FUNDAÇÃO COMUNITÁRIA TRICORDIANA DE EDUCAÇÃO Decretos Estaduais n.º 9.843/66 e n.º 16.719/74 e Parecer CEE/MG n.º 99/93

UNIVERSIDADE VALE DO RIO VERDE DE TRÊS CORAÇÕES Decreto Estadual n.º 40.229, de 29/12/1998

Pró-Reitoria de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão

CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS,

MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE

VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS

‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN VITRO

Três Corações 2006

GUILHERME ARAÚJO LACERDA

CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS,

MOLECULARES E MORFOLÓGICAS DE

VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS

‘PRATA-ANÃ’ CULTIVADAS IN VITRO

Dissertação apresentada à Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR como parte das exigências do Programa de Mestrado em Biotecnologia, área de concentração Biotecnologia Vegetal e Ambiental, para obtenção do título de mestre. Orientador: Prof. Dr. Luciano Vilela Paiva Co-orientador: Prof. Dr. Juscélio Clemente de Abreu

Três Corações 2006

634.772

L131c Lacerda, Guilherme Araújo

Características citogenéticas, moleculares e morfológicas de variantes somaclonais de

bananeiras ‘prata-anã’ cultivadas in vitro /

Guilherme Araújo Lacerda; orientação de Luciano

Vilela Paiva -- Três Corações : Universidade

Vale do Rio Verde de Três Corações, 2006. 62 p.

Dissertação apresentada ao curso de Mestrado

em Biotecnologia, para obtenção do título de

Mestre.

1. Banana - cultivo. 2. Banana prata-anã. 3.

Estômato. I. Lacerda, Guilherme Araújo, orient.

II. Abreu, Juscélio Clemente de, Co-orient.

III. Título.

Claudete de Oliveira Luiz CRB - 6 / 2176

“A felicidade se define como atividade de alma que age conforme a virtude, a visão do bem individual e social”

Aristóteles

AGRADECIMENTOS

À Deus, fonte de tudo, ao digníssimo Padre Libério, santo homem do Pai, que mesmo sem

conhecer, sempre agiu positivamente em minha vida.

À Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR, pela colaboração na execução do projeto, e

aos professores e funcionários da mesma que direta ou indiretamente auxiliaram.

À Multiplanta Tecnologia Vegetal, pelo fornecimento do material biológico.

Ao meu orientador professor Dr. Luciano Paiva Vilela, pelas oportunidades e crença no

potencial daqueles que buscam.

Ao professor Dr. Juscélio Clemente de Abreu, por sempre acreditar na capacidade dos alunos

e professores do curso de mestrado em Biotecnologia da UNINCOR, meu eterno

reconhecimento pelo seu trabalho.

Ao professor Dr. Sandro Barbosa, pelas orientações e apoio nos momentos desesperadores e

congratulantes do processo de aprendizado no curso.

Ao professor Dr. Nelson Delú Filho, entre aulas e cobranças, um amigo, que mostrou

caminhos e possibilidades para progredir.

Aos colegas e amigos de curso, Antônio Carlos, Cidinha, Romário, Daliane, Fabiano, Vitor,

Érika, em especial a Darlê, Gilmar e Iara... estarão para sempre marcados em meu coração.

Aos alunos de iniciação científica da UNINCOR, Éder, Vander, Andréia, Silvana e Giane,

que sempre reconheceram meu esforço em crescer sendo meus braços quando não os tive.

Ao pesquisador Dr. Eduardo Alves, pelas análise em microscopia eletrônica de varredura, e a

laboratorista Helô, obrigado pelo carinho e receptividade.

Ao pesquisador Dr. Antônio Chalfun Júnior, pelas orientações e conselhos, sobretudo o bom

humor e o respeito com que me recebeu.

Aos colegas do Laboratório Central de Biologia Molecular da UFLA, Janaina, Marcela,

Monalisa, Carol, Luca, Rafael, Rodrigo(s), Geraldo(s), Zé Renato, Paula Cabral, Marcus e

Pedro. Em especial a Paula Torga pelo ensino de técnicas e metodologias e ao Anderson, que

mesmo bravo sempre foi um companheiro de pesquisa e descobertas.

A amiga Maiana, a qual eu redigiria livros para descrever o sentimento que tenho, sendo

minha companheira de pesquisa nas vitórias e derrotas deste processo, saiba que nunca te

esquecerei... es minha Musa laboratorial...

A Dona Cidinha, pelo aconchego e carinho para quem está longe do lar e da família.

A meu irmão Gustavo, lembro hoje de tantas brigas, sendo que no final nós sempre fomos um

só...

Ao meu papai, que me ensinou sobre a capacidade de mudança das pessoas, ao descobrir seus

defeitos, supera-los e ainda ser capaz de transmitir a paz que todos deveríamos possuir.

A minha mamãe, coluna, base de nossa pequena-grande família, fonte de amor, respeito,

dignidade, confiança... através de sua garra e coragem, sempre me espelhei, obrigado por

acreditar em mim...

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................... 07

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .................................................................. 09

RESUMO .............................................................................................................................. 11

ABSTRACT ......................................................................................................................... 12

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 13

2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................ 15

2.1 Taxonomia e descrição botânica do gênero Musa ...................................................... 15

2.1.1 Cultivar ‘Prata-anã’ .................................................................................................... 15

2.2 Origem e evolução das bananeiras cultivadas ............................................................. 16

2.3 Micropropagação em Musa .......................................................................................... 16

2.4 Variação Somaclonal em Musa .................................................................................... 17

2.5 Melhoramento genético de bananeiras ........................................................................ 18

2.6 Citogenética do gênero Musa ........................................................................................ 21

2.7 Marcadores Morfológicos em Plantas com Variação Somaclonal ............................ 22

2.8 Marcadores Moleculares RAPD em Musa .................................................................. 23

3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 25

3.1 Material Genético .......................................................................................................... 25

3.2 Caracterização Citogenética em ‘Prata-anã’ e suas variantes somaclonais ............ 27

3.2.1 Análise do Ciclo Celular ............................................................................................ 27

3.2.2 Sincronização do Ciclo Celular ................................................................................. 28

3.2.3 Contagem numérica e morfometria das placas metafásicas ................................... 29

3.3 Extração e quantificação do DNA ................................................................................ 29

3.4 Oligonucleotídeos (“primers”) utilizados ...................................................................... 31

3.5 Amplificação via RAPD ................................................................................................ 32

3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................................ 33

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 34

4.1 O Ciclo Celular da Bananeira ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais ............... 34

4.2 Sincronização do Ciclo Celular da ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais ........ 36

4.3 Morfometria dos Cromossomos de ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais ....... 38

4.4 Características Morfológicas ao Microscópio Eletrônico de Varredura................... 39

4.5 Marcadores RAPD na diferenciação de Variantes Somaclonais .............................. 44

5 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 50

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 51

APÊNDICE .......................................................................................................................... 60

7

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página FIGURA 1 Bananeiras com 3 meses de idade, em casa de vegetação no Setor de

Paisagismo do Departamento de Agricultura. À esquerda, uma planta ‘Prata Anã’ normal e à direita ‘Prata Anã’ variante .....................................

18

QUADRO 1 Seções do gênero Musa (Fonte: Adaptado de SOUZA, 2002) ..................... 19 TABELA 1 Exemplos de alguns cultivares segundo seu grupo genômico e sua ploidia 20 FIGURA 2 Meio de multiplicação – B2, explantes de bananeira ‘Prata-anã’ cultivadas

in vitro. Sala de Crescimento do Laboratório Central de Biologia Molecular da Universidade Federal de Lavras .............................................

25

FIGURA 3 Radícula com aproximadamente 2 cm, explante I (PI) ‘Prata-anã’ variante

somaclonal em meio de enraizamento – B3. Laboratório de Pesquisa I da Universidade Vale do Rio Verde, campus de Três Corações – MG ............

26

FIGURA 4 Plântulas de bananeira ‘Prata-anã’ in vivo, normais (PA) e variantes

somaclonais (PI, PII e PIII). Sala de crescimento do Setor de Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras .....

26

FIGURA 5 Quantificação do DNA das amostras, PA – Prata-anã não variante, P1, P2

e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) caneletas 9 marcador de peso (5 ng/µL). Eletroforese horizontal em gel de agarose 1,2%, corrida a 100 volts por 25 minutos ........................................

30

TABELA 2 Dados do primers utilizados (Oligonucleotideos Data Sheet, QIAGEN®) .. 31 FIGURA 6 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã

não-variante (in vitro): (A) Placa metafásica normal, ao centro; (B) Placa metafásica com cromossomo desprendido, ao centro; (C) Anáfase; (D) Ponte anafásica, como cromossomos prendidos ...........................................

34

FIGURA 7 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã

variantes (in vitro): (A) PI - Placa metafásica normal, acima e anáfase, abaixo; (B) PI – Metáfase C, ao centro; (C) PII – Metáfase C, ao centro; (D) PII – Placa metafásica, ao centro; (E) PIII - Placas metafásicas; (F) PIII – Metáfase C ..........................................................................................

35

FIGURA 8 Meristemas radiculares de bananeiras Prata-anã (in vitro): (A) PA - não

variante onde observamos um bom espalhamento dos cromossomos; (B) PI – variante, notam-se ainda algumas sobreposições de cromátides ..........

37

FIGURA 9 Meristema radicular de bananeira Prata-anã (in vitro), PII variante, notam-

se claramente a organização metafásica dos cromossomos .......................... 38

TABELA 3 Valores médios da freqüência estomática e medidas de diâmetro polar e

equatorial de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’ ................................................................

39

FIGURA 10 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-

8

anã não-variante in vitro (A) e in vivo (B) e ‘Prata-anã’ variante in vitro (C) in vivo (D) ...............................................................................................

40

FIGURA 11 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-

anã não-variante (A) e variante (B) ambas in vivo ....................................... 41

FIGURA 12 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-

anã não-variante (A) e variantes (B) e (C) todas in vitro ............................. 42

TABELA 4 Relação do número de produtos amplificados por cada oligonucleotídeo

utilizado (Oligonucleotídeos Data Sheet, QIAGEN®) ................................. 44

FIGURA 13 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (1g agarose + 1µL de

brometo de etídeo + 100mL de TAE 1X), corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:20 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPJ-04, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro), 5-8 (in vivo) e caneleta 9 controle negativo (H2O) .......................................

46

FIGURA 14 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE

1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPM-13, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo).................................................................................

46

FIGURA 15 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE

1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPH-13, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) ................................................................................

47

FIGURA 16 Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE

1X por 1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPN-05, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3 pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) ................................................................................

47

9

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Página RAPD Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso ......................................... 14

OPJ Primer Operon Tec série J ...................................................................... 24

OPW Primer Operon Tec série W .................................................................... 24

PA Cultivar ‘Prata-anã’ não variante ............................................................ 25

PI Cultivar ‘Prata-anã’ variante somaclonal – Explante 1 .......................... 25

PII Cultivar ‘Prata-anã’ variante somaclonal – Explante 2 .......................... 25

PIII Cultivar ‘Prata-anã’ variante somaclonal – Explante 3 .......................... 25

B2 Meio de multiplicação ............................................................................ 25

MS Murashige e Skoog (1962) ....…………………………………………. 25

BAP 6-benzilaminopurina ………………………………………………… 25

B3 Meio de enraizamento ………………………………………………… 25

NAA Ácido naftaleno acético ……………………………………………….. 25

® Marca registrada ..................................................................................... 25

BOD Demanda bioquímica por oxigênio ......................................................... 27

TE Tampão de extração ................................................................................ 30

RNAse Ribonuclease …………………………………………………………... 30

EDTA Ácido etileno diamono tetracético .......................................................... 32

10

dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato ………………………………………….. 33

Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano ……………………………………... 33

CIEN BTA-03 Bananeira variante somaclonal resistente a Sigatoka Amarela .............. 37

HU Hidroxiuréia ………………………………………………………….... 38

TAE Tampão de corrida (Tris + ácido acético + EDTA) ………………........ 46

PCR Reação em cadeia da polimerase ……………………………………… 49

11

RESUMO

LACERDA, Guilherme Araújo. Características citogenéticas, moleculares e morfológicas de variantes somaclonais de bananeiras ‘Prata-anã’ cultivadas in vitro. 2006. 62 p. (Dissertação – Mestrado em Biotecnologia). Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR – Três Corações – MG *

A maior parte da produção de banana no Brasil é destinada ao mercado interno, o que ressalta a grande importância econômica e o elevado alcance social do cultivo, que é explorado, principalmente, por pequenos produtores. A variação somaclonal corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o processo de multiplicação, principalmente relacionada à estatura (no caso o gigantismo), cor, forma e arquitetura das folhas e má formação dos cachos. O objetivo deste trabalho foi averiguar os caracteres morfológicos da epiderme foliar, o comportamento citogenético, e a presença de marcadores moleculares tipo RAPD na tentativa de caracterizar os cultivares micropropagados de ‘Prata-anã’ em relação aos seus variantes somaclonais. O material in vivo foi oriundo do material in vitro, propagado a partir de plantas sabidamente normais e variantes, estando aclimatado em sala de crescimento em condições controladas de luz e temperatura. Houve diferença significativa entre o diâmetro polar dos estômatos da ‘Prata-anã’ não variante e suas variantes, ambas em condições in vitro, observando-se que o mesmo não ocorre para as plantas in vivo. Ambas as amostras apresentaram estômatos do tipo anomocítico. Foi observado também um processo evaginativo da abertura estomática nas bananeiras ‘Prata-anã’ variantes em relação às não variantes in vitro. A maior quantidade de cera presente nas plantas variantes tanto in vitro como in vivo, demonstram também a possibilidade de serem marcadores morfoanatômicos. Porém, tornam-se necessários estudos fisiológicos que expliquem o processo de evaginação da abertura estomática observada nas plantas variantes in vitro. O ciclo celular não revelou alterações significativas que pudessem comprometer a divisão celular dessas plantas. Porém, algumas células em divisão demonstraram cromossomos desprendidos da placa metafásica e anáfases em pontes. Alguns primers se comportaram diferentemente entre as plantas in vitro e in vivo apesar de ambos serem oriundos da micropropagação. Os primers OPJ-04 e OPM-13 apresentaram bandas polimórficas que diferenciaram a planta não variante material in vivo. Já o primer OPN-05 diferiu todas as plantas variantes in vitro da não variante. Sendo que as condições de amostragem do material in vitro e in vivo ocorreram em dias diferentes, apresentamos os resultados aqui obtidos como possíveis localizadores de diferenças genotípicas.

*Comitê Orientador: Dr. Luciano Vilela Paiva – UFLA (Orientador), Dr. Juscélio Clemente de Abreu – UNINCOR (Co-orientador).

12

ABSTRACT

LACERDA, Guilherme Araújo. Characteristics cytogenetics, moleculars and morphologicals of the somaclonal variantions in bananas ‘Prata-anã’ in vitro. 2006. 62 p. (Dissertation – Master in Biotecnology). Universidade Vale do Rio Verde – UNINCOR – Três Corações – MG *

Most of the production of banana in Brazil is destined to the domestic market, what it stands out the great economic importance and the raised social reach of the culture, that is explored, mainly, for small producers. The somaclonal variation corresponds to the appearance of abnormal plants during the multiplication process, mainly related to the stature (in this case the gigantism), color, form and architecture of the leaves and harm formation of the clusters. The objective of this work was to inquire the morphologic characters of the foliar epidermis, the cytogenetical behavior, and the presence of molecular markers type RAPD in the attempt to characterize to cultivate spread them of ‘Prata-anã’ in relation to its somaclonais variants. The in vivo material in was deriving of the material in vitro, propagated from normal and variant plants know, being acclimatized in room of growth in controlled conditions of light and temperature. It had significant difference enters the stomatical polar diameter of the not variant ‘Prata-anã’ and its variant, both in conditions in vitro, observing itself that the not occur of the plants in vivo. Both the samples had presented stomates of the anomocitical type. In vitro was also observed a evaginatian process of the stomatical opening in the variant banana plants ‘Prata-anã’ in relation to not variant in. The biggest amount of present wax in the variant plants in such a way in vitro as in vivo, also demonstrates the possibility to be marking morphoanatomical. However, necessary physiological studies become that explain the process of the evagination of the stomatical opening observed in the variant plants in vitro. The cellular cycle did not disclose alterations significant that could compromise the cellular division of these plants. However, some cells in division had demonstrated to unfastened chromosomes of the methafasical plate and anaphasical in bridges. Some primers if had differently held between the plants in vitro and in vivo although both to be deriving of the micropropagation. Primers OPJ-04 and OPM-13 had presented polymorphical bands who had differentiated the plant not variant material in vivo. Already primer OPN-05 differed all the variant plants in vitro from the not variant one. Being that the conditions of sampling of the in vivo and in vitro materials in had occurred in different days, we present the gotten results here as possible localizers of genotypical differences.

*Guidance Committee: Dr. Luciano Vilela Paiva – UFLA (Major Professor), Dr. Juscélio Clemente de Abreu – UNINCOR.

13

1 INTRODUÇÃO

A banana (Musa spp.), atualmente é cultivada nas regiões localizadas nos trópicos e

sub-trópicos, abrangendo mais de 80 países ao redor do mundo. Os brasileiros produzem

milhões de toneladas de bananas por ano, sendo uma espécie cultivada de Norte a Sul,

envolvendo desde a faixa litorânea até os planaltos interioranos.

De acordo com Vidal e García (2000), a produção de bananas é de vital importância

para centenas de milhões de pessoas em países em desenvolvimento, por quais,

aproximadamente 90% do total produzido é utilizado como alimento pelo consumo doméstico

in natura.

O consumo de banana no mundo ocupa a quarta colocação em termos de

importância alimentar, após o arroz, trigo e leite (CROUCH et al., 1999). A banana é rica em

carboidratos (24%), fibras (6-7%), e ainda em elementos minerais e vitaminas como potássio,

magnésio, cálcio, fósforo, sódio, ferro e vitaminas A, B e C (SHARROCK e LUSTY, 1999).

O fruto da bananeira é uma das principais fontes de potássio para o corpo humano (ZAIDAN

et al., 1999).

A maior parte da produção de banana no Brasil é destinada ao mercado interno, o

que ressalta a grande importância econômica e o elevado alcance social do cultivo, que é

explorado, principalmente, por pequenos produtores. Segundo dados estatísticos, o Brasil

exportou, em 2004, 188,087 milhões de toneladas deste fruto, totalizando U$ 26.983.000,00

(FAO, 2006).

Há uma grande necessidade de se obter variedades geneticamente melhoradas,

garantindo uma produção sustentável e ambientalmente segura, pois, a banana possui notável

papel sócio-econômico em países em desenvolvimento como o Brasil. Sua importância

garante tanto fonte alimentícia como fonte de divisas comerciais.

A micropropagação, mediante a cultura de ápices caulinares in vitro tem sido

adotada em muitos países para a produção de mudas de bananeira. No Brasil, este método

vem sendo utilizado de maneira crescente nos últimos anos (ÁLVARES e CALDAS, 2002).

Uma das principais vantagens das plantas propagadas in vitro, a partir de ápices caulinares, é

a obtenção de plantas livres de doenças e pragas, o que reduz a dispersão de organismos

fitopatogênicos (DAMASCO et al., 1996).

A grande limitação da micropropagação em bananeiras é a ocorrência de variantes

somaclonais, que causam grandes perdas aos produtores, como cachos sem valor comercial.

Segundo Larkin e Scowcroft (1981), o fenômeno da variação somaclonal pode ser definido

como uma variabilidade genética gerada durante a cultura in vitro. A variação somaclonal

14

corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o processo de multiplicação,

principalmente relacionada à estatura, cor, forma e arquitetura das folhas e má formação dos

cachos (ISRAELI et al., 1991).

Stover e Simmonds (1987), trabalhando com uma população representativa de

bananeira cv. Grande Naine, micropropagadas in vitro, verificou que a variação somaclonal

mais comumente encontrada foi com relação ao porte, variando de baixo ao gigantismo.

O objetivo do presente trabalho foi averiguar o comportamento citogenético, os

marcadores moleculares tipo RAPD e caracteres morfológicos da epiderme foliar para

caracterizar os cultivares micropropagados de ‘Prata-anã’ em relação aos seus variantes

somaclonais que apresentam a característica gigantismo.

15

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Taxonomia e descrição botânica do gênero Musa

As bananeiras compreendem plantas gigantes, herbáceas perenes, pertencentes à

classe Liliopsida (Lilitae, Monocotyledoneae), subclasse Zingiberidae, ordem Zingiberales,

família Musaceae, gêneros Musa e Ensete, que se desenvolvem em áreas tropicais e

subtropicais úmidas (CRONQUIST, 1981 apud CARVALHO, 2001). Sua propagação se dá

principalmente por via assexuada ou vegetativa através de mudas e brotos, embora as espécies

selvagens sejam propagadas por sementes (SIMMONDS, 1973).

A família Musaceae Juss., compreende apenas dois gêneros, Musa com 35 espécies

e Ensete com 7 espécies, totalizando-se cerca de 42 espécies. São plantas herbáceas, de

grande porte, com rizoma predominando como verdadeiro caule, sendo, em Musa o órgão de

propagação mais utilizado. Acima do solo aparece o pseudocaule muito macio, formado pela

junção da bainha das folhas, que são muito desenvolvidas. As folhas são convolutas,

completas, grandes, inteiras, peninérveas, com nervura central em forma de canaleta,

dispostas em espiral (CARVALHO, 2001).

2.1.1 Cultivar ‘Prata-anã’

Uma cultivar é um conjunto de plantas cultivadas o qual se distingue claramente por

uma série de caracteres, os quais se mantém nos descendentes, quando estes reproduzem tanto

sexuada quanto assexuadamente. Uma cultivar pode ser um clone, um grupo de clones

indiferenciados, uma linha ou linhas de indivíduos intercruzados, uma série de indivíduos de

fecundação cruzada, ou um conjunto de indivíduos formados em cada descendência, por

cruzamento, como um híbrido F1. Algumas cultivares tem-se originado naturalmente, mas a

maioria é criada por cultivo, tanto espontaneamente como por hibridação induzida

artificialmente. O importante é que elas se mantêm sob cultivo (CARVALHO, 2001).

A cultivar ‘Prata-anã’ apresenta pseudocaule vigoroso de cor verde-claro, brilhante,

com poucas manchas escuras próximas a roseta foliar. O porte varia de 2,0 a 3,5 m e o

diâmetro do pseudocaule é de, aproximadamente, 50 cm. A coloração do pecíolo e das

nervuras principais é também verde-claro-brilhante. A roseta é compacta, as pencas são mais

juntas e as bananas mais curtas e roliças que as da ‘Prata’. As pontas dos frutos tem formato

de gargalo e a ráquis é coberta por flores masculinas e por brácteas, menos nos primeiros 10-

15 cm. O “coração” é bastante desenvolvido e a cultivar é tolerante ao frio. Devido ao grande

16

vigor da planta, dispensa o uso de escoramento. Apresenta bom potencial de produtividade

sob condições de irrigação, podendo atingir 30-35 t/ha/ciclo (SILVA et al., 1999a).

2.2 Origem e evolução das bananeiras cultivadas

Embora o sudeste da Ásia seja considerado o centro da origem das espécies de Musa

(SIMMONDS, 1995), uma grande diversidade existe na África sub-Saara, onde diferentes

tipos são cultivados em diferentes sub-regiões. A introdução da banana ocorreu nos demais

continentes com a expansão do comércio, atingindo toda a costa asiática banhada pelo oceano

Índico, posteriormente difundindo-se pela costa africana e atingindo as Américas com as

conquistas européias (DE LANGHE, 1995).

2.3 Micropropagação em Musa

Por muito tempo (anos), a propagação da bananeira a muito não tem sido somente

vegetativa (mediante mudas), decorrente da lentidão do processo e da disseminação de

doenças e pragas para novas áreas. Uma alternativa é a micropropagação ou propagação in

vitro, que tem aumentado consideravelmente o número de plantas dentro de um curto espaço

de tempo. Segundo Souza et al. (1999), a micropropagação consiste-se no cultivo de

segmentos muito pequenos de plantas, no caso do rizoma, denominados de explantes,

realizado em meio artificial e sob condições de luminosidade, temperatura e fotoperíodos

totalmente controlados em laboratório.

Um aspecto importante a ser ressaltado é o potencial de propagação que o cultivo de

ápices caulinares de bananeira oferece, existindo grande amplitude no número de mudas

produzidas por explante em alguns laboratórios. Mencionou-se também as possibilidades para

a produção comercial dessas mudas. De acordo com Sandoval Fernández (1985) apud Souza

et al., 1999, a partir de um só explante é possível, teoricamente, mediante o subcultivo de

gemas laterais, obter em 12 meses mais de um milhão de plântulas.

A qualidade da muda é imprescindível para o bom desempenho da cultura da banana.

As mudas devem ser provenientes de plantas vigorosas, sadias, produtivas, com cachos bem

formados, sistema radicular em desenvolvido, rizoma e raízes sem necrose de broca e isento

de nematóides (SOUTO et al., 1997).

Porém, existem problemas na micropropagação como: (1) Contaminação das culturas,

causada por fungos e bactérias; (2) Escurecimento dos explantes, causada pela oxidação

17

polifenólica e (3) Variação somaclonal, pelo aparecimento de plantas anormais, as quais não

correspondem geneticamente à planta-mãe (SOUZA et al., 1999).

2.4 Variação Somaclonal em Musa

A variação somaclonal pode ser uma variação fenotípica de origem genética, ou seja,

uma variação cromossômica que se torna herdável nas gerações seguintes, ou epigenética, que

é uma variação transitória devido ao estresse fisiológico que o material sofre quando entra na

cultura in vitro.

Com a utilização da técnica de micropropagação, mudas de bananeiras provenientes de

cultura de tecidos são produzidas e colocadas a disposição do agricultor. Ainda hoje, a falta de

domínio dessa tecnologia, para alguns cultivares regionais de bananeira, é responsável pela

colocação no mercado de mudas de qualidade duvidosa, trazendo prejuízos aos agricultores

devido a ocorrência de alta taxa de variação somaclonal (SANTOS e RODRIGUES, 2004).

Para Damasco et al. (1994), a ocorrência de variação somaclonal resulta em plantas

possuindo fenótipos deletérios, sendo mais freqüentemente, o nanismo.

De acordo com Santos e Rodrigues (2004), estudos sobre os fatores que influenciam a

taxa de variação somaclonal no processo de micropropagação, descritos por Scowcroft (1984)

e George e Sherrington (1984), mostraram que o aparecimento de calos em determinada fase

do processo de micropropagação, relacionava-se com a taxa de variação somaclonal, bem

como períodos prolongados de cultivo in vitro.

Além desses fatores, Smith (1988), inclui a propagação assexuada, a instabilidade

genética e a composição do meio de cultura como determinantes da ocorrência de variação

somaclonal. Este mesmo autor menciona a característica do gigantismo como ocorrência de

variação somaclonal ao tratar-se da altura excessiva da planta devida a longa distância o ponto

de emergência da folha (estiolamento).

Vários autores relatam que as mudas micropropagadas cresceram mais rapidamente

nos estádios iniciais do desenvolvimento, o que pressupõe os resultados esperados por este

trabalho.

Segundo Drew e Smith (1990) e López e Espinosa (1995), é provável que o melhor

desempenho inicial das mudas micropropagadas se deva ao fato de que estas mudas já

possuem um sistema radicular ativo e área foliar com maior eficiência fotossintética desde o

momento do plantio. Estes mesmos autores mencionam que o desempenho das mudas

micropropagadas se deva a sanidade dessas plantas, sendo as mesmas livres de fitopatógenos

como fungos, bactérias e nematódeos.

18

Guimarães (2005) trabalhou com plantas variantes somaclonais da cultivar Prata Anã

identificadas em um bananal na cidade de Andradas, MG, segundo parâmetros morfológicos,

como folhas lanceoladas, porte mais alto, folhas mais eretas e pseudocaule mais fino que o

das plantas normais (Figura 1).

FIGURA 1 Bananeiras com 3 meses de idade, em casa de vegetação no Setor de Paisagismo

do Departamento de Agricultura. À esquerda, uma planta ‘Prata Anã’ normal e à direita ‘Prata Anã’ variante (GUIMARÃES, 2005).

De acordo com Álvares e Caldas (2002), a cultivar Nanicão micropropagada foi

significativamente superior à convencional até o oitavo mês pós plantio, enquanto a ‘Prata-

anã’ micropropagada foi significativamente superior à convencional quanto às variáveis

avaliadas até o 15o mês pós plantio (fase de florescimento). Estes mesmos autores

averiguaram que 1% das bananeiras ‘Prata-anã’ eram gigantes (110 cm mais altas do que as

plantas normais) e 0,5% apresentavam deformações nos cachos. Apenas os variantes

somaclonais com folhas variegadas puderam ser identificados nos estádios iniciais de

desenvolvimento.

2.5 Melhoramento Genético de Bananeiras

O gênero Musa, do qual faz parte a cultivar Prata-anã, se divide em cinco seções:

Callimusa, Rhodochlamys, Australimusa, Ingentimusa e Emmusa. De acordo com Vidal e

García (2000), bananas e platanos são originados de cruzamentos intra- e inter-específicos de

Musa acuminata Colla e Musa balbisiana Colla.

19

QUADRO 1 Seções do gênero Musa. Fonte: Adaptado de SOUZA, 2002.

Seções 2n = 2x Importância

Callimusa 20 Interesse ornamental

Rhodochlamys

22

Interesse ornamental

Australimusa 20

Bananas comestíveis, conhecidas como Fe'is (Musa maclay) e a

espécie (Musa textilis), cultivada para a produção de fibras

Ingentimusa

14

Possui apenas uma espécie Musa ingens

Emmusa

22

Maioria dos cultivares de banana

Duas importantes alterações determinaram a domesticação da bananeira: (1) a

ocorrência de partenocarpia por mutação em Musa acuminata; (2) existência de esterilidade

feminina, resultando no desenvolvimento dos frutos sem a ocorrência de polinização

(KAEMMER et al., 1992). Dessa forma as cultivares antigas derivadas de Musa acuminata

eram diplóides com genoma AA; 2x=22 cromossomos. Devido às hibridações realizadas com

esses cultivares, os mesmos passaram a triplóides e com genoma AAA; 3x=33 cromossomos.

Espécies asiáticas selvagens de Musa balbisiana apresentaram compatibilidade

genética com M. acuminata, sendo então incorporado ao seu genótipo o genoma B,

produzindo cultivares diplóides AB, triplóides AAB, ABB e até mesmo tetraplóides AAAA,

AAAB, AABB e ABBB (SOUZA, 2002).

Segundo Román et al. (2005), foram comprovados a condição triplóide (2n=3x=33) de

todos os clones estudados do subgrupo Cavendish do gênero Musa. O mesmo resultado foi

encontrado por Guimarães (2005), porém não sendo possível diferenciar citogeneticamente a

‘Prata-anã’ (2n=3x=33) de sua variante somaclonal (número do complemento cromossômico

não determinado) devido a dificuldades com a confecção das lâminas.

A produção de bananas visando o mercado de exportação está concentrada em

cultivares do subgrupo “Cavendish” de constituição genômica AAA, enquanto um grande

número de cultivares de constituição AAA, AAB e ABB são cultivadas para consumo local

em diversas regiões no mundo (SOUZA, 2002). Baseado em Silva et al (1997), no Brasil

predominam cultivares locais ou “landraces” de constituição genômica AAB como ‘Prata’

‘Pacovan’ e ‘Maçã’, que juntas correspondem a 75% da área plantada, seguida pelas

20

cultivares do subgrupo “Cavendish” (AAA) “Nanica” e “Nanicão” (21%), sendo os demais

cultivares totalizando 4%.

TABELA 1 Exemplos de alguns cultivares segundo seu grupo genômico e sua ploidia.

Cultivares/

Genótipos

Grupo

Genômico

Subgrupo Referência

‘Ouro’ AA - Silva, 2001 ‘Caru’ AAA - Silva, 2001 ‘São Tomé’ AAA - Silva, 2001 ‘Nanica’ AAA Cavendish Silva e Alves, 1999 ‘Nanicão’ AAA Cavendish Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 ‘Grand Naine’ AAA Cavendish Silva e Alves, 1999 ‘Caipira’ AAA - Silva e Alves, 1999 ‘Prata’ AAB Prata Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 ‘Prata-anã’ AAB Prata Silva e Alves, 1999 ‘Pacovan’ AAB Prata Silva e Alves, 1999 ‘Maçã’ AAB - Silva e Alves, 1999 ‘Mysore’ AAB Prata Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 ‘Terra’ AAB Terra Silva, 2001; Silva e Alves, 1999 ‘D’angola’ AAB Terra Silva e Alves, 1999 ‘Marmelo’ AAB Figo Gomes, 2002 ‘Figo’ ABB Figo Silva, 2001; Silva et al., 1999b ‘Pioneira’ AAAB - Silva e Alves, 1999 ‘Ouro da mata’ AAAB - Silva, 2001 FH1A 01 AAAB - Silva e Alves, 1999 FH1A 18 AAAB - Silva e Alves, 1999

Shepherd et al. (1986 apud SILVA et al., 1999), considera que a ausência de sementes

em cultivos comerciais é uma conseqüência da inexistência de pólen viável ou, ainda, de

polinizadores naturais eficientes. As cultivares que se apresentam sem sementes, quando

polinizadas, ou que as que produzem em quantidade pequena, podem ser tanto diplóides,

quanto triplóides. O estado triplóide, por si só, provavelmente, não é a causa mais importante

da esterilidade feminina em bananeiras cultivadas.

A utilização efetiva dos recursos genéticos disponíveis ao melhoramento genético

requer um pleno conhecimento da diversidade genética existente. Atualmente, se conhece a

herança da resistência a Sigatoka negra (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1994a), do nanismo

(ORTIZ e VUYLSTEKE, 1995b), do albinismo (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1994b),

partenocarpia (ORTIZ e VUYLSTEKE, 1995a), orientação do cacho (ORTIZ, 1995),

esterilidade feminina e masculina (ORTIZ, 1995), peso do cacho e outras características

quantitativas (VUYLSTEKE, 2001).

Na bananeira, a variabilidade genética localiza-se entre as diversas formas selvagens

da espécie Musa acuminata Colla, a qual abrange sete subespécies bastante distintas

21

morfologicamente, e entre os cultivares do grupo AA, que apresentam uma diversidade

morfológica muito grande (SHEPHERD et al. 1986 apud SILVA et al., 1999).

Uma cultivar triplóide, com um pouco de fertilidade feminina, pode produzir embriões

e híbridos com 22 e 33 cromossomos, em função da meiose desequilibrada (sacos

embrionários com 11 e 22 cromossomos, mais 11 cromossomos do pólen haplóide), bem

como embriões e híbridos com 44 cromossomos (33 mais 11) ou 77 cromossomos (duas vezes

33 mais 11). Na prática, entretanto, são os híbridos tetraplóides, com 44 cromossomos, que

têm potencial para serem utilizados como cultivares comerciais. É importante ressaltar que o

pólen contribui com apenas um quarto do novo genótipo, em cada fertilização deste tipo.

Portanto, é basicamente um processo de implantação de características adicionais, sem

provocar outras alterações. Assim, o híbrido tetraplóide sempre apresenta as características do

parental feminino triplóide, inclusive aquelas relacionadas com o paladar do fruto (DANTAS

et al. 1993b apud SILVA e ALVES, 1999).

2.6 Citogenética do gênero Musa

No gênero Musa existem dois números básicos de cromossomos, x=10 e x=11, de

acordo com Cheesman (1948 apud DANTAS et al., 1999b). A partir de contagens dos

cromossomos somáticos de dois acessos da coleção Trinidad, Shepherd (1959) apud Dantas et

al. (1999b), observou dois novos números básicos de cromossomos em Musa. O primeiro

acesso I.R.503, apresenta algumas semelhanças com Callimusa (série ou seção do gênero

Musa), mas diferenciavam quanto às características das sementes e ao número de

cromossomos (2n=18). O outro acesso, I. R. 510 que assemelha-se ao gênero Ensete quanto

ao diâmetro das sementes, mas em vários outros aspectos era semelhante com Musa. Outros

caracteres, a exemplo do pouco perfilhamento, eram intermediários entre os dois gêneros, e o

número de cromossomos foi 2n=14.

Shepherd (1999), descreve o procedimento para contagem cromossômica em Musa é

bastante simples. Consiste-se basicamente em um pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína a

0,03% seguida de fixação em ácido acético: etanol (1:3) e maceração com uma solução de 9:1

(orceína acética 45%: HCl 1N). Finalmente este material era esmagado com solução de

orceína, a fim de umedecer a amostra, seguida por confecção e selagem da lâmina.

De acordo com Shepherd (1984 apud DANTAS et al., 1999b), os cromossomos da

bananeira são pequenos e não são visíveis, pelo menos separadamente, numa célula que não

esteja em divisão mitótica. Apresentam-se como filamentos compridos e finos dentro do

núcleo; porém, no início da divisão (prófase) eles se contraem numa espiral compacta ainda

22

dentro da membrana externa do núcleo, estando aptos a receber alguns corantes especiais.

Nessa fase a contagem precisa é praticamente impossível. Shepherd (1992 apud DANTAS et

al., 1999b) ainda ressalta que os estudos do cariótipo da bananeira tem sido dificultados em

função dos cromossomos serem bastante pequenos, sendo impossível, na prática, uma

caracterização estrutural. Outro entrave citado pelo mesmo autor, é a considerável freqüência

de translocações.

Segundo Crouch, Vuylsteke e Ortiz (1998), a maioria dos cultivares de banana e

platanos tem 33 cromossomos (2n = 3x).

Ao utilizar a técnica de secagem ao ar com maceração enzimática, Guimarães (2005),

inferiu que com raízes coletadas de plantas variantes e não variantes in vitro foi possível se

observar um número de 33 cromossomos, tendo uma pequena oscilação de um ou dois

cromossomos para mais ou menos sido detectada. Células de ponta de raiz de plantas da

cultivar Prata Anã adultas sabidamente normais e variantes somaclonais foram analisadas,

entretanto, os resultados fornecidos não foram satisfatórios. Isso porque as plantas adultas não

fornecem um material tenro o suficiente para que as lâminas tenham qualidade e a contagem

possa ser realizada. As células freqüentemente apresentavam-se ‘embaçadas’, rompidas e as

lâminas muito sujas, além de haver uma maior dificuldade na ligação do corante ao DNA.

2.7 Marcadores Morfológicos em Plantas com Variação Somaclonal

Os marcadores fenotípicos, também conhecidos como marcadores morfológicos,

correspondem aos caracteres fenotípicos qualitativos, ou seja, caracteres cujas classes

fenotípicas são naturalmente distinguíveis entre si. Normalmente são representados por

caracteres como: coloração de determinada estrutura da planta (flores, vagens, tegumento da

semente, cotilédones, etc.) textura ou formato destas mesmas estruturas, resistência a doenças,

etc.

Com o incremento na multiplicação de bananeiras in vitro, o aparecimento de

variações somaclonais nesta cultura foi largamente relatado (STOVER, 1987). No entanto,

vale a pena ressaltar que a maioria destes relatos refere-se ao grupo Cavendish (AAA). Quatro

tipos de variantes (estatura, forma da folha, cor do pseudocaule e má formação dos cachos)

foram detectados por Hwang e Ko (1987), com taxas de 1,4%; 0,5%; 0,1% e 0,4%

respectivamente, numa população de 46.260 plantas. Com exceção da variante variegada no

pseudocaule, que é instável, todos os demais tipos de variação foram transmitidos

consistentemente nas três gerações seguintes.

23

De acordo com Israeli et al. (1991), as anormalidades mais freqüentemente

encontradas em bananeiras dizem respeito à estatura, má formação e alterações de folhas,

assim como o aparecimento de cachos mal formados.

Wenzel et al. (1997), se revelou bastante interessado no entendimento de mecanismos

de controle na expansão foliar. Em suas análises com mutantes anãs de cevada (Hordeum

vulgare L. ‘Himalaia’), comprovou uma redução numérica das células ao longo da folha.

Segundo Guimarães (2005) as plantas variantes da cultivar ‘Prata-anã’, após 3 meses

na casa de vegetação, já apresentavam uma altura maior, embora as condições de

luminosidade, irrigação, temperatura e substrato fossem as mesmas para as plantas variantes e

normais. Assim se confirmou a eficiência na seleção daquelas plantas da cultivar Prata-anã

que seriam variantes ou normais, porém sendo necessário o período de 3 meses. Para os

produtores de mudas, este período torna-se demasiadamente longo, objetivando-se este estudo

em identificar estes variantes ainda no cultivo in vitro.

A caracterização citoanatômica e morfológica, ou seja, a avaliação de determinadas

características da planta, tais como seus aspectos morfológicos, diâmetro do grão de pólen,

número de cloroplastos por par de células-guarda, tamanho e densidade de estômatos foliares,

tem sido adotados como critério indireto na identificação de ploidias (VICHIATO, 2005).

2.8 Marcadores Moleculares RAPD em Musa

Os marcadores RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) representam um

marco na análise genética por se tornarem um processo de análise de marcadores moleculares

rápido e de custo relativamente reduzido, tornando-se bastante acessível. A técnica baseia-se

em PCR (Polimerase Chain Reaction), no qual fragmentos de DNA podem ser amplificados

especificamente pelo uso de primers adequados flanqueando um fragmento do DNA da

amostra compatível. A variação no resultado decorre da presença ou ausência de sítios de

homologia a seqüência dos primers utilizados (FERREIRA e GRATAPAGLIA, 1998).

A tecnologia do RAPD é um caminho muito rápido para se obter informações sobre a

variabilidade genética (FORD-LOYD et al., 1996). Kaemmer et al. (1992) utilizaram

seqüências de microssatélites e amplificação aleatória (RAPD) na avaliação do polimorfismo

de quinze cultivares representativos do gênero Musa, compreendendo genótipos AA, AAA,

AAB, ABB e BB, tendo sido possível identificar bandas específicas de genoma A e B. A

identificação de marcadores é de grande interesse para o melhoramento, pois permite que a

definição da composição genômica de um híbrido seja feita em estágio de plântula ou in vitro,

24

contornando os problemas que envolvam a lenta propagação da planta, o longo ciclo da

cultura (18-24 meses) e o grande espaço requerido.

O potencial do uso de marcadores RAPDs para identificação precoce de variantes

somaclonais aliado a caracterização desses clones tem sido avaliado em Musa. Kaemmer et al.

(1992) identificaram em bananeira um polimorfismo de RAPD entre um mutante induzido

(‘GN 60’) de ‘Grande Naine’ e a planta original. Mais recentemente, Damasco et al. (1996)

avaliaram 57 plantas normais e 59 plantas anãs de Cavendish utilizando 66 primers

arbitrários, e identificaram um primer (OPJ-04) capaz de amplificar um fragmento de 1500

pares de base, presente apenas nas plantas normais. Ford-Lloyd, Howell e Newbury (1992)

avaliaram a instabilidade genética em germoplasma de musa mantido in vitro, empregando-se

marcadores RAPD.

Bhat e Jarret (1995) demonstram a utilidade de marcadores RAPD na caracterização

do germoplasma de Musa, tendo sido possível diferenciar clones que se mostram idênticos

sob o ponto de vista morfológico.

Segundo Guimarães (2005), o primer de RAPD OPW-08 distinguiu uma planta

variante somaclonal de todas as demais, inclusive de outras plantas também variantes,

sugerindo que a variação não ocorre de maneira uniforme no genoma, apesar das

características morfológicas serem compartilhadas por todos os variantes.

25

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Genético

Foram utilizadas bananeiras micropropagadas cedidas pela empresa Multiplanta

Tecnologia Vegetal – Ltda, repicadas a partir de variantes somaclonais previamente

determinados, de acordo com as características morfológicas como altura das plantas e de

plantas sem sintomas de variação. Como se tratavam de três plantas variantes distintas, foram

designadas PI, PII e PIII, sendo as não-variantes designadas PA – ‘Prata-anã’.

Os explantes de bananeira foram repicados em condições assépticas por períodos entre

30 e 60 dias, afim de multiplicar o número de clones utilizando-se o meio apropriado B2 (MS

sais, MS vitaminas, 3% sacarose, 3 a 5 mg/L BAP, 5 g/L ágar, pH 5,7). A temperatura da sala

de crescimento estava condicionada entre 27-28°C e luz constante. A Figura 2 mostra uma

visão parcial das plantas propagadas sob condições in vitro.

FIGURA 2 Meio de multiplicação – B2, explantes de bananeira ‘Prata-anã’ cultivadas in

vitro. Sala de Crescimento do Laboratório Central de Biologia Molecular do Departamento de Química da Universidade Federal de Lavras.

Para induzir o enraizamento, os explantes propagados no meio de multiplicação B2

foram transferidos para o meio de enraizamento B3 (MS vitaminas, MS sais, 3% sacarose, 0,5

mg/L NAA, 5 g/L ágar e pH 5,7). Com aproximadamente 7-10 dias, os explantes já

apresentavam sistema radicular, conforme demonstrado na Figura 3.

26

FIGURA 3 Radícula de ‘Prata-anã’ variante somaclonal, explante I (PI), com aproximadamente 2 cm, em meio de enraizamento – B3.

Após estabelecimento do sistema radicular in vitro, as plântulas foram aclimatizadas

em substrato comercial (Empresa Vida Verde Ltda.), e mantidas no setor de Fisiologia

Vegetal da Universidade Federal de Lavras (Figura 4). Sendo assim denominadas material in

vivo.

FIGURA 4 Plântulas de bananeira ‘Prata-anã’ in vivo, normais (PA) e variantes somaclonais (PI, PII e PIII). Sala de crescimento do Setor de Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras.

27

3.2 Caracterização Citogenética em ‘Prata-anã’ e suas variantes somaclonais

3.2.1 Análise do Ciclo Celular

Foram coletadas cinco radículas de cada explante (PA, PI, PII e PIII) in vitro, com 1-2

cm de comprimento e 12 dias em meio de enraizamento - B3. As radículas foram então

lavadas com água destilada e o excesso de água retirado. A seguir foram transferidos para

quatro frascos de 5 mL distintos, previamente identificados em PA, PI, PII e PIII, contendo

solução fixadora Carnoy I (3:1), onde permaneceram por 24 horas. Após a fixação, as raízes

foram lavadas em água destilada por 5 minutos, sendo as raízes imersas em outra placa de

Petri com água destilada por mais 5 minutos (dois banhos). Após os banhos as radículas

foram submetidas à maceração enzimática utilizando-se uma solução de pectinase (1,18

U/mg) 2% : celulase (17,8 mg proteína por mL) 20%, em gerbox por duas horas a 35°C em

estufa B.O.D. Q-315F16 Quimis®.

Terminada a maceração enzimática, as raízes foram lavadas rapidamente em água

destilada. Em seguida, foram submetidas a uma hidrólise ácida em HCl a 1N por 8 minutos

em banho maria a 60°C, e a um tratamento hipotônico em água destilada gelada, afim de

propiciar um choque térmico para enrijecer um pouco as radículas.

As radículas foram então coradas utilizando o Reativo de Schiff (Feulgen), em frascos

de 5mL cobertos com papel alumínio, devido à natureza fotolábil do corante, por 1 hora.

A montagem das lâminas deu-se sob estereomicroscópico binocular Q724S-1

Quimis®, com a região meristemática evidenciada pelo corante. A dissociação celular foi

feita com o auxílio de uma agulha de seringa de 1mL, gotejando, com pipeta de Pasteur, ácido

acético 45% para impedir a oxidação. A coifa foi mantida afim de evitar perda de material

meristemático em radículas muito pequenas. O material foi então macerado com a própria

agulha da seringa e em seguida coberto com a lamínula. Foi utilizado o papel filtro para retirar

o excesso de ácido acético 45%, batendo levemente com a extremidade do pincel para

esmagamento do material, seguindo-se por uma pressão digital do polegar sobre a lâmina-

lamínula-papel filtro, afim de espalhar melhor o material.

A seguir o material foi fixado a lâmina com o auxílio do balão de nitrogênio líquido e

retirando-se logo a lamínula. As lâminas foram deixadas para secar em temperatura ambiente

por 24 horas. Após esse período, foram varridas em microscópio biológico digital Q720D

Quimis®, em aumento total de até 400x, sendo então selecionadas as melhores para serem

seladas com Entelan.

28

3.2.2 Sincronização do ciclo celular

Segundo protocolo adaptado de Barbosa et al. (2003), as plântulas foram retiradas da

cultura in vitro e lavadas em água destilada a fim de remover o excesso de meio de cultura.

Em seguida todos os explantes (PA, PI, PII e PIII) tiveram suas radículas, in vivo, imersas em

solução contendo 240 mg/L de hidroxiuréia para fins bioquímicos Merk® (CH4N2O2, 5 g,

M=76,06 g/mol) por 15 horas. Para manter a parte aérea das plântulas fora de contato com a

solução, utilizaram-se copos plásticos, tomando-se o cuidado de identificar adequadamente o

material.

Transcorridas as 15 horas, o material foi lavado (recuperado) em água corrente de

torneira durante 6 horas, para remoção da solução de hidroxiuréia. Em seguida o excesso de

água foi retirado, utilizando-se o pincel e o papel filtro. Só então as radículas foram coletadas

de cada plântula (PA, PI, PII e PIII), com aproximadamente 0,5 cm de comprimento e 8 dias

em meio de enraizamento - B3. As radículas foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinoleína 300

mg/L (0,03%) por 6 horas, protegidas da luz, em temperatura ambiente. O material foi então

submetido a um banho rápido em água destilada para remoção de resíduos do antimitótico. A

seguir, transferiu-se para quatro frascos de 5 mL distintos e previamente identificados em PA,

PI, PII e PIII contendo a solução fixadora Carnoy I (3:1), onde permaneceram por 24 horas.

Após a fixação, as raízes foram lavadas em água destilada por 5 minutos, sendo as raízes

imersas em outra placa de Petri com água destilada por mais 5 minutos (dois banhos). Após os

banhos, as radículas foram submetidas a maceração enzimática, utilizando-se a solução

pectinase (1,18 U/mg) 2% : celulase (17,8 mg proteína por mL) 20%, em gerbox por duas

horas a 35°C em estufa B.O.D. Q-315F16 Quimis®.

Terminada a maceração enzimática, as raízes foram lavadas rapidamente em água

destilada. Em seguida seguiu-se a hidrólise ácida em HCl a 1N por 8 minutos em banho Maria

a 60°C com os quatro materiais (PA, PI, PII e PIII). A partir disso procedeu-se um banho em

água destilada gelada, afim de propiciar um choque térmico para enrijecer um pouco as

radículas.

As radículas foram então coradas utilizando o Reativo de Schiff (Feulgen), em frascos

de penicilina cobertos com papel alumínio, devido a natureza fotolábil do corante, por 2:30

horas. A montagem das lâminas seguiu-se segundo o item 3.2.1.

29

3.2.3 Contagem numérica e morfometria das placas metafásicas

Para cada planta estudada, foram avaliadas 10 metáfases para a determinação do

número cromossômico. A análise morfoanatômica das placas metafásicas dos cromossomos

foi realizada em metáfases oriundas do experimento de ciclo celular, sendo corados com

Reativo de Schiff (Feulgen).

Para a captura das imagens foi utilizado o microscópio biológico digital Q720D

Quimis® no laboratório de Pesquisa I da Universidade Vale do Rio Verde, Campus de Três

Corações – MG. As medições das placas metafásicas foram feitas com o software Jandel

Sigma Scan® Pro v. 2.0, realizadas no laboratório de Citogenética do Departamento de

Biologia da Universidade Federal de Lavras, em Lavras – MG.

As medidas de comprimento das placas metafásicas dos cromossomos obtidas pelo

processo análise de imagem, foram determinadas pela média de 10 placas metafásicas por

planta (PA, PI, PII e PIII), utilizando-se as “ferramentas” do programa citado.

Os resultados obtidos nessas avaliações foram submetidos à análise de variância e as

médias comparadas através do teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

3.3 Extração e quantificação do DNA

Para extração do DNA utilizou-se o protocolo adaptado de Guimarães (2005), onde

cerca de 1g de tecido foliar fresco foi triturado em N2 líquido, utilizando-se pistilo e

almofariz, até obter um pó bastante fino. Em seguida, o material foi transferido para

microtubos gelados, que foram preenchidos com 800 µL de tampão de extração (2% CTAB

(p/v), 0,1 mol/L Tris-HCl pH 8,0, 1,4 mol/L NaCl, 0,02 mol/L EDTA pH 8,0, 1% Sarcosil

(p/v), 1% PVP (p/v)) e 2 µL β-mercaptoetanol pré-aquecido a 65 °C, os quais foram

adicionados e misturados no triturado foliar. Esta mistura foi mantida em banho maria a

65 °C, por 1 hora, com homogeneização a cada 15 minutos, tendo o cuidado de observar

sempre o contato do tampão com o material vegetal.

Após este período, a mistura foi deixada em temperatura ambiente por 5 minutos,

sendo homogeinizada manualmente. Em seguida, 1 volume (600 µL) de solução de

clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi adicionado ao tubo e agitado por 10 minutos.

A separação das fases orgânica e aquosa foi realizada por centrifugação a 18.000 x g,

por 5 minutos, à temperatura ambiente, onde o sobrenadante (fase aquosa) foi transferido para

um novo microtubo.

30

A lavagem do sobrenadante com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) foi realizada

novamente, seguindo os mesmos volumes, tempos de agitação e centrifugação. Após a

segunda lavagem, a fase aquosa foi transferida para um novo microtubo e 900 µL de

isopropanol gelado foram adicionados para que o DNA fosse precipitado. O microtubo foi

então invertido levemente, para aumentar a precipitação e incubação por 30 minutos a –20 °C.

Após este período, a solução foi centrifugada a 18.000 x g, por 10 minutos à temperatura

ambiente e o sobrenadante foi descartado por inversão; 300 µL de etanol 70% gelado foram

adicionados e o tubo foi levemente girado para que o sedimento e paredes fossem lavadas. O

microtubo foi centrifugado a 18.000 x g, por 3 minutos à temperatura ambiente e o

sobrenadante foi descartado por inversão. O sedimento foi seco em câmara de fluxo laminar

por 2 horas e ressuspenso em 47,5 µL de tampão 0,01 mol/L Tris-HCl pH 8,0 adicionado de

2,5 µL de RNAse + TE (100 µg/mL) em banho maria por 30 minutos a 37o C. Em seguida, o

material foi centrifugado a 18.000 x g por 3 minutos, em temperatura ambiente, sendo

descartado o sobrenadante. Foi adicionado 900 µL de isopropanol gelado mais 90 µL de

acetato de sódio 3 M para melhor precipitação do DNA. O material foi incubado por 30

minutos em –20o C e centrifugado a 18.000 x g por 3 minutos, a temperatura ambiente, sendo

descartado o sobrenadante. Em seguida, adicionou-se 300 µL de etanol 70% gelado, agitando

levemente para levantar o sedimentado e centrifugado novamente a 1800 x g por 3 minutos, a

temperatura ambiente, sendo descartado o sobrenadante por inversão. As amostras foram

secas em câmara de fluxo laminar por 1 hora e ressuspensadas em 50 µL de tampão 0,01

mol/L Tris HCl e armazenadas em freezer a –20o C.

A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose 1,2%, pela comparação com

padrões de DNA de concentração conhecida (Figura 5).

FIGURA 5 Quantificação do DNA das amostras, PA – Prata-anã não variante, P1, P2 e P3

pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in vivo) caneleta 9 marcador de peso (5 ng/µL). Eletroforese horizontal em gel de agarose 1,2%, corrida a 100 volts por 25 minutos.

PA PI PII PIII PA PI PII PIII

1 2 3 4 5 6 7 8 9

MP

31

A corrida ocorreu a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L

Tris pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por 25 minutos. Após a eletroforese, o gel foi incubado

em solução de brometo de etídio (0,5 µg/mL) por 15 minutos, lavado por 10 minutos em água

corrente, sendo visualizado sob luz ultravioleta e fotografado em equipamento EDAS 290

(Kodak®).

De posse das concentrações reais de cada amostra, aproximadamente 50 ng/µL, o

DNA foi diluído (5x) em água de mili-Q até a concentração de trabalho de 10 ng/µL, sendo

tanto a solução estoque e a de trabalho mantidas a 4 °C.

3.4 Oligonucleotídeos (“primers”) utilizados

Os primers utilizados foram diluídos segundo protocolo de Ferreira e Grattapaglia

(1998). Baseados em informações contidas nos folhetos explicativos destes kit de primers,

adicionou-se em volume (µL) de tampão TE, a quantidade em µg de cada primer utilizado

(Tabela 2).

TABELA 2 Dados do primers utilizados (Oligonucleotideos Data Sheet, QIAGEN®).

Código 5’ - 3’ Peso Molecular pmoles µg/tubo

OPH-13 GACGCCACAC 2982 5267 16

OPJ-04 CCGAACACGG 3013 5056 15

OPJ-10 AAGCCCGAGG 3062 4864 15

OPJ-13 CCACACTACC 2917 5656 16

OPP-05 CCCCGGTAAC 2973 5616 17

OPP-06 GTGGGCTGAC 3084 5267 16

OPP-08 ACATCGCCCA 2957 5415 16

OPP-09 CTGGTCCGCA 3044 5495 17

OPP-17 TGACCCGCCT 2964 6015 18

OPN-01 CTCACGTTGG 3019 5656 17

OPN-02 ACCAGGGGCA 3062 4864 15

OPN-03 GGTACTCCCC 2964 6015 18

OPN-05 ACTGAACGCC 2997 5194 16

OPN-07 CAGCCCAGAG 3022 5058 15

OPN-13 AGCGTCACTC 2988 5533 17

Continua…

32

Continuação...

OPN-17 CATTGGGGAG 3108 4894 15

OPN-19 GTCCGTACTG 3019 5656 17

OPN-20 GGTGCTCCGT 3035 5876 18

OPM-02 ACAACGCCTC 2957 5415 16

OPM-04 GGCGGTTGTC 3075 5616 17

OPM-05 GGGAACGTGT 3108 4894 15

OPM-07 CCGTGACTCA 2988 5533 17

OPM-12 GGGACGTTGG 3124 5058 16

OPM-13 GGTGGTCAAG 3108 4894 15

OPM-14 AGGGTCGTTC 3059 5415 17

OPM-19 CCTTCAGGCA 2988 5533 17

OPU-06 ACCTTTGCGG 3019 5656 17

OPU-08 GGCGAAGGTT 3108 4894 15

Deste estoque básico preparou-se um estoque de trabalho fazendo-se uma diluição de

1:200 (2 µL da solução de primer 1 µg/µL e 398 µL de água de mili-Q) para se obter uma

concentração final de 5 ng/µL. No ensaio RAPD foram utilizados 3 µL deste estoque de

trabalho por reação, ou seja, uma quantidade final de 15 ng.

3.5 Amplificação via RAPD

Moléculas de DNA foram isoladas de todos os cultivares variantes e não variantes

utilizados no trabalho sendo testados os diferentes primers RAPD (série Operon) visando a

diferenciação molecular das plantas normais em relação as variantes.

O volume final de cada reação de amplificação foi 10 µL contendo 10 ng de DNA, 20

nmol/L Tris-HCl pH 8,4, 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol/L MgCl2, 50 µmol/L de cada um dos

dNTPs, 0,25 µmol/L do primer RAPD correspondente e 0,5 unidades (U) de enzima Tag

DNA polimerase. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador modelo

Mastercycler (Eppendorf, Hanburg, Germany), utilizando-se um programa com desnaturação

inicial a 95 °C por 1 minuto, seguido por desnaturação 94 °C por 10 segundos, anelamento a

36 °C por 1 minuto e extensão a 72 °C por 2 minutos. Os passos da desnaturação, anelamento

e extensão foram repetidos 34 vezes e, em seguida, a reação foi finalizada por uma extensão a

72 °C por 7 minutos. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose 1%

(m/v), com eletroforese a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L ta

33

pH 8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por 2 horas. Após a eletroforese em solução de brometo de

etídio (0,5 µg/mL) por 20 minutos, lavado em água corrente por 10 minutos, sendo

visualizado sob luz ultravioleta e fotografado no equipamento EDAS 290 (Kodak®).

3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Visando a diferenciação morfológica precoce de plantas cultivadas ‘Prata-anã’ não-

variante e variantes in vitro e in vivo, realizou-se cortes a mão livre em folhas destes

explantes, previamente lavadas em água corrente. Os cortes foram com largura e altura

máximos de 2 cm. As amostras assim obtidas foram imersas em solução fixativa Karnovisk’s

modificado: glutaraldeído 2,5%, formaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio 0,05M, pH

7,8 por um período de 24 horas. Em seguida, foram lavados em tampão cacodilato (três vezes

de 10 min), pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio 1% em água por 1 hora e

subseqüentemente lavados 3 vezes em água destilada, seguida da desidratação em uma série

de acetona (25, 50, 75, 90 uma vez cada e 100% por três vezes). Posteriormente, as amostras

foram levadas para o aparelho de ponto crítico para completar a secagem. Os espécimes

obtidos foram montados em suportes de alumínio stubs, com fita de carbono dupla face

colocada sobre uma película de papel alumínio, cobertos com ouro e observados em

microscópio eletrônico de varredura LEO EVO 40XVP. Diversas imagens para cada amostra

foram geradas e registradas digitalmente, a aumentos variáveis, nas condições de trabalho de

20 Kv e distância de 9 mm.

A freqüência estomática, baseou-se em 10 micrografias de diferentes áreas foliares

da superfície abaxial, observando-se a média entre o número das plantas variantes e não-

variantes in vitro. Para cada planta, foram determinadas os diâmetros polar e equatorial de 20

estômatos tomados aleatoriamente, segundo metodologia proposta por Boeger e Wisniewski

(2003). Para aferição dos diâmetros, foi utilizado o software LEO-32 v 4.0 2003.

Os resultados obtidos nessas avaliações foram submetidos à análise de variância e as

médias comparadas através do teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

34

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 O Ciclo Celular da Bananeira ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais

Os resultados do estudo do ciclo celular de plantas apresentando variação somaclonal

não revelaram alto índice de alterações significativas, como pontes cromossômicas, migrações

tardias e cromossomos desprendidos, que pudessem comprometer a divisão celular dessas

plantas. Porém, algumas células em divisão, demonstraram cromossomos desprendidos da

placa metafásica (Figura 6B) e anáfases em pontes (Figura 6D). Embora a freqüência destas

anormalidades tenha sido baixa, a mesma poderia acarretar mixoploidias, podendo as plantas

tanto variantes como não variantes apresentar vários números cromossômicos (x=9, 10 e 11).

FIGURA 6 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã não-

variante (in vitro): (A) Placa metafásica normal, ao centro; (B) Placa metafásica com cromossomo desprendido, ao centro; (C) Anáfase; (D) Ponte anafásica, como cromossomos prendidos.

A B

C D

35

Algumas metáfases C (metáfases que somente poderiam ser observadas com a

utilização de um antimitótico como a colchicina) também puderam ser notadas como pode ser

visto nas figuras 7B, 7C e 7F.

FIGURA 7 Fases do ciclo celular de meristemas radiculares de bananeira Prata-anã variantes

(in vitro): (A) PI - Placa metafásica normal, acima e anáfase, abaixo; (B) PI – Metáfase C, ao centro; (C) PII – Metáfase C, ao centro; (D) PII – Placa metafásica, ao centro; (E) PIII - Placas metafásicas; (F) PIII – Metáfase C.

A B

C D

E F

36

O delineamento do citoplasma em relação aos cromossomos, constitui um fato que

corrobora a adequação da técnica de coloração de Feulgen (Schiff) em comparação a Orceína

Acética 2% adotada por Shepherd (1999).

Román et al. (2005), em estudos com clones triplóides dos subgrupos ‘Plantain’ e

‘Bluggoe’ (grupo ABB) confirmaram o tamanho relativamente pequeno dos cromossomos e

também a estabilidade numérica nestes clones. No entanto, Giménez et al. (2001), em estudo

citogenético de um variante somaclonal de banana (CIEN BTA-03) resistente a Sigatoka

Amarela demonstraram um aumento no número cromossômico como evento mutagênico

significante.

Segundo Souza, Costa e Souza (1998), as variações somaclonais são influenciadas

tanto por fatores intrínsecos, a exemplo da instabilidade genética da cultivar, como

extrínsecos, no que diz respeito ao meio de cultura, número de subcultivos, tipo e grau de

diferenciação dos explantes utilizados. Possivelmente a associação entre esses fatores ou sua

atuação de forma isolada, podem ter favorecido a alteração das bases genéticas, acarretando

mudanças no cariótipo como aneuploidia, poliploidia e mixoploidias; mudanças associadas a

rearranjos cromossômicos, como translocações, deleções e inversões; rearranjos de genes

somáticos; amplificação gênica, assim como crossing over. Nenhuma dessas modificações

puderam ser observadas nos materiais estudados no presente trabalho.

4.2 Sincronização do Ciclo Celular da ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais

O número de metáfases não foi significante em comparação às metáfases encontradas

sem a utilização de antimitóticos e hidroxiuréia. Ressalta-se no entanto, que utilizou-se

somente de um tratamento de 15 horas, sabendo-se que um ciclo celular pode ter 24 horas

com a mitose ocorrendo em mais ou menos 1 hora em eucariotos.

Dentre as concentrações de 8-hidroxiquinoleína utilizadas, a concentração de 0,03%

(Shepherd, 1999) foi a que se mostrou mais eficiente, mesmo se comparada a diferentes

concentração da mesma (0,003% e 0,3%), e estas em associação a ciclohexamida (25 mg/L) e

em comparação com a colchicina (0,05%). Ao se realizar um pré-teste de tratamento com a

colchicina verificou-se uma total oxidação das radículas, bem como a menção do potencial

condensativo da mesma. Neste último caso, o que se espera de cromossomos tão pequenos é

uma descondensação e espalhamento para facilitar a contagem e a observação dos mesmos.

Os resultados do experimento de sincronização demonstraram que o melhor

espalhamento ocorreu com o material não variante (Figura 8A) em todos os cromossomos da

planta variante apresentaram-se mais condensados, como os observados na figura 8B.

37

FIGURA 8 Micrografia digital do meristema radicular de bananeiras Prata-anã (in vitro): (A)

PA - não variante onde observamos um bom espalhamento dos cromossomos; (B) PI – variante, notam-se ainda algumas sobreposições de cromátides.

De acordo com Torres, Davide e Bearzoti (2003), uma das dificuldades encontradas

em estudos citogenéticos é a baixa taxa de divisão celular dos meristemas radiculares de

algumas plantas. Tal obstáculo é superado, em alguns casos, com o uso de bloqueadores de

mitose, que propiciam o acúmulo de células em metáfase, bem como a individualização dos

cromossomos. No entanto, muitas vezes os índices metafásicos obtidos ainda não são

satisfatórios para análises mais detalhadas, fato observado neste trabalho.

Altos índices mitóticos e metafásicos tem sido obtidos em células de ponta de raiz de

várias espécies por meio de sincronização do ciclo celular com hidroxiuréia (HU). Esse

composto inibe de forma reversível a produção de desoxirribonucleotídeos, impedindo a

síntese de DNA e, portanto, bloqueando o ciclo na interfase. Após remoção da HU, o ciclo

prossegue normalmente, com um número elevado de células em sincronia (PAN et al., 1993

apud TORRES, DAVIDE e BEARZOTI, 2003).

Segundo Woloszyn, Golczyk e Joachimiak (2001), a hidroxiuréia deteve grandes

frações de células de Alliun cepa L. em sincronizações nas fase sucessivas como G1 e G2,

com um tratamento de 13 horas. Navarrete, Pérez-Villamil e López-Sáes (1979), mencionam

um tratamento de 8 horas, revelando também uma ação mais eficiente da hidroxiuréia sob a

fase G2 do que G1. Lendvai et al. (2002), obtiveram sucesso com um tratamento de 3 horas

para a fase S e um tratamento de 9-12 horas para a fase G2. Neste caso, observa-se que o

tratamento não foi adequado a cultivar Prata-anã variantes e não variantes, sugerindo talvez

novos testes e adequações do tempo de exposição e/ou recuperação das amostras.

De acordo com Guimarães (2005), utilizou-se os seguintes critérios na avaliação da

qualidade das lâminas preparadas: espalhamento das células na lâmina, presença de

citoplasma circundando os cromossomos, definição dos núcleos interfásicos, espalhamento e

A B

38

definição dos cromossomos. Ainda assim, a contagem e as tentativas de elaboração de um

cariótipo não foram possíveis.

4.3 Morfometria das Placas Metafásicas de ‘Prata-anã’ e suas Variantes Somaclonais

Como não foi possível construir o cariótipo da cultivar ‘Prata-anã’ e de suas variantes

somaclonais devido ao tamanho muito pequeno dos cromossomos. Afim de se estabelecer

uma possível diferença na distribuição equatorial dos cromossomos de PA, PI, PII e PIII,

mediu-se o comprimento das placas metafásicas (Figura 9) oriundas do estudo de ciclo

celular.

Os resultados obtidos entre o comprimento médio das placas metafásicas foram:

‘Prata-anã’não variante (PA) 5,44 µm - ab; variante somaclonal 1 (PI) 5,36 µm - ab; variante

somaclonal 2 (PII) 6,44 µm - a; e variante somaclonal 3 (PIII) 4,96 µm - b.

FIGURA 9 Meristema radicular de bananeira Prata-anã (in vitro), PII variante, notam-se claramente a organização metafásica dos cromossomos.

Os valores dos comprimentos médios das placas metafásicas não demonstraram

diferença significativa, afim de se estabelecer um marcador citogenético na diferenciação do

material não variante e variante somaclonal.

De acordo com Cuco et al. (2003), os procedimentos para preparações citológicas com

alta freqüência de metáfases para a análise de cariótipos de plantas dependem do

estabelecimento de uma rotina de obtenção de raízes apresentando meristemas com alto índice

mitótico. Aliado a isto, também é desejável a obtenção de preparações com alta freqüência de

metáfases apresentando cromossomos com morfologia nítida. Segundo Valárik et al. (2002),

um melhor conhecimento do cariótipo e estrutura dos cromossomos para a evolução em Musa

39

é necessário. Martina, Adeleke e Bosa (2002), concordam que os estudos individuais dos

cromossomos em bananeiras não estão bem identificados em estrutura e números de

complemento cromossômico.

Análises dos cromossomos de Musa tem sido complexas devido a dificuldades como

preparações citogenéticas com cromossomos pequenos (1 a 2 µm), sendo o genoma nuclear

delimitado em aproximadamente 600 Mpb, tendo cada cromossomo cerca de 50 Mpb de DNA

(DOLEZELOVA et al., 1998). Fatores como estes, segundo os mesmos autores impedem o

desenvolvimento de um cariótipo fiel em Musa e o desenvolvimento de um mapa citogenético

físico.

Osuji et al. (1998), relata que apenas um em 11 cromossomos por genoma de duas

espécies de Musa analisadas apresentou uma região 18S-25S rDNA reproduzível detectada

por hibridização in situ. Entre as espécies analisadas por estes mesmos autores, não foram

encontradas quaisquer correlações entre o número do cromossomo, tamanho do cromossomo

ou posição taxonômica, com número de regiões 18S-25S rDNA sendo evidentes.

4.4 Características Morfológicas ao Microscópio Eletrônico de Varredura

O número médio de estômatos, bem como os dados relativos aos diâmetros polar e

equatorial dos mesmos na cultivar Prata-anã não-variante e variante são apresentados na

(Tabela 3).

TABELA 3 Valores médios da freqüência estomática e medidas dos diâmetros polar e equatorial de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’.

Prata-anã

Número Médio de

Estômatos (mm2)

Diâmetro Polar

µm

Diâmetro Equatorial

µm

In vitro In vivo In vitro In vivo In vitro In vivo

PA - não variante 126,78a 159,51a 33,13a 31,38ab 34,83a 30,95b

PI - variante 1 110,11a 145,82a 30,99b 32,73a 28,17b 37,75a

PII - variante 2 108,92a 116,66a 28,80c 31,74ab 29,41b 33,32b

PIII - variante 3 64,28b 104,75b 28,12c 29,41b 34,83a 31,48b

*Médias seguidas de letras distintas diferem entre si pelo Teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

Como pode ser observado houve diferença significativa (p<0,01) entre a diâmetro

polar da ‘Prata-anã’ não variante e suas variantes in vitro. Verifica-se também que o número

40

médio de estômatos é relativamente menor nas plantas variantes somaclonais, porém sem

diferenças significantes.

Tanto as superfícies abaxiais quanto adaxiais apresentam ausência total de tricomas.

Porém, essas superfícies se distinguem quanto ao número de estômatos e a posição dos

mesmos em relação às células epidérmicas. A superfície adaxial apresenta um número

bastante reduzido de estômatos, e os mesmos parecem estar dispostos em um plano diferente

das células epidérmicas, demonstrando certa concavidade. No entanto, nenhuma dessas

características diferem nas plantas variantes das não variantes.

O estômato de todas as amostras foi classificado como do tipo anomocítico ou de

células irregulares, em que as células circundantes são em número indefinido e não diferem

das outras células epidérmicas (Figura 10).

FIGURA 10 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã não-variante in vitro (A) e in vivo (B) e ‘Prata-anã’ variante in vitro (C) in vivo (D).

De acordo com Faria et al. (2000), fatores ambientais podem alterar, dentro de certos

limites, o número de estômatos por unidade de área foliar, fato este comprovado por Ferris e

Taylor (1994) relacionando mudanças na anatomia foliar, como a densidade estomática, por

incrementos de CO2 atmosférico.

A C

B D

41

Na micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã não-

variante (Figura 11A), observa-se os estômatos do tipo anomocítico, enfileirados de maneira

uniforme, enquanto na superfície abaxial da cultivar Prata-anã variante(Figura 11B), os

estômatos são distribuídos de maneira menos uniforme, sendo a cera bastante desenvolvida.

FIGURA 11 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã

não-variante (A) e variante (B) ambas in vivo.

A descamação de cera é evidente somente nas plantas variantes de ambos os materiais

(in vitro e in vivo) podendo atuar dessa forma como marcador morfoanatômico.

Fica evidente ao observar esse processo evaginativo da abertura estomática nas

bananeiras ‘Prata-anã’ variantes (Figura 12B e 12C) em relação às não variantes (Figura

12A). Isso se deve, possivelmente, a algum processo fisiológico acarretado pelas mudanças na

membrana plasmática das células guarda e/ou mudanças na área de superfície do tonoplasto

dessas células.

Na cultivar Prata-anã não-variante in vivo quanto in vitro, confirmou-se também o

estômato do tipo anomocítico (Figura 12). Nota-se uma evaginação da abertura estomática e a

cera bastante desenvolvida.

A

B

42

FIGURA 12 Micrografia eletrônica de varredura da superfície abaxial da cultivar Prata-anã

não-variante (A) e variantes (B) e (C) todas in vitro.

De acordo com Albert e Filho (2002), a cutícula foliar tem componentes hidrófobos

(cera), semi-hidrófobos (cutina) e hidrófilos (pectinase e celulase). A cutícula em condições

áridas funciona como uma membrana extracelular em toda a área foliar promovendo uma

barreira entre a planta e o meio ambiente, agindo primariamente como uma barreira contra a

evaporação excessiva (CAMERON, TEECE e SMART, 2006).

Segundo Marcus, Moore e Cyr (2001), a ativação da bomba de prótons nas células

guarda, acarreta o influxo de K+, atuando na abertura dos canais voltagem porta K+ e,

A

B

C

43

conseqüentemente, na entrada de água via osmose. Estes mesmos autores demonstram

algumas possibilidades envolvidas na abertura e fechamento do estômato e/ou a transdução de

sinal para percepção da ativação da bomba de prótons, podendo estar relacionados com os

microtúbulos.

Simmonds (1949), verificou o efeito da poliploidia em famílias de “seedlings”

produzidos por retrocruzamento de três híbridos diplóides, obtidos por cruzamentos de duas

espécies diplóides. Alguns pentaplóides foram produzidos e apresentavam estômatos maiores

e densidades menores que os triplóides. Por sua vez os triplóides possuíam estômatos um

pouco maiores que os diplóides. Além da contagem do número de cromossomos, a análise dos

estômatos mostrou ser uma boa medida do grau de poliploidia das plantas.

Endoploidias produzem elevadas quantidades de DNA nuclear resultando em

conseqüentes duplicações da replicação original, ou 2C, representando o nível de ploidia

(MELARAGNO, MEHROTRA e COLEMAN, 1993). Estes mesmos autores encontraram em

células epidérmicas pavimentosas de caule e folha de Arabidopsis thaliana, endoploidias

como sendo comuns, mas não universais. Cerca de aproximadamente 29% (58 de 202 células)

das células epidérmicas pavimentosas de caule e folha, tinham núcleo com 2C em nível de

DNA, sendo os níveis de ploidia diferenciados em proporção aproximada de 2C, 25%; 4C,

28%; 8C, 37%; 16C, 10%, nestas mesmas células.

Estudos com citometria de fluxo realizados por Guimarães (2005), apresentaram

resultados mostrando que a quantidade de DNA é extremamente variável entre os indivíduos

(variantes e não variantes somaclonais). O mesmo trabalho revelou que não houve um padrão

de quantidade maior ou menor em um ou outro tipo de planta. A distribuição daquelas plantas

com mais ou menos quantidade de DNA no núcleo foi totalmente aleatória, não sendo

portanto, a citometria uma técnica eficiente para a distinção dos indivíduos da cultivar Prata-

anã que possuem a característica gigantismo como variante somaclonal.

Para Gao et al. (2005), o total do volume vacuolar das células guardas também muda

rapidamente durante o movimento estomático. A mudança do volume vacuolar tinha sido

implicado em uma maior contribuição da mudança de volume da célula guarda.

De acordo com Gao et al. (2005), mudanças no volume das células guarda são

acompanhados por mudanças na membrana plasmática e na área de superfície do tonoplasto.

Em algumas plantas, a membrana plasmática e a área de superfície do tonoplasto das células

guarda podem estar aumentadas 1,5 vezes o original durante a abertura estomática (BLATT,

2002 apud GAO et al., 2005).

Segundo Cameron, Teece e Smart (2006), as ceras cuticulares consistem de séries

homólogas de longas cadeias de ácidos graxos, álcoois, aldeídos, alcanos, ésteres e compostos

44

orgânicos cíclicos. Estes concordam com outros autores ao afirmar uma correlação indicando

que o aumento da cera reduziria a condutância epidérmica de algumas plantas. Da mesma

forma a diminuição da cera aumentaria a condutância.

Vários autores também relacionam o aumento da cera com a idade da planta. Ao se

comparar o incremento de cera entre as células epidérmicas de Eucalyptus regnans F. Muell,

verificou-se oclusões da câmara estomática e aumento relacionado a idade e altura da árvore

(ENGLAND e ATTIWILL, 2006)

Tornam-se necessários, pois, estudos fisiológicos a cerca da real causa desta

protuberância da abertura estomática, assim como a correlação do por que isso não ocorre

com as bananeiras variantes in vivo.

4.5 Marcadores RAPD na diferenciação de Variantes Somaclonais

No presente trabalho, procurou-se identificar variantes somaclonais de bananeiras

‘Prata-anã’ mediante o uso de marcadores RAPD. Foram testados 28 oligonucleotídeos, os

quais estão relacionados na Tabela 4, com seus respectivos resultados.

TABELA 4 Relação do número de produtos amplificados para cada oligonucleotídeo

utilizado (Oligonucleotídeos Data Sheet, QIAGEN®).

Oligonucleotídeo 5’ - 3’ Número de produtos amplificados

OPH-13 GACGCCACAC 13

OPJ-04 CCGAACACGG 09

OPJ-10 AAGCCCGAGG 09

OPJ-13 CCACACTACC 06

OPP-05 CCCCGGTAAC 05

OPP-06 GTGGGCTGAC 06

OPP-08 ACATCGCCCA 09

OPP-09 CTGGTCCGCA 11

OPP-17 TGACCCGCCT 07

OPN-01 CTCACGTTGG 03

OPN-02 ACCAGGGGCA 06

OPN-03 GGTACTCCCC 06

OPN-05 ACTGAACGCC 06

Continua…

45

Continuação...

OPN-07 CAGCCCAGAG 07

OPN-13 AGCGTCACTC 04

OPN-17 CATTGGGGAG 06

OPN-19 GTCCGTACTG 05

OPN-20 GGTGCTCCGT 07

OPM-02 ACAACGCCTC 05

OPM-04 GGCGGTTGTC 08

OPM-05 GGGAACGTGT 10

OPM-07 CCGTGACTCA 08

OPM-12 GGGACGTTGG 07

OPM-13 GGTGGTCAAG 08

OPM-14 AGGGTCGTTC 02

OPM-19 CCTTCAGGCA 04

OPU-06 ACCTTTGCGG 06

OPU-08 GGCGAAGGTT 07

A maioria dos fragmentos amplificados não apresentaram polimorfismos que

diferenciassem a ‘Prata-anã’ não variante (PA) de suas variantes somaclonais (PI, PII e PII).

Curiosamente alguns primers se comportaram diferentemente entre as plantas in vitro e in

vivo apesar de ambos serem oriundos da micropropagação.

O primer OPJ-04 (5’-CCGAACACGG-3’), mencionado por Damasco et al. (1996),

não apresentou bandas polimórficas para o material in vitro (Figura 13), porém conseguiu

distinguir a PA in vivo das demais variantes também in vivo. O que nos remete que a

característica relativa ao tamanho da planta, nanismo, apresentada por estes autores não se

relaciona diretamente com o gigantismo ocorrente nas plantas variantes somaclonais de

‘Prata-anã’.

46

Figura 13: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (1g agarose + 1µL de brometo de

etídeo + 100mL de TAE 1X), corrida a 100 volts em TAE 1X por 1:20 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPJ-04, PA – Prata-anã não variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro), 5-8 (in vivo) e caneleta 9 controle negativo (H2O).

O mesmo resultado ocorreu ao utilizarmos o primer OPM-13 (5’-GGTGGTCAAG-

3’), onde visualizamos perfeitamente a intensidade da banda polimórfica presente na PA in

vivo e ausente nas demais variantes também in vivo (Figura 14). Observou-se também uma

banda presente em todas plantas in vivo e ausente em todas plantas in vitro.

Figura 14: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por

1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPM-13, PA – Prata-anã não variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in

vivo).

A diferenciação entre as plantas in vitro e in vivo não era esperada para esta pesquisa,

no entanto, assim como no resultado obtido com o primer OPM-13, testes com o primer OPH-

PA PI PII PIII PA PI PII PIII

1 2 3 4 5 6 7 8

PA PI PII PIII PA PI PII PIII

1 2 3 4 5 6 7 8 9

C

OPJ-04

OPM-13

in vitro in vivo

in vitro in vivo

47

13 (5’-GACGCCACAC-3’), apresentaram bandas polimórficas que diferenciassem também a

procedência dessa cultivar em (Figura 15).

Figura 15: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por

1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPH-13, PA – Prata-anã não variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in

vivo).

O primer OPN-05 (5’-ACTGAACGCC-3’) apresentou um polimorfismo que diferiu o

a ‘Prata-anã’ não variante das variantes in vitro (Figura 16). Este mesmo primer apresentou

também polimorfismos que diferenciaram as plantas PA e PI de PII e PIII, todas in vitro, bem

como a PIII in vitro das demais.

Figura 16: Eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corrida a 100 volts em TAE 1X por

1:45 h. Bandas obtidas utilizando-se o primer OPN-05, PA – Prata-anã não

PA PI PII PIII PA PI PII

1 2 3 4 5 6 7 8

PA PII PIII PA PI PII PIII

1 2 3 4 5 6 7 8

PI

PIII

in vitro in vivo

OPH-13

in vitro in vivo

OPN-05

48

variante, PI, PII e PIII pratas-anãs variantes. Canaletas 1-4 (in vitro) e 5-8 (in

vivo).

Sendo que as condições de amostragem do material in vitro e in vivo ocorreram em

dias diferentes, apresentamos os resultados aqui obtidos como possíveis localizadores de

diferenças genotípicas. A sensibilidade da técnica por marcadores moleculares tipo RAPD

demonstra uma possível mutação de bases (inserção, deleção, alteração) que pode estar

acontecendo durante o processo de aclimatação das plantas.

Este fato mostra-se coerente com os resultados de Guimarães (2005), que sugere que

os variantes somaclonais, para características gigantismo, das bananeiras ‘Prata-anã’ não

ocorrem de maneira uniforme no genoma.

Guimarães (2005), utilizou 103 oligonucleotídeos na tentativa de diferenciar ‘Prata-

anã’ de ‘Prata’ (comum) e variantes somaclonais, e obteve com estes 188 bandas visualizadas

sem nenhum polimorfismo encontrado. Este mesmo autor revela que o primer OPW-08

forneceu um padrão específico de uma ‘Prata-anã’variante diferente das demais e da não

variante, discordando de Gomes (2002) apud Guimarães (2005), que sugeriu o primer OPW-

08 para distinguir as plantas ‘Prata’ daquelas ‘Prata-anã’. De acordo com Crouch, Vuylstake e

Ortiz (1998), a análise RAPD apresenta muitas desvantagens incluindo a dominância natural

do marcador sistêmico e problemas de reprodutividade. Os resultados encontrados com o

primer OPJ-04 não puderam ser reproduzidos com respectiva fidelidade comprovando um

problema com este marcador.

Segundo Crouch et al. (2000), acessos de banana apesar de exibirem características

morfológicas diferentes, apresentam estabilidade genética ao decorrer de seu genoma.

Assumindo que a análise por RAPD é sensível a mudanças durante a amplificação em PCR

(polimerase chain reaction). Entretanto, eles encontraram, em comum com vários autores,

resultados confiáveis gerados por protocolos precisos e controle estrito para aprimoramento

dos protocolos, replicando os ensaios ambíguos e interpretações em série dos resultados.

Para Vidal e García (2000), o sucesso do uso de marcadores RAPD requerem

conhecimento de fatores que influenciam na amplificação do DNA. Williams et al. (1993

apud VIDAL e GARCÍA, 2000), indicaram que o conteúdo de G + C no primer e o

comprimento elevado destes influenciam nos produtos obtidos da amplificação pela análise

RAPD.

Ferreira et al. (2004), utilizando 21 primers aleatórios, obteve 150 fragmentos (não

discriminados em polimórficos e monomórficos) ao utilizar a análise por RAPD em duas

cultivares diplóides híbridas (0323-03 e 4279-06) resistentes a Sigatoka Amarela e Negra.

49

Esta distinção ocorreu em estimativas de dissimilaridade genética proposta por estes autores e

comprovou a pequena distância entre os mesmos.

Kahangi, Lawton e Kumar (2002) diferenciaram 5 grupos genômicos AA, AB, AAA,

AAB e ABB, através de 10 primers, por análise RAPD, afim de descobrir que grupo

genômico prevalecia entre os cultivares kenianos. Onguso et al. (2004), analisou 20 cultivares

de Musa usando 25 primers decameros, assumindo que quando a variação entre as cultivares é

alta, o uso de poucos primers é suficiente, fato que justificou a utilização de 28

oligonucleotídeos neste trabalho, contudo, não impede que novos primers possam ser testados

ou avaliados.

50

5 CONCLUSÕES

Os resultados do estudo do ciclo celular não revelaram quaisquer alterações

significativas que pudessem comprometer a divisão celular dessas plantas. Porém, algumas

células em divisão demonstraram cromossomos desprendidos da placa metafásica e anáfases

em pontes. O tratamento com hidroxiuréia não apresentou quantidades suficientes de

metáfases em comparação com o experimento de ciclo celular.

O comportamento citogenético das bananeiras ‘Prata-anã’ in vitro, não diferenciaram

quanto a materiais variantes e não variantes. O comprimento das placas metafásicas também

não forneceu dados adequados para esta distinção.

O diâmetro polar dos estômatos mostrou-se como um bom marcador morfológico

diferenciando o material in vitro, porém o mesmo não foi observado com as amostras in vivo.

A maior quantidade de cera presente nas plantas variantes tanto in vitro como in vivo,

demonstram também a possibilidade de serem marcadores morfoanatômicos. Porém, tornam-

se necessários estudos fisiológicos que expliquem o processo de evaginação da abertura

estomática observada nas plantas variantes in vitro.

Os primers OPJ-04 e OPM-13 apresentaram bandas polimórficas que diferenciaram a

planta não variante material in vivo. Por outro lado o primer OPN-05 diferiu todas as plantas

variantes in vitro da não variante. Como observado, conclui-se que o material in vitro e in

vivo podem ser diferenciados através de alguns marcadores RAPD, como os primers: OPM-13

e OPH-13.

51

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fisiológico in vitro de bananeira (Musa sp., AAA e AAB) cvs. Nanica e Prata anã: influência

de diferentes níveis de potássio. Scientia Agricola. Piracicaba, v. 56, n. 2, p. 397-406, 1999.

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APÊNDICE

Página

TABELA 1A Resumo das análises de variância para o comprimento médio (CM) das placas metafásicas de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’ ..................................................................................................

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TABELA 2A Resumo das análises de variância para a freqüência estomática (FE) na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’..................................................................................................

61

TABELA 3A Resumo das análises de variância para as medidas de diâmetro polar (DP) de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’...............................................................

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TABELA 4A Resumo das análises de variância para as medidas de diâmetro equatorial (DE) de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’...............................................................

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TABELA 1A Resumo das análises de variância para o comprimento médio (CM) das placas

metafásicas de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’.

QM

FV GL CM

Comprimento 3 3,961**

Erro 36 0,880

Total 39

CV (%) 16,90

* e **, significativos a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente pelo Teste F.

TABELA 2A Resumo das análises de variância para a freqüência estomática (FE) na

epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de bananeira ‘Prata-anã’.

QM

FV GL FE

in vitro in vivo

Densidade 3 202,225** 178,066*

Erro 36 8,008 52,094

Total 39

CV (%) 16,42 32,65

* e **, significativos a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente pelo Teste F.

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TABELA 3A Resumo das análises de variância para as medidas de diâmetro polar (DP) de

estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de

bananeira ‘Prata-anã’.

QM

FV GL DP

in vitro in vivo

Diâmetro 3 130,136** 38,699*

Erro 76 5,965 12,263

Total 79

CV (%) 8,07 11,18

* e **, significativos a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente pelo Teste F.

TABELA 4A Resumo das análises de variância para as medidas de diâmetro equatorial (DE)

de estômatos na epiderme abaxial de plantas não-variantes e variantes de

bananeira ‘Prata-anã’.

QM

FV GL DE

in vitro in vivo

Diâmetro 3 235,247** 190,552**

Erro 76 8,644 17,415

Total 79

CV (%) 9,26 12,50

* e **, significativos a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente pelo Teste F.