Caracterização e estudos de expressão dos genes que codificam oxalato descarboxilase e formato...
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Caracterização e estudos de expressão dos genes que codificam oxalato
descarboxilase e formato desidrogenase dependente de NAD+ no fungo Crinipellis
perniciosa.
Aluno: Bruno Vaz de OliveiraOrientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães PereiraCo-orientadora: Johana Rinconez Pérez
Introdução
• Oxalato: composto intermediário do metabolismo de carboidratos
• Geralmente encontrado na forma de um sal de cálcio ou magnésio, visto que é um quelante de cátions bivalentes.
Na Vassoura-de-bruxa
• Ceita et al 2005– Plantas infectadas pelo fungo apresentaram,
inicialmente, um aumento no número de cristais de oxalato quando comparadas com plantas sadias;
– após cerca de 36 dias os cristais de oxalato apresentavam significativa redução e após 45 dias os cristais praticamente desapareceram.
– Tal consumo dos cristais de oxalato foi relacionado à produção de peróxido de hidrogênio, o qual se concentra ao redor destes cristais.
Na Vassoura-de-bruxa
• O oxalato poderia ser aproveitado pela planta para gerar EROs, as quais estariam envolvidas na sinalização intracelular que culminaria na morte celular programada da vassoura verde
• Cacaueiros resistentes à Vassoura-de-bruxa não apresentam a formação de cristais de oxalato, contrastando com a presença dos mesmos em plantas suscetíveis.
Na Vassoura-de-bruxa
Sclerotinia sclerotiorum
• Ascomiceto• Homotálico• Baixa especificidade de hospedeiro
– Soja– Feijão– Ervilha– Canola– Girassol– Tomate– Batata
www.potatodiseases.org
Oxalato durante o processo infeccioso: várias funções
Modelo de infecção por S. sclerotiorum
Sintomas
• Folhas murchas• Necrose• Podridão “úmida”• Micélio branco • Esclerótios
Pesq. agropec. bras., Brasília, v.34, n.6, p.1101-1106, jun. 1999
Voltando ao oxalato...
Fator de patogenicidade essencial
Fungos mutantes para a produção de oxalato incapazes de infectar hospedeiros
E se a planta fosse capaz de degradar o oxalato produzido pelo fungo???
Tomate e Tabaco Transgênicos
• Expressão de uma OXDC do fungo Flammulina velutipes em plantas de tomate e tabaco
Na Vassoura-de-bruxa
• Inspeção do genoma de Crinipellis perniciosa revelou a presença de um gene com similaridade a uma OXCD de Flammulinna velutipes
• Análise de ESTs obtidos a partir de bibliotecas cDNA acusou um alto nível de expressão de um gene com similaridade a uma formato desidrogenase dependente de NAD+
Objetivos
• Caracterização dos genes que codificam a oxalato descarboxilase (OXDC) e a formato desidrogenase dependente de NAD+ (FDH-NAD) – obtenção e análise de sua seqüência completa – análise de sua expressão em diferentes condições
de cultivo in vitro
Justificativa
• Evidências sugerindo o envolvimento do oxalato com a fitopatogenicidade por C. perniciosa
• Superexpressão do gene que codifica a formato desidrogenase dependente de NAD+ nas biliotecas do micélio crescido em extrato de cacau
• Ambas as vias estão de fato relacionadas?? • Possível desenvolvimento de cacau transgênico
resistente a C. perniciosa, expressando a oxalato descarboxilase.
Resultados - Sequenciamento
Resultados - Sequenciamento
Teste dos primers para os genes OXDC e FDH. 1) Ladder lamda; 2) Controle (primers para beta-actina); 3) Primers OXDC 1 e OXDC 3; 4) Primers OXDC1 e OXDC 4; 5) Primers FDH 1 e FDH 2; 6) Primers FDH 1 e FDH 4; 7) Primers FDH 2 e FDH 3; 8) Primers FDH 2 e FDH 4.
Resultados - Sequenciamento
Resultados - Sequenciamento
Resultados - Sequenciamento
Clones - OXDC
Clones - FDH
Resultados - Sequenciamento
Resultados - Sequenciamento
Resultados - Sequenciamento
PCR – Fragmentos da OXDC
Resultados - Sequenciamento
PCR – Fragmentos da FDH
• Purificação dos fragmentos• Reação de sequenciamento 3
tentativas sem sucesso• Clonagem no plasmídeo PGEM Teasy
e nova tentativa de sequenciamento • Seqüência a partir do cDNA
Resultados - Sequenciamento
Resultados
1. Meio Mínimo2. Oxalato 1 mM3. Oxalato 10 mM4. Formato 5 mM5. Formato 50
mM6. Formato 100
mM7. Metanol 0,5%8. Metanol 1 %9. Metanol 2%
Resultados
1) Meio mínimo; 2) oxalato 1 mM; 3) Indução com oxalato 50 mM por 2 horas; 4) formato 50 mM; 5) metanol 2%, 6) Peróxido 1 mM; 7) Extrato de cacau susceptível a C. perniciosa; 8) Extrato de cacau resistente a C. perniciosa;
Próximos passos
• Nova extração de RNA
• Hibridização do RNA com as sondas dos genes OXDC e FDH
• Sequenciamento a partir do plasmídeo PGEM Teasy
• Caracterização da oxaloacetase