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Caracterización química de las toxinas
y efectos en la salud humana de las cianobacterias
Profa.Sandra M. F. O.Azevedo
IBCCF - UFRJ
Registros da ocorrência de florações de
cianobactérias
Relatos da observação de florações na Europa há
pelo menos 1000 anos
Geraldus Cambresis (1188 ) descreveu o lago Llangorse (Wales) como:
“the lake has many miracolous properties ....it sometimes turns
bright green, and in our days it has been known to become scarlet,
not all over, but as if blood were flowing along certains currentes
and eddies”.....
Há também relatos que indicam o conhecimento
tradicional da toxicidade de florações entre povos
primitivos da América do Norte, África e Austrália.
(Cood et al., 2005)
2 08:30
Primeiros relatos “técnicos” de mortes de
animais pela ingestão de cianobactérias
Local Cianobactérias Animais mortos Referencia
Jutland –
Dinamarca – 4
lagos
Não identificada Bovinos e peixes Hald
(1833)
Australia –
Lago
Alexandria
Nodularia
spumigena
Ovelhas, bovinos,
cavalos, porcos e
cães
Francis
(1878)
Pomerania
(Polonia) –
lago Barlewice
Microcystis
aeruginosa,
Anabaena flos-
aquae,
“limnochlide flos-
aquae”(Aphanizo
menon flos-aquae)
Potros, patos,
galinhas, porcos e
peixes
Benecke
(1884)
3 08:30
Toxicologia - Primeira metade do Sec. XX
Trabalhos confirmando efeitos tóxicos em animais domésticos:
Ex.: The effect on livestock of water contaminated with freshwater algae
(Graham,G.W., J.Am.Vet.Med.Assoc.1925,20:780-784)
Outros relatos na Argentina, África do Sul, Canadá, etc
Trabalhos relatando reações alérgicas na população exposta à
florações
Ex: Symptons of hay fever caused by algae. (Heise, H.A., J. Allergy
1949, 20:383)
Trabalhos pioneiros confirmando efeitos tóxicos de florações,
através de bioensaios
Development of toxicity in Blue-Green Algae (Grant,G.A. and Hughes,
E.O., Canadian J. Public Health 1953, 44: 334-339)
4 08:30
5
Estudos ecológicos
Estudos toxicológicos
Separação entre Ecologia and Toxicologia
DIFERENTES CEPAS DE ESPÉCIES DE
CIANOBACTÉRIAS
Substancias tóxicas
diversas
CIANOTOXINAS
Neurotoxinas
Hepatotoxinas
Citotoxinas
Endotoxinas - LPS
6 08:30
Cianotoxinas: Década de 1980
Neurotoxinas
Anatoxina-a
Anatoxina-a(s)
Saxitoxinas
Hepatotoxinas
Microcistinas
Nodularina
Cilindrospermopsina
7 08:30
Compound Chemistry Source LD50
µg kg-1
BW
botulin A (s.c.) protein soil bacteria (Chlostridium
sp.)
0.004 ciguatoxin 1 polyether marin dinoflagellates 0.25
batrachotoxin steroid
alkaloid
tropical frogs (Phyllobates
sp.)
2 saxitoxin alkaloid cyanobacteria 8
tetrodotoxin alkaloid puffer fish (symb. bacteria) 8 anatoxin-A(s) alkaloid cyanobacteria 40
microcystin-LR peptide cyanobacteria 50 amanitine peptide mushroom (Amanita
phalloides.)
100 anatoxin-A alkaloid cyanobacteria 250 aconitine terpenoid
alkaloid
monkshood (Aconitum sp.) 270 microcystin-RR peptide cyanobacteria 600
strychnine alkaloid Strychnos nux-vomica 980 phalloidine peptide mushroom (Amanita
phalloides)
2,000 cylindrospermopsin
psin
alkaloid cyanobacteria 2,100 rotenone alkaloid Lonchocarpus (fabaceae) 2,650
domoic acid amino acid diatom (Pseudonitzschia
sp.)
3,600 digitoxin steroid
glycoside
foxglove (Digitalis sp.) 3,900 ouabain steroid
glycoside
tropical plants 11,000 atropine alkaloid solanaceae 30,000
Toxicidade de algumas moléculas naturais
Toxicidade relativa à aplicação i.p. em camundongos;
Compilado do website da National Library of Medicine
8 08:30
B
D
Estruturas Química das Neurotoxinas
(A) anatoxina-a, (B) homoanatoxina-a, (C) anatoxina-a(s)
e (D) estrutura geral das saxitoxinas
A
D C
B
9 08:30
Saxitoxinas
R1
R2
R3
Carbamatos
R4: CONH2
N-Sulfocarbamoil
R4: CONHSO3-
Decarbamoil
R4: H
H H H STX GTX5 dcSTX
OH H H NeoSTX GTX6 dcneoSTX
OH H OSO3- GTX1 C3 dcGTX1
H H OSO3- GTX2 C1 dcGTX2
H OSO3- H GTX3 C2 dcGTX3
OH OSO3- H GTX4 C4 dcGTX4
Saxitoxinas
Bloqueio reversível
dos canais de sódio
Rapidamente
excretada pela urina
(t1/2 90 min.)
11 08:30
(A) microcistinas, (B) nodularinas, (C) cilindrospermopsina
Estrutura Química das Hepatotoxinas
12 08:30
Cilindrospermopsina
Citotoxina: danos no fígado, rins, trato gastrointestinal, sistemas endócrino, imunológico e vascular, músculos;
Dois mecanismos possíveis de intoxicação:
1. Via rápida: LD50 24h 2.100,00 g/Kg ;
2. Via lenta: (5-6 dias) LD50 200 g/Kg
Este efeito é interpretado como a ação da toxina na inibição da síntese protéica, a qual parece ser irreversível.
NOAEL = 30 g/Kg/dia - para consumo oral
(camundongos machos)
TDI = 1 g/L, baseado em estudos de
carcinogenicidade
Microcistinas
Carmichael, 1994. Scientific American, 270:78-86
Cianotoxinas mais frequentemente encontradas
Heptapeptídeos cíclicos – mais de 90 variantes
14 08:30
compound source IARC class
GV µg L
-1
LD50
mg kg-1
BW
endrin pesticide n.carc. 0.6 1.4 carbofuran pesticide n.carc. 7 2
Microcystin-LR peptide 2B 1a 5
pentachlorophe
nol
wood
preservative
2B 9a 36
aldrin/dieldrin pesticide 3 0.03 44 chlorpyrifos pesticide n.carc. 30 60 acrylamide indust. chemical 2A 0.5 107
DDT pesticide 2B 1 135 chlordane pesticide 2B 0.2 145
arsenic metal 1 10 145 atrazine pesticide 3 2 850
simazine (rat) pesticide 3 2 971 metolachlor pesticide n.carc. 10 1150
cadmium (rat) metal 2A 3 2330 dioxan indust. chemical 2B 50 5300
Toxicidade oral para camundongos de compostos listados no
“WHO Guidelines for Drinking Water Quality”
a: GV provisório; dados de toxicidade compilados dosis.nlm.nih.gov/chemical.html;
1: carcinogênico; 2A: provavelmente carc.; 2B: possivelmente carc.; 3 não
classificável; n.carc.: não carcinogênico.
Microfilamentos em
hepatócitos normais
Microfilamentos em
hepatócitos após
exposição à microcistinas
Mecanismos de ação de microcistinas
Inibidores potentes
de Proteinas
Fosfatases da família
serina/treonina – PP1
e PP2A
Carmichael, 1994. Scientific American, 270:78-86
DL 50 (ip) – 50 a
1200µg/Kg de peso
16 08:30
Mecanismos de ação de microcistinas
ADDA se liga
ao sítio ativo
das PPs
Mdha se liga covalentemente ao
residuo de cisteína 273 das PPs
Gupta et al., (1997)
Cavidade
C-terminal Cavidade
ácida
Cavidade
hidrofóbica
Cavidade
C-terminal Cavidade
ácida
Cavidade
hidrofóbica
17 08:30
Efeitos agudos em humanos
Casos de problemas gastrointestinais e hepáticos relacionados com microcistinas em mananciais de abastecimento público
1931 – USA – Rios Ohio e Potomac – 5000-8000 pessoas afetadas durante uma floração de Microcystis
1981 – Australia – Armindale – enzimas hepáticas elevadas numa população abastecida por um reservatório que apresentava uma floração tóxica de Microcystis (Falconer et al.,1983)
1988 – Brasil – Itaparica – 2000 pessoas foram afetadas e 88 faleceram durante um período de 42 dias de floração de Microcystis e Anabaena no reservatório (Teixeira et al., 1993)
1994 – Suécia – 121 casos de problemas gastrointestinais relacionados com Microcystis na água potável (Annadotter et al., 2001).
18 08:30
Relações da cadeia trófica e saúde
Courtesy H. Pearl 19 08:30
Exposição Humana a Cianotoxinas
Diferentes vias: exposição
Oral
Água potável
Alimento
(bioacumulação)
Atividades
recreacionais
Atividades
recreacionais
Atividades
profissionais
Intravenosa Hemodialise
Parenteral
Inalação
20 08:30
Caruaru – fevereiro de 1996
117 de 136 pacientes (86%) dialisados
passaram a apresentar os seguintes
sintomas :
Dor de cabeça, distúrbios visuais,
náusea e vômito.
Hepatomegalia
60 mortes ocorridas até outubro 1996
puderam ser atribuídas a uma mesma
síndrome
21 08:30
O que ocorreu:
22 08:30
O que ocorreu:
Sistema de purificação de
água da clínica
Sala de hemodiálise
23 08:30
Concentrações de Microcistina e Cilindrospermopsina no carvão
ativado, resinas de troca iônica e areia das clínicas A e B
Clínica/tipo de amostra
Microcistina
(µg/g)
Cilindrospermopsina
(µg/g)
Clínica A – carvão
1.0
19.70
Clínica A – resina
aniôanica
0.5
0.02
Clínica A – resina
catiônica
2.1
0.05
Clínica A – areia
ND
ND
Clínica B – carvão
3.4
ND
Clínica B - areia
ND
ND
ND = não detectado
24 08:30
Espectro por HPLC/PDA a partir de extrato de
amostra de fígado de paciente renal crônico
Carmichael et al (2001)) 25 08:30
Análises histopatológicas
Azevedo et al.(2002) 26 08:30
27 08:30
Descrição de espécies de cianobactérias presentes no
reservatório de Tabocas – amostras fitoplanctônicas de março
a maio de 1996
•Presença de várias espécies picoplanctônicas
•Descrição de espécie nova – Romeria caruaru
28 08:30
29 08:30
Avanços no conhecimento sobre toxicologia de
microcistinas em vertebrados
Após pelo menos 4 décadas de estudos:
Fígado não é o único órgão afetado. Há dados consistentes sobre
efeitos no coração, gônadas, cérebro, rins, pulmão e intestino.
Os efeitos decorrentes da exposição a doses subletais (única ou
crônica) estão relacionados também com estresse oxidativo e/ou
resposta inflamatória.
A via detoxicação parece ser preferencialmente pela ação de GSH e a
biotransformação de microcistinas pode se dar por ligação direta com
GSH ou pela ação da glutationa S-transferase – excreção pelas fezes e
urina.
Processo de excreção lento, pois microcistinas podem permanecer na
circulação sanguínea por pelo menos 2 meses após uma única
exposição (dados em peixes, camundongos, ratos e humanos)
30 08:30
Entrada
Dano ao fígado
Liberação de ALT
Liberação de LDH
Entrada
Dano ao fígado
Liberação de ALT
Liberação de LDH
Ativação: fosfolipase A2 e
cicloxigenase
Produção: mediadores
inflamatórios,
TNF-α e IL-1
Respostas à Microcistinas ao nível celular
31 08:30
Leucócitos isolados de voluntários saudáveis e pacientes renais
crônicos, incubados por 24 horas com 10µg/L de microcistinas-
LR, mostraram que essa dose pode induzir mudanças na função
dessas células, especialmente relacionadas com a formação de
espécies reativas de oxigênio (ROS)
32 08:30
Novembro de 2001:
Água da rede de abastecimento do Rio de Janeiro apresentou forte
cheiro de geosmina
Análise do fitoplâncton no manancial : dominância Anabaena e
Microcystis.
Análises Microcistinas:
Água da rede – 0,4 g MCYST/L
Setor de diálise do HUCCF-UFRJ – água pós-carvão ativado: 0,3 g
MCYST/L (3/12/01) – monitoramento subsequente (Dez. a Fev) –
nenhum resultado positivo
Análises de MCYSTs no soro de 12 pacientes durante 2 meses. 08:30 33
MCYSTs detectadas por ELISA no soro de pacientes
renais crônicos
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1/dez 11/dez 21/dez 31/dez 10/jan 20/jan 30/jan
Dias de hemodiálise
Co
nce
ntr
açã
o d
e M
CY
ST
s (
ng
/mL
) P3
P4
P6
P8
P13
P14
P21
P24
P27
P31
P34
P38
0,00
0,20
0,40
0,60
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Dias de hemodiálise
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P38
34 08:30
Concentração de MCYST em fígado, pulmão e soro
sem
ana
1
sem
ana
3
sem
ana
5
sem
ana
7
0.0
200.0
400.0
600.0
800.0
ng
de M
CY
ST
/g d
e t
ecid
o
a
Concentração de MCYST (ng de MCYST/g de tecido) de ratos injetados via
ip com 55g/kg. n=5. p<0,001 (dados não publicados)
sem
ana
1
sem
ana
3
sem
ana
5
sem
ana
7
0.0
5.0
10.0
15.0
ng
de M
CY
ST
/g d
e t
ecid
o
semana 1
semana 3
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
ng d
e M
CY
ST/
mL
Fígado Pulmão
Soro
35 08:30
Efeitos de Microcistinas no Pulmão
36 08:30
Efeito de Microcistinas no parênquina pulmonar
10
0
m
B
10
0
m
A
10
0
m
E
10
0
m
F
10
0
m
D
10
0
m
C
100 m
B
100
m
A
100 m
E
100 m
F
100 m
D
100 m
C
10
0
m
B
1
0
0
m
A
10
0
m
E
10
0
m
F
10
0
m
D
10
0
m
C
10
0
m
B
1
0
0
m
A
10
0
m
E
10
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m
F
10
0
m
D
10
0
m
C
100
m
B
100
m
A
100
m
E
100
m
F
100
m
D
100
m
C
Fotomicrografias do parênquima pulmonar (200x). A, grupo
controle; B, C, D, E, F, camundongos sacrificados após 2, 8, 24,
48 e 96 horas, após injeção ip de MCYST-LR (40µg/Kg).
37 08:30
38 08:30
Impactos das Cianotoxinas na Biota Aquática e
para a saúde humana
Efeito indireto
Efeito direto
Bioacumulação
Ingestão de células e/ou cianotoxinas
diretamente da água
Consumo de outros organismos que
já tenham acumulado cianotoxinas
39 08:30
Florações de
cianobactérias em
lagoas costeiras:
Jornal O Globo 23/09/2004
Jornal O Globo 30/08/2001 40 08:30
Ago Sep Sep Oct Oct Nov Nov
0
20
40
60
se
sto
n p
oin
t 1
; liv
er
an
d v
isc
era
l o
rga
ns
0
100
200
300 se
sto
n p
oin
t 3 a
nd
mu
sc
le
Seston point 1 (µg.L-1) Seston point 3 (µg.L-1) Liver (µg.g-1)
Visceral organs (µg.g-1) Muscle (µg.Kg-1)
Concentração de microcistinas no seston e em
peixes da Lagoa de Jacarepaguá - 1998
Magalhães et al (2001) 41 08:30
Dec Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov
/98 /99
0
0,5
1
1,5
2
Estimated daily intake Tolerable Daily Intake (TDI = 0.04µg.Kg-1.day-1)
Magalhães et al (2001)
Estimativa da ingestão diária de microcistinas
Magalhães et al (2001) 42 08:30
*calculados para pessoas de 70 kg usando 0.04 µg kg-1 PC d-1 e
um consumo de 150 g peso fresco.
**dados compilados de Ibelings & Chorus, Environ. Poll. (2007)
Microcistinas em organismos aquáticos
consumíveis como alimento humano**
Organism MC µg g-1
TDI
factor* Reference
Pejerrey 0.05 - 0.34 2.7 - 18.2 Cazenave et al. 2005
Carp 0.038 2.0 Li et al. 2004
Tilapia 0.002 - 0.337 0.1 - 18.1 Magalhaes et al. 2001
Unidentified crab 0.103 5.5 Magalhaes et al. 2003
Red Swamp Crawfish 0.005 - 0.010 0.3 - 0.5 Chen & Xie, 2005a
Freshwater Shrimp 0.006 - 0.026 0.3 - 1.4 Chen & Xie, 2005a
Anodonta woodiania 0.009 - 0.026 0.5 - 1.4 Chen & Xie, 2005b
Hyriopsis cumingii 0.022 - 0.039 1.2 - 2.1 Chen & Xie, 2005b
Lamprotula leai 0.021 - 0.058 1.1 - 3.1 Chen & Xie, 2005b
43 08:30
Toxinas muito potentes e possivelmente carcinogênicas;
Potencialmente podem ocorrer em qualquer ecossistema
aquático;
Ocorrem geralmente em altas concentrações intracelulares,
mas podem estar bastante diluídas no ambiente;
Altamente variáveis quanto a estrutura química e
propriedades;
Produzidas naturalmente sendo dificilmente consideradas
pelas legislações;
Moléculas relativamente estáveis e, portanto, não facilmente
degradadas.
Após Várias Décadas de Pesquisa sobre Cianotoxinas...
O Que Falta Saber?
Efeitos da toxicidade crônica
Mecanismos de detoxicação
Mecanismos de excreção