UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

CARACTERIZAÇÃO DE DOIS cD�As HOMÓLOGOS A UMA AP E�DO�UCLEASE EM CA�A-DE-AÇÚCAR

ANDREA LIMA DE OLIVEIRA

NATAL-RN 2009

II

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

CARACTERIZAÇÃO DE DOIS cD�As HOMÓLOGOS A UMA AP

E�DO�UCLEASE EM CA�A-DE-AÇÚCAR

ANDREA LIMA DE OLIVEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Orientadora: Profª Drª Kátia Castanho Scortecci

NATAL-RN 2009

III

TERMO DE APROVAÇÃO

IV

Dedico este estudo: Aos meus pais,

Edileuza e Alexande; e aos meus irmão, Kamilla

e André Luiz.

V

AGRADECIME�TOS

Foram muitos os que me ajudaram a concluir este trabalho.

Meus sinceros agradecimentos...

...a Deus, por ter me dado paciência, coragem e amor pelo meu trabalho;

... a minha família, pela confiança e apoio;

...aos amigos do mestrado, pelas conversas e pela amizade;

...aos professores Paulo Marinho e Adriana Uchoa pelas valiosas sugestões na banca da

defesa;

...ao grupo de Genética Molecular Vegetal pelas contribuições;

...aos ICs do LBMG por toda a ajuda que me foi dada;

...as professoras Lucymara e Marie-Anne por terem aceitado participar da banca de mestrado;

...a CAPES, pela bolsa de estudos concedida;

...a Dra. Kátia Castanho Scortecci, pela paciência e orientação recebida.

VI

"As ciências têm as raízes amargas, porém os frutos são doces."

(Aristóteles)

VII

RESUMO O genoma de todos os organismos está sujeitos a lesões que podem ser causados por fatores

endógenos e ambientais. Uma vez no genoma, as lesões podem levar a formação e acúmulo de

mutações, as quais podem ser prejudiciais ao desenvolvimento do organismo. As vias de

reparo de DNA são um mecanismo que permite o organismo detectar e corrigir essas lesões

ou minimizar seus efeitos. Várias vias de reparo de DNA são conhecidas e bem caracterizadas

em animais e microorganismos. Em plantas, as vias de reparo ainda não são bem

caracterizadas, mas muitas pesquisas têm revelado a participação de todas as vias conhecidas

no reparo do genoma das plantas, sendo os modelos mais estudados Arabidopsis thaliana e

Oriza sativa. A via de reparo de interesse deste trabalho é a via de BER, a qual apresenta

várias proteínas atuando no reparo do DNA. Porém, a classe de proteínas da via BER focadas

são as AP endonucleases, responsáveis pela hidrólise do sítio AP. Este trabalho teve como

objetivo caracterizar dois cDNAs de cana-de-açúcar: scARP1 e scARP3, homólogos a AP

endonucleases de A.thaliana e identificados num trabalho de data-mining do projeto

SUCEST. Para tanto, foram construídos cassetes de super-expressão, contendo o cDNA

scARP1 sob o controle do promotor forte 35S. Além disso, anteriormente no laboratório foi

obtido uma planta de �icotiana tabacum contendo o cassete de super-expressão

(35S+scARP1) em orientação anti-senso. Foi analisado o desenvolvimento desta planta, e

foram obtidas também algumas sementes (T2) desta planta. Estas sementes foram germinadas

e analisadas quanto à presença do cassete de super-expressão e desenvolvimento. Além disso,

para estes dois genes foram clonados as regiões promotoras por PCR walking. Os fragmentos

obtidos foram clonados, sequenciados e, analisados por meio do programa PLANTCARE. Os

motivos encontrados nessas regiões dos genes de cana-de-açúcar foram comparados com

potenciais regiões promotoras das plantas de Arabidopis, O. sativa e S. bicolor. Estas análises

mostraram a presença de diferentes motivos relacionados à respostas ao estresse oxidativo.

Palavras-chave: reparo por excisão de base, AP endonuclease, cana-de-açúcar

VIII

ABSTRACT

The genome of all organisms is subject to injuries that can be caused by endogenous and

environmental factors. If these lesions are not corrected, it can be fixed generating a mutation

which can be lethal to the organisms. In order to prevent this, there are different DNA repair

mechanisms. These mechanisms are well known in bacteria, yeast, human, but not in plants.

Two plant models Oriza sativa and Arabidopsis thaliana had the genome sequenced and due

to this some DNA repair genes have been characterized. The aim of this work is to

characterized two sugarcane cDNAs that had homology to AP endonuclease: scARP1 and

scARP3. In silico has been done with these two sequences and other from plants. It has been

observed domain conservation on these sequences, but the cystein at 65 position that is a

characteristic from the redox domain in APE1 protein was not so conservated in plants.

Phylogenetic relationship showed two branches, one branch with dicots and monocots

sequence and the other branch with only monocots sequences. Another approach in order to

characterized these two cDNAs was to construct overexpression cassettes (sense and anti-

sense orientation) using the 35S promoter. After that, these cassettes were transferred to the

binary vector pPZP211. Furthermore, previously in the laboratory was obtained a plant from

�icotiana tabacum containing the overexpression cassette in anti-sense orientation. It has

been observed that this plant had a slow development and problems in setting seeds. After

some manual crossing, some seeds were obtained (T2) and it was analyzed the T2

segregation. The third approach used in this work was to clone the promoter region from these

two cDNAs by PCR walking. The sequences obtained were analyzed using the program

PLANTCARE. It was observed in these sequences some motives that may be related to

oxidative stress response.

Key words: base excision repair, AP endonuclease, sugarcane

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Diferentes vias de reparo de DNA..............................................................................2

Figura 2. Reparo por excisão de base (BER) ............................................................................9

Figura 3. Esquema do plasmídio pKCS42...............................................................................15

Figura 4. Esquema da técnica de PCR walking.......................................................................27

Figura 5. Domínios conservados em AP endonuclease de planta...........................................30

Figura 6. Alinhamento das proteínas homólogas a AP endonuclease.....................................31

Figura 7. Relação filogenética das sequências AP em plantas e no homem............................35

Figura 8. Confirmação da presença do promotor 35S no vetor pSPORT1..............................37

Figura 9. Esquema do cassete de super-expressão em orientação senso.................................37

Figura 10. Plantas de �. tabacum............................................................................................40

Figura 11. Plantas transformadas com Agrobacterium tumefasciens......................................41

Figura 12. Desenvolvimento de plantas selvagens e transgênicas...........................................43

Figura 13. Variação fenotípica dentro da população segregante.............................................43

Figura 14. Análise da presença do gene para canamicina.......................................................45

Figura 15. Resultado da PCR em Tempo Real para expressão de ARP1 e ARP3..................45

Figura 16. Comparação entre ARP1 e ARP3 na PCR em Tempo Real...................................46

Figura 17. Gel da confirmação da presença de inserto em vetor pGEM T-easy.....................47

X

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Comparação entre regiões promotoras de AP endonucleases em diferentes

plantas.......................................................................................................................................50

Tabela 2. Motivos encontrados nas regiões promotoras e suas funções..................................51

XI

LISTA DE ABREVIATURAS

ABRE: Elemento de resposta a ácido abscisico

ADP1: adaptador 1

ADP2: adaptador 2

AP: sítio apurínico/apirimidínico

AP1: primer para o adaptador 1

AP2: primer para o adaptador 2

BER: Reparo por excisão de base

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DEPC: Dietil Pirocarbonato

dNTP: desoxinucleotídeos trifosfato

D.O.: densidade óptica

DR: Reversão direta

DSBR: Reparo de quebra de dupla-fita

EndoIII: endonuclease III

Endo IV: endonuclease IV

ETOH: álcool etílico

ExoIII: exonuclease III

GGR: Reparo Global do Genoma

HR: Recombinação homóloga

MMR: Mau-pareamento

MS: Murashige e Skoog

NER: Reparo por excisão de nucleotídeos

NHEJ: Recombinação não homóloga do tipo “end-joining”

PVPP: Polivinilpolipirolidona

ROS: Espécies Reativas de Oxigênio

TCR: Reparo Acoplado à transcrição

UV- Ultravioleta

XII

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................1

1.1 DANOS AO DNA.....................................................................................................1

1.2 LESÕES AO DNA DE PLANTAS..........................................................................3

1.3 VIAS DE REPARO DE DNA..................................................................................4

1.3.1 Fotorreativação..................................................................................................... 4

1.3.2 Reparo por mau emparelhamento (MMR)............................................................4

1.3.3 Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)...........................................................5

1.3.4 Reparo por quebra de dupla-fita (DSB).................................................................6

1.3.4.1 Recombinação homóloga (HR)..............................................................6

1.3.4.2 Recombinação homóloga do tipo “end-joining”(NHEJ).......................7

1.3.5 Reparo por excisão de base (BER)........................................................................7

1.3.5.1 AP endonucleases.................................................................................10

2 JUSTIFICATIVA.............................................................................................................12

3 OBJETIVOS......................................................................................................................14

3.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................14

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................14

4 METODOLOGIA............................................................................................................15

4.1CONSTRUÇÃO DO CASSETE DE SUPER-EXPRESSÃO EM ORIENTAÇÃO

SENSO..........................................................................................................................15

4.2 MANIPULAÇÃO DE �icotiana tabacum.............................................................21

4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS cDNAs scARP1 E scARP3...........................23

4.4 CLONAGEM DOS PROMOTORES…………………………….........…………25

4.5 MINERAÇÃO DOS DADOS.................................................................................28

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................29

5.1 ANÁLISE IN SILICO DOS cDNAS scARP1 E scARP3 .....................................29

5.2 CONSTRUÇÃO DO CASSETE DE SUPER-EXPRESSÃO................................36

5.3 EXPRESSÃO DO CASSETE DE SUPER EXPRESSÃO ANTI-SENSO

EM TABACO...........................................................................................................................38

5.4 OBTENÇÃO DE �. tabacum................................................................................40

5.5 CLONAGEM DOS PROMOTORES E ANÁLISE I� SÍLICO.............................46

6 CONCLUSÃO..................................................................................................................52

7 PERSPECTIVAS.............................................................................................................52

XIII

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................53

1

1. I�TRODUÇÃO 1.1 DANOS AO DNA

O genoma está sob constante ataque de fatores exógenos (radiação ultravioleta ou

ionizante, infecções virais, fumaça de cigarro e oxidantes) e endógenos (espécies reativas de

oxigênio, por exemplo). A maioria dos agentes ambientais nocivos exerce seus efeitos tóxicos

em seres humanos e em outros organismos através de modificações no material genético

destes indivíduos, porém o genoma de todos os organismos apresenta informações para

manutenção de sua integridade. Os danos causados por esses mutágenos ao DNA podem ser

observados na forma de rupturas de simples ou dupla fita, bases e grupamentos fosfatos

modificados e crosslinks entre fitas ou dentro da própria fita do ácido desoxirribonucléico

(Wood et al., 2005; Nordstrand et al., 2007; Tembe & Henderson, 2007; Scicchitano &

Mellon, 1997).

Naturalmente podem ocorrer quebras nas fitas de DNA durante os processos de

replicação, transcrição e reparo como resultado da atividade de endonucleases endógenas,

despurinações espontâneas, e vários outros mecanismos (Deagle et al., 2006). Quando essas

alterações permanecem no genoma, o processo de replicação pode ser bloqueado ou

impedido; ou se uma lesão se fixar gerando uma mutação, esta pode se acumular no genoma e

até mesmo levar à morte celular. Assim, o DNA está sendo continuamente reparado para

preservar a integridade genômica (Kiyohara & Yoshimasu, 2007; Scicchitano & Mellon,

1997).

Ao longo dos anos tem se verificado que as lesões ao DNA são um evento constante

nos organismos e também que estes apresentam diferentes vias para corrigir essas lesões,

estas vias são recrutadas dependendo da natureza do dano, do tecido em consideração, e do

potencial replicativo das células nesse tecido (Rao, 2007). Uma vez que muitos tipos de lesões

podem surgir – a partir de processos de oxidação, desaminação, despurinação e

despirimidação do DNA -, uma variedade de sistemas de reparo de DNA é requerida

(Huffman et al., 2005; Tubbs et al., 2007). Estas vias de reparo evoluíram tanto em

complexidade quanto em especificidade, a fim de assegurar a integridade genômica mediante

constantes ameaças endógenas e exógenas (Rao, 2007) As vias de reparo são cruciais para a

viabilidade celular, e pesquisas estão revelando um número cada vez maior de proteínas

envolvidas, tais como glicosilases, AP endonucleases, liases, dentre outras. Assim, estes

estudos permitem compreender um pouco melhor como ocorre o processeo de reparo de

DNA. A importância do reparo do DNA pode ser ilustrada pela deficiência de reparo em

2

algumas síndromes caracterizadas por instabilidades genômicas, que denotam na incidência

aumentada do câncer e por alterações metabólicas múltiplas (Christmann et al., 2003).

Segundo Nordstrand et al. (2007), foram identificadas seis vias para o reparo de DNA,

são elas: reparo por fotorreativação , reparo por excisão de base (BER), reparo por mal-

emparelhamento (MMR), reparo por excisão de nucleotídeo (NER), recombinação homóloga

(HR) e recombinação não homóloga do tipo end-joining (NHEJ). As vias de recombinação

homóloga (HR) e não-homóloga do tipo end-joinig (HNEJ) fazem parte do Reparo de quebra

de dupla-fita - DSBR - (Sancar et al., 2004; Nouspikel, 2007). A Figura 1 mostra alguns dos

tipos de lesões específicas que podem surgir no DNA simples fita ou dupla fita e a via que

pode atuar no reparo dessas.

VIAS DE REPARO DE D�A

Figura 1 – Diferentes vias de Reparo de D�A. Representação esquemática onde em a são representados os agentes comuns de danos ao DNA (parte superior); e na parte mediana alguns exemplos de lesões de DNA induzidas por estes agentes; e na parte inferior alguns dos mecanismos de reparo de DNA responsáveis pela remoção das lesões; em b são representados alguns efeitos dos danos ao DNA na progressão do ciclo celular. Na parte inferior são representadas as consequências das mutações surgidas. Abreviações: cis-Pt e MMC - cisplatina e mitomicina C, respectivamente; (6-4)FP e CPD - fotoproduto 6-4 e Ciclobutano Dímero de Pirimidina, respectivamente; BER e NER, Reparo por Excisão de Base e Nucleotídeo, respectivamente; RH, Recombinação Homóloga; EJ, end joining. (Adaptado de Hoeijmakers, 2001)

O reparo de DNA é bem mais estudado em animais e microorganismos, porém o

número de pesquisas sobre este processo em plantas vem aumentando nestes últimos anos

com a identificação de genes de diferentes vias de reparo homólogos a outros organismos,

como por exemplo, genes de reparo humanos (Hays, 2002).

3

1.2 LESÕES AO DNA DE PLANTAS

As plantas por serem organismos sésseis e fotossintetizantes estão continuamente

expostas à ação de agentes potencialmente mutagênicos, tais como a radiação solar

ultravioleta (UV), poluentes presentes no ar e no solo. Além disso, as plantas possuem uma

reserva de células germinativas, as quais entram em meiose tardiamente. Com isso, as

mutações ocorridas em células somáticas podem estar presentes em células gaméticas

(Roldán-Arjona et al., 2009; Bray & West, 2005).

As fontes de danos ao DNA são mais estudadas em sistemas animais, porém os poucos

estudos voltados à quantificação dessas lesões no DNA das plantas tem demonstrado que o

genoma vegetal pode ser lesado por agentes endógenos e exógenos, e que estes agentes

podem levar ao retardo no crescimento e desenvolvimento, destruição da membrana celular e

danos às proteínas fotossintéticas (Roldán-Arjona et al., 2009; Bray & West, 2005; Tuteja et

al., 2008). A produtividade das plantas é outro fator importante que é afetado por condições

de estresse biótico, como infecções por patógenos (fungos, bactérias, vírus e insetos), e

abiótico, como por exemplo, temperaturas extremas, íons tóxicos, variações na

disponibilidade de água (Mahajan & Tuteja, 2005; Bray & West, 2005).

Um das causas que mais contribuem para lesões de dupla fita de DNA é a produção de

Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), as quais são geradas pelo metabolismo celular

aeróbico e pela exposição à radiação ionizante, luz próxima do violeta ou compostos redox

ativos, e podem oxidar a maioria dos tipos de macromoléculas, incluindo lipídios, proteínas e

ácidos nucléicos (Roldán-Arjona et al., 2009). Nas células vegetais, as EROs são a causa

primária das quebras de simples fita, tanto através da destruição das unidades de desoxirribose

quanto por modificações covalentes das bases. O reparo de bases modificadas potencialmente

mutagênicas é mediado pelas vias de reparo por excisão. As EROs são produzidos

constantemente em células de plantas como resultados de processos celulares oxidativos que

normalmente ocorrem e apresentam um perigo intermitente à integridade e viabilidade celular

mesmo na ausência de estresses externos (Bray & West, 2005).

Segundo Tuteja et al. (2008), as informações disponíveis sobre as vias de reparo e seus

componentes são limitadas, porém o conhecimento sobre a regulação da expressão de genes

de reparo de DNA é essencial para entender as respostas das plantas aos efeitos citotóxicos e

mutagênicos de agentes danosos ao DNA, sejam eles endógenos ou ambientais. Os modelos

vegetais mais estudados são a Arabidopsis thaliana (dicotiledônea, 130 Mpb, n=5) e Oryza

sativa (arroz -monocotiledônea, 430 Mpb, n=12), nas quais já foram encontradas várias

proteínas de reparo de DNA que são similares às proteínas humanas. Dentre essas proteínas

4

destacam-se: AtXPB (Ribeiro et al., 1998), AtNTH1 e AtNTH2 (Roldán-Arjona et al., 2000),

AtARP, AtAPE1 e AtAPE2 (Babiychuk et al., 1994), AtOGG1 (Dany &Tissier, 2001;

Garcia-Ortiz et al., 2001) e AtPARP1 (Doucet-Chabeaud et al., 2001; Lepiniec et al., 1995),

entre outras.

As proteínas de reparo encontradas na via de reparo por excisão de base em plantas

serão discutidas posteriormente.

1.3 VIAS DE REPARO DE DNA

1.3.1 Fotorreativação

A fotorreativação é um mecanismo de reparo de lesões de DNA induzidas por luz UV,

realizado por fotoliases, as quais utilizam a energia da luz visível. Os dímeros de pirimidina

ciclobutano (DPC) e os fotoprodutos (6-4) no DNA, potencialmente bloqueiam tanto a

replicação quanto a transcrição do DNA, e apresentam estruturas de dímeros de timinas que

são diretamente clivados pelas DPC liases ou (6-4) fotoliase (Friedberg, 2008; Kimura &

Sakaguchi, 2006; Nordstrand et al., 2007). Em Arabidopsis thaliana foram encontradas DPC

fotoliases a partir de experimentos com mutantes sensíveis a UV (Waterworth et al., 2002).

Em arroz, uma DPC fotoliase foi isolada por Hirouchi et al. 2003.

1.3.2 Reparo por mau emparelhamento (MMR)

O reparo por mau emparelhamento corrige maus emparelhamentos na fita de DNA,

gerados principalmente durante o processo de replicação (Kunkel & Erie, 2005). Isso inclui

mau emparelhamento base-base, bem como pequenos mau emparelhamentos de deleção e

adição. Uma característica particular da via de reparo MMR é que a excisão do mau

emparelhamento é acoplado à síntese de uma longa cadeia de DNA, acima de 1000 bases

(Nordstrand, et al., 2007). O reparo por mau emparelhamento restaura o emparelhamento

errôneo formado pela incorporação de uma base incorreta pela DNA polimerase ou durante a

recombinação. A cadeia molde de DNA, que contém a sequência correta, é metilada e pode

ser distinguida da não metilada (a fita recém sintetizada). Em E.coli, MutS e MutL

reconhecem o mau emparelhamento, e MutH introduz uma lacuna na fita nova não metilada.

Uma exonuclease remove a cadeia recém formada, a DNA polimerase preenche a lacuna e a

DNA ligase religa o DNA (Kimura e Sakaguchi, 2006).

Kimura e Sakaguchi (2006) relatam estudos mostrando que os genes MSH, que são

homólogos de MutS de E. coli, foram isolados de plantas, a maioria de Arabidopsis. Mus1 e

5

Mus2 , homólogos de MutS, foram isolados de Zea mays. Já MLH1, um homólogo de MutL,

também foi encontrado em Arabidopsis.

1.3.3 Reparo por excisão de nucleotídeo (NER)

O Reparo por Excisão de Nucleotídeo é usado primariamente para remover lesões do

DNA, tal como crosslinks entre as fitas ou na fita de DNA, lesões de distorção na hélice que

interferem com o pareamento de bases, geralmente obstruindo os processos normais de

replicação e transcrição. A via de reparo NER é uma via tão complexa quanto a via BER, pois

remove uma maior variedade de lesões no DNA, e utiliza um grande número proteínas (em

torno de trinta proteínas) que são evolucionariamente conservadas entre os eucariotas (De

Boer & Hoeijmakers, 2000). A via NER pode ser subdividida em duas: reparo global do

genoma (GGR) e o reparo acoplado à transcrição (TCR). Como é sugerido por seus nomes, as

sub-vias agem em formas diferentes de DNA: DNA que não é transcrito (ou as fitas não-

transcritas de genes expresso), e DNA ativamente transcrito, respectivamente. Tanto em GGR

como em TCR o reconhecimento dos danos ao DNA corresponde à primeira etapa que ocorre,

seguido da abertura da dupla-fita do DNA. Em GGR, a lesão no DNA é reconhecida por

XPC/Rad23 (xeroderma pigmentosum, grupo de complementação C/Rad23) ou UV-DDB

(proteína de ligação ao DNA lesado por UV). Em contraste, durante a TCR, o reconhecimento

da lesão se dá por CSA (Síndrome de Cockayne, tipo A) ou CSB (Síndrome de Cockayne,

tipo B) (Kimura e Sakaguchi, 2006).

Após a etapa de reconhecimento, as incisões são realizadas em uma das extremidades

das bases modificadas, e em um total de 25-30 nucleotídeos em um ou outro lado são

removidos como uma única fita. A lacuna gerada então é preenchida pela enzima DNA

polimerase δ/ϵ e selada pela enzima DNA ligase I (Gill &Fast, 2007; Kiyohara &Yoshimasu,

2007; Nordstrand et al., 2007).

Em plantas, a via de NER vem sendo estudada através de estudos com Arabidopsis.

Vários genes foram isolados através de experimentos com mutantes sensíveis a UV ou outros

mutágenos, tais quais XPF (AtRad1), XPG (AtRad2), XPD (AtRad3), XPB (AtRad52), dentre

outros (Fidantsef et al., 2000; Kunz et al., 2005; Liu et al., 2001; Costa et al., 2001, Ribeiro et

al., 1998).

6

1.3.4 Reparo de Quebra de Dupla-fita (DSB)

Efeitos externos, como a radiação ionizante e substâncias químicas, e fatores internos,

como os erros durante a replicação, podem induzir quebras na dupla-fita do DNA (DSBs).

Dentro das células, o DNA enfrenta nucleases e produtos metabólicos, tais como espécies

reativas de oxigênio. Estes produtos químicos introduzem alterações no DNA, incluindo bases

e açúcares modificados, adutos DNA-proteína, sítios livre de base e lesões em tandem. Do

exterior, a radiação ionizante (RI) e a luz ultravioleta (UV) alteram a composição química da

do esqueleto de DNA (Pardo et al., 2009). O Reparo por Quebra de Dupla-fita é formado

quando duas ou mais rupturas que ocorrem em fitas opostas do DNA em 10-20 pb em cada

um (Constantinou et al., 2001).

As quebras de dupla-fita são danos muito graves que podem comprometer a

sobrevivência do organismo. Estas lesões são rapidamente reparadas nas células por um dos

tipos de mecanismos existentes, Recombinação Homóloga (HR) ou Recombinação não-

homóloga do tipo end-joining (NHEJ) (Kimura & Sakaguchi, 2006).

1.3.4.1Recombinação homóloga

O reparo de DSBs pela recombinação homóloga (HR) corresponde a uma troca ou

transferência de sequências idênticas ou quase idênticas entre a molécula de DNA que

apresenta a DSB e outra molécula de DNA intacta. A HR é um mecanismo fiel se o molde de

DNA usado para o reparo é idêntico à sequência original de DNA presente na quebra de

dupla-fita. Do contrário, o reparo pela HR pode levar a mutações locais ou a rearranjos

deletérios no genoma (Pardo et al., 2009). Deste modo, a recombinação genética é um

processo no qual a informação na forma de seqüência nucleotídica é trocada ou transferida

entre cromossomos. Na recombinação homóloga a troca de material se dá entre seqüências

altamente relacionadas, e desempenha um papel importante ou essencial nos ciclos celulares

mitóticos e meióticos. Mecanismos desconhecidos reprimem a HR na fase G1 do ciclo celular

durante o qual a recombinação não homóloga do tipo end-joining é o modo predileto de

reparo de Quebras de dupla-fita (DSBs) (Holloman et al., 2008).

O papel da recombinação homóloga durante a prófase da primeira divisão meiótica é

muito importante. Na prófase, a HR contribui com fidelidade na segregação dos homólogos e

na geração de diversidade genética entre os produtos meióticos (Heyer et al., 2006). Segundo

Heyer et al (2006) a HR pode ser dividida em três estágios: a) uma lacuna na dupla-fita é

gerada devido a uma ação enzimática específica ou a um estresse genotóxico; b) a lacuna

7

gerada estabelece uma conexão física com um molde duplex homólogo, levando a formação

de um DNA heteroduplex, c) a molécula de dupla-fita lesada vai sendo reparada, tendo-se ao

final do processo duas moléculas intactas, a molécula molde e a que foi reparada.

Segundo Gill e Fast (2007), o reparo por recombinação homóloga é a principal forma

de reparo de quebra de dupla-fita em levedura. Em plantas as informações sobre mecanismos

de DSBs são advindas de estudos com Arabidopsis, cujos genes AtRAD51, AtRAD50 e

AtMRE11, envolvidos na via de recombinação homóloga, foram isolados e analizados. Todos

esses genes citados revelaram que quando mutados introduzem nas plantas um fenótipo de

sensibilidade à radiação ionizante, mostrando que os mesmos desempenham um papel crucial

no reparo de quebra de dupla-fita (Kimura & Sakaguchi, 2006).

1.3.4.2 Recombinação não homóloga do tipo end-joining (NHEJ)

O Reparo por recombinação Não Homóloga tipo End-Joining é a principal via de

reparo que corrige lesões em DNA de quebra na dupla fita (DSB) na maioria das células

eucarióticas. A via de reparo NHEJ consiste em juntar as extremidades quebradas de volta,

sem considerar a fidelidade absoluta da seqüência do DNA, não há presença de um molde de

DNA homólogo (Hays, 2002; Bray & West, 2005). Homólogos de várias proteínas envolvidas

no NHEJ foram identificados em procariotas recentemente, porém a função desta via em

bactéria ainda não está totalmente esclarecida, porém compreende-se que o NHEJ estaria

envolvido em funções fisiológicas importantes em algumas bactérias. Tais funções poderiam

incluir formas especializadas do reparo do genoma sob as circunstâncias que conduzem à

acumulação de DSBs, ou podem promover a diversidade genética (Bowater & Doherty,

2006). Foram isolados de plantas os genes AtKU70, AtKU80, Arabidopsis D�A ligase IV e

AtXRCC4, os quais atuam na via de NHEJ.

1.3.5 Reparo por excisão de base (BER)

Em células de mamíferos, a via BER é o principal mecanismo celular para corrigir

danos como: nucleotídeos danificados, sítios abásicos e às rupturas das fitas-simples geradas

pelas espécies reativas de oxigênio, agentes alquilantes e radiações ionizantes, desta forma

impedindo os efeitos mutagênicos e citotóxicos gerados por esses danos (Chan et al., 2006).

Quando comparada com outras vias de reparo de DNA, como o reparo por excisão de

nucleotídeo, o sistema de reparo por excisão de bases também é bem conservado desde

bactérias a humanos, considerando os componentes centrais da maquinaria de BER (Hitomi et

al., 2007).

8

As proteínas da via BER reconhecem, excisam e substituem bases danificadas do

DNA, principalmente aquelas que derivam da degradação oxidativa e hidrólise endógena de

DNA. Na Figura 2 é representada esquematicamente esta via de multiproteínas que se inicia

por meio da ação das DNA glicosilases específicas para cada tipo de dano, estas reconhecem

a lesão e clivam a ligação N-glicosil que conecta a base alterada ao esqueleto de açúcar-

fosfato, criando assim no local um sítio apurínico ou apirimídico, conhecido com sítio abásico

ou sítio AP. Neste local é inserida uma nova base (pela ação de uma DNA Polimerase,

principalmente Pol ß) e conseqüente é realizada a ligação desta à estrutura do DNA pela DNA

ligase. De uma forma particular, esta via reconhece e repara modificações de base como

uracil, 8-hidroxiguanina, metilação e oxidação, bem como sítios abásicos e quebras de

simples fita de DNA (Gill &Fast, 2007; Wood et al., 2005; Nordstrand et al., 2007; Wilson &

Bohr, 2007).

A via BER é definida como um reparo de DNA iniciado por uma glicosilase específica

para cada tipo de lesão no DNA e pode ser subdividida em duas vias: a via curta de BER e a

via longa (Figura 2). A via curta é responsável pela remoção e correção de um único

nucleotídeo, e a via longa é responsável pela remoção e correção de dois a treze nucleotídeos.

Deste modo, o reparo BER por meio da via curta é iniciado por uma glicosilase

monofuncional e envolve a remoção da base lesada e então ocorre hidrólise do sítio AP (sítio

abásico) por uma AP endonuclease, catalisando a incisão da fita lesada, levando a formação

de uma extremidade 3’OH e uma 5’ fosfato-desoxirribose (Figura 2). Então, uma DNA

polimerase β (pol β) hidroliza a fração 5’dRP e preenche a lacuna nucleotídica gerada,

preparando assim a fita para a ligação das extremidades pela DNA ligase I ou pelo complexo

DNA ligase IIIα e XRCC1. A via longa de BER (Figura 2) é iniciada de uma forma muito

similar a via curta, porém, além de um número maior de nucleotídeos retirados, ocorre

também o envolvimento de outras enzimas. Na via longa, a síntese de DNA pode ser

catalisada pela Pol β, δ ou ε, tendo uma variedade de outras proteínas atuando para finalizar

o processo como: Fen1, PARP1 e DNA ligase 1 (Sattler et al., 2003; Almeida & Sobol,

2007).

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Figura 2. Reparo por excisão de base (BER). Representação esquemática da via BER e as diferentes proteínas atuando. As DNA glicosilases iniciam este processo pela remoção da base lesada através da clivagem da cadeia de açúcar-fosfato e excisão do resíduo abásico contendo oligonucleotídeos, seguido da síntese de DNA e ligação. Há duas subvias para BER. A via curta de BER dependente de DNA polimerase β, enquanto que a via longa de BER dependente de DNA polimerase δ/β. As proteínas entre parênteses não são encontradas em plantas, já as proteínas marcadas por asteriscos estão presentes em várias cópias. Adaptada de Kimura & Sakaguchi (2006).

Segundo Kimura & Sakaguchi (2006), no Projeto Genoma do Arroz foram

identificados vários genes homólogos à maioria dos genes de reparo envolvidas nas diferentes

vias, como NER e BER, por exemplo. Dentre esses agrupamentos gênicos identificados tem-

se TagI, MutM, AlkA, Ogg1, MutY, AP endonucleases e PARP1. Agnez-Lima et al. (2001),

utilizando sequências de proteínas de BER de bactérias, levedura, humana e genes de

Arabidopsis obtidas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), identificou clusters

homólogos para a maioria das proteínas de BER (UNG, AtMMH1, OGG1, NTH, ARP,

Via longa de BER

Via curta de BER

Oxidação ou desaminação de base do DNA

Sítio AP

DNA glicosilase

(Atividade dRP liase de Pol β)

(DNA polimerase β) DNA polimerase

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MAG2 e MAG3) no banco de dados do SUCEST (FAPESP). Além disso, foi observado que

essas proteínas apresentavam um alto grau de conservação.

1.3.5.1 AP ENDONUCLEASES

As enzimas de reparo AP endonucleases são enzimas-chave no mecanismo de reparo

de DNA, sendo responsáveis pelo reconhecimento do sítio AP e clivagem do esqueleto

fosfodiéster da molécula de dupla-fita, preparando assim a fita de DNA para subseqüente

síntese do reparo e ligação, este processo tem sido observado desde bactérias até o homem

(Kerins et al., 2003).

Com base nos seus mecanismos de atuação, duas classes de AP endonucleases foram

descritas em E.coli. As enzimas AP endonucleases da classe I, como a endonuclease III e

VIII, correspondem a AP liases que clivam a fita de DNA na extremidade 3’ do sítio AP. A

clivagem do sítio AP por esse mecanismo resulta numa extremidade 3´-OH/ 5´-fosfato. Além

disso, essas enzimas da classe I também apresentam atividade de DNA glicosilase que atua na

remoção de lesões resultantes de estresse oxidativo, como a timina-glicol. As AP

endonucleases da classe II, como a endonuclease IV e a exonuclease III em E. coli, clivam a

extremidade 5’ da fita de DNA no sítio AP de forma hidrolítica. A clivagem por esses

mecanismos produzem extremidades 3’OH e 5’desoxirribose fosfato. Essa classe de AP

endonucleases é específica para sítios AP e não possui atividade de DNA glicosilase. A classe

II de AP endonucleases é dividida em duas famílias com base na sua necessidade de Mg2+.

Em geral, a maior atividade nas células é das AP endonucleases de classe II, que iniciam o

reparo pela incisão do DNA imediatamente à extremidade 5’ do sítio AP (Demple et al.,

1997; Haltiwanger et al., 2000; Wong et al., 2003; Zharkov, 2008).

Kaneda et al. (2006) propôs que as AP endonucleases reconhecem o espaço produzido

pela deleção da base do ácido nucléico, e isso se deve a presença de um resíduo de triptofano

que foi reconhecido na enzima Exonuclease III. As proteínas tipo endonucleases III (beta

liases) apresentam o motivo Cys-Xaa6-Cys-Xaa2-Cys-Xaa5-Cys (conservado em vários

organismos) e este é responsável pela ligação a um grupamento ferro/enxofre ([4Fe-4S]2+), o

qual apresenta atividade redox. Este domínio metálico é comumente encontrado em proteínas

transferidoras de elétrons. Na enzima EndoIII, observou-se que o cluster [4Fe-4S]2+ é

resistente à oxidação ou redução, sugerindo um papel mais estrutural do que relacionado à

transferência de elétrons (David & Williams, 1998).

Além disso, há também um motivo hélice-grampo-hélice que tem se mostrado um sítio

de ligação livre para glicol-timina, não demonstrando, porém, uma especificidade de

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substrato. Esse motivo foi primeiro descoberto em EndoIII. Tanto o motivo hélice-grampo-

hélice quanto o cluster ferro/enxofre parecem interagir com a base lesada. (Aspinwall et al.,

1997; Ikeda et al., 1998). Endo IV e ExoIII são as principais AP endonucleases de E. coli.

Sob condições fisiológicas normais, ExoIII compreende aproximadamente 90% do total de

atividade celular de AP endonuclease, porém em períodos de estresse oxidativo EndoIV é

sintetizada em níveis comparados aos de ExoIII. Este fato parece estar relacionado a um

mecanismo de resposta que visa prevenir efeitos deletérios de concentrações elevadas de

ânions superóxidos (Wilson III & Barsky, 2001).

As células humanas codificam dois homólogos (hsApe1 e hsApe2) da ExoIII de

E.coli, e Arabidopsis codifica três homólogos (AtAPE1L, AtAPE2, AtARP), mas em plantas

não foi encontrado nenhum homólogo a EndoIV (Hays, 2002; Murphy et al., 2009). Ref/HAP

(também conhecida por APE1/Ref-1, HAP1 ou APE1), a qual foi primeiro identificada em

mamíferos, é uma proteína que age na regulação transcricional da expressão gênica,

contribuindo para a manutenção da estabilidade genômica. Ela funciona como um fator redox

que mantém fatores de transcrição (como, Fos-Jun, NF-Κb, p53 e outros) em um estado

reduzido. O estado redox dos resíduos de cisteína pode, por exemplo, influenciar nas

propriedades das proteínas, bem como estabilidade protéica, atividade de chaperona, atividade

enzimática e estrutura protéica. Além disso, atua na via de BER, sendo a principal

endonuclease apurínica/apirimídica (Ando et al., 2008; Tell et al., 2009; Wong et. al., 2003;

Bhakat et al.,2009; Jeon & Irani, 2009; Yuk et al., 2009). A proteína AtArp foi identificada

por Babiychuk e colaboradores (1994) em Arabidopsis a partir de experimentos com a

proteínas Ref/HAP.

No banco de dados do projeto SUCEST (Sugarcane Espressed Tag Project), Agnez-

Lima e colaboradores (2001) identificaram dois cDNAs de cana-de-açúcar homólogos a

AtARP de A. thaliana denominados de scARP1 e scARP3, os quais são alvo do nosso

trabalho.

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