Caracterização

5º Semestre - Licenciatura em Bioquímica

Bioquímica Analítica Professora Alice S. Pereira

Protocolo 1

Caracterização Bioquímica da Ferritina de Baço Equino

Discentes:

Lídia Cavaca Nº 39745

Mariana Campaniço Nº 40138

Rita Manguinhas Nº 40082

Bioquímica Analítica Caracterização Bioquímica da Ferritina de Baço Equino

2 | P á g i n a

Índice 1. Resumo .................................................................................................................................. 3

2. Fundamentos Teóricos .......................................................................................................... 3

2.1. Ferritina ......................................................................................................................... 3

2.2. Métodos Utilizados ....................................................................................................... 3

3. Protocolo Experimental ......................................................................................................... 5

4. Resultados e Discussão ......................................................................................................... 5

4.1. Espectro de UV/Visível da Ferritina de baço ................................................................. 5

4.2. Determinação da concentração da Ferritina ................................................................ 5

4.2.1. Método de Lowry .................................................................................................. 5

4.2.2. Método de Bradford.............................................................................................. 6

4.3. Análise da ferritina por SDS-Page .................................................................................. 7

4.4. Determinação do conteúdo em ferro não-hémico ....................................................... 8

4.4.1. Determinação do ferro pelo método da 1,10-fenantrolina ...................................... 8

4.4.2. Determinação do conteúdo total em ferro por ICP-AES ........................................... 9

4.5. Análise da Ferritina por PAGE ....................................................................................... 9

4.6. Detecção de ferro não-hémico em gel de poliacrilamida em condições nativas ......... 9

4.7. Determinação da massa molecular total da ferritina por cromatografia de exclusão

molecular................................................................................................................................. 10

5. Conclusões........................................................................................................................... 11

6. Bibliografia .......................................................................................................................... 13


3 | P á g i n a

1. Resumo

Pretendeu-se caracterizar bioquimicamente a ferritina de baço equino, utilizando

vários métodos e ferramentas como: métodos colorimétricos (método de Lowry, método de

Bradford e método da 1,10-fenantrolina), espectroscopia de UV/visível, electroforeses em

condições desnaturantes e em condições nativas, cromatografia de exclusão molecular e

espectrometria de emissão atómica por plasma acoplado indutivamente (ICP-AES).

Obtiveram-se como resultados principais a concentração de ferritina (1,55mg/mL),

considerando-se a concentração pelo método de Bradford a mais próxima da realidade; a

massa molecular da ferritina (451,27kDa) que se aproxima do valor real de 450kDa; massa

molecular das subunidades da ferritina (17,14kDa); número de átomos de ferro por molécula

de ferritina (aproximadamente 715 átomos).

2. Fundamentos Teóricos

2.1. Ferritina

Ferritina é uma proteína de grandes dimensões com uma camada exterior

(apoferritina) com 450kDa e um núcleo de óxido férrico hidratado [Fe(III)O.OH]. Dentro da

ferritina conseguem existir até 4500 átomos de ferro juntamente com quantidades variáveis

de fosfato. A camada exterior da ferritina é composta por 24 subunidades (tendo cada uma

20kDa) e estas estão em contacto com o ferro no seu interior em vários locais formando assim

a interfase Ferro-Proteína. [1]

A ferritina usada nesta actividade experimental foi a ferritina de cavalo. Esta ferritina é

usada muitas vezes como standard devido a mais de 90% das suas subunidades serem

idênticas.

A função comum a todas as ferritinas é o armazenamento de ferro na sua forma

solúvel. As funções mais específicas das ferritinas podem ser agrupadas em: armazenamento

de ferro para outras células (ferritinas de células especializadas); armazenamento de ferro

para uso intracelular (housekeeping ferritina); armazenamento de ferro para desintoxição

(ferritina stress housekeeping). Nas células especializadas de armazenamento de ferro os níveis

de ferritina vão depender do propósito do reservatório (ex: hepatócitos – armazenamento a

longo prazo) enquanto para a ferritina de housekeeping, a sua quantidade de ferro já vai

depender dos níveis da sua utilização. [1-2]

2.2. Métodos Utilizados

Em bioquímica são cada vez mais utilizados métodos colorimétricos para quantificação

de proteínas, acoplados a espetrofotometria de UV/visível. O método de Lowry e o método de

Bradford são exemplo destes processos.

No primeiro, dá-se a oxidação das ligações peptídicas por iões cobre II (CuSO4.5H2O),

sob condições alcalinas (NaOH), produzindo Cu+ (teste de Biuret). Por sua vez, Cu+ reage com o

reagente Folin-Ciocalteau (mistura de ácido fosfotúngstico e ácido fosfomolíbdico). Este último

é reduzido por resíduos aromáticos, presentes em tirosinas e triptofanos, oxidando-os. Estas


4 | P á g i n a

reações resultam no aparecimento de uma cor azul forte, que depende do conteúdo em

resíduos aromáticos. O reagente Folin-Ciocalteau reduzido tem um máximo de absorção a

750nm. Assim, a concentração total de proteína é dada em função da quantidade de resíduos

de triptofano e tirosina. [3,4]

No segundo, dá-se a ligação entre o corante Coomassie Blue G250 e as proteínas, mais

propriamente a resíduos de arginina e lisina, mas também a histidinas e resíduos aromáticos

de triptofanos, tirosinas e fenilalaninas, numa extensão menor. [5] O corante pode estar na sua

forma catiónica, caso se apresente em condições acídicas, ou na sua forma aniónica, caso

esteja sob condições alcalinas. Dependendo das condições de pH, o corante vai absorver a

comprimentos de onda diferentes. A forma aniónica é a que se liga a proteínas e possui um

máximo de absorção a 595nm, permitindo a sua quantificação. [6]

O método de Bradford é mais simples, rápido e sensível que o método de Lowry. O

método de Lowry é mais suscetível a interferências por reagentes e amostras não proteicas

que podem interagir com os iões cobre II ou com o reagente Folin-Ciocalteau. Contudo, o

método de Bradford também apresenta algumas desvantagens como a variação de

absortividade específica para diferentes proteínas devido à baixa solubilidade ou baixo peso

molecular, e ainda por resultados que nem sempre são reproduzíveis devido à variação do

grau de pureza do azul de Coomassie G250. [7]

Para a caracterização bioquímica de proteínas, a quantificação não é suficiente. É

necessário caracterizar a estrutura da proteína e estimar ou calcular a sua massa molecular.

Um dos métodos utilizados é a eletroforese, que se baseia na mobilidade

electroforética de moléculas carregadas sob o efeito de um campo elétrico. Esta permite

estimar aproximadamente o peso molecular de proteínas, dado que estas vão migrar de

acordo com o seu tamanho, forma e peso. Quanto mais pequenas, mais rapidamente migram

através dos poros do gel utilizado, que no caso de proteínas, é o polímero poliacrilamida.

A eletroforese pode ser feita em condições desnaturantes (SDS-PAGE), onde é utilizado

o detergente Dodecil sulfato de sódio, que carrega negativamente as proteínas e também as

desnatura, fazendo com que estas percam a sua estrutura nativa e assumam uma forma

similar entre elas. Isto permite ver, por exemplo, se uma proteína tem uma ou mais

subunidades e se estas são semelhantes ou não. [8]

Mas também se pode efetuar uma eletroforese em condições não desnaturantes,

preservando a estrutura nativa da proteína, permitindo estimar o seu peso molecular total, ou

compará-las com outras proteínas.

O método que permite calcular, com alguma precisão, a massa molecular de proteínas

é a cromatografia de exclusão molecular, que se baseia na separação de proteínas de acordo

com o seu tamanho. Proteínas maiores são eluídas em primeiro lugar, enquanto que proteínas

mais pequenas ficam presas nos poros da resina e demoram mais tempo a sair da coluna. Para

refinar qualquer um dos métodos cromatográficos existentes, usa-se HPLC (high-performance

liquid chromatography) que possui bombas de alta pressão, permitindo um processo mais

rápido e limitar o problema da difusão lateral da amostra, melhorando a resolução. [8]

Outro método colorimétrico é utilizado para determinação da quantidade de iões

metálicos, nomeadamente o ferro - método da 1,10-fenantrolina. O método baseia-se na

utilização de cloreto de hidroxilamina como agente redutor, normalmente a 10%. Dá-se,

portanto a redução rápida de ferro férrico (Fe3+) a ferro ferroso (Fe2+). A 1,10-fenantrolina

forma um complexo laranja-vermelho com o ferro ferroso (Fe2+), cuja intensidade de cor é


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independente do pH, desde que este se encontre dentro dos limites 2-9. Este método

apresenta diversas vantagens em relação a outros com o mesmo propósito, porque a

intensidade da cor do complexo formado com o ferro ferroso é relativamente forte, apresenta

poucas interferências com outras substâncias, o complexo produzido é muito estável e

consegue ser observado mesmo passado muito tempo e é feito em meio ácido, o que não leva

à formação de precipitados. [9]

3. Protocolo Experimental

Foi seguido o protocolo fornecido pelo docente.

4. Resultados e Discussão

Nota: as linhas das tabelas assinaladas a vermelho correspondem aos valores desprezados

para obtenção das rectas.

4.1. Espectro de UV/Visível da Ferritina de baço

Figura 1 - Espectro UV-Vísivel da Ferritina em dH2O

O pico presente neste espectro vai ser a absorção de cadeias laterais dos aminoácidos

aromáticos da Ferritina.

Não se pode retirar informações deste espectro (utilização directa da lei de Lambert-

Beer) visto que a banda vai ser alargada devido ao ferro que se encontra dentro da Ferritina,

não se conseguindo observar um ponto definido de absorção.

4.2. Determinação da concentração da Ferritina

4.2.1. Método de Lowry

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

0,160

0,180

0,200

250,0 350,0 450,0 550,0 650,0

Ab

s

λ (nm)


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y = 0,0085x + 0,0571 R² = 0,9843

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Ab

s

BSA (µg)

y = 0,0487x + 0,4932 R² = 0,9713

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0,00 5,00 10,00 15,00

Ab

s

BSA (µg)

Tabela 1 - Recta de calibração para o método de Lowry.

BSA (µg) Abs

0,0 0,067

17,2 0,186

34,4 0,293

51,6 0,471

68,8 0,641

86,0 0,745

0,0 0,182

17,2 0,166

34,4 0,397

51,6 0,531

68,8 0,675

86,0 0,761

Após obtenção da recta de calibração substituiram-se os valores de absorvância obtidos para

as amostras de Ferritina. As concentrações obtidas foram as seguintes:

Amostra A: 2,41 mg/ml (Abs=0,262);

Amostra B: 2,38 mg/ml (Abs=0,380).

4.2.2. Método de Bradford

Tabela 2 - Recta de calibração para o método de Bradford

BSA (µg) Abs

0,00 0,412

2,15 0,651

4,30 0,738

6,45 0,802

8,60 0,959

10,75 1,070

12,90 1,115

15,05 1,100

0,00 0,451

2,15 0,615

4,30 0,704

6,45 0,804

8,60 0,949

10,75 1,046

12,90 1,101

15,05 1,161

Figura 2 - Recta de Calibração do Método de Lowry a 750nm

Figura 3 - Recta de Calibração do Método de Bradford em dH2O a 595nm


7 | P á g i n a

y = -1,119x + 2,2662 R² = 0,9907

1,100

1,200

1,300

1,400

1,500

1,600

1,700

1,800

1,900

2,000

2,100

0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Log

MM

Rf

Após obtenção da recta de calibração substituiram-se os valores de absorvância obtidos para

as amostras de Ferritina. As concentrações obtidas foram as seguintes:

Amostra A: 1,39 mg/ml (Abs=0,697);

Amostra B: 1,70 mg/ml (Abs=0,908).

4.3. Análise da ferritina por SDS-Page

Tabela 3 - Recta de Calibração para a electroforese em SDS-Page

Rf MM (kDa) Log kDa

0,18 245 2,39

0,20 180 2,26

0,23 135 2,13

0,28 100 2,00

0,33 75 1,88

0,41 63 1,80

0,51 48 1,68

0,63 35 1,54

0,78 25 1,40

0,84 20 1,30

0,96 17 1,23

1,01 11 1,04

Foi realizada uma electroforese SDS-PAGE (fig.5)

onde se pode verificar apenas uma única banda

correspondente à ferritina, embora se saiba que a

ferritina é constituída por dois grupos de várias

subunidades. Tendo em conta que as subunidades têm

uma massa molecular bastante próxima (cadeias L –

19kDa e cadeias H – 21kDa), pode afirmar-se que esta

electroforese não tem a resolução necessária para se

poder ver duas bandas correspondendo a subunidades

diferentes. A solução seria o aumento da percentagem

em poliacrilamida.

No entanto, após aferição com a recta de

calibração, foi possível estimar que a banda

correspondente à ferritina vai ter uma massa molecular

por volta dos 17,14KDa (Rf=0,92).

Também se pode verificar que existe um arrastamento/degradação ao longo do gel, tal

como uma pequena banda de elevado peso molecular, junto ao poço. Com estes dois factores

confere-se que a solução tinha presente alguns contaminantes.

Figura 5 - Electroforese em SDS-Page do P1

Figura 4 - Recta de Calibração para a electroforese em SDS-Page


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y = 3E+06x - 0,0036 R² = 0,9881

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

0,00E+00 1,00E-07 2,00E-07 3,00E-07 4,00E-07

Ab

s

Quantidade de Ferro (mol)

4.4. Determinação do conteúdo em ferro não-hémico

4.4.1. Determinação do ferro pelo método da 1,10-fenantrolina

Tabela 4 - Recta de Calibração para o método da Fenantrolina

Quantidade de Ferro (mol)

Abs

0,00E+00 0,015

3,58E-08 0,097

7,16E-08 0,180

1,43E-07 0,392

1,79E-07 0,411

2,15E-07 0,573

2,69E-07 0,746

3,58E-07 0,932

0,00E+00 0,007

3,58E-08 0,094

7,16E-08 0,148

1,43E-07 0,410

1,79E-07 0,236

2,15E-07 0,614

2,69E-07 0,784

3,58E-07 0,869

A partir da recta de calibração foi possível calcular as seguintes quantidades em ferro:

Amostra A: 1,18E-7 mol (Abs=0,359) – [Ferro] = 0,0024mmol/ml;

Amostra B: 2,59E-7 mol (Abs=0,780) – [Ferro] = 0,0026mmol/ml;

Amostra C: 3,52E-7 mol (Abs=1,059) – [Ferro] = 0,0024mmol/ml.

Recorreu-se ao método da 1,10-fenantrolina (fig.6) para determinação da quantidade

de ferro em ferritina e, posteriormente, calcular o número de átomos de ferro por molécula de

ferritina.

Para efeitos de cálculos, utilizou-se o valor de ferro padrão (0,05mg/mL) e a média dos

valores de concentração de ferritina (1,549897mg/mL) pelo método de Bradford (depois

dividido por 1000 e, por fim, dividido pela massa molecular da ferritina - 3,44x10-06). Optou-se

por usar os valores obtidos pelo método de Bradford, uma vez que este é muito mais sensível

e menos susceptível de interferências que o método de Lowry. Desta forma, os dois valores

obtidos por este último método foram excluídos, também por apresentarem um erro superior

a 25% em relação ao valor mais baixo do método de Bradford.

De seguida, calcularam-se as médias das absorvâncias das amostras feitas em

triplicado para A, B e C. Cada média foi substituída na recta y=3E06x-0,0036, obtendo-se os

valores do número de moles de ferro (mol), que depois foram convertidos em mmol. Ao

mesmo tempo, descobriu-se a quantidade de ferritina, multiplicando-se o volume (μL)

utilizado em cada amostra pela concentração de ferritina (3,44x10-06).

Figura 6 - Recta de Calibração para o método da Fenantrolina em dH2O a 510nm


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Por fim, multiplicaram-se ambas as quantidades pelo número de Avogadro (6,022x1023

mol−1), tendo especial atenção às unidades, obtendo-se o número de átomos de ferro e o

número de moléculas de ferritina.

Finalmente, foi possível calcular a razão N Fe/N Ferritina, descobrindo-se a média do

número de átomos de ferro por molécula de ferritina (aproximadamente 715 átomos). Este

valor encontra-se bastante afastado do valor teórico, 4500 átomos, com um erro de 84,11%.

4.4.2. Determinação do conteúdo total em ferro por ICP-AES

Segundo o relatório do laboratório de análises Requimte, os valores obtidos foram os

seguintes: Tabela 5 - Resultados das análises do laboratório Requinte

4.5. Análise da Ferritina por PAGE

Com a electroforese que foi corada com solução

corante de Coomassie (fig.7) podem ver-se três bandas

(três proteínas), mas apenas a última corresponde à

ferritina. Assim, comprovam-se os factos observados no

SDS PAGE, de que a nossa amostra continha impurezas.

4.6. Detecção de ferro não-hémico em gel de poliacrilamida em

condições nativas

A electroforese corada com uma solução de

ferricianeto de potássio (fig.8), foi utilizada para a

detecção de ferro não hémico. Nesta electroforese é

possível ver duas bandas com alguns compostos retidos

nos poços. A segunda banda corresponde ao ferro

dentro da ferritina. A outra banda irá corresponder a

outra proteína contendo ferro não hémico, que é uma

impureza.

Figura 7 - Electroforese em condições nativas da amostra de Ferritina

Figura 8 - Electroforese em condições nativas para detecção de ferro não-hémico


10 | P á g i n a

4.7. Determinação da massa molecular total da ferritina por

cromatografia de exclusão molecular

Figura 9 - Cromatograma das proteínas padrão

Figura 10 - Cromatograma do Azul Dextrano e da Ferritna

Tabela 6 - Recta de calibração para a cromatografia de filtração em gel

Molécula Ve (mL)

Pico máx. Ve/Vo Log (MM)

1º Azul Dextrano 31,08 1 3,30

2º Ferritina 38,16 1,23 2,64

3º Catalase 43,41 1,40 2,38

4º BSA 51,91 1,67 1,82

5º Citocromo c 66,16 2,13 1,09

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00

mA

u

Volume de Eluição (ml)

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00

mA

u

Volume de Eluição (ml)


11 | P á g i n a

Figura 11 - Recta de calibração para a cromatografia de filtração em gel

O cromatograma padrão (fig.9) apresenta cinco bandas correspondentes às moléculas

que foram separadas por ordem decrescente de massa molecular. De acordo com os limites de

exclusão da resina Superdex 200 [10]: para dextranos os limites são entre 1-100kDa; para

proteínas os limites são entre 10- 600kDa, nota-se que o Azul Dextrano é a única molécula que

ultrapassa os limites de exclusão. Desta forma, é o primeiro a ser eluído e o seu volume de

eluição corresponde ao volume morto (Vo).

Este cromatograma foi utilizado para construir a recta padrão (fig. 11) que permitiu

calcular a massa molecular da ferritina. O Azul Dextrano não é uma proteína, por isso, não é

contabilizado na recta padrão. O seu volume de eluição é apenas para fazer um acerto nos

volumes de eluição dos outros componentes da mistura.

O cromatograma da Ferritina (fig. 10) é utilizado para retirar o volume a que esta foi

eluída, neste caso, o pico máximo da segunda banda. A primeira banda, mais uma vez,

pertence ao Azul Dextrano, cujo volume de eluição terá o mesmo efeito de acerto do volume

de eluição da ferritina.

Posteriormente, apenas foi necessário substituir o valor acertado do volume da

ferritina na recta padrão e calcular a sua massa molecular de 451,27KDa (Ve/Vo=1,22). Este

valor aproxima-se bastante do da literatura, sendo este de 450KDa. Assim, estes resultados

foram obtidos com um erro experimental de 0,28%.

O cromatograma padrão não apresenta uma boa resolução ao nível das primeiras três

bandas. Isto pode dever-se ao facto de estas moléculas apresentarem massas moleculares

relativamente próximas, pelo que a diferença entre tempos de eluição não é suficiente para

que sejam separadas totalmente.

5. Conclusões

O objetivo do trabalho, isto é, a caracterização bioquímica da ferritina de baço equino,

foi maioritariamente alcançado. No entanto, alguns dos métodos utilizados, nomeadamente, a

espectroscopia de UV/visível e a espectrometria de emissão atómica por plasma acoplado

indutivamente (ICP-AES), não apresentaram resultados plausíveis ou possíveis de analisar.

y = -1,7451x + 4,7864 R² = 0,9974

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

2,8

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2

Log

(MM

)

Ve/Vo


12 | P á g i n a

Contudo, todos os outros métodos foram analisados, obtendo-se informações

importantes para caracterização desta proteína. O processo mais eficiente foi o da

cromatografia por filtração em gel onde se obteve um erro muito reduzido (0,28%).

Quanto à ferrita, segundo os métodos utilizados, concluiu-se que esta tem várias

subunidades com uma massa molecular de 17,14KDa, que na sua totalidade tem uma massa

molecular de 451,27KDa e que a concentração utilizada foi de 1,55mg/mL.

Em relação ao ferro conseguiu-se concluir que este está presente na ferritina na forma

não hémica e que a sua concentração foi de 2,46E-3mmol/ml, sendo a proporção de 715

átomos de Fe por 1 molécula de Ferritina.


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6. Bibliografia

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homeostasis and novel dietary strategies”; Biol. Res. 39 (1): 167-171

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[10] http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s6782?lang=pt&region=PT

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