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CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANOMESTRADO ACADÊMICO EM NANOCIÊNCIAS
DISCIPLINA: NANOTECNOLOGIA
Ana Paula Tasquetto da Silva, Benonio Villalba e Iuri Jauris
Profª Drª Marta Palma AlvesProfª Drª Renata Raffin
Profª Drª Solange Fagan
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ARTIGO
Fator de impacto: 7.365
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INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
• Câncer de próstata potencialmente letal
• 6° tipo de câncer mais comum no mundo, e 3° mais comum em homens
• Tratamento Quimioterapia Paclitaxel (PTX) - nome comercial Taxol®, Bristol-Myers Squibb.
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INTRODUÇÃO
ProblemaAlta toxicidade, especialmente hematológica.
Diversos casos de interrupção do tratamento!
SoluçãoNanopartículas magnéticas funcionalizadas e
revestidas por “casca” ou polímero hidrofílico
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INTRODUÇÃO
PotencialidadesMelhora o contraste em ressonância
magnética;
Entrega vetorizada do fármaco;
Maior capacidade de armazenamento de fármaco;
Boa dispersão em solução aquosa;
Biocompatibilidade com células e tecidos.
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INTRODUÇÃO
Como revestir as nanopartículas magnéticas com PTX?
Polianilina (PAn) biocompatível em aplicações in vivo e in vitro aplicados na engenharia biomédica e em biosensores.
Porém! fracas propriedades hidrofílicas limita sua aplicação biomédica.
Solução: Modificar PAn estruturalmente PAn + anidrido succínico poly[aniline-cosodium N-(1-one-butyric acid) aniline] (SPAnNa)
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INTRODUÇÃO
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METODOLOGIAMETODOLOGIA
Preparação das SPAnH/MNPs
• MNPs de Fe3O4 Co-precipitação
• FeCl3 e FeCl2 – 4H2O dissolvidos em 400 mL de água e agitados por 5 min.
• MNPs foram dispersas por sonicação e separadas da solução através de um ímã misturadas com SPAn e dopados com HCl 0,2 M.
• Formação de SPAnH/MNP espectroscopia no infravermelho.
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METODOLOGIA
Caracterização das SPAnH/MNPs
•Tamanho e morfologia microscopia eletrônica de transmissão.
•Tamanho hidrodinâmico espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer).
•Magnetização MNPs dispositivo supercondutor de interferência quântica (SQUID).
•Concentração do grupo carboxila na superfície da amostra método TBO.
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METODOLOGIA
Ensaio de estabilidade e atividade do PTX conjugado
•Atividade do PTX conjugado ensaio da proteína tubulina medida através do monitoramento do aumento da Abs (380 nm por 1h).
•Densidade óptica ELISA.
•Estabilidade PTX livre e conjugado variações de sua atividade utilizando o teste da proteína tubulina, após armazenamento a 25 e 37 ºC, por 21 dias.
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METODOLOGIA
Análise de Western blot
•Células CWR22R foram tratadas com PTX livre e conjugado.
•Proteínas foram quantificadas pela análise de Bradford.
•Lisados celulares membrana nitrocelulose bloqueadas com tampão TBS e imunocarregadas com anticorpos primários contra tubulina e β-actina.
•Incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase.
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METODOLOGIA
Ensaios de citotoxicidade in vitro
•Células PC3 e CWR22R cultivadas em meio RPMI + soro fetal bovino + gentamicina + penicilina + estreptomicina.
•50 µL de SPAnH/MNPs com PTX livre e PTX conjugado foram adicionados ao meio de cultura.
•Medição por densidade óptica 490 nm leitor de ELISA.
•Culturas celulares realizadas na presença de campo magnético de 800 Gauss.
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METODOLOGIA
Estudos de captação celular
•Células PC3 e CWR22R foram incubadas com SPAnH/MNPs por 2h a 37 ºC.
•Fixadas por glutaraldeído 3%.
•Células colocadas em moldes coradas com acetato de uranila 4% e citrato de chumbo.
•Imagens TEM com uma tensão de aceleração de 100 kV e microscopia confocal.
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RESULTADOSRESULTADOS
Caracterização SPAnNa e SPAnH/MNPs
Espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS)
Picos centrados em 398,2 eV (-N=), 399,3 eV (-N-) H399,8 eV (-N-) R
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RESULTADOS
• Imagens de MET MNPs e SPAnH/MNPs possuem 8 e 11 nm de diâmetro, respectivamente.
• A espessura da “casca” foi de aproximadamente 1,5 nm.
• O tamanho hidrodinâmico das MNPs e SPAnH/MNPs foi cerca de 80,6 e 73,7 nm, respectivamente.
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RESULTADOS
O potencial zeta do SPAnH/MNPs em água deionizada foi de 43,5 ± 1,07 mV e diminui para -30,5 ± 0,45 mV quando o PTX foi incorporado ao SPAnH/MNPs.
SQUID Tanto as MNPs como SPAnH/MNPs apresentam características de superparamagnetismo.
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RESULTADOS
Espectroscopia FT-IR: Picos não mudam quando comparados SPAnH e MNPs separadamente com o SPAnH/MNPs;
Para COOH C=O pico em 1707 cm-1
O-H pico em 3410 cm-1
Fe-O pico em 582 cm-1
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RESULTADOS
Atividade e estabilidade térmica PTX + SPAnH/MNPs
Máximo de 302,75 μg de PTX pode ser associado a 1mg de SPAnH/MNPs
Decréscimo na atividade relativa fraca interação de alguns grupos funcionais do PTX com a tubulina
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RESULTADOS
• A melhora sensível na estabilidade térmica do SPAnH/MNPs + PTX prolonga o tempo de duração no qual o PTX pode circular eficientemente no organismo.
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RESULTADOS
Captação celular
• Co-cultura de células PC3 com Cy5/SPAnH/MNPs por 8 h não tinha efeito sobre o equilíbrio dinâmico entre tubulina e microtúbulos. No entanto, os conjugados podem ser guiadas e concentrada para o fundo das placas de cultura através da aplicação de um campo magnético, resultando em conjugados mais ser interiorizados nas células.
• Alguns conjugados (cor vermelha) foram aprisionadas dentro dos lisossomos (cor verde) em um tempo de incubação e mostrado em amarelo imagem da fluorescência, o que implica que não houve aparente efeito citotóxico.
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RESULTADOS
Imagem confocal de células PC3 expostas a Cy5/SPAnH/MNPs conjugadas por 8 h (A) sem e (B) com a aplicação de campo magnético (800 Gauss).
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RESULTADOS
• As nanopartículas em negro de células PC3 e CWR22R (fig. A, B) são Fe3O4. Assim, PTX ligado as SPAnH / MNPS é transportado para as células de forma rápida e eficaz, aumentando a eficácia do tratamento e diminuindo a dose.
Imagens de MET (A) células PC3 (B) e células CWR22R (ambos 10.000)
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RESULTADOS
Western blot
• Tratamento de células CWR22R durante 24 h com diferentes concentrações de PTX livre e conjugado não teve nenhum efeito perceptível em β-actina.
• No entanto, o tratamento com 10 mM de PTX livre ou conjugado reduziu os níveis de α-tubulina para 52% e 63%, respectivamente, em relação aos controles não tratados.
• A redução observada com PTX-limite foi aprimorado para 81% quando um campo magnético foi aplicado durante a cultura fazendo aumentar significativamente a concentração do fármaco para a área específica.
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RESULTADOS
Análises de Western blot de α-tubulina e β-actina em células CWR22R tratados por 24 horas com (A) 0 mM (controle); (B) 2 mM, (C) 5 mM, e (D) 10 mM livre PTX; (E) 2 mm (F) 5 mM, (G) 10 mM PTX-ligado; células tratadas com (H) 2 mM, (I) 5 mM, e (J) 10 mM PTX conjugado foram submetidos ao campo magnético (800 Gauss).
• Isto sugere que, após o tratamento com PTX livre e conjugado, as tubulinas reuniriam rapidamente aos microtúbulos e isto resultou a não formação de mitose, consequentemente induzindo a apoptose.
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RESULTADOS
Citotoxicidade in vitro
• A citotoxicidade sem e com PTX conjugado as células PC3 e CWR22R foram obtidos através do método de ensaio XTT.
• A viabilidade celular após 48 h de incubação com SPAnH / MNPS em diferentes concentrações, demonstraram que as células PC3 e CWR22R co-cultivados com SPAnH / MNPS permaneceram viáveis em comparação com o controle quando a concentração de SPAnH / MNPS foi de até 500 µg/mL .
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RESULTADOS
• No entanto, PTX livre e conjugado foram tóxicos para os dois tipos de células de modo dose-dependente. No caso da célula PC3, o IC50 (50% inibição do crescimento celular) de valor-limitePTX foi 9,7 µg/mL mais baixa do que a de PTX livre (11,1 µg/mL) e foi significativamente reduzida para apenas 4,6 µg/mL para a aplicação magnética direcionamento para o PTX-limite.
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RESULTADOS
• Da mesma forma, no caso de células CWR22R, o valor de IC50 do PTX conjugado foi de 4,2 µg/mL mais baixa do que o PTX livre (7,1 µg/mL) e foi bastante reduzido para apenas 1,7 µg/mL para a aplicação magnética segmentação para o PTX-limite.
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RESULTADOS
• SPAnH / MNPS sozinho não teve efeito citotóxico em células PC3 ou CWR22R (fig. a), mesmo quando um campo magnético foi aplicado (fig. e).
Microscopia de Fluorescência
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RESULTADOS
• No entanto, o número de células mortas (em vermelho) aumentou quando a dose de PTX-limite aumentou (fig. b,d).
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• Além disso, quando PTX estava conjugado poderia ser concentrada uma área específica por um campo magnético aplicado (fig. f) (maioria das células mortas na região).
RESULTADOS
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CONCLUSÃOCONCLUSÃO
Em resumo, uma molécula SPAnH/MNPS atóxica, transportadora de fármaco contendo carboxilas foi desenvolvida com sucesso e poderá ser utilizada de forma eficaz para imobilizar o fármaco hidrofóbico PTX.
Além disso, estudos de estabilidade térmica mostraram um aumento na meia-vida do composto, para a temperatura de 37°C, de 19h do fármaco livre para 57h para o fármaco associado às nanopartículas.
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CONCLUSÃO
O PTX associado às nanopartículas pode ser concentrado no local do tumor por aplicação de campo magnéticos, reforçando a sua eficácia terapêutica.
O fármaco associado às nanopartículas apresentou ainda uma melhora de 58,6% a 76,1% na inibição do crescimento das células cancerígenas.
Eficácia do tratamento do tumor, ou seja, com menor dose terapêutica e potencialmente, menos efeitos colaterais.