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Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010 1

CURSO 2009-2010


Práctica 1. El microscopio óptico.

Objetivo

Aprender a usar correctamente el microscopio óptico compuesto, familiarizándose con sus

componentes y con diferentes métodos de medición, mediante el estudio cualitativo y cuantitativo de

distintas preparaciones microscópicas.

Introducción

Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta útil en el desarrollo científico. Aunque

las lentes de aumento han sido conocidas a lo largo de la historia, no fue hasta la llegada del moderno

microscopio compuesto (s. XVII-XVIII) cuando este instrumento comenzó a ser aplicado al estudio biológico.

Si para la mayoría de biólogos, el microscopio es una herramienta de trabajo importante, para los biólogos

celulares es indispensable.

El microscopio compuesto está formado por dos elementos; un sistema primario de lentes de

aumento y un segundo sistema de lentes, similar a un telescopio. La luz es forzada a pasar a través de la

muestra y es enfocada con los sistemas de lentes primarias y secundarias. Si reemplazados la fuente de luz

por una fuente de electrones, el microscopio se convierte en un microscopio electrónico de transmisión. Si la

luz es proyectada sobre la muestra y los sistemas de lentes captan la luz rebotada por la muestra el

microscopio se convierte en un microscopio quirúrgico. Si son electrones los que son proyectados sobre la

muestra, barriendo su superficie hablamos de un microscopio electrónico de barrido.

La función de un microscopio es mejorar la resolución del ojo humano. El microscopio se usa para

ampliar una imagen de un objeto de forma que podamos observar detalles que serían imposibles de

observar a simple vista por el ojo humano. A causa de esta ampliación, la resolución se confunde a menudo

con la magnificación o aumento que se refiere al tamaño de la imagen. En general, a mayor magnificación

mayor resolución; aunque ésto no siempre es cierto. Hay limitaciones de carácter práctico en el diseño de

las lentes que pueden resultar en un incremento de la magnificación sin incrementar la resolución.

Considerando la figura 1.1, si una imagen de una célula es aumentada desde 10x a 45x, la imagen

es más grande; pero no necesariamente más nítida. La imagen de la izquierda está aumentada sin mejorar

la resolución, mientras que la imagen de la derecha tiene los mismos aumentos, pero la resolución ha

mejorado. Cuando la imagen es aumentada 10 veces (desde 10x a 100x) es imposible usar la imagen de la

izquierda; sin embargo, la imagen de la derecha nos da una información más detallada. Sin resolución la

cantidad de detalles observables es fija y, a pesar de incrementar el tamaño de la imagen, no se observan

más detalles. En este punto se alcanza el límite de resolución o poder de resolución de las lentes

objetivo (u objetivo). Esta propiedad de los objetivos viene fijada por su diseño y construcción. Para cambiar

la resolución, la única solución a menudo es usar objetivos diferentes.


La razón de la dicotomía entre magnificación y poder de resolución es la capacidad del ojo

humano para diferenciar entre dos objetos próximos. Es necesario que dos objetos estén separados 0,1

mm, aproximadamente, cuando los mantenemos a 25 cm de los ojos para poder detectarlos como objetos

diferentes. Si están a menos de 0,1 mm los percibimos como un único objeto. Si los dos objetos están

separados 0,01 mm no podremos discriminarlos como dos objetos; a menos que aumentemos su imagen

por 10x, con lo que hemos alterado eficazmente nuestra capacidad de resolución desde 0,1 mm a 0,01 mm

o, inversamente, nuestro poder de resolución a aumentado en un factor de 10.

Figura 1.1. Magnificación frente a resolución.

Así pues, una lente puede aumentar una imagen sin incrementar la resolución. Varios artefactos

pueden ser inherentes al diseño de las lentes, provocando que el objeto aparezca con los límites

desdibujados. Por lo que, incluso si aparecen separados 0,1 mm, los límites están tan desdibujados que

perdemos la capacidad de diferenciar ambos objetos. Al igual que nos sucede al observar los optotipos

oftalmológicos; podemos intuir las letras al incrementar el tamaño pero somos incapaces de identificarlas

correctamente.

Generalmente, se habla de la idoneidad de los objetivos microscópicos en términos de su

magnificación o aumentos; mientras que el valor más importante es su resolución. Todos los

Sólo magnificación Magnificación y resolución


microscopios poseen un objetivo que puede aumentar por 40x el tamaño normal de una muestra; pero sólo

un objetivo de buena calidad permite observar correctamente una muestra.

Como se ha mencionado el valor de la resolución puede ser determinado de dos formas:

1. La distancia más pequeña entre dos puntos, que permite observarlos como distintos. Con esta

medida, conforme disminuye la distancia aumenta la resolución. Hay una correlación inversa

entre el límite de resolución (Formula de Abbe) y lo que de hecho se resuelve:

Límite de resolución = (0,61·λ)/AN

2. Para cambiar esta fórmula a una correlación directa, se necesita sólo el reciproco del límite de

resolución. El poder de resolución es inversamente reciproca al límite de resolución. Así, la

resolución aumenta conforme aumenta la distancia. Consecuentemente, en la mayoría de

microscopios hoy en día usan la resolución, en lugar del límite de resolución, para indicar la

calidad de sus objetivos.

Poder de resolución = AN/(0,61·λ)

El poder de resolución de los objetivos es una característica de sus propiedades físicas y de la

longitud de onda de la luz que pasa a través de sus lentes. Las propiedades físicas se resumen en un valor

conocido como apertura numérica (AN), mientras que la longitud de onda es determinada por el color de la

luz utilizada.

Apertura numérica (AN) = n·sen θ

Figura 1.2. Apertura numérica e índice de refracción.

La apertura numérica de una lente depende de dos parámetros. Del ángulo de incidencia de la luz

en la lente y del índice de refracción del material óptico de fabricación de la lente. La mitad del ángulo del

cono de luz incidente se designa por el símbolo θ . La mitad del ángulo de incidencia de la luz se usa para

calcular el ángulo de luz subtendida relativa al eje óptico del microscopio. El ángulo de incidencia de la luz y,


por tanto, θ pueden ser modificado por el condensador situado debajo de la platina. Si el condensador es

móvil, el ángulo de incidencia puede variarse; así, conforme el condensador está más cerca del objeto más

grande es el ángulo de incidencia de la luz. Tranduciéndose en una mejora de la resolución del microscopio.

Figura 1.3. Apertura numérica y ángulo de incidencia de la luz.

Las propiedades refractivas de un objetivo se resumen en un valor conocido como índice de

refracción (IR ó n). El índice de refracción está en función de la distorsión de la luz al pasar del aire a la

lente y viceversa. En un microscopio, el material de fabricación de la lente está especialmente formulado

para incrementar su índice de refracción; sin embargo, una vez fabricado esta propiedad no puede ser

cambiada. Aunque el medio alrededor del objetivo (lentes objetivo) si puede ser modificado; sustituyendo el

aire entre el objetivo y el portaobjetos por aceite de inmersión, con índice de refracción superior al del aire.

Considerando lo anterior, en la práctica la máxima resolución se puede aumentar optimizado de tres

formas:

a) El método más fácil es aumentar el ángulo de la luz incidente, alterando la posición y/o diseño

del condensador, situado debajo de la platina.

b) El índice de refracción puede ser mejorado mediante el uso de lentes especialmente fabricadas

y/o mediante el control del medio a través del cual pasa la luz, usando aceite de inmersión en

objetivos diseñados para este propósito.

c) Disminuir la longitud de onda de la luz usada. Por razones prácticas, la modificación de la

longitud de onda tiene mayor efecto sobre la resolución del microscopio que cambios en el

ángulo de incidencia de la luz (θ) o el índice de refracción (n).

En microscopía óptica de campo claro es conveniente trabajar en el rango de luz visible y la longitud de

onda más corta del espectro de luz visible es el azul. Por lo que, los microscopios incorporan un filtro azul

en su diseño; que se conoce como filtro de luz día, generalmente.

Aberraciones

Las distorsiones o aberraciones cromáticas y esféricas son inherentes al diseño de las lentes;

debido a que las lentes son esféricas y proyectan una imagen esférica. Sin embargo, la teoría óptica se

basa en imágenes planas. Además, las diferentes longitudes de onda de luz son refractadas distintamente;


la imagen esférica se distorsiona incluso en múltiples imágenes, debido a que cada longitud de onda forma

una imagen separada.

Una lente que está corregida para producir campos planos en vez de curvos se conoce como lente

“plan”, mientras que una lente corregida para campo plano y aberración cromática se denomina lente “plan

achromat”. Si la lente está corregida para aberraciones cromáticas para el rojo y azul, mientras que la

corrección esférica es sólo para el verde, es una lente “achromat”.

Angulo de incidencia

Aunque el ángulo θ puede ser alterado, hay un límite teórico a este ángulo que permite a la luz

pasar a la lente. Para cada objetivo hay una posición idónea del condensador; en la que se presenta la luz

al objetivo con un ángulo apropiado, permitiendo un máximo de intensidad de luz; mientras mantiene θ tan

grande como sea posible. En los microscopios buenos se puede ver el diafragma del condensador en el

campo de luz y permiten un ajuste preciso (vertical y horizontal) del condensador a su posición ideal. El

diafragma de iris se usa para corregir las aberraciones esféricas de las lentes y debe ser ajustado para

cada objetivo. No deben ser usados para controlar la intensidad de luz a menos que la resolución no sea

importante para el observador.

Alineación

Un uso correcto de un microscopio requiere que la óptica y la fuente de luz estén correctamente

alineadas en el eje óptico. Todas las correcciones de aberraciones dependen de una adecuada alineación

del microscopio. Generalmente, se usan dos técnicas para alinear el microscopio:

a) La primera, y quizás la principal, se conoce como

iluminación crítica. En este proceso una imagen de la

fuente de luz (filamento de la lámpara) es proyectada en el

plano del objeto, superponiéndose la imagen de la fuente

de luz en el objeto. Sin embargo, tiene la desventaja de que

exige el uso de una fuente de luz uniforme plana; lo que

realmente no es posible con el filamento de una lámpara de

tungsteno.

b) El segundo procedimiento de alineación es conocido como

iluminación Koehler y es el más común. En este

procedimiento, una imagen del diafragma de campo se

proyecta en el plano del objeto. Este procedimiento requiere

un condensador de campo equipado con un diafragma de

iris móvil (o centrable).

Figura 1.4. Iluminación Koehler (August Koehler).


Ejercicio 1.1. El microscopio óptico de campo claro.

Introducción

El microscopio óptico compuesto es un instrumento que permite observar objetos no visibles a

simple vista mediante un sistema óptico de lentes, que al ser atravesadas por la imagen de un objeto la

amplifican.

- Partes del microscopio

En un microscopio óptico se distinguen una parte mecánica y otra óptica:

a) La parte mecánica consta de las siguientes piezas:

• Pie de soporte o estativo: alberga la fuente de iluminación.

• Brazo: continuación del pie donde están insertadas el resto de piezas.

• Tubo: cilindro hueco por donde circulan los rayos luminosos. En la parte inferior tiene un

revolver con los sistemas de lentes, llamados objetivos, y en la superior porta la lente llamada

ocular.

• Platina: superficie horizontal para colocar la preparación microscópica. Esta se sujeta mediante

una pinza, y puede moverse sobre la platina mediante un carro accionado por tornillos, en un

plano inferior. Cualquier punto de la preparación puede ser fijado por el observador, tomando

sus coordenadas con los nonios que porta el carro. La platina puede desplazarse en sentido

vertical gracias a dos pares de tornillos situados a derecha e izquierda sobre el brazo: los

tornillos macrométricos, que provocan desplazamientos rápidos, y los micrométricos, que

mueven la platina muy lentamente. Mediante el desplazamiento de la platina se consigue el

enfoque de la preparación.

b) La parte óptica del microscopio óptico se compone de:

• Ocular: sistema de lentes convergentes situado en la parte superior del tubo.

• Objetivos: son tubos que albergan sistemas de lentes convergentes que proporcionan

aumentos hasta 100x. Los objetivos están montados sobre una pieza base, llamada revolver,

que permite intercambiarlos sobre la preparación. Cada objetivo lleva impresas sus

características ópticas (aumentos, apertura numérica, etc.).

• Condensador: es un sistema de lentes convergentes situado inmediatamente por debajo de la

platina (en nuestro caso, es fijo y se desplaza junto con la platina). Su función es concentrar los

rayos luminosos sobre la preparación.

• Diafragma: palanca montada en la misma pieza del condensador, que regula la entrada de luz

a éste y a la preparación. Al igual que en las cámaras fotográficas, un diafragma abierto


proporciona más luz, pero menor profundidad de campo (nitidez del enfoque a diferentes niveles

horizontales de la preparación).

• Fuente luminosa: es una lámpara de tungsteno, montada en el interior del pie.

Figura 1.1.1. Componentes del microscopio óptico.

- Principios de magnificación

El principio de magnificación de un microscopio consiste en dos sistemas de lentes convexas que se

combinan apropiadamente para magnificar las muestras.


Junto a la muestra AB, un sistema de lentes convexas (Lo), llamado objetivo, se usa para magnificar

de 1 a 100 veces y crear una imagen real A’B’. Junto al ojo un sistema de lentes llamado ocular es usado

para magnificar de 5 a 20 veces y crear una imagen virtual A’’B’’ a una distancia de visión nítida

(aproximadamente a 250 mm del ojo). Es esta imagen aumentada A’’B’’ la que vemos durante la

observación microscópica (Figura 1.1.2).

Figura 1.1.2. Esquema óptico del microscopio.

- Características ópticas del microscopio

• Aumento total (M): Es el producto de los aumentos del objetivo por los del ocular. Puede obtenerse un

rango de aumentos variable. Se calcula como:

M = Mobjetivo x Mocular (x Mi)

Donde:

Mobjetivo = aumento del objetivo.

Mocular = aumento de los oculares (indicado en los oculares).

Mi = aumentos intermedios si corresponden (por defectos es 1)

• Apertura numérica (AN): Determina la eficiencia del condensador y el objetivo. Cuanto mayor es la

AN, las imágenes resultan de mayor calidad. Se calcula como:


Apertura numérica (AN) = n·sen θ

Donde:

n = índice de refracción del medio entre el objetivo y la preparación.

θ = la mitad del ángulo máximo con el que penetra en el objetivo el cono de luz, desde un

punto enfocado en el eje óptico.

• Límite de resolución: Es la distancia mínima real que tiene que haber entre dos puntos para que el

microscopio pueda mostrar dichos puntos como distintos y separados. Se calcula mediante la fórmula

de Abbe:

Límite de resolución = (0,61·λ)/AN

Donde:

λ = longitud de onda de la luz incidente (400 nm para la luz azul).

AN = apertura numérica.

El poder de resolución del ojo humano es aproximadamente 70 µm.

• Distancia de trabajo: es el espacio entre el objetivo y la cara superior de la preparación, cuando la

imagen está enfocada. Cuando mayor es el aumento del objetivo menor es la distancia de trabajo.

• Profundidad de campo: es el espesor de muestra de la preparación microscópica que aparece nítido

por encima y por debajo del plano de enfoque. Cuanto mayor es la AN del objetivo (o mayor es su

aumento) menor es la profundidad de campo.

Material

• Microscopio binocular.

• Portaobjetos con preparaciones microscópicas.

Procedimiento

1. Comprobar la magnificación y la apertura numérica de los objetivos que están en el revolver del

microscopio y la magnificación de las lentes oculares. Estos valores están impresos en cada uno de los

objetivos (Figura 1.1.3) y de los oculares. En la tabla 1.1.1 anotar los valores de magnificación para

cada objetivo y ocular y la AN para cada objetivo y el condensador. Calcular la magnificación total y el

límite de resolución para cada objetivo y el poder de resolución máximo del microscopio usando aceite


de inmersión (AN = 1,5). Asumir que la luz que atraviesa la muestra tiene una longitud de onda de 400

nm.

Figura 1.1.3. Características de los objetivos.

Tabla 1.1.1.

Magnificación Apertura Numérica Aumento Total M = Mobjx Mocular (x Mi)

Límite de Resolución (0,61xλ)/AN

Magnificación de los oculares:

Apertura numérica del condensador:

Indica el objetivo de mayor AN:

A.N. para una interfase de aire: 1,0

A.N para una interfase de aceite 1,5

Poder de resolución máximo del microscopio: AN/(0,61xλ) (µm)

2. Girar el revolver porta objetivos hasta que el objetivo de menor aumento esté en posición de

observación. Coger una preparación microscópica, colocarla en la platina asegurándose que queda

correctamente fijada, y con el cubreobjetos hacia arriba. Encender el microscopio ajustar la intensidad

de luz con el potenciómetro a un nivel confortable para el observador. Nunca controlar la intensidad de

luz con el condensador, asegurarse que el condensador esté abierto y en posición correcta.


3. Ajustar los oculares a la posición neutra de dioptrías (“0”). Ajustar los oculares a la distancia interpupilar

y dioptrías del observador. La mayoría de microscopios están equipados con un tirador entre los

oculares para su ajuste y sólo se requiere empujar o tirar directamente de los oculares juntos o

individualmente. Mover los oculares (derecha e izquierda) hasta ver un campo de visión uniforme.

4. Enfocar el microscopio sobre cualquier objeto dentro del campo de visión:

• Localizar un punto suficientemente contrastable en el centro del campo de visión y cerrar el ojo

izquierdo. Usando los tornillos macro- y micrométrico enfocar hasta obtener una imagen nítida con

el ojo derecho solamente.

• Ahora cerrar el ojo derecho y ajustar el foco del ocular izquierdo girando el dioptrio situado en él. No

reajustar el foco del ojo izquierdo con los enfoques macrométrico y micrométrico, usar el anillo de

ajuste del ocular.

5. Seguidamente todos los usos del microscopio sólo requerirán los ajustes de enfoque macrométrico y

micrométrico. Por supuesto, será necesario y se deberá comprobar y reajustar el microscopio al inicio

de cada sesión.

6. Comenzar siempre enfocando la preparación por el objetivo de menor aumento (4x). Incluso si se va a

usar el objetivo de mayor aumento (40x ó 100x). Es más eficaz comenzar con el objetivo de menor

aumento e ir aumentando gradualmente la magnificación del objetivo, afinando el enfoque de la muestra

con cada uno de ellos. Si los objetivos son parafocales, una preparación microscópica enfocada con un

objetivo también estará, prácticamente, enfocada con el resto de objetivos y sólo se tendrá que corregir

levemente el enfoque micrométrico.

7. Manipular el control macrométrico de enfoque hasta ver la preparación enfocada. Mover los tornillos de

desplazamiento horizontal (XY) de la platina, hasta situar la preparación en la región de estudio

deseada. Entonces, centrar la preparación y enfocar cuidadosamente, usando los tornillos de enfoque

macrométrico y micrométrico, partiendo del objetivo de menor aumento hasta el de mayor aumento,

realizando el estudio de la muestra con cada una de las magnificaciones. Usar el micrométrico para el

ajuste fino y enfocar al máximo la imagen.

8. Durante el uso del microscopio, una mano debe de permanecer sobre el micrométrico reajustando el

enfoque constantemente y la otra mano se usa para dirigir los movimientos de la platina.

9. Dibujar las imágenes que se observan con diferentes aumentos del microscopio, para cada preparación

microscópica.


Ejercicio 1.2. Medida de las dimensiones en los ejes X, Y, y Z en microscopía.

Introducción

- Medidas en el eje Z

El tornillo micrométrico de los microscopios está diseñado para que una vuelta completa de éste

eleva o desciende la platina 0,2 mm. El tornillo micrométrico tiene una escala con 100 divisiones, que

representan cada una de ellas 0,002 mm (2 µm) de desplazamiento vertical de la platina (eje Z). Esto nos

permite hacer una lectura directa en la escala graduada del tornillo micrométrico del desplazamiento vertical

realizado en el plano de enfoque de la preparación. Por lo que esta escala puede usarse para determinar el

espesor de las muestras y estructuras microscópicas examinadas.

- Medidas en los ejes X e Y

Al colocar una preparación en el portaobjetos mecánico de la platina, el margen de desplazamiento

es de 50 mm x 75 mm, aproximadamente; lo que nos permite realizar medidas comprendidas dentro de

esos márgenes en muestras microscópicas. Para ello se usan las escalas ubicadas en el portaobjetos

mecánico de la platina; así como, situar y localizar áreas de interés en la preparación mediante el sistema

de coordenadas, que nos permite volver a un área de estudio o de interés determinada de forma precisa y

reiterada. Los tornillos de control del portaobjetos mecánico, ubicados directamente a la derecha del

portaobjetos y enfrente de los tornillos de enfoque, deben girarse para cambiar la posición visual de la

muestra en el portaobjetos mecánico y en las escalas (de los ejes X e Y) situadas en este sistema.

Las escalas ubicadas en la parte frontal posterior y lateral izquierda proporcionan respectivamente

las lecturas para los ejes X e Y del plano horizontal de la preparación. La escala principal (“m”) está

graduada en milímetros, y la escala vernier (“n”); corresponde a:

1 división de “n” = (9 divisiones de “m”)/10

En la figura 1.3.1 se muestra un ejemplo de uso de un nonio. El valor 0 de la escala vernier (n) se

sitúa entre 12 y 13 de la escala principal (m); por lo que tomamos el menor valor de la escala principal (m),

12, como valor entero de la medición. Para calcular los decimales de la medida nos fijamos en la escala

vernier (n) y comprobamos cual es la menor de sus divisiones que coincide con una división de la escala

principal (m), en nuestro caso la división número 8 de la escala vernier es la primera en coincidir con una

división de la escala principal (m), el 20. Por lo que consideramos 0,8 como el valor decimal de nuestra

medida. Obteniéndose un valor total de 12,8 mm (12 + 0,8).


Figura 1.3.1. Escala del portaobjetos mecánico.

Material

• Microscopio.

• Preparación microscópica.

Procedimiento

1. Colocar la preparación en la platina del microscopio.

2. Enfocar correctamente el límite superior de la preparación. Anotar la marca de escala indicada en el

tornillo micrométrico. Cuidadosamente, gira el tornillo de enfoque micrométrico y cuando el microscopio

este justamente enfocado en el límite inferior de la preparación, anotar en la tabla 1.3.1 la lectura que se

registra en la escala del tornillo micrométrico.

Para realizar está operación resulta de gran utilidad centrarnos en estructuras tisulares que

atraviesen completamente la muestra perpendicularmente al plano de sección. En nuestro caso, será de

gran utilidad el sistema vascular puesto de manifiesto mediante el uso de colorantes perfundidos en el

sistema vascular.

Tabla 1.3.1.

Posición Profundidad

Límite superior:

Posición media:

Límite inferior:

Grosor de la preparación (Límite superior- Límite inferior): (media ± σ) (µm)

3. Considerando los esquemas de la figura 1.3.2, localizar las regiones indicadas y con ayuda de la

retícula y las escalas del portaobjetos mecánico de la platina acotar las muestras calculando el tamaño

de cada uno de las distancias que se indican en dicha figura. Anotar los resultados en la tabla 1.3.2.

Escala principal “m”. Escala vernier “n”.


Tomar como referencia un extremo del segmento a medir con ayuda de la retícula anotar el valor

indicado en la correspondiente escala (eje X o Y) y recorrer en dirección X o Y, según corresponda, la

preparación hasta el otro extremo del segmento a medir, anotar el valor indicado en la escala. La

sustracción de los dos valores obtenidos será la longitud de dicho segmento y, por tanto, el tamaño de

esa región de la preparación.

Muy importante: Comprobar que al desplazarse en dirección X no se altera la posición en el eje Y,

y viceversa. De lo contrario, la medida sería errónea.

Figura 1.3.2. Secciones de cerebro. A) Sección sagital. B) Sección coronal.

A)

B)

a

b

c d

e

f

g h

i j

k

l


Tabla 1.3.2.

Segmento Medida (±σ) (mm) Segmento Medida (±σ) (mm)

A g

B h

C i

D j

E k

F l

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