CENTRO UNIVERSITÁRIO LA SALLE · fazer um novo começo, ... derivados como fonte de carbono e/ou...

UNILASALLEUNILASALLE

OSMAR RODRIGUES SOARES

DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE MICROORGANISMOS

BIORREMEDIADORES DE HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO

ATRAVÉS DE PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGEM DIGITA L

CANOAS, 2009

CENTRO UNIVERSITÁRIO LA SALLE





Trabalho de conclusão apresentado para a banca examinadora do curso de Ciência da Computação do Centro Universitário La Salle - Unilasalle, como exigência parcial para obtenção do grau de Bacharel em Ciência da Computação.

Orientação: Prof. Ms. Mozart Lemos de Siqueira

CANOAS, 2009





Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Ciência da Computação pelo Centro Universitário La Salle - Unilasalle.

Aprovado pela banca examinadora em 24 de novembro de 2009.

BANCA EXAMINADORA:

____________________________________ Profª. Drª. Márcia Häfele Islabão Franco

Unilasalle

________________________________________ Prof. Ms. Neide Pizzolato Angelo

Unilasalle

Dedico este trabalho de conclusão

àqueles que, nos momentos que pensei

em desistir, quando precisei de força e

ânimo para seguir na caminhada, foram

fonte de incentivo e apoio. Dedico este

trabalho para Goréti, Gustavo e Fabrício.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente

para a realização desse trabalho.

Agradeço aos professores do Curso de Ciência da Computação do Centro

Universitário La Salle, pelos ensinamentos e pelo incentivo ao estudo, em especial

aos professores Mozart Lemos de Siqueira e Giovani André Piva que me orientaram

nesse trabalho de conclusão.

Agradeço também aos colegas de aula que ao longo do curso muito me

ensinaram e acho que, pelo menos um pouco, comigo aprenderam.

Agradeço a minha família que ao longo do tempo muito me incentivou e apoiou

nessa longa caminhada.

Acima de tudo, agradeço a Deus que sempre foi e sempre será fonte de fé para

seguir adiante na caminhada.

“Embora ninguém possa voltar atrás e

fazer um novo começo, qualquer um pode

recomeçar agora e fazer um novo fim.”

(Chico Xavier)

RESUMO

O presente trabalho propõe um modelo que utiliza processamento e análise de

imagem digital para realizar a determinação, a contagem e a classificação de

microorganismos com capacidade para biorremediar hidrocarbonetos de petróleo. A

biorremediação é uma técnica que utiliza métodos biológicos para recuperar

ambientes poluídos. Na metodologia proposta, a imagem digital é capturada no

formato de cores RGB, a partir de experimentos com colônias de microorganismos

cultivadas em placas de Petri. Para melhorar a qualidade da imagem, é realizado um

pré-processamento na imagem original através do cálculo da média dos pixels

vizinhos. As Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) dos microorganismos com

capacidade de biorremediação são identificadas na imagem digital através de

segmentação por limiarização, levando-se em consideração o padrão de cor

vermelho-âmbar formado ao redor da colônia dos microorganismos como resultado

ao Teste de Bavendamm. Posteriormente, as UFCs são identificadas e contadas

com a utilização da técnica de crescimento de região, levando-se em consideração

os pixels pertencentes à vizinhança de raio 4. A análise automática da imagem é

finalizada com a classificação das colônias segundo a sua capacidade para

biorremediar petróleo e seus derivados. Essa classificação é obtida pela análise da

intensidade do halo vermelho-âmbar formado ao redor da colônia. O modelo

proposto foi implementado no ambiente MATLAB (MathWorks, Inc.). Os resultados

obtidos foram comparados a resultados gerados pelo método direto, ou seja,

resultados obtidos pela análise manual humana. Pela comparação dos resultados,

observou-se a viabilidade da metodologia proposta, tendo em vista que os

resultados gerados com o método automático foram compatíveis a aqueles obtidos

pelo método manual.

Palavras-chave: Visão computacional. Imagem digital. Processamento de imagem.

Análise de imagem. Segmentação. Matlab. Biorremediação.

ABSTRACT

This work proposes a model that uses processing and digital image analysis to make

the determination, count and classification of microorganisms with capacity for

bioremediate petroleum hydrocarbons. The bioremediation is a technique that uses

biological methods to restore polluted environments. In the proposed approach, the

digital image is captured in RGB color format, from experiments with colonies of

microorganisms cultivated in Petri dishes. To improve the quality of the image, we

conducted a pre-processing in the original image through the calculating the average

of neighboring pixels. The Colony Forming Units (CFU) of microorganisms capable of

bioremediation are identified in the digital image through segmentation by

thresholding, taking into account the pattern of amber-red color formed around the

colonies of the organism as a result of the Bavendamm Test. Subsequently, the CFU

are identified and counted using the technique of growth of the region, taking into

account the pixels belonging to the neighborhood radius 4. The automatic analysis of

the image is finished with the classification of settlements according to their ability to

bioremediate oil and its derivatives. This classification is obtained by analyzing the

intensity of the red-amber halo formed around the colony. The proposed model was

implemented in MATLAB (MathWorks, Inc.). The results were compared to results

generated by the direct method, in other words, results obtained by human manual

analysis. By comparison of results showed the viability of the proposed methodology,

given that the results generated with the automatic method were compatible with

those obtained by the manual method.

Keys words: Computer vision. Digital image. Image processing. Image analysis.

Segmentation. Matlab. Bioremediation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Colônias de microorganismos cultivadas em placa de Petri .....................14

Figura 2 – Resultado à Reação de Bavendamm.......................................................15

Figura 3 - Etapas do processamento e análise de imagem digital ............................18

Figura 4 - Filtragem por média, usando máscara 3x3 ...............................................22

Figura 5 - Máscaras de Kuwahara para filtragem com preservação de bordas ........23

Figura 6 - Segmentação por thresholding (limiarização) ...........................................24

Figura 7 - Crescimento de regiões usando sementes conhecidas............................26

Figura 8 - Resultado da segmentação por detecção de borda..................................26

Figura 9 - Visão geral do modelo proposto ...............................................................37

Figura 10 - Colônia de microorganismo com capacidade biorremediadora ..............41

Figura 11 - Escala de capacidade para biorremediação ...........................................42

Figura 12 - Imagem analisada com uma colônia biorremediadora............................44

Figura 13 - Imagem analisada com cinco colônias biorremediadoras.......................45

Figura 14 - Imagem analisada sem colônias biorremediadoras ................................45

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CCD - Charge Coupled Device

CO2 - Dióxido de carbono

GHz - Gigahertz

HAP - Hidrocarboneto Aromático de Petróleo

LaPSI - Laboratório de Processamento de Sinais e Imagens

MB - Megabyte

RAM - Random Access Memory

RGB - Red, Green, Blue

RNA - Rede Neural Artificial

SAIMO - Sistema de aquisição de imagens para uso em microscopia óptica

UFC - Unidade Formadora de Colônia

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................12

1.1 Poluição por hidrocarbonetos de petróleo e biorreme diação ................13

1.2 Determinação, contagem e classificação de microorga nismos .............14

1.3 Visão geral da solução proposta ...............................................................16

1.4 Estrutura do trabalho .................................................................................16

2 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGEM DIGITAL ............................18

2.1 Etapas de um sistema de processamento e análise de imagem digital 20

2.1.1 Aquisição da imagem ...................................................................................20

2.1.2 Pré-processamento ......................................................................................20

2.1.3 Segmentação ...............................................................................................22

2.1.3.1 Thresholding (Limiarização) .........................................................................24

2.1.3.2 Crescimento de região..................................................................................25

2.1.3.3 Detecção de borda .......................................................................................26

2.1.4 Representação e descrição ..........................................................................27

2.1.5 Reconhecimento e interpretação..................................................................28

3 DETECÇÃO E CONTAGEM DE MICROORGANISMOS ATRAVÉS DE

PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGEM DIGITAL ............................30

3.1 Caracterização e classificação de microorganismos a quáticos ............30

3.2 Detecção de microorganismos através processamento d e imagem e

redes neurais ..............................................................................................31

3.3 Detecção de borda e estimação da quantidade de flag elos ...................32

3.4 Localização de imagens ao microscópio utilizando pr ocessamento

digital de imagem .......................................................................................32

3.5 Detecção de face em imagem colorida .....................................................33

3.6 Segmentação de pele humana utilizando modelo de cor es RGB ..........34

3.7 Segmentação de pele baseada em aprendizagem celular ......................34

4 MODELO PROPOSTO.................................................................................36

4.1 Os experimentos .........................................................................................37

4.2 Aquisição da imagem .................................................................................38

4.3 Cálculo da média da imagem ....................................................................38

4.4 Segmentação das colônias ........................................................................39

4.5 Identificação das colônias .........................................................................40

4.6 Classificação das colônias ........................................................................41

5 AVALIAÇÃO ................................................................................................43

5.1 Metodologia de avaliação ..........................................................................43

5.2 Resultados obtidos ....................................................................................43

5.3 Análise .........................................................................................................46

6 CONCLUSÃO ...............................................................................................47

REFERÊNCIAS ............................................................................................49

APÊNDICE A - Experimentos realizados......................................................51

APÊNDICE B - Código-fonte do protótipo ....................................................57

12

1 INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas a área de processamento e análise de imagens digitais

vem apresentando um significativo crescimento. Por um lado o uso de equipamentos

de captura de imagem se populariza, motivado principalmente pelo avanço

tecnológico e conseqüente redução nos preços. Por outro, novos recursos

tecnológicos possibilitam a realização de tarefas que até pouco tempo não podiam

ser executadas. Nesse mesmo sentido, as pesquisas envolvendo processamento e

análise de imagens digitais têm possibilitado o surgimento de novos equipamentos,

novas tecnologias e novas soluções.

Há poucas décadas atrás o uso de imagens digitais se restringia a algumas

áreas de conhecimento. Segundo Conci, Azevedo e Leta (2008, p. 3), “até a década

de 1980, o maior emprego das imagens digitais consistia em imagens provenientes

da pesquisa espacial”. Atualmente o uso de imagens digitais está inserido nas mais

variadas áreas de conhecimento: medicina, indústria, aplicações militares, biologia,

microscopia, segurança, arte, sensoriamento remoto, astronomia, entre outras.

Imagens são modificadas para ressaltar determinadas características ou

propriedades, possibilitando a análise automática por computador, ou mesmo para

facilitar a interpretação humana.

Um exemplo do uso de processamento e análise de imagem digital é o Projeto

Reticulócitos (PROJETO RETICULÓCITOS, 2005 apud BANDEIRA, 2005) do

Laboratório de Processamento de Sinais e Imagens (LaPSI) do Departamento de

Engenharia Elétrica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), que

em cooperação com o Hospital de Clínicas de Porto Alegre, objetiva a contagem

automática de células de sangue, utilizando processamento de imagem digital.

A área de processamento e análise de imagens digitais está em contínuo

crescimento. Sistemas de análise de imagens digitais a cada dia executam tarefas

mais complexas. Contudo, segundo Gonzalez e Woods (2000, p. 407), “não

sabemos ainda como dotar tais sistemas com uma performance que chegue ao

menos perto das capacidades humanas na realização geral das funções de análise

de imagens”. Os atuais sistemas de processamento e análise de imagens digitais

são projetados para resolver problemas específicos, ou seja, são altamente

dependentes do problema a ser resolvido.

13

Nesse contexto se insere o presente trabalho. Nele é apresentada uma

metodologia que consiste inicialmente na captura de imagens digitais provenientes

de experimentos onde são cultivadas colônias de microorganismos. A essas

imagens são aplicadas técnicas de processamento e análise de imagem digital para,

de maneira automática, determinar a presença, quantificar e classificar as colônias

formadas por microorganismos com capacidade para biorremediar hidrocarbonetos

aromáticos e petróleo (HAPs).

1.1 Poluição por hidrocarbonetos de petróleo e bior remediação

Atualmente a poluição do meio ambiente é um dos grandes problemas

enfrentados pela humanidade. “Contaminações de solos com hidrocarbonetos de

petróleo são um problema ambiental com abrangência mundial devido à alta

demanda de produtos refinados de petróleo.” (BERGER, 2005, p. 4).

Conforme Jacques (2005), uma das estratégias para eliminação dos

Hidrocarbonetos Aromáticos de Petróleo (HAPs) dos solos contaminados é a

biorremediação, onde os microorganismos que apresentam capacidade de

metabolizar estes compostos irão transformá-los em substâncias inertes, CO2 e

água. URURAHY apud SOUZA (2005) afirma que, por assimilarem petróleo e seus

derivados como fonte de carbono e/ou de energia, os microorganismos vêm se

apresentando como uma poderosa alternativa aos métodos convencionais de

tratamento, sendo cada vez mais empregados na resolução de problemas

ambientais. A “biorremediação pode ser considerada como uma nova tecnologia

para tratar locais contaminados mediante o uso de agentes biológicos capazes de

modificar ou decompor poluentes alvos. Estratégias de biorremediação incluem: a

utilização de microrganismos [...] ” (MARIANO, 2007, p. 296).

Berger (2005) refere que para avaliar as possibilidades de biorremediação do

solo, deve ser feita uma caracterização prévia do solo a ser tratado. Já Spinelli

(2005) lista uma série de critérios que devem ser conhecidos quando se fala em

biorremediação. Dentre esses critérios cita a existência de microorganismos que

tenham a necessária atividade catabólica. Determinar a presença desses

14

microorganismos é o objetivo do isolamento e contagem das colônias em amostras

de solo.

Entretanto, Spinelli (2005, p. 70), ao relatar o processo de quantificação de

bactérias e fungos, refere que “[...] as colônias eram contadas por método direto”, ou

seja, a contagem é realizada de forma manual através da análise visual dos

experimentos, o que demanda tempo, além dessa análise estar sujeita a

imprecisões e a erros interoperador e intra-operador.

1.2 Determinação, contagem e classificação de micro organismos

Tendo em vista a análise das colônias cultivadas ser realizada de forma

manual, através da observação dos experimentos, a utilização de técnicas de

processamento e análise de imagem digital pode contribuir para uma melhora

substancial na qualidade dos resultados do processo de determinação, contagem e

classificação dos microorganismos biorremediadores. Os erros intra-operador e

interoperador, e ainda as imprecisões a que o processo manual está sujeito, podem

ser minimizados com utilização de um processo automatizado.

Figura 1 - Colônias de microorganismos cultivadas em placa de Petri Fonte: Autoria própria, 2008.

15

A figura 1 apresenta uma imagem com colônias de microorganismos cultivados

em placa de Petri. A imagem foi capturada a partir dos experimentos realizados pela

aluna Luciane de Sá Brito Almeida, durante o seu trabalho de conclusão do curso de

Ciências Biológicas no Unilasalle, no ano de 2008. Durante o seu desenvolvimento,

os microorganismos com capacidade para biorremediar hidrocarbonetos aromáticos

de petróleo irão se diferenciar dos demais pela formação de um halo vermelho-

âmbar ao redor da sua colônia, conforme mostrado na figura 2. O aparecimento

desse halo ocorre em virtude da reação dos microorganismos ao Teste de

Bavendamm.

A "Reação de Bavendamm" pode ser citada como um exemplo clássico da utilização das técnicas de formação de halo. Nesta reação, o ácido fenólico, ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico, conhecido como ácido gálico (DAVIDSON et al., 1938; NOBLES, 1965), sob ação das fenoloxidases fúngicas forma quinonas, que são identificadas pela formação de um halo de cor âmbar em torno do micélio (CONCEIÇÃO, 2005, p. 100).

Figura 2 - Recorte na figura 1, demonstrando o resultado à Reação de Bavendamm Fonte: Autoria própria, 2008.

Na realização do Teste de Bavendamm é adicionada a substância resorcinol às

culturas dos microorganismos. Aqueles microorganismos com capacidade para

biorremediar hidrocarbonetos de petróleo reagirão, formando um halo na cor

vermelho-escura acastanhada (âmbar) ao redor da colônia. Quanto mais escura for

a tonalidade vermelho-âmbar do halo formado, maior será a capacidade de

biorremediação do microorganismo.

A análise manual dos experimentos consiste em identificar e contar as

Unidades Formadoras de Colônias (UFC) positivas para o Teste de Bavendamm

diretamente na placa de Petri. Portanto, essa análise está sujeita à percepção visual

do operador e à sua experiência no desempenho dessa tarefa.

16

1.3 Visão geral da solução proposta

A solução proposta utiliza processamento e análise de imagens digitais para

determinar a presença, quantificar e classificar microorganismos biorremediadores

de hidrocarbonetos de petróleo.

As colônias dos microorganismos com capacidade de biorremediação são

identificadas na imagem, rotuladas, contadas e classificadas de acordo com a

coloração vermelho-âmbar produzida no seu halo.

A metodologia proposta foi implementada no ambiente MATLAB (MathWorks,

Inc.). Os resultados obtidos foram comparados a resultados obtidos com a análise

manual (humana), onde ficou comprovada a viabilidade da proposta de determinar a

presença, quantificar e classificar microorganismos biorremediadores de

hidrocarbonetos aromáticos de petróleo através de processamento e análise de

imagens digitais.

1.4 Estrutura do trabalho

O presente trabalho está estruturado em seis capítulos e dois apêndices. No

capítulo dois é apresentado um resumo do referencial teórico contendo os conceitos

empregados, referentes a processamento e análise de imagens digitais. O capítulo

três apresenta técnicas de processamento e análise de imagem digital aplicadas à

detecção e contagem de microorganismos, que foram empregados em trabalhos de

relevância desenvolvidos por pesquisadores da área. O método proposto é

apresentado em detalhes no capítulo quatro: o capítulo inicia com uma visão geral

do modelo proposto e, na sequência, são detalhadas as etapas do processo. No

quinto capítulo é realizada a avaliação da metodologia proposta e dos resultados

obtidos com os experimentos realizados. No capítulo seis está a conclusão do

presente trabalho e a indicação de trabalhos futuros nessa área de pesquisa.

O trabalho traz ainda dois apêndices. O Apêndice A apresenta os resultados

obtidos e as imagens utilizadas nos experimentos realizados durante o presente

17

trabalho. Para cada experimento há a imagem original coletada da placa de Petri e

as imagens média, segmentada e de colônias identificadas, que foram geradas na

execução protótipo. O Apêndice B contém o código-fonte integral do protótipo

desenvolvido para o ambiente MATLAB (MathWorks, Inc.)

18

2 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGEM DIGITAL

Conforme proposto por Gonzalez e Woods (2000), o processamento e análise

de imagens digitais pode ser divido em três áreas: processamento de baixo nível,

processamento de nível intermediário e processamento de alto nível. Segundo

Gonzalez e Woods (2000, p. 408), “embora essas subdivisões não tenham fronteiras

definitivas, elas fornecem um esquema de trabalho útil para a categorização dos

vários processos que são componentes inerentes de um sistema autônomo de

análise de imagens”.

Figura 3 - Etapas do processamento e análise de imagem digital

Fonte: Gonzalez e Woods, 2000, p. 408.

A figura 3 apresenta uma visão geral das técnicas de processamento e análise

de imagens digitais conforme proposto por Gonzalez e Woods (2000). Conforme a

proposta, o processamento de baixo nível trata de funções que podem ser vistas

como reações automáticas, não requerendo inteligência da parte do sistema de

análise de imagem. Já o processamento de nível intermediário é composto por

19

tarefas de extração e caracterização de componentes em uma imagem resultante do

processo de baixo nível. Por sua vez, o processamento de alto nível envolve as

tarefas que requerem mais inteligência por parte do sistema: o reconhecimento e a

interpretação. Para Gonzalez e Woods (2000, p. 409) “esses dois processos

possuem uma forte semelhança àquilo que é geralmente referido como cognição

inteligente”.

Uma outra divisão, também didática, para classificar os procedimentos

característicos de um sistema de processamento e análise de imagem digital foi

proposta por Pedrini e Schwartz (2008). Para eles o processamento e análise de

imagens digitais pode ser divido em dois níveis de abstração: processamento de

imagens, constituído por tarefas de baixo nível; e análise de imagens, que envolve

as tarefas de alto nível. Para os autores essa divisão objetiva apenas simplificar o

estudo das tarefas envolvidas no processo.

O processamento digital de imagens consiste em um conjunto de técnicas para capturar, representar e transformar imagens com o auxílio de computador. O emprego dessas técnicas permite extrair e identificar informações das imagens e melhorar a qualidade visual de certos aspectos estruturais, facilitando a percepção humana e a interpretação automática por meio de máquinas. A análise de imagens é, tipicamente, baseada na forma, na textura, nos níveis de cinza ou nas cores dos objetos presentes nas imagens. Uma dificuldade inerente ao processo de análise de imagens é seu caráter multidisciplinar, em que diversos domínios de conhecimento são comumente necessários para solucionar satisfatoriamente o problema, tais como geometria computacional, visualização científica, psicofísica, estatística, teoria da informação e muitos outros (PEDRINI e SCHWARTZ, 2008, p.1 e 2).

Contudo, Pedrini e Schwartz (2008) e Gonzalez e Woods (2000) concordam

que o conhecimento sobre o domínio do problema está codificado, em um sistema

de processamento de imagens digitais, na forma de uma base de conhecimento.

O conhecimento sobre o domínio do problema está codificado em um sistema de processamento de imagens na forma de uma base de conhecimento. A base de conhecimento é dependente da aplicação, cujo tamanho e complexidade podem variar significativamente. A base de conhecimento deveria ser utilizada para guiar a comunicação entre os módulos de processamento a fim de executar uma determinada tarefa. (Pedrini e Schwartz, 2008, p. 4 e 5). Esse conhecimento pode ser tão simples quanto o detalhamento de regiões de uma imagem em que se sabe que a informação de interesse pode ser localizada, limitando assim a busca que precisa ser conduzida na procura por aquela informação. A base de conhecimento pode também ser bastante complexa, tal como uma lista inter-relacionada de todos os principais defeitos possíveis em um problema de inspeção de materiais (Gonzalez e Woods, 2000, p. 06).

20

Nas seções seguintes são descritas as etapas constituintes de um sistema de

processamento e análise de imagem digital, conforme proposto por Gonzalez e

Woods (2000).

2.1 Etapas de um sistema de processamento e análise de imagem digital

O processamento e análise de imagens digitais envolve um conjunto de etapas

que, ao final, deverão produzir o resultado esperado. Para Gonzalez e Woods

(2000), os sistemas de análise automática de imagens digitais são altamente

especializados, de modo a não possuir capacidade de generalização. A seguir são

apresentadas as etapas de um sistema de processamento e análise de imagens

digitais.

2.1.1 Aquisição da imagem

Na etapa de aquisição é realizada a captura da imagem por meio de um

dispositivo como, por exemplo uma câmera fotográfica, e a conversão dessa

imagem para uma representação adequada ao processamento digital subsequente.

2.1.2 Pré-processamento

A imagem digital resultante do processo de aquisição pode apresentar

imperfeições ou degradações decorrentes, por exemplo, das condições de

iluminação. O pré-processamento visa aumentar as chances de se obter sucesso

nas etapas seguintes do processo, reduzindo essas imperfeições.

A melhora na qualidade da imagem pode ser obtida por meio da aplicação de

técnicas de atenuação de ruído, correção de contraste ou brilho, suavização de

determinadas propriedades da imagem, entre outras.

21

Como exemplo de pré-processamento podemos citar o realce de imagem

digital. Seu objetivo é melhorar a qualidade da imagem, tornando-a mais adequada

às etapas posteriores, ou então melhorar as condições da imagem tendo em vista a

percepção visual humana.

As técnicas de realce de imagem, segundo Pedrini e Schwartz (2008), dividem-

se em categorias: métodos aplicados ao domínio espacial e métodos do domínio da

frequência.

Conforme Conci, Azevedo e Leta (2008), o processamento ou a análise de

imagens no domínio da frequência é geralmente realizado em três passos:

a) a imagem é transformada do domínio espacial para o domínio da frequência,

usando uma transformada, como por exemplo a Transformada de Fourier;

b) operações de filtragem são realizadas na imagem;

c) a imagem resultante é revertida do domínio da frequência para o domínio

espacial, para que possa ser exibida.

O domínio espacial refere-se ao próprio plano da imagem, ou seja, ao conjunto

de pixels que formam a imagem. As técnicas usadas no domínio espacial tratam

diretamente os pixels constituintes da imagem.

A filtragem é um exemplo de técnica que pode ser executada tanto no domínio

da frequência como no domínio espacial. Seu objetivo é diminuir imperfeições como,

por exemplo, ruídos gerados na aquisição da imagem.

Um tipo de filtro aplicado no domínio espacial é a média de pixels. Essa

operação de filtragem tende a realizar uma suavização na imagem e pode causar

perda de detalhes finos da imagem. A filtragem através de média pode também ser

encontrada na literatura sendo referenciada como filtro de suavização.

Filtros de suavização são usados para borramento e redução de ruídos. O borramento é utilizado em pré-processamento, tais como redução de pequenos detalhes de uma imagem antes da extração de objetos (grandes), e conexão de pequenas descontinuidades em linhas e curvas. A redução de ruídos pode ser conseguida pelo borramento com filtro linear assim como por filtragem não-linear (Gonzalez e Woods, 2000, p. 136).

O processo de filtragem geralmente é executado com a utilização de matrizes

denominadas máscaras. Por conveniência costuma-se usar matrizes quadras de

ordem n x n, para que cada máscara tenha um pixel central, que receberá o valor

médio dos vizinhos.

22

A figura 4 apresenta o resultado da filtragem por média para redução de ruído.

Nesse exemplo foi utilizada máscara de 3x3 pixels.

Um ponto desfavorável da filtragem por média é a perda de detalhes na

imagem. Quanto maior a máscara utilizada, maior será a área de redução de

contraste e maior será a perda de definição da imagem.

(a)

(b)

Figura 4 - Filtragem por média, usando máscara 3x3: (a) Imagem original ruidosa, (b) Imagem após filtragem

Fonte: Autoria própria

Outra questão a ser considerada ao utilizar filtragem por média são as bordas

da imagem, principalmente em aplicações dependentes dessa área. Foram criados

vários métodos de filtragem com preservação das bordas. Uma das primeiras

propostas nesse sentido foi a utilização de Máscaras de Kuwahara (KUWAHARA et

al. apud PEDRINI E SCHWARTZ, 2008). A figura 5 exemplifica essa técnica.

O filtro considera uma região quadrada de dimensões (2k-1) x (2k-1) pixels ao redor de um pixel (x, y) da imagem. Essa região é subdivida em quatro janelas de k x k pixels. A variância dos níveis de cinza para cada janela é calculada. O valor de cada pixel (x, y) da imagem é substituído pela média dos níveis de cinza da janela, cuja variância é mínima (PEDRINI e SCHWARTZ, 2008, p.128).

2.1.3 Segmentação

A segmentação é o processo que separa a imagem em suas partes

constituintes, ou seja, divide uma imagem em regiões que possuem o mesmo

conteúdo no contexto da aplicação. “A segmentação é muito natural e fácil para o

23

ser humano, porém complexa para o computador.” (CONCI, AZEVEDO e LETA,

2008, p. 199).

Figura 5 - Máscaras de Kuwahara para filtragem com preservação de bordas Fonte: Kuwara et al. apud Pedrini e Schwartz, 2008, p. 128.

Pedrini e Schwartz (2008, p. 151) consideram que “um processo de

segmentação que identifique corretamente a localização, a topologia e a forma dos

objetos é um requisito de fundamental importância para que as informações

resultantes de um sistema de análise de imagens sejam confiáveis”.

Para Gonzalez e Woods (2000, p. 295) “em geral, a segmentação autônoma é

uma das tarefas mais difíceis em processamento de imagens. Esse passo determina

o eventual sucesso ou fracasso na análise”.

Existem muitas técnicas para segmentar uma imagem digital. Esse conjunto de

técnicas pode ser agrupado em duas categorias distintas. A primeira trata de

identificar os objetos de interesse pela análise de suas fronteiras ou bordas. As

técnicas da segunda categoria usam as informações contidas no interior do objeto,

como cor e textura.

A seguir são descritas algumas dessas técnicas de segmentação de imagens

digitais.

k

k

k

k

k

k

k

k

24

2.1.3.1 Thresholding (Limiarização)

A “limiarização é uma das mais importantes abordagens para a segmentação

de imagens.” (GONZALEZ e WOODS, 2000, p. 316). Seu objetivo é extrair objetos

de interesse da imagem, através da escolha de limiares de níveis de cinza ou cores,

que sirvam como parâmetros separadores. Pedrini e Schwartz (2008) referem que

uma maneira para melhorar o formato do histograma, e consequentemente

aumentar as chances de seleção de um “bom” limiar, é considerar apenas os pixels

que estejam localizados sobre ou próximo das fronteiras entre os objetos e o fundo

da imagem.

A figura 6 apresenta um exemplo do uso de limiarização em imagem colorida,

que consiste num mapeamento dos pixels de uma imagem f(x, y) para uma imagem

resultante g(x, y).

A operação de limiarização poderia ser executada com base na equação

abaixo, onde “L” representa o valor de limiar de separação entre objetos e fundo, ou

seja, o limite que define se o pixel em questão na imagem g(x, y) receberá valor 1 ou

0:

1 (objeto), se f(x, y) ≤ L, g(x, y) =

0 (fundo), caso contrário,

Figura 6 - Segmentação por thresholding (limiarização): (a) Imagem original, (b) Imagem segmentada

Fonte: Freitas et al., 2007, p. 66.

25

2.1.3.2 Crescimento de região

A segmentação por crescimento de região é um exemplo de técnica que usa

informações contidas no interior dos objetos de interesse. A região (ou objeto), a ser

“descoberta” na imagem é iniciada com um pixel semente. Os demais pixels

pertencentes à região serão identificados pela similaridade de suas características

com a semente, de acordo com a aplicação em questão.

Ao utilizar crescimento de regiões por agregação de pixel para segmentar

imagens digitais, deve-se considerar duas questões de fundamental importância na

sua aplicação: primeiro a seleção da semente, sendo que a quantidade de sementes

selecionadas define a quantidade máxima de áreas que a imagem será divida.

A segunda questão é decidir quando um novo pixel deve ser inserido na região,

definindo corretamente que propriedades devem ser consideradas. Nesse caso

descritores de características internas como cor, textura e área serão

indispensáveis. Contudo, os descritos por si só não são capazes de fornecer

condições que possibilitem a identificação inequívoca das regiões. Essa condição

pode ser alcançada com a utilização conjunta da informação de conectividade dos

pixels. Nesse caso, o critério que decide se um pixel pertence à região levará em

consideração, além dos descritores, a relação com os pixels vizinhos, que poderá

ser a vizinhança 4 ou vizinhança 8, conforme o caso.

Um pixel p nas coordenadas (x,y) tem quatro vizinhos horizontais e verticais cujas coordenadas são dados por (x+1,y), (x-1,y), (x,y-1), (x,y+1). Esse conjunto de pixels, ditos na vizinhança 4 de p, recebem a notação N4(p). Os quatro pixels vizinhos das diagonais de p têm coordenadas (x+1,y+1), (x+1,y-1), (x-1,y+1), (x-1,y-1) e recebem a notação ND(p), junto com a vizinhança 4, esse conjunto é chamado vizinhança 8 e recebe a notação N8(p) (CONCI, AZEVEDO E LETA, 2008, p. 210 e 211).

A figura 7 ilustra um exemplo de segmentação por crescimento de região

adaptado de Gonzalez e Woods (2000). Na figura “a”, a matriz representa uma

imagem digital em níveis de cinza. Os valores indicam o nível de cinza de cada pixel.

Foram selecionados os pixels (3, 2) e (3, 4) como sementes. A diferença de nível cor

(cinza claro e escuro) nos pontos é apenas uma forma didática e visual para

melhorar o entendimento do exemplo. A figura “b” mostra o resultado para o

processo de crescimento de região usando a diferença absoluta de menos de 3

entre o nível de cinza da semente e do pixel sendo analisado.

26

Figura 7 - Crescimento de regiões usando sementes conhecidas: (a) matriz da imagem original; (b) resultado da segmentação usando a diferença absoluta de

menos de 3 entre os níveis de intensidade Fonte: Adaptado de Gonzalez e Woods, 2000, p. 327.

2.1.3.3 Detecção de borda

Uma outra técnica para segmentação de imagens é a detecção de borda. “Uma

borda é o limite ou fronteira entre duas regiões com propriedades relativamente

distintas de nível de cinza.” (PEDRINI e SCHWARTZ, 2008, p. 153). Para segmentar

imagens que apresentem distribuição de níveis de cinza suficientemente

homogênea, como na figura 8, a transição entre duas regiões, e sua conseqüente

identificação, pode ser determinada simplesmente com base na descontinuidade dos

níveis de cinza.

(a)

(b)

Figura 8 - Resultado de segmentação por detecção de borda: (a) Imagem original, (b) Imagem segmentada Fonte: Popova e Mitev, 2000.

1 2 3 4 5

1 a a b b b

2 a a b b b

3 a a b b b

4 a a b b b

5 a a b b b

(b)

1 2 3 4 5

1 0 0 5 6 7

2 1 1 5 8 7

3 0 1 6 7 7

4 2 0 7 6 6

5 0 1 5 6 5

(a)

27

Como visto aqui, a segmentação é um passo inicial, porém decisivo, para

encontrar uma solução adequada ao problema de análise de imagem em questão.

Há muitas alternativas de técnicas para executar a segmentação, contudo Gonzalez

e Woods (2000, p. 340) orientam que “a escolha de uma técnica de segmentação

em relação à outra é ditada principalmente pelas características peculiares do

problema sendo considerado”.

2.1.4 Representação e descrição

Representar e descrever uma imagem digital significa expressar os dados

presentes nessa imagem de uma forma que o computador os entenda. “O processo

de descrição visa à extração de características ou propriedades que possam ser

utilizadas na discriminação entre classes de objetos.” (PEDRINI e SCHWARTZ,

2008, p. 4).

Gonzalez e Woods (2000), ao definir os processos de representação de

imagem, afirmam que a representação de uma região envolve a escolha entre duas

opções: representar a região em termos de suas características externas, ou seja,

suas fronteiras; ou representar em termos de suas características internas, por

exemplo, através dos pixels que compõe a região.

Gonzalez e Woods (2000) defendem que, embora os dados obtidos pela

segmentação algumas vezes sejam usados diretamente como descritores, a prática

mais comum utiliza esquemas de representação que compactam esses dados de

uma forma mais inteligente. Entre esses esquemas de representação incluem-se o

código da cadeia, a representação por aproximações poligonais, por assinaturas, por

segmentos de fronteiras e pelo esqueleto da região.

Pedrini e Schwartz (2008) apresentam uma relação de descritores de bordas e

outra de descritores de região. Os primeiros são baseados em propriedades

geométricas como diâmetro, perímetro, energia de deformação e descritores de

Fourier. Os descritores de região levam em consideração informações obtidas dos

pixels que constituem a região.

28

2.1.5 Reconhecimento e interpretação

No último estágio da figura 3, que demonstra as etapas do processamento e

análise de imagens digitais, é realizado o processamento de alto nível, que

compreende os processos de reconhecimento e interpretação. “A maioria das

técnicas usadas para o processamento de baixo nível e de nível intermediário

incluem um conjunto razoavelmente bem definido de formulações teóricas.”

(GONZALEZ e WOODS, 2000, p. 409). No entanto, Gonzalez e Woods (2000)

observam que ao entrar em reconhecimento, e especialmente em interpretação, o

conhecimento e compreensão dos princípios fundamentais tornam-se menos

precisos e mais especulativos.

Essa falta relativa de entendimento resulta, em último caso, em uma formulação de restrições e idealizações com a intenção de reduzir a complexidade da tarefa a um nível tratável. O produto final é um sistema com capacidades operacionais altamente especializadas (GONZALEZ e WOODS, 2000, p. 409).

O reconhecimento consiste em atribuir um rótulo a um objeto presente na

imagem, com base nas características extraídas através dos seus descritores.

Nessa fase do processo, portanto, ocorre a atribuição de significado àqueles objetos

que foram considerados como constituintes da imagem.

Várias abordagens foram criadas para o reconhecimento dos objetos. Contudo,

essas abordagens podem ser agrupadas em métodos de reconhecimento por

decisão teórica e métodos estruturais para o reconhecimento.

O reconhecimento por decisões teóricas baseia-se na representação dos padrões na forma de um vetor, seguida da busca por abordagens para o agrupamento e para atribuição dos vetores de padrões a classes de padrões. As principais abordagens para o reconhecimento por decisões teóricas são os classificadores por distância mínima, correlacionadores, classificadores bayesianos e redes neurais. No reconhecimento estrutural, os padrões são representados na forma simbólica (como cadeias e árvores), e os métodos de reconhecimento baseiam-se em casamento de cadeias ou em modelos que tratam os padrões simbólicos como sentenças de uma linguagem artificial (GONZALEZ e WOODS, 2000, P. 409).

Na fase final do processamento e análise de imagens digitais ocorre a

interpretação da imagem. Nesse momento o sistema terá que atribuir significado à

imagem usada como entrada no sistema.

Dependendo do problema a ser resolvido, o objetivo pode ser alcançado nas

fases anteriores à interpretação. Contudo, quando se trata de análise automática de

29

imagens, processo que segundo Gonzalez e Woods (2000) também é chamado de

análise de cenas ou compreensão de imagens, a atribuição de significado será o

resultado a ser alcançado.

30

3 DETECÇÃO E CONTAGEM DE MICROORGANISMOS ATRAVÉS DE

PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGEM DIGITAL

Na seção a seguir são apresentados trabalhos relacionados ao uso de

processamento e análise de imagem digital para a automatização do processo de

determinação e quantificação de microorganismos. São apresentados também

trabalhos que exemplificam o uso do ambiente MATLAB na segmentação de

imagens digitais coloridas.

O enfoque dado à segmentação se justifica pela importância dessa etapa ao

processo de análise de imagens digitais. Gonzalez e Woods (2000), ao comentarem

sobre a segmentação, referem que é uma das tarefas mais difíceis no

processamento de imagens digitais, e se bem executada favorece substancialmente

para que a solução seja bem sucedida, mas a segmentação mal realizada quase

sempre leva a falhas no processamento.

3.1 Caracterização e classificação de microorganism os aquáticos

Santos (2001) propõe uma metodologia para a caracterização e classificação

de microorganismos aquáticos, bem como a determinação de suas características

cinemáticas. Para a caracterização e o reconhecimento de padrões foram

empregados processamento digital de imagens e redes neurais artificiais (RNA). A

metodologia proposta para aquisição e processamento da imagem e para a medição

das bactérias aquáticas é composta pelas seguintes etapas:

a) Observação em microscópio de imagens de bactérias aquáticas com câmera

de vídeo CCD (Charge Coupled Device);

b) Captura das imagens para microcomputador;

c) Conversão das imagens para padrão em tons de cinza;

d) Aplicação de filtros de Gauss, Laplace e Médio;

e) Conversão em imagem binária por escolha de limiar;

f) Aplicação de operadores morfológicos para contagem e medição das

bactérias aquáticas;

31

g) Estudo das medidas das bactérias por processamento digital de imagens.

A metodologia proposta alcançou os resultados esperados, contando

corretamente a quantidade de bactérias nas imagens e destacando os detalhes de

cada microorganismo. Através da análise desses detalhes, foi possível calcular

grandezas geométricas que não eram obtidas com as técnicas convencionais

utilizadas anteriormente como área, perímetro, diâmetro, entre outras.

3.2 Detecção de microorganismos através processamen to de imagem e redes

neurais

Kumar e Mittal (2008) propõem uma técnica para detecção rápida de

microorganismos utilizando processamento de imagem e redes neurais artificiais. Os

autores defendem a idéia de que a detecção e classificação de microorganismos

pode ser mais eficiente e rápida combinando as técnicas de microscopia e análise

de imagem. Na metodologia proposta, a imagem é capturada com uma câmera

digital acoplada ao microscópio. Para realizar a classificação são selecionados nove

parâmetros, extraídos da imagem digital. Os parâmetros são os seguintes:

a) comprimento não-uniforme em 45º (45° run length non-uniformity);

b) largura (width);

c) fator de forma (shape factor);

d) comprimento horizontal não-uniforme (horizontal run length non-uniformity);

e) média de intensidade do nível de cinza (mean gray level intensity);

f) 10% dos valores do histograma de níveis de cinza (ten percentile values of

the gray level histogram);

g) 99% dos valores do histograma de níveis de cinza (99 percentile values of

the gray level histogram);

h) somatório da entropia (sum entropy);

i) entropia (entropy).

Esses nove parâmetros, usados para classificar os microorganismos, são

extraídos da imagem com a utilização dos softwares Image Pro Plus (Media

Cybernetics) e maZda (Institute of Electronics, Technical University of Lódz, Lódz,

Polônia).

32

Para realizar a classificação dos microorganismos os parâmetros são

submetidos a uma rede neural artificial (RNA), previamente treinada.

Com a utilização da metodologia proposta, os microorganismos foram

precisamente identificados e classificados.

3.3 Detecção de borda e estimação da quantidade de flagelos

Popova e Mitev (2000) apresentam dois algoritmos para análise de imagem. O

primeiro é um algoritmo para segmentação dos flagelos de microorganismos.

Flagelos são as estruturas que permitem a locomoção dos microorganismos.

Tamanho, forma e número de flagelos são importantes parâmetros morfofisiológicos

no estudo dos microorganismos.

Para realizar a segmentação é usada a técnica de detecção de borda. O

algoritmo de segmentação proposto possui o diferencial de não depender da escolha

de ponto inicial na imagem.

O segundo algoritmo proposto é baseado no primeiro, e tem o objetivo de

estimar a quantidade de flagelos nos microorganismos.

Os resultados obtidos através da execução do método proposto foram

comparados a outros algoritmos similares, mas dependentes da escolha do ponto

inicial, e mostraram-se mais preciso.

3.4 Localização de imagens ao microscópio utilizand o processamento digital

de imagem

Bandeira (2005) apresenta uma proposta para solucionar o problema de

controle de posicionamento das aquisições de imagem, que ocorre num sistema de

contagem de células de sangue por processamento digital de imagens. O sistema de

contagem é fruto do Projeto Reticulócitos, originário do Laboratório de

Processamento de Sinais e Imagens (LaPSI) do Departamento de Engenharia

Elétrica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), em cooperação

33

com o Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A partir do Projeto Reticulócitos surgiu o

SAIMO (Sistema de Aquisição de Imagens para uso em Microscopia Óptica). O

SAIMO possui limitações no controle de posicionamento e no campo de visão

limitado. O controle de posicionamento fica a cargo do operador. Devido à limitação

do campo de visão, várias aquisições devem ser feitas para se obter o número

mínimo de células recomendado. Além disso, há um possível aumento de erro de

contagem associado às imagens parciais de célula presentes nas bordas das

imagens.

O trabalho tem como proposta solucionar o problema de controle de

posicionamento das aquisições, com a localização da cena durante a captura da

imagem. Além disso, é proposta uma técnica de composição em mosaico com as

imagens adquiridas, reduzindo os problemas causados pelo campo de visão

limitado. Também são propostos métodos de pré-processamento visando reduzir, e

se possível, eliminar problemas de baixo contraste, distribuição não uniforme de

luminosidade e presença de ruído nas imagens adquiridas.

Como pré-processamento são realizadas as operações: transformação de RGB

para níveis de cinza; extração do fundo das imagens; redução do tamanho da

imagem, nos casos necessários; estiramento de histograma e binarização. As

operações de pré-processamento objetivam proporcionar a redução do tempo das

tarefas subseqüentes.

Os resultados obtidos mostraram que o método é rápido na localização e

eficiente na composição do mosaico, podendo ser utilizado como parte de um

sistema de contagem de células por processamento digital de imagens.

3.5 Detecção de face em imagem colorida

Rein-Lien, Abdel-Mottaleb e Jain (2002) propõem um algoritmo de detecção de

rosto em imagens digitais coloridas na presença de diferentes condições de

iluminação, bem como fundos complexos. Baseado numa técnica de compensação

de iluminação e numa transformação não-linear de cor, o método proposto procura

regiões de pele humana em toda a imagem de entrada e gera candidatos a rosto,

com base no arranjo espacial destas áreas da pele selecionadas. O algoritmo

34

constrói olho, boca e mapas de contorno para verificar cada área candidata a rosto.

Resultados experimentais demonstraram que o algoritmo proposto foi bem sucedido

na tarefa de detecção de rosto em um vasto leque de variações faciais na cor,

posição, escala, orientação e expressão faciais em imagens obtidas a partir de

várias coleções de fotos.

3.6 Segmentação de pele humana utilizando modelo de cores RGB

Freitas et al. (2007) propõem uma técnica de segmentação de imagens

digitais, capturadas por webcam, pela cor da pele humana utilizando o modelo de

cores RGB (do inglês Red, Green, Blue). A técnica consiste em executar um

processo de limiarização nos três canais do modelo RGB. Para demonstrar a

eficiência da técnica proposta, foi desenvolvido um protótipo no ambiente

MATLAB/Simulink (Mathworks Inc.). A técnica de segmentação proposta apresentou

boa aplicabilidade em ambientes com fundo simples, porém apresentou limitações

em imagens com fundo complexo. A definição de fundo simples ou complexo

baseia-se na menor ou maior presença de objetos com cores semelhantes a cor da

pele humana, respectivamente. A técnica ainda apresentou deficiência em

segmentar objetos com cores semelhantes às cores da pele humana.

3.7 Segmentação de pele baseada em aprendizagem cel ular

Ahmad, Mehran e Shohreh (2008) propõem um algoritmo que combina

informações de cor e textura da pele com a aprendizagem de autômatos celulares

para realizar a segmentação de pele humana em imagens coloridas. Os autores

sustentam que não há evidência comprovada mostrando que um espaço de cor em

especial possibilite o melhor desempenho para a detecção de pele, considerando

todas as situações e tipos de imagens.

Primeiramente, o método proposto procura pela presença da cor da pele na

imagem. As regiões detectadas com cor de pele servem de entrada para um extrator

35

de textura, que extrai as características de textura da pele através de propriedades

estatísticas e mapeia-os para um mapa de probabilidade de pele. Autômatos

celulares aprendem a usar esse mapa para tomar decisões sobre a existência de

pele nessas regiões. O algoritmo proposto demonstrou taxa de acerto de

aproximadamente 83,4% e taxa de falso positivo em torno de 11,3%, em testes

realizados com a base de dados de pele da Compaq. Os resultados experimentais

demonstraram a efetividade do algoritmo proposto.

36

4 MODELO PROPOSTO

Gonzalez e Woods (2000, p. 407) definem a análise de imagens digitais

quando afirmam que “é um processo de identificação, de descobrimento e de

entendimento de padrões que sejam relevantes à performance de uma tarefa

baseada em imagens.” Para Gonzalez e Woods (2000) uma das principais metas do

processamento e análise de imagens digitais é dotar uma máquina com capacidade

semelhante a dos seres humanos para análise de imagem.

Diante desse desafio, e visando contribuir para uma melhoria na detecção e

contagem de microorganismos, o modelo apresentado se propõe a determinar a

presença, quantificar e classificar microorganismos biorremediadores de

hidrocarbonetos de petróleo através de processamento e análise de imagens

digitais.

Para representar e descrever as colônias com capacidade biorremediadora

foram utilizadas características internas, no caso, a cor dos pixels que compõem a

colônia.

O modelo proposto foi implementado através de um protótipo desenvolvido

com a utilização do ambiente MATLAB (MathWorks, Inc.). O protótipo foi

desenvolvido num computador com processador AMD Athlon™ 64 Processor 288+,

1.80 GHz, 512 MB de memória RAM. A sua execução, nesse mesmo computador,

apresentou desempenho satisfatório, mesmo quando analisadas imagens com

tamanho grande, em torno de 2.304 x 1.728 pixels.

A figura 9 apresenta uma visão geral do modelo proposto. As subseções a

seguir detalham as etapas constituintes desse modelo. A organização dessas etapas

em pré-processamento e processamento e análise, conforme indicado na figura 9

pelas linhas tracejadas, está de acordo com a divisão conceitual das técnicas de

análise de imagens proposta por Gonzalez e Woods (2000). Sendo que, no presente

caso, o processamento de nível intermediário e o processamento de alto nível estão

presentes no grupo denominado processamento e análise.

O código-fonte do protótipo desenvolvido com base no modelo proposto pode

ser encontrado, na íntegra, no Apêndice B. Na sua implementação foi utilizada a

Versão 7.1 (R.14) Service Pack do MATLAB (MathWorks, Inc.).

37

4.1 Os experimentos

As imagens utilizadas no presente trabalho foram capturadas a partir de

experimentos realizados no ano de 2008, no Unilasalle, durante o trabalho de

conclusão do curso de Ciências Biológicas da aluna Luciane de Sá Brito Almeida.

Em seu trabalho de conclusão a aluna Luciane Almeida propôs uma adaptação da

metodologia de isolamento e qualificação de microorganismos biorremediadores de

Hidrocarbonetos Aromáticos de Petróleo (HAPs).

Figura 9 - Visão geral do modelo proposto Fonte: Autoria própria, 2009.

Aquisição da imagem

Cálculo da Média da imagem

Segmentação (limiar nos 3 canais RGB)

Identificação das colônias

Cultivo dos microorganismos

Classificação (+, ++, +++)

Apresentação dos resultados

Processamento e Análise

Pré-Processamento

38

Nesses experimentos os microorganismos são cultivados em placas de Petri. A

essas culturas é acrescida a substância resorcinol. Conforme demonstrado na figura

2, como resultado à Reação de Bavendamm, os microorganismos com capacidade

para biorremediar hidrocarbonetos de petróleo se diferenciam dos demais pela

formação de um halo com coloração vermelho-âmbar ao redor das suas colônias.

Quanto mais escuro o halo formado na colônia, maior será a capacidade de

biorremediação dos microorganismos.

4.2 Aquisição da imagem

As imagens foram capturadas no sistema de cores RGB, utilizando-se uma

câmera digital com resolução máxima de 4.1 Megapixels, que produz imagem de até

2.304 x 1.728 pixels.

A captura da imagem se deu diretamente das placas de Petri, ou seja, não foi

utilizado nenhum outro equipamento que modificasse ou ampliasse a imagem, como

por exemplo, microscópio.

A iluminação é um fator importante em qualquer processo de aquisição de

imagem. Contudo, a incidência direta de luz na placa de Petri deve ser evitada, pois

devido à superfície de vidro transparente dessas placas, pode ocorrer a formação de

reflexo na placa de Petri e consequente perda de detalhes na imagem.

4.3 Cálculo da média da imagem

Visando produzir melhores condições para as etapas seguintes, a imagem

original passou por um pré-processamento através de cálculo de média de pixels.

Para a execução do cálculo foi processado separadamente cada canal de cor RGB.

No processo de cálculo foi utilizada média aritmética. A matriz que representa a

imagem foi percorrida do início ao fim. Para cada pixel foi atribuída a média

aritmética, calculada entre o seu próprio valor e o valor dos seus vizinhos. Os pixels

39

vizinhos foram selecionados de acordo com a matriz formada através da janela

indicada na execução do protótipo.

O problema dos pixels localizados nas bordas não possuírem todos os vizinhos

foi resolvido pela manutenção das bordas da imagem original. Essa solução

mostrou-se satisfatória porque as bordas da imagem não contêm informações

relevantes para o resultado final da análise automática.

O protótipo criado possibilita a execução da média com janela de tamanho

variável, ou seja, o operador pode informar o tamanho da janela. Foram testadas

execuções com janela de tamanho 3, 5, 7, 9, 11 e 13 pixels. Os melhores resultados

foram obtidos com janelas de tamanho de 3 e 5 pixels. Com a utilização de janelas

maiores que 5 pixels, as colônias localizadas na imagem tendem a sofrer uma

diminuição na área, devido ao efeito de borramento que é causado com a execução

da média com essas janelas.

4.4 Segmentação das colônias

As colônias formadas por microorganismos biorremediadores foram

identificadas na imagem por segmentação, com base no padrão de cor vermelho-

âmbar formado com a Reação de Bavendamm, através da técnica de thresholding

(limiarização).

Para realizar a segmentação, a matriz que representa a imagem é percorrida

do início ao fim. Cada pixel da imagem é testado nos seus três canais de cores

RGB. Para que seja selecionado como pertencente a uma colônia com capacidade

de biorremediação, o pixel deverá atender simultaneamente aos intervalos de níveis

de cor conforme listado abaixo:

a) canal de cor R (vermelho): valores entre 45 e 148;

b) canal de cor G (verde): valores entre 13 e 80;

c) canal de cor B (azul): valores entre 14 e 39.

O processo de segmentação originará uma imagem binária como saída. As

colônias selecionadas são marcadas com a cor preta. Ao restante da imagem é

atribuída a cor branca, indicando que essas áreas foram consideradas com fundo da

imagem.

40

4.5 Identificação das colônias

A identificação das colônias é executada com a técnica de crescimento de

região. Cada colônia segmentada na etapa anterior é marcada como sendo uma

região. A procura de uma nova colônia começa no início da matriz que representa a

imagem. A semente para a nova região será o primeiro pixel encontrado que

satisfaça as condições estabelecidas. A partir desse pixel semente são buscados os

demais pixels pertencentes à colônia. No método proposto, além dos critérios de cor,

foi usada a vizinhança 4 de p como critério de conectividade para indicar os pixels

pertencentes à mesma colônia.

O processo de identificação das colônias é realizado em três etapas. Na

primeira são identificadas todas as possíveis colônias com capacidade de

biorremediação. Nessa etapa são agrupados em regiões todos os pixels que

atendem aos critérios estabelecidos, ou seja, aqueles que receberam a cor preta no

processo de segmentação.

Na etapa seguinte, são eliminadas as “falsas” colônias. São consideradas

falsas colônias aquelas que possuem número reduzido de pixels. No presente

trabalho, através da análise dos experimentos, optou-se por usar um limite de 0,2%

(dois décimos por cento) dos pixels totais da imagem, como tamanho mínimo para

considerar uma colônia como “verdadeira”.

As “falsas” colônias são formadas por microorganismos com capacidade de

biorremediação desprezível ou por elementos “estranhos” presentes na imagem,

como, por exemplo, o efeito da iluminação na borda da placa de Petri. Nos

experimentos utilizados existiam também anotações feitas com caneta, escritos na

superfície externa da placa de Petri, que atendiam aos critérios de cor estabelecidos.

Esses falsos positivos foram removidos com a execução desse procedimento de

eliminação por área mínima.

Na terceira etapa do processo de identificação, são marcadas as colônias

consideradas como “verdadeiras”, ou seja, são mantidas na imagem apenas as

regiões que atendam aos critérios de cor, conectividade e área mínima

estabelecidos. No final dessa terceira etapa as colônias formadas por

microorganismos com capacidade de biorremediar derivados de petróleo estarão

determinadas, ou seja, sua localização e quantidade serão conhecidas.

41

Para finalizar a processo de análise, resta a classificação das colônias de

acordo com a sua capacidade biorremediadora.

4.6 Classificação das colônias

Para realizar a classificação das colônias foi criada uma escala de capacidade

de biorremediação. Essa escala foi baseada no padrão de coloração apresentado

pela colônia da figura 10. Essa colônia é formada por microorganismos com

reconhecida capacidade de biorremediação.

Figura 10 - Imagem de colônia formada por microorganismo com capacidade para biorremediar hidrocarbonetos de petróleo

Fonte: Prof. Giovani Piva, 2008.

A escala de capacidade de biorremediação foi formada a partir de um recorte

da figura 10. Essa imagem que serviu de parâmetro para criação da escala é

mostrada na figura 11.

Para que se tenha um único valor combinando os três canais de cores RGB, a

imagem resultante do cálculo de média de pixels e a imagem representativa da

escala de biorremediação foram convertidas para níveis de cinza. Essas conversões

para níveis de cinza foram realizadas para facilitar a comparação dos pixels das

colônias selecionadas com os pixels da escala de biorremediação.

42

Figura 11 - Recorte de área da figura 10. Referência para criar a escala de capacidade de biorremediação

Fonte: Autoria própria, 2009.

As colônias foram classificadas conforme a tabela abaixo. Essa tabela mostra

uma classificação padrão usada para classificar a capacidade de biorremediação.

Tabela 1 - Escala de capacidade de biorremediação

Tipo Simbologia Descrição

1 +++ Ótima

2 ++ Boa

3 + Regular

Fonte: Autoria própria, 2009.

A classificação das colônias foi realizada através da quantidade de pixels da

colônia, pertencentes a cada categoria da tabela, conforme as seguintes condições:

a) Se pelo menos 25% (vinte e cinco por cento) dos pixels da colônia são do

tipo 1, então a colônia é classificada com capacidade de biorremediação

Ótima;

b) Se não atender ao critério anterior e se pelo menos 25% (vinte e cinco por

cento) dos pixels da colônia são do tipo 2, então a colônia é classificada com

capacidade de biorremediação Boa;

c) Se não atender a nenhuma das condições anteriores, então a colônia será

classificada com capacidade de biorremediação Regular.

Apesar dos percentuais acima listados mostrarem-se adequados à

classificação das colônias analisadas, devido a indisponibilidade de outros trabalhos

que pudessem fornecer outras imagens, não é possível afirmar que tais percentuais

sejam apropriados para realizar-se a classificação em outros experimentos, mesmo

que semelhantes aos experimentos utilizados no presente trabalho.

43

5 AVALIAÇÃO

Nas seções seguintes será explicada a metodologia de avaliação utilizada.

Serão também demonstrados os resultados obtidos na análise das imagens. Para

realizar essas análises foram utilizadas duas imagens com presença de colônias

formadas por microorganismos com capacidade de biorremediação e uma terceira

imagem formada por colônias sem capacidade biorremediadora.

5.1 Metodologia de avaliação

Os resultados obtidos pelo método proposto foram comparados a resultados

obtidos pela análise manual humana, para os mesmos experimentos.

A análise manual foi realizada pelo prof. Giovani André Piva, Mestre em

Microbiologia Agrícola e do Ambiente, professor adjunto do Centro Universitário La

Salle, que atuou como co-orientador no presente trabalho. A análise manual indicou

quais colônias eram formadas por microorganismo com capacidade positivas de

biorremediação.

A classificação do “poder biorremediador”, através de análise manual, não

apresenta boa eficiência. Essa classificação seria resultado da percepção visual do

analisador, de modo que o resultado final seria a opinião pessoal de quem realizou a

classificação.

5.2 Resultados obtidos

Os resultados obtidos na determinação, contagem e classificação dos

microorganismos com capacidade de biorremediação foram obtidos através do

método descrito no capítulo 4. Esses resultados obtidos com a execução do

protótipo foram comparados a resultados obtidos com a análise manual. A seguir é

apresentado um comparativo entre as análises automática e manual.

44

No Apêndice A são encontradas as imagens originais, imagens médias

geradas, imagens resultantes da segmentação e imagens com as colônias

identificadas, bem como os resultados encontrados nos experimentos realizados

durante o presente trabalho.

A figura 12 mostra a primeira imagem analisada. Nessa imagem está

identificada com o número “1” a única colônia com capacidade de biorremediação.

Tendo em vista a dificuldade de se obter imagens formadas por múltiplas

colônias com capacidade de biorremediação, e visando uma avaliação mais efetiva

do modelo proposto, foi criada a imagem da figura 13, que contem uma colônia com

capacidade de biorremediação replicada 5 (cinco) vezes.

A imagem da figura 14 é formada por colônias sem capacidade de

biorremediação. A execução desse teste demonstra a eficiência do método proposto

em não apresentar resultados falso-positivos.

Figura 12 - Imagem analisada com uma colônia biorremediadora Fonte: Autoria própria, 2009.

Resultados obtidos na análise da figura 12:

Resultado da análise automática:

a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: 1 (uma);

b) Classificação:

- colônia 1: + (regular).

Resultado da análise manual:


b) Classificação: Não pode ser realizada.

1

45

Figura 13 - Imagem analisada com cinco colônias biorremediadoras Fonte: Autoria própria, 2009.



a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: 5 (cinco);

b) Classificação:

- colônia 1: + (regular);







b) Classificação: Não pode ser realizada.

Figura 14 - Imagem analisada sem colônias biorremediadoras Fonte: Autoria própria, 2009.

5

4

3

2 1

46



a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: nenhuma.


a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: nenhuma.

5.3 Análise

A metodologia proposta mostrou-se adequada para determinar, quantificar e

classificar colônias de microorganismos com capacidade para biorremediar

hidrocarbonetos de petróleo em experimentos submetidos à Reação de

Bavendamm. A análise automática, além de produzir resultados compatíveis aos

resultados da análise manual, foi capaz de realizar a classificação dos

microorganismos, conforme a capacidade de biorremediação.

47

6 CONCLUSÃO

O presente trabalho apresentou um estudo sobre a utilização de

processamento e análise de imagem digital na detecção, contagem e classificação

de microorganismos biorremediadores de Hidrocarbonetos Aromáticos de Petróleo.

Foi examinada a viabilidade e as vantagens que a detecção e contagem automáticas

desses microorganismos apresentam em relação à analise manual.

A metodologia proposta foi implementada através de um protótipo,

desenvolvido no ambiente MATLAB (MathWorks, Inc.).

Os resultados obtidos com a execução do protótipo foram comparados a

resultados obtidos através da análise manual. Essa comparação demonstrou a

viabilidade do método proposto. Além de alcançar resultados compatíveis aos

resultados da análise manual, o método proposto alcançou resultados que foram

além daqueles obtidos pelo método manual, uma vez que não é viável a

classificação dos microorganismos através de análise manual.

Por assimilarem hidrocarbonetos de petróleo como fonte de energia, os

microorganismos vêm se apresentando como uma poderosa alternativa aos

métodos convencionais de tratamento, sendo cada vez mais empregados na

resolução de problemas ambientais. Com o trabalho, espera-se ter contribuído para

a melhora na qualidade dos resultados obtidos no processo de análise da

capacidade de biorremediação dos microorganismos.

A utilização do método proposto pode agregar mais precisão e maior rapidez

aos resultados obtidos, além de minimizar erros interoperador e intra-operador a que

o processo manual está sujeito.

Dentre as limitações encontradas na realização do estudo, destaca-se a

dificuldade na obtenção de imagens de múltiplos experimentos com cultura de

microorganismos. Não foram localizados outros trabalhos nessa área de pesquisa

da biologia que pudessem fornecer imagens para testes. Uma maior variedade de

imagens permitiria uma comparação mais completa do modelo proposto.

Por outro lado, uma dificuldade a ser considerada por quem faz pesquisa em

processamento e análise de imagem digital é a complexidade matemática de alguns

conceitos. Contudo, com estudo e dedicação essa barreira poderá ser ultrapassada.

48

Trabalhos futuros sobre o tema aqui abordado podem ser desenvolvidos no

sentido de ampliar os resultados gerados pela análise automática. A especificação

de qual microorganismo gerou a colônia, determinando se bactéria ou fungo, pode

ser objeto de estudos futuros. Essa identificação pode ser executada, por exemplo,

através da análise de características das colônias como textura e forma.

Técnicas de inteligência artificial como, por exemplo, Lógica Fuzzy ou Redes

Neurais Artificiais (RNA), podem ser empregadas para realizar a identificação e

classificação dos microorganismos, agregando maior qualidade aos resultados

gerados. No mesmo sentido, o método proposto pode ser adaptado e aplicado a

outras áreas de estudo.

No processo de isolamento e detecção de microorganismos biorremediadores,

muitas vezes a análise dos experimentos é realizada pelo método direto, ou seja,

através de análise manual humana. Espera-se que o modelo proposto, e o protótipo

originado a partir dele, possam contribuir para uma melhora na qualidade da análise,

atenuando erros interoperador e intra-operador, e fornecendo resultados mais

precisos do que aqueles obtidos com a análise manual.

49

REFERÊNCIAS

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50

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51

APÊNDICE A - Experimentos realizados

Experimento realizado a partir de recorte da imagem capturada do trabalho de

conclusão do Curso de Ciências Biológicas da aluna Luciane de Sá Brito Almeida.

Imagem original:

Imagem média:

Imagem segmentada:

Imagem com a identificação

das colônias:

Resultados obtidos:


b) Classificação:


1

52



Imagem original:

Imagem média:

Imagem segmentada:


das colônias:

Resultados obtidos:

a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: 0 (zero).

53



Imagem original:

Imagem média:

Imagem segmentada:


das colônias:

Resultados obtidos:


b) Classificação:


1

54

Experimento realizado com imagem criada a partir de recortes da escala de

capacidade de biorremediação.

Imagem original:

Imagem média:

Imagem segmentada:


das colônias:

Resultados obtidos:

a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: 3 (três);

b) Classificação:


- colônia 2: ++ (boa);

- colônia 3: +++ (ótima).

1 2

3

55

Experimento realizado com imagem formada pela da união de regiões de

imagens distintas.

Imagem original:

Imagem média:

Imagem segmentada:


das colônias:

Resultados obtidos:


b) Classificação:






2 1

3

4 5

56

Experimento realizado com imagem formada pela da união de regiões de

imagens distintas.

Imagem original:

Imagem Média:

Imagem

Segmentada:

Imagem com as

colônias

identificadas:

Resultados obtidos:

a) Nº de colônias com capacidade de biorremediação: 3 (três);

b) Classificação:




2 1 3

57

APÊNDICE B - Código-fonte do protótipo

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %% %% Função principal: recebe uma imagem RGB e um int eiro (representando o %% tamanho da máscara) como argumentos e calcula a media da imagem, através %% da máscara informada %% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function Prototipo(imagem, janela) img=imread(imagem); imtool(img); img_media1=Media(img, janela); img_media2=Media(img_media1, janela); img_media3=Media(img_media2, janela); img_media4=Media(img_media3, janela); imwrite(img_media4, 'c:\temp\Media\imagem_media.jpg' , 'jpg' ); imtool(img_media4); img_threshold=Threshold(img_media4); img_threshold_gray = rgb2gray(img_threshold); imwrite(img_threshold_gray, 'c:\temp\Threshold\imagem_threshold.jpg' , 'jpg' ); imtool(img_threshold_gray); [img_colonias, quant_colonias]=Identifica(img_t hreshold_gray); imwrite(img_colonias, 'c:\temp\Colonias\imagem_matriz.jpg' , 'jpg' ); disp( '-------------------------------------------------- -----------' ); disp( 'Quantidade de Colônias Biorremediadoras:' ); disp(quant_colonias); disp( '-------------------------------------------------- -----------' ); imtool(img_colonias); for n = 1 : quant_colonias classificacao=Classifica(img_media4, img_co lonias, n); disp( 'Colônia:' ); disp(n); disp( 'Capacidade Biorremediadora:' ); disp(classificacao); disp( '-------------------------------------------------- -----------' ); end end %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %% %% Função que calcula a média da imagem. Recebe com o argumentos a imagem %% RGB e o tamanho da janela a ser utilizada. %% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function img_media=Media(img, janela) [L, C, P] = size(img); img_media = img; % controla o tamanho da janela, garantindo ser um n ro. ímpar, para que % tenha um pixel central

58

if (janela == 0) janela = 3; elseif (mod(janela, 2) == 0) janela = janela - 1; end % janela diminui % 3 - (3/2 - 0.5) = 1 -- > inicio: (2,2) fim: (31,31), para 32x32 % 5 - (5/2 - 0.5) = 2 -- > inicio: (3,3) fim: (30,30), para 32x32 % 7 - (7/2 - 0.5) = 3 -- > inicio: (4,4) fim: (29,29), para 32x32 % 9 - (9/2 - 0.5) = 4 -- > inicio: (5,5) fim: (28,28), para 32x32 % exemplo para janela=3 e imagem 99 x 120 (linha x coluna) % diminui = 3 / 2 - 0.5 = 1 % inicio = 3 - 1 = 2, ou seja, inicia no pixel da p osição (2, 2) e % pegará pixels de (1, 1) até (3, 3) % fimL=99 - 1 = 98, ou seja, finaliza no pixel da posição (96, 117) e % fimC = 120 - 1 = 119 pegará pixel de (93, 114) a té (99, 120) % exemplo para janela=7 e imagem 99 x 120 (linha x coluna) % diminui = 7 / 2 - 0.5 = 3 % inicio = 7 - 3 = 4, ou seja, inicia no pixel da p osição (4, 4) e % pegará pixels de (1, 1) até (7,7) % fimL=99 - 3 = 96, ou seja, finaliza no pixel da posição (96, 117) e % fimC = 120 - 3 = 117 pegará pixel de (93, 114) a té (99, 120) diminui = janela / 2 - 0.5; inicio = janela - diminui; fimL = L - diminui; fimC = C - diminui; red =zeros(janela * janela); green=zeros(janela * janela); blue =zeros(janela * janela); for l=inicio : fimL for c=inicio : fimC % se janela=3, pega de (c-1, l-1) até (c+1, l+1) % se janela=7, pega de (c-3, l-3) até (c+3, l+3) somaR = uint16(0); for a = l-diminui : l+diminui for b = c-diminui : c+diminui somaR = somaR + uint16(img(a, b, 1)); end end somaG = uint16(0); for a = l-diminui : l+diminui for b = c-diminui : c+diminui somaG = somaG + uint16(img(a, b, 2)); end end somaB = uint16(0); for a = l-diminui : l+diminui for b = c-diminui : c+diminui somaB = somaB + uint16(img(a, b, 3)); end end

59

red = somaR / (janela * janela); green = somaG / (janela * janela); blue = somaB / (janela * janela); img_media(l, c, 1) = uint8(red); img_media(l, c, 2) = uint8(green); img_media(l, c, 3) = uint8(blue); end end end %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %% %% Função que realiza o processo de Threshold na im agem RGB recebida como %% argumento, através dos seguintes limiares: %% Vermelho: max: 148 min: 45 %% Verde: max: 80 min: 13 %% Azul: max: 39 min: 14 %% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function img_threshold=Threshold(img); maxR =148; minR = 45; maxG = 80; minG = 13; maxB = 39; minB = 14; img_threshold = img; x = size(img); for i=1 : x(1) for j=1 :x(2) if ((img(i,j,1) >= minR) && (img(i,j,1) <= maxR) && ( img(i,j,2) >= minG) && (img(i,j,2) <= maxG) && (img(i,j,3) >= minB) && (img(i,j,3) <= maxB)) % marca como colonia img_threshold(i,j,1) = 0; img_threshold(i,j,2) = 0; img_threshold(i,j,3) = 0; else % marca como fundo img_threshold(i,j,1) = 255; img_threshold(i,j,2) = 255; img_threshold(i,j,3) = 255; end end end end

60

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %% %% Função que realiza identifica as colonias presen tes na imagem em tonz de %% cinza passada como argumento. A identificação é realizada pelo técnica de %% crescimento de região. A função utiliza a subfun ção Cresce_Pilha, e está %% orginanizada em 3 partes: %% - realiza a identificação de todas as possíveis colônias presentes %% - elimina as "falsas" colônias que possuem 200 p ixels ou menos %% - realiza a identificação das colônias "verdadei ras" que restaram %% presentes na imagem %% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function [img_colonias, quant]=Identifica(img); % define as variáveis globais, que são usadas nessa função e na % subfunção Cresce_Pilha global IMG; % matriz auxiliar, utilizada para saber quando o pi xel foi marcado como % pertencente a colonia global MATRIZ; % Estrutura de dados usada para armazenas os pixels que devem ter seus % vizinhos analisados, para descobrir se pertencem a colônia global PILHA; % Contador de pixels armazenados na pilha global CONT_PILHA; IMG = img; PILHA = zeros(2, 1000); CONT_PILHA = 0; cont_colonia = 1; % controla a quantidade de colônias [lin_img, col_img] = size(IMG); % guarda dimensões da imagem (coluna,

%linha, profundidade) lin=1; % variável para se mover na matriz (linha) col=1; % variável para se mover na matriz (coluna) parar=0; % controla parada do laço %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% % 1ª parte da função: realiza a identificação de to das as possíveis % colônias presentes %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% MATRIZ = zeros(lin_img, col_img); while parar == 0 % se pixel é preto e ainda não vai marcado, quer di zer que é o % primeiro pixel da colônia (a semente da c olônia) if ((IMG(lin, col) < 100) && (MATRIZ(lin, col) == 0)) MATRIZ(lin, col) = cont_colonia;

% marca pixel como sendo da colônia atual % chama função recursiva que vai marcar os demais p ixels da colônia

% Empilha CONT_PILHA = CONT_PILHA + 1; PILHA(1, CONT_PILHA) = lin; PILHA(2, CONT_PILHA) = col; Cresce_Pilha(lin, col, cont_colonia);

61

% após a colônia ter sido marcada, inicializa os co ntadores para % começar a varredura do início da matriz (imagem) e incrementa o % contador de colônias lin = 1; col = 1; cont_colonia = cont_colonia + 1; % se não é pixel preto ou é preto, mas já foi marca do, passa para o % próximo pixel else col = col + 1; % se acabou as colunas, inicia na primeira coluna, da próxima linha if (col > col_img) col = 1; lin = lin + 1; % se ultrapassou o número de linhas, então pode par ar pois % varreu toda a imagem e não achou novas colônias if (lin > lin_img) parar = 1; end end end end %while % diminui uma colônia, para acertar o número de col ônias cont_colonia = cont_colonia - 1; %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% % 2ª parte da função: Elimina as "falsas" colônias, que possuem menos % que 0,2% (0,002) dos pixels da imagem %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% for n=1 : cont_colonia quant = 0; for l=1 : lin_img for c=1 : col_img if (MATRIZ(l, c) == n) quant = quant + 1; end end end % se a quantidade de pixels for menor que o limite (0,2%), apaga (passa % para branco) os pixels que foram marcados com o c ontador limite = double(lin_img * col_img * 0.002) ; if (quant < limite) for L=1 : lin_img for C=1 : col_img if (MATRIZ(L, C) == n) IMG(L, C)=255; end end end end end % fim do laço do cont_colonia

62

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% % 1ª parte da função: realiza a identificação das c olônias "reais" % presentes na imagem (mais de 90 pixels) %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% lin=1; % variável para se mover na matriz (linha) col=1; % variável para se mover na matriz (coluna) cont_colonia = 1; % quantidade de colônias parar=0; % controla parada do laço MATRIZ = zeros(lin_img, col_img); PILHA = zeros(2, 100); CONT_PILHA = 0; while parar == 0 % se pixel é preto e ainda não vai marcado, quer di zer que é o primeiro % pixel da colônia (a semente da colônia) if ((IMG(lin, col) < 100) && (MATRIZ(lin, col) == 0)) MATRIZ(lin, col) = cont_colonia; % marca pixel como sendo da colônia atual % chama função recursiva que vai marcar os demais p ixels da colônia % Empilha CONT_PILHA = CONT_PILHA + 1; PILHA(1, CONT_PILHA) = lin; PILHA(2, CONT_PILHA) = col; Cresce_Pilha(lin, col, cont_colonia); % após a colônia ter sido marcada, inicializa os co ntadores para % começar a varredura do início da matriz (imagem) e incrementa o % contador de colônias lin = 1; col = 1; cont_colonia = cont_colonia + 1; % se não é pixel preto ou é preto, mas já foi marca do, passa para o % próximo pixel else col = col + 1; % se acabou as colunas, inicia na primeira coluna, da próxima linha if (col > col_img) col = 1; lin = lin + 1; % se ultrapassou o número de linhas, então pode par ar pois % varreu toda a imagem e não achou novas colônias if (lin > lin_img) parar = 1; end end end end %while % diminui uma colônia, para acertar o número de col ônias quant = cont_colonia - 1; % atribuir a matriz resultante do processamento na variável de retorno img_colonias = MATRIZ; end

63

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %% %% Função que classifica a colônia. Recebe como arg umentos uma imagem RGB, %% a matriz que guarda a posição da colônia na imag em, e a identificação da %% colônia a ser classificada. %% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function resul=Classifica(img_rgb, matriz, colonia) img = rgb2gray(img_rgb); [lin_img, col_img] = size(img); quant=uint32(0); quantReg=uint32(0); quantBom=uint32(0); quantOtm=uint32(0); total=uint32(0); media=uint16(0); for l=1 : lin_img for c=1 : col_img % se o pixel pertence a colônia sendo analisada if (matriz(l, c) == colonia) quant = quant + 1; total = total + uint32(img(l, c)); %% Regular Bom Ótimo %% 84 - 63 62-43 42-23 if (img(l, c) >= 63) quantReg = quantReg + 1; elseif (img(l, c) <= 62 && img(l, c) >= 43) quantBom = quantBom + 1; elseif (img(l, c) <= 42) quantOtm = quantOtm + 1; end end end end %% Classificação pela quantidade de pixels da colôn ia pertencentes a %% categoria +++ (Ótimo), ++ (Bom) e + (Regular): %% Se 30% de Ótimo --> Ótimo, senão %% Se 30% de Bom --> Bom, senão %% --> Regular porcentOtm = quantOtm * 100 / quant; porcentBom = quantBom * 100 / quant; porcentReg = quantReg * 100 / quant; % Mostra na tela as porcentagens que classificam a colônia % disp('Porcentagem: Ótima - Boa - Regular '); % disp(porcentOtm); % disp(porcentBom); % disp(porcentReg);

64

if (porcentOtm >= 25) resul= '+++ (Ótima)' ; elseif (porcentBom >= 25) resul= '++ (Boa)' ; else resul= '+ (Regular)' ; end end % fim da function Classifica %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %% %% Função auxiliar que realiza a localização da col ônia na imagem. A função %% recebe como argumentos a posição do pixel sement e e o número que deve %% ser atribuído a colônia sendo localizada. Os pix els pertencentes à %% colônia são aqueles conforme a vizinhança-de-4 %% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function Cresce_Pilha(lin, col, cont_colonia) global IMG; global MATRIZ; global PILHA; global CONT_PILHA; continuar=1; [lin_img, col_img] = size(IMG); while CONT_PILHA > 0 % Desempilha lin = PILHA(1, CONT_PILHA); col = PILHA(2, CONT_PILHA); CONT_PILHA = CONT_PILHA - 1; if (lin > 1) if ((IMG(lin-1, col) < 100) && (MATRIZ(lin-1, col) == 0)) MATRIZ(lin-1, col) = cont_colonia; % Empilha CONT_PILHA = CONT_PILHA + 1; PILHA(1, CONT_PILHA)=lin-1; PILHA(2, CONT_PILHA)=col; end end if (col > 1) if ((IMG(lin, col-1) < 100) && (MATRIZ(lin, col-1) == 0)) MATRIZ(lin, col-1) = cont_colonia; % Empilha CONT_PILHA = CONT_PILHA + 1; PILHA(1, CONT_PILHA)=lin; PILHA(2, CONT_PILHA)=col-1; end end if (lin < lin_img) if ((IMG(lin+1, col) < 100) && (MATRIZ(lin+1, col) == 0)) MATRIZ(lin+1, col) = cont_colonia; % Empilha CONT_PILHA = CONT_PILHA + 1; PILHA(1, CONT_PILHA)=lin+1;

65

PILHA(2, CONT_PILHA)=col; end end if (col < col_img) if ((IMG(lin, col+1) < 100) && (MATRIZ(lin, col+1) == 0)) MATRIZ(lin, col+1) = cont_colonia; % Empilha CONT_PILHA = CONT_PILHA + 1; PILHA(1, CONT_PILHA)=lin; PILHA(2, CONT_PILHA)=col+1; end end end % while end % function Cresce_Pilha

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