de epitélio e os dois sistemas de graduação de displasia epitelial. Nesta análise foram consideradas as espessuras: normal, acantose e atrofia apenas

Espessura epitelial

Sistema OMS Sistema binário

Discreta Moderada Intensa TOTAL Baixo risco Alto risco TOTAL

Normal

54 33 6 93 87 6 93

58,07% 35,48% 6,45% 100% 93,55% 6,45% 100%

31,21% 15,71% 8,00% 20,31% 23,77% 6,52% 20,31

Acantose

64 64 49 177 119 58 177

36,16% 36,16% 27,68% 100% 67,23% 32,77% 100%

36,99% 30,48% 65,33% 38,65% 32,51% 63,04% 38,65%

Atrofia

55 113 20 188 160 28 188

29,25% 60,11% 10,64% 100,00% 85,11% 14,89% 100,00%

31,79% 53,81% 26,67% 41,04% 43,72% 30,43% 41,04%

TOTAL

173 210 75 458 366 92 458

37,77% 45,85% 16,38% 100,00% 79,91% 20,09% 100,00%

100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

36

Tabela 5.2 - Distribuição dos casos do estudo de acordo com as variações de espessura de epitélio e os dois sistemas de graduação de displasia epitelial. Nesta análise foram consideradas as espessuras: normal, acantose e atrofia e atrofia extrema

Espessura epitelial

Sistema OMS Sistema binário

Discreta Moderada Intensa TOTAL Baixo risco Alto risco TOTAL

Normal

54 33 6 93 87 6 93

58,07% 35,48% 6,45% 100% 93,55% 6,45% 100%

31,21% 15,71% 8,00% 20,31% 23,77% 6,52% 20,31%

Acantose

64 64 49 177 119 58 177

36,16% 36,16% 27,68% 100% 67,23% 32,77% 100%

36,99% 30,48% 65,33% 38,65% 32,51% 63,04% 38,65%

Atrofia

52 91 17 160 137 23 160

32,50% 56,87% 10,63% 100,00% 85,62% 14,38% 100,00%

30,06% 43,33% 22,67% 34,93% 37,43% 25,00% 34,93%

Atrofia extrema

3 22 3 28 23 5 28

10,71% 78,58% 10,71% 100,00% 82,14% 17,86% 100,00%

1,73% 10,48% 4,00% 6,11% 6,28% 5,43% 6,11%

TOTAL

173 210 75 458 366 92 458

37,77% 45,85% 16,38% 100,00% 79,91% 20,09% 100,00%

100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

Na análise estatística comparando os graus de displasia epitelial segundo o

sistema da OMS com as variações de espessura, notou-se uma relação positiva

entre: espessura normal e displasia discreta, acantose e displasia intensa e atrofia e

displasia moderada. Na análise considersndo a atrofia extrema separada da atofia,

esta se relaciona positivamente com a displasia moderada.

Na análise estatística comparando os graus de displasia epitelial segundo o

sistema binário com as variações de espessura, notou-se uma relação positiva

entre: acantose e lesões de alto risco e epitélio com espessura normal e atrofia com

lesões de baixo risco. Na analise considerando a atrofia extrema separada da atofia,

esta se relaciona positivamente com as lesões de alto risco.

37

5.3 Imuno-histoquímica

Para o estudo imuno-histoquímico foram selecionados 20 casos de cada uma

das variações de espessura epitelial e estes submetidos ao anticopor anti-p53 clone

PAb 240.

Dos 20 casos que apresentavam espessura normal de epitélio 5 (25%) foram

positivos para o anticorpo e, dos casos com acantose, 8 (40%) foram positivos. Com

relação aos casos que foram classificados como tendo atrofia epitelial, 7 (35%)

foram positivos para o anti-proteína p53 mutada e, por fim, dos 20 casos com atrofia

extrema, 8 (40%) foram positivos. O gráfico 5.1 apresenta estes resultados.

Grafico 5.1 - Porcentagem de casos de variações de espessura de epitélio positivos e negativos para a proteína p53 mutada

Não houve diferença estatisticamente significante na presença da proteína

p53 mutada entre os tipos de espessura epitelial em nenhuma das duas análises

(p=0,4421 e p=0,4046, quando atrofia extrema foi considerada).

A figura 5.2 exemplifica a marcação imuno-histoquímica positiva para a

proteína p53 mutada.

25% 40% 35% 40%

75% 60% 65% 60%

Normal Acantose Atrofia Extrema

Imuno-histoquímica

Positivo Negativo

38

39

6 DISCUSSÃO

A queilite actínica é uma desordem potencialmente maligna sabidamente

causada pela radiação ultravioleta (UV) que atinge o nosso planeta através dos raios

solares19,20. Esta lesão antecede, virtualmente, todos os carcinomas epidermoides

de lábio3.

A principal característica histopatológica da queilite actínica é apresentar

displasia epitelial, que pode ser de qualquer grau19. A graduação das displasias

epiteliais é feita pela avaliação das alterações arquiteturais e citológicas que o tecido

sofreu26, entretanto, esta graduação é de caráter subjetivo, pois a técnica depende

do examinador que realiza a classificação das alterações que o tecido sofreu27.

O objetivo de todos os sistemas de graduação de displasias já propostos é

chegar a um diagnóstico mais preciso das desordens potencialmente malignas, para

tentar estabelecer em que estágio de progressão a lesão se apresenta, e

determinar, por meio dos achados morfológicos, o prognóstico da lesão e o

tratamento mais indicado26. Entretanto, como já foi dito, esta técnica depende do

examinador27 e é subjetiva. Mais recentemente, o sistema binário de graduação foi

proposto. Esse sistema divide as lesões em baixo e alto risco após uma contagem

do número de alterações citológicas e arquiteturais presentes. A tentativa é de

reduzir a subjetividade da graduação29.

É importante ressaltar que ainda não foram encontrados marcadores

biológicos que permitam estabelecer como será a progressão dessas desordens

potencialmente malignas29.

Embora não seja considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS)

como um dos critérios a serem avaliados para graduação histológica das displasias,

a variação de espessura epitelial é um achado frequente das desordens

potencialmente malignas57, incluindo a queilite actínica22,25. As variações de

espessura de epitélio na queilite actínica são a acantose e a atrofia. A acantose é

caracterizada pelo espessamento da camada espinhosa do epitélio, conduzindo a

uma hiperplasia do mesmo, enquanto a atrofia é a diminuição no número de

camadas23.

40

O objetivo deste trabalho foi determinar, em uma coleção de casos de queilite

actínica, a frequência de aparecimento de epitélio com espessura normal, com

acantose ou com atrofia epitelial. Além disso, em uma segunda análise, os casos

com atrofia foram divididos em atrofia e atrofia extrema, achado que foi

anteriormente observado por nosso grupo e que foi definido como epitélio

constituído por poucas camadas de células, tipicamente quatro a seis camadas22.

Inicialmente, para que se pudesse definir a espessura que seria considerada

como normal, acantose ou atrofia, foi necessário determinar o que seria a espessura

normal do epitélio do vermelhão do lábio. Como não foi possível encontrar esse

dado na literatura, optou-se por uma análise inicial de cortes histológicos que

contivessem epitélio do vermelhão do lábio e que não demonstrassem alterações

sugestivas da ação solar (displasia epitelial e elastose solar).

Após essa análise, para este trabalho, foram considerados como epitélio

exibindo acantose, os que apresentaram espessura pelo menos uma vez e meia

maior que a espessura considerada como normal. Os cortes considerados como

tendo atrofia foram aqueles que apresentaram metade ou menos da espessura

considerada como normal. Essas variações de espessura de epitélio foram

relacionadas com o grau de displasia epitelial utilizando-se os sistemas de

graduação de displasia epitelial proposto pela OMS 28 e o sistema binário 29.

Observou-se que, dos 458 casos de queilite actínica estudados, a maior parte

apresentou alguma variação de espessura de epitélio, totalizando 79,69% da

amostra. Apenas 20,31% dos casos revelaram espessura de epitélio considerada

normal. A atrofia foi a alteração encontrada com maior frequência (41,04%), embora

a quantidade de casos com acantose tenha sido semelhante, correspondendo a

38,65% da amostra. Quando os casos com atrofia extrema foram analisados

separadamente, nota-se que 6,11% da amostra apresentaram esta alteração.

A ocorrência de alteração de espessura de epitélio em lesões de queilite

actínica é comumente observada na literatura, pois a presença de acantose ou

atrofia é achado frequente no epitélio dessa lesão3,24,25, embora nenhum outro

trabalho tenha analisado de forma sistemática estas alterações e nem em amostra

tão ampla Trabalhos anteriores que analisaram a variação de espessura do epitélio

na queilite actínica encontraram a acantose como achado mais frequente19,24,25,

41

diferindo dos resultados destes trabalho. Deve-se ressaltar que, na queilite actínica,

a área examinada tende a não ser uniforme, podendo compreender não apenas a

região do vermelhão de lábio, mas também, a mucosa labial, que é caracterizada

por um epitélio mais espesso22.

Este trabalho também comparou as variações de espessura de epitélio

encontradas nos casos de queilite actínica com os graus de displasia epitelial

obtidos segundo o sistema proposto pela OMS28 e segundo o sistema binário

proposto por Kujan et al29.

O que se observa é que a maioria dos casos (58,07%) com espessura normal

foi graduada como tendo displasia epitelial discreta, enquanto 60,11% dos casos

com atrofia foram considerados como displasia moderada. Já os casos com

acantose distribuíram-se mais igualitariamente entre os três graus de displasia.

Na avaliação que separou os casos com atrofia extrema, pode-se notar que

78,58% desses casos foram graduados como apresentando displasia epitelial

moderada. O que se tem notado no Serviço de Patologia Cirúrgica da Faculdade de

Odontologia da USP é que casos que apresentam atrofia extrema tendem a

apresentar distúrbios que comprometem a estratificação epitelial 22.

Os resultados mostram, também, que a maior parte dos casos de queilite

actínica graduados como displasia epitelial intensa apresentou acantose do epitélio,

seguido da atrofia. A presença de acantose já foi relacionada ao aumento do grau de

displasia em outro estudo no qual ela foi observada e foi proposto que essa

associação possa significar que o dano à camada basal foi um evento inicial e a

exposição crônica ao sol pode ter causado o espessamento dessa camada19,24.

Os casos que apresentavam displasia epitelial discreta segundo a

classificação da OMS somaram 173 (37,77%) casos e a distribuição das variações

de espessura do epitélio foi bastante semelhante nesse grupo. Apenas a atrofia

extrema foi diferente, com uma incidência bastante baixa de 1,73% dos casos.

Quando as 458 lesões foram graduadas segundo o sistema binário, em baixo

ou alto risco, a dificuldade em se interpretar os resultados está no fato da grande

maioria dos casos ter sido considerada como baixo risco (79,91%), portanto, em

todas as variações de espessura, a maior parte dos casos foi graduada como baixo

42

risco. Por outro lado, quando se analisa dentre os casos que foram considerados de

baixo ou alto risco, qual a proporção de cada uma das variações epiteliais, nota-se

que a atrofia foi considerada como a variação predominante em 43,72% dos casos

graduados como de baixo risco e a acantose foi a mais fequente dentre as displasias

de alto risco, correspondendo a 63,04% dos casos.

Tanto o sistema da OMS quanto o binário se baseiam em alterações

morfológicas sofridas pelos tecidos28, mas sabe-se que não são classificações

precisas, pois dependem da interpretação subjetiva de achados morfológicos pelo

examinador. É bem discutido na literatura que a graduação histológica não é

suficiente para determinar quais casos de desordens potencialmente malignas

realmente irão evoluir para um carcinoma invasivo26. Por esse motivo, faz-se

fundamental a busca por um marcador biológico que possa demonstrar

precocemente essa predisposição, marcador este, que não foi determinado para

lesões de boca58,59.

Já foi observado que o gene TP53 pode apresentar mutações associadas à

exposição excessiva à radiação UV. Estas mutações são conhecidas como

mutações com assinatura UV53.

Já foram realizados outros trabalhos em que foi observada a expressão da

proteína p53 em lesões de queilite actínica, entretanto, o clone utilizado na maioria

desses estudos foi o DO-7 que não apresenta especificidade para a proteína

mutada, ou seja, detecta tanto a proteína nativa, quanto a mutada58,60. Para este

estudo selecionou-se o anticorpo anti-p53 clone PAb240 que é específico para a

proteína mutada, pois seu epítopo é uma sequência de cinco aminoácidos que só se

manifesta na mutação mais comum do gene TP5355.

Não foi objeto desse estudo comparar espressão da proteína p53 mutada

com o grau de displasia epitelial presente nas lesões de queilite actínica visto que já

foi objeto de estudo de nosso grupo em um outro trabalho onde ficou percebido que

87,5% dos casos estudados apresentou alguma positividade para a proteína

mutada, o que mostra a importância da mutação no gene TP53 na

fotocarcinogênese em lábio61.

43

Os resultados mostraram que, dos casos considerados com espessura

normal de epitélio, 25% revelaram presença da proteína p53 mutada, enquanto 40%

dos casos de acantose, 35% dos casos de atrofia e 40% dos casos de atrofia

extrema tiveram expressão da marcação.

Não há nenhum trabalho em que se compara a expressão da proteína p53

mutada com as variações de espessura do epitélio da queilite actínica.Trabalhos que

utilizaram o clone DO-7 em lesões de QA aprsentaram uma presença de 60% de

positividade62 e de 85% de positividade60, enquanto que neste trabalho foi

observada 35% de positividade. Isso se deve ao fato de que o clone DO-7 não é

espicífico para a proteína p53 mutada, enquanto que o PAb240, que foi utilizado

neste trabalho, é específico para a proteína mutada51.

Em nosso caso, essa diferença não foi estatisticamente significante, portanto,

pode-se afirmar que a mutação do gene TP53 não está relacionada às variações de

espessura do epitélio na queilite actínica. Por outro lado, deve-se ressaltar que

ocorrem mutações nesse gene mesmo em casos de queilite actínica em que não é

observada a presença de alteração de espessura de epitélio. Esse achado aponta

para o risco da ocorrência de uma progressão para uma lesão maligna mesmo em

casos de queilite actínica em que as alterações epiteliais são poucas, visto que a

mutação no gene TP53 é sabidamente um evento inicial na fotocarcinogênese 63.

Outro achado interessante é que tanto na acantose, quanto na atrofia

extrema, ocorreu uma maior positividade da proteína p53 mutada. Foi observado

que na acantose também ocorreu o maior número de casos graduados como

displasia epitelial intensa (49 casos = 27,68% da amostra), segundo a classificação

da OMS. Já na atrofia extrema, apenas 3 casos (10,71%) foram observados como

apresentando displasia epitelial intensa, segundo a classificação da OMS, tendo a

maioria de seus casos graduados como displasia epitelial moderada, segundo esta

mesma classificação. Entretanto, como já foi dito, em nosso serviço, tem se notado a

presença de distúrbios que comprometem a estratificação epitelial em casos de

atrofia epitelial extrema22, o que pode indicar um quadro displásico mais severo,

condizente com a porcentagem de positividade para o anticorpo utilizado.

Por conta disso, o que se percebe é que, nem sempre a classificação do grau

da displasia epitelial é suficiente para predizer como evoluirá uma determinada lesão

44

com potencial de transformação maligna, pois lesões que apresentaram uma maior

porcentagem de casos classificados como displasia epitelial moderada, segundo a

classificação da OMS foram tão positivas para a proteína p53 mutada quanto

àquelas que apresentaram uma maior quantidade de casos que mostraram displasia

epitelial intensa.

Por fim, o que se pode dizer é que, tanto o epitélio com espessura normal,

como todas as variações de espessura de epitélio apresentaram a presença de

proteína p53 mutada, o que indica que todas elas podem evoluir para uma lesão

maligna e que isso independe do grau de displasia epitelial.

Tomando como base os achados dessa pesquisa, pode-se pensar que a

busca por marcadores prognósticos é fundamental, pois os sistemas de graduação

de displasias epiteliais não refletem as alterações moleculares e já mostraram que

nem sempre podem predizer quais lesões evoluirão para uma lesão maligna 27.

45

7 CONCLUSÃO

Neste trabalho concluiu-se que:

A variação de espessura de epitélio ocorre na maioria dos casos de

queilite actínica;

A acantose é a variação de espessura de epitélio mais relacionada a

distúrbios arquiteturais e citológicos, pois tanto na comparação com o

sistema de graduação da OMS, quanto na comparação com o sistema

binário, foi notada uma maior ocorrência de acantose nos graus de

displasia epiteliais mais altos;

Não foi observada relevância estatística quando as variações de

espessura de epitélio foram comparadas à proteína p53 mutada;

A presença de proteína p53 mutada foi notada em todas as variações

de espessura de epitélio, incluindo aquela considerada normal,

portanto, não há um relação entre esta alteração genética e as

alterações morfológicas estudadas.

Em conclusão, o acompanhamento clínico dos pacientes de queilite actínica é

de caráter essencial, já que ainda não há como determinar, com clareza, qual destas

lesões evoluirá para uma neoplasia maligna.

46

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ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

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