Caracterização da Amplificação do Centrossomo em ... · cells, analyst A found 0–3 clusters...
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Carla Aparecida Pinheiro
Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em
Condrossarcomas
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo da Fundaccedilatildeo PIO XII ndashHospital de Cacircncer de Barretos para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede Aacuterea de Concentraccedilatildeo Oncologia Orientador Prof Dr Adhemar Longatto Filho Co-orientador Prof Dr Iberecirc Cauduro Soares
Barretos SP 2014
Este projeto foi elaborado e estaacute apresentado de acordo com as normas da Poacutes-Graduaccedilatildeo
do Hospital de Cacircncer de Barretos ndash Fundaccedilatildeo Pio XII baseando-se no Regimento do
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Oncologia e no Manual de Apresentaccedilatildeo de Dissertaccedilotildees e
Teses do Hospital de Cacircncer de Barretos Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordacircncia com o Coacutedigo de Boas Praacuteticas Cientiacuteficas (FAPESP)
natildeo havendo nada em seu conteuacutedo que possa ser considerado como plaacutegio fabricaccedilatildeo ou
falsificaccedilatildeo de dados As opiniotildees hipoacuteteses e conclusotildees ou recomendaccedilotildees expressas
neste material satildeo de responsabilidade dos autores e natildeo necessariamente refletem a visatildeo
da Fundaccedilatildeo Pio XII ndash Hospital de Cacircncer de Barretos
Embora o Nuacutecleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Cacircncer de Barretos tenha
realizado as anaacutelises estatiacutesticas e orientado sua interpretaccedilatildeo a descriccedilatildeo da metodologia
estatiacutestica a apresentaccedilatildeo dos resultados e suas conclusotildees satildeo de inteira responsabilidade
dos pesquisadores envolvido
IacuteNDICE
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma 1
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer 3
13 Cultura celular 6
2 JUSTIFICATIVA 8
3 OBJETIVOS
31 Objetivos Gerais 9
32 Objetivos Especiacuteficos 9
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 10
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias 11
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo 12
42 Tamanho da Amostra 14
43 Metodologia Estatiacutestica 14
44 Avaliaccedilatildeo dos Riscos Benefiacutecios 14
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias 15
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 15
52 Cultura de Fibroblastos Normais 18
53 Tecido crio-preservado 19
531 Dados Cliacutenicos 19
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31
533 Analise dos dados 43
6 DISCUSSAtildeO 46
7 CONCLUSAtildeO 49
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50
ANEXOS
Anexo 1 52
Anexo 2 53
Anexo 3 55
Anexo 4 56
RESUMO
Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014
INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O
tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia
nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor
ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica
envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos
centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e
hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo
do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de
pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma
MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a
anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes
operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos
histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de
10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo
utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de
imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de
fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da
amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram
obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi
coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente
do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram
grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de
15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das
ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada
amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de
ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B
encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas
ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters
jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se
apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-
preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e
em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram
as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias
todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a
formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-
histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
Este projeto foi elaborado e estaacute apresentado de acordo com as normas da Poacutes-Graduaccedilatildeo
do Hospital de Cacircncer de Barretos ndash Fundaccedilatildeo Pio XII baseando-se no Regimento do
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Oncologia e no Manual de Apresentaccedilatildeo de Dissertaccedilotildees e
Teses do Hospital de Cacircncer de Barretos Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordacircncia com o Coacutedigo de Boas Praacuteticas Cientiacuteficas (FAPESP)
natildeo havendo nada em seu conteuacutedo que possa ser considerado como plaacutegio fabricaccedilatildeo ou
falsificaccedilatildeo de dados As opiniotildees hipoacuteteses e conclusotildees ou recomendaccedilotildees expressas
neste material satildeo de responsabilidade dos autores e natildeo necessariamente refletem a visatildeo
da Fundaccedilatildeo Pio XII ndash Hospital de Cacircncer de Barretos
Embora o Nuacutecleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Cacircncer de Barretos tenha
realizado as anaacutelises estatiacutesticas e orientado sua interpretaccedilatildeo a descriccedilatildeo da metodologia
estatiacutestica a apresentaccedilatildeo dos resultados e suas conclusotildees satildeo de inteira responsabilidade
dos pesquisadores envolvido
IacuteNDICE
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma 1
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer 3
13 Cultura celular 6
2 JUSTIFICATIVA 8
3 OBJETIVOS
31 Objetivos Gerais 9
32 Objetivos Especiacuteficos 9
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 10
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias 11
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo 12
42 Tamanho da Amostra 14
43 Metodologia Estatiacutestica 14
44 Avaliaccedilatildeo dos Riscos Benefiacutecios 14
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias 15
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 15
52 Cultura de Fibroblastos Normais 18
53 Tecido crio-preservado 19
531 Dados Cliacutenicos 19
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31
533 Analise dos dados 43
6 DISCUSSAtildeO 46
7 CONCLUSAtildeO 49
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50
ANEXOS
Anexo 1 52
Anexo 2 53
Anexo 3 55
Anexo 4 56
RESUMO
Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014
INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O
tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia
nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor
ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica
envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos
centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e
hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo
do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de
pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma
MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a
anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes
operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos
histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de
10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo
utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de
imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de
fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da
amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram
obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi
coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente
do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram
grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de
15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das
ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada
amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de
ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B
encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas
ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters
jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se
apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-
preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e
em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram
as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias
todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a
formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-
histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
IacuteNDICE
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma 1
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer 3
13 Cultura celular 6
2 JUSTIFICATIVA 8
3 OBJETIVOS
31 Objetivos Gerais 9
32 Objetivos Especiacuteficos 9
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 10
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias 11
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo 12
42 Tamanho da Amostra 14
43 Metodologia Estatiacutestica 14
44 Avaliaccedilatildeo dos Riscos Benefiacutecios 14
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias 15
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 15
52 Cultura de Fibroblastos Normais 18
53 Tecido crio-preservado 19
531 Dados Cliacutenicos 19
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31
533 Analise dos dados 43
6 DISCUSSAtildeO 46
7 CONCLUSAtildeO 49
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50
ANEXOS
Anexo 1 52
Anexo 2 53
Anexo 3 55
Anexo 4 56
RESUMO
Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014
INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O
tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia
nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor
ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica
envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos
centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e
hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo
do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de
pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma
MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a
anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes
operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos
histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de
10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo
utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de
imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de
fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da
amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram
obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi
coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente
do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram
grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de
15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das
ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada
amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de
ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B
encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas
ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters
jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se
apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-
preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e
em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram
as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias
todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a
formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-
histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
53 Tecido crio-preservado 19
531 Dados Cliacutenicos 19
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31
533 Analise dos dados 43
6 DISCUSSAtildeO 46
7 CONCLUSAtildeO 49
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50
ANEXOS
Anexo 1 52
Anexo 2 53
Anexo 3 55
Anexo 4 56
RESUMO
Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014
INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O
tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia
nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor
ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica
envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos
centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e
hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo
do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de
pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma
MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a
anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes
operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos
histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de
10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo
utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de
imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de
fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da
amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram
obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi
coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente
do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram
grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de
15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das
ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada
amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de
ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B
encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas
ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters
jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se
apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-
preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e
em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram
as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias
todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a
formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-
histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
RESUMO
Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014
INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O
tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia
nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor
ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica
envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos
centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e
hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo
do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de
pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma
MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a
anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes
operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos
histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de
10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo
utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de
imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de
fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da
amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram
obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi
coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente
do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram
grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de
15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das
ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada
amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de
ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B
encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas
ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters
jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se
apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-
preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e
em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram
as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias
todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a
formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-
histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada
amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de
ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B
encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas
ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters
jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se
apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-
preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e
em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram
as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias
todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a
formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-
histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
ABSTRACT
Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation
(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014
INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the
mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because
chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic
background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One
possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an
error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of
centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and
hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for
generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently
centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of
patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in
cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND
METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at
the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically
classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The
patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal
antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the
negative control for the analysis of the centrosome amplification for the
immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS
Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case
was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome
The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary
cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification
of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers
analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the
percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
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11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these
cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found
values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was
found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all
samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue
and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary
cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters
in cryo-preserved tissues
KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de
carcinogecircnese (Chan 2011) 4
Figura 2
Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo
imunocitoquimica para anticorpo S100 12
Figura 3
Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas
Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase
Orange aumento de 10x 17
Figura 4
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um
cluster com quatro centrossomos 17
Figura 5
Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de
Imunofluorescecircncia 18
Figura 6
Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica
em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo
puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura
da cortical e halo de esclerose medular 27
Figura 7
Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise
puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade
de metaacutestase oacutessea 27
Figura 8
Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo
liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
Figura 9
Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia
ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo
expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica
poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
30
Figura 10
Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da
siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31
Figura 11
Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em
parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com
presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da
celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32
Figura 12
Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo
diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que
invade partes moles com limites indefinidos Este caso era
acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna
(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33
Figura 13
Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista
na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34
Figura 14
Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo
de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35
Figura 15
Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute
3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e
aumento de 200 vezes
Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a
uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X 39
Figura 17
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40
Figura 18
Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2
centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41
Figura 19
Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina
com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I
histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42
Figura 20
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a
protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina
A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X 43
Figura 21
Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
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51
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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que
6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
44
Figura 22
Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e
eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas
com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico
tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X 45
Figura 23
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento
de 1000 X 46
Figura 24
Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo
de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem
mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no
primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X 47
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
49
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas
primaacuterias de condrossarcomas)
16
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas
primaacuterias de condrossarcomas
16
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de
fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de
imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
18
Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-
preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica
20
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas analisados por dois
observadores independentes
31
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-
preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores
independentes
32
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
44
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster
menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
LISTA DE ABREVIATURAS
CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
degC Graus Celsius
Ca +2 Iacuteon caacutelcio
cm2 Centiacutemetros quadrados
CO2 Dioacutexido de carbono
CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular
DAB Diamino Benzidina
DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico
F Feminino
g Gramas
H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio
HE Hematoxilina e eosina
M Masculino
ml Mililitros
MMII Membros inferiores
MMSS Membros superiores
PAF para-formaldeiacutedo
PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)
PCM Material pericentriolar
QT Quimioterapia
RT Radioterapia
TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
LISTA DE SIacuteMBOLOS
ᵞ Gamma
microg Micrograma
Porcentagem
lt Menor
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma
O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e
de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes
estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de
suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]
O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida
Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro
mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]
Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no
tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute
de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]
Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e
metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do
tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente
em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor
[1]
Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de
recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em
contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a
recorrecircncia local eacute de 10 [4]
Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A
radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida
paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave
quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando
inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a
expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o
ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)
inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o
inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
2
este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento
quimioteraacutepico [7]
Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em
modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores
Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente
agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um
citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de
remodelamento oacutesseo [9]
O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do
gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2
pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]
O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da
localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da
malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta
metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos
casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]
A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que
pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10
anos de 20 a 40 [4 2 9]
O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de
diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a
amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como
estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves
terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
3
12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer
O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do
nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os
rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o
centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo
do fuso mitoacutetico [10]
O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e
a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle
apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo
frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante
a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e
morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente
dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o
agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos
moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute
comeccedilando a emergir [11]
A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do
centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente
agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e
contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]
Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para
a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos
Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo
de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A
presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois
centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do
fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de
sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o
desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
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DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
4
Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]
Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada
com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]
[14] [15]
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e
sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma
maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas
gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos
perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]
Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as
alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens
celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do
centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no
gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da
amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
5
dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos
foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]
Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores
gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos
tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo
do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor
[20]
Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles
analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As
amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees
malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo
encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos
centrossomos [17]
Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como
biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma
melhor estimativa do prognoacutestico [14]
O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA
genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo
cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo
estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a
ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do
centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor
tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou
regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral
que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53
causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo
centrossomo [21]
A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar
que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de
centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos
soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
6
A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a
instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim
este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica
em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de
condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes
para os pacientes com condrossarcomas
13 Cultura celular
A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um
meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas
que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um
experimento
Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-
fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do
fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a
partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o
campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se
mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo
explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas
de ceacutelulas dispersas
A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam
rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo
de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas
estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas
manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem
ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo
das ceacutelulas em cultura [26]
A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas
foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais
frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
7
denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas
isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]
As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais
Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito
mais alta em uma placa de cultura [27]
Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as
ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas
proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e
com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou
EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]
Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas
Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver
multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de
tecidos[26]
Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de
culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser
removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria
dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas
ou meses [26]
Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto
pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade
de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
8
2 JUSTIFICATIVA
A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como
uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral
Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo
baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos
extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica
diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do
centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa
maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese
O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre
tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio
eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau
histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau
histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos
Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e
radioterapia permanecem por serem elucidados
Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com
e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
9
3 OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-
preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de
Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em
cultura celular primaacuteria de condrossarcoma
31 Objetivos Especiacuteficos
Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012
Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de
tumor
Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012
Estabelecer as culturas primaacuterias
Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras
tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e
imuno-histoquiacutemica respectivamente
Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
10
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes
portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de
2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero
amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de
condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de
condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo
funcionou
Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de
Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)
Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados
em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente
classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz
parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e
pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)
Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma
metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido
crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital
de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado
Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que
a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado
Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo
com laudos de exames
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
11
411 Estabelecimento de culturas primaacuterias
Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute
embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado
eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute
macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura
25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro
Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com
1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em
Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um
periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e
confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos
frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o
processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido
Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com
anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (
ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com
paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)
(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno
DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e
montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram
analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de
Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
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51
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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
12
Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo
S100
412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo
Imuno-histoquiacutemica
Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido
crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga
positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4
(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)
Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio
na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No
segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo
lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente
(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo
realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-
peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO
EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo
lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em
seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt
Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
13
montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de
centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a
mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-
se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um
aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo
positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida
se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura [14]
Imunocitoquiacutemica
A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland
EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no
interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada
em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula
Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-
formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100
(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo
com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em
metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa
e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo
monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura
ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em
seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes
intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia
USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra
coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich
Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula
O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando
para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento
de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
14
qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos
casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas
conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de
imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo
estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]
42 Tamanho da Amostra
Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de
Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no
banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo
assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho
43 Metodologia Estatiacutestica
A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo
maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis
qualitativas
Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram
analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um
intervalo de confianccedila de 95
44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios
Riscos natildeo apresenta riscos
Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e
melhorar o tratamento do tumor
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
15
5 RESULTADOS
51 Culturas Primaacuterias
Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento
ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de
consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo
feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau
histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau
I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo
submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente
encaminhado material para cultura
512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de
imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma
amostra conforme dados da tabela 2
A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64
das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em
76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4
condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas
a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo
observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos
com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No
condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1
Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com
um cluster (tabela 2)
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
16
Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de
condrossarcomas)
Caso Sexo
idade Local do tumor
QT
RT Anatomopatoloacutegico
Recidiva
tumoral
1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III
siacutendrome de Ollier Sim
3 F50 Fecircmur distal
esquerdo NatildeoNatildeo
Encondroma
Condrossarcoma grau I Natildeo
4 M42 Ombro esquerdo e
regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo
QT quimioterapia
RT radioterapia
Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de
condrossarcomas
Caso Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal (2) Amplificado 1
Cluster
2
Clusters
3
Clusters
1 Condrossarcoma recidivado
Grau III 36 64 15 2 0
2 Condrossarcoma Recidivado ndash
Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1
3 Condrossarcoma ndash
Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0
4 Condrossarcoma ndash Grau III
(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0
Amostra de recidiva do caso 1
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
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Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
17
Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em
microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x
Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)
mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
18
Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia
52 Cultura de Fibroblastos Normais
Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059
SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo
tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados
satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de
fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica
Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais
(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica
Subtipo
Quanto agrave presenccedila de
centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()
Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0
Fibroblastos normais Controle
(teacutecnica com
Imunocitoquimica)
96 4 3 1 0
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
19
53 Tecido crio-preservado
531 Dados Cliacutenicos
Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram
encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-
histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos
descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para
anaacutelise do centrossomo
Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo
resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo
feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O
tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses
Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os
outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no
serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a
procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos
a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico
Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no
membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
20
Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo
da imuno-histoquiacutemica
ID Sexoidade Tempo de
seguimento Localizaccedilatildeo
tumoral Anatomopatoloacutegico
Tipo histoloacutegico
Diagnoacutestico anterior
Origem patoloacutegica
1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio
2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio
3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio
4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio
6 F46 3844 Cintura
escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio
7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio
8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio
9 F25 105 Cintura
escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio
10 M42 1774 Cintura
escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio
Continuaccedilatildeo da tabela 4
ID Cirurgia
anterior ao diagnoacutestico
Cirurgia anterior com recidiva local ou com
margens comprometidas ao diagnoacutestico
Metaacutestase Tipo de cirurgia
Estado funcional atual do membro
Uacuteltima informaccedilatildeo
1 NA NA Sim poacutes-
diagnoacutestico Ressecccedilatildeo
simples Com
limitaccedilatildeo Oacutebito por
Cacircncer
2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Natildeo se aplica
Vivo sem doenccedila
3 NA NA Sim ao
diagnoacutestico Natildeo
operado Ignorado
Oacutebito por Cacircncer
4 Sim Sim Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila
8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +
Proacutetese Com
limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila
9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo
simples Funcional
Vivo sem doenccedila
10 Sim NA Sim ao
diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado
Vivo com doenccedila
ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
21
Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de
lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram
grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi
encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia
informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos
Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples
ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados
a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs
pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi
realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso
submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do
paciente que natildeo foi operado
Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram
funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que
natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax
A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o
diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi
pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e
apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal
Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de
Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os
outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital
O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos
com doenccedila
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
22
Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica
direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico
inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular
Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita
pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
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11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
23
A
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
24
Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e
halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia
B
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
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4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
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7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
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9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
25
Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com
saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise
puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
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5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
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13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
26
Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e
ramos puacutebicos
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
27
Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com
hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com
aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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51
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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
28
Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo
meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos
Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu
uma transformaccedilatildeo maligna
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
29
Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia
figura anterior com circulaccedilatildeo colateral
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
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9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
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Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
30
Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto
vegetante em diaacutefise de uacutemero
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
31
532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo
A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes
de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em
todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com
hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em
microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes
Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram
cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem
de ceacutelulas acometidas
Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do
centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou
690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo
No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A
encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi
revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram
considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo
Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas analisados por dois observadores independentes
Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo
Caso Analista A Analista B
1 1800 2200
2 2100 2000
3 1390 690
4 930 930
5 1900 2000
6 1700 1300
7 1000 1000
8 1600 1300
9 1400 1100
10 400 1000
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
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6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
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11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
32
Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters
por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters
em meacutedia 1 cluster (tabela 6)
Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de
condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes
Nuacutemero de clusters de centrossomos
Caso Analista A Analista B
1 0 0
2 3 6
3 1 1
4 0 0
5 1 1
6 2 1
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 1 1
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
33
Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes
binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma
lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
34
Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I
histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico
aumento de 200X
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
35
Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
36
Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com
marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
37
Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas
ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de
microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
38
Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3
centrossomos Aumento de 1000 X
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
39
Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica
com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster
menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
40
Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)
mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada
vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio
oacuteptico aumento de 200X
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
41
Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos
(seta preta) Aumento de 1000 X
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
42
Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-
histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos
A
B
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
43
A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2
centrossomos Aumento de 1000 X
533 Analise dos dados
Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95
de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente
de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e
representados pela figura 25
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de
concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo
de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura
26)
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
44
Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas
Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213
Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
45
Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters
Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila
Tamanho da amostra 10
Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500
Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
46
6 DISCUSSAtildeO
Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias
alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha
anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor
da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para
este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute
multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais
envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de
culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os
resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e
difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de
condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas
primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com
classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia
condrossarcoma
Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a
teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos
centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados
foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos
normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e
64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado
que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na
transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente
revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra
condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais
do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo
mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a
amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado
em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
47
ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma
[71213]
As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que
variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura
primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura
primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo
A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de
Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na
organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm
sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste
estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de
clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais
demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto
tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias
foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso
remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar
os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos
uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados
foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos
os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters
foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com
clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular
seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os
clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular
Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em
metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem
natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]
Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As
dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido
foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
48
nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas
para a amplificaccedilatildeo do centrossomo
A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro
achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade
cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]
Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do
centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente
representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares
instabilidade cromossocircmica e aneuploidia
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
49
7 CONCLUSAtildeO
A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do
condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado
A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo
agraves amostras de tecido crio-preservado
As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade
dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
50
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion
2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91
3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393
4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858
5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376
6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011
7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596
8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011
9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835
10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112
11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98
12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144
13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455
14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930
15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190
16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99
17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
52
ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
55
Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
51
18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109
19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560
20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366
21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011
22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J
Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of
Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins
DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM
THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555
28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246
29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15
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ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
53
Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
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25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
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Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
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ANEXOS
Anexo1
FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________
Nuacutemero de ceacutelulas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado
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Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
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25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
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Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
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Anexo2
FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma
1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento
DDMMAAAA 4
5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado
5
6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA
6
7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil
1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado
8
9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado
9
10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental
completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior
completo 99- Ignorado
10
11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
11
12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
12
13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
13
14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-
Ignorado
14
15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica
5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica
15
16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA
16
17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA
17
18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-
Ignorado
18
19 Quimioterapia
0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
19
20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
20
21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado
21
22 Data de recidiva
DDMMAAAA
22
23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado
23
24 Tipo Histoloacutegico
1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado
24
54
25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
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Anexo 3
56
Anexo 4
57
58
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25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado
25
26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado
26
27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-
Ignorado
27
28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila
3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado
28
29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA
29
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Anexo 3
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Anexo 4
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