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Programa de Ps-Graduao em Biocincias e Biotecnologia Aplicadas
Farmcia
EFEITO DA INFLAMAO DO TORNOZELO SOBRE AS
CARACTERSTICAS HISTOLGICAS, A EXPRESSO
GNICA E NVEIS DA CREATINA CINASE NOS
MSCULOS SLEO E TIBIAL ANTERIOR DE RATOS
DIABTICOS
CLARA MARIA PINHEIRO
ARARAQUARA SP 2011
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
JLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
CMPUS DE ARARAQUARA
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CLARA MARIA PINHEIRO
EFEITO DA INFLAMAO DO TORNOZELO SOBRE AS
CARACTERSTICAS HISTOLGICAS, A EXPRESSO GNICA E NVEIS
DA CREATINA CINASE NOS MSCULOS SLEO E TIBIAL ANTERIOR DE
RATOS DIABTICOS
Equipe de trabalho:
Orientador: Prof. Dr. Iguatemy Loureno Brunetti1
Co-Orientadora: Profa. Dra. Tania de Ftima Salvini2
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
ARARAQUARA SP 2011
1 Prof. Dr., Departamento de Anlises Clnicas, UNESP Araraquara.
2 Profa. Titular, Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de So Carlos.
Dissertao de Mestrado no
Programa de Ps-Graduao de
Biocincias e Biotecnologia
Aplicadas Farmcia da Faculdade
de Cincias Farmacuticas da
Universidade Estadual Paulista
Julio de Mesquita Filho campus Araraquara como parte dos
requisitos para o ttulo de mestre
em Biocincias e Biotecnologia
Aplicadas Farmcia. rea de
concentrao: Bioqumica.
kl
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EFEITO DA INFLAMAO DO TORNOZELO SOBRE AS
CARACTERSTICAS HISTOLGICAS, A EXPRESSO GNICA E NVEIS
DA CREATINA CINASE NOS MSCULOS SLEO E TIBIAL ANTERIOR DE
RATOS DIABTICOS
COMISSO EXAMINADORA
Prof. Dr. Iguatemy Loureno Brunetti
Orientador e Presidente da Comisso Examinadora - UNESP
Profa. Dra. Amanda Martins Baviera
Universidade Federal do Mato Grosso - UFMT
Prof. Dr. Thiago Luiz de Russo
Universidade Federal de So Carlos - UFSCar
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Os teus sonhos foram muito mais alm do que os teus ps pisaram. Os teus sonhos iro muito mais alm de onde j chegaram. (Trecho da msica Dom Bosco dos Sonhos de Dalcides Biscalquin)
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Dedico este trabalho minha famlia que
sempre me incentivou e apoiou na
realizao de mais um sonho.
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AGRADECIMENTOS
A experincia vivenciada durante o perodo do mestrado, sempre esteve acompanhada
por muitas pessoas que me ajudaram e ofereceram sua colaborao, apoio e conselho
nos momentos mais difceis. Agradeo pela ajuda de todos, pessoas que foram e
continuam sendo muito importantes em minha vida, pois me ajudaram a realizar mais
um sonho. Nos momentos mais difceis que conhecemos a verdadeira amizade. Fico
muito lisonjeada em saber que sou rodeada de pessoas queridas e que me ajudaram
prontamente quando eu mais precisei.
Primeiramente agradeo a Deus, sempre presente em minha vida, dando-me coragem e
fora para seguir em frente na realizao dos meus sonhos. Sinto que estou sempre em
suas mos.
Agradeo imensamente a minha famlia, em especial meus pais, Noel e Beth, meu irmo
Guilherme, minha cunhada Karina, meu sobrinho Henrique (que me chama
carinhosamente de Tatinha) e minha madrinha Teresinha. A todos vocs obrigada de
corao por andarem comigo, pelo apoio e confiana em mim, por estarem sempre na
torcida e por me ensinarem o verdadeiro sentido do AMOR e de FAMLIA.
Ao meu orientador e professor Iguatemy Loureno Brunetti, por me aceitar em seu
laboratrio. Obrigada pela ateno, pacincia e calma, dignas de uma pessoa sria, mas
extrovertida. Obrigada pelo incentivo e apoio para a apresentao do meu trabalho em
um congresso internacional, que me acrescentou muitas experincias e permitiu
conhecer o estado da arte em msculos esquelticos. Momentos que guardarei para o
resto de minha vida, com a principal lio: nunca estamos sozinhos!
minha co-orientadora e professora Tania de Ftima Salvini pela parceria com o
Laboratrio de Plasticidade Muscular que contribuiu para a realizao dessa pesquisa,
sempre abrindo portas, pela ateno e aprendizado compartilhados.
amiga Sabrina Peviani Messa, que desde a minha iniciao cientifica sempre me
incentivou no caminho da cincia e me ajudou com tanto carinho, pacincia e
dedicao. Quanto deu devo a voc! Nunca me esquecerei que sempre acreditou em
mim. Obrigada pelas conversas e pelos momentos de descontrao durante a nossa
convivncia e principalmente na fase final desse trabalho e durante a deciso de viajar
ou no para o congresso. Que Deus continue te abenoando!
Ao Guilherme e ao Hugo por tantas caronas para Araraquara.
Aos amigos e colegas do Laboratrio de Bioqumica Vnia Ortega (Cabedal), Renata,
Juliana, Vanessa, Marciano, Ricardo, Andr e Tnia pela convivncia diria,
compreenso e auxilio, troca de experincias, aprendizado e amizade.
Vnia (Cabedal) obrigada por estar sempre disposta a me ajudar, pelas risadas,
conselhos e principalmente por me ajudar na realizao desse trabalho, com tantos
detalhes... Continue sendo essa pessoa animada e divertida! Obrigada por sempre me
acompanhar nos sorvetes do Chiquinho nas tardes quentes em Araraquara.
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Ao pessoal do Laboratrio de Plasticidade Muscular Sabrina, Joo, Gabriel, Thiago,
Davilene, Fernanda, Rubia, Paula, Catarina, Mar, Marcela, Cris. Obrigada pela
pacincia e pela convivncia.
Ao Joo, Gabriel e Sabrina. Descobri em vocs verdadeiros amigos, sei que posso
confiar em vocs de olhos fechados, nos momentos fceis e principalmente nos difceis.
Obrigada pela pacincia e dedicao. Gostaria que soubessem que sem o apoio de
vocs, talvez eu no teria participado do congresso na Alemanha. Todas as vezes que
falava do meu medo, vocs sempre me lembravam que eu seria capaz. Obrigada pelo
incentivo e pelos pensamentos positivos para que tudo fosse maravilhoso, como
realmente aconteceu.
Aos tcnicos Marcos (Laboratrio de Bioqumica - UNESP e tambm Cabedal) e Teresa
(Laboratrio de Plasticidade Muscular), muito obrigada pela ajuda, conversas e risadas.
As minhas amigas Maria Luiza e Kamilla, tambm companheiras de ps-graduao em
outras instituies, mas que sempre se mostraram preocupadas, atenciosas e
compreensivas durante essa etapa da minha vida. Obrigada pela amizade verdadeira
durante todos esses anos. Vocs so muito especiais.
Aos meu primos, primas e familiares que me acompanharam nas fases e conquistas da
minha vida, sintam-se carinhosamente lembrados.
Rosemira pelas conversas e risadas, com um alto astral, contagiando todos ao seu
redor. Quantas histrias de tomates!!
s Professoras Maria Teresa Pepato e Regina Vendramini pelo apoio durante a
realizao desse estudo.
todos que direta ou indiretamente participaram para o desenvolvimento dessa
pesquisa.
Ao CNPq pela concesso da bolsa de estudos e a Fundao de Amparo a Pesquisa do
Estado de So Paulo - FAPESP - pelo financiamento dessa pesquisa.
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RESUMO
O Diabetes Mellitus um dos mais importantes problemas de sade pblica,
ocasionando complicaes crnicas como a atrofia muscular e perda da qualidade de
vida do paciente. Quando ocorre uma leso articular, o msculo responde com um
processo de atrofia onde gerada uma modificao no tecido muscular funcionalmente
relacionado com essa articulao. Contudo, estudos experimentais que contribuam ao
esclarecimento da relao entre inflamao articular e as modificaes histolgicas e da
expresso gnica do msculo de animais diabticos no tm sido desenvolvidos. Outro
parmetro importante que deve ser estudado a atividade da enzima creatina cinase
(CK) uma vez que sua atividade pode ser alterada em funo de vrias causas como na
injria, distrofia, inflamao ou necrose da musculatura esqueltica ou cardaca. O
presente projeto teve por objetivo estudar o efeito da inflamao aguda do tornozelo
sobre os msculos Sleo (SO) e Tibial Anterior (TA), investigando a presena de
alteraes histolgicas, alteraes na expresso gnica dos atrogenes atrogina-1e
MuRF-1 e na atividade da creatina cinase em msculos de ratos no-diabticos e
diabticos com e sem tratamento insulnico. Foram estudados 54 ratos Wistar (150g). A
induo do diabetes foi por via intrapenitoneal com 50mg de estreptozotocina (STZ) por
Kg de peso corporal, dissolvida em tampo citrato pH 4,5. Para a inflamao a
articulao do tornozelo foi mantida em 90 localizando a fossa distal e posterior ao
malolo lateral, introduzindo nesta zona uma agulha de dimetro 26 com 0.03ml
carragenina a 3%. Os grupos de animais diabticos com terapia insulnica foram
tratados duas vezes ao dia (as 8h e 17h) com 2,5 U de insulina NPH durante 13 dias,
totalizando 5U/dia A insulina foi administrada por via subcutnea. Os animais foram
divididos em 9 grupos com 6 ratos/grupo: i) animais no diabticos: Controle (C);
Citrato (Ci); Salina (S); Inflamado (Ca); ii) animais diabticos: Diabtico (D); Diabtico
tratado com Insulina (DI); Diabtico Salina (DS); Diabtico e Inflamado (DCa);
Diabtico e Inflamado, tratado com insulina (DCaI). Os msculos TA e SO destes
animais foram avaliados aps 13 dias de diabetes e 3 dias de inflamao da articulao
tbio-tarsica direita. O diabetes juntamente com a articulao inflamada promove uma
maior expresso de genes relacionados atrofia, com diminuio de massa nos dois
msculos estudados, sendo que a insulina no foi capaz de reverter essa situao no
msculo TA. Demonstrando que a regulao diferente entre msculos de contrao
lenta (SO) e msculos de contrao rpida (TA). Houve menor atividade da CK
somente no SO do grupo DCa (p
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10
ABSTRACT
Diabetes mellitus is one of the most serious public health problems, which diminishes
the quality of life of the patient and leads to many chronic complications, one of which
is muscle atrophy. When a joint is injured, the muscle responds with a process of
atrophy in which a change occurs in the muscle tissue functionally related to the
joint. However, no experimental studies have been carried out to clarify the relationship
between joint inflammation and changes in the histology and gene expression of
muscles in diabetic animals. Another important variable that should be studied is the
activity of the enzyme creatine kinase (CK), since it can be altered under various
conditions, such as injury, muscular dystrophy, inflammation or necrosis of skeletal or
heart muscle. The aim of this project was to study the effect of acute inflammation of
the ankle on the soleus (SO) and tibialis anterior (TA) muscles, by noting the
histological changes, changes in the expression of the atrophy-related genes (atrogenes)
atrogin-1 and MuRF-1 and activity of CK in muscles of non-diabetic and diabetic rats,
treated and untreated with insulin. We studied 54 Wistar rats (150g). Diabetes was
induced by intraperitoneal injection of 50mg streptozotocin (STZ) per kg body weight,
dissolved in citrate buffer (pH 4.5). To induce inflammation, the ankle joint was held at
90, with the fossa located distal and posterior to the lateral malleolus, and inserting a
26-gauge needle into this region, with 0.03mL of 3% carrageenan. The groups of
insulin-treated diabetic animals were treated twice a day (at 8 am and 5 pm) by
subcutaneous injection with 2.5 IU of NPH insulin, totaling 5 IU/day, for 13 days. The
animals were divided into 9 groups of 6 rats per group: i) non-diabetic animals: control
(C), citrate (Ci), saline (S), inflamed (Ca); ii) diabetic animals: diabetic (D),
diabetic treated with insulin (DI), diabetic saline (DS), diabetic inflamed (DCa) and
inflamed diabetic treated with insulin (DCaI). The TA and SO muscles of these animals
were assessed after 13 days of diabetes and 3 days of inflammation of the right tibio-
tarsal (ankle) joint. Diabetes combined with an inflamed joint promoted an increased
expression of genes related to atrophy, leading to a reduction in the mass of both
muscles. Insulin was unable to reverse this situation in the TA muscle, demonstrating
that the regulation is different between slow-twitch muscles (SO) and fast-twitch
muscles (TA). CK activity was lower only in the SO muscle of the DCa group (p
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11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Homeostase da glicose ............................................................................ 21
Figura 2. Reao da enzima creatina cinase ........................................................... 33
Figura 3. Fluxograma para diviso dos grupos de estudo....................................... 40
Figura 4. Fluxograma do experimento ................................................................... 41
Figura 5. Mecanismos propostos de toxicidade induzida pela STZ ....................... 43
Figura 6. Recipiente de vidro utilizado para medio do volume........................... 45
Figura 7. Medida de volume do tornozelo ............................................................. 45
Figura 8. Diviso do msculo TA aps sua retirada .............................................. 46
Figura 9. Variao da Massa Corporal ................................................................... 54
Figura 10. Glicemia dos ratos nos diferentes grupos experimentais 1 dia aps
aplicao de STZ .....................................................................................................
56
Figura 11. Massa do msculo TA dos diferentes grupos experimentais 3 dias
aps a administrao de carragenina na articulao do tornozelo direito e 10 dias
da injeo de STZ ....................................................................................................
58
Figura 12. Massa do msculo SO dos diferentes grupos experimentais 3 dias
aps a administrao de carragenina na articulao do tornozelo direito, e 10 dias
aps a injeo de STZ..............................................................................................
59
Figura 13. Cortes transversais das fibras musculares dos msculos TA corados
com azul de toluidina ..............................................................................................
60
Figura 14. rea de Seco Transversa das fibras do msculo TA dos diferentes
grupos experimentais, 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao
do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ..............................................
61
Figura 15. Expresso Gnica da atrogina-1 no msculo TA dos diferentes
grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao
do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .............................................
62
-
12
Figura 16. Expresso Gnica do MuRF-1 no msculo TA dos diferentes grupos
experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao do
tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .................................................
63
Figura 17. Expresso Gnica da atrogina-1 no msculo SO dos diferentes grupos
experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao do
tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ ..................................................
64
Figura 18. Expresso Gnica do MuRF-1 no msculo SO dos diferentes grupos
experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao do
tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ ..................................................
65
Figura 19. Nveis musculares da atividade de CK do msculo TA dos diferentes
grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao
do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .............................................
67
Figura 20. Nveis musculares da atividade de CK do msculo SO dos diferentes
grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao
do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .............................................
68
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13
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Primers construdos com senso e antisenso para atrogina-1 , MuRF-1 e
GAPDH ...................................................................................................................
49
Tabela II. Comparao do volume (mdia desvio padro) (ml) dos grupos ......... 66
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14
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP: trifosfato de adenosina
AST: rea de seco transversa
CK: creatina cinase
cDNA: fita de DNA complementar
DM: diabetes mellitus
DO: densitometria ptica
EDL: msculo extensor digital longo
E1: enzima de ativao
E2: enzima de conjugao transporte
E3: enzima de ligao ligases
GOD: glicose oxidase
H2O2: perxido de hidrognio
IGF-1: fator de crescimento semelhante insulina tipo 1
IMA: inibio muscular artrognica
LCA: ligamento cruzado anterior
MN : motoneurnio alfa.
MuRF-1: muscle Ring Finger-1
NO: xido ntrico
OMS: Organizao Mundial de Sade
PCR: amplificao por reao em cadeia de polimerase
POD: peroxidase
PT: protenas totais
RT: transcrio reversa
RMA: resposta muscular artrogncia
SO: msculo sleo
STZ: estreptozotocina
SOD: superxido dismutase
TA: msculo tibial anterior
TNF : fator de necrose tumoral alfa
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15
SUMRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
1. INTRODUO................................................................................................. 18
1.1 Diabetes................................................................................................................ 20
1.2 Diabetes e Msculo Esqueltico.......................................................................... 23
1.3 Vias Proteolticas envolvidas na atrofia muscular............................................... 25
1.4 Processo Inflamatrio.......................................................................................... 28
1.5 Modelo Inflamatrio com carragenin................................................................. 29
1.6 Resposta Muscular frente s modificaes articulares........................................ 29
1.7 Atrofia Muscular por desuso................................................................................ 31
1.8 Creatina Cinase.................................................................................................... 33
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 37
3. MATERIAIS E MTODOS............................................................................. 39
3.1 Animais ............................................................................................................... 39
3.2 Grupos Experimentais.......................................................................................... 39
3.3 Modelo de induo do diabetes por STZ............................................................. 41
3.4 Terapia insulnica................................................................................................. 43
3.5 Modelo inflamatrio............................................................................................ 43
3.6 Glicemia............................................................................................................... 44
3.7 Volume................................................................................................................. 44
3.8 Retirada dos Msculos......................................................................................... 45
3.9 Anlise Histolgica.............................................................................................. 46
3.10 Extrao de RNA total......................................................................................... 47
3.11 Transcrio Reversa............................................................................................. 47
3.12 Real Time PCR................................................................................................. 48
3.13 Oligonucleotdeos primers................................................................................... 49
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16
3.14 Determinao de Protenas Totais....................................................................... 49
3.15 Determinao dos nveis de creatina cinase......................................................... 50
4. ANLISE ESTATSTICA DOS RESULTADOS.......................................... 52
5. RESULTADOS ................................................................................................. 54
5.1 Massa Corporal.................................................................................................... 54
5.2 Glicemia............................................................................................................... 55
5.3 Massa dos Msculos TA e SO............................................................................. 57
5.4 rea de seco Transversa................................................................................... 59
5.5 Expresso Gnica no msculo TA....................................................................... 61
5.6 Expresso Gnica no msculo SO....................................................................... 63
5.7 Volume................................................................................................................. 65
5.8 Creatina Cinase.................................................................................................... 67
6. DISCUSSO....................................................................................................... 70
7. CONCLUSO.................................................................................................... 78
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................. 80
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17
Introduo
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18
1.0 INTRODUO
O msculo esqueltico um dos tecidos que apresentam grande plasticidade no
corpo humano, sendo sua composio fundamental para a sua funo de prover
mobilidade ao sistema sseo, gerar calor em resposta ao frio, alm de captar parte da
glicose circulante no organismo. Sua funo pode ser modificada em resposta a
mudanas na carga, atividade ou condies patolgicas. Por isso perodos prolongados
de desuso, desnervao e imobilizao resultam em significativa atrofia muscular
(LIEBER, 2002; BRUTON, 2002; ZHANG et al., 2006; FERREIRA et al., 2006).
Assim os msculos esquelticos so tecidos dinmicos que podem alterar suas
caractersticas fenotpicas proporcionando uma melhor adaptao funcional frente a
estmulos variados.
O msculo esqueltico apresenta uma organizao anatmica muito bem
definida. Ele constitudo por fibras recobertas por uma bainha de tecido conjuntivo
fibroso, o endomisio. Essas fibras individuais so agrupadas por um segundo tecido
conjuntivo, o perimsio, para formar fascculos de fibras. Finalmente todos os fascculos
so agrupados para formar o msculo que rodeado por um denso tecido conjuntivo, o
epimsio. Diferente dos aspectos histolgicos e morfolgicos que so iguais para todas
as fibras do msculo esqueltico, as respostas fisiolgicas e bioqumicas podem ser
diferentes de acordo com o estmulo na qual as fibras so expostas (FLUCK;
HOPPELER, 2003).
A composio do msculo em relao aos diferentes tipos de fibras depende da
funo. As fibras musculares podem ser classificadas em dois tipos principais: I e II.
Isso se d por meio de caractersticas fisiolgicas e bioqumicas. As fibras tipo I so de
contrao lenta gerando energia atravs de processos aerbicos, com menor velocidade
de propagao do clcio, e apresentam grande nmero de mitocndrias, sendo muito
resistente fadiga; recebe maior vascularizao e contm altos nveis de mioglobina,
tem baixa velocidade de contrao, relaxamento e baixa capacidade de gerar fora. As
fibras do tipo II so de contrao rpida com maior velocidade de contrao e obtm
energia atravs de processos anaerbicos. Tem alta capacidade de conduo do
potencial de ao, rpida propagao de clcio, com alta velocidade de contrao e
relaxamento, grande capacidade de gerar fora, pouca resistncia e capilarizao, baixo
nmero de mitocndrias e reduzida quantidade de mioglobina. As fibras de contrao
-
19
rpida so classificadas em vrios subtipos, com base na imunohistoqumica com
anticorpos especficos para a cadeia pesada de miosina (MHC), podendo ser dos tipos
IIa, IIb, IIc e IId (BOFF, 2008). A fibra IIa uma fibra rpida intermediria, possuindo
potencial moderadamente desenvolvido para gerao de fora tanto por processos
aerbicos e anaerbicos, sendo portanto de contrao rpida porm com certa
resistncia a fadiga. A fibra IIb possui maior potencial anaerbico, sendo portanto de
contrao mais rpida porm mais fatigvel que a IIa. Existem tambm as fibras
hbridas, tipos IC, IIC, IIAC, IIAD, IIDA, IIBD e IIDB, formadas pela expresso de
duas ou mais isoformas da MHC. Elas resultam da coexpresso de pares especficos de
isoformas da MHC. Msculos posturais possuem uma maior proporo de fibras de
contrao lenta (tipo I) e resistente fadiga, enquanto que os msculos envolvidos na
locomoo so compostos predominantemente por fibras de contrao rpida (tipo II) e
menos fatigveis (LIEBER, 2002).
O principal tecido que mais utiliza a glicose o crebro, e de forma
independente da insulina; segue em importncia o msculo esqueltico que difere do
primeiro, uma vez que necessita da insulina para captao da glicose sangunea.
Indivduos diabticos apresentam ausncia ou deficincia na produo de insulina e/ou
resistncia ao hormnio, o que leva a alteraes no metabolismo dos carboidratos,
protenas e lipdeos, e a desordens musculares como a atrofia muscular e a neuropatia
perifrica. O hormnio anablico insulina sintetizado pelo pncreas mantido em nveis
plasmticos adequados devido a rigorosos mecanismos de regulao (CHONKAR et al.,
2006). H tambm mecanismos contra-reguladores, como a secreo dos hormnios:
adrenalina, nor-adrenalina, cortisol e hormnio do crescimento, cuja ao contrria
insulina para que ocorra a gliconeognese.
As fibras musculares tm capacidade de alterar suas propriedades fisiolgicas e
bioqumicas de acordo com os estmulos a que so submetidas, com o resultado
refletindo na quantidade ou tipo das protenas musculares. Esta capacidade adaptativa
envolvendo diferentes componentes da fibra reflete a plasticidade muscular
(BALDWIN; HADDAD, 2001; PILEGAARD et al., 2000; PETTE, 2002).
Alteraes nas articulaes tambm podem levar a atrofia muscular devido a
diminuio do uso da articulao afetada pelo edema e/ou por dor, sendo assim, torna-se
importante conhecer a resposta muscular esqueltica frente s diversas situaes como
as alteraes da fisiologia e biomecnica articular em msculo de ratos diabticos.
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20
1.1 Diabetes
O Diabetes Mellitus (DM) um dos mais srios problemas de sade pblica,
devido ao aumento de sua prevalncia e de suas complicaes; afeta a populao de
pases em todos os estgios de desenvolvimento. De acordo com a Organizao
Mundial de Sade, o Brasil o sexto pas com maior nmero de pessoas com diabetes
(SACCO et al., 2007), sendo que no mundo 285 milhes de pessoas adultas (entre 20 e
79 anos) so diabticas e em 2030 previsto um aumento de 7,7% com 439 milhes de
adultos diabticos. Os fatores que levaro a esse aumento no nmero de pessoas
diabticas so o crescimento e envelhecimento populacional, assim como a urbanizao,
associados a mudanas no estilo de vida. Esse aumento ser maior em paises em
desenvolvimento, 69% de aumento de adultos diabticos, enquanto pases
desenvolvidos sofrero um aumento de 20% (SHAW et al., 2010).
O DM faz parte de um grupo de doenas metablicas caracterizadas por
hiperglicemia resultante de defeitos na secreo, produo e/ou resistncia tecidual a
insulina. A hiperglicemia crnica no diabetes est associada a danos de longo prazo
referente disfuno e falncia de vrios rgos e tecidos especialmente olhos, rins,
nervos, vasos sanguneos, msculos cardaco e esqueltico. Essas complicaes
crnicas contribuem para o aumento da morbidade e mortalidade, ocasionando perda da
qualidade de vida do diabtico (FERNANDES et al., 2001; COMMITTEE REPORT ,
2003; SACCO et al., 2007).
-
21
Figura 1. Homeostase da Glicose
(retirada de http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/diabetes/diabetes-mellitus-6.php)
Os processos de captao e liberao da glicose so regulados por hormnios. A
insulina o mais importante desses hormnios, uma vez que o nico hormnio capaz
de diminuir os nveis de glicose no sangue mantendo sua homeostasia, como
apresentado na Figura 1. A insulina sintetizada e secretada pelas clulas beta (clulas
) das ilhotas de Langerhans do pncreas de acordo com a demanda do organismo, e
consegue diminuir os nveis de glicose no sangue promovendo a sua captao por vrios
tipos de clulas, entre elas micitos, adipcitos e hepatcitos. No tecido adiposo, a
insulina facilita a converso de glicose em cidos graxos (lipognese) e inibe a quebra
de lipdeos (liplise). No fgado, a insulina estimula a converso de glicose em
glicognio e cidos graxos, alm de diminuir a formao de glicose a partir de outras
fontes como a converso de aminocidos em glicose pela neoglicognese. Outros
hormnios, entre eles o glucagon, tem efeito contrrio a insulina e aumentam os nveis
-
22
de glicose no sangue atravs da estimulao da quebra do glicognio para liberao de
glicose (glicogenlise) e aumento da velocidade da gliconeognese (CARVALHEIRA
et al., 2002).
Com base em sua etiologia o DM classificado em dois tipos principais, a
diabetes do tipo 1 (insulino-dependente), uma condio em que as clulas beta do
pncreas no produzem ou produzem muito pouco insulina; e a diabetes tipo 2 (no
insulino-dependente), considerada como uma condio na qual existe uma deficincia
das clulas e/ou resistncia insulina nos tecidos perifricos (SATO et al., 2006).
Indivduos com maior risco de desenvolver o diabetes tipo 1 podem, muitas vezes, ser
identificados atravs de prova sorolgica para auto-imunidade, devido ao processo
patolgico que ocorre nas ilhotas pancreticas.
O diabetes tipo 1 uma forma mais frequente entre crianas e adolescentes, e
resulta da incapacidade progressiva do pncreas em produzir insulina. A velocidade de
destruio das clulas bastante varivel, sendo rpida em algumas pessoas
(principalmente crianas) e lenta em outras (principalmente adultos). No diabetes tipo 1
os pacientes, especialmente crianas e adolescentes, podem apresentar cetoacidose
como a primeira manifestao da doena, que um quadro grave de descompensao
diabtica com risco de vida iminente. O DM tipo 2, com a hiperglicemia moderada,
pode rapidamente evoluir para hiperglicemia grave e/ou cetoacidose na presena de
infeco ou outra condio de estresse. Muitos desses indivduos com este ltimo tipo
de diabetes podem eventualmente se tornarem dependentes de insulina para a
sobrevivncia, a fim de promover reduo da glicemia e preveno da cetoacidose,
podendo a insulina exgena ser instituda assim que o diagnstico estiver estabelecido
(COMMITTEE REPORT, 2003; MANNA, 2007).
Para o diabetes tipo 2 o grau de hiperglicemia pode causar danos patolgicos e
mudanas funcionais em vrios tecidos-alvo, sem apresentar sintomas clnicos, podendo
o diabtico no detectar a doena por um longo perodo de tempo. Durante esse perodo
possvel demonstrar anormalidade no metabolismo de carboidratos, sendo detectado
pelos nveis de glicose no plasma, estando o indivduo em jejum e tambm aps uma
carga oral de glicose (COMMITTEE REPORT, 2003).
O diabetes tipo 2 de aparecimento lento, e frequentemente passa
desapercebido. Possui fator hereditrio e relao bem estabelecida com a obesidade e o
sedentarismo. Neste tipo de diabetes h uma alterao no metabolismo de glicose e
lipdios caracterizada por hiperglicemia crnica, resistncia insulina em msculo
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esqueltico, fgado e tecido adiposo. O organismo inicialmente compensa a resistncia
insulina com uma hipersecreo do hormnio, mas com o tempo ocorre exausto das
clulas levando a deficincia insulnica, e aumento da glicemia. Assim, ao menos
inicialmente, e muitas vezes durante toda a sua vida, esses diabticos no necessitaro
de insulina para sobreviver (VIOLLET et al., 2009; SURAMPUDI et al., 2009;
COMMITTEE REPORT, 2003).
Os sintomas caractersticos do diabetes devido hiperglicemia so: poliria
(mico freqente), polidipsia (ingesto de grandes volumes de gua) e glicosria
(excreo de glicose na urina); alm de poliastenia (perda de peso), polifagia (fome
excessiva) e viso desfocada. Com a progresso da doena iniciam as complicaes
como retinopatia com perda potencial da viso; nefropatia levando insuficincia renal;
desenvolvimento da neuropatia perifrica; lceras nos ps, amputaes, e neuropatia
autonmica que causa sintomas gastrintestinais, geniturinrio, cardiovasculares e
disfuno sexual. Pacientes com diabetes tem maior incidncia de aterosclerose
cardiovascular, vascular perifrica e doena cerebrovascular, assim como hipertenso e
atrofia muscular esqueltica (COMMITTEE REPORT, 2003; CHONKAR et al., 2006).
1.2 Diabetes e Msculo esqueltico
As desordens metablicas que ocorrem no DM afetam vrios sistemas, o que
inclui os msculos esquelticos. Estas mudanas compreendem defeitos estruturais e
metablicos (PELIT et al., 2008). Os msculos esquelticos convertem energia qumica
em movimento e fora, variando de atividades rpidas e intensas a atividades de
trabalho contnuo e de baixa intensidade (BERCHTOLD et al. 2000; HOOD, 2001;
PETTE, 2002). Msculos como o sleo (SO) realizam atividades lentas, mas estveis,
como a tenso postural. J msculos como o tibial anterior (TA) realizam atividades
mais intensas e rpidas. A maioria dos msculos contm uma mistura de tipos de fibras,
mas alguns msculos possuem maior quantidade de um tipo em relao a outro. O
msculo SO, por exemplo, possui maior quantidade de fibras de miosina de cadeia leve
I e IIa, que confere a ele caractersticas ideais para a manuteno da tenso postural
(ARANY et al., 2007). A insulina um potente estimulador do transporte de glicose no
msculo (HIGAKI et al., 2001), sendo que as aes da insulina no msculo esqueltico
so influenciados pelo tipo de fibra (HICKEY et al., 1995). Os msculos diabticos com
predominncia de fibras lentas (tipo I) exibem maior sensibilidade a insulina e maior
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captao de glicose do que msculos com predomnio de fibras rpidas (tipo II)
(SNOW; THOMPSON, 2009).
A captao da glicose mediada pela insulina difere nos grupos musculares, pois
dependente dos transportadores de glicose muscular conhecidos como GLUT-4. As
fibras musculares do tipo I expressam mais transportadores de glicose da membrana
(GLUT-4) (HARDIN, et al., 1993) uma vez que estas fibras utilizam preferencialmente
a glicose captada, do que aquela estocada na forma de glicognio dentro do msculo.
Tanto a insulina quanto o fator de crescimento semelhante insulina (IGF-1) so
determinantes importantes de massa muscular, por promoverem o crescimento por
conseqncia de estimulao da sntese protica e tambm a supresso da degradao
protica. IGF-1 promove o crescimento muscular por estmulo e diferenciao das
clulas satlites e mioncleos (HESZELE; PRICE, 2004). importante salientar que a
manuteno da massa muscular ocorre pelo equilbrio da sntese e degradao das
protenas musculares (GOLDSPINK, 1999). Portanto, qualquer estmulo que provoque
mudana na sntese e/ou degradao das protenas musculares pode levar a um
significativo impacto sobre a massa muscular. Desse modo, quando ocorre diminuio
da sntese e/ou aumento da degradao protica, ocorre a atrofia muscular. Esta pode ser
definida como a perda involuntria de 10% da massa muscular, como consequncia de
condies catablicas como o caso do DM e da sarcopenia, est associada reduo
da qualidade de vida e aumento da morbidade e mortalidade (HESZELE; PRICE,
2004). Nessas condies catablicas a perda de massa muscular notvel, seja ela pela
protelise muscular elevada ou pela apoptose dos mioncleos estar acelerada em idosos.
No DM a ausncia de insulina gera profundas alteraes metablicas no msculo
esqueltico, como reduo da captao de glicose e aminocidos, reduo da sntese de
protenas e aumento na protelise (COTTER et al., 1989). O processo de atrofia
caracterizado pela ativao de diferentes processos proteolticos, em particular um
sistema de degradao de protenas dependente de trifosfato de adenosina (ATP)
conhecido como a via ubiquitina-proteassoma. (PEPATO et al., 1996). Entre os
marcadores genticos da atrofia muscular dois genes se destacam: a atrogina-1/MAFbx
e MuRF-1, havendo aumento em suas expresses quando h perda da massa muscular.
Chonkar e colaboradores (2006) demonstraram que em ratos diabticos tipo 1,
induzidos por estreptozotocina (STZ), aps 6 a 8 semanas, ocorreu uma perda
significativa de peso e de massa muscular nos msculos extensor digital longo (EDL) e
SO. Alm disso, foi verificada a reduo da fora de contrao muscular nos mesmos
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msculos de ratos diabticos, quando comparados ao grupo controle. Os autores
concluram que o diabetes induzida por STZ provoca atrofia muscular associada
reduo na fora de contrao dos msculos SO (fibras lentas) e EDL (fibras rpidas).
A atrofia muscular e a neuropatia so complicaes muito importantes do DM.
A neuropatia diabtica uma complicao preocupante e responsvel por graves
desabilidades (CHONKAR et al., 2006), atingindo o sistema nervoso perifrico o que
pode levar a transtornos trficos da pele e da estrutura osteoarticular do p, com
propenso a acarretar o chamado p diabtico. Os movimentos mais afetados so
flexo, inverso e everso do tornozelo e movimentos da primeira articulao
metatarsofalangeana. A atrofia muscular observada nos pacientes com neuropatia
diabtica pode causar deformidades, diminuio da amplitude de movimento do p e
tornozelo (SACCO et al., 2007).
Os nervos sural e o fibular so os primeiros a serem acometidos no decorrer da
progresso da neuropatia diabtica, sendo este o responsvel pela inervao do msculo
TA, motor primrio da flexo do tornozelo. Desse modo o TA um dos primeiros
msculos a serem comprometidos na neuropatia diabtica (SACCO et al., 2007).
Diabticos com mais de 50 anos podem apresentar a neuropatia proximal de
membros inferiores caracterizada por um grau varivel de dor e perda sensorial com
fraqueza muscular proximal e atrofia. O aparecimento da neuropatia agudo ou
subagudo. Os pacientes queixam-se de dormncia ou dores da face anterior da coxa,
muitas vezes do tipo queimao, havendo piora noite e por contato. Dificuldade em
andar e subir escadas so comuns, devido fraqueza dos msculos quadrceps e
iliopsoas (SAID, 2007).
1.3 Vias proteolticas envolvidas na atrofia muscular
Existem quatro vias proteolticas conhecidas que quando tem suas atividades
aumentadas podem contribuir para a atrofia muscular: a via das catepsinas ou
lisossomais, via das calpanas dependentes de clcio, via das caspases e via da
ubiquitina proteassoma ATP-dependente.
Na via proteoltica lisossomal, existem as proteases catepsinas B, D, H e L e
outras hidrolases cidas, presentes nos lisossomos. Essa via apresenta uma pequena
influncia sobre a protelise total, assim como ocorre com as vias dependentes de
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clcio. As catepsinas no degradam protenas citoslicas, como as protenas
miofibrilares, seu papel maior est na degradao de protenas de membrana como
receptores, canais de ons e transportadores, protenas endocitadas e organelas.
(JACKMAN & KANDARIAN, 2004, MACHADO, 2009, POWERS et al., 2007).
Outra via de protelise a via das calpanas, que so proteases dependentes de
Ca2+
envolvidas na organizao do citoesqueleto, ciclo celular e apoptose. As fibras
msculo-esquelticas contm as calpanas-1, -2 e -3. O aumento das concentraes de
Ca2+
intracelulares pode ativar as calpanas presentes no disco Z do sarcmero capazes
de degradarem protenas importantes da arquitetura do sarcmero como a nebulina,
titina, protena-C, vinculina. Com a clivagem da titina ocorre a liberao das miofibrilas
para serem ubiquitinadas e degradadas pelo proteassoma (JACKMAN &
KANDARIAN, 2004, POWERS et al., 2007, ZHANG et al., 2007).
Outra via proteoltica importante a via das caspases, responsvel pela apoptose
ou morte celular programada, de modo que as caspases tornam as protenas
miofibrilares disponveis para a ubiquitinao, uma vez que o sistema proteoltico
ubiquitina proteassoma no capaz de degradar protenas intactas. (MACHADO, 2009,
POWERS et al., 2007).
Finalmente, a via ubiquitina-proteassoma, mediadora da degradao protica no
msculo esqueltico, e tem atividade especialmente aumentada em condies de atrofia
muscular. importante observar que para a atuao dessa via necessria a ao
primria da via das calpanas e/ou caspases. A via ubiquitina-proteassoma, principal via
de protelise muscular, promove a degradao de protenas miofibrilares atravs da
atividade do proteassoma, por meio da adio de uma cadeia de poliubiquitina na
protena a ser degradada (substrato), sendo esse processo altamente modulado. Isso se
d por meio da ao de trs enzimas, E1 (enzima de ativao), E2 (enzima de
conjugao-transporte) e E3 (enzima de ligao - ligases), sendo exemplo dessa enzima
a atrogina-1 e o MuRF-1. A ativao da ubiquitina pela E1 transferida a E2, que
formando um complexo ativado, se ligam a E3, que sua vez reconhece o substrato
(ubiquitinizao), devido ao domnio FBox das molculas. Assim as ligases E3
ubiquitinam tipos especficos de protenas determinando quais so alvos para a
degradao pelo proteossoma (GOMES et al., 2001, JACKMAN & KANDARIAN,
2004, ZHANG et al., 2006).
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Duas ligases de ubiquitina (E3) especficas do msculo aumentam
significativamente em presena de atrofia: Muscle Ring Finger-1 (MuRF-1) e Muscle
Atrophy Fbx (MAFbx) ou atrogina-1. Os nveis de RNA mensageiro (RNAm) para
atrogina-1 aumentam rapidamente antes que a diminuio do peso seja detectada e
mantm sua elevao quando a protelise acelerada, sugerindo assim que os nveis
de RNAm da atrogina-1 so importantes na manuteno da protelise de diferentes
etiologias como desnervao, imobilizao e suspenso (SACHECK et al., 2007).
A atrogina-1 constituda por um domnio F-box, o qual caracteriza uma classe
de protenas ubiquitina-ligases (E3), chamadas de complexo SCF (protena Skp1,
protena Cal, protena Ring Fingers e protena F-Box) (GOMES et al., 2001). A
atrogina-1 um exemplo de protena F-box, e desempenha um papel primordial na
ligao da protena que ser ubiquitinada e degradada (LECKER et al., 2004).
Alm da via de degradao de mioprotenas pela atrogina-1, outra protena
ubiquitina-ligase E3 chamada MuRF-1 (Muscle RING Finger 1) tambm exerce papel
de destaque na quebra de protenas (BODINE et al., 2001; CAO et al., 2005). Os
membros da famlia MuRF-1 foram encontrados associados a componentes
miofibrilares, como a titina na linha M do sarcmero, sendo estes componentes
possveis alvos da degradao pela MuRF-1 no msculo atrfico.
Outro fato interessante a resistncia atrofia muscular demonstrada em
animais knockout para os genes da atrogina-1 e MuRF-1. Ratos normais apresentaram
atrofia nos msculos gastrocnmios, em 7 e 14 dias aps desnervao. J animais
geneticamente modificados, apresentam fentipo idntico aos normais, como
morfologia e peso normal dos msculos, quando submetidos desnervao
demonstrarando uma significativa atenuao do processo de atrofia muscular, durante
os mesmos 7 e 14 dias dos animais normais (BODINE, 2001). Sendo esses resultados
demonstrativos da importncia da via de ubiquitinao como mediadora da atrofia
muscular, possvel tambm utilizar ambos MuRF-1 e a atrogina-1 como marcadores
precoces da atrofia muscular.
Um fator de transcrio nuclear envolvidos em processos de atrofia durante
processos inflamatrios o NF-B (Nuclear Fator kappa B - dependente). Este fator
est associado perda de massa muscular na inflamao crnica, pela atividade de
citocinas como o TNF- ou a IL-1, e na ausncia dessas citocinas, ativado por
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espcies reativas de oxignio (GUTTRIDGE, 2004; LADNER, 2003). Sua ativao se
d por meio da ubiquitinao e degradao de sua protena inibitria IkB, que em estado
normal encontra-se ligada ao NF-kB mantendo-o no citoplasma (GLASS, 2005,
SANDRI, 2008,
1.4 Processo Inflamatrio
A inflamao um processo que acompanha a maior parte das doenas
articulares e as complicaes em sua resoluo so uma limitao para o rpido retorno
do sujeito s atividades de vida diria.
Quando um estmulo endgeno ou exgeno causa uma alterao na fisiologia
normal de um tecido (COTRAN et al., 2000), inicia-se uma inflamao local. Esta
constitui uma resposta de proteo para livrar o organismo da causa inicial da agresso
tecidual e de suas consequncias (COTRAN et al., 2000). A inflamao se manifesta
clinicamente atravs de cinco sinais e sintomas dor, rubor, calor, tumor e alterao na
funo.
A resposta inicial ao agente agressor chamada de inflamao aguda ocorrendo
nesta fase alteraes no calibre vascular, com constrio arteriolar e posterior dilatao
das arterolas pr-capilares, abertura dos esfncteres capilares e dilatao das vnulas,
sendo esta seqncia responsvel pela hiperemia, o que leva a exsudao. Nesta etapa
tambm ocorre a liberao de mediadores pr-inflamatrios como a histamina,
serotonina e prostaglandinas. Devido a um aumento do fluxo sanguneo h calor e
rubor. J a resposta tardia chamada de inflamao crnica caracterizada por infiltrao
de clulas mononucleares, refletindo uma reao agresso persistente. Como a presso
osmtica intravascular diminui e aumenta a presso osmtica intersticial, juntamente
com o aumento da presso hidrosttica dos vasos, causa um desequilbrio das foras,
levando sada de clulas, macromolculas e fluidos do sistema vascular, para o tecido
intersticial, gerando o edema (COTRAN et al., 2000).
Esse acmulo de lquido piora o processo inflamatrio, resultando em um
ambiente txico, que leva a morte celular e necrose tecidual (MICHOLOVITZ, 1996),
isso pode dificultar ou interromper a troca de nutrientes, atrasando o processo de
cicatrizao e recuperao do tecido. Devido ao acmulo de lquido no interior do
interstcio celular, h o aparecimento da dor, levando a imobilizao da zona lesada.
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Pode ocorrer fibrose, aderncias e rigidez da estrutura, trazendo sequelas e aumento do
perodo de recuperao do local inflamado (GRIFFIN et al.,1990; COTRAN et al.,
2000).
1.5 Modelo inflamatrio com carragenina
Neste estudo o modelo inflamatrio utilizado no experimento, foi o modelo da
carragenina. As carrageninas so conhecidas desde o sculo XIX, e eram extradas de
algas vermelhas e utilizadas como agente emulsificante em alimentos caseiros.
Carrageninas so classes de galactoses sulfatadas, biomolculas constituintes da parede
celular de diferentes espcies de algas marinhas vermelhas (FERREIRA, 2005).
As carrageninas so utilizadas em modelos de inflamao local aguda desde
1962. H trs tipos principais de carragenina: (kappa), (lambda) e (iota). Elas
ativam um grande nmero de mediadores inflamatrios tais como produtos do
metabolismo do cido araquidnico, principalmente prostaglandina I2, as bradicininas, o
fator de necrose tumoral alfa (TNF ), substncia P, neurocininas, citocinas, xido
ntrico, entre outros (FERREIRA, 2005).
Inicialmente na inflamao causada pela carragenina ocorre infiltrao de
neutrfilos no espao perivascular, acompanhado da liberao local de compostos como
o glutamato, aspartato, substncia P, histamina e serotonina. (SLUKA; WESTLUND,
1993, NANTEL et al., 1999; HONG, 2002; LAWANDA et al., 2000; TAN-NO et al.,
2006). Estas substncias geram edema e sensibilizam os aferentes primrios resultando
em hiperalgesia primria (HARGREAVES et al., 1988). Aps produo elevada de
xido ntrico, prostaglandinas, ERON e ciclo-oxigenases, os neurnios do corno dorsal
da medula so ativados gerando sensibilizao central, espinhal ou supra-espinhal, o
que junto com o aumento dos nociceptores perifricos, manifesta-se como hiperalgesia
secundria (SLUKA; WESTLUND, 1993; TAN-NO K. et al., 2006; SALVEMINI,
1996). Essa resposta pode ser encontrada nas reas adjacentes leso e algumas vezes
em localizaes distantes.
1.6 Resposta Muscular frente s modificaes articulares
Os resultados obtidos a partir de diversos estudos clnicos permitem associar a
presena de alteraes da estrutura e fisiologia articular, com modificaes nas
propriedades dos msculos funcionalmente relacionados articulao (PALMIERI et al,
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2003 e 2004; HOPKINS et al., 2004; WILLIAMS et al., 2004; SUETTA et al., 2007;
PAP et al., 2004; FITZGERALD et al., 2004).
Em condies como a osteoartrite (OA), caracterizada pela degenerao crnica
da cartilagem articular, diversos trabalhos tm mostrado que alteraes na fora
muscular no esto relacionadas dor nem atrofia, o que sugere a presena de um
mecanismo muscular especfico causador da perda de fora (GR et al., 2003). Neste
tipo de pacientes no tem sido esclarecido se as mudanas musculares so produtos do
desuso gerado pela OA, ou se na realidade ocorrem por mecanismos musculares
especficos (HERZOG et al., 2003, PAP et al., 2004; SUETTA et al., 2007). Ainda em
indivduos com artrite reumatide tm sido observado mudanas musculares como
infiltrados de clulas mono-nucleares sem necrose, presena de clulas plasmticas
perto dos capilares, anormalidades mitocondriais (possivelmente por estresse oxidativo
secundrio inflamao) e expresso de MHC (Major Histocompatibility Complex) tipo
II. No entanto, nestes pacientes as mudanas musculares esto associadas miopatia
inflamatria secundria patologia ou miopatia inflamatria crnica em funo do
consumo crnico de corticoesteroides (MIR et al., 1996; LINDEHAMMAR et al.,
2004).
Outras condies articulares como meniscopatias e procedimentos como a
artroscopia de joelho, mostraram diminuio na rea de seco transversa do
quadrceps, enquanto as leses do ligamento cruzado anterior (LCA) evidenciaram
modificaes no padro de recrutamento do quadrceps em atividades estticas e
dinmicas (AKIMA; FURUKAWA, 2005; WILLIAMS et al., 2004; STOCKMAR et
al., 2006).
Uma das possveis explicaes para a diminuio de fora nas condies acima
mencionadas o mecanismo de Inibio Muscular Artrognica (IMA), embora segundo
a opinio de Palmieri e colaboradores (2004), um termo mais adequado deveria seria
Resposta Muscular Artrognica, levando em conta que alguns estudos tm mostrado
facilitao (aumento reflexo H) da musculatura analisada. A IMA pode ser definida
como inibio reflexa contnua da musculatura que rodeia uma articulao depois de
leso das estruturas dessa articulao (PALMIERI et al., 2004).
Outros autores tm mostrado tambm a relao entre a leso articular e a
alterao muscular. Stockmar e colaboradores (2006) analisaram as mudanas no
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msculo vasto medial do quadrceps em indivduos que sofreram ruptura do LCA e
observaram que as fibras desse msculo sofreram mudanas estruturais e metablicas
importantes, mostrando atrofia, diminuio na atividade glicoltica, mudando para uma
atividade mais oxidativa com aumento da resistncia de modo a compensar a
instabilidade do joelho. Akima e Furukawa (2005) registraram que 5,2 meses (em
mdia) depois da artroscopia de joelho ou menisectomia, ocorre atrofia no quadrceps
femoral em geral, sem modificaes significativas nos msculos isquiotibiais e adutor
maior.
Considerando estes estudos fica evidente que as mudanas articulares podem
gerar alteraes na estrutura e funo dos msculos, sobressaindo a presena de atrofia,
porm, os fatores subjacentes de tais modificaes em ratos diabticos no tm sido at
hoje, suficientemente exploradas. Portanto, torna-se importante entender os mecanismos
e vias de sinalizao envolvida na atrofia muscular de ratos diabticos expostos
inflamao do tornozelo, uma vez que no conhecido se os animais diabticos,
tratados ou no com insulina, sofrem uma adaptao muscular diferente de animais
normais nas mesmas condies de estudo.
1.7 Atrofia Muscular por desuso
Conforme os resultados de modelos animais de suspenso da pata traseira em
ratos em imobilizao, a atrofia por desuso tem sido atribuda a alteraes na regulao
do metabolismo protico envolvendo diminuio na sntese e aumento na protelise no
msculo esqueltico (SIU et al., 2005; FERREIRA et al., 2006; GUILLOT et al., 2006;
ELEY et al., 2007); sendo iniciada pela reduo na tenso e na atividade contrtil do
msculo, e no por citocinas inflamatrias (ZHANG et al., 2006).
Entre os estudos que analisaram o efeito precoce do desuso sobre o msculo est
o trabalho de Ferreira e colaboradores (2006), onde estes autores investigaram o efeito
da suspenso da pata traseira de ratos sobre a resposta de seus micitos e outras clulas
no musculares como as endoteliais e fibroblastos, e a resposta apopttica. Os
resultados mostraram que a relao da expresso DNA/protenas mudou na primeira
semana, refletindo-se assim uma diminuio no contedo de protenas e do peso
muscular neste perodo. Tambm houve um aumento notvel (200%) na atividade
mittica de clulas no musculares nas primeiras 6 horas de suspenso. Este ltimo
dado foi relacionado com o aumento do tecido conjuntivo muscular que gera atrofia
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adicional pela diminuio no fluxo sanguneo sobre a fibra muscular. Este trabalho
mostrou tambm aumento na quantidade de mono e oligonucleossomos do citosol 6
horas depois, sendo assim evidente a presena de apoptose celular.
O efeito agudo do desuso foi tambm estudado por Sacheck e colaboradores
(2007). Neste trabalho foram comparados os efeitos de dois modelos de desuso, a
desnervao e a isolamento da coluna vertebral (laminectomia parcial das razes T7 a
S1, com seco bilateral dessas razes), sobre a expresso de genes relacionados
atrofia, analisando tambm se os efeitos foram similares com os observados em
modelos de doenas sistmicas (como cncer e diabetes). Os resultados obtidos
mostraram que no terceiro dia do desuso ocorreu perda do peso muscular, refletindo
assim a habilidade do msculo para reagir de forma aguda ao estmulo. Um resultado
notvel deste estudo foi o aumento no RNAm de genes essenciais na atrofia rpida,
atrogina-1 e MuRF-1, no terceiro dia; este aumento na expresso ocorreu
concomitantemente a maior perda no peso muscular. Foi evidente tambm que 78%
dos genes expressos nas doenas sistmicas foram tambm expressos no modelo
experimental de desuso, dando suporte hiptese da existncia de um programa comum
final para mediar a atrofia, sem importar a origem ou a natureza dela.
Vrios estudos mostram que o aumento na expresso da atrogina-1 e MuRF-1
em grupos de ratos com articulao inflamada, pode ser explicado atravs da ao da
citocina TNF. Estudos anteriores mostraram que a injeo de carragenina em uma
articulao causa um processo inflamatrio complexo, que envolve um grande nmero
de mediadores, dentre eles o TNF, uma citocina inflamatria envolvida no estmulo de
processos proteolticos na musculatura esqueltica (REID; LI, 2001; RALL;
ROUBENOFF, 2004 e DOGRA et al., 2007). Estas explicaes derivam da observao
que os nveis sricos de TNF encontram-se bem elevados aps administrao de
carragenina na pata de ratos (NISHIKORI et al., 2002).
Estudos para analisar o efeito do desuso sobre o msculo tm sido realizados em
modelos de suspenso (imobilizao) por perodos de 2 4 semanas, existindo s
alguns trabalhos que analisaram o efeito precoce do desuso sobre o tecido muscular.
Siu e colaboradores (2005) encontraram que depois de 14 dias de suspenso, o
msculo gastrocnmio (GM) de ratos perdeu aproximadamente 30% do seu peso,
aumentando em 119% a fragmentao de DNA e em 73% o contedo de Bx (protena
apopttica). Os autores concluem que estes resultados sugerem que a apoptose pode ter
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uma participao importante na atrofia nos msculos Tipo I e Tipo II, provavelmente
mediante a eliminao de mioncleos na fibra atrofiada.
Guillot e colaboradores (2006) mostraram que aps trs semanas de suspenso
da pata de ratos o msculo SO sofreu 50% de perda no seu peso enquanto que o
Extensor Digital Longo dos dedos (EDL) perdeu s 12% do peso; alm disso no SO foi
observada uma diminuio significativa (p
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A CK um dmero composto por duas subunidades, a B (brain) e M (muscle).
Elas so produtos de dois genes estruturais diferentes, podendo existir trs pares de
diferentes dmeros: BB, MB e MM. As isoenzimas so encontradas no citosol da clula
ou associadas s estruturas miofibrilares. Existe uma quarta isoenzima que difere das
outras imunologicamente e na mobilidade eletrofortica, conhecida como CK Mt, esta
localiza-se entre as membranas mitocondriais. Tanto a CK B, quanto a CK M
existem como homo e heterodmeros no citosol, sendo sua funo evitar flutuaes dos
nveis de ATP durante os perodos de alta demanda energtica, como na contrao
cardaca e contrao do msculo esqueltico, atividade da bomba de Clcio e, excitao
neuronal. A forma mitocondrial (CK - Mt) geralmente encontrada como octamero,
com a funo de formar fosfocreatina, esta vai para o citosol onde o fosfato de alta
energia transferido de volta para ATP pela CK - M para o consumo energtico celular.
(LIN et al., 2008; BESSMAN; CARPENTER, 1985).
Nveis elevados da CK so utilizados no auxlio-diagnstico e no monitoramento
teraputico de vrias doenas como Distrofia Muscular de Duchenne, Infarto do
Miocrdio, Doenas musculares inflamatrias e degenerativas, Doenas do Sistema
Nervoso Central como Isquemia Cerebral (LIN et al., 2008; BESSMAN;
CARPENTER, 1985; BURTIS et al., 2006).
Considerando as alteraes que ocorrem no tecido muscular de ratos diabticos e
com inflamao articular, a hiptese deste trabalho que a inflamao do tornozelo em
ratos diabticos acarreta aumento na expresso gnica de genes relacionados atrofia
muscular, reduzindo tambm a rea de seco transversa das fibras e alterando os nveis
da CK muscular sendo este aumento mais acentuado que em animais normais. Para
testar esta hiptese os msculos SO e TA de ratos diabticos foram examinados aps 3
dias de induo de inflamao articular (fase aguda).
Considerando as alteraes da musculatura esqueltica no DM e a resposta
muscular devido inflamao articular, torna-se importante conhecer os mecanismos
envolvidos no incio da atrofia muscular nessa condio de diabetes agudo (13 dias da
injeo de STZ) sem e com tratamento insulnico. Alm de que, at o presente momento
no conhecemos estudos abordando a expresso de genes relacionados atrofia dos
msculos SO e TA concomitante inflamao aguda do tornozelo em ratos diabticos
agudos.
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Os resultados deste estudo podem ser relevantes para a clnica e cincia da
reabilitao no sentido de que novas formas de tratamento ou aprimoramento das j
existentes possam ser elucidadas e contribuir com a minimizao das consequncias da
inflamao e com reduo do perodo de recuperao, acelerando o retorno do indivduo
s suas atividades funcionais e melhora da qualidade de vida de pessoas com diabetes.
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36
Objetivos
-
37
2.0 OBJETIVOS
Avaliar o efeito da inflamao articular aguda (3 dias) sobre a expresso de
genes de atrofia, a morfologia das fibras musculares e os nveis musculares da creatina
cinase em ratos diabticos tratados ou no com insulina.
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38
Materiais e Mtodos
-
39
3.0 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Animais
Para o desenvolvimento do projeto foram utilizados 54 ratos Wistar com peso
mdio de 150 gramas, os quais permaneceram em caixas (4 animais por caixa), com
livre acesso gua e a rao peletizada (Purina). Os animais foram provenientes do
Biotrio Central do Campus de Botucatu UNESP e foram mantidos em biotrio do
Laboratrio de Bioqumica Clnica do Departamento de Anlises Clnicas, UNESP -
Araraquara, com controle da luminosidade (ciclo claro/escuro de 12h), temperatura (22-
25C) e umidade de 50-55%.
O experimento foi conduzido segundo as normas internacionais de tica na
experimentao animal (National Research Council, 1996) e aps a aprovao do
Comit de tica Animal da Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Cincias
Farmacuticas Unesp, Campus Araraquara (Protocolo CEP/FCF/CAr n 31/2009).
Todos os procedimentos experimentais foram realizados com os animais
anestesiados usando injeo intraperitonial de soluo de xilazina 12 mg/Kg/peso
corporal e quetamina 95 mg/Kg/peso por via intraperitoneal.
3.2 Grupos Experimentais
Os 54 animais foram distribudos em um dos nove grupos, aps pareamento,
utilizando como critrio a glicemia de cada animal (seis animais por grupo):
1) Controle - C: Animais normais (no-diabticos), no receberam qualquer tipo de
interveno.
2) Citrato - Ci: Animais normais (no-diabticos), receberam injeo intrapenitoneal de
tampo citrato.
3) Salina - S: Animais normais (no-diabticos), receberam somente administrao de
salina na articulao do tornozelo direito.
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40
4) Inflamado - Ca: Animais normais (no-diabticos), receberam a administrao de -
carragenina na articulao do tornozelo direito.
5) Diabtico - D: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de estreptozotocina
(STZ), e no receberam qualquer tipo de interveno no tornozelo.
6) Diabtico Insulina - DI: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de STZ e
foram tratados com insulina e no receberam qualquer tipo de interveno no tornozelo.
7) Diabtico Salina DS: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de STZ e
receberam a administrao de salina na articulao do tornozelo direito.
8) Diabtico e Inflamado - DCa: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de
STZ e foram submetidos administrao de -carragenina na articulao do tornozelo
direito.
9) Diabtico e Inflamado, tratado com insulina - DCaI: Animais que receberam
injeo intrapenitoneal de STZ, foram tratados com insulina e submetidos
administrao de -carragenina na articulao do tornozelo direito.
Figura 3. Fluxograma para diviso dos grupos de estudo.
54 animais
Pareamento (glicemia)
30 animais 24 animais
Induo diabetes (STZ-50 mg/kg)
Diabticos
Normais (No - Diabticos)
Ci S Ca C DS DCaI DI DCa
D
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
A) B)
A) Administrao de STZ B) Inflamao ou efuso
Figura 4. Fluxograma do experimento
3.3 Modelo de induo do diabetes por STZ
Para a induo do diabetes os animais foram submetidos a jejum prvio de 14-16
horas para administrao por via intrapenitoneal de 50mg de STZ por Kg de peso
corporal, dissolvida em tampo citrato pH 4,5 (DELFINO et al., 2002).
A STZ um antibitico e agente alquilante que capaz de inibir a secreo de
insulina e causar um estado de Diabetes Mellitus (tipo I) cerca de uma hora aps sua
administrao por via endovenosa em ratos. Isso acontece devido a sua estrutura, que
destri seletivamente as clulas -pancreticas, promovendo sua degranulao
(GOODNER, 1973; ANDERSON et al., 1974).
A STZ possui, em sua estrutura (Figura 3), um grupo glicdico derivado da 2-
deoxi-D-glicose que reconhecido pelos transportadores de glicose das clulas ,
permitindo sua entrada destas clulas (HERR et al.,1967; SCHEIN; LOFTUS, 1968
ANDERSON et al., 1974; GOODNER, 1973) e um grupo N-metil-N-nitrosouria
ligado ao carbono 2 da hexose, sendo este citotxico para as clulas -pancreticas; a
hexose reconhecida pelos transportadores de glicose (GLUT-2), e faz com que a STZ
se acumule nas clulas pancreticas. Clulas produtoras de insulina que no
expressam GLUT2 em sua membrana plasmtica so resistentes STZ (ANDERSON et
al., 1974; SCHEIN; LOFTUS, 1968).
STZ
dias de tratamento
Inflamao ou Efuso
-
42
O grupo N-metil-N-nitrosouria inibe a atividade da enzima superxido
dismutase (SOD), permitindo o acmulo de ERON, espcies txicas s clulas
(FISCHER; HAMBURGUER, 1979; GRANKVIST et al., 1981; PAPACCIO et al.,
1986). O acmulo dessas espcies reativas promove a degradao do DNA nuclear
(SANDLER et al.,1983), havendo consequentemente a ativao de uma enzima
reparadora de DNA, a poli (ADP-ribose) sintetase (PARP) (YAMAMOTO et al., 1981),
que utiliza como substrato nicotinamida adenina dinucleotdeo (NAD+). A elevao da
atividade desta enzima provoca a depleo de NAD+ intracelular (SCHEIN &
LOFTUS, 1968), levando inibio da respirao celular, da produo de ATP e da
sntese protica (consequentemente queda na sntese de pr-insulina) (YAMAMOTO et
al., 1981; UCHIGATA et al., 1982), havendo perda do balano inico celular com
posterior apoptose (SANDLER et al., 1983).
Existem outros mecanismos pelos quais a STZ causa danos em clulas -
pancreticas, por exemplo, a STZ, como sendo um potente agente alquilante, promove a
alquilao direta do DNA atravs de radicais metil ou ctions metil, via sua
decomposio (BENNET; PEGG, 1981; JOHANSSON; TJALVA, 1978). Essa
metilao ocorre mais especificamente nas guaninas, induzindo a apoptose nas clulas
(MURATA et al., 1999). Outra hiptese a gerao de ERON (KWON et al., 1994;
BEDOYA et al., 1996; KANETO et al., 1995; KRONCKE et al., 1995; LENZEN,
2008), que podem participar da toxicidade da molcula na promoo para a
diabetognese.
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43
Figura 5. Mecanismos propostos de toxicidade induzida pela STZ.
* Metilao do DNA induzida por CH3+ ou
CH3.
** Modificao do DNA induzida por espcies reativas de oxignio e/ou nitrognio.
3.4 Terapia insulnica
Os grupos de animais diabticos com terapia insulnica foram tratados duas
vezes ao dia (as 8h e 17h) com 2,5 U de insulina NPH (Humulin NPH U-100 Lilly) por
13 dias, totalizando 5U/dia A insulina foi administrada por via subcutnea.
3.5 Modelo inflamatrio
Aps serem pesados e anestesiados, os animais dos grupos Ca, DCa, DCaI e
receberam 0.03ml de carragenina a 3% (Sigma Chemical Company - St. Louis, USA)
na articulao tbio-tarsica direita, dissolvida em soluo salina, seguindo o mtodo
descrito por Omote e colaboradores (2002), e Wang e colaboradores (2000). O
procedimento consistiu em manter a articulao do tornozelo em 90, localizando a
fossa distal e posterior ao malolo lateral, introduzindo nesta zona uma agulha
(dimetro 26), a qual foi dirigida distalmente para a cpsula articular at a percepo da
perda de resistncia, injetando nesse momento a carragenina. Os animais dos grupos S e
DS receberam mediante o mesmo procedimento a injeo de 0.03ml de salina. Aps
tais procedimentos da injeo os animais permaneceram nas caixas sob condies j
decomposio
CH3+ ou
CH3
* metilao do DNA
decomposio e metabolizao
O2- e/ou
NO
** modificao do DNA
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44
descritas sem restries na sua atividade e foram eutanaziados ao trmino do
experimento.
3.6 Glicemia
Para determinar a glicemia dos animais utilizamos o mtodo da glicose-oxidase.
Foi retirado da cauda aproximadamente 1ml de sangue obtido o plasma para a anlise.
A glicose-oxidase (GOD), presente no reagente catalisa a oxidao da glicose da
amostra, em presena de H2O, originando cido glucnico e perxido de hidrognio.
GOD
Glicose + O2 + H2O cido Glucnico + H2O2
Numa segunda etapa da reao o perxido de hidrognio reage com 4-
aminoantipirina e fenol, em reao catalizada por peroxidase (POD). Esta reao
oxidativa de acoplamento forma a antipirilquinonimina (com absoro mxima entre
490 e 520 nm) proporcional concentrao de glicose na amostra.
POD
antipirilquinonimina + 4H2O . 2H2O2 + fenol + 4-aminoantipirina
3.7 Volume
Os volumes dos tornozelos direitos foram avaliados por um mtodo baseado no
princpio de Arquimedes. Este mtodo considerado o padro-ouro e demonstrou alta
reprodutibilidade (CCI = 0,99) com um erro inferior a 1%. Um recipiente de vidro foi
especialmente produzido, com orifcio e ducto para dar vazamento ao excesso de gua e
para conter a pata e o tornozelo do animal (5 centmetros de altura e 4 centmetros de
dimetro). O recipiente foi previamente calibrado para garantir a reprodutibilidade das
medidas de volume (ICC = 0,93). Para padronizar a medida, uma marca foi feito no
tornozelo dos ratos, 1 centmetro a partir da base do calcanhar. O animal foi suspenso
por um dispositivo semelhante ao utilizado por Dolan e colaboradores (2003). O frasco
foi preenchido com gua at exceder um volume pr-estabelecido pelo orifcio com o
excesso de gua vertido at a estabilizao do fluxo. Em seguida, a pata direita do
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45
animal foi colocada no recipiente at a marca no tornozelo. A gua deslocada foi
coletada e pesada, seu volume foi calculado considerando sua densidade como igual a
1g/ml. Esta medida foi realizada antes e 3 dias aps a induo da inflamao nos grupos
S, Ca, DS, DCa e DCaI (Figuras 5 e 6).
Figura 6. Recipiente de vidro utilizado para medio do volume.
Figura 7. Medida do volume do tornozelo.
3.8 Retirada dos msculos
Foram retirados os msculos SO e TA direitos com os animais vivos e
anestesiados, aps 13 dias da injeo de STZ e 3 dias aps a injeo de carragenina.
Aps a retirada, cada msculo foi pesado e dividido com um corte horizontal no seu
ventre deixando uma poro para a extrao de RNA total e determinao da atividade
da CK e outra parte foi utilizada para anlise histolgica da area de seco transversa
(AST).
Parte dos msculos TAs utilizados para anlise histolgica, foram congelados
em isopentano com nitrognio lquido e armazenados em freezer a 80C. A parte
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46
destinada extrao do RNA total foi armazenada em microtubo (eppendorfe)
autoclavado e congelado em nitrognio lquido e posteriormente armazenado em freezer
a 80C at sua anlise. No foi realizada a anlise histologia no msculo SO devido a
falta de massa muscular para as outras anlises, que foram priorizadas. Para anlise da
CK o sobrenadante dos msculos triturados (0.040 gramas em 1 ml de tampo fosfato
pH 7.4) foram aliquotados em microtubos (eppendorf), congelados em nitrognio
lquido e armazenados em freezer a 80C para quantificao de protenas totais e da
enzima. Aps a retirada dos msculos, os animais foram eutanaziados com overdose de
anestesia.
Figura 8. Diviso do msculo TA aps sua retirada. Sendo AST rea de seco transversa; CK creatina cinase; PT protenas totais e RNA extrao de RNA para expresso gnica.
3.9 Anlise Histolgica
A partir de msculos TA de todos os ratos, foram obtidos cortes histolgicos
transversais e seriados (10 m), em micrtomo criostato, mantidos 25C. As lminas
Comprimento do Msculo
AST
CK + PT
RNA
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47
com os cortes histolgicos foram coradas com azul de toluidina (TB) para avaliao
morfolgica e morfomtrica.
Uma vez os cortes corados com TB, foi realizada uma anlise morfolgica geral
sobre a estrutura muscular, comparando entre os diferentes grupos, atravs do corte
histolgico transversal da regio central do ventre de cada msculo TA. Para a
obteno das fotos dos cortes, um microscpio (Axiolab, Carl Zeiss, Jena, Alemanha)
equipado com uma cmera digital (Sony DSC S75, Tkio, Japo) foi usado. A rea de
seco transversal de cem fibras musculares, escolhidas aleatoriamente, de cada
msculo foram mensuradas a partir da imagem obtida da regio central do ventre
muscular usando o software ImageJ.
3.10 Extrao de RNA total
A extrao de RNA total de cada animal foi obtida a partir de 100 mg de
msculo, utilizando-se o reagente Trizol (Gibco) pelo mtodo descrito por
Chomczynski e Sacchi (1987). O trizol mantm a integridade do RNA enquanto rompe
as clulas e dissolve os componentes celulares. Em seguida foi adicionado o
clorofrmio, seguido de centrifugao, separando a soluo em fases aquosa onde o
RNA permanece exclusivamente e fase orgnica. Aps o isolamento da fase aquosa, o
RNA foi precipitado com isopropanol. O pellet foi lavado com etanol e
subsequentemente dissolvido em 30ul de gua livre de RNAses. A absorbncia das
amostras foi determinada em 260nm; para avaliar a qualidade do RNA isolado foi
determinada a razo entre as absorbncias a 260 e 280 nm (razo 1.8). Os estoques de
RNA foram mantidos a 80C. Tambm foi avaliada a qualidade do material por
eletroforese das amostras (2 g de RNA total) em gel denaturante de agarose-formamida
(1%), em tampo MOPS (40mM de cido morfolinopropanosulfnico). Posteriormente,
os gis foram observados com brometo de etdeo.
3.11 Transcrio Reversa (RT)
Aps o isolamento do RNA total, foram realizadas as transcries reversas (RT)
utilizando 1g de RNA total. A reao de RT foi realizada da seguinte forma:
-
48
Quantidades variadas de RNA total: 200 u de Transcriptase Reversa; 0,8 mM dNTPs; 1
mM MgC2; 0,02 ug/ul primer oligo dT; 4 mM DTT. A reao foi realizada em um
termociclador (Eppendorf Hamburgo, Alemanha) (10 minutos a 70C, 60 minutos a
42C e 10 minutos a 94C). A integridade do produto da RT (cDNAs) foi conferida
atravs da realizao de gel de agarose (1%) no desnaturante, corado com brometo de
etdeo.
3.12 Real Time-PCR
Em seguida, diferentes fraes das RTs foram utilizadas na amplificao em
cadeia por Polimerase (PCR) com monitoramento da gerao de amplicons em tempo
real (PCR real-time, Rotor Gene 3000, Cobert Research).
As amplificaes por PCR foram efetuadas utilizando-se 10-80ng/ l de cDNA
adicionado a uma reao contendo 25 l de SYBR Green PCR master misx, 50-900nM
dos primers (senso e antisenso) em uma soluo com volume final de 55 l , dividido em
duplicata. As condies de ciclagem ocorreram conforme a padronizao de cada
primer.
Aps a reao de PCR, foi possvel determinar o incio da fase de amplificao
exponencial (Ct, cycle threshold), sendo que os valores de cada amostra foram
utilizados como dados para a anlise da expresso gnica do GAPDH, atrogina-1 e
MuRF-1. Os dados foram analisados usando o mtodo de comparao absoluta por
meio da curva padro que possibilitou determinar a diferena entre os valores de Cts
das amostras.
A normalizao dos dados foi feita pelo gene constitutido GAPDH, usado como
controle interno. Outro gene constitutivo, o RPLPO tambm foi mensurado para
confirmao dos resultados, no entanto, no houve diferena entre as razes:
RPLPO/GAPDH ou GAPDH/RPLPO. Por este motivo o GAPDH foi escolhido como o
gene constitutivo deste estudo.
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49
3.13 Oligonucleotdeos primers
Os oligonucleotdeos, que foram utilizados como primers, para as reaes de
polimerase em cadeia para atrogina-1 foram construdos utilizando-se o Primer Express
Software (Applied Biosystems, Foster City, CA), como mostrado na tabela. Os Primers
para MuRF-1 foram retirados de Granado e colaboradores (2005).
Tabela I: Primers construdos com senso e antisenso para atrogina-1, MuRF-1 e
GAPDH.
Primer Senso Antisenso
atrogina-1 TACTAAGGAGCGCCATGGATACT GTTGAATCTTCTGGATCCAGGAT
MuRF-1 TGTCTGGAGGTCGTTTCCG ATGCCGGTCCATGATCACTT
GAPDH GATGCTGGTGCTGAGTATGTCG GTGGTG-CAGGATGCATTGCTGA
Primers construdos com dados do GeneBank: atrogina-1 (AF441120) (J Physiol,
549(2), 409418, 2003); MuRF-1 Granado et al., 2005 (Am J Physiol Endocrinol
Metab. 289: 10071014); GAPDH (AF106860).
3.14 Determinao de Protenas Totais
Para determinao das protenas totais, foi utilizada uma alquota do
sobrenadante do extrato muscular, sendo o contedo proteco das amostras determinado
pelo mtodo descrito por Hartree (1972), usando soro de albumina bovina para
construo da curva analtica. Foram preparadas trs solues com os seguintes
reagentes:
i) Soluo A: a 2g de Tartarato de Sdio e potssio, foram misturados a 100g de
Na2CO3, dissolvidos em 500 mL de NaOH 1 mol/L e diludos com gua Milli-Q para 1
litro;
ii) Soluo B: a 2g de Tartarato de sdio e potssio, foi adicinado 1g de CuSO4.5 H2O,
dissolvidos em 90 mL de gua e 10 mL de NAOH 1mol/L;
iii) Soluo C: 1 volume do Folin-Ciocalteau diludos em 15 volumes de gua Milli-Q.
Esta soluo (preparada diariamente) esta entre 0,15 mol/L e 0,18 mol/L quando titulada
para pH 10 com NaOH 1 mol/L.
-
50
Em tubos de ensaio adicionou-se 200 l de amostra diluda adequadamente em
tampo fostato de sdio pH 7,4 e 180 l da soluo A, os tubos foram levados ao banho
em 50oC durante 10 minutos. Aps estabilizao em temperatura ambiente, foi
adicionado aos tubos 20 l da soluo B e deixados em temperatura ambiente por 10
minutos. Para finalizar, foi adicionado 600 l da soluo C e levados ao banho de 50C
por 10 minutos. Resfriados a temperatura ambiente, foram retirados 300 l da reao
final para a leitura no espectrofotmetro de placa a 650 nm.
A determinao de protenas totais foi realizada para normalizao dos dados da
CK muscular.
3.15 Determinao de nveis de Creatina Cinase (CK)
Para a determinao da atividade da CK foram obtidas amostras dos msculos
TA e SO coletadas aps 3 dias de inflamao do tornozelo.
Uma amostra de 0,040g de msculo foi retirada e colocada em um microtubo
com 1ml de tampo fosfato (0,01M e pH 7,4), triturada em homogenizador (modelo
Metabo), em banho de gelo, com velocidade de 27 mil rpm, durante 1 minuto e meio.
Aps a homogenizao o tubo foi centrfugado por trinta minutos a 4C e a 12.000 g.
Uma alquota do sobrenadante foi diluda adequadamente para a determinao
enzimtica (PEREIRA et al., 1998).
Foi utilizado o mtodo cintico CK_NAC (COMMITEE ENZYMES, 1976;
OLIVER, 1955). Este mtodo acopla reao da CK as reaes enzimticas
sequenciais, hexoquinase e glicose-6-fosfato desidrogenase, que levam a formao de
NADPH, o qual quantificado por espectrofotometria no UV.
-
51
Anlise Estatstica
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52
4.0 ANLISE ESTATSTICA DOS RESULTADOS
Inicialmente foram aplicados os testes Shapiro Wilks e Levene para avaliar a
normalidade e homogeneidade dos dados, respectivamente. O ANOVA one-way
seguido pelo Teste de Tukey foi ento usado para detectar possveis diferenas entre os
grupos. O t de Student pareado foi utilizado para a comparao entre os volumes inicial
e final do tornozelo. O nvel de significncia mnimo estabelecido foi de 0,05. Para isto
utilizou-se o software GraphPad Instat (Verso 3.00, 32 bit para Windows 95).
-
53
Resultados
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54
5.0 RESULTADOS
5.1 Massa Corporal
Houve variao no ganho de massa corporal entre os grupos experimentais
(Figura 9). Nos grupos de ratos diabticos D, DS, DCa o ganho de massa foi
significativamente menor, em relao aos grupos C, Ci, S e Ca, para o grupo DCa foi
observado o menor ganho de massa em relao aos demais grupos. Por outro lado, os
grupos diabticos tratados com insulina tiveram o ganho de massa igual aos grupos no-
diabticos (C, Ci, S e Ca), indicando eficincia do tratamento insulnico na variao da
massa corporal.
Figura 9. Variao da massa corporal. Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica com Ca; e:
diferena estatstica com D; f: diferena estatstica com DI; g: diferena estatstica com DS e h: diferena estatstica com
DCa (*p
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55
5.2 Glicemia
Observa-se que os nveis glicmicos dos grupos no-diabticos (C, Ci, S e Ca)
no apresentaram diferena estatstica entre os nveis glicmicos iniciais e finais. Por
outro lado, houve um aumento da glicemia nos grupos diabticos (DCa, DCaI, DI e DS)
comparado com os grupos no-diabticos (C, Ci, S e Ca) (p
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56
Figura 10. Glicemia dos ratos nos diferentes grupos experimentais 1 dia aps a administrao de STZ (glicemia inicial)
e aps 13 dias aps a administrao de STZ (glicemia final). Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica
com Ca; e: diferena estatstica com D; f: diferena estatstica com DI; g: diferena estatstica com DS e h: diferena
estatstica com DCa (*p
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5.3 Massa dos msculos TA e SO
Em relao ao msculo TA, somente no grupo Ca houve perda de massa
quando comparado aos outros grupos no-diabticos (Figura 11). Todos os grupos
diabticos apresentaram perda de massa com exceo do grupo DI que manteve sua
massa igual as massas dos grupos C, Ci, S, mostrando que a insulina reverteu a perda de
massa muscular quando comparada ao grupo D. Os grupos diabticos que tiveram
interveno no tornozelo (DS, DCa, DCaI) mostraram perda de massa em relao aos
dos grupos C e Ci. Apenas o grupo DCa apresentou diminuio de massa em relao
aos grupos C, Ci, S e aos demais grupos diabticos (D, DI, DS, DCaI). Nesse caso, o
tratamento com insulina no grupo diabtico e inflamado (DCaI) amenizou a perda de
massa quando comparado ao grupo DCa, sugerindo que o tratamento com insulina
apesar de no ser capaz de manter a massa igual aos grupos C, Ci, S, capaz de
minimizar a sua perda em relao a inflamao na diabetes.
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58
Figura 11. Massa do msculo Tibial Anterior dos diferentes grupos experimentais 3 dias aps a administrao de
carragenina na articulao do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ. Resultados normalizados pela massa
corporal final de cada animal. Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo
C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica com Ca; e: diferena estatstica com D; f: diferena estatstica com DI, g: diferena estatstica com DS (*p
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59
a massa igual aos grupos C e Ci, capaz de minimizar a sua perda em relao a
inflamao na diabetes, assim como observado no msculo TA. Alm disso, a
inflamao com carragenina parece ter maiores efeitos sobre a perda de massa no
msculo de ratos diabticos quando comparado aos seus efeitos no msculo de ratos
no-diabticos.
Figura 12. Massa do msculo SO dos diferentes grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na
articulao do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ. Resultados normalizados pela massa corporal final de
cada animal. Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica com Ca; e: diferena estatstica com D; f:
diferena estatstica com DI; g: diferena estatstica com DS e h: diferena estatstica com DCa (*p
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60
diabticos em relao a C e Ci (Figura 14). Nos grupos diabticos tambm foi
observada uma diminuio da AST em relao a C e Ci. O grupo D apresentou a mesma
diminuio que os grupos DS, DCa, DCaI. Torna-se importante observar que como no
houve diferena entre os grupos no-diabticos S e Ca, assim como entre os grupos
diabticos DS, DCa e DCaI, a diminuio na AST deve ser dependente da distenso da
cpsula articular tanto pela salina quanto pela carragenina.
Alm disso, o tratamento com insulina no foi capaz de influenciar a
recuperao da AST no grupo DI em relao ao grupo D, nem entre os grupos DCaI e
DCa.
Figura 13. Cortes transversais das fibras musculares dos msculos TA corados com azul de toluidina.
Observe a atrofia das fibras musculares dos msculos TA dos grupos diabticos (D, DS, DCa e DCaI),
principalmente dos grupos DS, DCa e