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5. TEXTOS GERAIS

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5.1. Textos gerais sobre esterilidade .............................. 5155.2. Textos gerais sobre vacinas...................................... 5235.3. Análise estatística de resultados de ensaios e testes

biológicos ................................................................ 5415.4. Solventes residuais .................................................. 5775.5. Tabelas alcoométricas .............................................. 5895.6. Aferição dos interferões .......................................... 599

5.7. Quadro das características dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa ...................... 607

5.8. Harmonização das Farmacopeias............................ 6155.9. Polimorfismo .......................................................... 6195.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso

farmacêutico ............................................................ 6235.11. Características nas monografias ............................ 629

513FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

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5.1. TEXTOS GERAISSOBRE ESTERILIDADE

5.1. Textos gerais sobre esterilidade ................................ 5155.1.1. Métodos de preparação de produtos estéreis .... 5155.1.2. Indicadores biológicos de esterilização .......... 5175.1.3. Eficácia dos conservantes antimicrobianos ...... 518

5.1.4. Qualidade microbiológica das preparaçõesfarmacêuticas ........................................................ 519

5.1.5. Aplicação do conceito FO à esterilização pelo vapor das preparações aquosas .............................. 520

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5.1. TEXTOS GERAIS SOBRE ESTERILIDADE

5.1.1. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS

Esterilidade é a ausência de microrganismos vivos. Arealização de ensaios não é suficiente para garantir aesterilidade de um produto e a garantia da esterilidade passaigualmente pela aplicação de processos de produçãoconvenientemente validados. É essencial estudar o efeito dométodo de esterilização escolhido sobre o produto (incluindoo recipiente ou a embalagem final) do ponto de vista daeficácia e da manutenção da sua integridade e validar essemétodo antes de o pôr em prática. Recomenda-se a escolha deum recipiente que seja compatível com o método deesterilização aconselhado. A utilização escrupulosa de umprocesso validado é condição a respeitar, sob pena de obterum produto não estéril ou deteriorado. De cada vez que sefazem mudanças de vulto no processo de esterilização faz-se nova validação incluindo no que diz respeito ainquinação microbiana (carga). É óbvio que as normas de boaprática de fabrico (descritas, por exemplo, no guia CEErelativo às boas práticas de fabrico) terão que ser observadas,nomeadamente no que diz respeito a:

– emprego de pessoal qualificado e convenientementetreinado,

– utilização de locais adequados,

– utilização de equipamento de produção adequado,concebido para poder ser facilmente limpo e esterilizado,

– respeito pelas precauções necessárias para reduzir o riscode inquinação microbiana (biocarga) antes da esterilização,

– utilização de métodos validados em todas as etapas críticasda produção,

– vigilância do ambiente e controlos durante a produção.

As precauções a tomar para limitar a carga microbiana antesda esterilização incluem a utilização de compostos queapresentem um nível suficientemente baixo de contaminaçãomicrobiana. Pode ser desejável executar controlomicrobiológico e estabelecer limites apropriados paracompostos cuja origem, natureza ou modo de preparaçãocomportem riscos de contaminação.

Os métodos descritos neste texto aplicam-se principalmenteà inactivação ou eliminação de bactérias, leveduras e fungos.Entretanto, para os produtos biológicos de origem animal ouhumana, ou quando material de origem animal ou humanaé utilizado na produção, é necessário demonstrar, aquandoda validação, que o processo utilizado permite eliminar ouinactivar os contaminantes víricos potenciais. Indicações aeste respeito são fornecidas, por exemplo, nas NotasExplicativas CEE.

Sempre que possível, é conveniente escolher um processo quepermita a esterilização do produto na embalagem definitiva(esterilização final). Quando se utiliza um processo final (pelovapor, pelo calor seco ou por radiações) totalmente validado,pode admitir-se, sob reserva de aprovação pela AutoridadeNacional, que se recorra à libertação paramétrica, isto é,fundamentar a libertação de um lote de unidades esterilizadasmais nos dados de produção do que nos resultados de umensaio de esterilidade efectuado sobre uma amostra desse lote.


5.1.1. Métodos de preparação de produtos estéreis

Se a esterilização final não for possível, convém recorrer àfiltração usando um filtro que retenha bactérias, ou à técnicaasséptica; sempre que possível, aplica-se um tratamentocomplementar apropriado (por exemplo, aquecimento) aoproduto no seu recipiente definitivo. Em todos os casos, orecipiente e o sistema de fecho mantêm a esterilidade doproduto durante todo o tempo de validade.

Nível de segurança de esterilidade (NSE)

Nos casos apropriados, nos métodos descritos mais adiantefaz-se referência ao conceito de «nível de segurança deesterilidade ou NSE». Com efeito, não pode garantir-se nemverificar em absoluto a esterilidade de todas as unidadescontidas numa população que tenha sido objecto deesterilização. A inactivação de microrganismos por processosfísicos ou químicos é um fenómeno que se rege por uma leiexponencial e, por consequência, existe sempre uma certaprobabilidade estatística de um microrganismo sobreviver àesterilização. Para um determinado processo, estaprobabilidade de sobrevivência é função do número, do tipo eda resistência dos microrganismos presentes, bem como doambiente em que se desenrola a operação. O nível desegurança de esterilidade (NSE) de um processo deesterilização indica o grau de segurança com o qual umconjunto de unidades é tornado estéril pelo processoutilizado. O NSE para determinada técnica é expresso como aprobabilidade da existência de uma unidade não estéril nessapopulação. Um NSE de 10–6, por exemplo, corresponde a umaprobabilidade de existir, no máximo, 1 microrganismo viávelem 106 unidades esterilizadas do produto final. O NSEassociado a um processo, para um determinado produto, éestabelecido com base em estudos de validação apropriados.

MÉTODOS E CONDIÇÕES DE ESTERILIZAÇÃO

A esterilização pode ser efectuada por um dos métodosdescritos a seguir. É possível utilizar variantes oucombinações destes métodos, desde que o processo escolhidoseja validado quer no aspecto de eficácia, quer na manutençãoda integridade do produto, incluindo o recipiente ou aembalagem.

Qualquer que seja o método de esterilização utilizado, osparâmetros críticos são objecto de controlo para confirmarque o conjunto do lote é sujeito, durante todo o processo detratamento, às condições de esterilização previamentedefinidas. Esta exigência é válida em todos os casos, mesmoquando são utilizadas condições padrão.

Esterilização final

Para a esterilização final, é essencial ter em conta a nãouniformidade das condições físicas ou químicas durante ociclo de esterilização. O local menos acessível ao agente deesterilização é determinado para cada processo de carga epara cada tipo e forma de recipiente ou de embalagem (porexemplo, o ponto mais frio de uma autoclave). Convémigualmente determinar a dose mínima letal resultante dociclo de esterilização e a reprodutibilidade deste, paraassegurar que todas as cargas submetidas à esterilizaçãorecebem o tratamento recomendado.

Depois de se estabelecer um processo de esterilização final,avalia-se a sua eficácia na rotina, sempre que possível, porverificação e registo apropriados das condições físicas ouquímicas atingidas pela carga, durante toda a duração do ciclode esterilização.

Esterilização pelo vapor (em autoclave). Quando é aplicável,a esterilização pelo vapor saturado sob pressão é o método

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recomendado, nomeadamente para as soluções aquosas. Paraeste método de esterilização final, as condições padrãoaplicáveis às preparações aquosas são de 121°C, durante, pelomenos, 15 min. Podem utilizar-se outras combinações detemperatura e tempo desde que se demonstre que o processoescolhido assegura uma taxa de letalidade adequada ereprodutível quando aplicado como rotina dentro dos limitesde tolerância estabelecidos. Os métodos e precauçõesutilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 10–6. Asinformações relativas à validação por meio do conceito F0 sãodadas mais adiante (5.1.5).

Os parâmetros físicos (temperatura e pressão) existentesdentro da autoclave durante o processo de esterilização sãoconhecidos. A temperatura é geralmente determinada pormeio de sondas instaladas no interior de vários recipientesrepresentativos bem como em pontos da autoclavepreviamente identificados como os mais frios do conjunto dacarga. Os parâmetros físicos são registados durante todo odecorrer do ciclo, por exemplo na forma de diagramatemperatura/tempo ou qualquer outra apropriada.

Quando se procede a um ensaio biológico de verificação, éconveniente utilizar um indicador biológico apropriado (5.1.2).

Esterilização pelo calor seco. Para este método deesterilização final as condições padrão são de 160°C durante,pelo menos, 2 h. Podem utilizar-se outras combinações detemperatura e tempo desde que se demonstre que oprocesso escolhido assegura uma taxa de letalidade adequadae reprodutível quando aplicado como rotina dentro doslimites de tolerância estabelecidos. Os métodos e precauçõesutilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 10–6.

A esterilização pelo calor seco realiza-se em estufas deventilação forçada ou noutros dispositivos especialmentepreparados para o efeito. A carga é cotocada de tal modo que atemperatura seja uniforme em todo o conjunto. Obtêm-sedados relativos à temperatura no interior do esterilizadordurante o processo de esterilização, recorrendo geralmente asondas instaladas no interior de vários recipientesrepresentativos bem como em pontos do esterilizadorpreviamente identificados como os mais frios do conjunto dacarga. A temperatura é registada durante todo o decorrer dociclo, de forma apropriada.


O calor seco a mais de 220°C é frequentemente utilizado paraesterilizar e despirogenar material de vidro. Neste caso, emlugar de utilizar indicadores biológicos de esterilização(5.1.2), é possível demonstrar a existência de uma redução de3 log das endotoxinas resistentes ao calor.

Esterilização por radiações ionizantes. Este método de esterili-zação efectua-se por exposição do produto a uma radiação ioni-zante que pode ser uma radiação gama proveniente de umradioisótopo apropriado (cobalto 60, por exemplo) ou um feixede electrões acelerados por meio de um acelerador apropriado.

Em certos países existem regulamentações especiais para autilização das radiações ionizantes para fins de esterilização(ver, por exemplo, as Notas Explicativas CEE).

Para este método de esterilização final, a dose padrão (doseabsorvida) é de 25 kGy. Podem utilizar-se outros valores desdeque se demonstre que a dose escolhida assegura uma taxa deletalidade adequada e reprodutível quando aplicado comorotina dentro dos limites de tolerância estabelecidos. Osmétodos e precauções utilizados permitem obter um NSE de,pelo menos, 10–6.

Durante o processo de esterilização, a radiação absorvida peloproduto é objecto de verificações regulares, efectuadas porprocessos dosimétricos que são independentes da taxa deradiação. Os aparelhos são calibrados em relação a uma fontepadrão numa instalação de referência quando da recepção edepois com intervalos de tempo apropriados que nãoultrapassam 1 ano.


Esterilização por gases. Este método só é utilizado quandonão é possível aplicar qualquer um dos outros processos. Éessencial assegurar a penetração do gás e da humidade noproduto a esterilizar e utilizar depois um processo deeliminação do gás em condições que se verificou previamentepermitirem que no produto esterilizado os resíduos ouprodutos de transformação do gás se reduzem a umaconcentração inferior à que pode provocar efeitos tóxicosquando da utilização. A este respeito, as notas explicativas daCEE fornecem indicações quanto ao emprego do óxido deetileno.

Convém, sempre que possível, determinar e registar aconcentração do gás, a humidade relativa, a temperatura e otempo de esterilização. As determinações são efectuadas noslocais mais desfavoráveis do ponto de vista da realização dascondições de esterilização, locais estes que foramdeterminados quando da validação.

A eficácia do processo é verificada, para cada cargaesterilizada, com indicadores biológicos apropriados (5.1.2).

Um amostra apropriada de cada lote é submetida a um ensaiode esterilidade (2.6.1) antes da sua libertação.

Filtração

Certas substâncias activas ou produtos não susceptíveis deserem submetidos a uma esterilização final podem seresterilizados por filtração usando um tipo de filtro quesatisfaça a uma prova microbiana realizada com ummicrorganismo de ensaio apropriado. Pode servir umasuspensão de Pseudomonas diminuta (ATCC 19146 NCIMB11091 ou CIP 103020). Recomenda-se aplicar uma carga deprova de, pelo menos, 107 ufc por cm2 de área activa defiltração e preparar a suspensão num meio de cultura detriptano-soja que, após passagem através do filtro, érecolhido em condições assépticas e incubado em aerobiose a32°C. Estes produtos necessitam de precauções especiais. Oprocesso e o ambiente de produção são escolhidos de modo alimitar os riscos de contaminação microbiana e são objectode verificação regular por métodos apropriados. Oequipamento, os recipientes e fechos e, se possível, oscomponentes do produto são submetidos a um processo deesterilização conveniente. Efectua-se a filtração esterilizantetão próximo quanto possível do ponto de enchimento. Asoperações que se seguem à filtração são realizadas emcondições assépticas.

As soluções são filtradas por uma membrana antibacterianade porosidade nominal inferior ou igual a 0,22 µm ou poroutro tipo de filtro que possua propriedades equivalentes deretenção de bactérias. São tomadas precauções para evitar asperdas de soluto por adsorção no filtro e a libertação decontaminantes pelo filtro. Tem-se em conta a contaminaçãomicrobiana antes da filtração, a capacidade do filtro, otamanho dos lotes e o tempo de filtração. Um mesmo filtronão é utilizado durante um espaço de tempo superior àqueleque foi definido como adequado quando da validação doconjunto filtro-produto.

5.1.1. Métodos de preparação de produtos estéreis

516 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII

5. Textos gerais

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A integridade dos filtros esterilizantes é verificada antes edepois do seu uso por meio de ensaios adaptados ao tipo defiltro e à etapa em que é efectuada a verificação (por exemplo,ponto de bolha, resistência à pressão ou taxa de difusão).

Dados os riscos suplementares que comporta a filtração, emrelação aos outros métodos de esterilização, pode serdesejável proceder a uma pré-filtração com um filtroantibacteriano quando é impossível limitar a contaminaçãomicrobiana por outros meios.

Preparação asséptica

O objectivo da preparação asséptica é manter a esterilidade deum produto obtido a partir de componentes previamenteesterilizados por um dos métodos antes descritos. O processode atingir este objectivo é operar em condições e eminstalações concebidas para impedir a contaminaçãomicrobiana. A preparação asséptica pode compreender oenchimento e o fecho asséptico dos recipientes, a misturaasséptica dos componentes da fórmula seguida doenchimento e do acondicionamento assépticos.

Para manter a esterilidade dos componentes e do produtodurante a preparação é conveniente dispensar atençãoespecial aos seguintes aspectos:

– meio ambiente,

– pessoal laborante,

– áreas críticas,

– esterilização dos recipientes/fechos e operações detransferência de produtos,

– duração máxima da armazenagem antes da embalagem final.

A validação do processo de preparação compreendeverificações adequadas sobre o conjunto dos parâmetrosreferidos e o próprio processo é objecto de verificaçõesregulares por simulação com meios de crescimentomicrobiano que são postos a incubar e examinados com vistaà detecção de uma eventual contaminação microbiana. Alémdisso, dos produtos esterilizados por filtração ou preparadosem condições assépticas é submetida ao ensaio de esterilidade(2.6.1) uma amostra apropriada antes da libertação do lote.

5.1.2. INDICADORES BIOLÓGICOS DE ESTERILIZAÇÃO

Os indicadores biológicos são preparações aferidas demicrorganismos seleccionados, utilizados para avaliar aeficácia de um procedimento de esterilização. São geralmenteconstituídos por uma população de esporos bacterianosdepositados num suporte inerte, por exemplo uma tira depapel de filtro, uma lâmina de vidro ou um tubo de materialplástico. O suporte semeado é embalado de modo a que oconjunto fique protegido de qualquer alteração oucontaminação, permitindo no entanto que o agenteesterilizante entre em contacto com os microrganismos. Assuspensões bacterianas podem apresentar-se em ampolasseladas. Os indicadores biológicos são preparados de modo apoderem ser conservados em condições definidas. Determina-se um prazo de validade.

Microrganismos da mesma espécie bacteriana que as bactériasutilizadas para fabricar os indicadores biológicos podem serinoculados directamente num produto líquido a esterilizar, ounum produto líquido similar ao produto a esterilizar. Nestecaso, demonstra-se que o líquido utilizado não tem efeito

inibidor para os esporos utilizados, em particular quanto àsua germinação.

Os indicadores biológicos são caracterizados pelo nome daespécie bacteriana do microrganismo indicador, número daestirpe na colecção de origem, número de esporos viáveis porsuporte e pelo valor D. O valor D é o valor de um parâmetrode esterilização (duração ou dose absorvida) necessário parareduzir em 10 por cento do valor inicial, o número demicrorganismos viáveis. Só tem significado em condiçõesexperimentais bem definidas. Estão presentes apenas osmicrorganismos indicados. Podem ser utilizados comoindicadores biológicos suportes com mais do que uma espéciebacteriana. São fornecidas informações sobre o meio decultura e condições de incubação.

Recomenda-se que os indicadores biológicos sejam colocadosem locais considerados menos acessíveis ao agenteesterilizante, ou identificados como tais por préviasdeterminações físicas. Após exposição ao agente esterilizante,utiliza-se uma técnica asséptica para transferir o suportecarregado de esporos para o meio de cultura, afim de evitarqualquer risco de contaminação na altura do exame. Podemser utilizados indicadores biológicos que incluam umaampola com meio de cultura directamente colocada naembalagem de protecção do suporte semeado.

A escolha dos microrganismos indicadores é efectuada combase nos seguintes critérios:

a) a resistência da estirpe indicadora ao método deesterilização considerado é, quando comparada, superior àde todos os microrganismos patogénicos e à dosmicrorganismos potencialmente presentes no produto,

b) a estirpe indicadora não é patogénica,

c) a estirpe indicadora desenvolve-se facilmente,

O desenvolvimento após incubação dos microrganismosindicadores submetidos ao processo de esterilizaçãodemonstra que o processo foi insuficiente.

1. Esterilização pelo vapor. Recomenda-se a utilização deindicadores biológicos na esterilização pelo vapor para avalidação dos ciclos de esterilização. Recomenda-se autilização de esporos de Bacillus stearothermophilus (porexemplo ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157 ou CIP52.81). O número de esporos viáveis por suporte é superiora 5 � 105 e o valor D a 121°C superior a 1,5 min. Verifica-se se a exposição dos indicadores biológicos aovapor durante 6 min a 121 � 1°C mantém os esporosrevivificáveis, e que não há desenvolvimento dosmicrorganismos indicadores após exposição ao vapordurante 15 min a 121 � 1°C.

2. Esterilização pelo calor seco. Recomenda-se a utilização deBacillus subtilis (por exemplo a var. niger ATCC 9372,NCIMB 8058 ou CIP 77.18) na preparação de indicadoresbiológicos. O número de esporos viáveis por suporte ésuperior a 1 � 105 e o valor D a 160°C é da ordem de 1 a3 min. O calor seco a temperaturas superiores a 220°C éutilizado frequentemente na esterilização e eliminação depirogénios no material de vidro. Neste caso, ademonstração da existência de uma redução de 3 log deendotoxinas bacterianas resistentes ao calor substitui autilização de indicadores biológicos.

3. Esterilização por radiações. Podem ser utilizadosindicadores biológicos para monitorizar as operações derotina, como meio suplementar para avaliar a eficácia dadose de radiação escolhida, especialmente no caso deesterilização com electrões acelerados. Recomenda-se a


5.1.2. Indicadores biológicos de esterilização

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utilização de esporos de Bacilius pumilus (por exemplo,ATCC 27.142, NCTC 10327, NCIMB 10692 ou CIP 77.25). Onúmero de esporos viáveis por suporte é superior a 1 � 107.O valor D é superior a 1,9 kGy. Verifica-se que não existedesenvolvimento de microrganismos indicadores apósexposição a 25 kGy (dose mínima absorvida)

4. Esterilização por gases. A utilização de indicadoresbiológicos é necessária para todos os procedimentos deesterilização por gases, tanto na validação dos ciclos comonas operações de rotina. A esterilização por gases écorrectamente utilizada para os dispositivos médicos, osisoladores, os locais, etc. A utilização dos gases nestecontexto não faz parte das actividades da Farmacopeia. Autilização de esporos de Bacillus subtilis (por exemplo avariedade niger ATCC 9372, NCIMB 8058 ou CIP 77.18) érecomendado para o óxido de etileno. O número deesporos viáveis por suporte é superior a 5 � 105. Osparâmetros de resistência são conhecidos para o procedi-mento utilizado: por exemplo, para o óxido de etileno, ovalor D é superior a 2,5 min para um ciclo de ensaioenvolvendo 600 mg/l de óxido de etileno a 54°C com 60por cento de humidade relativa. Verifica-se a ausência dedesenvolvimento dos microrganismos indicadores apósexposição durante 60 min no ciclo do ensaio atrásdescrito, e que a sua exposição durante 15 min num ciclocom temperatura reduzida (600 mg/l, 30°C e 60 por centode humidade relativa) deixa os esporos revivificáveis. Aexposição dos indicadores a 600 mg/l de óxido de etileno,durante 60 min, a 54°C e sem humidificação deve deixaresporos revivificáveis para assegurar que o indicadorbiológico é capaz de revelar a existência de uma humidifi-cação insuficiente.

5.1.3. EFICÁCIA DOS CONSERVANTESANTIMICROBIANOS

Quando as preparações farmacêuticas não possuam elaspróprias propriedades conservantes adequadas, podemadicionar-se-lhes agentes de conservação antimicrobianos,particularmente em preparações aquosas, com o fim deevitar ou limitar a proliferação microbiana que pode ocorrernas condições normais de conservação e de emprego e assimapresentar um risco de infecção para o doente e deterioraçãoda preparação, nomeadamente nos recipientes multidose. Os agentes de conservação antimicrobianos não sãoutilizados para substituir o cumprimento das boas práticasde fabrico.

A eficácia de um agente de conservação antimicrobiano podeser aumentada ou diminuída pelo composto activo dapreparação, pela composição da preparação na qual éincorporado ou pelo recipiente e modo de fecho adoptado. Aactividade antimicrobiana da preparação no recipientedefinitivo é avaliada para o seu período de validade com oobjectivo de assegurar que aquela actividade não sofrealteração durante o período de conservação. Estes examessão efectuados em amostras colhidas do recipiente definitivoimediatamente antes do ensaio.

Durante a fase de desenvolvimento de uma preparaçãofarmacêutica, verifica-se a actividade antimicrobiana própriada preparação ou, se necessário, demonstra-se que, quandoadicionada de 1 ou mais conservantes apropriados, assegurauma protecção adequada contra os efeitos nocivos que podemresultar da contaminação ou da proliferação microbianadurante o período de conservação e emprego da preparação.

A eficácia da actividade antimicrobiana demonstra-se atravésdo ensaio abaixo descrito, que não se destina ao controlo derotina.

ENSAIO DE EFICÁCIA DOS CONSERVANTESANTIMICROBIANOS

O ensaio consiste na contaminação artificial da preparação, sepossível no recipiente definitivo, através da inoculação demicrorganismos apropriados, conservando a preparaçãosemeada a uma temperatura adequada, colhendo amostras dorecipiente em determinados intervalos de tempo e efectuandonelas uma contagem dos microrganismos.

Consideram-se adequadas as propriedades conservantes dapreparação quando, nas condições do ensaio e após intervalosde tempo e temperaturas prescritos, se produzir, conforme oscasos, uma diminuição importante ou uma ausência deaumento do número de microrganismos na preparaçãoinoculada. Os critérios de aceitação, em termos de diminuiçãodo número de microrganismos em função do tempo, variampara as diversas categorias de preparações de acordo com ograu de protecção pretendido (ver quadros)

Microrganismos de ensaio

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82.118.

Staphylococcus aureus ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518; CIP 4.83.

Candida albicans ATCC 10231; NCPF 3 179; IP 48.72.

Aspergillus niger ATCC 16404; IMI 149007; IP 1431.83.

Os ensaios efectuam-se com 1 estirpe de cada vez.Complementam-se os microrganismos especificados comestirpes ou espécies que constituem contaminantes potenciaisda preparação. Por exemplo, a Escherichia coli (ATCC 8739;NCIMB 8545; CIP 53.126) utiliza-se em todas as preparaçõesorais e a Zygosaccharomyces rouxii (NCY 381; IP 2021.92)nas preparações orais com elevada concentração de açúcar.

Preparação do inóculo

Antes do ensaio, semeie à superfície de um meio gelosado B(2.6.12) para bactérias ou um meio gelosado C semantibióticos (2.6.12) para fungos uma cultura-mãe recenteobtida de cada um dos microrganismos especificados. Incubeas culturas bacterianas a uma temperatura entre 30-35°C,durante 18-24 h, a cultura de C. albicans entre 20-25°C,durante 48 h, e a cultura de A. niger entre 20-25°C, durante 1 semana ou até à obtenção de uma esporulação satisfatória.Podem ser necessárias subculturas depois de revitalização dosmicrorganismos, até que estes atinjam um desenvolvimentoóptimo, sendo recomendável que se mantenha um númeromínimo de repicagens.

Para a colheita das culturas bacterianas e de C. albicansutilize um líquido de suspensão estéril contendo 9 g/l decloreto de sódio R. Disperse e transfira a cultura desenvolvidaem superfície para um recipiente apropriado. Junte umaquantidade adequada de líquido de suspensão para reduzir onúmero de microrganismos para cerca de 108 por mililitro.Para recolher a cultura de A. niger utilize um líquido desuspensão estéril contendo 9 g/l de cloreto de sódio R e 0,5 g/lde polissorbato 80 R e ajuste o número de esporos para cercade 108 por mililitro com a mesma solução. Colhaimediatamente uma amostra apropriada de cada suspensão edetermine o número de unidades formadoras de colónias pormililitro em cada suspensão, através da sementeira em placasou filtração por membrana (2.6.12). Este valor serve para

5.1.3. Eficácia dos conservantes antimicrobianos


5. Textos gerais

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determinar o inóculo e a linha de base a ser utilizada noensaio. As suspensões são usadas imediatamente.

MÉTODO

Para se efectuar a contagem de microrganismos viáveis naspreparações inoculadas, use o mesmo meio gelosado que foiempregue na cultura inicial do microrganismo correspondente.

Semeie vários recipientes da amostra com uma suspensão deum dos microrganismos de ensaio de modo a que se obtenhaum inóculo com 105 a 106 microrganismos por mililitro oupor grama da preparação. O volume da suspensão do inóculonão ultrapassa 1 por cento do volume do produto. Misturecuidadosamente para assegurar uma distribuição homogénea.

Mantenha o produto semeado a uma temperatura entre 20°C e25°C, ao abrigo da luz. Colha amostras apropriadas de cadarecipiente, por exemplo 1 ml ou 1 g, no tempo 0 e nosintervalos de tempo apropriados, consoante o tipo depreparação, e calcule o número de microrganismos viáveisatravés da sementeira em placas ou filtração por membrana(2.6.12), assegurando que toda a actividade antimicrobianaresidual da preparação tenha sido eliminada pela diluição, porfiltração ou através da utilização de um desactivador específico.No caso de se utilizar o método das diluições, leva-se em linhade conta a redução da sensibilidade na detecção de pequenonúmero de microrganismos viáveis. No caso de se utilizar umdesactivador específico, confirma-se, através de controlosapropriados, a capacidade do sistema de permitir o crescimentodos microrganismos de ensaio.

O método é validado com o objectivo de se verificar acapacidade para pôr em evidência a redução na contagem donúmero de microrganismos viáveis.

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO

Os critérios para avaliação da actividade antimicrobianaapresentam-se na tabela em termos de redução logarítmica donúmero de microrganismos viáveis relativamente ao valorobtido no inóculo.

Preparações parentéricas e oftálmicas

Redução logarítmica

6 h 24 h 7 dias 14 dias 28 dias

Bactérias A 2 3 – – NEB – 1 3 – SA

Fungos A – – 2 – SAB – – – 1 SA

SA: sem aumentoNE: não encontrado

Os critérios A representam a eficácia que se recomenda sejaatingida. Quando justificados, se os critérios A não puderemser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentaremreacções indesejáveis, aplicam-se os critérios B.

Preparações tópicas e locais


2 dias 7 dias 14 dias 28 dias

Bactérias A 2 3 – SA B – – 3 SA

Fungos A – – 2 SA B – – 1 SA

Os critérios A representam a eficácia que se recomenda sejaatingida. Quando justificados, se os critérios A não puderemser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentaremreacções indesejáveis, aplicam-se os critérios B.

Preparações orais


14 dias 28 dias

Bactérias 3 SAFungos 1 SA

Estes critérios representam a eficácia que se recomenda sejaatingida.

5.1.4. QUALIDADE MICROBIOLÓGICADAS PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS

O presente capítulo é publicado a título de informação.

O fabrico, o acondicionamento, a conservação e adistribuição das preparações farmacêuticas são conduzidasde modo a assegurar uma qualidade microbiológicasatisfatória. As preparações farmacêuticas satisfazem àsseguintes exigências:

Categoria 1

Preparações obrigatoriamente estéreis de acordo com amonografia da forma farmacêutica correspondente e outraspreparações rotuladas de estéreis.

– Ensaio de esterilidade (2.6.1)

Categoria 2

Preparações para aplicação local ou para administração nasvias respiratórias, com excepção das preparaçõesobrigatoriamente estéreis, e dispositivos transdérmicos.

– Contagem dos germes aeróbios viáveis totais (2.6.12). Nomáximo, 102 bactérias, fungos e leveduras por grama, pormililitro ou por dispositivo transdérmico (compreendendoa película protectora e a camada de suporte).

– Enterobactérias e outras bactérias Gram-negativas (2.6.13).Dispositivos transdérmicos: ausência de bactérias,verificada em 1 dispositivo (comprendendo a películaprotectora e a camada de suporte). Outras preparações: nomáximo, 10 bactérias por grama ou por mililitro.

– Ausência de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1,0 g,1 ml ou 1 dispositivo (comprendendo a película protectorae a camada de suporte) (2.6.13).

– Ausência de Staphylococcus aureus verificada em 1,0 g, 1 ml ou 1 dispositivo (comprendendo a película protectorae a camada de suporte) (2.6.13).

Categoria 3

A. Preparações para administração por via oral ou rectal

– Contagem de germes aeróbios viáveis totais (2.6.12). Nomáximo, 103 bactérias e 102 leveduras por grama ou pormililitro.

– Ausência de Escherichia coli (1,0 g ou 1,0 ml).


5.1.4. Qualidade microbiológica das preparações farmacêuticas

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B. Preparações para administração por via oral contendomatérias primas de origem natural (animal, vegetal oumineral), quando é impossível um pré-tratamentoantimicrobiano e é autorizada para as matérias primasuma contaminação microbiana superior a 103

microrganismos por grama ou por mililitro. Excluem-seos medicamentos com base em plantas descritos nacategoria 4.

– Contagem de germes aeróbios viáveis totais (2.6.12). Nomáximo, 104 bactérias e 102 fungos e leveduras porgrama ou mililitro.

– Enterobactérias e outras bactérias gram-negativas. Nomáximo, 102 bactérias por grama ou por mililitro(2.6.13).

– Ausência de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).

– Ausência de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).

– Ausência de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)(2.6.13).

Categoria 4

Medicamentos com base em plantas, exclusivamentecompostos por uma ou várias drogas vegetais (inteiras, emfragmentos ou em pó).

A. Medicamentos com base em plantas que necessitam douso de água fervente.

– Contagem dos germes aeróbios viáveis totais (2.6.12).No máximo, 107 bactérias e 105 fungos e leveduras porgrama ou por mililitro.

– No máximo, 102 Escherichia coli por grama ou pormililitro (2.6.13), utilizando diluições apropriadas.

B. Outros medicamentos com base em plantas em que nãointervem a água fervente.

– Contagem dos germes aeróbios viáveis totais (2.6.12).No máximo, 105 bactérias e 104 fungos e leveduras porgrama ou por mililitro.

– Enterobactérias e outras bactérias gram-negativas. Nomáximo. 103 bactérias por grama ou por mililitro(2.6.13).

– Ausência de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).

– Ausência de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).

5.1.5. APLICAÇÃO DO CONCEITO F0À ESTERILIZAÇÃO PELO VAPOR DAS PREPARAÇÕES AQUOSAS

Esta secção é publicada a título de inforrnação.

O valor F0 associado a um processo de esterilização pelo vaporsaturado exprime a sua letalidade, em termos de tempo (emminutos) de exposição à temperatura de 121°C que serianecessário para obter o mesmo resultado que com o processoutilizado, aplicado ao produto na sua embalagem final, emrelação aos microrganismos que possuem um valor de Z de 10.

O vator F0 total de um processo tem em conta as fases deaquecimento e de arrefecimento do ciclo e pode ser calculadopor integração relativamente aos tempos das taxas deletalidade associados a intervalos de temperatura poucopronunciados.

Quando um ciclo de esterilização pelo vapor é escolhido nabase do conceito F0, é confirmado que ele permite obter, demodo constante, uma adequada segurança de esterilidade.Para validar o processo, pode igualmente ser necessárioefectuar um acompanhamento microbiológico contínuo erigoroso durante a produção de rotina para demonstrar queos parâmetros microbiológicos se mantêm compreendidosdentro das tolerâncias estabelecidas para obter um NSE de,pelo menos, 10–6.

Na esterilização pelo vapor, Z caracteriza a resistência de ummicrorganismo às variações de temperatura. Define-se como avariação de temperatura necessária para modificar o valor Dde um factor de 10.

D é o valor de um parâmetro de esterilização (duração oudose absorvida) necessário para reduzir até 10 por cento dovalor inicial o número de micorganismos viáveis. D só temsignificado em condições experimentais bem definidas.

Entre estes diferentes parâmetros existem as seguintesrelações matemáticas:

F0 = D121 (log N0 – log N) = D121 log IF

D121 = valor de D dos esporos de referência (5.1.2) a 121°C,N0 = número inicial de microrganismos viáveis,N = número final de microrganismos viáveis,IF = factor de inactivação.

Z =

D1 = valor de D do microrganismo à temperatura T1,D2 = valor de D do microrganismo à temperatura T2.

IF = N0 – N = 10t/D

t = tempo de exposição,D = valor de D do microrganismo nas condições de

exposição.

T2 – T1��log D1 – log D2

5.1.5. Aplicação do conceito F0 à esterilização pelo vapor das preparações aquosas


5. Textos gerais

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5.2. TEXTOS GERAISSOBRE VACINAS

5.2. Textos gerais sobre vacinas ...................................... 5235.2.1. Terminologia utilizada nas monografias

das vacinas .................................................... 5235.2.2. Bandos de frangos isentos de

microrganismos patogénicos específicos para a produção e o controlo da qualidade das vacinas .................................................... 523

5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação de vacinas para uso humano ........................ 525

5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparação de vacinas para uso veterinário .................... 529

5.2.5. Substâncias de origem animal utilizadas napreparação de vacinas para uso veterinário .......... 531

5.2.6. Avaliação da inocuidade das vacinas para usoveterinário .................................................................. 532

5.2.7. Avaliação da eficácia das vacinas para uso veterinário .............................................................. 534

5.2.8. Minimização do risco da transmissão de agentes de encefalopatias espongiformes animais por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinário .............................................. 534

5.2.9. Avaliação da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinário .................................. 538

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5.2. TEXTOS GERAIS SOBRE VACINAS

5.2.1. TERMINOLOGIA UTILIZADA NAS MONOGRAFIAS DAS VACINAS

Sistema de lote semente. Sistema em que lotes sucessivos deum produto derivam do mesmo lote semente primário. Para aprodução de rotina, um lote semente de trabalho é preparadoa partir do lote semente primário. A origem e a história daspassagens do lote semente primário e do lote semente detrabalho são registadas.

Lote semente primário. Cultura de um microrganismodistribuída, a partir de um único granel, em recipientesprocessados em conjunto numa única operação de forma aassegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir acontaminação. Um lote semente primário na forma liquida énormalmente conservado a uma temperatura igual ouinferior a -70°C. Um lote semente primário liofilizado éconservado a uma temperatura que reconhecidamenteassegure a sua estabilidade.

Lote semente de trabalho. Cultura de microrganismo a partirdo lote semente primário e que se destina a ser utilizado naprodução. Os lotes semente de trabalho são distribuídos emrecipientes e conservados como descrito anteriormente para olote semente primário.

Sistema de banco de células. Sistema em que lotes sucessivosde um produto são fabricados a partir de culturas de célulasque derivam do mesmo banco de células primário. Utiliza-seum certo número de recipientes do banco de células primáriopara preparar o banco de células de trabalho. O sistema debanco de células é validado no nível máximo de passagens quese atinge na produção de rotina.

Banco de células primário. Uma cultura de células distribuídaem recipientes numa única operação, processados emconjunto e conservados de forma a assegurar a uniformidadee a estabilidade e a prevenir a contaminação. Um banco decélulas primário é normalmente conservado a umatemperatura igual ou inferior a -70°C.

Banco de células de trabalho. Cultura de células derivada dobanco de células primário e destinada a ser utilizada napreparação de culturas de células de produção O banco decélulas de trabalho é distribuído em recipientes e processadoe conservado como descrito para o banco de célulasprimário.

Cultura de células primárias. Cultura de células obtida portripsinização de um órgão ou tecido apropriado. As célulassão essencialmente idênticas às do tecido animal de origem enão têm mais do que 5 passagens in vitro após a preparaçãoinicial obtida a partir do tecido animal.

Linhas celulares. Cultura de células com elevada capacidadede multiplicação in vitro. Nas linhas celulares diplóides, ascélulas têm essencialmente as mesmas características que asdo tecido animal de origem. Nas linhas celulares contínuas,as células são capazes de se multiplicarem indefinidamenteem cultura e podem ser obtidas de tecidos sãos ou tumorais.Algumas linhas celulares contínuas podem, em certascondições, ter actividade oncogénica.


5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

Cultura de células de produção. Cultura de células derivadade um ou de vários recipientes do banco de células detrabalho ou cultura de células primárias destinadas a serutilizadas na produção.

Células testemunha. Quantidade de células reservadas, nomomento da inoculação do vírus, a servirem de célulastestemunha não inoculadas. As culturas são incubadas emcondições similares às culturas celulares utilizadas na produção.

Colheita única. Material colhido por uma ou várias vezes deuma única cultura celular de produção inoculada com omesmo lote semente de trabalho ou com uma suspensãoproveniente do lote semente de trabalho, incubado e colhidonum único ciclo de produção.

Mistura monovalente de colheitas. Mistura de colheitascontendo a mesma estirpe ou tipo de microrganismo ouantigénio e derivadas de ovos, de recipientes de culturascelulares etc. e processadas ao mesmo tempo.

Granel final. Produto submetido a todas as fases de fabrico comexclusão do acondicionamento final. É constituído por uma ouvárias misturas de colheitas monovalentes, provenientes deculturas de uma ou mais espécies ou tipos de microrganismos,após eventual clarificação, diluição ou adição de adjuvante ououtra substância auxiliar. É tratado de forma a assegurar a suahomogeneidade e utilizado para enchimento dos recipientespertencentes a um ou a vários lotes finais.

Lote final. Um conjunto de recipientes definitivos, fechados, oude outras unidades de dosagem, que se espera seja homogéneonomeadamente no que respeita ao risco de contaminaçãodurante o enchimento ou preparação do produto final. Asunidades de dosagem são cheias ou preparadas de formadiferente, a partir do mesmo granel final, liofilizadas emconjunto, se for o caso, e fechadas numa única sessão contínuade trabalho. Levam um número ou um código de identificaçãoque identifica o lote final. Quando o granel final é cheio e/ouliofilizado em várias sessões de trabalho diferentes, resultamvários lotes finais aparentados (também chamados sublotes oulotes de repartição) que normalmente são identificados comuma parte comum no número ou código de identificação.

Vacinas combinadas. Preparação com vários componentes,formulada de tal forma que os vários antigénios sãoadministrados simultaneamente. Os diferentes componentesantigénicos destinam-se a proteger contra diferentes tipos ouestirpes do mesmo microrganismo e/ou contra diferentesespécies de microrganismos. Uma vacina mista pode serapresentada pelo fabricante, quer sob a forma de umapreparação líquida única ou liofilizada, quer sob a forma devários constituintes acompanhados das indicações necessáriaspara a mistura antes da utilização.

5.2.2. BANDOS DE FRANGOS ISENTOSDE MICRORGANISMOS PATOGÉNICOSESPECÍFICOS PARA A PRODUÇÃO E O CONTROLO DA QUALIDADE DAS VACINAS

INTRODUÇÃO

Quando uma monografia o especifica, os frangos, ovosembrionados e culturas celulares utilizados para a produção e

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controlo de qualidade das vacinas são obtidos a partir de ovosproduzidos por um bando de frangos isentos demicrorganismos patogénicos específicos (SPF). A qualidade deum bando SPF é assegurada por meio do sistema descrito aseguir. A lista de microrganismos estabelecida é baseada nosconhecimentos actuais e será actualizada sempre que fornecessário.

PRINCÍPIOS GERAIS E MÉTODOS

Um bando é definido como um grupo de aves pertencentes aum meio ambiente comum e cujo criador não teve nenhumcontacto com bandos não SPF. Uma vez o bando definido, nãose junta qualquer ave não SPF.

Nos bandos SPF estabelecidos numa base de rotação, osnascimentos e a criação do bando de substituição é sempreefectuada em pavilhões com ambiente controlado. Comacordo das Autoridades Nacionais, pode ser admitida aintrodução de ovos embrionados SPF provenientes de umbando SPF controlado, de outro pavilhão do mesmo local. Apartir das 8 semanas de idade, estas aves de substituição sãoconsideradas como um bando e controladas mensalmente deacordo com o descrito em «Ensaios posteriores». Nomomento da postura, todas as aves de substituição sãocontroladas de acordo com o indicado em «Ensaio inicial».

O bando é colocado em condições que reduzam ao mínimo orisco de contaminação. É isolado de qualquer bando não SPF,instalado num isolador ou sobre uma rede, num pavilhão comar filtrado sob pressão positiva. São tomadas medidasapropriadas a fim de impedir o acesso de roedores, avesselvagens, insectos e de pessoas não autorizadas.

O pessoal autorizado a penetrar nas instalações não tevecontacto com nenhuma ave ou agente susceptível de infectaro bando. Aconselha-se ao pessoal a tomar duche e a mudar deroupa ou usar vestuário protector para entrar no pavilhão.

Os produtos introduzidos no pavilhão são esterilizados. Osalimentos são submetidos a tratamento apropriado de modo aevitar a introdução de microrganismos indesejáveis e a águaprovém de um reservatório clorado. Nenhum medicamentoque possa interferir com a detecção de doenças no grupo podeser administrado.

Mantém-se um registo permanente da saúde geral do bando equalquer anomalia é tomada em consideração. Os factores acontrolar compreendem a morbilidade, a mortalidade, acondição física geral, o consumo de alimentos, a posturadiária e a qualidade dos ovos, a fertilidade e taxa denascimentos. Os ovos sujos são eliminados; a superfície dosovos limpos ainda quentes pode ser desinfectada.

O bando provém de frangos isentos de agentes patogénicostransmitidos por via vertical. Em particular, cada frango quedá origem ao bando é objecto de controlo repetido paraassegurar que está isento do vírus da leucose e dos seusanticorpos. A fim de estabelecer o estatuto SPF de um bando,este é mantido nas condições SPF durante um período deensaio de, pelo menos, 4 meses. Demonstra-se, após 6semanas e no fim do período do ensaio, que todos os animaisdo bando estão isentos de qualquer manifestação de infecçãoprovocada pelos agentes que figuram na lista da rubrica«Ensaio inicial».

Para cada nova geração de um determinado bando, atotalidade do bando é controlada o mais tardar até à idade de20 semanas, utilizando os ensaios prescritos em «Ensaioinicial». Após o ensaio inicial, efectuam-se mensalmente os

ensaios prescritos em «Ensaios posteriores» numa amostrarepresentativa de 5 por cento (10 aves, no mínimo, e 200, nomáximo) com um ensaio final de 4 semanas após a últimacolheita de ovos.

No momento escolhido, colhem-se amostras de sangue, de umnúmero apropriado de aves, para todos os ensaios. As amostrasde soro obtidas são analisadas para pesquisa de anticorposcontra os agentes correspondentes. Os ensaios deseroneutralização são efectuados em misturas de 5 soros, nomáximo. Todos os outros ensaios são efectuadosindividualmente em cada soro. Utilizam-se controlos positivos enegativos em todos os ensaios. Os reagentes utilizados nosensaios são aferidos em relação aos reagentes padrãointernacionais ou europeus, caso estes estejam disponíveis. Nocaso do vírus da leucose aviária, além da pesquisa de anticorposefectuada nas amostras do soro, são colhidas amostrasapropriadas para pesquisa do vírus.

Além dos ensaios serológicos, efectua-se um exame clínicouma vez por semana, pelo menos, a fim de verificar se as avesestão isentas do vírus da varíola aviária e de sinais de outrasinfecções. Em caso de mortalidade, efectuam-se examesnecrópsicos e, quando necessário para confirmação dodiagnóstico, exames histopatológicos para verificar se as avesmortas estão ou não isentas de qualquer sinal de infecção.Verifica-se a ausência de Salmonella spp, pelo exame deculturas de amostras de fezes, pelo menos uma vez em cada 4 semanas; pode utilizar-se para os ensaios uma mistura de 10 amostras, no máximo.

Se se obtiver um resultado positivo num ensaio efectuadopara definir o estatuto SPF de um bando, este não pode serqualificado SPF. Se se obtiver um resultado positivo numensaio efectuado num bando definido como SPF, o bandoperde o estatuto SPF. Como se descreve a seguir, aplicam-sedisposições especiais para o agente da anemia dos pintos(AAP). Nenhum frango, embrião ou cultura celular, recolhidoapós o último ensaio negativo é utilizado e todos os produtosobtidos a partir destas colheitas são destruídos e os ensaios decontrolo de qualidade efectuados com estes produtos não sãoválidos, devendo ser repetidos.

Para voltar a ter o estatuto SPF, o bando é mantido nascondições SPF e os ensaios de rotina mensais continuam a serefectuados em 5 por cento do bando, excepto para a detecçãodo agente causal de infecção que originou o resultado positivo,em que o ensaio é efectuado mensalmente em todas as aves dobando. As aves infectadas e a sua descendência são retiradas dobando. O bando volta a ter o estatuto SPF após 2 ensaiosconsecutivos totalmente negativos.

Um resultado positivo no ensaio de pesquisa do AAP nãoexclui necessariamente a utilização dos produtos do bando.No entanto, as vacinas vivas preparadas com substratosprovenientes dos bandos SPF e destinadas a aves com menosde 7 dias de idade, são preparadas com substratos isentos doAAP. As vacinas inactivadas administradas a aves com menosde 7 dias podem ser produzidas a partir de materialproveniente de bandos sem prova de estarem isentos do AAP,com a condição de se demonstrar que o método deinactivação utilizado é eficaz para o AAP.

Mantém-se durante, pelo menos, cinco anos, um registopermanente da mortalidade e dos resultados dos controlosefectuados no bando. Qualquer constatação da diminuição dapostura ou da taxa de nascimentos, excepto os casosacidentais identificados como sendo de origem não infecciosae a obtenção de resultados indicando a existência de infecçãopor um agente específico são imediatamente comunicados aoutilizador dos ovos.

5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas


5. Textos gerais

15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 524

ENSAIO INICIAL

Sob reserva de autorização das Autoridades Nacionais,podem ser utilizados outros tipos de ensaios desde quepossuam uma sensibilidade pelo menos igual á do tipo deensaio indicado e uma especificidade apropriada.

5.2.3. SUBSTRATOS CELULARESUTILIZADOS NA PREPARAÇÃO DE VACINAS PARA USO HUMANO

O presente capítulo geral trata das linhas celulares diplóides e das linhas celulares continuas utilizadas na preparação de vacinas para uso humano; os aspectos específicos das vacinas preparadas com a tecnologia do ADN recombinante são tratados na monografia «Produtos obtidos pela tecnologia do ADN recombinante». O quadro fornece uma lista de ensaios a efectuar nas diferentes etapas (células semente, banco de células primário, banco de células de trabalho, células pertencentes ao nível de duplicação da população, pelo menos, igual ao nível máximo que irá ser utilizado na produção). Descrevem-se a seguir as disposições gerais respeitantes à utilização das linhas celulares e à aplicação dos métodos de ensaio.

Quando uma vacina é produzida com células primárias, ou células que foram submetidas apenas a uma pequeno número de passagens, sem constituição de um banco de células, as exigências aplicáveis à vacina constam da monografia específica.

Linhas celulares diplóides. A linha celular diplóide possui umacapacidade elevada mas definida de multiplicação in vitro.

Linhas celulares contínuas. Uma linha celular contínuapossui uma capacidade ilimitada de multiplicação in vitro;muitas vezes as células apresentam diferenças de cariotipocom as células de origem; podem ser obtidas a partir de umtecido saudável ou de um tecido tumoral.


5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação de vacinas para uso humano

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Tipo de ensaio

Imunoadsorção com enzimaconjugada

Inibição de hemoaglutinação

Anticorpos fluorescentes




Seroneutralização contra cadaserotipo presente no país de origem


Seroneutralização

Imunoadsorção com enzimaconjugada para o vírus eseroneutralização para osanticorpos


Inibição de hemoaglutinação



lmunoadsorção com enzimaconjugada

Aglutinação e, para confirmarum ensaio positivo, inibição dehemoaglutinação


Aglutinação

Tipo de ensaio


Inibição de hemaglutinação


Microrganismo

Adenovirus aviários

Adenovírus hemoaglutinanteaviário (Vírus da doença dos ovosmoles; vírus do síndrome da quedada postura 76 – EDS 76

Agente da anemia dos pintos

Reovírus aviários

Vírus da encefalomielite aviária

Vírus da bronquite infecciosaaviária

Vírus da bursite aviária

Vírus da gripe tipo A

Vírus da laringotraqueíteinfecciosa aviária

Vírus da leucose aviária

Vírus da doença de Marek

Vírus da doença de Newcastle

Vírus da nefrite aviária

Vírus via reticuloendotelioseaviária

Vírus da rinotraqueíte do perú

Mycoplasma gallisepticum

Mycoplasma synovise

Sallmonella pulloram

Microrganismo

Adenovírus aviários

Adenovírus hemaglutinanteaviário

Agente da anemia dos pintos

ENSAIOS POSTERIORES

Sob reserva de autorização das Autoridades Nacionais,podem ser utilizados outros tipos de ensaios desde quepossuam uma sensibilidade pelo menos igual à do tipo deensaio indicado e uma especificidade apropriada.

Microrganismo

Reovírus aviários

Vírus da encefalomielite aviária

Vírus da bronquite infecciosaaviária

Vírus da bursite aviária

Vírus da gripe tipo A

Vírus da laringotraqueíteinfecciosa aviária

Vírus da leucose aviária

Vírus da doença de Marek

Vírus da doença de Newcastle

Vírus da nefrite aviária

Vírus via reticuloendotelioseaviária

Vírus da rinotraqueíte do perú

Mycoplasma gallisepticum

Mycoplasma synovise

Sallmonella pulloram

Tipo de ensaio




Imunodifusão contra cadaserotipo presente no país de origem


Seroneutralização

Imunoadsorção com enzimaconjugada para os anticorpos


Inibição de hemaglutinação



lmunoadsorção com enzimaconjugada



Aglutinação

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No caso de vacinas injectáveis preparadas com uma linha celular contínua, o procedimento de purificação é validado para se demonstrar a redução da concentração de ADN das células do substrato até um nível equivalente, no máximo, a 10 ng por dose humana unitária, salvo indicação em contrário.

Sistema de banco de células. A produção de vacinas emlinhas celulares contínuas ou em linhas celulares diplóidesbaseia-se num sistema de banco de células. A idade in vitrodas células é contada a partir do lote semente primário. Cadabanco de células de trabalho é preparado a partir de 1 ouvários recipientes do banco de células primário. A utilização,a identidade e o inventário dos recipientes sãominuciosamente registados.

Meios e substâncias de origem humana ou animal. Acomposição dos meios utilizados para o isolamento e para oconjunto das culturas posteriores é minuciosamenteregistado; se são utilizadas substâncias de origem humana ouanimal, elas estão isentas de agentes estranhos.

Se for utilizada albumina humana, ela está em conformidade com a monografia «Solução de albumina humana». Através de ensaios apropriados, demonstra-se que os soros de origem bovina utilizados para a preparação e manutenção das culturas celulares são estéreis e isentos de vírus bovinos, nomeadamente do vírus da diarreia bovina assim como de micoplasmas.

Efectuam-se ensaios apropriados na tripsina utilizada para apreparação das culturas celulares para demonstrar a



5. Textos gerais

EnsaioCélulassemente

Bancode célulasprimário(BCP)

Bancode células

de trabalho(BCT)

Células do nível de duplicação de população pelo menos igual

ao nível máximo que irá ser utilizado na produção

QUADRO 1 – Ensaios efectuados nas linhas celulares

Morfologia

Selecção apropriada entre os seguintesensaios (por ex. isoenzimas), imunológicos(por ex. histocompatibilidade), marcadorescitogenéticos, impressão genómica

Cariotipo (linhas celulares diplóides)

Longevidade das células (linhascelulares diplóides)

Contaminação bacteriana e fúngica

Micoplasmas

Ensaio em culturas celulares

Co-cultura

Ensaios em animais e em ovos

Pesquisa específica de potenciaiscontaminantes de acordo com a origem dascélulas (ver a seguir em «Agentescontaminantes infecciosos»)

Retrovírus

Poder tumorígeno

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1. IDENTIDADE E PUREZA

2. AGENTES ESTRANHOS

3. PODER TUMORÍGENO

(1) A característica diplóide demonstra-se para cada banco de células de trabalho utilizando-se as células com nível de duplicação da população, pelo menos,igual ao nível máximo que irá ser utilizado para a produção.

(2) Ensaio efectuado em cada banco de células de trabalho utilizando-se as células com nível de duplicação da população, pelo menos, igual ao nível máximo queirá ser utilizado para a produção.

(3) Ensaio efectuado em cada banco de células primárias utilizando-se as células com nível de duplicação da população, pelo menos, igual ao nível máximo queirá ser utilizado para a produção.

(4) As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 são reconhecidas como não possuindo poder tumorígeno e não necessitam do ensaio de poder tumorígeno. Osensaios de poder tumorígeno já não são realizados em linhas celulares com poder tumorígeno conhecido ou previsto.

15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 526

esterilidade e a ausência de micoplasmas e de vírus,nomeadamente de pestivírus e parvovírus.

Células semente. Os dados na base dos quais é avaliada aaceitabilidade das células semente compreendem, sempre quepossível, a origem, a história e a caracterização.

Origem das células semente. Para as linhas celulareshumanas, o dossier contem as seguintes informações dodador: origem étnica e geográfica, idade, sexo, estadofisiológico geral, tecido ou órgão utilizado, resultados daeventual pesquisa de agentes patogénicos.

Para as linhas celulares animais, o dossier contém asseguintes informações da origem das células: espécie,linhagem, condições de exploração, origem geográfica, idade,sexo, estado fisiológico geral, tecido ou órgão utilizado,resultados da eventual pesquisa de agentes patogénicos.

As células de origem neural (por exemplos os neuroblastomase as células P12) podem conter substâncias que concentremos agentes das encefalopatias espongiformes; estas células nãosão utilizadas na produção de vacinas.

História das células semente. O dossier contem as seguintesinformações: método utilizado para isolar as células semente,os métodos de cultura e qualquer outro procedimentoutilizado para estabelecer o banco de células primário,nomeadamente aqueles susceptíveis de provocar umaexposição das células a agentes estranhos.

As informações disponíveis sobre os ingredientes dos meiosde cultura das células, por exemplo a proveniência dassubstâncias de origem animal, são muitas vezes incompletas;em casos justificados e autorizados, os bancos de células jáestabelecidos com esses meios podem ser utilizados para aprodução de vacinas.

Caracterização das células semente. A caracterização dascélulas semente assenta nos seguintes aspectos:

(1) identidade (por exemplo isoenzimas, serologia, impressãogenómica),

(2) características de crescimento e propriedades morfológicas(microscopia óptica e electrónica),

(3) cariotipo das linhas celulares diplóides,

(4) longevidade in vitro das linhas celulares diplóides, emtermos do nível de duplicação da população

Estabilidade dos substratos celulares. Demonstra-se que alinha celular tem uma viabilidade apropriada nas condiçõesprevistas para a sua conservação. Para cada produto preparadocom a linha celular, é necessário demonstrar que pode serobtida uma produção reprodutível com as célulaspertencentes aos níveis de passagens situadas entre o início eo fim da duração prevista de utilização.

Agentes contaminantes infecciosos. As linhas celularesutilizadas para a produção de vacinas estão isentas de agentesinfecciosos. As pesquisas de agentes contaminantes efectuam-se como indicado no quadro.

Consoante a origem e a história da linha celular, pode sernecessária a pesquisa de alguns potenciais contaminantesespecíficos, nomeadamente aqueles que reconhecidamenteconstituem agentes infecciosos latentes da espécie deorigem (por exemplo o vírus símio 40 para o macaco rhesus).No caso de linhas celulares provenientes de roedores, sãoefectuados ensaios para a produção de anticorpos nomurganho, no rato e no hamster para detectar eventuaisvírus específicos da espécie.

Pesquisam-se retrovírus nas linhas celulares como sedescreve adiante. Se for detectada a presença de retrovíruscapazes de se replicarem, a linha celular não é aceitável para aprodução de vacinas.

Poder tumorígeno. Para a preparação de vacinas vivas, a linhacelular não possui poder tumorígeno ao nível de duplicaçãoda população utilizada na produção.

Se a linha celular com poder tumorígeno for utilizada napreparação de outras vacinas, valida-se o sistema depurificação a fim de demonstrar que a concentração de ADNproveniente das células é equivalente, no máximo, a 10 ngpor dose humana unitária, salvo indicação em contrário e quea concentração em proteínas provenientes das células dosubstrato é reduzida até um limite aceitável.

Se a linha celular possuir um reconhecido poder tumorígeno,não é necessário proceder a ensaios de poder tumorígeno. Seo potencial poder tumorígeno de uma linha celular fordesconhecido, a linha celular é considerada comotumorígena, ou é submetida a um ensaio de podertumorígeno in vitro como adiante se descreve; se osresultados do ensaio in vitro forem negativos ou se não foremclaramente positivos, a linha celular será objecto de umensaio in vivo como adiante se descreve. Os ensaios sãoefectuados em células pertencentes ao nível de duplicação dapopulação, pelo menos, igual ao nível máximo que irá serutilizado na produção. As linhas celulares MRC-5, WI-38 eFRhL-2 são reconhecidas como não possuindo podertumorigeno e não necessitam do ensaio de poder tumorígeno.

Caracterização genómica. Demonstra-se a diploidia das linhas celulares diplóides; se não estiver validada a eliminação de células intactas durante o tratamento após a colheita, é necessário efectuar uma caracterização mais aprofundada pela análise do cariotipo. São examinadas amostras provenientes de 4 níveis de passagens regularmente distribuídas pelo período de vida da linha celular. Cada exame incide em, pelo menos, 200 células em metafase, para se verificar o número exacto de cromossomas e avaliar a frequência de hiperploidia, de hipoploidia, de poliploidia, de fracturas e de anomalias estruturais.

As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 são reconhecidascomo sendo diplóides e bem caracterizadas; desde que nãotenham sido geneticamente modificadas, não é necessárioefectuar uma caracterização mais aprofundada.

MÉTODOS DE ENSAIO APLICÁVEIS ÀS CULTURASCELULARES

Identificação. A identidade das células estabelece-se com basena impressão genómica e numa escolha apropriada dosseguintes aspectos:

(1) características bioquímicas (análise dos isoenzimas),

(2) características imunológicas (antigénios dehistocompatibilidade),

(3) marcadores citogenéticos.

Células contaminantes. As impressões genómicas efectuadascom finalidade de identificação servem igualmente parademonstrar a ausência de células contaminantes.

Contaminação bacteriana e fúngica. O banco de célulasprimário e o banco de células de trabalho satisfazem aoensaio de esterilidade (2.6.1), efectuado para cada meio em 10 ml do sobrenadante das culturas celulares e em 1 porcento dos recipientes, com o mínimo de 2 recipientes.



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Micoplasmas (2.6.7). O banco de células primário e o bancode células de trabalho satisfazem ao ensaio dos micoplasmas,efectuado em 1 ou vários recipientes pelo método cultural epelo método de epifluorescência em culturas celulares.

Pesquisa de agentes estranhos em culturas celulares. Ascélulas satisfazem ao ensaio dos vírus hemadsorventes e aosensaios de pesquisa dos agentes estranhos em culturascelulares que estão descritos no capitulo 2.6.16 em «Culturascelulares de produção: células testemunhas». Se as célulassão de símio, são também inoculadas em culturas de célulasrenais de coelho para pesquisa do herpesvírus B (herpesvírus1 de cercopiteco).

Co-cultura. Co-cultive separadamente células intactas ecélulas lisadas com outros sistemas celulares compreendendocélulas humanas e células de símio. Pesquise a aparição deeventuais alterações morfológicas. Efectue a pesquisa deagentes hemaglutinantes nos líquidos de cultura. As célulassatisfazem ao ensaio se não houver qualquer indicação dapresença de agente estranho.

Retrovírus. Pesquise a eventual presença de retrovírus:

(1) através de ensaio de infectividade,

(2) por microscopia electrónica de transmissão,

(3) se os ensaios (1) e (2) derem resultados negativos, pelapesquisa da transcriptase inversa (em presença domagnésio e do manganésio) realizada nos depósitosobtidos por centrifugação a alta velocidade.

Ensaio em animais. A cada grupo dos seguintes animais,injecte por via intramuscular (ou no caso de murganhosrecém-nascidos, por via subcutânea) 107 células viáveisigualmente repartidas entre os animais do grupo:

(1) 2 ninhadas com, pelo menos, 10 murganhos recém--nascidos com menos de 24 horas de idade,

(2) 10 murganhos adultos.

Injecte por via intracerebral em cada um dos 10 murganhosadultos 106 células viáveis para detecção da eventual presençado vírus da coriomeningite linfocitária.

Mantenha os animais em observação durante, pelo menos, 4semanas. Examine os animais que apresentam sintomas dedoença ou anomalia para determinar a sua causa. As célulassatisfazem ao ensaio se não se observarem sinais de presençade agentes estranhos. O ensaio só é válido se, pelo menos, 80por cento dos animais de cada grupo permanecem de boasaúde e sobrevivem até ao final do período de observação.

No caso de células de roedores (por exemplo células ováricasde hamster chinês ou células renais de hamster recém-nascido), efectue, nos animais aos quais as células foraminjectadas, uma pesquisa de anticorpos contra potenciascontaminantes víricos para a espécie.

Ensaios em ovos. Injecte, pelo menos, 106 células viáveis nacavidade alantóide de cada um de 10 ovos de galinha SPF(5.2.2) com 9 a 11 dias idade, e no saco vitelino de 10 ovos degalinha SPF (5.2.2) com 5 a 6 dias idade. Incube-os durante,pelo menos, 5 dias. Proceda à pesquisa de hemaglutininas noslíquidos alantóides, com eritrócitos mamíferos e aviários;efectue o ensaio a temperaturas de 5 ± 3°C e 20-25°C eproceda à leitura dos resultados decorridos 30 a 60 min. Ascélulas satisfazem ao ensaio se não se observar qualquer sinalda presença de agentes estranhos. O ensaio só é válido se,pelo menos, 80 por cento dos embriões permanecem sãos esobrevivem até ao final do período de observação.

Ensaio de poder tumorígeno in vitro. Podem ser utilizadosos seguintes ensaios:

(1) formação de colónias em gelose mole,

(2) produção de crescimento celular invasivo após inoculaçãoem culturas de órgãos,

(3) estudo da actividade de transformação através, porexemplo, do sistema de prova 3T3 que põe em evidência apresença de oncogenes activos.

Ensaio de poder tumorígeno in vivo. O ensaio consiste emestabelecer uma comparação entre a linha celular continua euma testemunha positiva apropriada (por exemplo célulasHeLa ou Hep2).

São apropriados os seguintes sistemas animais:

(1) murganhos atímicos (genotipo Nu/Nu),

(2) murganhos, ratos ou hamsters recém-nascidos tratadoscom soro ou com globulina antitimocitária,

(3) murganhos timectomizados e irradiados que foram recons-tituídos CF-, B+) com medula óssea de murganhos sãos.

Qualquer que seja o sistema animal escolhido, a linha celulare as células de referência são injectadas em grupos distintosde 10 animais cada um. Em ambos os casos, o inóculo poranimal é de 107 células em suspensão num volume de 0,2 mle a injecção pode ser por via intramuscular ou subcutânea. Sese utiliza animais recém-nascidos, estes são tratados com 0,1 ml de soro ou globulina antitimocitária nos dias 0, 2, 7 e14 após o nascimento. São considerados soros ou asglobulinas activos aqueles que suprimem os mecanismosimunitários dos animais em crescimento ao ponto de ainoculação das 107 células de referência positivas produziremregularmente de tumores e metástases. Se os animais foremseveramente afectados e apresentarem sem ambiguidadestumores de crescimento progressivo, sacrifique-os antes dofinal do ensaio para evitar sofrimento inútil.

No final do período de observação, sacrifique e examine todosos animais, incluindo os grupos testemunhas; pesquise, nolocal de injecção e noutros órgãos por exemplo, os gânglioslinfáticos, os pulmões, os rins e o fígado), sinaismacroscópicos e microscópicos de proliferação das célulasinoculadas.

Em todos os casos, examine os animais em intervalosregulares procedendo à palpação para detectar a formaçãoeventual de nódulos nos locais de injecção. Meça os nódulosem 2 direcções perpendiculares e registe regularmente osresultados das medições para determinar se são decrescimento progressivo. Se alguns animais apresentarem,durante a observação, nódulos com sinais de regressão,sacrifique-os antes que os nódulos não sejam detectáveis àpalpação e proceda a um examine histológico. Observe osanimais que apresentam nódulos em crescimentoprogressivo durante 1-2 semanas. Nos animais que nãoapresentam formação de nódulos, metade são observadosdurante 3 semanas e a outra metade durante 12 semanas,antes de serem sacrificados para se proceder à observaçãohistológica.

Efectue uma necrópsia em cada animal, para pesquisa nolocal de injecção e em outros órgãos (por exemplo: gânglioslinfáticos, pulmões, cérebro, baço, rins, fígado),nomeadamente sinais macroscópicos de formação tumoral.Proceda ao exame histológico de todas as lesões comaparência tumoral e do local de injecção. Além disso, dadoque algumas linhas celulares podem dar metástases semmanifestação de crescimento tumoral local, proceda



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sistematicamente em todos os animais, ao exame histológicodos gânglios linfáticos regionais detectáveis e dos pulmões.

O ensaio só é válido se, pelo menos, 9 dos 10 animaisinoculados com células de referência positivas apresentaremtumores de crescimento progressivo.

5.2.4. CULTURAS CELULARESUTILIZADAS NA PREPARAÇÃO DE VACINAS PARA USO VETERINÁRIO

As culturas celulares utilizadas na preparação de vacinas parauso veterinário satisfazem às exigências descritas nestasecção. Pode também ser necessário que as culturas celularesutilizadas no controlo das vacinas satisfaçam todas oualgumas destas exigências.

Para a maioria dos vírus dos mamíferos é possível a suamultiplicação em células de linha celulares, não sendo porisso aceite a utilização de células primárias.

As células cronicamenie infectadas utilizadas na preparação devacinas veterinárias satisfazem às exigências que lhes sãoaplicáveis descritas a seguir. Demonstra-se que as células seencontram infectadas apenas com o agente indicado.

LINHAS CELULARES

As linhas celulares utilizadas na produção são normalmenteobtidas através de um sistema de banco de células. Cadabanco de células primário é identificado com um códigoespecífico. O banco de células primário é conservado emalíquotas a uma temperatura igual ou inferior a -70°C. Nãosão utilizadas na produção de vacinas células que tenhamsido submetidas a um número de passagens superior a 20 apartir do banco de células primário. Quando se utilizamculturas de células em suspensão, um aumento do númerode células correspondente a três duplicações da populaçãoequivale aproximadamente a uma passagem. Se as célulasutilizadas na produção tiverem sido submetidas a umnúmero de passagens superior a 20, demonstra-se, porvalidação ou através de novos ensaios, que as células deprodução são sensivelmente idênticas às células do banco decélulas primário no que diz respeito às característicasbiológicas e à pureza, e que a sua utilização não tem efeitosprejudiciais na produção da vacina.

É conhecida com detalhe e registada por escrito a históriada linha celular (por exemplo, origem, número de passagense o meio utilizado na multiplicação, condições deconservação).

Fica registada uma descrição dos métodos de conservação ede utilização das células, incluindo pormenores que permitamassegurar que durante a produção o número de passagenspermitidas não é ultrapassado.

Conservam-se, para fins analíticos, quantidades suficientes dobanco de células primário e de cada banco de células detrabalho.

Os ensaios descritos a seguir são efectuados em culturas dobanco de células primário e do banco de células de trabalhoou em células do banco de células de trabalho com o númeromáximo de passagens admitido para a produção eprovenientes de uma amostra homogénea e representativa.Demonstra-se a representatividade da amostra.

QUADRO 2 – Fases das culturas celulares em que os ensaios são efectuados

Banco de Banco de Células do bancocélulas células de células de

primário de trabalho trabalho com onúmero máximo

de passagens

Microscopia geral + + +Bactérias e fungos + + –Micoplasmas + + –Vírus + + –Identificação da espécie + – +Análise cariotípica + – +Poder tumorígeno + – –

Características das culturas. Descreve-se o aspecto do tapetecelular antes e depois da coloração histológica. Regista-se, sepossível sob a forma numérica, a informação relativaespecialmente à velocidade e à taxa de crescimento. Éigualmente indicada a presença ou ausência de inibição porcontacto, de células plurinucleadas ou de qualquer outraanomalia celular.

Análise cariotípica. Efectua-se um exame cromossómico empelo menos 50 células em mitose do banco de célulasprimário e da passagem máxima admitida para a produção.Qualquer marcador cariotípico presente nas células do bancode células primário é encontrado nas células com o númeromáximo de passagens. O número de cromossomas (valormodal) nas células da passagem máxima não é superior a 15por cento do valor obtido no banco de células primário. Oscariotipos são idênticos. Se o número de cromossomas forsuperior ao valor declarado, se alguns marcadores cariotípicosnão forem encontrados nas células do banco de células detrabalho com o número máximo de passagens utilizado naprodução, ou se os cariotipos forem diferentes, a linha celularnão é utilizada no fabrico de vacinas.

Identificação da espécie. Demonstra-se, por um métodovalidado, que as células do banco de células primário e dobanco de células de trabalho com o número máximo depassagens utilizado na produção pertencem à espécie indicadapelo fabricante.

Quando se efectua um ensaio de imunofluorescência com osoro específico da espécie de origem das células e se verificaque todas as células apresentam fluorescência, não énecessário realizar outros ensaios com reagentes capazes dedetectar contaminação com células de outras espécies.

Contaminação bacteriana e fúngica. As células satisfazem aoensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de células contém,pelo menos, o número de células de um tapete celular comuma área de 70 cm2 e para células em suspensãoaproximadamente o mesmo número de células. Antes de serealizar e ensaio, as células são mantidas em cultura durante,pelo menos, 15 dias, sem antibióticos.

Micoplasmas (2.6.7). As células satisfazem ao ensaio dosmicoplasmas. Antes de se realizar a ensaio, as células sãomantidas em cultura durante. pelo menos, 15 dias, semantibióticos.

Ausência de vírus contaminantes. Por técnicas apropriadas, epelos ensaios descritos a seguir, verifica-se a ausência dequalquer contaminação par vírus.

Os tapetes celulares examinados têm uma área de, pelomenos, 70 cm2, são preparados e mantidos em cultura no


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mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condiçõesque as células utilizadas na preparação da vacina. Os tapetescelulares são mantidos em cultura, pelo menos durante 28dias no total. As subculturas realizam-se com intervalos de 7dias, a não ser que seja impossível manter as células com vidadurante tanto tempo. Neste caso, convém realizar assubculturas com intervalos inferiores, mas tão longos quantopossível. O número de células que se obtém na últimasubcultura, em recipientes apropriados, é suficiente para seefectuarem os ensaios descritos a seguir.

Os tapetes celulares são examinados regularmente durante operíodo de incubação para se detectar eventuais efeitoscitopatogénicos e, no final do período de observação, sãosubmetidos aos ensaios para pesquisa de víruscitopatogénicos, vírus hemadsorventes e vírus específicos,estes últimos efectuados por imunofluorescência ou porqualquer outro método apropriado a seguir indicado.

Detecção de vírus citopatogénicos. Efectue, com um coranteapropriado, a coloração citológica a 2 tapetes celulares com,pelo menos, 6 cm2 cada um. Examine toda a superfície dostapetes celulares corados e verifique a presença eventual decorpos de inclusão, de células gigantes em númeroanormalmente elevado ou de qualquer outra lesão indicativade anomalias celulares que possam ser atribuídas a um agentecontaminante.

Detecção de vírus hemadsorventes. Lave várias vezes, comuma solução tampão apropriada, tapetes celulares com umaárea total de 70 cm2. Adicione uma suspensão apropriada dehemácias em volume suficiente para cobrir uniformemente asuperfície dos tapetes celulares. Decorridos diferentes temposde incubação, verifique a presença de hemadsorção.

Detecção de vírus específicos. Verifique através de ensaiosapropriados a ausência de contaminantes específicos daespécie de origem da linha celular e das espécies às quais oproduto se destina. Para poder efectuar os ensaios de detecçãode vírus específicos prepare, em suportes adequados, umnúmero suficiente de células. É incluído em cada ensaio umnúmero apropriado de controlos positivos. Os ensaiosrealizam-se, por exemplo, com anticorpos conjugados comfluoresceína ou reagentes similares.

Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha detapetes celulares com uma superfície total de, pelo menos,140 cm2. Congele e descongele as células pelo menos 3 vezese a seguir elimine por centrifugação os fragmentos celulares.Inocule partes alíquotas do líquido obtido, em células comuma confluência inferior ou igual a 70 por cento, dosseguintes tipos:

– células primárias da espécie de origem,

– células sensíveis aos vírus patogénicos para as espécies alvoda vacina,

– células sensíveis aos pestivírus.

Mantenha as células inoculadas em cultura durante, pelamenos, 7 dias, prepare os extractos congelação-descongelaçãocomo se descreveu anteriormente e inocule em culturasfrescas de células do mesmo tipo numa quantidade suficienteque permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube ascélulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas sãoexaminadas regularmente para se detectar a presença dequalquer efeito citapatogénico devido a microrganismos vivos.

Ao fim do período de 14 dias, as células inoculadas sãosubmetidas ao seguinte controlo:

– verificação da ausência de microrganismos citopatogénicosou hemadsorventes pelos métodos anteriormente indicados,

– verificação da ausência de pestivírus ou outroscontaminantes específicos por imunofluorescência ououtros métodos validados («Detecção de vírusespecíficos»).

Poder tumorígeno. Se necessário, efectuam-se ensaios paraavaliar o risco potencial da linha celular para as espécies alvo.

CÉLULAS PRIMÁRIAS

A utilização de células primárias como substrato de fabrico devacinas destinadas aos mamíferos não é na maior parte doscasos aceite, uma vez que se podem utilizar linhas celulares.Na entanto, se não houver alternativa à utilização de célulasprimárias, estas provêm de explorações ou de bandos isentosde microrganismos patogénicos específicos, completamenteprotegidos contra a introdução de doenças (barreirassanitárias. filtros nas entradas de ar, sistema apropriado dequarentena antes da introdução de animais). No caso de setratar de bandos de frangos, estes satisfazem as exigênciasprescritas em «Bandos de Frangos isentos de MicrorganismosPatogénicos Específicos para a Produção e o Controlo daQualidade de Vacinas» (5.2.2). No caso de se tratar de outrosanimais, demonstra-se que a exploração se encontra isenta demicrorganismos patogénicos específicos. Também osreprodutores da exploração de onde se obtêm as célulasprimárias destinadas ao fabrico de vacinas são submetidos acontrolos que incluiem, pelo menos, 2 exames serológicos derotina por ano e, entre estes, 2 exames serológicossuplementares em 15 por cento dos reprodutores.

Particularmente no caso de células de mamíferos, éconveniente utilizar, sempre que possível, um sistema de lotesemente que compreenda, por exemplo, um banco de célulasprimário submetido a menos de 5 passagens e um banco decélulas de trabalho que não tenha sido submetido a mais daque 5 passagens a partir da suspensão celular inicial obtidados tecidos animais.

O banco de células primário, banco de células de trabalho e ascélulas com o número máximo de passagens utilizado naprodução são submetidos aos ensaios indicados no quadro 3de acordo com os métodos descritos a seguir. A amostra cobretodo o tipo de células utilizadas no fabrico da lote. Nenhumlote de vacina produzida com estas células pode ser libertadose algum dos ensaios não der resultados satisfatórios.

QUADRO 3 – Fases das culturas de células primárias em que os ensaios são efectuados

Banco de Banco de Nível máximocélulas células de passagens

primário de trabalho

Microscopia geral + + +Bactérias e fungos + + –Micoplasmas + + –Vírus + + –Identificação da espécie + – –

Características das culturas. Descreve-se o aspecto do tapetecelular antes e depois da coloração histológica. Registam-se,se possível sob a forma numérica, informações relativasespecialmente à velocidade e à taxa de crescimento. Indica-seigualmente a presença ou ausência de inibição por contacto,de células plurinucleadas ou de qualquer outra anomaliacelular.

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Identificação da espécie. Demonstra-se, por um métodovalidado, que as células do banco de células primáriopertencem à espécie indicada.

Quando se efectua um ensaio de imunofluorescência com osoro específico da espécie de origem das células e se verificaque todas as células examinadas apresentam fluorescência, nãoé necessário realizar outros ensaios com reagentes capazes dedetectar contaminação com células de outras espécies.

Esterilidade bacteriana e fúngica. As células satisfazem aoensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de células contém,pelo menos, o número de células de um tapete celular comuma área de 70 cm2 ou, para as células em suspensão,aproximadamente o mesmo número de células. Antes de serealizar o ensaio, as células são mantidas em cultura durante,pelo menos, 15 dias, sem antibióticos.

Micoplasmas (2.6.7). As células satisfazem ao ensaio dosmicoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as células sãomantidas em cultura durante, pelo menos, 15 dias, semantibióticos.

Ausência de vírus contaminantes. Pelos ensaios descritos aseguir, verifica-se a ausência de qualquer contaminação porvírus.

Os tapetes celulares examinados têm uma área de, pelomenos, 70 cm2 e são preparados e mantidos em cultura nomesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condiçõesque as células utilizadas na preparação da vacina.

Os tapetes celulares são mantidos em cultura, pelo menos,durante 28 dias no total ou durante o período mais longopossível, se 28 dias for impossível. As subculturas realizam-secom intervalos de 7 dias, a não ser que seja impossível manteras células com vida durante tanto tempo. Neste caso, convémrealizar as subculturas com intervalos inferiores, mas tãolongos quanto possível. O número de células que se obtém naúltima subcultura, em recipientes apropriados, é suficientepara se efectuarem os ensaios descritos a seguir.

Os tapetes celulares são examinados regularmente durante operíodo de incubação para se detectar eventuais efeitoscitopatogénicos e, no final do período de observação, sãosubmetidos aos ensaio para pesquisa de vírus citopatogénicos,vírus hemadsorventes e vírus específicos, estes últimosefectuados por imunofluorescência ou por qualquer outrométodo apropriado como se indica a seguir.

Detecção de vírus citopatogénicos. Efectue, com um coranteapropriado, a coloração citológica de 2 tapetes celulares com,pelo menos, 6 cm2 cada um.

Examine toda a superfície dos tapetes celulares corados everifique a presença eventual de corpos de inclusão, de célulasgigantes em número anormalmente elevado ou de qualqueroutra lesão indicativa de anomalias celulares que possam serimputadas a um agente contaminante.

Detecção de vírus hemadsorventes. Lave várias vezes, comuma solução tampão apropriada, tapetes celulares com umaárea total de 70 cm2. Adicione uma suspensão apropriada de hemácias em volume suficiente para cobriruniformemente a superfície dos tapetes celulares. Decorridosdiferentes tempos de incubação, verifique a presença dehemadsorção.

Detecção de vírus específicos. Verifique através de ensaiosapropriados a ausência de contaminantes específicos da

espécie de origem da linha celular e das espécies alvo doproduto.

Para poder efectuar os ensaios de detecção de vírusespecíficos, prepare, em suportes adequados. um númerosuficiente de células É incluído em cada ensaio um númeroapropriado de controlos positivos. Os ensaios realizam-se, porexemplo, com anticorpos conjugados com fluoresceína oureagentes similares.

Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponhatapetes celulares com uma superfície total de, pelo menos,140 cm2. Congele e descongele as células pelo menos 3 vezese a seguir elimine por centrifugação os fragmentos celularesInocule partes alíquotas do líquido obtido, em células comuma confluência inferior ou igual a 70 por cento, dosseguintes tipos:

– células primárias da espécie de origem,

– células sensíveis aos vírus patogénicos para as espécies alvoda vacina,

– células sensíveis aos pestivírus.

Mantenha as células inoculadas em cultura durante, pelomenos, 7 dias, prepare os extractos congelação-descongelaçãocomo se descreveu anteriormente, e inocule em culturasfrescas de células do mesmo tipo numa quantidade suficienteque permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube ascélulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas sãoexaminadas regularmente para se detectar a presença dequalquer efeito citopatogénico devido a microrganismos vivos.

Ao fim do período de 14 dias, as células inoculadas sãosubmetidas ao seguinte controlo:

– verificação da ausência de microrganismos citopatogénicosou hemadsorventes pelos métodos anteriormenteindicados,

– verificação da ausência de pestivírus ou de outroscontaminantes específicos, por imunofluorescência ou outrosmétodos validados (ver «Detecção de vírus específicos»).

5.2.5. SUBSTÂNCIAS DE ORIGEMANIMAL UTILIZADAS NA PREPARAÇÃODE VACINAS PARA USO VETERINÁRIO

No fabrico de medicamentos veterinários imunológicospodem ser utilizadas substâncias de origem animal (porexemplo, soro, tripsina e albumina sérica), como ingredientesdos meios de cultura ou como constituintes das vacinas oudos diluentes. Recomenda-se que a sua utilização seja tantoquanto possível reduzida.

Colocam-se algumas restrições à utilização de substâncias deorigem animal com o objectivo de minimizar o riscoassociado à eventual presença de agentes patogénicos nessassubstâncias.

– A utilização de substâncias de origem animal comoconstituintes das vacinas ou diluentes não é em geralaceite, a não ser que sejam esterilizados por um métodovalidado apropriado. Quando a sua utilização se revelarindispensável e a esterilização seja impossível, são aplicadosos critérios indicados em «Exigências».

– As substâncias de origem animal utilizadas durante ofabrico são esterilizadas ou inactivadas por um método


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validado apropriado ou submetidas a um ensaio paradetecção de agentes estranhos como se descreve em«Exigências». No caso de vacinas inactivadas, o métodoutilizado para a inactivação da estirpe da vacina éigualmente validado para a inactivação de eventuaiscontaminantes das substâncias de origem animal.

Além das restrições descritas a seguir, os fabricantes aplicamrestrições relativas à manipulação de substâncias de origemanimal nas instalações de fabrico de vacinas.

Pode tornar-se necessário adaptar as restrições impostas nestasecção em função da evolução da situação zoo-sanitária nopaís de origem e na Europa.

EXIGÊNCIAS

As substâncias de origem animal satisfazem às exigências da Farmacopeia no caso de existir a correspondente monografia.

Origem. Convém avaliar cuidadosamente as riscos associadosà evolução da situação zoo-sanitária no país de origem dasubstância e às doenças infecciosas potencialmente presentesna espécie animal de origem, tendo em conta as espécies alvopropostas. Os critérios de selecção são os mais exigentes, emparticular para as substâncias utilizadas nos produtos que sedestinam à mesma espécie e para as substâncias de origembovina, caprina, ovina e porcina.

Preparação. As substâncias de origem animal são preparadas apartir de um granel homogéneo identificado por um númerode lote.

O lote pode conter substâncias provenientes de um semnúmero de animais. No entanto, uma vez definido eidentificado por um número, o lote não é de qualquer formasujeito a adições ou a contaminações.

Demonstra-se que todos os lotes da substância se encontramisentos de contaminações como se descreve a seguir, e/ouforam sujeitos a um processo de inactivação validado.

Inactivação. O processo de inactivação escolhido é capaz dereduzir o título de pelo menos 106 de certos potenciaiscontaminantes na substância considerada. Se não se puderdemonstrar experimentalmente esta redução de título, sãofeitos estudos de cinética no processo de inactivação, que dãoresultados satisfatórios tendo em conta o nível mais provávelde contaminação.

A lista dos contaminantes potenciais para os quais se tornanecessário demonstrar a eficácia do método de inactivação éestabelecida em função da espécie animal de origem dasubstância. A demonstração da eficácia do método, que temem linha de conta cada situação particular, pode ter a formade referências a literatura publicada ou de resultadosexperimentais produzidos pelo fabricante.

Ensaio. Quando a amostra se apresenta na forma sólida, con-vém, para verificar a ausência de contaminantes, dissolvê-la oususpendê-la num líquido apropriado de maneira a obter umasolução ou uma suspensão com uma concentração pelo menosigual a 300 g/l. Se a amostra for insolúvel, ou tiver uma acçãocitotóxica, é utilizada uma concentração mais baixa.

Qualquer lote em que se revele a existência de microrganismos vivos de qualquer espécie não satisfaz, sendo rejeitado ou novamente processado e demonstrado satisfatório.

Ausência de contaminação vírica. A solução (suspensão) dasubstância sólida ou da substância líquida não diluída é

submetida a um ensaio para pesquisa de contaminantes pormétodos suficientemente sensíveis. Os métodos utilizadoscompreendem ensaios em culturas de células suficientementesensíveis e incluem células primárias provenientes da mesmaespécie da amostra. Uma parte das células é submetida a, pelomenos, duas passagens.

As células são regularmente observadas durante 21 dias para detecção de eventuais efeitos citopatogénicos.Durante este período de observação, todos os 7 dias, umaparte das células da espécie de origem é examinada paradetecção de efeitos citopatogénicos após fixação e coloração,uma outra parte é submetida a um ensaio para detecção deagentes hemoadsorventes e uma outra à pesquisa de agentesespecíficos por métodos apropriados de serodiagnóstico.

Contaminação bacteriana e fúngica. Antes da sua utilização,as substâncias são submetidas ao ensaio de esterilidade(2.6.1) e ao ensaio dos micoplasmas (2.6.7), ou a umprocesso de esterilização que assegure a inactivação dequalquer contaminante bacteriano, fúngico oumicoplásmico.

5.2.6. AVALIAÇÃO DA INOCUIDADE DAS VACINAS PARA USO VETERINÁRIO

Durante o desenvolvimento de uma vacina são efectuadosensaios de inocuidade nas espécies alvo com a finalidade depôr em evidência os riscos potencialmente associados com autilização da vacina. As vacinas vivas apenas são preparadascom estirpes cuja inocuidade tenha sido demonstrada.

Nos ensaios, «dose» significa a quantidade de produtorecomendada para utilização e contém o título ou a actividademáximos susceptíveis de serem obtidos nos lotes de fabrico.No caso das vacinas vivas, é necessário efectuar os ensaioscom um ou vários lotes da vacina preparada a partir dapassagem menos atenuada utilizada na produção.

No caso de vacinas combinadas, demonstra-se a inocuidade decada um dos componentes e da vacina combinada. Nasvacinas inactivadas, os ensaios de inocuidade efectuados coma vacina combinada podem ser considerados suficientes parademonstrar a inocuidade dos componentes individuais.

Os ensaios descritos a seguir, com as modificações ou osensaios suplementares indicados na secção «Produção» deuma monografia específica, podem ser efectuados no quadrodos ensaios de desenvolvimento necessários para demonstrara inocuidade da vacina.

A. ENSAIOS LABORATORIAIS

Inocuidade da administração de uma dose única. Administre,a um grupo de animais receptivos de cada uma das espécies ecategorias às quais a vacina se destina, 1 dose de vacina porcada uma das vias de administração recomendadas. Consoanteo caso, este grupo inclui animais com a idade mínima paravacinação e fêmeas gestantes. Os animais são observados eexaminados regularmente para pesquisa de reacções gerais oulocais. Quando apropriado, os estudos compreendem umdetalhado exame necrópsico, macroscópico e microscópico dolocal da injecção; estes exames não são normalmentenecessários no caso de animais que não se destinam aoconsumo. São igualmente registados outros critériosobjectivos, por exemplo a temperatura rectal dos mamíferos eo rendimento zootécnico.

5.2.6. Avaliação da inocuidade das vacinas para uso veterinário


5. Textos gerais

15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 532

A temperatura rectal é registada pelo menos no dia anteriorao da vacinação, no momento da vacinação, 4 h mais tarde enos 4 dias seguintes. Os animais são mantidos em observaçãoe examinados durante um período de tempo em que se esperanão haver reacções mas, em todos os casos, durante, pelomenos, 14 dias após a administração da vacina.

Os estudos de inocuidade podem igualmente incluir o exame dafunção reprodutora quando os dados sugerem que a origem damatéria-prima do produto constitui um factor de risco. Seestiver prescrito na monografia, efectua-se o estudo das funçõesreprodutoras dos machos e das fêmeas gestantes e nãogestantes, incluindo a pesquisa de efeitos indesejáveis nadescendência, por exemplo de natureza teratogénica e abortiva.

Inocuidade da administração de uma sobredose. Éadministrada uma sobredose por cada uma das vias deadministração recomendadas, aos animais das categorias maissensíveis das espécies alvo, incluindo, se for o caso, animaiscom a idade mínima para vacinação e fêmeas gestantes. Asobredosagem consiste normalmente em 10 doses de vacinaviva ou 2 doses de vacina inactivada. Os animais sãoobservados e examinados regularmente para pesquisa dereacções gerais ou locais. São igualmente registados outroscritérios objectivos, por exemplo a temperatura rectal dosmamíferos e o rendimento zootécnico. Os animais sãomantidos em observação e examinados durante, pelo menos,14 dias após a administração da vacina.

Inocuidade da administração repetida de uma dose única. Aadministração repetida de uma dose única pode sernecessária para revelar quaisquer efeitos indesejáveisinduzidos pela referida administração. Estes ensaiosefectuam-se nas categorias mais sensíveis das espécies alvo,pela via de administração recomendada. Os animais sãoobservados e examinados, no mínimo, durante 14 dias após aúltima administração para pesquisa de reacções gerais oulocais. São igualmente registados outros critérios objectivos,por exemplo a temperatura rectal dos mamíferos e orendimento zootécnico.

Resíduos. Normalmente não é necessário efectuar um estudode resíduos. Todavia, caso o fabrico de vacinas veterináriasenvolva a utilização de adjuvantes e/ou conservantes, atende-seà possível persistência de resíduos nos produtos alimentares. Senecessário investigam-se os efeitos dos referidos resíduos. Alémdisso no caso de vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidaspode ser necessário efectuar a pesquisa do microrganismovacinal residual no local de injecção, para além dos estudos dedisseminação que se descrevem a seguir.

Efeitos indesejáveis nas funções imunológicas. Caso a vacinapossa afectar negativamente a resposta imunitária do animalvacinado ou da sua descendência, são efectuados ensaiosadequados das funções imunológicas.

Exigências especiais aplicáveis às vacinas vivas. Efectuam-seos seguintes ensaios nas vacinas vivas:

(a) Disseminação da estirpe da vacina. Utilizando a via deadministração recomendada mais favorável para adisseminação, investiga-se a possibilidade de transmissãoda estirpe da vacina de animais vacinados a animais nãovacinados da espécie alvo. Pode também ser necessárioinvestigar os riscos de transmissão a espécies não alvopotencialmente muito sensíveis à estirpe da vacina viva.Convém igualmente avaliar o número possível detransmissões de animal para animal em circunstânciasnormais, assim como as suas previsíveis consequências.

(b) Disseminação no animal vacinado. Verifica-se a presençado microrganismo nas fezes, urina, leite, ovos e secreçõesorais, nasais ou outras. Além disso, pode ser necessárioestudar a disseminação da estirpe da vacina no corpo doanimal, com especial destaque para os seus locais dereplicação preferenciais. Este estudo é obrigatório paravacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas dosanimais destinados ao consumo.

(c) Reversão à virulência ou aumento da virulência. Para ocaso de vacinas atenuadas utilize a estirpe ao nível dapassagem menos atenuada para a espécie alvo entre o lotesemente primário e o produto acabado. No caso de outrasvacinas vivas, utilize o material proveniente da passagemque se espera ser a mais virulenta para as espécies alvo. Aprimeira vacinação é efectuada pela via de administraçãorecomendada mais favorável à reversão à virulência.Efectuam-se, pelo menos, cinco passagens em série emanimais das espécies alvo. Caso tal não seja tecnicamentepossível, em virtude do microrganismo não se replicar demodo adequado, efectuam-se nas espécies alvo tantaspassagens quantas possível. Se necessário, pode proceder-se à propagação do microrganismo in vitro entreduas passagens in vivo. As passagens efectuam-se pela viade administração que mais provavelmente conduz àreversão à virulência. Utilizam-se, pelo menos, duasespécies receptivas em cada passagem. Comprova-se apresença de microrganismos vivos provenientes da vacinano substrato de cada passagem. A inocuidade da estirpedo nível mais elevado de passagens é comparada com a daestirpe de origem.

No caso de vírus particulares, a monografia pode exigirum maior número de passagens, e para cada passagem,um número de animais mais elevado se se dispuser dequalquer indicação que revele o seu interesse. A últimapassagem é efectuada em animais da categoria maisapropriada para avaliar o risco potencial.

(d) Propriedades biológicas da estirpe da vacina. Podem sernecessários mais ensaios por forma a determinar, tãoexactamente quanto possível, as propriedades biológicasintrínsecas da estirpe utilizada na vacina (por exemplo,neurotropismo). No caso de vacinas que utilizamvectores, é necessário fazer uma avaliação do risco deuma modificação do tropismo ou da virulência daestirpe e, se necessário, efectuar ensaios específicos.Estes ensaios são sistematicamente efectuados quandose incorpora um gene estranho na estirpe comoproteína estrutural.

(e) Recombinação ou rearranjo genómico da estirpe. Éanalisada a probabilidade de recombinação ou rearranjogenómico com a estirpe de campo ou outras.

B. ENSAIOS DE CAMPO

Os resultados dos ensaios laboratoriais são normalmentecomplementados e confirmados com dados comprovativosprovenientes dos ensaios de campo.

Nos mamíferos destinados ao consumo, os ensaios incluem amedição da temperatura rectal antes e após a vacinação numnúmero suficientemente elevado de animais; noutrosmamíferos, essas medições efectuam-se quando os ensaioslaboratoriais indiciem qualquer problema. Registam-se otamanho e a persistência de qualquer reacção local e aproporção de animais que apresentam reacções locais ougerais. Se necessário, convém igualmente medir orendimento zootécnico.


5.2.6. Avaliação da inocuidade das vacinas para uso veterinário

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3. Textos gerais

C. ECOTOXICIDADE

Durante o desenvolvimento da vacina avaliam-se os efeitosnocivos da vacina para o ambiente e identificam-se asmedidas preventivas necessárias para diminuir os referidosriscos. O grau de exposição do ambiente à vacina é avaliadolevando em atenção a espécie alvo e modo de administração,de excreção da vacina e o modo de eliminação do produto nãoutilizado. Se estes factores indicarem que haverá um riscosignificativo de exposição do ambiente ao produto, aecotoxicidade potencial é avaliada levando em linha de contaas propriedades da vacina determinadas, por exemplo, nosensaios descritos nesta secção.

5.2.7. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DAS VACINAS PARA USO VETERINÁRIO

Durante o desenvolvimento da vacina, a sua eficácia édemonstrada através de ensaios efectuados em cada uma dasespécies e categorias às quais a vacina se destina, utilizandocada uma das vias de administração recomendadas e o esquemavacinal proposto. A natureza dos ensaios a efectuar varia consi-deravelmente consoante o tipo de vacina considerado.

Os ensaios indicados na secção «Produção» numa monografiaespecifica podem ser efectuados no quadro dos ensaios dedesenvolvimento necessários para demonstrar a eficácia davacina. Convém ter em conta as seguintes considerações.

A dose a utilizar nos ensaios será a quantidade de produtorecomendada para utilização, contendo o título ou aactividade mínima admitidos no fim do prazo de validade.

No caso de vacinas vivas, é necessário efectuar os ensaios coma vacina preparada a partir da passagem mais atenuadautilizada na produção.

Os ensaios de eficácia confirmam todas as indicaçõesreclamadas para a vacina. Se, por exemplo, se indica que oproduto confere protecção contra doenças respiratórias, pelomenos demonstra-se que protege contra os sinais clínicos dadoença respiratória. Quando se reclama uma protecção anti-infecciosa, este facto é demonstrado por técnicas de reisolamento. Se tem várias indicações, a sua eficácia édemonstrada para cada uma delas.

A influência na eficácia da vacina da presença de anticorposadquiridos passivamente ou transmitidos pela mãe éadequadamente avaliada. Qualquer declaração ou indicaçãorespeitante ao início e duração da protecção é corroboradacom os resultados obtidos nos ensaios.

A eficácia de cada um dos componentes das vacinascombinadas é demonstrada utilizando a vacina combinada.

Realizam-se ensaios de compatibilidade imunológica quandose recomenda a administração simultânea de várias vacinasou quando essa compatibilidade faz parte do esquemahabitual de vacinação. Sempre que um produto sejarecomendado como parte do esquema de vacinação,demonstra-se o seu papel na primo-vacinação e no «rappel»ou a sua contribuição na eficácia do esquema vacinal.

ENSAIOS LABORATORIAIS

Em princípio, a eficácia é demonstrada através de ensaios, naespécie alvo, com prova virulenta após administração doproduto de acordo com as condições de utilização

recomendadas. A prova virulenta é efectuada utilizando umaestirpe diferente daquela que foi utilizada na produção davacina, Na medida do possível, as condições em que se efectua aprova virulenta reproduzem as condições naturais de infecção,por exemplo no que diz respeito ao número de microrganismose à via de administração utilizados.

Se possível, convém determinar qual o tipo de mecanismoimunitário (celular/humoral, local/geral, classe deimunoglobulina) que resulta da administração do produto àsespécies alvo.

ENSAIOS DE CAMPO

De uma forma geral, os resultados dos ensaios laboratoriaissão completados por dados obtidos nos ensaios de campo,efectuados com animais testemunhas não tratados. Quando os ensaios laboratoriais não permitam demonstrar a eficácia, aceita-se que sejam apenas efectuados ensaios de campo.

5.2.8. MINIMIZAÇÃO DO RISCO DA TRANSMISSÃO DE AGENTES DE ENCEFALOPATIASESPONGIFORMES ANIMAIS POR PRODUTOS MEDICAMENTOSOSPARA USO HUMANO E PARA USO VETERINÁRIO

1. OBSERVAÇÕES GERAIS2. OBJECTIVO DO CAPITULO GERAL3. MANUFACTURA (INCLUINDO A RECOLHA DE MATÉRIAS-

-PRIMAS)3.1. Animais utilizados como fonte de matérias-primas3.2. Partes de animais, líquidos corporais e secreções utilizadas

como matérias-primas3.3. Validação do procedimento3.4. Idade dos animais3.5. Produtos específicos

4. CONCLUSÕES

1. OBSERVAÇÕES GERAIS

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET)incluem o scrapie(1) em ovinos e caprinos, a encefalopatiaespongiforme dos cervídeos, a encefalopatia espongiformebovina (EEB), e também, no homem, o Kuru e a doença deCreutzfeldt-Jacob (DCJ). Os agentes transmissíveisresponsáveis por estas doenças replicam-se nos indivíduosinfectados, geralmente sem sinais de infecção detectável pelosmétodos actuais de diagnóstico in vivo. Depois de períodos deincubação que podem atingir vários anos, os agentesdesenvolvem a doença que conduz à morte do indivíduo. Nãoé conhecida nenhuma solução terapêutica.O diagnóstico é baseado nos sintomas clínicos e aconfirmação post mortem pelas lesões cerebraiscaracterísticas, por histopatologia ou por detecção das

5.2.7. Avaliação da eficácia das vacinas para uso veterinário


5. Textos gerais

(1) A designação oficial portuguesa, conforme a denominaçãoreferida na Portaria 713/96 de 9 de Dezembro. é «Tremor epizoóticodos ovinos e caprinos». No entanto, a designação scrapie é aquelaque está consagrada.

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proteínas fibrilares específicas das encefalopatiasespongiformes. A demonstração da infecciosidade porinoculação do tecido suspeito a espécies alvo ou a animaisde laboratório pode igualmente ser utilizada paraconfirmação, mas o período de incubação varia de váriosmeses a vários anos. Foram assinalados casos de transmissãoiatrogénica de encefalopatias espongiformes. Nos ovinos, oscrapie foi transmitido acidentalmente após utilização deuma vacina contra o vírus Louping III preparada a partir deuma mistura de cérebro e baço de ovino tratados comformol, na qual foram incorporados inadvertidamentetecidos provenientes de um ovino infectado. No homem.foram reportados casos de transmissão da DCJ. Nestesúltimos. foi atribuída à administração parenteral repetida dehormona do crescimento e gonadotropina obtidas dehipófises de cadáveres humanos. Casos de DCJ foramigualmente atribuídos à utilização de instrumentoscontaminados em cirurgia cerebral e ao transplante demeninges e córneas humanas.

Existe pouca informação sobre as características dos seusagentes infecciosos. São extremamente resistentes à maioriados tratamentos químicos ou físicos capazes de inactivar osvírus convencionais. Não induzem respostas imunitáriasdetectáveis. Existem barreiras naturais que limitam aproliferação da infecção entre as espécies, mas elas podemser ultrapassadas em circunstâncias apropriadas quedependem geralmente da estirpe, da dose, da via de exposiçãoe da importância da barreira inter-espécies. Estudos emanimais de laboratório demonstraram que a inoculaçãointracerebral é a via mais eficaz.

O homem tem estado naturalmente exposto ao agenteinfeccioso do scrapie nos últimos 200 anos, mas apesar dosextensos estudos epidemiológicos realizados nenhum sinal detransmissão entre ovinos e homem foi detectado. A EEB foi,pela primeira vez, notificada no Reino Unido em 1986. Umgrande número de bovinos e de herdades foram afectadas. Éclaro que a EEB é uma infecção transmitida pela alimentação.Casos de EEB apareceram noutros países, quer em animaisimportados do Reino Unido, quer em animais autóctones. Namedida em que as propriedades biológicas do agente causal daEEB é diferente das do agente do scrapie, é concebível que asbarreiras inter-espécies o seja também. Existem indíciosconvincentes de que a nova variante da DCJ seja devida aoagente responsável da EEB em bovinos.

A aparição de uma nova variante da DCJ no homem reforçouas inquietações relativas à possível transmissão do agenteinfeccioso da EEB ao homem. Assim, a devida prudênciacontinua a aconselhar o máximo rigor nos casos em que osprodutos biológicos provenientes de espécies afectadas porestas doenças para além da experimentação, especialmente naespécie bovina, sejam utilizadas para o fabrico de produtosmedicinais.

As recomendações seguintes são, assim, seguidas para reduzirao mínimo o risco de contaminação. Apesar deste capítulogeral, é sublinhado que o potencial risco associado a umproduto medicinal é considerado individualmente à luz dascircunstâncias específicas e do conhecimento actual.

2. OBJECTIVO DO CAPÍTULO GERAL

Este capítulo considera as implicações da EET nos produtosmedicinais e as medidas a tomar para reduzir ao mínimo o riscode transmissão pela sua utilização. Este capitulo aplica-se, assim,aos produtos de origem animal, particularmente aos produtosobtidas a partir de ruminantes, utilizados na preparação de:

– substâncias activas,

– excipientes,

– produtos base, matérias-primas e reagentes utilizados naprodução (por exemplo; albumina sérica bovina, enzimas,meios de cultura incluindo aqueles que servem depreparação a bancos de células de trabalho ou novosbancos de células-mãe).

Este capítulo geral também se aplica aos produtos queentrem em contacto directo com os equipamentos utilizadosna produção (e que deste modo são potenciaiscontaminantes), por exemplo, os meios de ensaio utilizadosna validação fabril e de equipamentos.

Este capítulo geral está relacionado com os produtos obtidosde todos os ruminantes. As medidas propostas são sobretudoaplicáveis aos produtos oriundos de bovinos, e pode sernecessário adaptá-las aos produtos de origem ovina, caprina ede outras espécies em que a susceptibilidade às EET, paraalém da experimentação, seja estabelecida.

Este capítulo geral é lido em conjunto com as diferentesdecisões da Comissão das Comunidades Europeiasprogressivamente implementadas desde 1991.

3. MANUFACTURA E RECOLHA DE MATÉRIAS-PRIMAS

Quando os fabricantes tiverem a opção entre a utilização de produtos de origem ruminante ou não, a utilização deprodutos oriundos de animais não ruminantes é preferencial.A substituição dos produtos base de ruminante por produtosoriundos de uma outra espécie em que seja estabelecido quesofra de EET, ou que possa ser infectada experimentalmentepor via oral, não é normalmente aceitável.

No pedido de autorização de introdução no mercado o requerente fornece os detalhes da origem dos produtos(incluindo a origem geográfica do animal) e sobre as medidastomadas para reduzir ao mínimo o risco de transmissão dosagentes da EET. O fabricante farmacêutico audita ofornecedor destes produtos a fim de garantir uma origem euma manipulação conformes ao presente capítulo geral e aossistemas apropriados de controlo de qualidade.

O risco de transmissão de agentes infecciosos pode serreduzido de modo significativo através do controlo de umcerto número de parâmetros, entre os quais:

– a origem dos animais,

– a natureza do tecido animal utilizado no fabrico,

– o(s) processo(s) de produção.

Nenhuma destas medidas pode necessariamente estabelecer,por si só, a inocuidade de um produto, podendo ser necessáriorecorrer às três medidas complementares mencionadas acimapara reduzir ao mínimo o risco de contaminação.

3.1. Animais utilizados como fontes de matérias-primas

Uma selecção minuciosa dos produtos base constitui o critériomais importante para a inocuidade dos produtos medicinais.

3.1.1. As matérias-primas de melhor qualidade provêem depaíses em que nenhum caso de EEB tenha sido reportado enos quais:

– a notificação é obrigatória, e

– a verificação clínica e biológica dos casos suspeitos éobrigatória.


5.2.8. Minimização do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinário

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3. Textos gerais

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Uma certificação oficial está disponível. Para além disso, énecessário assegurar a ausência de risco de infecção por EEBpelos seguintes factores:

– importação de bovinos oriundos de países apresentandouma incidência elevada de EEB,

– importação de bovinos nascidos de fêmeas afectadas,

– utilização de alimentos à base de carne e ossos paraalimento de ruminantes, e contendo proteínas deruminantes tendo como origem países apresentando umabaixa ou alta incidência de EEB ou em que a situação sejadesconhecida.

3.1.2. As matérias-primas podem igualmente provir de paísesem que a incidência de casos autóctones de EEB seja baixa,se, e para além dos factores descritos no parágrafo 3.1.1.:

– as carcaças de todos os animais infectados são destruídas,

– a progénie (descendência) das fêmeas afectadas não éutilizada,

– as proteínas de origem mamífera são interditas naalimentação de ruminantes.

Os animais são nascidos depois da entrada em vigor destainterdição. Se a data de nascimento dos animais fordesconhecida, a data de aplicação desta interdição e o períodode incubação da EEB são tomadas em consideração para avaliara inocuidade da fonte de aprovisionamento.

Os rebanhos no seio dos quais tenham sido declarados casosde EEB não podem ser utilizados para aprovisionamento.

3.1.3. As matérias-primas provenientes de países com altaincidência de EEB não podem ser utilizados.

Paralelamente a estas medidas, os pedidos de autorização deintrodução no mercado justificam as suas estratégias deaprovisionamento relativamente às categorias de produtos, aquantidade de produtos base e a utilização prevista doproduto medicinal acabado no homem. É possível beneficiarde uma margem de segurança suplementar fornecendo-sejunto de países nos quais os produtos base sejam oriundos derebanhos bem controlados.

3.2. Partes animais, líquidos corporais e secreções utilizadascomo matérias-primas

Num animal infectado por uma EET, os níveis deinfecciosidade variam segundo os órgãos ou as secreções. Combase nos dados relativos à scrapie natural, os órgãos, tecidos esecreções foram classificados em quatro grupos principaisapresentando diferentes níveis de risco potencial, conformeapresentado na tabela 1. Apesar de ser bem conhecido que arepartição da infecciosidade nos bovinos com EEB seja maisrestrita, a classificação dos tecidos e líquidos corporais natabela é sempre utilizada para a selecção dos produtos base. Ascategorias contidas na tabela apenas têm um carácterindicativo e é importante ter em atenção os seguintes pontos:

– a classificação dos tecidos apresentada na tabela l é baseadana titulação da infecciosidade no murganho por viaintracerebral. Nos modelos experimentais utilizando asestirpes adaptadas aos animais de laboratório, podemobservar-se títulos mais elevados e uma classificação detecidos ligeiramente diferente,

– em algumas situações, pode produzir-se uma contaminaçãocruzada entre tecidos pertencentes a categorias deinfecciosidade diferentes. O risco potencial dependerá dascircunstâncias nas quais os tecidos foram retirados,

nomeadamente do contacto entre os produtos de um grupode risco reduzido com os pertencentes a um grupo de riscoelevado. Assim, a contaminação cruzada entre certostecidos corre o risco de ser acrescida se os animaisinfectados forem abatidos por trepanação ou se o cérebroe/ou a medula espinal forem serrados. O risco decontaminação cruzada é reduzido se os líquidos corporaisforem recolhidos com um mínimo de lesões tissulares, seos elementos celulares forem retirados e se o sangue fetalfor recolhido evitando qualquer contaminação pelos tecidosmaternos ou fetais como a placenta ou os líquidosamniótico e alantoideu,

– o risco devido à contaminação cruzada depende de diversosfactores complementares, tais como:

– as precauções tomadas para evitar qualquercontaminação durante a recolha dos tecidos (ver acima),

– o nível de contaminação (quantidade de tecidocontaminante),

– a quantidade de matéria-prima a utilizar,

– o tratamento a que será submetida a matéria-primadurante o processo de fabrico.

Os fabricantes apresentam uma estimativa do risco.

TABELA 1 – Títulos infecciosos relativos à scrapie nos tecidos e líquidos corporais de ovinos e caprinos naturalmente infectados

e apresentando scrapie clínica (2)

CATEGORIA I Cérebro, medula espinal, (olho). infecciosidade elevada

CATEGORIA II Íleo, gânglios linfáticos, cólon proximal,infecciosidade média baço, amígdalas, (duramáter, epífise,cerebral, placenta), líquido céfalo-raquidiano,

hipófise, glândulas supra-renais.

CATEGORIA III Cólon distal, mucosa nasal, nervos infecciosidade reduzida periféricos, medula óssea, fígado, pulmões,

pâncreas, timo.

CATEGORIA IV Coágulo sanguíneo, fezes, coração, rins,infecciosidade glândulas mamárias, leite, ovários, saliva,indetectável (3) glândulas salivares, vesículas seminais,

soro, músculos esqueléticos, testículos,tiróide, útero, tecido fetal, (bílis, ossos(4),tecido cartilagíneo, tecido conjuntivo,pêlos, pele, urina).

3.3. Validação do procedimento

O controlo do aprovisionamento é o critério mais importantepara atingir uma inocuidade aceitável do produto. devido àresistência estabelecida documentalmente dos agentes da EETà maior parte dos processos de inactivação.

Os estudos de validação dos processos de eliminação/inactivaçãosão de difícil interpretação pois é necessário ter em considera-ção a natureza do produto contaminado intencionalmente e asua relevância face à situação natural, a concepção do estudo



5. Textos gerais

(2) Os estados de referência não dosearam os tecidos entreparêntesis, mas a infecciosidade relativa é indicada por outros dadossobre encefalopatias espongiformes. As matérias-primas nãomencionadas podem ser classificadas por analogia com aquelas que osão, baseando-se na sua composição.(3) Nenhuma infecciosidade foi transmitida em roedores apósinoculação intracerebral (até 5 mg).(4) Para o crânio e vértebras, ver também o ponto 3.2. relativamenteà contaminação cruzada.

15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 536

(compreendendo a redução de escala do processo) e o métodode detecção do agente (doseamento in vitro ou in vivo), apóscontaminação intencional e após tratamento. São necessáriaspesquisas suplementares para se poder atingir um acordorelativamente à metodologia mais apropriada para os estudosde validação. Actualmente, os estudos de validação não são,assim, geralmente exigidos. No entanto, se a concepção dosprocedimentos que permitam eliminar ou inactivar osagentes das EET for reivindicada, esta será justificada pelosestudos de validação apropriados. Os estudos de validação sãoespecíficos do processo.

Para além das restrições particulares que se aplicam aosestudos de validação sobre as EET e à sua interpretação. Oobstáculo principal é a identificação das etapas que irãoeliminar ou inactivar eficazmente os agentes das EET duranteo fabrico dos produtos medicinais de origem biológica. Osfabricantes são incitados a prosseguir as suas investigaçõessobre os métodos de eliminação ou de inactivação a fim deidentificar as etapas/procedimentos que irão favorecer aeliminação ou inactivação dos agentes infecciosos das EET.

Em todos os casos, um procedimento de produção éelaborado, se possível, tendo em conta as informaçõesdisponíveis sobre os métodos presumivelmente eficazes paraa eliminação ou inactivação dos agentes das EET.

Alguns procedimentos de produção podem contribuirconsideravelmente para a redução do risco de contaminaçãopela EET, por exemplo, os procedimentos utilizados nofabrico do sebo e seus derivados (ver adiante).

3.4. Idade dos animais

Estando assumido que a infecciosidade das EET se acumuladurante um período de incubação de vários anos, pode serprudente utilizar como fonte de aprovisionamento animaisjovens.

3.5. Produtos específicos

– É pouco provável que o leite e seus derivados possamapresentar um risco de contaminação.

– É pouco provável que algumas matérias-primas e seusderivados, tais como os pêlos e a lã utilizados no fabrico deálcoois de lã e de lanolina, apresentem um risco decontaminação. se as garantias de recolha e de tratamentosforem fornecidas.

– O sebo utilizado como matéria-prima no fabrico dederivados do sebo é produzido segundo um método, pelomenos tão robusto e rigoroso como os mencionados nosregulamentos internacionais. Os derivados do sebo, como oglicerol e os ácidos gordos que são fabricados a partir dosebo através de procedimentos rigorosos foram objecto deconsiderações específicas e é pouco provável que sejaminfecciosos. Exemplos de procedimentos rigorosos são:

– a transesterificação ou hidrólise sob pressão, a umatemperatura de, pelo menos, 200°C e durante 20 min,no mínimo (para a produção de glicerol, ácidos gordos eésteres de ácidos gordos).

– a saponificação pelo NaOH 12 M (para a produção deglicerol e sabão):

– produção por lotes: a uma temperatura de pelo menos95°C e durante 3 h no mínimo,

– produção em continuo: a uma temperatura de, pelomenos, 140°C, a uma pressão de 2 bares (2000 hPa)durante 8 min, no mínimo, ou equivalente.

– Gelatina:

– Para a gelatina produzida a partir de ossos de bovinos(5),o conjunto dos seguintes parâmetros contribui para ainocuidade deste produto:

– a origem geográfica dos animais,

– os crânios e medulas espinais presentes na matéria- -prima(6) são eliminados,

– é geralmente recomendada a exclusão das vértebras,em função da origem geográfica dos animais,

– o método de fabrico actualmente preferido é ahidrólise alcalina,

– os sistemas tais como a certificação ISO 9000 e HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point) sãoimplementados para a vigilância do processo deprodução e a produção por lotes (definição do lote,separação dos lotes, limpeza entre lotes, etc.),

– os procedimentos são implementadas para assegurar atraçabilidade e auditar os fornecedores de matérias- -primas.

– Para a gelatina produzida a partir da pele de bovinos:

– toda a contaminação cruzada com as substânciaspotencialmente infecciosas é evitada.

Os fabricantes apresentam uma estimativa do risco.

4. CONCLUSÕES

A estimativa do risco associado à EET necessita que todos osparâmetros citados sejam minuciosamente tomados emconsideração, e a opção prioritária consiste em evitar autilização das matérias-primas derivadas de animais em que asusceptibilidade às EET esteja estabelecida (de outro modoque não a prova experimental) nos produtos fabricados pelaindústria farmacêutica. A aceitabilidade de um produtomedicinal, em particular, contendo tais matérias-primas oupodendo, em resultado do fabrico, contê-las, depende de umcerto número de factores, entre os quais:

– os documentos e os registos atestando a origem dos animais,

– a natureza do tecido animal utilizado durante o fabrico,– o(s) procedimento(s) de fabrico,

– a via de administração,

– a quantidade de tecido utilizado nos produtos medicinais,

– a posologia terapêutica máxima (dose diária e duração dotratamento),

– a utilização prevista do produto.



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(5) São aqui considerados como produto base, os ossos antes dodesengorduramento(6) A futura distribuição geográfica das EEB/EET não pode serprevista. Qualquer modificação da distribuição geográfica dasEEB/EET pode conduzir na pior das situações, a retirada de produtosmedicinais contendo gelatina. Devido ao elevado número de produtosmedicinais que contêm gelatina como excipiente e o prazo devalidade elevado da gelatina a partir da sua produção até à data limitede conservação de produtos farmacêuticos, qualquer retirada teráconsequências dramáticas em termos de aprovisionamento deprodutos medicinais essenciais. O crânio e a medula espinal são, porisso, retirados dos produtos-base da gelatina derivada de ossos debovino qualquer que seja a origem geográfica dos animais utilizados.

15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 537

Os fabricantes farmacêuticos e os produtores de produtosmedicinais de origem animal são responsáveis pela selecção ejustificação das medidas adequadas. O estado da ciência e dastecnologias são tomados em consideração.

Apesar deste capítulo geral, é de sublinhar que o riscopotencial associado a um produto medicinal específico éconsiderado individualmente à luz das circunstânciasespecíficas e dos conhecimentos do momento.

Estas indicações são igualmente utilizadas na avaliação darelação risco-benefício de cada produto.

5.2.9. AVALIAÇÃO DA INOCUIDADE DE CADA LOTE DE VACINAS E SOROS PARA USO VETERINÁRIO

O termo «produto» utilizado neste texto, tanto se aplica a umavacina como a um soro.

Definição das reacções anormais. Durante os estudos dedesenvolvimento, o tipo e o tamanho das reacções esperadasapós administração do produto, são definidas à luz dosestudos de inocuidade. No quadro dos ensaios de inocuidadeefectuados em cada lote, esta definição das reacções locais egerais normais ou anormais é depois utilizada para se avaliaras reacções aceitáveis e não aceitáveis.

Quantidade administrada durante o ensaio. Para um produtoapresentando o título ou a actividade pretendidos dentro doslimites especificados para os lotes de produção, o termo«dose» nos ensaios, designa a dose recomendada. Aquantidade a ser administrada no ensaio é geralmentedefinida em número de doses. No caso de vacinas vivasliofilizadas, as 10 doses são reconstituídas num volumeapropriado de solvente para o ensaio. No caso de produtos quese apresentam na forma de 2 recipientes contendorespectivamente 1 ou vários componentes vivos liofilizados eum ou vários componentes inactivados a utilizar comodiluente, pode ser necessário utilizar líquido suplementarpara reconstituir o(s) componente(s) liofilizado(s). Quandonecessário e justificado convém injectar num local oconteúdo de 2 recipientes do componente inactivadomisturado no conteúdo de um número máximo de recipientesdo componente vivo liofilizado e os restantes componentesvivos liofilizados reconstituídos num solvente apropriado,podem ser inoculados num local separado. No caso de vacinascombinadas, os ensaios efectuados na vacina combinadaconsideram-se como suficientes para estabelecer a inocuidadedos componentes individuais.

Via de administração. O produto administra-se por uma dasvias recomendadas. Em princípio, convém preferencialmenteutilizar a via de administração mais favorável em permitir adetecção de reacções.

Quando se sabe que existe um risco particular, por exemplona sequência dos estudos de desenvolvimento, efectua-se uma2ª administração com a dose apropriada após um intervaloapropriado como se determinou durante a fase dedesenvolvimento.

Espécies animais e categorias alvo. Salvo excepção justificadae autorizada, convém utilizar animais com idade mínimarecomendada e da espécie mais sensível para a vacinação ouadministração do produto.

Número de animais. Nas monografias indicam-se o numerode animais a utilizar. Regra geral, é de 2 para os mamíferos ede 10 para as aves e os peixes.

Identificação dos animais. Salvo excepção justificada, todosos animais são objecto de uma marcação que permita oregisto individual dos dados respeitantes ao período total deobservação.

Período de observação. Quando se registam critériosobjectivos como se descreve a seguir, tal como a temperaturacorporal, os animais são examinados e observados durante,pelo menos, 3 dias antes da administração do produto. Apósadministração do produto, os animais São mantidos emobservação e examinados, pelo menos, 1 vez por dia, durante,no mínimo, 14 dias, para se detectar reacções locais e gerais.No dia da administração do produto, é necessário efectuar,pelo menos, 1 inspecção suplementar após 4 h, ou nosintervalos de tempo especificados nas monografias. Nos casosde 2ª administração do produto, o período de observaçãotermina 14 dias após a administração.

Reacções locais e gerais. Os animais que apresentamreacções locais ou gerais anormais graves são abatidos. Emtodos os animais mortos efectua-se um exame necrópsicomacroscópico. Podem ser indicados exames microscópicos emicrobiológicos complementares.

Os animais mantidos em observação são examinados comvista a serem detectadas reacções locais ou gerais.

Quando constituam indicadores de utilidade reconhecida, sãotambém registados outros critérios, por exemplo atemperatura corporal, a massa corporal, outros índices derendimento e consumo de alimentos.

Reacções locais. Na medida em que for apropriado epossível, registam-se o tamanho e a persistência de qualquerreacção local (incluindo a aparecimento de reacçõesdolorosas) e também o numero de animais que manifestamas reacções locais.

Reacções gerais. A temperatura, e se apropriado, a massacorporal são anotados como indicadores gerais dos efeitossistémicos da administração do produto. Todos os sinaisclínicos são igualmente registados.

Temperatura corporal. Nos mamíferos, os estudos incluem amedição da temperatura corporal durante o período deobservação. A temperatura corporal é registada, pelo menos, 3 dias antes da administração do produto, na altura daadministração e depois, decorridas 4 h e em intervalosregulares. A temperatura corporal antes da administração doproduto encontra-se entre os valores fisiológicos. Pelo menosnos produtos em que é previsível um aumento significativo datemperatura (por exemplo nos produtos que contêmendotoxinas e várias vacinas víricas vivas) ou nos quais amonografia correspondente especifica um aumento datemperatura (por exemplo, no máximo, 2°C nas vacinascontra a actinobacilose do porco), recomenda-se a utilizaçãoda temperatura média dos dias anteriores à administração doproduto (por exemplo, -3 dias ao dia 0) como linha base detemperatura, para se dispor de um critério claro para aavaliação do ensaio.

Massa corporal e consumo de alimento. Quando constitui umindicador de inocuidade com uma fiabilidade e uma utilidadereconhecidas, por exemplo nos animais jovens em fase decrescimento ou nos peixes, a massa corporal é medida edocumentada pouco tempo antes da administração doproduto e durante o período de observação. Controla-se o

5.2.9. Avaliação da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinário


5. Textos gerais

15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 538

consumo de alimentos e documenta-se como indicador doefeito da administração do produto. Na maior parte dos casos,é suficiente registar a ração diária consumida ou a que éparcial ou totalmente rejeitada, mas, em alguns casos, podeser necessário registar o peso efectivo da alimentaçãoconsumida, quando se trata de um indicador apropriado dainocuidade do produto.

Sinais clínicos. Anotam-se todos os sinais clínicos de naturezageral, esperados ou não, nomeadamente as modificações doestado de saúde e as alterações de comportamento.

Fichas de avaliação. Em função dos sinais esperados,preparam-se as fichas de avaliação para cada produto. Todos osparâmetros e todos os dados são registados nestas fichas. As

fichas incluem parâmetros gerais mas também são adaptadas acada tipo de produto e incluem a lista de sinais clínicos quepodem ser mais marcantes para um dado produto.

Critérios para a repetição do ensaio. Se surge um sinalanormal, com base se necessário de um exame necrópsico, oveterinário responsável determina se esse sinal é devido aoproduto. Se a causa do sinal clínico não for claro ou quandoum animal é retirado do ensaio por motivos independentes doproduto, o ensaio pode ser repetido. Se, no 2º ensaio,reaparece o mesmo sinal anormal, o produto não satisfaz aoensaio. Regista-se qualquer tratamento administrado aosanimais durante o período de observação. Se o tratamentopuder interferir com o ensaio, o ensaio não é válido.


5.2.9. Avaliação da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinário

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5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICADE RESULTADOS

DE ENSAIOS E TESTESBIOLÓGICOS

1. Introdução ...................................................................... 5432. Aleatoriedade e independência de tratamentos

individuais ...................................................................... 5433. Ensaios dependentes de respostas quantitativas .......... 5444. Ensaios dependentes de respostas qualitativas ............ 5535. Exemplos ........................................................................ 555

6. Combinação de resultados de ensaios .......................... 5677. Para além desta monografia ........................................ 5698. Tabelas e métodos de cálculo........................................ 5709. Glossário de símbolos e termos.................................... 573

10. Bibliografia recomendada ............................................ 575

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A segunda versão desta monografia aparece agora restruturada, mantendo-se os conceitos definidos na introdução feita na tradução portuguesa para a Farmacopeia Portuguesa VI. Aconselhamos a consulta daquela monografia, pois alguns conceitos não estão aqui contemplados; por outro lado, e mantendo o princípio já consignado, apresenta-se em suplemento um glossário de termos estatísticos nas versões portuguesa e inglesa, uma vez que a terminologia estatística está muito ligada à língua inglesa.

1. INTRODUÇÃO

Este capítulo contém indicações relativas à concepção deensaios biológicos prescritos na Farmacopeia e à análise dosseus resultados. Foi redigido para uso dos utilizadores de quenem a formação nem as funções principais sejam de estatís-tica, mas que, pelas suas funções devem analisar ou interpre-tar os resultados daqueles ensaios, muitas vezes sem o auxílioou orientação de um especialista. Os métodos de cálculodescritos aqui não têm um carácter obrigatório para interpre-tação dos doseamentos que constituem parte integrante daFarmacopeia. Podem ser utilizados métodos alternativos, soba condição de serem tão fiáveis como os aqui descritos. Háuma grande escolha de programas de cálculo à disposição doanalista, e podem ser mais ou menos úteis de acordo com asfacilidades disponíveis e as competências do analista.

Há situações onde a orientação de um especialista é necessária: tratamento global da organização e análise de ensaios no âmbito da investigação ou do desenvolvimento de novos produtos; as restrições impostas ao desenho do ensaio neste capítulo não sejam satisfeitas, por exemplo restrições laboratoriais específicas podem requerer desenhos de ensaios particulares, ou quando o uso de doses em número igual e equidistantes não é apropriado; análise de curvas dose-resposta não lineares de grande extensão, como por exemplo nos ensaios imunológicos. Um esboço pormenorizado de análises de curva dose-resposta para um conjunto alargado de modelos é incluído na secção 3.4 e um exemplo simples é dado na secção 5.4.

1.1. DESENHO GERAL E PRECISÃO

A Farmacopeia descreve métodos biológicos destinados aodoseamento de substâncias e preparações em que a actividade não pode ser correctamente determinada por métodosquímicos ou físicos. Na medida do possível, o princípioaplicado nos doseamentos é a comparação com a preparaçãopadrão de modo a determinar a quantidade da amostra queproduz o mesmo efeito biológico que uma quantidade deter-minada da substância padrão, a Unidade. Uma das condiçõesessenciais à aplicação destes métodos de titulação é que osensaios são efectuados simultaneamente com as preparaçõespadrão e as amostras, e em condições idênticas. Para certosensaios (por exemplo, determinação de títulos de vírus), aactividade da amostra não é expressa em termos relativos emrelação ao padrão. A secção 4.5 refere-se a este tipo de ensaio.

Qualquer avaliação da actividade derivada do ensaio biológicoé sujeita a erro aleatório devido à variabilidade inerente dasrespostas biológicas e devem ser feitos os cálculos dos erros,se possível, a partir dos resultados dos ensaios, mesmoquando são utilizados os métodos oficiais. Os métodos para odesenho dos ensaios e cálculos dos respectivos erros são,assim, descritos a seguir. Em cada caso, antes da adopção deum método estatístico, devem ser realizados ensaiospreliminares em número apropriado de modo a certificar aaplicabilidade do método.

Os limites de confiança para uma determinada actividade dãouma indicação da precisão com a qual a actividade foicalculada no ensaio. São calculados tendo em atenção odesenho experimental e o tamanho da amostra. O limite deconfiança para 95 por cento é habitualmente escolhido paraos ensaios biológicos. Os métodos matemáticos são utilizadospara calcular aqueles limites e para garantir que existe aprobabilidade de 95 por cento de que estes limites incluam aactividade real. A aceitação desta precisão pela Farmacopeiadepende dos requisitos estipulados na monografia dapreparação em causa.

Os termos «média» e «desvio padrão» são usados aqui tal como definidos nos manuais de bioestatística mais divulgados.

Os termos «actividade declarada» ou «actividade rotulada»,«actividade atribuída», «actividade assumida», «relação deactividade» e «actividade estimada» são usados neste capítulopara os conceitos seguintes:

– «actividade declarada» ou «actividade rotulada»: no caso deum produto preparado, é um valor nominal atribuído apartir do conhecimento existente da actividade da matériaprima; no caso da matéria prima, consiste na actividadeprevista pelo fabricante,

– «actividade atribuída»: a actividade da substância padrão,

– «actividade assumida»: actividade provisória de umaamostra que forma a base de cálculo da dose que irá teruma actividade equivalente à dose da preparação com opadrão a utilizar,

– «relação de actividade « de uma amostra: relação entre asdoses da preparação padrão e da amostra com uma activi-dade equivalente nas condições do ensaio,

– «actividade estimada»: actividade calculada a partir dosdados do ensaio.

A secção 9 (Glossário de símbolos e termos) contém umatabela com os símbolos mais usados neste anexo. Quando otexto se referir a um símbolo inexistente naquela secção ouusar um símbolo para um conceito diferente, ele será definidona respectiva parte do texto.

2. ALEATORIEDADE EINDEPENDÊNCIA DE TRATAMENTOSINDIVIDUAIS

A distribuição de diferentes tratamentos a diferentes unidadesexperimentais (animais, tubos, etc.) deve ser realizada estrita-mente por processos aleatórios. Qualquer outra escolha decondições experimentais, que não sejam contempladas nodesenho experimental, deve igualmente ser aleatória.Exemplos disso são a escolha da posição das jaulas numlaboratório e a ordem de administração dos tratamentos. Emparticular, um grupo de animais que receba a mesma dose dequalquer preparação não deve ser tratado em conjunto (aomesmo tempo ou na mesma posição), a não ser que existauma forte evidência que a fonte de variação relevante (porexemplo, entre tempos ou entre posições) seja negligenciável.A distribuição aleatória pode ser obtida a partir de computa-dores usando a função aleatória pré-definida. O experimenta-dor deve verificar que são produzidas séries de númerosdiferentes cada vez que a função é activada.

As preparações atribuídas a cada unidade experimental devemser tão independentes quanto possível. Dentro de cada grupoexperimental, as diluições atribuídas a cada tratamento não


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5.3. Análises estatísticas

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 543

devem ser apenas divisões da mesma dose, mas preparadasindividualmente. Sem esta precaução indispensável, a variabi-lidade inerente à preparação não estará completamente repre-sentada na variância do erro experimental. O resultado seráuma subestimação do erro residual conduzindo a:

1) um aumento injustificado do rigor dos testes da análise devariância (ver secções 3.2.3 e 3.2.4),

2) uma subestimativa dos verdadeiros limites de confiançapara o teste, que são calculados a partir da estimativa de s2

(média quadrática do erro residual), tal como é mostradona secção 3.2.5.

3. ENSAIOS DEPENDENTES DE RESPOSTAS QUANTITATIVAS

3.1. MODELOS ESTATÍSTICOS

3.1.1. PRINCÍPIOS GERAIS

Os ensaios biológicos incluídos na Farmacopeia foramconcebidos como «ensaios de diluição», o que significa que ésuposto que as amostras a serem ensaiadas tenham a mesmasubstância activa que as preparações padrão, mas em propor-ções diferentes de substância activa e substâncias inertes. Emtal caso, as amostras podem, em teoria, ser derivadas daspreparações padrão por diluição com substâncias inertes. Paraverificar se um ensaio em especial pode ser considerado umensaio de diluição, é necessário observar os efeitos da diluiçãodos padrões na relação dose-resposta da substância activa.Quando a diferença entre a relação dose-resposta das prepara-ções padrão e da amostra num ensaio se desvia marcadamente do efeito da diluição da substância activa na diluição teórica doensaio, este modelo não é validado para este ensaio específico.

Diferenças significativas nas relações dose-resposta do padrão e da amostra podem sugerir que uma das preparações contém, para além da substância activa, outras componentes que não são inertes mas que podem influenciar as respostas medidas.

Para realizar o efeito da diluição no modelo teórico aparente,é útil transformar a relação dose-resposta numa função linearna maior latitude possível de doses. Dois modelos estatísticossão de interesse para os ensaios biológicos prescritos: omodelo de linhas paralelas e o modelo de relação de declives.

A aplicação de qualquer um deles é dependente do preenchi-mento das seguintes condições:

1) os diferentes tratamentos foram atribuídos aleatoriamenteàs unidades experimentais,

2) as respostas de cada tratamento estão normalmentedistribuídas,

3) os desvios padrões da resposta dentro de cada grupo tratadodo padrão e da amostra não diferem significativamente unsdos outros.

Quando um ensaio é desenvolvido, o analista deve determinarque os dados recolhidos em múltiplos ensaios obedecem àsseguintes condições teóricas:

– a condição 1 pode ser preenchida através de um usoeficiente da secção 2,

– a condição 2 é um requisito que na prática é semprecumprido. Desvios menores deste requisito geralmente nãointroduzem defeitos nas análises, desde que as diferentesréplicas por tratamento sejam incluídas. Em caso de

dúvida, pode ser feito um teste para desvio à normalidade(p. ex. o teste de Shapiro-Wilk(1)),

– a condição 3 pode ser verificada com um teste de homoge-neidade de variâncias (p. ex. o teste de Bartlett(2) ou o testede Cochran(3)). A inspecção das representações gráficas dosdados pode igualmente ser elucidativa deste objectivo (verexemplos na secção 5).

Quando as condições 2 e/ou 3 não forem satisfeitas, a trans-formação das respostas podem originar um melhor preenchi-mento daquelas condições. Exemplos são ln y, �y� ou y2:

– a transformação logarítmica das respostas y em ln y podeser útil quando a homogeneidade das variâncias não ésatisfatória. Pode igualmente melhorar a normalidade dadistribuição quando ela está desvia para a direita,

– a transformação de y em �y� é útil quando as observaçõesseguem a distribuição de Poisson, isto é, quando sãoobtidas por contagem,

– a transformação quadrática de y em y2 é útil quando, porexemplo, é mais provável que a dose seja proporcional à áreade uma zona de inibição do que à medida do diâmetro da zona.

Para alguns ensaios dependentes de respostas quantitativas,tal como os imunoensaios ou ensaios in vitro em células, deveser usado um grande número de doses. Estas doses dãorespostas que abarcam toda a latitude de respostas eproduzem uma curva não linear prolongada da dose-resposta. Tais curvas são típicas de todos os bioensaios, mas paramuitos ensaios o uso de um largo número de doses não éético (por exemplo, ensaios in vivo) ou prático, e os objectivosdo ensaio podem ser atingidos com um número limitado dedoses. É, deste modo, habitual restringir as doses à partelinear da curva dose-resposta obtida por uma transformaçãoapropriada, de modo a que os métodos descritos nas secções3.2 ou 3.3 sejam aplicáveis. Contudo, em alguns casos aanálise de toda a curva dose-resposta é desejável. Um esboçode um modelo aplicável para tais análises é dado na secção 3.4e um exemplo simplificado é apresentado na secção 5.4.

Uma categoria separada é constituída pelos ensaios em que aresposta não pode ser mensurada em cada unidadeexperimental, mas em que apenas a fracção das unidadesrespondendo a cada tratamento podem ser contadas. Estacategoria é abordada na secção 4.

3.1.2. ENSAIOS DE ROTINA

Quando um ensaio é de utilização em rotina, é normalmentepossível verificar sistematicamente o cumprimento dascondições 1 a 3, porque o número limitado de observaçõespor ensaio pode influenciar a sensibilidade dos testes estatís-ticos. Felizmente, foi demonstrado que, em ensaios balancea-dos simetricamente, pequenos desvios à homogeneidade davariância e da normalidade não afectam seriamente osresultados do ensaio. A aplicabilidade do modelo estatísticodeve ser questionada apenas quando uma série de ensaiosdemonstrar uma validação duvidosa. Pode então ser necessá-rio desenvolver uma série de investigações preliminares comodiscutido na secção 3.1.1.



5. Textos gerais

(1) Wilk, M. B. e Shapiro, S. S. (1968). «The joint assessment of nor-mality of several independent samples», Technometrics, 10: 825-839.(2) Bartlett, M. S. (1937). «Properties of sufficiency and statisticaltests», Proc. Roy. Soc. London, Series A, 160: 280-282.(3) Cochran, W. G. (1951). «Testing a linear regression amoungvariances», Biometrics 7, 17-32.

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Duas outras condições necessárias condicionam do modeloestatístico a ser usado:

– para o modelo de linhas paralelas

4A. A relação entre o logaritmo da dose e a resposta pode ser representada por uma linha recta no intervalo das dosesusadas,

5A. Para qualquer amostra no ensaio, a linha recta é paralelaà obtida com o padrão.

– para o modelo de relação de declives

4B. A relação entre a dose e a resposta pode ser representada por uma linha recta para cada preparação no ensaio acimado intervalo de doses utilizadas,

5B. Para cada amostra no ensaio, a linha recta intersecta oeixo y (na dose zero) no mesmo ponto que a linha recta dapreparação padrão (isto é, as funções de resposta de todasas preparações do ensaio devem ter o mesmo ponto deintercepção da resposta da função padrão).

As condições 4A e 4B apenas podem ser verificadas em ensaios em que, pelo menos, 3 diluições de cada preparação foramtestadas. O uso de um ensaio com apenas 1 ou 2 diluiçõespode ser justificado quando a experiência demonstrou que a linearidade e o paralelismo ou igual intercepção são regular-mente realizadas.

Depois de recolher os resultados de um ensaio, e antes decalcular a sua actividade relativa de cada amostra, deve ser feita uma análise de variância de modo a verificar se as condi-ções 4A e 5A (ou 4B e 5B) são cumpridas. Para tal, o total dasoma dos quadrados é subdividido num certo número desomas de quadrados correspondentes a cada condição que foirealizada. O restante da soma dos quadrados representa o erroexperimental residual para a qual a ausência ou presença decausas relevantes de variação pode ser comparada pelas sériesde rácios-F.

Quando a validação está estabelecida, a actividade de cadaamostra relativamente ao padrão pode ser calculada eexpressa como uma relação de actividade ou convertida numaqualquer unidade relevante para a amostra em teste, porexemplo em Unidades Internacionais. Os limites de confiançapodem ser calculados para cada conjunto de dados do ensaio.

Se alguma das cinco condições (1, 2, 3, 4A e 5A ou 1, 2, 3, 4B e 5B) não for preenchida, os métodos de calculo aqui descritos não são válidos e deve ser realizado um estudo especial doensaio técnico.

O analista não deve usar mais nenhuma transformação a não ser que seja demonstrado que o incumprimento dos requisitos não é acidental mas é devido a uma modificação sistemáticadas condições experimentais. Neste caso, os ensaios, tal como descrito na secção 3.1.1., devem ser repetidos antes de adoptaruma nova transformação nos ensaios de rotina.

Um número excessivo de ensaios inválidos devido à ausênciade paralelismo ou de linearidade, num ensaio de rotinarealizado para comparar materiais similares, indica desenhosexperimentais com replicação inadequada. Esta inadequaçãoresulta normalmente do reconhecimento incompleto de todasas causas de variação que podem afectar o ensaio, o que podeoriginar na subavaliação do erro residual conducente agrandes rácios-F.

Nem sempre é possível ter em atenção todas as causaspossíveis de variação num único ensaio (por exemplo,variação diária). Nestes casos, os limites de confiança deensaios repetidos da mesma amostra podem não se sobrepor

satisfatoriamente, e deve ter-se cuidado na interpretação doslimites de confiança individuais.. De modo a obter umaavaliação mais correcta do limite de confiança pode sernecessário realizar vários ensaios independentes e combiná--los numa única actividade estimada e num único intervalode confiança (ver secção 6).

Com o objectivo fazer o controlo de qualidade de ensaios derotina é recomendado manter o registo das previsões dodeclive da regressão e da previsão do erro residual nos mapasde controlo.

– Um erro residual excepcionalmente elevado pode indicarum problema técnico. Este facto deve ser investigado e, sefor demonstrado que algo correu mal durante o processo, oensaio deve ser repetido. Um erro residual invulgarmenteelevado pode igualmente indicar a presença de uma respostafora de contexto (outlying) ou de uma observação aberrante.Uma resposta questionável devido à falha de cumprimentodo procedimento durante um ensaio é rejeitada. Se fordescoberto um valor aberrante após o registo das respostas,mas puder ser relacionado com irregularidades do ensaio,pode ser justificada a sua omissão. A rejeição ou retençãoarbitrária de uma resposta aparentemente aberrante podeser uma forte causa de interferência. Em geral, desenco-raja-se a rejeição de observações apenas devido à significân-cia de um teste de contexto.

– Um erro residual excepcionalmente baixo pode verificar-seesporadicamente e dá origem a rácios-F que excedem osvalores críticos. Em tal caso, pode justificar-se a substitui-ção do erro residual estimado a partir do ensaio individualpelo erro residual médio baseado nos dados históricosregistados nos mapas de controlo.

3.1.3. CÁLCULOS E RESTRIÇÕES

De acordo com os princípios gerais de um bom desenhoexperimental as seguintes 3 restrições são normalmenteimpostas no desenho dos ensaios. Elas têm vantagens quer nafacilidade de cálculo quer na precisão.

a) Cada preparação no ensaio deve ser testada com o mesmonúmero de diluições.

b) No modelo de linhas paralelas, o rácio de doses adjacentesdeve ser constante para todos os tratamentos do ensaio; nomodelo de relação de declives, o intervalo entre dosesadjacentes deve ser constante para todos os tratamentosdo ensaio.

c) Deve existir um número igual de unidades experimentaisem cada tratamento.

Se for usado um desenho experimental que satisfaça estas condições os cálculos são simples. As fórmulas são apresentadasnas secções 3.2 e 3.3. É recomendado o uso de programasinformáticos (software) que tenha sido desenvolvido expressa-mente para este objectivo. Existem vários programas quepodem facilmente ser utilizados para todos os desenhos expe-rimentais descritos nas monografias. Nem todos os programas usam as mesmas fórmulas e algoritmos, mas todos eles devemchegar aos mesmos resultados.

Desenhos experimentais que não cumpram as restriçõesacima mencionadas podem ser realizáveis e correctos, mas asfórmulas necessárias são demasiado complicadas para seremdescritas neste texto. Uma breve descrição dos métodos decálculo é apresentada na secção 7.1. Estes métodos podemigualmente ser usados em desenhos restringidos, mas nessecaso eles são equivalentes com as fórmulas simples. Asfórmulas para os desenhos restringidos apresentadas neste



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texto podem ser usadas, por exemplo, para criar programasespecíficos numa folha de cálculo. Os exemplos na secção 5podem ser usados para clarificar o especialista e para verificarse um dado programa fornece os resultados correctos.

3.2. MODELO DE LINHAS PARALELAS

3.2.1. INTRODUÇÃO

O modelo de linhas paralelas é ilustrado na figura 3.2.1.-I. Ologaritmo das doses está representado no eixo horizontal coma menor concentração à esquerda a com a maior à direita. Asrespostas estão indicadas no eixo vertical. As respostas indivi-duais de cada tratamento estão indicadas com pontos negros.As 2 linhas representam as relações ln(dose)-resposta dopadrão e da amostra.

FIGURA 3.2.1.-I – Modelo de linhas paralelas para um ensaio 3 + 3.

Nota: o logaritmo natural (ln ou loge) é usado extensivamenteneste texto. O termo «antilogaritmo» é usado para designarex. No entanto, é igualmente possível utilizar os logaritmosdecimais ou de Briggs (log ou log10); neste caso, o antiloga-ritmo correspondente é 10x.

Para a existência de um ensaio satisfatório a actividadeassumida das amostras do teste deve ser próxima daactividade real. Com base nesta actividade assumida e naactividade atribuída do padrão, são preparadas diluiçõesequivalentes (se possível), isto é, doses correspondentes dopadrão e da amostra devem dar a mesma resposta. Se nãoexistir informação sobre a actividade assumida, devem serrealizados ensaios preliminares num grande amplitude dedoses para determinar a amplitude onde a curva é linear.

Quanto mais próximo da actividade assumida correcta daamostra, mais próximas estarão as 2 linhas, uma vez quedevem existir respostas iguais para doses iguais. A distânciahorizontal entre as linhas representa a «verdadeira»actividade da amostra, relativamente à sua actividadeassumida. Quanto maior a distância entre as 2 linhas, pior aactividade assumida da amostra. Se a linha da amostra estásituada à direita da do padrão, a actividade assumida foi

sobrestimada, e os cálculos indicam uma actividade estimadamenor do que a actividade assumida. Igualmente, se a linhada amostra está situada à esquerda da do padrão, a actividadeassumida foi subestimada, e os cálculos indicam umaactividade estimada superior à actividade assumida.

3.2.2. DESENHO EXPERIMENTAL

As seguintes condições são úteis na optimização da precisãodo desenho experimental:

1) o rácio entre o declive e o erro residual deve ser o maiorpossível,

2) a amplitude das doses deve ser a maior possível,

3) as linhas devem estar tão próximas quanto possível, isto é,a actividade assumida deve ser um bom cálculo daverdadeira actividade.

A alocação de unidades experimentais (animais, tubos, etc.) adiferentes tratamentos pode ser feita de várias maneiras.

3.2.2.1. Desenho completamente aleatório

Se a totalidade das unidades experimentais parecer ser razoa-velmente homogénea sem indicação de que a variabilidade daresposta é menor dentro de certos subgrupos reconhecidos, adistribuição das unidades a diferentes tratamentos deve serefectuada aleatoriamente.

Se unidades dentro de subgrupos, tais como posições físicasou dias de experimentação, tiverem tendências a serem maishomogéneos do que a totalidade das unidades, a precisão doensaio pode ser aumentada através da introdução de uma oumais restrições no desenho. Uma escolha cuidadosa dobalanço sobre estas restrições permite a eliminação de fontesde variação irrelevantes.

3.2.2.2. Desenho de bloco aleatório

Neste desenho é possível segregar uma fonte de variaçãoidentificável, tal como a variação sensível entre ninhadas deanimais de experimentação ou a variação entre caixas de Petrinos ensaios de difusão microbiológica. O desenho requer quecada tratamento seja aplicado em igual número de vezes emcada bloco (ninhada ou caixa de Petri) e só é adequadoquando o bloco for suficientemente grande para acomodartodos os tratamentos.

Isto está ilustrado na secção 5.1.3. É igualmente possível usarum desenho aleatório com replicação. Os tratamentos devematribuídos aleatoriamente a cada bloco. Na secção 8.5 éapresentado um algoritmo para obter permutações aleatórias.

3.2.2.3. Desenho do quadrado latino

Este desenho é apropriado quando a resposta pode serafectada por duas fontes de variação diferentes, cada uma dasquais assume k diferentes níveis ou posições. Por exemplo,num ensaio de um antibiótico em placa os tratamentospodem ser arranjados numa ordenação de k × k numa placagrande, cada tratamento ocorrendo uma vez em cada linha decada coluna. O desenho é apropriado quando o número delinhas, o número de colunas e o número de tratamentos forigual. As respostas são registadas num quadrado de formatoconhecido por quadrado latino. As variações devidas àsdiferenças nas respostas entre as k linhas e entre as k colunaspodem ser segregadas, deste modo reduzindo o erro. Nasecção 5.1.2 apresenta-se um exemplo de desenho dequadrado latino, e na secção 8.6 é fornecido um algoritmopara obter quadrados latinos.



5. Textos gerais

Padrão

Amostra

In dose (x)

Res

post

a (V

)

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 546

3.2.2.4. Desenho de permutação

Este desenho é útil quando a experiência pode ser subdividida em blocos mas é possível aplicar apenas dois tratamentos acada bloco, por exemplo um bloco pode ser uma unidadesingular que pode ser testada em duas ocasiões. O desenhopretende incrementar a precisão eliminando os efeitos dasdiferenças entre unidades ao mesmo tempo que balança oefeito de qualquer diferença entre níveis gerais de respostanas duas etapas do teste. Se forem testadas duas doses de umpadrão e de uma amostra é designado como um teste depermutação duplo.

A experiência é dividida em duas partes separadas por umintervalo de tempo apropriado. As unidades são divididas em quatro grupos e cada grupo recebe um dos quatro tratamentosna primeira parte do teste. As unidades que receberam umapreparação na primeira parte do teste recebem a outra pre-paração na segunda parte, e unidades recebendo pequenasdoses numa parte do teste recebem as grandes doses naoutra. O arranjo das doses é mostrado na tabela 3.2.2.-I. Nasecção 5.1.5 pode ser encontrado um exemplo.

TABELA 3.2.2.-I – Ordenação das doses num ensaio cruzado

Grupo de unidades Tempo I Tempo II

1 S1 T22 S2 T13 T1 S24 T2 S1

3.2.3. ANÁLISE DE VARIÂNCIA

Esta secção fornece as fórmulas requeridas para desenvolvera análise de variância e será mais facilmente percebida refe-renciando com os exemplos práticos da secção 5.1. Igual-mente deve ser consultado o glossário de símbolos (secção 9).

As fórmulas são indicadas para ensaios simétricos onde umaou mais amostras (T, U, etc.) são comparadas com o padrão(P). Deve ser realçado que as fórmulas apenas podem ser usa-das se as doses forem igualmente espaçadas, se forem aplica-dos números iguais de tratamentos por amostra e a cada tra-tamento é aplicado um número igual de vezes. Não se devemusar estas fórmulas em quaisquer outras circunstâncias.

Para além de alguns ajustamentos ao termo de erro, a análise básica dos dados resultantes de um ensaio é a mesma paraos desenhos completamente aleatório, de bloco aleatório ede quadrado latino. As fórmulas de testes de bloco aleatórionão se adaptam completamente a este esquema, pelo que sãoincorporadas no Exemplo 5.5.5.

Tendo considerado os pontos discutidos na secção 3.1. etransformado as respostas, se necessário, devem ser calcula-das as médias dos valores em cada tratamento e em cada preparação, como mostrado nas tabelas 3.2.3.-I. Os contrastes lineares, que relacionam os declives das rectas de ln(dose)--resposta, devem igualmente ser formados. Na tabela 3.2.3.-II são apresentadas 3 fórmulas adicionais, necessáriaspara a construção da análise de variância.

A variação total na resposta causada por diferentes tratamentos é agora dividida, como mostrado na tabela 3.2.3.-III., sendo as somas dos quadrados derivadas dos valores obtidos nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II. A soma dos quadrados devidos à ausência de linearidade apenas pode ser calculada se pelo menos 3 doses por preparação forem incluídas no ensaio.

O erro residual do ensaio obtém-se pela subtracção das variações permitidas no desenho à variação total da resposta (tabela 3.2.3.-IV). Nesta tabela representa a média de todas as respostas registadas no ensaio. Deve ter-se em atenção que para um quadrado latino, o número de respostas replicadas (n) é igual ao número de linhas, colunas ou tratamentos (dh).

A análise de variância é agora completada do seguinte modo.Cada soma de quadrados é dividida pelo número de graus deliberdade correspondentes para dar origem às médiasquadráticas. A média quadrática para cada variável em testeé expressa como o rácio do erro residual (s2) e asignificância destes valores (conhecidos como rácios-F) sãoverificadas pelo uso da tabela 8.1 ou uma subrotinaapropriada de um programa informático.

3.2.4. TESTES DE VALIDAÇÃO

Os resultados dos ensaios são considerados «estatisticamenteválidos» se o resultado desses testes for o seguinte.

1) O termo da regressão linear é significativo, isto é, aprobabilidade calculada é inferior a 0,05. Se este critério



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 3.2.3.-I – Fórmulas para os ensaios de linhas paralelas com d doses de cada preparação

Padrão (S) 1ª amostra (T) 2ª amostra (U, etc.)

Resposta média à dose mais baixa S1 T1 U1

Resposta média à 2ª dose S2 T2 U2

... ... ... ...

Resposta média à dose mais elevada Sd Td Ud

Total da amostra PS � S1 � S2 �... � Sd PT � T1 � T2 � ... � Td PU � ... etc.

Contraste linear LS � 1S1 � 2S2 � ... LT � 1T1 � 2T2 � ... LU � ... etc.

�dSd �� (d � 1)PS �dTd �� (d � 1)PT

TABELA 3.2.3.-II – Fórmulas complementares para a construção da análise de variância

HP � HL � K �n(PS � PT � ...)2

��hd

12n�d3 � d

n�d

1�2

1�2

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 547

não for satisfeito, não é possível calcular os limites deconfiança para 95 por cento,

2) o termo de não-paralelismo não é significativo, isto é, aprobabilidade calculada não é inferior a 0,05. Isto indicaque a condição 5A, da secção 3.1 é satisfeita,

3) o termo de não-linearidade não é significativo, isto é, aprobabilidade calculada não é inferior a 0,05. Isto indicaque a condição 4A, da secção 3.1 é satisfeita.

Um desvio significativo ao paralelismo num ensaio múltiplopode ser devido à inclusão no ensaio de uma amostra que dáuma recta ln(dose)-resposta com um declive diferente do dasoutras preparações. Em vez de declarar a invalidação doensaio, pode ser decidido eliminar todos os dados relaciona-dos com aquela preparação e recomeçar a análise do princípio.

Quando a validação estatística é estabelecida, podem sercalculadas as actividades e os limites de confiança pelosmétodos descritos na secção seguinte.

3.2.5. CÁLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DECONFIANÇA

Sendo I o ln do rácio entre doses adjacentes de umapreparação, o declive comum (b) de ensaios com d doses decada preparação obtém-se a partir de:

b � (3.2.5.-1)

e o logaritmo da relação de actividade de uma amostra, porexemplo T, é:

HL (LS � LT � ...)��Inh

M ’T � (3.2.5.-2)

A actividade calculada é uma estimativa da «verdadeiraactividade» de cada desconhecido. Os limites de confiançapodem ser calculados como os antilogaritmos de:

CM ’T � �(C� �� 1�)�(C�M�’2T� �� 2�V�)�

onde C � e V � (3.2.5.-3)

O valor de t pode ser obtido na tabela 8.2 para p = 0,05 ecom os graus de liberdade iguais ao número de graus deliberdade do erro residual. A actividade estimada (RT) e oslimites de confiança associados obtêm-se multiplicando osvalores obtidos por AT depois da obtenção dosantilogaritmos. Se as soluções de armazenamento não sãoexactamente equivalentes, com base nas actividadesatribuídas e assumidas, é necessário introduzir um factor decorrecção (ver Exemplos 5.1.2 e 5.1.3).

3.2.6. VALORES EM FALTA

Num ensaio balanceado, um acidente totalmente desligadodos tratamentos aplicados pode conduzir à perda de uma oumais respostas, por exemplo devido à morte de um animal.Se se considerar que o acidente não está ligado à composi-ção da preparação administrada, os cálculos exactos podemser realizados mas as fórmulas são mais complicadas epodem apenas ser dadas dentro do contexto dos modelos

SSreg�b2dnSSreg��SSreg � s2t2

PT � PS�db



5. Textos gerais

TABELA 3.2.3.-III – Fórmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade

Origem da variação Graus de liberdade (f) Soma dos quadrados

Amostras h � 1 SSprep � HP (P2S�P2

T � ...) � K

Regressão linear 1 SSreg � HL (LS � LT � ...)2

Não paralelismo h � 1 SSpar � HL (L �L � ...) � SSreg

Nãolinearidade (*) h (d � 2) SSlin � SStreat � SSprep � SSreg � SSpar

Tratamentos hd � 1 SStreat � n(S21 � ... � S2

d � T 21 � ... � T 2

d � ...) � K

(*) Não calculado para as titulações de 2 doses.

TABELA 3.2.3.-IV – Cálculo do erro residual

Origem da variação Graus de liberdade Soma dos quadrados

blocos (linhas) (*) n � 1 SSblock � hd (R21 � ... �R2

n ) � K

colunas (**) n � 1 SScol � hd (C21 � ... � C2

n ) � K

total aleatório hd (n � 1) SSres � SStot � SStreat

erro residual (***) blocos completos (hd � 1) (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock

quadrado latino (hd � 2) (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock � SScol

total nhd � 1 SStot � � (y � y� )2

(*) (*) Não calculado para os ensaios totalmente aleatórios.(**) Só calculado para os quadrados latinos.(***) Depende do tipo de ensaio utilizado.

1�h

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 548

lineares gerais (ver secção 7.1). Contudo, existe um método aproximado que mantém a simplicidade do desenho balan-ceado substituindo a resposta em falta por um valor calculado.A perda de informação é tomada em consideração diminuindoos graus de liberdade do total da soma dos quadrados e para oerro residual pelo número de valores em falta e usando umadas fórmulas a seguir fornecidas para o valor em falta. Deveter-se em atenção que este método é apenas aproximativo, eque o uso de um método exacto é preferencial.

Se mais do que uma observação estiver em falta pode usar-sea mesma fórmula. O procedimento consiste em fazer umaestimativa aproximada de todos os valores em falta, exceptode um, e usar a fórmula apropriada para esse valor e usartodos os restantes valores incluindo os estimados por aproxi-mação. Preencha o valor calculado. Continue de modosemelhante calculando o valor da primeira estimativagrosseira. Depois de calcular todos os valores em falta destemodo, todo o ciclo deve ser repetido desde o princípio, e emcada cálculo utilize o valor mais recente, calculado ouestimado, para cada resposta à qual a fórmula tenha sidoaplicada. Este procedimento deve ser repetido até que 2ciclos consecutivos dêem os mesmos valores; a convergênciaé normalmente rápida.

Considerando que o número de valores substituídos épequeno relativamente ao número total de observações naexperiência completa (digamos, inferior a 5 por cento), aaproximação implícita nesta substituição e redução dosgraus de liberdade pelo número de valores em falta substi-tuídos deste modo é normalmente satisfatória. Contudo, aanálise deve ser interpretada com grande cuidado, especial-mente se existir uma preponderância de valores em faltanum tratamento ou bloco; se forem encontrados aspectosinvulgares deve consultar-se um especialista. A substituiçãode valores em falta num teste sem réplicas é uma operaçãoparticularmente delicada.

Desenho completamente aleatório

Num ensaio completamente aleatório o valor em falta podeser substituído pela média aritmética das outras respostas domesmo tratamento.

Desenho de bloco aleatório

O valor em falta obtém-se aplicando a equação:

y’ � (3.2.6.-1)

em que B’ é a soma das respostas do bloco contendo o valorem falta, T’ o total do tratamento correspondente e G’ asoma de todas as respostas registadas no ensaio.

Desenho do quadrado latino

O valor em falta obtém-se de:

y’ � (3.2.6.-2)

onde B’ e C’ são as somas das respostas na linha e colunacontendo o valor em falta. Neste caso k = n.

Desenho de permutação

Se ocorrer um acidente conduzindo à perda de valores numdesenho de permutação, deve ser consultado um livro deestatística (por exemplo, D. J. Finney, ver secção 10), pois a aplicação das fórmulas apropriadas depende das combinaçõesde tratamentos efectuados.

k(B � C’ � T’) � 2G’��

(k � 1) (k � 2)

nB’ � kT’ � G’��(n � 1) (k � 1)

3.3. MODELO DE RELAÇÃO DE DECLIVES

3.3.1. INTRODUÇÃO

Este modelo é adequado, por exemplo, para alguns ensaiosmicrobiológicos quando a variável independente é aconcentração de um factor de crescimento essencial inferiorà concentração óptima do meio. O modelo de relação dedeclives é ilustrado na figura 3.3.1.-I.

FIGURA 3.3.1.-I – Modelo de relação de declives para um ensaio2 � 3 � 1

As doses estão representadas no eixo horizontal com a con-centração zero à esquerda e a maior concentração à direita.As respostas estão indicadas no eixo vertical. As respostasindividuais de cada tratamento estão indicadas com pontosnegros. As 2 linhas são as relações dose-resposta calculadaspara o padrão e para a amostra, na condição que se inter-ceptam na dose zero. Ao contrário do modelo de linhas para-lelas, as doses não são transformadas logaritmicamente.

Tal como no caso de um ensaio baseado no modelo de linhasparalelas, é importante que a actividade assumida estejapróxima da actividade real, e preparar diluições equivalentesdas amostras e do padrão (se possível). Quanto mais correctafor a actividade assumida mais juntas estarão as 2 linhas. Orácio dos declives representa a «verdadeira» actividade daamostra relativamente à actividade assumida. Se o declive daamostra for mais íngreme que o do padrão, a actividade foisubestimada e os cálculos indicam uma actividade estimadamaior que a actividade assumida. De igual modo, se odeclive da amostra for menos íngreme que o do padrão, aactividade foi sobrestimada e os cálculos indicam umaactividade estimada inferior à actividade assumida.

Na preparação de uma experiência, todas as respostas devemser examinadas quanto ao cumprimento das condições 1, 2 e3 da secção 3.1. A análise de variância a realizar em ensaiosde rotina é descrita na secção 3.3.3 de modo a que ocumprimento das condições 4B e 5B da secção 3.1 possa serexaminado.

3.3.2. DESENHO DO ENSAIO

A utilização da análise estatística apresentada a seguir impõeas seguintes restrições ao ensaio:



5. T

exto

s ge

rais

Padrão

Amostra

Res

post

a (V

)

dose (x)

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 549

a) o padrão e as amostras devem ser testadas com o mesmonúmero de diluições igualmente espaçadas,

b) um grupo extra de unidades experimentais que não estejasujeito ao tratamento deve ser testado (os brancos),

c) deve existir um número igual de unidades experimentaisem cada tratamento.

Tal como já foi referido na secção 3.1.3, os desenhos experi-mentais que não cumpram estas restrições podem ser possí-veis e correctos, mas as análises estatísticas simples aquiapresentadas não são aplicáveis e deve ser obtido aconselha-mento especializado ou ser utilizada programação apropriada.

O desenho com 2 doses por preparação e 1 branco, o«desenho (2h+1) com zero comum» é preferível, uma vezque permite a maior precisão combinada com a possibilidade de verificar a validação dentro das restrições atrás mencionadas.

No entanto, nem sempre pode ser assumida como válidauma relação linear abaixo da dose zero. Com uma ligeiraperda de precisão um desenho sem brancos pode ser usado.Neste caso, 3 doses por preparação, o «desenho (3h) com zero comum», é preferível a 2 doses por preparação. As dosesdevem ser como se segue:

1) o padrão é dado numa dose alta, perto mas nãoexcedendo a mais alta dose com uma resposta média naparte rectilínea da curva dose-resposta,

2) as outras doses devem estar uniformemente distribuídasentre a dose mais alta e a dose zero,

3) as amostras devem ser dadas em doses correspondentesbaseadas na actividade assumida do material.

Um desenho completamente aleatório, de blocos aleatóriosou de quadrado latino pode ser usado, tal como descrito nasecção 3.2.2. O uso de qualquer um dos desenhos necessitade ajustamentos ao erro da soma dos quadrados tal comodescrito para os ensaios baseados no modelo de linhas

paralelas. A análise de um ensaio de uma ou mais amostrascontra um padrão é descrita a seguir.

3.3.3. ANÁLISE DE VARIÂNCIA

3.3.3.1. O desenho (hd � 1)

As respostas são verificadas tal como descrito na secção 3.1e, se necessário, transformadas. É então calculada a médiadas respostas para cada tratamento e cada preparação comomostrado na tabela 3.3.3.1.-I. Adicionalmente calcula-se aresposta média dos brancos (B).

A soma dos quadrados nas análises de variância sãocalculadas como se mostra nas tabelas 3.3.3.1.-I até 3.3.3.1.-III. A soma dos quadrados devidos à não linearidadepode apenas ser calculada se, pelo menos 3 doses de cadapreparação tiverem sido incluídas no ensaio. O erro residualé obtido subtraindo as variações permitidas no desenho àvariação total da resposta (tabela 3.3.3.1.-IV).

A análise de variância é completada como se segue. Cadasoma de quadrados é divido pelo correspondente número degraus de liberdade para obter médias quadráticas. A médiaquadrática de cada variável a ser testada é expressa como orácio do erro residual (s2) e a significância destes valores(rácios-F) é avaliada através da tabela 8.1 ou de umasubrotina adequada de um programa informático.

3.3.3.2. O desenho (hd)

As fórmulas são basicamente as mesmas do desenho (hd + 1),mas existem algumas pequenas diferenças.

– B é retirado de todas as fórmulas.

– k �

– SSblank é removido da análise de variância.

n(PS � PT � ...)2

��hd



5. Textos gerais

TABELA 3.3.3.1.-I – Fórmulas para os ensaios de relação de declive com d doses de cada preparação e 1 branco

Padrão (S) 1ª amostra a analisar (T) 2ª amostra a analisar (U, etc.)

Resposta média à menor dose S1 T1 U1

Resposta média à 2ª dose S2 T2 U2

... ... ... ...

Resposta média à maior dose Sd Td Ud

Total da amostra PS � S1 � S2 � ... � Sd PT � T1 � T2 � ... � Td Pu � ...

Produto linear LS � 1S1 � 2S2 � ... � dSd LT � 1T1 � 2T2 � ... � dTd Lu � ...

Ordenada na origem aS � (4d � 2)PS � 6LS aT � (4d � 2) PT � 6LT au � ...

Declive bS � 2LS � (d � 1)PS bT � 2LT � (d � 1) PT bu � ...

Tratamentos GS � S21 � ... � S2

d GT � T 21 � ... � T 2

d Gu � ...

Não linearidade (*) JS � GS� � JR � GT� � Ju � ...


3d3T�

d3 � dP2

T�d

3b2S�

d3S � d

P2S�d

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 550

– O número de graus de liberdade para os tratamentostorna-se hd � 1.

– O número de graus de liberdade do erro residual e davariância total é calculado como descrito para o modelode linhas paralelas (ver tabela 3.2.3.-IV).

As validações do ensaio, da actividade e dos intervalos deconfiança são descritas nas secções 3.3.4. e 3.3.5.


Os resultados dos ensaios são considerados «estatisticamenteválidos» se o resultado das análises de variância forem osseguintes:

1) a variação devida aos brancos nos desenhos (hd+1) não ésignificativa, isto é, a probabilidade calculada não émenor que 0,05. Isto indica que as respostas dos brancosnão diferem significativamente da intercepção comum ea relação linear é válida abaixo da dose zero,

2) a variação devida à intercepção não é significativa, isto é,a probabilidade calculada não é menor que 0,05. Istoindica que a condição 5B, secção 3.1 é satisfeita,

3) em ensaios incluindo pelo menos 3 doses por preparação,a variação devida à não-linearidade não é significativa,isto é, a probabilidade calculada não é menor que 0,05.Isto indica que a condição 4B, secção 3.1 é satisfeita.

A variação significativa devida aos brancos indica que ahipótese da linearidade não é válida perto da dose zero. Seisto for sistemático e não acidental para o tipo de ensaio, odesenho hd é mais apropriado. Qualquer resposta dosbrancos deve ser rejeitada.

Quando estes testes indicam que o ensaio é válido, aactividade é calculada com os seus limites de confiança talcomo descrito na secção 3.3.5.

3.3.5. CÁLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE CONFIANÇA

3.3.5.1. O desenho (hd+1)

A intercepção comum a’ das preparações pode ser calculadaa partir de:

a’ � (3.3.5.1.-1)(2d � 1) B � (2d � 3)ha��

h(2d � 3) � 2d � 1



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 3.3.3.1.-II – Fórmulas complementares para a construção da análise de variância

HB � HI � K �n(B � PS � PT � ...)2

��hd � 1a � aS � aT � ...��

h(d2 � d)n

��4d3 � 2d2 � 2d

nhd2 � nhd��hd2 � hd � 4d � 2

TABELA 3.3.3.1-III – Fórmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade

Origem da variação Graus de liberdade (f) Soma dos quadrados

Regressão n � 1 SSreg � SStreat � SSblanck � SSint � SSlin

Brancos n � 1 SSblanck � HB (B � a)2

intersecção h � 1 SSint � HI ((a2S � a2

T � ...) � h (d2 � d)2 a2

ausência de linearidade (*) h (d � 2) SSlin � (JS � JT � ...)

Tratamentos hd SStreat � n(B2 � GS � GT ...) � K


TABELA 3.3.3.1.-IV – Cálculo do erro residual

Origem da variação Graus de liberdade Soma dos quadrados

blocos (linhas) (*) n � 1 SSblock � hd (R21 � ... �R2

n ) � K

colunas (**) n � 1 SScol � hd (C21 � ... � C2

n ) � K

total aleatório (hd � 1) (n � 1) SSres � SStot � SStreat

erro residual (***) blocos completos hd (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock

quadrado latino (hd � 1) (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock � SScol

total nhd � n � 1 SStot � � (y � y� )2

(*) (*) Não calculado para os ensaios totalmente aleatórios.(**) Só calculado para os quadrados latinos.(***) Depende do tipo de ensaio utilizado.

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O declive do padrão, e de modo idêntico para cada uma daspreparações, é calculado a partir de:

b’S � (3.3.5.1.-2)

A relação de actividade de cada amostra pode agora sercalculada a partir de:

R ’T � (3.3.5.1.-3)

que deve multiplicado por AT, a actividade assumida daamostra, de modo a determinar a actividade estimada RT. Seo intervalo entre doses adjacentes não for idêntico para opadrão e amostra, a actividade deve ser multiplicada porIS /IT. Note que, ao contrário da análise de linhas paralelas,não são calculados os antilogaritmos.

O intervalo de confiança para R’T é calculado a partir de:

CR ’T � K’ ± �(C� �� 1�)�(C�R�’2T� �� 1�)�� K�’�(K�’ �� 2�C�R�’T)� (3.3.5.1.-4)

onde C = e K’ � (C � 1)V2

V1 e V2 estão relacionados com a variância e covariância donumerador e denominador de RT . Eles podem ser calculadosa partir de:

V1 � � � � (3.3.5.1.-5)

V2 � (3.3.5.1.-6)

Os limites de confiança são multiplicados por AT, e senecessário por IS/IT.

3.3.5.2. O desenho (hd)

As formulas são as mesmas do que no desenho (hd+1), comas seguintes modificações:

a’ � a (3.3.5.2.-1)

V1 � � � � (3.3.5.2.-2)

V2 � (3.3.5.2.-3)

3.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS

Este modelo é aconselhado, por exemplo, para algunsimunoensaios quando a análise é requerida para curvasdose-resposta sigmoides prolongadas. Este modelo éilustrado na figura 3.4.-I.

Os logaritmos das doses estão representados no eixo horizon-tal com a menor concentração à esquerda e a maior à direita. As respostas estão indicadas no eixo vertical. As respostasindividuais de cada tratamento estão indicadas com pontosnegros. As 2 curvas são as relações ln(dose)-resposta calcula-das para o padrão e amostras.

3(d � 1)��3(d � 1) � h(d � 1)

3�h(d � 1)

1��d � 1

6��nd(2d � 1)

3d(d � 1)��(3d � 1) (d � 2) � hd(d � 1)

3��2(2d � 1) � hd (d � 1)

1��d(d � 1)

6�n(2d � 1)

b’2S��b’2S � s2t2V1

b ’T�b ’S

6LS � 3d(d � 1)a’��

2d3 � 3d2 � d

A forma geral das curvas pode usualmente ser descrita pela função logística, mas outras formas são igualmente possíveis. Cada curva pode ser caracterizada por 4 parâmetros: aassímptota superior (α), a assímptota inferior (δ), o factor dedeclive (β) e a locação horizontal (γ). Este modelo é assimhabitualmente referido como o modelo dos 4 parâmetros. Arepresentação matemática da curva ln(dose)-resposta é:

u � � �

Para um ensaio válido é necessário que as curvas do padrãoe das amostras tenham o mesmo factor de declive, e omesmo nível de respostas máximas e mínimas nos extremos. Apenas a locação horizontal (γ) das curvas pode ser diferente. A distância horizontal entre as curvas está relacionada com aactividade «verdadeira» da amostra. Se o ensaio é usado emrotina, pode ser suficiente testar as condições de igualdadede resposta dos níveis superior e inferior quando o ensaio édesenvolvido e então voltar a testar esta condição directa-mente apenas em intervalos apropriados ou quando existiremalterações dos materiais ou das condições de ensaio.

Os cálculos de semelhanças máximas dos parâmetros e dosseus intervalos de confiança podem ser obtidos através deprogramas informáticos apropriados. Estes programasinformáticos podem incluir alguns testes de validação. Porexemplo, se os cálculos de semelhanças máximas mostraremdesvios significativos aos modelos ajustados nas condiçõesassumidas de igualdade superior e inferir das assímptotas edeclives, então uma ou todas as condições podem não estarsatisfeitas.

O modelo logístico levanta um número de problemasestatísticos que podem requerer soluções diferentes paradiferentes tipos de ensaios, e não é possível fazer um resumosimples. Uma grande variedade de aproximações é descritana literatura relevante. Para este tipo de análises érecomendado aconselhamento profissional. De qualquermaneira, é incluído um exemplo simples na secção 5.4 demodo a ilustrar uma via «possível» para analisar os dadosapresentados. Na secção 7.5 é apresentada uma pequena

� � ��1 � e� (x � )



5. Textos gerais

FIGURA 3.4.-I – Modelo de curva logística de 4 parâmetros

Padrão

Amostra

In dose (x)

Res

post

a (V

)

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 552

discussão de métodos alternativos juntamente com outrasconsiderações estatísticas.

Se não for possível nem o aconselhamento profissional nemo recurso a programas apropriados, é possível o uso demétodos alternativos: 1) se existirem estimativas «razoáveis»dos limites superior (α) e inferior (δ), seleccionar para todasas amostras as doses com médias de respostas (u) compreen-didas entre 20 por cento e 80 por cento dos limites, trans-forme as respostas das doses seleccionadas para e use omodelo de linhas paralelas (secção 3.2) para a análise; 2)seleccione a amplitude de doses para as quais as respostas(u) ou as respostas apropriadamente transformadas, porexemplo ln(u), sejam aproximadamente lineares quandograficadas contra o ln(dose); o modelo de linhas paralelas(secção 3.2) podem então ser usado para a análise.

4. ENSAIOS DEPENDENTES DERESPOSTAS QUALITATIVAS

4.1. INTRODUÇÃO

Em certos ensaios é impossível, ou excessivamente traba-lhoso, medir o efeito de cada unidade experimental numaescala quantitativa. Em alternativa, um efeito tal como amorte ou sintomas de hipoglicémia podem ser observadosquer ocorrendo ou não em cada unidade, e o resultadodepende do número de unidades em que ocorreu. Taisensaios são designados qualitativos ou tudo-ou-nada.

A situação é muito semelhante à descrita para os ensaiosquantitativos na secção 3.1, mas em vez de n repostasseparadas para cada tratamento um único valor é registado, isto é, a percentagem de unidades em cada grupo de trata-mento mostrando um efeito positivo. Quando estas percen-tagens são graficadas em função do logaritmo das doses acurva resultante tende a ser sigmoide (forma de S) em vezde ser linear.

O cálculo da curva dose-resposta é feito através de umafunção matemática que representa esta curvatura sigmoide.A função mais utilizada é a função da distribuição normalcumulativa. Esta função tem algum mérito teórico, e étalvez a melhor escolha quando a resposta é um reflexo datolerância das unidades. Se a resposta mais provavelmentedepende de um processo de crescimento, o modelo dedistribuição logística é preferível, embora o resultado dadiferença entre os 2 modelos seja muito pequeno.

As estimativas das semelhanças máximas do declive e locali-zação das curvas apenas podem ser encontradas aplicandoum procedimento iterativo. Há muitos procedimentos queconduzem aos mesmos resultados, mas eles diferem emeficácia devido à velocidade de convergência. Um dosmétodos mais rápidos consiste na optimização directa dafunção das semelhanças máximas (ver secção 7.1), que podeser facilmente realizado com programas informáticos quetenham uma subrotina interna para este objectivo.Infelizmente, a maior parte destes procedimentos não fazema estimativa dos limites de confiança, e a técnica para osobter é demasiado complica para ser aqui descrita. A técnicaa seguir descrita não é a mais rápida, mas foi escolhidadevido à sua simplicidade comparativamente com outrastécnicas alternativas. Pode ser usada para ensaios em queuma ou mais amostras são comparadas com um padrão.Para além disso, devem estar preenchidas as seguintescondições:

1) a relação entre o logaritmo da dose e a resposta pode serrepresentada pela curva da distribuição normalcumulativa,

2) as curvas do padrão e da amostra são paralelas, isto é,têm forma idêntica e apenas podem diferir pela sualocalização horizontal,

3) em teoria, não existe uma resposta natural a dosesextremamente baixas nem uma ausência de resposta adoses extremamente altas.

4.2. MÉTODO DA PROBABILIDADE ITERATIVA (4)

A curva sigmoide pode ser linearizada substituindo cadaresposta, isto é, a fracção de resposta positiva do grupo, pelovalor correspondente da distribuição normal padronizadacumulativa. Este valor, muitas vezes referido como«normit», distribui-se teoricamente entre � ∞ e � ∞. Nopassado, foi proposto acrescentar 5 a cada «normit» paraobter o «probit». Este facto facilita os cálculos manuaisporque os valores negativos são evitados. Com a chegada doscomputadores, a necessidade de adicionar 5 aos «normits»desapareceu. O termo «método normit» é mais adequadopara o método descrito a seguir. No entanto, e uma vez quea designação «análise probit» está tão divulgada, neste textoir-se-á manter aquela designação.

Uma vez linearizadas as respostas é possível aplicar a análise de linhas paralelas, como descrito na secção 3.2. Infelizmente, a condição de validação da homogeneidade da variância paracada dose não é cumprida. A variância é mínima para onormit = 0 e aumenta para valores positivos e negativos donormit. É, por isso, necessário dar maior peso à resposta naparte média da curva, e menor peso nas zonas extremas dacurva. Este método, a análise de variância, e a estimativa daactividade e dos intervalos de confiança é descrito a seguir.

4.2.1. TABULAÇÃO DE RESULTADOS

A tabela 4.2.1.-I é utilizada para introduzir os dados nascolunas indicadas por números:

(1) a dose do padrão ou da amostra,

(2) o número de n unidades submetidas a tratamento,

(3) o número de unidades r com resposta positiva aotratamento,

(4) o logaritmo x da dose,

(5) a fracção p = r/n das respostas positivas do grupo.

O primeiro ciclo começa aqui.

(6) a coluna Y é preenchida com zeros na primeira iteracção,

(7) o valor Φ = Φ (Y) da função da distribuição normalpadronizada cumulativa (ver igualmente a tabela 8.4). Ascolunas (8) a (10) são calculadas usando as seguintesequações:

(8) Z � (4.2.1.-1)

(9) y � Y � (4.2.1.-2)P � Φ�

Z

e�y2/2��2��



5. T

exto

s ge

rais

(4) Embora na maioria dos textos de estatística publicados emportuguês se mantenha o termo probit, entendeu-se traduzir peloseu real significado – probabilidade iterativa.

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 553

(10) w � (4.2.1.-3)

As colunas (11) a (15) podem ser facilmente calculadas apartir das colunas (9) e (10) como wx, wx2 e wxy, respectiva-mente, e o somatório (Σ) de cada uma das colunas (10) a (15)é calculada separadamente para cada uma das preparações.

Os somatórios calculados na tabela 4.2.1.-I são transferidospara as colunas (1) a (6) da tabela 4.2.1.-II e as 6 colunasadicionais (7) a (12) são calculadas como se segue:

(7) Sxx � � wy2 � (4.2.1.-4)

(8) Sxy � � wxy � (4.2.1.-5)

(9) Syy � � wy2 � (4.2.1.-6)

(10) x� � (4.2.1.-7)

(11) y� � (4.2.1.-8)

O declive comum b pode agora ser obtido

b � (4.2.1.-9)

e a intercepção a do padrão, e igualmente para as amostras,obtém-se

(12) a � y� � bx� (4.2.1.-10)

� Sxy��Sxx

� wy��w

� wx� �w

��wy�2

��w

��wx� ��wy�� w

��wx�2��w

nZ2

�Φ � Φ2

A coluna (6) da primeira tabela de trabalho pode agora ser substituída por Y = a + bx e o ciclo repete-se até que a diferença entre 2 ciclos seja pequena (por exemplo, a máxima diferença de Y entre dois ciclos consecutivos é menor que 10-8).


A validade dos ensaios deve ser avaliada antes de calcular aactividade e os intervalos de confiança. Os desvios à lineari-dade podem ser medidos como se segue, se pelos menos 3doses de cada preparação forem incluídas: adicione uma 13ªcoluna à tabela 4.2.1.-II e preencha-a com:

Syy � (4.2.2.-1)

O somatório da coluna é a medida dos desvios à linearidadee segue aproximadamente uma distribuição χ2 com N-2hgraus de liberdade. A significância deste valor pode seravaliada com a ajuda da tabela 8.3 ou com uma subrotinaapropriada de um programa informático. Se o valor forsignificativo para o nível de probabilidade 0,05, o ensaio deveprovavelmente ser rejeitado (ver secção 4.2.4). Quando oteste acima não der uma indicação de desvios significativos àregressão linear, os desvios ao paralelismo são testados parao nível de significância 0,05 com:

�2 � � � (4.2.2.-2)

com h-1 graus de liberdade.

4.2.3. CÁLCULO DA ACTIVIDADE E SEUS LIMITES DECONFIANÇA

Quando não existirem indicações de um desvio significativodo paralelismo e linearidade o ln(relação de actividade) M’T écalculado com:

M ’T � (4.2.3.-1)aT � as�b

�� Sxy�2��

� Sxx

S2xy�Sxx

S2xy�Sxx



5. Textos gerais

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)

dose n r x p Y ΦΦ Z y w wx wy wx2 wy2 wxy

S . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .

� � � � � � � � � � � �

T . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .

� � � � � � � � � � � �

etc.

TABELA 4.2.1.-I. – Primeira tabela de trabalho

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)

� w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy Sxx Sxy Syy x� y� a

S . . . . . . . . . . . .

T . . . . . . . . . . . .

etc. . . . . . . � � � �

TABELA 4.2.1.-II. – Segunda tabela de trabalho

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 554

e o antilogaritmo retido. Faça t = 1,96 e s = 1. Os limites deconfiança são calculados como os antilogaritmos de:

CM ’T �(C � 1) (x�S � x�T) � �(C� �� 1�)��V� �� S�xx� �� C�(M�’T�� x�S�� x�T)�2��

(4.2.3.-2)

onde C � e V � �

4.2.4. RESULTADOS INVÁLIDOS

Se o teste de desvio à linearidade descrito na secção 4.2.2 forsignificativo, o ensaio deve normalmente ser rejeitado. Seexistirem razões para conservar o ensaio, as fórmulas sãoligeiramente modificadas. t transforma-se no valor-t(p = 0,05) com o mesmo número de graus de liberdadeusado para verificar a linearidade e s2 transforma-se no valorde χ2 dividido pelo mesmo número de graus de liberdade (eassim tipicamente é maior que 1).

O teste para paralelismo é também ligeiramente modificado.O valor de χ2 para não-paralelismo é dividido pelo seunúmero de graus de liberdade. O valor obtido é dividido pelovalor de s2 anteriormente calculado de modo a obter o rácio--F com h-1 e N-2h graus de liberdade, que é avaliado domodo habitual para o nível de significância 0,05.

4.3. O MÉTODO LOGIT

Tal como indicado na secção 4.1 o método logit pode, porvezes, ser o mais apropriado. O nome do método é derivadoda função logit que é o inverso da distribuição logística. Oprocedimento é idêntico ao descrito para o método probitcom as seguintes modificações nas fórmulas Φ e Z.

Φ � (4.3.-1)

Z � (4.3.-2)

4.4. OUTRAS FORMAS DA CURVA

Os métodos probit e logit são quase sempre adequados para as análises de respostas qualitativas exigidas na Farmacopeia. No entanto, deve ser referido que a curva ln(dose)-respostatem outras formas para além das 2 curvas descritas, podendoser adoptada uma outra curva Φ.

Por exemplo, se for demonstrado que a curva não é simétrica, pode ser apropriado aplicar a distribuição de Gompertz (mé-todo gompit) sendo nesse caso e Φ � 1 � e –e Y e Z � eY – eY.

4.5. A DOSE EFECTIVA MEDIANA

Em alguns tipos de ensaios é desejável determinar a doseefectiva mediana que é a dose que produz uma resposta em50 por cento das unidades. O método probit pode ser usadopara determinar a dose efectiva mediana (ED50), mas umavez que não há necessidade de exprimir esta dose relativa-mente a um padrão, as fórmulas são ligeiramente diferentes.

Nota: pode opcionalmente ser incluído um padrão de modoa validar um ensaio. Habitualmente o ensaio é consideradoválido se o valor calculado de ED50 para o padrão forsuficientemente próximo da ED50 assumida. O significado de«suficientemente próximo» neste contexto depende dosrequisitos especificados na monografia.

e�Y�(1 � e�Y)

1�1 � e�Y

1��

T

w

1��

S

w

b2 � Sxx��b2 � Sxx � s2t2

A tabulação das respostas das amostras, e opcionalmente dopadrão, é realizada de acordo com o descrito na secção 4.2.1.O teste para a linearidade é realizado tal como descrito nasecção 4.2.2. Para este tipo de ensaio não há necessidade defazer o teste de paralelismo. A ED50 da amostra T, e de igualmodo para as outras amostras, é obtido tal como descrito nasecção 4.2.3, com as seguintes modificações nas fórmulas4.2.3.-1 e 4.2.3.-2).

M ’T � (5.5.-1)

e

CM ’T �(C � 1) x�T � �(C� �� 1�)��V� �� S�xx� �� C� (�M�’T �� x��T)�2�

Onde V � e C não muda (4.5.-2)

5. EXEMPLOS

Esta secção é composta por exemplos trabalhados para ilustrar a aplicação das fórmulas. Os exemplos foram seleccionados com o objectivo principal de ilustrar os métodos estatísticos de cálculo. Não têm por objectivo reflectir o método mais adequado para o ensaio, caso as monografias individuais permitam a possibilidade de usar alternativas. Para aumentar o seu valor para a validação de programas, são apresentados mais números decimais do que o necessário. Deve igualmente ser notado que existem outros métodos de cálculo equiva-lentes. Esses métodos devem conduzir exactamente aos mesmos resultados do que os apresentados nos exemplos.

5.1. MODELO DE LINHAS PARALELAS

5.1.1. ENSAIO MÚLTIPLO DE DUAS DOSES COM DESENHOCOMPLETAMENTE ALEATÓRIO

Ensaio de corticotrofina por injecção subcutânea em rato

O padrão é administrado nas doses de 0,25 e 1,0 unidade por100 g de peso corporal. Assumiu-se que as 2 amostras têmuma actividade de 1 unidade por miligrama e são adminis-tradas nas mesmas quantidades que o padrão. As respostasindividuais e as médias de cada grupo tratado são apresenta-das na tabela 5.1.1.-I. A representação gráfica não sugerequalquer dúvida quanto à homogeneidade da variância e ànormalidade dos dados, mas sugere problemas quanto aoparalelismo da preparação U.

1��T

w

�aT�b



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 5.1.1.-I – Resposta instrumental y – massa de ácidoascórbico (mg) por 100 g de glândula supra-renal

Padrão S Amostra T Amostra U

S1 S2 T1 T2 U1 U2

300 289 310 230 250 236

310 221 290 210 268 213

330 267 360 280 273 283

290 236 341 261 240 269

364 250 321 241 307 251

328 231 370 290 270 294

390 229 303 223 317 223

360 269 334 254 312 250

342 233 295 216 320 216

306 259 315 235 265 265

média 332,0 248,4 323,9 244,0 282,2 250,0

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 555

As fórmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aosresultados:

PS � 580,4 LS � 41,8

PT � 567,9 LT � �39,95

PU � 532,2 LU � �16,1

HP � 10/2 � 5 HL � � 20

A análise de variância pode agora ser completada com asfórmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.1.-IIapresenta os resultados.

120�

6

A análise sem a amostra U conclui que os resultados estão de acordo com os requisitos quanto à regressão e ao paralelismo, e em consequência a actividade pode ser calculada. Asfórmulas na secção 3.2.5 dão:

– para o declive comum:

b � � �58,970

– o ln(actividade) é:

M’T � � �0,1060

C � � 1,0476

V � � �0,9609

– e ln(limites de confiança) são:

1,0476 � 0,1060 � �0�,0�4�7�6� �� (�1�,0�4�7�6� �� 0�,1�0�6�0�2�� 2� �� 0�,9�6�0�9�)�� 0,1110 � 0,3034

Tomando os antilogaritmos encontramos a relação deactividade de 1,11 com os limites de confiança para 95 porcento entre 0,82 e 1,51.

Multiplicando pela actividade assumida da amostra T conduza uma actividade de 1,11 unidades/mg com os limites deconfiança para 95 por cento entre 0,82 e ,.51 unidades/mg.

5.1.2. DESENHO DE QUADRADO LATINO COM 3 DOSES

Ensaio de difusão de um antibiótico usando um tabuleirorectangular

O padrão tem uma actividade atribuída de 4855 UI/mg. Aamostra tem uma actividade assumida de 5600 UI/mg. Paraas soluções de armazenamento dissolva 25,2 mg de padrãoem 24,5 ml de solvente, e 21,4 mg de amostra em 23,95 mlde solvente. As soluções finais são preparadas diluindoinicialmente as soluções de armazenamento a 1/20 e deseguida usando uma razão de diluição de 1,5.

O quadrado latino é gerado com o método descrito na secção8.6 (ver tabela 5.1.2.-I). As respostas deste ensaio de rotina sãomostradas na tabela 5.1.2.-II (halos de inibição em mm � 10). Os valores médios dos tratamentos são mostrados na tabela 5.1.2.-III. A representação gráfica dos dados (verfigura 5.1.2.-I) não coloca dúvidas quanto à normalidade ehomogeneidade da variância dos dados.

66830,6��

(�58,970)2 � 2 � 10

66830,6��66830,6 � 738,64 � 2,0282

567,9�580,4��

2 � (�58,970)

20(�41,8 � 39,95)��

ln 4 � 10 � 2



5. Textos gerais

FIGURA 5.1.1.-I.

TABELA 5.1.1.-II – Análise de variância

Amostas 2 6256,6 3128,3

Regressão 1 63830,8 63830,8 83,38 0,000

Não paralelismo 2 8218,2 4109,1 5,37 0,007

Tratamentos 5 78305,7

Erro residual 54 41340,9 765,57

Total 59 119646,6

Origem da variação

Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

A análise confirma a existência de uma regressão linearaltamente significativa. O desvio ao paralelismo, no entanto,é também significativo (p = 0,0075) o que era esperado daobservação do gráfico onde a amostra U não é paralela aopadrão. Esta amostra é por isso rejeitada e a análise repetidausando apenas a amostra T e o padrão.

TABELA 5.1.1.-III – Análise de variância sem a amostra U

Amostras 1 390,6 390,6

Regressão 1 66830,6 66830,6 90,5 0,000

Não lineariadade 1 34,2 34,2 0,05 0,831


Erro residual 36 26587,3 738,54

Total 39 93842,8


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

Res

post

a in

stru

men

tal y

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 556

As fórmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aosresultados:

PS � 529,667 LS � 35,833

PT � 526,333 LT � 39,333

HP � 6/3 � 2 HL � � 3

A análise de variância pode agora ser completada com asfórmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.2.-IVapresenta os resultados

72�24



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 5.1.2.-I – Distribuição dos tratamentos na placa

1 2 3 4 5 6

1 S1 T1 T2 S3 S2 T3

2 T1 T3 S1 S2 T2 S3

3 T2 S3 S2 S1 T3 T1

4 S3 S2 T3 T1 S1 T2

5 S2 T2 S3 T3 T1 S1

6 T3 S1 T1 T2 S3 S2

FIGURA 5.1.2.-I.

TABELA 5.1.2.-II – Medidas das zonas de inibição (mm � 10)

1 2 3 4 5 6 média de linha

1 161 160 178 187 171 194 175,2 � R1

2 151 192 150 172 170 192 171,2 � R2

3 162 195 174 161 193 151 172,7 � R3

4 194 184 199 160 163 171 178,5 � R4

5 176 181 201 202 154 151 177,5 � R5

6 193 166 161 186 198 182 181,0 � R6

média de 172,8 179,7 177,2 178,0 174,8 173,5

coluna � C1 � C2 � C3 � C4 � C5 � C6

TABELA 5.1.2.-III – Média dos tratamentos

Padrão S Amostra T

S1 S2 S3 T1 T2 T3

média 158,67 176,50 194,50 156,17 174,67 195,50

TABELA 5.1.2.-IV – Análise de variância

Amostas 1 11,1111 11,1111

Regressão 1 8475,0417 8475,0417 408,1 0,000

Não paralelismo 1 18,3750 18,3750 0,885 0,358


Tratamentos 5 8510

Blocos 5 412 82,40 3,968 0,012

Colunas 5 218,6667 43,73 2,106 0,107

Erro residual 20 415,3333 20,7667

Total 35 9556


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

A análise mostra diferenças significativas entre as linhas.Isto indica o aumento de precisão adquirido pela utilizaçãodesenho do quadrado latino em vez de um desenho comple-tamente aleatório. Uma regressão altamente significativa euma origem sem significância das linhas individuais daregressão para o paralelismo e linearidade confirmam que oensaio satisfaz as actividades calculadas.

As fórmulas na secção 3.2.5 dão:

– para o declive comum:

b � � 46,346

– o ln(actividade) é:

M’T � � �0,02397

C � � 1,0108

V � � 0,2192

– e ln(limites de confiança) são:

1,0108 � (�0,0240) �

�0�,0�1�0�8� �� (�1�,0�1�0�8� �� (��0�,0�2�4�0�)2� �� 2� �� 0�,2�1�9�2�)�� 0,02423 � 0,06878

A relação de actividade é encontrada tomando os antiloga-ritmos, resultando em 0,9763 com os limites de confiançapara 95 por cento de 0,9112 a 1,0456.

8475,0417��

46,3462 � 3 � 6

8475,0417��

8475,0417 � 20,7667 � 2,0862

526,333�529,667��

3 � (46,346)

3 (35,833 � 39,333��

ln 1,5 � 6 � 2

Zon

a de

inib

ição

(nm

x 1

0)

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 557

É necessário aplicar o factor de correcção de

� 0,00700 porque as soluções não

exactamente equivalentes com base na sua actividade assumida. Multiplicando por este factor a potência assumidade 5 600 UI/mg obtém-se a potência de 5 456 UI/mg comlimites de confiança para 95 por cento entre 5 092 e 5 843 UI/mg.

5.1.3. DESENHO DE UM BLOCO ALEATÓRIO DE 4 DOSES

Titulação de um antibiótico por turbidimetria

O objectivo desta titulação é a atribuição de uma actividadeem unidades internacionais por ampola. A actividadeatribuída do padrão é de 670 UI/ml, a actividade assumida daamostra é de 20 000 UI/ampola. Com base nestes dados, sãopreparadas as soluções-mãe como se segue: dissolver 16,7mg do padrão em 25 ml de solvente, e o conteúdo de umaampola da amostra em 40 ml de solvente. As soluções finaissão obtidas através de uma primeira diluição a 1/40 das 2soluções-mãe, seguidas de uma série de diluições na razãode 1,5. Os tubos são colocados em banho de água segundouma repartição em blocos completos (ver secção 8.5). Asrespostas obtidas são registadas na tabela 5.1.3.-I.

A análise da figura 5.1.3.-I não põe em dúvida a validação dashipóteses da normalidade dos dados e da homogeneidade davariância. O desvio padrão de S3 é um pouco elevado massem apresente razões para preocupação. A aplicação dasfórmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduz aos seguintesresultados:

PS � 719,4 LS � �229,1

PT � 687,6 LT � �222

HP � 5/4 � 1,25 HL � � 1

A análise de variância é efectuada com a ajuda das fórmulasapresentadas nas tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultadosobtidos são apresentados na tabela 5.1.3.-II.

60�60

4855 � 25,2/24,5 ��

5600 � 21,4 / 23,93

Existe uma diferença significativa entre os blocos, o que demonstra que um ensaio de blocos completos permite obter uma fidelidade superior. O carácter altamente significativoda regressão e a ausência de desvios de paralelismo e delinearidade significativos confirmam que a titulação permitecalcular as actividades. As fórmulas da secção 3.2.5 dão:

– para o declive comum

b � � �111,255

– para ln(relação de actividade):

M’T � � 0,071457

C � � 1,00223

V � � 0,4110

– e para o ln(limites de confiança):

1,00223 � 0,0715 �

�0�,0�0�2�2�3� �� 1�,0�0�2�2�3� �� 0�,0�7�1�5�2�� 2� �� 0�,4�1�1�0�)�� 0,07162 � 0,04293

101745,6��(�111,255)2 � 4 � 5

101745,6��101745,6 � 53,916 � 2,0482

687,6 � 719,4��

4 � (�111,255)

1 � (�229,1 � 222)��

ln (1,5) � 5 � 2



5. Textos gerais

TABELA 5.1.3.-I – Absorvência das suspensões ( � 1000)

Padrão S Amostra T

Bloco S1 S2 S3 S4 T1 T2 T3 T4 Média

1 252 207 168 113 242 206 146 115 181,1

2 249 201 187 107 236 197 153 102 179,0

3 247 193 162 111 246 197 148 104 176,0

4 250 207 155 108 231 191 159 106 175,9

5 235 207 140 98 232 186 146 95 167,4

média 246,6 203,0 162,4 107,4 237,4 195,4 150,4 104,4

FIGURA 5.1.3.-I.


Amostas 1 632,025 632,025

Regressão 1 101745,6 101745,6 1887,1 0,000

Não paralelismo 1 25,205 25,205 0,467 0,500


Tratamentos 7 102662

Linhas 4 876,75 219,188 4,065 0,010

Erro residual 28 1509,65 53,916

Total 39 105048,4


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

Abs

orvê

ncia

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 558

Tomando o antilogaritmo destes últimos valores, obtemosuma relação de actividade de 1,0741 com um intervalo deconfiança para 95 por cento de 1,0291 a 1,1214. A aplicação

de um factor de correcção de � 0,89512

é necessária porque, tendo em conta a actividade prevista da amostra, as doses utilizadas não são exactamente equiva-lentes. Multiplicando a relação de actividade por este factor de correcção e pela actividade assumida de 20 000 UI/ampola, obtemos uma actividade estimada de 19 228 UI/ampola, comum intervalo de confiança para 95 por cento de 18 423 a 20 075 UI/ampola.

5.1.4. ENSAIO MÚLTIPLO DE 5 DOSES COMPLETAMENTEALEATÓRIAS

Titulação in vitro de 3 vacinas da hepatite B porcomparação com um padrão

Três séries independentes de 5 diluições a 0,5 são preparadasa partir de cada vacina. Após alguns passos adicionaisinerentes ao ensaio, a absorvência foi medida. Os resultadosobtidos são apresentados na tabela 5.1.4.-I.

670 � 6,7 / 25��

20000 � 1 / 40

A aplicação das fórmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-IIconduz aos seguintes resultados:

PS � 9,108 LS � 6,109

PT � �5,586 LT � 6,264

PU � 6,544 LU � 6,431

PV � 6,027 LV � 6,384

HP � � 0,6 HL � � 0,3

A análise de variância é completada com as fórmulas dastabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados obtidos sãoapresentados na tabela 5.1.4.-III.

36�120

3�5



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 5.1.4.-I – Absorvência

TABELA 5.1.4.-II – Média das transformadas logarítmicas de absorvência

Diluição Padrão S Amostra T

1:16000 0,043 0,045 0,051 0,097 0,097 0,094

1:8000 0,093 0,099 0,082 0,167 0,157 0,178

1:4000 0,159 0,154 0,166 0,327 0,355 0,345

1:2000 0,283 0,295 0,362 0,501 0,665 0,576

1:1000 0,514 0,531 0,545 1,140 1,386 1,051

Diluição Padrão U Amostra V

1:16000 0,086 0,071 0,073 0,082 0,082 0,086

1:8000 0,127 0,146 0,133 0,145 0,144 0,173

1:4000 0,277 0,268 0,269 0,318 0,306 0,316

1:2000 0,586 0,489 0,546 0,552 0,551 0,624

1:1000 0,957 0,866 1,045 1,037 1,039 1,068

Os logaritmos da densidade óptica têm uma relação linearcom os logaritmos das doses. As médias das transformadaslogarítmicas dos valores da densidade óptica sãoapresentadas na tabela 5.1.4.-II. A representação gráfica dosdados não demonstra nenhuma anomalia.

S1 � 3,075 T1 �2,344 U1 �2,572 V1 �2,485

S2 � 2,396 T2 �1,789 U2 �2,002 V2 �1,874

S3 � 1,835 T3 �1,073 U3 �1,305 V3 �1,161

S4 � 1,166 T4 0,550 U4 0,618 V4 0,554

S5 � 0,635 T5 0,169 U5 �0,048 V5 0,047

FIGURA 5.1.4.-I.

TABELA 5.1.4.-III – Análise de variância

Amostas 3 4,475 1,492

Regressão 1 47,58 47,58 7126 0,000

Não paralelismo 3 0,0187 0,006 0,933 0,434



Erro residual 40 0,267 0,0067

Total 59 52,42


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

Uma regressão altamente significativa e a ausência de desvios do paralelismo e de linearidade confirmam que a actividade pode ser calculada com segurança. As fórmulas da secção 3.2.5 dão:


b � � 0,908481 � 0,3 � (6,109 � 6,264 � 6,431 � 6,384)

��ln 2 � 3 � 4

In A

bsor

vênc

ia

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 559

– para ln(relação de actividade) da amostra T:

M’T � � 0,7752

C � � 1,00057

V � � 3,8436

– e para o ln(limites de confiança) da amostra T:

1,00057 � 0,7752 �

�0�,0�0�0�5�7� �� (�1�,0�0�0�5�7� �� 0�,7�7�5�2�2�� 2� �� 3�,8�4�3�6�)�� 0,7756 � 0,0689

Tomando o antilogaritmo destes últimos valores, obtemosuma relação de actividade de 2,171 com um intervalo deconfiança para 95 por cento de 2,027 a 2,327.

Como todas as preparações têm uma actividade assumida de20 µg de proteína por mililitro, o cálculo dá para a mostra Tuma actividade de 43,3 µg de proteína por mililitro com umintervalo de confiança para 95 por cento de 40,5 a 46,5 µg deproteína por mililitro.

O mesmo procedimento é usado para calcular a actividadedas outras amostras e dos intervalos de confiança associados.Os resultados obtidos são apresentados na tabela 5.1.4.-IV.

47,58��0,90852 � 5 � 3

47,68��47,58 � 0,0067 � 2,0212

�5,586 � (�9,108)��

5 � 0,90848

A análise de variância é mais complicada neste ensaio do quenos outros porque, na soma dos quadrados, a componentedevida ao paralelismo não é independente da devida àsdiferenças entre animais. Para verificar o paralelismo dasrectas de regressão, é necessário calcular um segundo termode erro obtido subtraindo a componente do paralelismo eduas componentes de interacção à componente devida àsdiferenças entre animais.

A análise de variância usa 3 componentes de interacção resul-tantes da repetição dos tratamentos no interior de cada grupo:

dias � preparação; dias � regressão; dias � paralelismo.

Estes termos reflectem a tendência que têm os factoresconsiderados (preparações, regressão e paralelismo) paravariar de dia para dia. Os rácio-F correspondentes permitemverificar a validade do ensaio neste aspecto. Se os valores deF são significativamente elevados, convém interpretar osresultados do ensaio com circunspecção e mesmo, sepossível, de o reiniciar.

A análise de variância é realizada aplicando as fórmulas dastabelas 3.2.3.-I a 3.2.3.-III separadamente para cada um dos2 dias e ao conjunto de todos os dados. As fórmulas dastabelas 3.2.3.I e 3.2.3.-II dão:



5. Textos gerais

TABELA 5.1.4.-IV – Cálculos finais da actividade das vacinas a examinar e limites de confiança para 95 por cento

(em µg de proteína por mililitro)

Limite inferior Estimativa Limite superior

Vacina T 40,5 43,4 46,5

Vacina U 32,9 35,2 37,6

Vacina V 36,8 39,4 42,2

5.1.5. DUPLO ENSAIO CRUZADO

Titulação de insulina por injecção subcutânea em coelhos

O padrão é administrado a 1 unidade e 2 unidades pormililitro. A amostra é administrada em doses equivalentesdeterminadas com base na actividade assumida do produtoque é de 40 unidades por mililitro. Cada animal recebe porvia subcutânea 0,5 ml das soluções apropriadas, de acordocom o plano representado na tabela 5.1.5.-I. As respostasobtidas são apresentadas na tabela 5.1.5.-II. A grandevariância constatada reflecte a variabilidade dos resultadosentre os animais e mostra a utilidade de aplicar um ensaiocruzado.

TABELA 5.1.5.-I – Ordem dos tratamentos

Grupo de coelhos

1 2 3 4

dia 1 S1 S2 T1 T2

dia 2 T2 T1 S2 S1

FIGURA 5.1.5.-I.

TABELA 5.1.5.-II – Resposta y: soma dos valores da glicémia(mg/100ml) após 1 hora e 2,5 horas

grupo 1 grupo 2 grupo 3 grupo 4

S1 T2 S2 T1 T1 S2 T2 S1

112 104 65 72 105 91 118 144

126 112 116 160 83 67 119 149

62 58 73 72 125 67 42 51

86 63 47 93 56 45 64 107

52 53 88 113 92 84 93 117

110 113 63 71 101 56 73 128

116 91 50 65 66 55 39 87

101 68 55 100 91 68 31 71

média 95,6 82,8 69,6 93,3 89,9 66,6 72,4 106,8

Res

post

a (m

g /

100

ml)

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 560

Dia 1 PS �165,25 LS � 13

PT �162,25 LT � �8,75

HP � � 4 HL � � 16

Dia 2 PS �173,38 LS � 20,06

PT �176,99 LT � �5,25

HP � � 4 HL � � 16

conjunto PS �169,31 LS � 16,53

PT �169,13 LT � 7,00

HP � � 8 HL � � 32

e as fórmulas da tabela 3.2.3.-III permitem calcular:

192�

616�

2

96�6

8�2

96�6

8�2

As fórmulas da secção 3.2.5. dão:


b � � �33,95


M’T � � 0,00276

C � � 1,0695

V � � 0,2402

– e para o ln(limites de confiança):

1,0695 � 0,00276 � �0�,0�6�9�5� �� (�1�,0�6�9�5� �� 0�,0�0�2�7�6�2�� 2� �� 0�,2�4�0�2�)�� 0,00295 � 0,18279

Tomando o antilogaritmo destes últimos valores, obtemosuma relação de actividade de 1,003 com um intervalo deconfiança para 95 por cento de 0,835 a 1,204. Estes resulta-dos multiplicados por AT = 40 dão uma actividade de 40,1unidades por mililitro com um intervalo de confiança para95 por cento de 33,4 a 48,2 unidades por mililitro.

5.2. MODELO DE RELAÇÃO DE DECLIVES

5.2.1. DESENHO COMPLETAMENTE ALEATÓRIO (0,3,3)

Ensaio do factor VIII

Um laboratório desenvolve um ensaio colorimétrico dofactor VIII em soluções concentradas. O laboratório não temexperiência deste tipo de titulações mas tenta torná-looperacional. São preparadas 3 diluições equivalentes para opadrão e para a amostra. É igualmente preparado um brancoembora não seja esperada uma relação dose-resposta linearpara as doses mais baixas. Cada diluição é observada com 8réplicas, um número superior ao que será utilizado nosensaios de rotina.

A representação gráfica dos dados mostra claramente que arelação dose-resposta efectivamente não é linear para asdoses baixas. As respostas obtidas para o branco não sãousadas nos cálculos (são necessários novos ensaios parajustificar esta decisão). As fórmulas das tabelas 3.3.3.2.-I e3.3.3.1-II dão:

PS = 0,6524 PT = 0,5651

LS = 1,4693 LT = 1,2656

aS = 0,318 aT = 0,318

bS = 0,329 bT = 0,271

GS = 0,1554 GT = 0,1156

JS = 4,17 10-8 JT = 2,84 10-6

e

HI = 0,09524 a’= 0,05298 K = 1,9764

E a análise de variância é realizada com a ajuda das fórmulasdas tabelas 3.3.3.1.-III e 3.3.3.1.-IV.

A existência de uma regressão muitíssimo significativa e aausência de desvio da linearidade e intersecção indicam quea actividade pode ser calculada.

8859,5��

(-33,95)2 � 2 � 16

8859,5��8859,5 � 137,3 � 2,0482

169,13 � 169,31��

2 � (�33,95)

32 � (�16,53 � 7)��

ln 2 � 16 � 2



5. T

exto

s ge

rais

Dia 1 Dia 2 Conjunto

SSprep � 18,000 SSprep � 13,781 SSprep � 0,141

SSreg � 3784,5 SSreg � 5125,8 SSreg � 8859,5

SSpar � 144,5 SSpar � 1755,2 SSpar � 1453,5

Os termos da interacção obtêm-se pela operação: dia 1 � dia 2 – conjunto:

SSdias � prep � 31,64

SSdias � reg � 50,77

SSdias � par � 446,27

Calcula-se também a soma dos quadrados devidos àvariabilidade diária:

SSdias � N (D21 � D2

2) � K � 478,52

e a soma dos quadrados devidos aos blocos (variabilidadeentre animais):

SSblocos � 2 � B2i � K � 39794,7

onde Bi é a resposta média por animal.

A análise de variância pode ser completada conformedescrito na tabela 5.1.5.-III.

1�2

TABELA 5.1.5.-III – Análise de variância

Não paralelismo 1 1453,5 1453,5 1,064 0,311

Dias � amostra 1 31,6 31,6 0,023 0,880

Dias � reg. 1 50,8 50,8 0,037 0,849

Erro residual entre coelhos 28 38258,8 1366,4

Coelhos 31 39794,7 1283,7

Amostras 1 0,14 0,14 0,001 0,975

Regressão 1 8859,5 8859,5 64,532 0,000

Dias 1 478,5 478,5 3,485 0,072

Dias � não para 1 446,3 446,3 3,251 0,082

Erro residual inter-coelhos 28 3844,1 137,3

Total 63 53423,2


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 561

Declive da curva do padrão:

b’s � � 0,0822

Declive da curva da amostra

b’r � � 0,0677

A aplicação da fórmula 3.3.5.1.-3 dá:

R � � 0,823

C � � 1,000083

K � 0,000083 � 0,75 � 0,000062

e os limites de confiança para 95 por cento são:

0,823 � �0�,0�0�0�0�8�3� �� 1�,6�7�8� �� 0�,0�0�0�0�6�2� �� (��1�,6�4�6�)�� 0,823 � 0,006

A relação de actividade estimada é de 0,823 com umintervalo de confiança para 95 por cento entre 0,817 e 0,829.

0,08222��

0,08222 � 3,86 10�6 � 2,1882 � 0,0357

0,0677��

0,0822

6 � 1,266 � 36 � 0,0530��

84

6 � 1,469 � 36 � 0,0530��

84

5.2.2. ENSAIO TOTALMENTE ALEATÓRIO (0,4,4,4)

Ensaio in vitro de vacinas da gripe

O teor em antigéneo da hemaglutinina (AH) de 2 vacinasgripais é determinado por imunodifusão radial simples. As 2vacinas possuem uma actividade declarada de 15 µg de AHpor dose, equivalente a um teor em AH de 30 µg/ml. O teorem AH atribuído ao padrão é de 39 µg/ml.

O padrão e as vacinas a titular são examinadas em 4concentrações, preparadas em duplicado com base nosrespectivos teores (atribuído ou declarado). Quando é obtidoo equilíbrio entre o reagente interno e o reagente externo,mede-se a superfície da zona anular da preparação. Osresultados obtidos são apresentados na tabela 5.2.2.-I.

A representação gráfica dos dados não apresenta nenhumaspecto fora do habitual. A aplicação das fórmulas dastabelas 3.3.3.1.-I e 3.3.3.1-II dão:

PS = 108,2 PT = 103,85 PU = 85,8

LS = 301,0 LT = 292,1 LU = 234,1

aS = 141,0 aT = 116,7 aU = 139,8

bS = 61,2 bT = 64,95 bU = 39,2

GS = 3114,3 GT = 2909,4 GU = 1917,3

JS = 0,223 JT = 2,227 JU = 0,083

e

HI = 0,0093 a’ = 11,04 K = 14785,8

E a análise de variância é realizada com a ajuda das fórmulasdas tabelas 3.3.3.1.III e 3.3.3.1.-IV. Os resultados obtidos sãoapresentados na tabela 5.2.2.-II.

A existência de uma regressão muitíssimo significativa e aausência de desvio da linearidade e intersecção indicam quea actividade pode ser calculada.

Declive da curva do padrão:

b’s � � 6,356

Declive da curva da vacina T:

b’r � � 6,056

Declive da curva da vacina U:

b’U � � 4,1236 � 234,1 � 60 � 11,04

��180

6 � 292,1 � 60 � 11,04��

180

6 � 301,1 � 60 � 11,04��

180



5. Textos gerais

TABELA 5.2.1.-I – Absorvências

branco padrão S (em UI/ml) amostra T (em UI/ml)

Conc. B S1 S2 S3 T1 T2 T3

0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03

0,022 0,133 0,215 0,299 0,120 0,188 0,254

0,024 0,133 0,215 0,299 0,119 0,188 0,253

0,024 0,131 0,216 0,299 0,118 0,190 0,255

0,026 0,136 0,218 0,297 0,120 0,190 0,258

0,023 0,137 0,220 0,297 0,120 0,190 0,257

0,022 0,136 0,220 0,305 0,121 0,191 0,257

0,022 0,138 0,219 0,299 0,121 0,191 0,255

0,023 0,137 0,218 0,302 0,121 0,190 0,254

média 0,0235 0,1351 0,2176 0,2996 0,1200 0,1898 0,2554

FIGURA 5.2.1.-I.


Regressão 2 0,1917 0,0958 24850 0,000

Intersecção 1 3.10�9 3.10�9 7.10�4 0,978

Não linear 2 2.10�5 1.10�5 2,984 0,061


Erro residual 42 1,62.10�4 3,86.10�6

Total 47 0,1919


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

Abs

orvê

ncia

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 562

A relação de actividade estimada é de 6,056/6,356 = 0.953para a vacina T e de 4,123/6,356 = 0,649 para a vacina U.

C � �1,0056

K’ � 0,0056 � 0,625 � 0,0035

Os limites de confiança são dados pela fórmula 3.3.5.1.-4.

Para a vacina T:

0,955 � �0�,0�0�5�6� �� 1�,9�1�3� �� 0�,0�0�3�5� �� (��1�,9�1�3�)� � 0,955 � 0,063

Para a vacina U:

0,649 � �0�,0�0�5�6� �� 1�,4�2�3� �� 0�,0�0�3�5� �� (��1�,3�0�1�)� � 0,649 � 0,058

O teor em AH, expresso em µg/ml, é calculado multiplicandoas relações de actividade e os limites de confiança pela acti-vidade assumida (30 µg/ml). Os resultados obtidos figuramna tabela 5.2.2.-III.

6,3562��

6,3562 � 1,068 � 2,1792 � 0,0444

5.3. RESPOSTAS QUALITATIVAS

5.3.1. TITULAÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO RELATIVAMENTEA UM PADRÃO PELO MÉTODO DA PROPABILIDADEITERACTIVA (PROBIT)

Ensaio in vivo de uma vacina diftérica

Uma vacina diftérica, com a actividade assumida de 140UI/ampola, é titulada por comparação com um padrão com aactividade atribuída de 132 UI/ampola. Com bases nestasactividades, preparam-se doses equivalentes destas prepara-ções, que são administradas de modo aleatório a um grupode cobaios. Após determinado intervalo de tempo, os animaissão submetidos a uma prova de virulência através da toxinadiftérica. Os resultados obtidos, expressos em número deanimais sobreviventes, são apresentados na tabela 5.3.1.-I.

Os valores são transpostos para a primeira tabela detrabalho, onde são calculadas as colunas seguintes comodescrito na secção 4.2.1. A tabela 5.3.1.-II representa oprimeiro ciclo de cálculo.



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 5.2.2.-I – Superfície de precipitação (mm2)

Padrão S Amostra T Amostra T

I II I II I II

7,5 18,0 18,0 15,1 16,8 15,4 15,7

15,0 22,8 24,5 23,1 24,2 20,2 18,6

22,5 30,4 30,4 28,9 27,4 24,2 23,1

30,0 35,7 36,6 34,4 37,8 27,4 27,0

Conc.(µg/ml)

FIGURA 5.2.2.-I.


Regressão 3 1087,7 362,6 339,5 0,000

Intersecção 2 3,474 1,737 1,626 0,237

Não linear 6 5,066 0,844 0,791 0,594


Erro residual 12 12,815 1,068

Total 23 1109,0


Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadradomédio

Rácio F

Probabilidade

TABELA 5.2.2.-III – Estimativa da quantidade de AH (µg/dose)

Limite inferior Estimativa Limite superior

Vacina T 13,4 14,3 15,3

Vacina U 8,9 9,7 10,6

TABELA 5.3.1.-I – Dados brutos do ensaio em cobaios da vacina diftérica

1,0 12 0 1,0 11 0

1,6 12 3 1,6 12 4

2,5 12 6 2,5 11 8

4,0 11 10 4,0 11 10

Padrão (S) actividade atribuída

132 UI/ampola

dose(UI/ml)

submetidosa prova

protegidosdose

(UI/ml)submetidos

a provaprotegidos

Amostra (T) actividade assumida

140 UI/ampola

FIGURA 5.3.1.-I.

Sup

erfíc

ie d

a zo

na a

nela

r

Pro

babi

lidad

e

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 563

A soma das 6 últimas colunas desta tabela é realizada deseguida para cada uma das preparações, e os resultados sãotransportados para a segunda tabela de trabalho (ver tabela5.3.1.-III), onde as outras colunas são calculadas com aajuda das fórmulas 4.2.1.-4 a 4.2.1.-10. O declive comum bresultante é de 1,655.

De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y naprimeira tabela de trabalho, e de seguida efectua-se osegundo ciclo de cálculo (tabela 5.3.1.-IV).

Procede-se assim por ciclos de cálculos iteractivos até àobtenção de uma diferença mínima entre 2 ciclosconsecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-seentão sob a forma indicada na tabela 5.3.1.-V.

O teste de linearidade é feito conforme descrito na secção4.2.2. O valor de χ2 com 4 graus de liberdade é de 0,851 � 1,070 � 1,921, ou seja, um valor de p de 0,750 oque não é significativo.

Uma vez que não há desvio significativo da linearidade, oteste de paralelismo pode ser efectuado como descrito namesma secção. O valor de χ2 com 1 grau de liberdade é de

(16,71 � 17,27) � � 0,001, ou seja um valor de p

de 0,974 o que não é significativo.

Procedendo como indicado na secção 4.2.3, obtemos asseguintes estimativas:


M’T � � 0,137

C � � 1,127

V � � � 0,1101

�17,96

1�18,37

2,4012 � 5,893��

2,4012 � 5,893 � 12 � 1,9602

�1,721 � (�2,050)��

2,401

14,152��

5,89



5. Textos gerais

Vacina Dose n r x p Y ΦΦ Z y w wx wy wx2 wy2 wxy

S 1,0 12 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 �1,253 7,64 0,00 �9,57 0,00 12,00 0,00

1,6 12 3 0,470 0,250 0 0,5 0,399 �0,627 7,64 3,59 �4,79 1,69 3,00 �2,25

2,5 12 6 0,916 0,500 0 0,5 0,399 0,000 7,64 7,00 0,00 6,41 0,00 0,00

4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95

T 1,0 11 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 �1,253 7,00 0,00 �8,78 0,00 11,0 0,00

1,6 12 4 0,470 0,333 0 0,5 0,399 �0,418 7,64 3,59 �3,19 1,69 1,33 �1,50

2,5 11 8 0,916 0,727 0 0,5 0,399 0,570 7,00 6,42 3,99 5,88 2,27 3,66

4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95

TABELA 5.3.1.-II. – Primeira tabela de trabalho no primeiro ciclo

vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy2 Sxx Sxy Syy x� y� a

S 29,92 20,30 �7,18 21,56 22,36 7,70 7,79 12,58 20,64 0,68 �0,24 �1,36

T 28,65 19,72 �0,80 21,03 21,97 12,11 7,46 12,66 21,95 0,69 �0,03 �1,17

TABELA 5.3.1.-III. – Segunda tabela de trabalho no primeiro ciclo


S 1,0 12 0 0,000 0,000 �1,36 0,086 0,158 �1,911 3,77 0,00 �7,21 0,00 13,79 0,00

1,6 12 3 0,470 0,250 �0,58 0,279 0,336 �0,672 6,74 3,17 �4,53 1,49 3,04 �2,13

2,5 12 6 0,916 0,500 0,15 0,561 0,394 �0,001 7,57 6,94 �0,01 6,36 0,00 �0,01

4,0 11 10 1,386 0,909 0,93 0,824 0,258 1,260 5,07 7,03 6,39 9,75 8,05 8,86

T 1,0 11 0 0,000 0,000 �1,17 0,122 0,202 �1,769 4,20 0,00 �7,43 0,00 13,14 0,00

1,6 12 4 0,470 0,333 �0,39 0,349 0,370 �0,430 7,23 3,40 �3,11 1,60 1,34 �1,46

2,5 11 8 0,916 0,727 0,35 0,637 0,375 0,591 6,70 6,14 3,96 5,62 2,34 3,63

4,0 11 10 1,386 0,909 1,13 0,870 0,211 1,311 4,35 6,03 5,70 8,36 7,48 7,90

TABELA 5.3.1.-IV. – Primeira tabela de trabalho no segundo ciclo

vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy Sxx Sxy Syy x� y� a

S 18,37 14,80 �2,14 14,85 17,81 5,28 2,93 7,00 17,56 0,81 �0,12 �2,05

T 17,96 12,64 �0,55 11,86 18,35 6,76 2,96 7,15 18,34 0,70 �0,03 �1,72

TABELA 5.3.1.-V. – Segunda tabela de trabalho depois do último ciclo

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 564

– e para ln(limites de confiança):

0,155 � 0,013 � �0�,1�2�7� (�0�,6�4�9� �� 1�,1�2�7� �� 0�,0�3�6�2)�� 0,142 � 0,288

A actividade e os limites de confiança podem agora serobtidos multiplicando os antilogaritmos pela actividadeassumida (149 UI/ampola). A estimativa assim obtida é de160,6 UI/ampola com um intervalo de confiança para 95 porcento entre 121,0 e 215,2 UI/ampola.

5.3.2. MÉTODO LOGIT E OUTROS MÉTODOS DE ANÁLISEDA TITULAÇÃO DE UMA AMOSTRA RELATIVAMENTE A UMPADRÃO

Os resultados serão fornecidos para a situação onde ométodo logit e outros métodos «clássicos» desta famíliasão aplicados para os dados da secção 5.3.1. Este exemplodeve ser considerado como um exercício ilustrativo, e nãocomo uma alternativa ao método da probabilidade iteractiva (probit) no caso particular. Só poderá serutilizada outra função com base em justificaçõesexperimentais ou teóricas.

5.3.3. DETERMINAÇÃO DA DE50 DE UMA SUBSTÂNCIAPELO MÉTODO DA PROBABILIDADE ITERACTIVA (PROBIT)

Ensaio in vitro de uma vacina oral da poliomielite

A titulação de uma vacina oral da poliomielite é efectuada pela determinação de DE50 em placas ELISA com 10 diluições diferentes e 8 réplicas de 50 µl. Os resultados obtidos sãoapresentados na tabela 5.3.3.-I.



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 5.3.2.-I – Resultados obtidos com diferentes análises de funções

Logit Gompit Ângulo(*)

Φ 1 � e�eY

sin Y �

Z eY�eY

cos Y

Declive b 4,101 2,590 1,717

�2 lin 2,15 3,56 1,50

�2 par. 0,0066 0,168 0,0010

Actividade 162,9 158,3 155,8

Limite inf. 121,1 118,7 122,6

Limite sup. 221,1 213,3 200,7

se Y � � � então Φ = 0 e Z = 0

(*)

se Y � � � então Φ = 1 e Z = 01�2

1�2

1�2

e�Y��(1 � e�Y )2

1�2

1�2

1�1 � e�Y


T 10�3,5 8 0 �8,06 0,000 0,00 0,5 0,399 �1,253 5,09 �41,04 �6,38 330,8 8,00 51,4

10�4,0 8 0 �9,21 0,000 0,00 0,5 0,399 �1,253 5,09 �46,91 �6,38 432,0 8,00 58,8

10�4,5 8 1 �10,36 0,125 0,00 0,5 0,399 �0,940 5,09 �52,77 �4,79 546,8 4,50 49,6

10�5,0 8 2 �11,51 0,250 0,00 0,5 0,399 �0,627 5,09 �58,63 �3,19 675,1 2,00 36,7

10�5,5 8 6 �12,66 0,750 0,00 0,5 0,399 0,627 5,09 �64,50 3,19 816,8 2,00 �40,4

10�6,0 8 7 �13,82 0,875 0,00 0,5 0,399 0,940 5,09 �70,36 4,79 972,1 4,50 �66,1

10�6,5 8 7 �14,97 0,875 0,00 0,5 0,399 0,940 5,09 �76,23 4,79 1140,8 4,50 �71,7

10�7,0 8 8 �16,12 1,000 0,00 0,5 0,399 1,253 5,09 �82,09 6,38 1323,1 8,00 �102,9

10�7,5 8 8 �17,27 1,000 0,00 0,5 0,399 1,253 5,09 �87,95 6,38 1518,9 8,00 �110,2

10�8,0 8 8 �18,42 1,000 0,00 0,5 0,399 1,253 5,09 �93,82 6,38 1728,2 8,00 �117,6

TABELA 5.3.3.-II. – Primeira tabela de trabalho do primeiro ciclo

TABELA 5.3.3.-I – Diluições (10x µl de vacina não diluída)

�3,5 �4,0 �4,5 �5,0 �5,5 �6,0 �6,5 �7,0 �7,5 �8,0

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

FIGURA 5.3.3.-I.

Pro

babi

lidad

e

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 565

Estes valores são transpostos para a primeira tabela detrabalho, onde são calculadas as colunas seguintes comodescrito na secção 4.2.1. A tabela 5.3.3.-II representa oprimeiro ciclo deste método de cálculo.

A soma das 6 últimas colunas desta tabela é realizada deseguida e os resultados são transportados para a segundatabela de trabalho (ver tabela 5.3.3.-III), onde as outrascolunas são calculadas com a ajuda das fórmulas 4.2.1.-4 a4.2.1.-10. O declive comum b resultante é de -0,295.

De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y naprimeira tabela de trabalho, e de seguida efectua-se osegundo ciclo de cálculo. Procede-se assim por ciclos decálculos iteractivos até à obtenção de uma diferença mínimaentre 2 ciclos consecutivos. A segunda tabela de trabalhoapresenta-se então sob a forma indicada na tabela 5.3.3.-IV.

O teste de linearidade é feito conforme descrito na secção4.2.2. O valor de χ2 com 8 graus de liberdade é de 2,711, ouseja, um valor de p de 0,951 o que não é significativo.

Procedendo como indicado na secção 4.5, obtemos asseguintes estimativas:


M’T � � 0,137

C � � 1,197

V � � 0,052

– e para ln(limites de confiança):

�14,692 � (�2,420) � �0�,1�9�7� �� (�2�,8�8�2� �� 1�,1�9�7� �� 0�,0�0�9�2)�� 12,272 � 0,754

Esta estimativa é expressa em termos de ln(diluição).

Para converter esta expressão em ln(DE50)/ml é necessário

efectuar a transformação M’T � ln� �.

Como a actividade deste tipo de vacina é expresso em termosde log10(DE50)/ml, é necessário dividir os resultados porln(10). A actividade estimada assim obtida é igual a 6,63log10(DE50)/ml, com um intervalo de confiança para 95 porcento entre 6,30 e 6,96 log10(DE50)/ml.

1000�

50

1��19,39

(�0,646)2 � 55,883��(�0,646)2 � 55,883 � 12 � 1,9602

�1,721 � (�2,050)��

2,401

5.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS

5.4.1. ANÁLISE DE UMA CURVA LOGÍSTICA DE 4PARÂMETROS

Titulação serológica de imunosoros tetânicos

Como já foi previamente indicado na secção 3.4, esteexemplo tem por objectivo ilustrar um modo «possível» deanálise dos dados apresentados, mas não necessariamentereflectir o «único» modo de análise ou o «mais apropriado».Muitas outras aproximações estão descritas na literatura,mas elas não conduzem, na maior parte das situações, aresultados muito diferentes. Encontramos na secção 7.5uma breve discussão destas aproximações alternativas bemcomo de outras considerações estatísticas.



5. Textos gerais

vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy Sxx Sxy Syy x� y� a

T 50,93 �674,3 11,17 9484,6 57,50 �312,32 556,92 �164,43 55,05 �13,24 0,219 �3,690

TABELA 5.3.3.-III. – Segunda tabela de trabalho do segundo ciclo

vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy2 Sxx Sxy Syy x� y� a

T 19,39 �238,2 0,11 2981,1 26,05 �37,35 55,88 �36,11 26,05 �12,28 0,006 �7,931

TABELA 5.3.3.-IV. – Segunda tabela de trabalho do último ciclo

TABELA 5.4.1.-I – Respostas observadas

Padrão S Amostra T

Dil. Obs. 1 Obs. 2 Dil. Obs. 1 Obs. 2

1/10 2,912 2,917 1/10 3,017 2,987

1/20 2,579 2,654 1/20 2,801 2,808

1/40 2,130 2,212 1/40 2,401 2,450

1/80 1,651 1,638 1/80 1,918 1,963

1/160 1,073 0,973 1/160 1,364 1,299

1/320 0,585 0,666 1/320 0,861 0,854

1/640 0,463 0,356 1/640 0,497 0,496

1/1280 0,266 0,234 1/1280 0,340 0,344

1/2560 0,228 0,197 1/2560 0,242 0,217

1/5120 0,176 0,215 1/5120 0,178 0,125

Um imunosoro de cobaio é doseado por comparação comum imunosoro de referência (0,4 UI/ml) com uma técnicade imunoadsorção por enzima conjugado (ELISA) Aplicam--se 10 diluições a ? de cada preparação numa placa ELISAcom 96 pocilhos. Cada diluição é aplicada 2 vezes. Os resul-tados observados são apresentados na tabela 5.4.1.-I.

Para este exemplo assume-se que o laboratório validou ascondições 1 a 3 especificadas na secção 3.1.1, quando oensaio foi desenvolvido em condições de rotina. Para alémdisso, o laboratório validou também as condições de igual-dade do limite superior e do limite inferior das amostras.

A representação gráfica não demonstra aspectos anormais.Procede-se ao ajustamento dos parâmetros da função

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 566

logística pelo método dos mínimos quadrados, utilizandoum programa informático apropriado, supondo que ostermos de erro residual são variáveis aleatórias normaisindependentes e identicamente distribuídas. Neste caso sãonecessários 3 parâmetros (α, β e δ) para descrever o factorde declive comum e as assímptotas comuns inferior esuperior, mais 2 parâmetros complementares (γS e γT) paradescrever a posição horizontal das 2 curvas. O programafornece as estimativas para os diferentes parâmetros:

α = 3,196 γS = �4,307

β = 1,112 γT = �4684

δ = 0,145

Além disso, fornece para a variância residual s2 umaestimativa de 0,001429 com 20 graus de liberdade (variaçãointra-tratamentos).

Para obter os limites de confiança, e verificar o paralelismo ea linearidade, linearisam-se as respostas u observadas, antesde as submeter a uma análise de linhas paralelas ponderadaatravés do programa. Este procedimento é muitosemelhante ao descrito na secção 4.2 pelo método daprobabilidade iteractiva (probit), introduzindo-se asseguintes modificações:

Y = β (x � ) y � Y �� Φ

Z

Φ = w =

Z =

Obtém-se assim, uma análise de variância ponderada dasrespostas transformadas y com as ponderações w:

e�Y��(1 � e�Y)2

Z2 (� � �)2��

s21

�1 � e�Y

u � ��

uma actividade estimada de 1,459 � 0,4 � 0,584 UI/ml. Afórmula 4.2.3.-2 dá, para os limites de confiança para 95 porcento, os valores de 0,557 e 0,612 UI/ml.

6. COMBINAÇÃO DE RESULTADOS DE ENSAIOS

6.1. INTRODUÇÃO

Para satisfazer as exigências da Farmacopeia é muitas vezesnecessário realizar vários ensaios independentes e combinaros seus resultados. A questão coloca-se quanto à admissibi-lidade da combinação dos resultados dos ensaios, e em casoafirmativo, de que modo.

Dois ensaios podem ser considerados como independentesquando a execução de um deles não afecta as probabilidadesassociadas aos resultados dos outros. Isto implica que oconjunto dos erros aleatórios ligados aos principais factoresde influência de um dos ensaios (por exemplo, diluições dopadrão e da amostra, sensibilidade do indicador biológico)devem ser independentes dos erros aleatórios corresponden-tes ao outro ensaio. Os ensaios realizados em vários diasconsecutivos a partir de diluições do padrão preparadas nomesmo momento não são considerados ensaios independentes.

Existem vários métodos para combinar os resultados deensaios independentes, sendo o mais aceitável do ponto devista teórico o que apresenta maior dificuldade de aplicação. A seguir são descritos 3 métodos de aproximação simplificada; outros podem ser usados desde que as condições necessáriassejam satisfeitas.

Antes de combinar as actividades obtidas a partir dos ensaiosbaseados no modelo de linhas paralelas ou no modelo daprobabilidade iteractiva (probit) devem ser transformadosem logaritmos; pelo contrário, as actividades obtidas a partirde ensaios baseados no modelo de relação de declives sãoutilizadas tal qual. Como os 2 primeiros modelos são deutilização mais corrente que o da relação de declives, é osímbolo M (representando o logaritmo da actividade) que éusado nas fórmulas desta secção. Lendo R (relação dedeclive) em vez de M, o experimentador pode aplicar asmesmas fórmulas para calcular os resultados dos ensaiosbaseados no modelo de relação de declives. Antes de seremcombinados, todas as estimativas de actividade devem sercorrigidas relativamente à actividade atribuída parapreparação.

6.2. COMBINAÇÃO PONDERADA DE RESULTADOS DEENSAIOS

Este método pode ser utilizado se as seguintes condiçõesforem satisfeitas:

1) As estimativas de actividade resultam de ensaiosindependentes,

2) para cada ensaio, C está perto de 1 (digamos inferior a 1,1),

3) o número de graus de liberdade dos erros residuaisindividuais é superior ou igual a 6 e de preferênciasuperior a 15,

4) as estimativas individuais de actividade formam umasérie homogénea (ver secção 6.2.2).

Se as condições não forem satisfeitas, este método não podeser aplicado. O método descrito na secção 6.3 pode então ser



5. T

exto

s ge

rais

TABELA 5.4.1.-II. – Análise de variância ponderada

Amostras 1 0,529653 0,467

Regressão 1 6599,51 0,000

Não paralelismo 1 0,0458738 0,830

Não linearidade 16 8,89337 0,918


Erro residual 20 20,0000

Total 39 6628,98


graus deliberdade

Chi-quadrado Probabilidade

Não se observam desvios significativos de paralelismo e delinearidade; o método de doseamento é satisfatório para os cálculos da actividade. Se a condição de igualdade dasassímptotas superior e inferior não for satisfeita, é provávelque se observem desvios significativos de linearidade e/ouparalelismo, uma vez que os testes de paralelismo e delinearidade reflectem a justeza do ajustamento do modelo de 4 parâmetros na sua totalidade. O erro residual na análise de variância é sempre igual a 1 em resultado da transforma-ção. É, no entanto, possível calcular um factor de heteroge-neidade (análogo ao utilizado no método dos probits).

A actividade relativa da amostra pode ser obtida pelo cálculodo antilogaritmo de γS � γT. Multiplicando este valor pelaactividade atribuída da preparação de referência, obtemos

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 567

utilizado para obter a melhor estimativa da actividade média,podendo ser adoptado para os ensaios ulteriores comoactividade assumida.

6.2.1. CÁLCULO DOS FACTORES DE PONDERAÇÃO

É presumido que os resultados de cada um dos n’ ensaiosforam analisados para dar origem a n’ valores de M com oslimites de confiança associados. Para cada ensaio, o intervalode confiança logarítmico L é obtido por subtracção ao limitesuperior o inferior. O factor de ponderação W é calculadopara cada valor de M com a ajuda da fórmula 6.2.1.-1, onde ttoma o mesmo valor que o utilizado no cálculo dos limitesde confiança.

W � (6.2.1.-1.)

6.2.2. HOMOGENEIDADE DAS ESTIMATIVAS DEACTIVIDADE

Elevando ao quadrado o desvio de cada valor de Mrelativamente à média ponderada, e depois multiplicandocada um dos desvios pelo factor de ponderação apropriado eefectuando a sua soma no conjunto dos ensaios, obtemosuma variável estatística em que a distribuição segueaproximadamente uma lei de χ2 (ver tabela 8.3) e que podeser utilizado para verificar a homogeneidade de uma série deestimativas do logaritmo da actividade:

�2 � �n’

W (M � M�)2 onde M� � (6.2.2.-1.)

Se o valor de χ2 assim calculado é inferior ao valor da tabelaque corresponde a (n’�1) graus de liberdade, as actividadessão homogéneas e os valores obtidos na secção 6.2.3 para aactividade média e os limites associados terão significado.

Se o valor de χ2 calculado é superior ao valor da tabela, asactividades são heterogéneas. Isto significa que as variaçõesentre as estimativas individuais de M são superiores ao queseria previsível pelas estimativas dos limites de confiança,quer dizer que existe uma variabilidade significativa entre osensaios. Nestas circunstâncias, a condição 4 não é satisfeita eas equações da secção 6.2.3 não são aplicáveis, mas elaspodem ser substituídas pelas da secção 6.2.4.

6.2.3. CÁLCULO DA MÉDIA PONDERADA E DOS LIMITESDE CONFIANÇA

Os produtos WM são formados para cada ensaio e a sua somaé dividida pela soma dos factores de ponderação de todos os ensaios, para dar a média logarítmica ponderada da actividade.

M� � (6.2.3.-1.)

O erro tipo de ln(actividade média) é a raiz quadrada doinverso da soma dos factores de ponderação:

SM� � �� (6.2.3.-2.)

e os limites de confiança aproximados são obtidos tomandoo antilogaritmo do valor dado pela equação:

M� � t � sM� (6.2.3.-3.)

onde o número de graus de liberdade associado a t é igual àsoma do número de graus de liberdade para os quadradosmédios do erro nos ensaios individuais.

1��W

�WM�

�W

�WM�W

4t2�L2

6.2.4. CÁLCULO DA MÉDIA PONDERADA E DOS LIMITESDE CONFIANÇA BASEADO NAS VARIAÇÕES INTRA- EINTER-ENSAIOS

Quando os resultados de vários ensaios repetidos são combi-nados, o valor de χ2 pode ser significativo. Considera-seentão que a variabilidade observada tem duas componentes:

– a variabilidade intra-ensaio s2M = 1/W,

– a variabilidade interensaios s2M� �

onde M� é a média não ponderada. A primeira varia de umensaio para outro, enquanto que a segunda é comum a todosos valores M.

Calculamos então, para cada valor M, um factor de ponderação:

W’ �

que substitui W na secção 6.2.3, onde t toma aproximada-mente o valor 2.

6.3. COMBINAÇÃO NÃO PONDERADA DE RESULTADOS DEENSAIOS

Para combinar da maneira mais simples as n’ estimativas deM obtidas a partir de n’ ensaios, determinamos a sua médiaseguida do cálculo do desvio padrão segundo a fórmula:

S2M� � (6.3.-1.)

e os limites de confiança são dados por

M� � tsM� (6.3.-2.)

onde t possui (n’�1) graus de liberdade. O número n’ deestimativas de M é normalmente pequeno, e em consequên-cia o valor de t é relativamente grande.

6.4. EXEMPLO DE ACTIVIDADE MÉDIA PONDERADA E DOSSEUS LIMITES DE CONFIANÇA

Na tabela 6.4.-I estão representadas 6 estimativas indepen-dentes da actividade da mesma preparação, com os limitesde confiança para 95 por cento e os números de graus deliberdade correspondentes. As condições 1, 2 e 3 da secção6.2 são satisfeitas. Os valores ln(actividade) e os factores deponderação são calculados como descrito na secção 6.2.

��M � M��2��

n’�n’ � 1�

1��

s2M � s2

M�

��M � M��2��

n’�n’ � 1�



5. Textos gerais

TABELA 6.4.-I. – Análise de variância ponderada

18367 17755 19002 20 9,8183 3777,7

18003 17415 18610 20 9,7983 3951,5

18064 17319 18838 20 9,8017 2462,5

17832 17253 18429 20 9,7887 4003,0

18635 17959 19339 20 9,8328 3175,6

18269 17722 18834 20 9,8130 4699,5

actividadeestimada(UI/amp.)

Limiteinferior

(UI/amp.)

Limite superior

(UI/amp.)

Graus de

liberdade

lnactividade

M

PonderaçãoW

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A homogeneidade das estimativas de actividade é avaliadapor meio da fórmula 6.2.2.-1, que dá um valor de χ2 de 4,42com 5 graus de liberdade. Este resultado não é significativo(p � 0,49) e portanto todas as condições são satisfeitas.

O cálculo da actividade média ponderada para a fórmula6.2.3.-1 dá um valor de 9,8085.

A fórmula 6.2.3.-2 dá um desvio padrão de 0,00673 e oslimites de confiança para 95 por cento aproximadoscalculados pela fórmula 6.2.3.-3, onde t possui 120 graus deliberdade, são de 9,7951 e 9,8218.

Tomando o antilogaritmo destes valores, obtemos uma acti-vidade de 18 187 UI/ampola com um intervalo de confiançapara 95 por cento entre 17 946 e 18 431 UI/ampola.

7. PARA ALÉM DESTA MONOGRAFIA

É impossível apresentar uma exposição completa de métodosestatísticos num texto da Farmacopeia, mas os métodosanteriormente descritos devem ser normalmente suficientespara a maior parte dos ensaios da farmacopeia. O objectivodesta secção é a de tentar trazer uma visão mais global sobreos métodos alternativos ou mais gerais que foramdesenvolvidos. O leitor que estiver interessado é convidado aaprofundar o assunto explorando a literatura existente. Dequalquer modo, a aplicação de métodos estatísticos maisespecializados deverá ser deixada ao cuidado de especialistas.

7.1 MODELOS LINEARES GERAIS

Os métodos descritos neste anexo podem, globalmente, serdescritos como modelos lineares gerais (ou «generalistas»para poder incluir os métodos de probits e de logits). O prin-cípio geral consiste na definição de uma matriz de estruturalinear X (ou matriz de planificação) em que cada linharepresenta uma observação e cada coluna um efeito linear(preparação, bloco, coluna, dose). Por exemplo, o ensaio dequadrado latino do exemplo 5.1.2 poderá ser representadopor uma matriz de 36 linhas e 13 colunas: 1 coluna paracada preparação, 1 coluna para as 5 doses, 5 colunas para osblocos com excepção do primeiro e 5 colunas para as linhascom excepção da primeira. Todas as colunas, com excepçãodaquela contendo as doses são preenchidas com o valor 0 ou1 dependendo da observação corresponder ou não ao efeitoconsiderado. Um vector Y é construído com as observações(transformadas). As actividades são estimadas com auxílio dafórmula (XtX)-1XtY, e é fácil de deduzir a estimativa daactividade m através do rácio dos efeitos relevantes. O inter-valo de confiança é calculado pelo teorema de Fieller:

onde g �

e v11, v22, v12 representam respectivamente os multiplicado-res da variância para o numerador e denominador e o multi-plicador da covariância. Eles são obtidos directamente apartir de (XtX)�1 ou indirectamente fazendo:

Var(a1�a2) � Var(a1) � Var(a2) – 2Cov(a1,a2)

e Cov(a1�a2,b) � Cov(a1,b) – Cov(a2,b)

t2s2v22�b2

Uma análise de variância completa implicando a partição detodas as componentes é ligeiramente mais complexa porqueela implica uma redefinição de X, com mais colunas, paraverificar as hipóteses de paralelismo e de linearidade, depoisdo qual as hipóteses lineares podem ser testadas. Para astitulações baseadas em respostas qualitativas, os efeitoslineares (ordenadas na origem aS, aT, etc e declive comumb) são determinadas maximizando a soma dos tratamentosnlnΦ(ai � bx) � (n � r)ln(1 � Φ(ai � bx)), onde x é ln(dose), Φ representa a forma da distribuição e i ∈ {S, T, ...}.

7.2. HETEROGENEIDADE DA VARIÂNCIA

Nem sempre é possível resolver o problema da heterogenei-dade da variância pela simples transformação das respostas.Uma aproximação possível consiste na utilização de umaregressão linear ponderada. Para obter uma estimativa semdistorção (bias) aplica-se às observações um factor de ponde-ração proporcional ao inverso do erro das variâncias. Comoo verdadeiro erro das variâncias nem sempre é conhecido,pode-se proceder através da determinação iteractiva dasponderações. No entanto, o cálculo do intervalo de confiançacoloca ainda novos problemas.

7.3. VALORES ABERRANTES E ROBUSTEZ DOS MÉTODOS

O método dos mínimos quadrados descrito neste anexoapresenta o inconveniente de ser extremamente sensível aresultados aberrantes. Um resultado nitidamente aberrantepode falsear totalmente os resultados. Resolve-se esseproblema normalmente, rejeitando esses resultados dosdados do ensaio. Esta pratica pode conduzir à rejeiçãoarbitrária de dados, e não é isenta de perigos. Não é fácilpropor regras gerais sobre o modo de decidir se uma obser-vação específica constitui ou não um resultado aberrante, epor isso métodos mais robustos foram desenvolvidos, quesão menos sensíveis à presença de resultados aberrantesporque atribuem menor peso às observações que se afastammuito do valor presumido. Estes métodos colocam, noentanto, outros problemas ligados ao cálculo dos intervalosde confiança ou à definição de uma função de ajustamentosatisfatória.

7.4. ERROS CORRELACIONADOS

A aleatoriedade absoluta nem sempre é realizável ou verda-deiramente sustentável do ponto de vista prático. É, por isso,frequente que as doses sucessivas de uma série de diluiçõesapresentem erros correlacionados e que, em consequência,os limites de confiança sejam demasiado aproximados.Foram desenvolvidos métodos que permitem ter em atençãoeste efeito de autocorrelação.

7.5. CURVAS DOSE-RESPOSTA NÃO LINEARESPROLONGADAS

A análise das curvas dose-resposta não lineares prolongadascoloca um conjunto de problemas estatísticos que éindispensável ter em consideração, e por causa dos quais érecomendada a consulta a um especialista. Alguns dessesproblemas são apresentados sucintamente a seguir.

1) Um exemplo utilizando a função logística de 4 parâmetrosé descrito anteriormente. No entanto, é igualmente possí-vel utilizar modelos baseados em função que dêem outrascurvas sigmoides. Foi sugerido o emprego de modeloscomportando parâmetros suplementares de assimetria.



5. T

exto

s ge

rais

mL, mU �

m � � �v1�1�� 2�m�v1�2�� m�2v�22� �� g��v1�1��(1 � g)

v212

�v22

ts�b

gv12�v22

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 569

2) A heterogeneidade da variância é corrente quando asrespostas se distribuem numa grande intervalo. Se aanálise ignora esta heterogeneidade, a interpretação dosresultados corre o risco de ser incorrecta e as estimativasdistorcidas (biased). Perante um número de réplicaslimitado o recurso a factores de ponderação proporcio-nais ao inverso das variâncias de erro tem poucas oportu-nidades de ser fiável. Uma aproximação satisfatória podeser o cálculo de uma função que exprima uma relaçãoentre a variância e a resposta média.

3) Os procedimentos estatísticos de ajustamento das curvaspodem originar estimativas diferentes dependendo dashipóteses colocadas quanto à homogeneidade da variân-cia e ao intervalo das respostas utilizado.

4) Em princípio, a igualdade das respostas máxima emínima, obtidas com as diferentes preparações incluídasnuma dosagem, pode ser directamente verificada em cadaensaio. No entanto, a interpretação dos resultados destestestes estatísticos pode não ser evidente. Os testes delinearidade e de paralelismo descritos no método deanálise simplificada (exemplo 5.4.1) incluem indirecta-mente as verificações de igualdade e de precisão doslimites inferior e superior.

5) Muitos doseamentos incluem os «controlos» que servempara identificar as respostas limite (inferior e/ousuperior), mas estes valores podem não ser coincidir comos limites superior e inferior obtidos pelo ajustamentoestatístico a partir da curva dose-resposta prolongada.

6) O método de análise simplificado descrito no exemplo5.4.1 fornece intervalos de confiança aproximados.

Outros métodos podem igualmente ser utilizados para ocálculo, como por exemplo o método baseado na ausênciade ajustamento do modelo completamente especificado.Para dados de doseamentos típicos, com respostascobrindo o conjunto do intervalo para cada preparaçãotestada, todos os métodos dão resultados similares.

8. TABELAS E MÉTODOS DE CÁLCULO

As tabelas contidas nesta secção apresentam os valorescríticos correspondentes aos números de graus de liberdademais usuais. Se determinado valor crítico não figurar, devemser consultadas tabelas mais detalhadas. Numerosos progra-mas informáticos contêm funções estatísticas, e o seuemprego é preferível ao uso das tabelas aqui apresentadas.Uma outra aproximação possível consiste na utilização dosmétodos de cálculo descritos a seguir a cada tabela, paradeterminar a probabilidade correspondente a uma variávelestatística e a um número de graus de liberdade dados.

8.1 DISTRIBUIÇÃO DE F

Se o valor observado é superior ao valor indicado na tabela,ele é considerado como significativo (linhas superiores, p = 0,05) ou muito significativo (linhas inferiores, p = 0,01).df1 é o número de graus de liberdade do numerador e df2 onúmero de graus de liberdade do denominador.

Método de cálculo: seja F o rácio-F e df1 e df2 como descrito acima. Seja pi � � � p � 3,14159265358979... O métodoseguinte permite o cálculo do valor p.



5. Textos gerais

df1 → 1 2 3 4 5 6 8 10 12 15 20 ∞

df2 ↓

10 4,965 4,103 3,708 3,478 3,326 3,217 3,072 2,978 2,913 2,845 2,774 2,538

10,044 7,559 6,552 5,994 5,636 5,386 5,057 4,849 4,706 4,558 4,405 3,909

12 4,747 3,885 3,490 3,259 3,106 2,996 2,849 2,753 2,687 2,617 2,544 2,296

9,330 6,927 5,953 5,412 5,064 4,821 4,499 4,296 4,155 4,010 3,858 3,361

15 4,543 3,682 3,287 3,056 2,901 2,790 2,641 2,544 2,475 2,403 2,328 2,066

8,683 6,359 5,417 4,893 4,556 4,318 4,004 3,805 3,666 3,522 3,372 2,868

20 4,351 3,493 3,098 2,866 2,711 2,599 2,447 2,348 2,278 2,203 2,124 1,843

8,096 5,849 4,938 4,431 4,103 3,871 3,564 3,368 3,231 3,088 2,938 2,421

25 4,242 3,385 2,991 2,759 2,603 2,490 2,337 2,236 2,165 2,089 2,007 1,711

7,770 5,568 4,675 4,177 3,855 3,627 3,324 3,129 2,993 2,850 2,699 2,169

30 4,171 3,316 2,922 2,690 2,534 2,421 2,266 2,165 2,092 2,015 1,932 1,622

7,562 5,390 4,510 4,018 3,699 3,473 3,173 2,979 2,843 2,700 2,549 2,006

50 4,034 3,183 2,790 2,557 2,400 2,286 2,130 2,026 1,952 1,871 1,784 1,438

7,171 5,057 4,199 3,720 3,408 3,186 2,890 2,698 2,563 2,419 2,265 1,683

∞ 3,841 2,996 2,605 2,372 2,214 2,099 1,938 1,831 1,752 1,666 1,571 1,000

6,635 4,605 3,782 3,319 3,017 2,802 2,511 2,321 2,185 2,039 1,878 1,000

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8.2. DISTRIBUIÇÃO DE T

Se o valor observado é superior ao valor indicado na tabela,ele é considerado significativo (p � 0,05) ou muito significa-tivo (p � 0,01).

O valor t (p = 0,05) para um dado número de graus deliberdade df é obtido pelo método seguinte, que é exacto até6 casas decimais.



5. T

exto

s ge

rais

df p � 0,05 p � 0,01 df p � 0,05 p � 0,01

1 12,706 63,656 22 2,074 2,819

2 4,303 9,925 24 2,064 2,797

3 3,182 5,841 26 2,056 2,779

4 2,776 4,604 28 2,048 2,763

5 2,571 4,032 30 2,042 2,750

6 2,447 3,707 35 2,030 2,724

7 2,365 3,499 40 2,021 2,704

8 2,306 3,355 45 2,014 2,690

9 2,262 3,250 50 2,009 2,678

10 2,228 3,169 60 2,000 2,660

12 2,179 3,055 70 1,994 2,648

14 2,145 2,977 80 1,990 2,639

16 2,120 2,921 90 1,987 2,632

18 2,101 2,878 100 1,984 2,626

20 2,086 2,845 ∞ 1,960 2,576

Métodos de cálculo: o valor p para determinado t com dfgraus de liberdade é obtido pelos métodos descritos nasecção 8.1 com F = t2, df1 = 1 e df2 = df.

t = 1.959964 1

2.37228 / df +

2.82202 / df ^ 2 +

2.56449 / df ^ 3 +

1.51956 / df ^ 4 +

1.02579 / df ^ 5 +

0.44210 / df ^ 7

SSee ddff11 ffoorr ppaarr SSee ddff11 ffoorr iimmppaarr ee ddff22 ppaarr SSee ddff11 ee ddff22 ffoorreemm íímmppaarreess

x = df1 / (df1 + df2/F) x = df2 / (df2 + df1 * F) x = atn (sqr (df1 * F / df2))

s = 1 s = 1 cs = cos (x)

t = 1 t = 1 sn = sin (x)

for i = 2 to (df1 - 2) step 2 for i = 2 to (df2 - 2) step 2 x = x /2

t = t*x* (df2 + i - 2) /i t = t*x* (df1 + i - 2) /i s = 0

s = s + t s = s + t t = sn * cs / 2

next i next i v = 0

p = s*(1 - x) ^ (df2 /2) p = 1 - s* (1 - x) ^ (df1 /2) w = 1

for i = 2 to (df2 - 1) step 2

s =s + t

t = t * i /(i + 1) * cs * cs

next i

for i = 1 to (df1 - 2) step 2

v = v + w

w = w*(df2 + i) / (i + 2) sn * sn

next i

p = 1 + (t * df2 * v-x-s) / pi * 4

8.3. DISTRIBUIÇÃO DE � 2

df p � 0,05 p � 0,01 df p � 0,05 p � 0,01

1 3,841 6,635 11 19,675 24,725

2 5,991 9,210 12 21,026 26,217

3 7,815 11,345 13 22,362 27,688

4 9,488 13,277 14 23,685 29,141

5 11,070 15,086 15 24,996 30,578

6 12,592 16,812 16 26,296 32,000

7 14,067 18,475 20 31,410 37,566

8 15,507 20,090 25 37,652 44,314

9 16,919 21,666 30 43,773 50,892

10 18,307 23,209 40 55,758 63,691

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Se um valor observado é superior ao valor indicado natabela, ele é considerado significativo (p = 0,05) ou muitosignificativo (p = 0,01).

Método de cálculo: seja x2 o valor da variável χ2 e df talcomo descrito acima. O método seguinte permite calcular ovalor de p.

x é negativo, pode-se utilizar a fórmula indicada acima. Estemétodo assume que o computador pode apresentar cerca de15 casas decimais. Se o número de dígitos for inferior ousuperior a 15, este método necessita de alguns ajustamentossimples.



5. Textos gerais

SSee éé ddff ffoorr ppaarr SSee ddff éé íímmppaarr

s = 0 : x = sqr (x2) :

t = exp (-x2 / 2) s = 0

for i = 2 to df step 2 t = x* exp (- x2/2) / sqr (pi / 2)

s = s + t for i = 3 to df step 2

t = t* x2 / i s = s + t

next i t = t* x2 / i

p = 1 - s next i

p = 1 - s - 2* phi (x)

Neste método phi é a distribuição normal reduzida cumulativaΦ (ver secção 8.4).

8.4. DISTRIBUIÇÃO DE ? (DISTRIBUIÇÃO NORMALREDUZIDA CUMULATIVA)

x ΦΦ x ΦΦ x ΦΦ

0,00 0,500 1,00 0,841 2,00 0,977

0,05 0,520 1,05 0,853 2,05 0,980

0,10 0,540 1,10 0,864 2,10 0,982

0,15 0,560 1,15 0,875 2,15 0,984

0,20 0,579 1,20 0,885 2,20 0,986

0,25 0,599 1,25 0,894 2,25 0,988

0,30 0,618 1,30 0,903 2,30 0,989

0,35 0,637 1,35 0,911 2,35 0,991

0,40 0,655 1,40 0,919 2,40 0,992

0,45 0,674 1,45 0,926 2,45 0,993

0,50 0,691 1,50 0,933 2,50 0,994

0,55 0,709 1,55 0,939 2,55 0,995

0,60 0,726 1,60 0,945 2,60 0,995

0,65 0,742 1,65 0,951 2,65 0,996

0,70 0,758 1,70 0,955 2,70 0,997

0,75 0,773 1,75 0,960 2,75 0,997

0,80 0,788 1,80 0,964 2,80 0,997

0,85 0,802 1,85 0,968 2,85 0,998

0,90 0,816 1,90 0,971 2,90 0,998

0,95 0,829 1,95 0,974 2,95 0,998

Para os valores de x negativos, o valor de Φ obtém-se a partirda tabela tomando 1-Φ(-x).

Método de cálculo: Seja x o valor da variável x. O métodoseguinte permite obter o valor de Φ correspondente se 0 �x � 8,15. Se x � 8,15 o valor de Φ pode ser igualado a 1. Se

s = 0

t = x

i = 1

repeat

s = s + t

i = i + 2

t = t*x*x/i

until t<1E-16

phi = 0.5+s*exp(-x*x/2)/sqr(2*pi)

8.5. PERMUTAÇÕES ALEATÓRIAS

As permutações aleatórias são indispensáveis no caso deensaios de blocos completos. O algoritmo representado aseguir mostra como obter uma permutação aleatória de Ntratamentos por meio da função de cálculo de um sistemainformático.

1. inscrever na linha os N tratamentos possíveis.

2. escolher aleatoriamente um número inteiro r tal que 1 � r � N.

3. permutar o r-ésimo tratamento e N-ésimo tratamento dalinha.

4. fazer N � N�1 e repetir os passos 2 a 4 até N � 1.

O exemplo seguinte, de 6 tratamentos, ilustra este algoritmo.

1. N � 6 S1 S2 S3 T1 T2 T3

2. r � 2 → ←

3. S1 T3 S3 T1 T2 S2

4. N � 5

2. r � 4 → ←

3. S1 T3 S3 T2 T1 S2

4. N � 4

2. r � 4 ↓

3. S1 T3 S3 T2 T1 S2

4. N � 3

2. r � 1 → ←

3. S3 T3 S1 T2 T1 S2

4. N � 2

2. r � 1 →

3. T3 S3 S1 T2 T1 S2

4. N � 1

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM 2

8.6. QUADRADOS LATINOS

O exemplo seguinte mostra como utilizar 3 permutaçõesindependentes para obter um quadrado latino.

1). gerar uma permutação aleatória de N tratamentospossíveis (ver secção 8.5):

T3 S3 S1 T2 T1 S2

2). pode construir-se um quadrado latino simples rodandopara a direita os termos desta permutação. Inscreva naprimeira linha a permutação obtida na etapa 1. A segundalinha é constituída pela mesma permutação, mas em queos termos foram transpostos para a direita, o tratamentosituado na extrema direita vem ocupar o espaço livre naextrema esquerda. Repita esta operação em cada linhaaté que todos os tratamentos apareçam uma vez em cadacoluna:

9. GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS E TERMOS

9.1. GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS



5. T

exto

s ge

rais

T3 S3 S1 T2 T1 S2

S2 T3 S3 S1 T2 T1

T1 S2 T3 S3 S1 T2

T2 T1 S2 T3 S3 S1

S1 T2 T1 S2 T3 S3

S3 S1 T2 T1 S2 T3

3). gere de seguida 2 permutações aleatórias independentesdos números 1 a N:

– uma para as linhas:

2 3 6 1 4 5

– e uma para as colunas:

3 4 6 2 5 1

4). O quadrado latino pode agora ser encontrado colocandopor ordem as linhas e colunas do quadrado latinosimples de acordo com as 2 permutações para as linhase colunas:

3 4 6 2 5 1

2 T3 S3 S1 T2 T1 S2

3 S2 T3 S3 S1 T2 T1

6 T1 S2 T3 S3 S1 T2

1 T2 T1 S2 T3 S3 S1

4 S1 T2 T1 S2 T3 S3

5 S3 S1 T2 T1 S2 T3

↓

1 2 3 4 5 6

1 S1 T3 T2 T1 S3 S2

2 S2 T2 T3 S3 T1 S1

3 T1 S1 S2 T3 T2 S3

4 S3 S2 S1 T2 T3 T1

5 T3 T1 S3 S1 S2 T2

6 T2 S3 T1 S2 S1 T3

Símbolo Definição

a Intersecção da regressão linear das respostas com adose ou ln(dose)

b Declive da regressão linear da resposta em dose, oulogaritmo da dose

d Número de níveis de doses para cada preparação(excluindo o branco nos ensaios do modelo de relaçãode declives)

e Base de logaritmos naturais (= 2,71828182845905...)

g Cálculo usado no teorema de Fieller: g �

h Número de preparações num ensaio, incluindo apreparação padrão

m Actividade estimada obtida como o rácio dos efeitosnos modelos lineares

n Número de réplicas de cada tratamento

p Probabilidade de que determinado cálculo sejasuperior ao valor observado. Igualmente usado norácio r/n na probabilidade iteractiva

r Número de unidades respondendo em cada grupotratado em ensaios dependentes de respostasqualitativas

s Estimativa do desvio padrão �� s2� �s2 Estimativa da variância residual dada pelo erro médio

quadrático na análise de variância

t Estatística de Student (tabela 8.2)

u Resposta observada na análise de quatro parâmetros

C � 1�

C

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 573

9.2. GLOSSÁRIO DE TERMOS

Correspondência utilizada entre a terminologia portuguesa ea inglesa (5).

Terminologia Terminologiaem língua portuguesa em língua inglesa

actividade potencyactividade atribuída assigned potencyactividade declarada stated potencyactividade estimada estimated potencyactividade real true potencyactividade rotulada labelled potencyaleatoriedade randomisationamplitude rangedistorção biascoeficiente de regressão conjunto pooled regression coeficientcurvatura oposta opposite curvaturedesenho de 5 ponto com zero comum common-zero 5 point designdesvio padrão standard deviationdesvio padrão da média standard deviation of the meanensaio assayensaios qualitativos quantal assayserro das variâncias error varianceserro padrão standard errorfluxograma flowchartlimite de confiança confidence intervalmédia não ponderada unweighted meanmédia ponderada weighted meanmédia(s) mean(s)método das semelhanças máximas maximum likehood methodmodelo de linhas paralelas parallel-line modelmodelo de relação de declives slope-ratio modelnão paralelismo non-parallelismordenação arraypermutação cross-overprobabilidade iterativa probitprobabilidade iterativa funcional working probitrelação de actividade potency ratiosoma dos quadrados para o erro sum of squares for errortermo de erro error termtermo de erro médio quadrático error-mean square termtermo de não-paralelismo non-parallelism termteste testtransformação probabilística iterativa probit transformation



5. Textos gerais


v11, v12, v22 Multiplicadores de (co)variância para o numerador edenominador do rácio m no teorema de Fieller

w Coeficiente de ponderação

x O ln(dose)

y Resposta individual ou transformada

A Actividade assumida das amostras quando sepreparam doses

B Resposta média dos brancos nos ensaios de de relaçãode declives

C Estatística usada no cálculo dos limites de confiança:

C �

Cp,...,Cn Resposta média de cada coluna do desenho do

quadrado latino

D1, D2 Resposta total no tempo I, tempo II no ensaio depermutação duplo

F Rácio de 2 estimativas independente de variânciaseguindo a distribuição-F (tabela 8.1.)

GS,GT,... Valores do tratamento usados na análise de variânciados ensaios de relação de declives.

HP, HL Multiplicadores usados na análise de variância dosensaios de linhas paralelas.

HB, HI Multiplicadores usados na análise de variância dosensaios de relação de declives.

I Nos ensaios de linhas paralelas, o ln do rácio entredoses adjacentes. Nos ensaios de relação de declives, ointervalo entre doses adjacentes.

JS, JT,... Valores lineares usados na análise de variância dosensaios de relação de declives

K Termo de correcção utilizado no cálculo da soma dequadrados numa análise de variância

L Amplitude do intervalo de confiança em logaritmos

LS, LT,... Contrastes lineares de padrões e amostras

M’ ln relação de da actividade de uma amostra específica

N Número total de respostas num ensaio (� dh)

PS,PT,.... Soma do padrão e das amostras

R Actividade estimada de uma amostra específica

R’ Relação de da actividade de uma amostra específica

R1 ... Rn Resposta média em cada linha 1 a n do desenho doquadrado latino, ou em cada bloco num desenho deblocos aleatório

S Padrão

S1,...,Sd Resposta média à menor dose 1 até à maior d de umpadrão S

SS Soma dos quadrados de uma fonte específica devariação

T, U, V, ... Amostras em ensaio

T1,...,Td Resposta média à menor dose 1 até à maior d de umpadrão T

V Coeficiente de variância no cálculo dos limites deconfiança

W Factor de ponderação usada na combinação deresultados de ensaios

X Estrutura linear ou desenho matricial usado paragerar modelos lineares

Y Vector representativo das respostas (transformadas)nos modelos lineares gerais

1�1 � g

(5) Esta sub secção é aqui introduzida para facilidade de consulta,pelo leitor, da bibliografia em inglês e compreensão da terminologiaadoptada nesta área pela Comissão da Farmacopeia Portuguesa, apartir da 6ª edição. Em estatística está muito consagrada a termino-logia em inglês, e foi nossa intenção proceder à adequação à termi-nologia portuguesa, pelo que apresenta aqui um glossário de termoscom a correspondência à versão inglesa da Farmacopeia Europeia.


Z A primeira derivada de Φ

α Assímptota superior da curva ln(dose)-resposta naanálise de quatro parâmetros

β Factor de declive da curva ln(dose)-resposta naanálise de quatro parâmetros

γ O ln(dose) correspondente a 50 por cento de respostano modelo de quatro parâmetros

δ Assímptota inferior da curva ln(dose)-resposta naanálise de quatro parâmetros

π 3,141592653589793238...

Φ Distribuição normal reduzida cumulativa (tabela 8.4)

χ2 Estatística chi-quadrado (tabela 8.3)

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5. T

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s ge

rais

Finney, D. J. (1978). Statistical method in biological assay,3a Ed. Griffin, London.

Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles andPractice of Statistics in Biological Research, 2ª Ed. W. H.Freeman & Co, New York.

Peace, K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for DrugDevelopment, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.

Bowerman, B. L. & O’Connell (1990). Linear StatisticalModels an Applied Approach, 2ª Ed. PWS-KENT PublishingCompany, Boston.

Govindarajulu, Z. (2001). Statistical Techniques in Bioassay,2ª Ed, Karger, New York.

10. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

Esta secção contém uma lista de referências bibliográficasde leitura recomendada para um estudo mais aprofundadodo assunto.

Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3a Ed. CambridgeUniversity Press, Cambridge.

Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalizedlinear models, Journal of the Royal Statistical Society, SeriesA 135, 370-384.

DeLean, A., Munson, P. J. e Rodbard, D. (1978).Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves:Application to bioassay, radioligand assay and physiologicaldose-response curves, Am J. Physiol. 235 (2): E97-E102.

16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 575


5. T

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5.4. SOLVENTESRESIDUAIS

1. Introdução .................................................................. 5792. Âmbito da presente nota explicativa .......................... 5803. Princípios gerais.......................................................... 580

3.1. Classificação dos solventes residuais em função da avaliação do risco .............................. 580

3.2. Métodos que permitem estabelecer os limites de exposição ........................................................ 580

3.3. Opções que permitem descrever os limites dossolventes da classe 2 .......................................... 580

3.4. Procedimentos analíticos .................................. 5813.5. Declaração de conformidade dos limites em

solventes residuais .............................................. 5814. Limites de solventes residuais .................................... 581

4.1. Solventes a evitar................................................ 581

4.2. Solventes de utilização limitada ........................ 5824.3. Solventes com baixo potencial tóxico................ 5824.4. Solventes para os quais não foram encontrados

dados toxicológicos adequados .......................... 582Glossário

Anexo 1: lista de solventes incluídos nesta notaexplicativa .................................................... 583

Anexo 2: informações complementares...................... 585A2.1: regulamentação ambiental para os

solventes orgânicos voláteis .............. 585A2.2: solventes residuais nos produtos

farmacêuticos .................................... 585Anexo 3: métodos relativos ao estabelecimento

de limites de exposição ................................ 585

17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 577

5.4. SOLVENTES RESIDUAIS

LIMITAÇÃO DOS TEORES DE SOLVENTES RESIDUAIS NAS SUBSTÂNCIAS ACTIVAS,

NOS EXCIPIENTES E NOSMEDICAMENTOS

A Conferência Internacional para a Harmonização (ICH)(International Conference on Harmonization of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for HumanUse) adoptou um documento intitulado «Impurezas: Notaexplicativa relativa aos solventes residuais», que prescreve oslimites do teor de solventes que podem permanecer nassubstâncias activas, nos excipientes e nos medicamentos apósfabrico. Esta nota explicativa, cujo texto é reproduzido aseguir, exclui os produtos já comercializados. Contudo, aFarmacopeia Portuguesa aplica às substâncias activas, aosexcipientes e aos medicamentos existentes os princípiosenunciados na nota explicativa, tenham estes sido objecto, ounão, de uma monografia na Farmacopeia. É convenientepesquisar, no conjunto das substâncias e produtos, eventuaisvestígios de solventes que tenham subsistido após fabrico.

Quando os limites a aplicar estão conformes aos a seguirfornecidos, os ensaios de solventes residuais não são, regrageral, mencionados nas monografias específicas, uma vez queos solventes utilizados podem diferir de fabricante parafabricante e os requisitos deste capítulo geral são postos emprática pela aplicação da monografia geral «Substâncias parauso farmacêutico». Por consequência, a Autoridade compe-tente deve estar informada dos solventes utilizados durante oprocesso de fabrico. Estas informações devem figurarigualmente no processo apresentado para pedido de obtençãode um certificado de conformidade às monografias daFarmacopeia Portuguesa e são mencionadas no certificado.

Quando se utilizam solventes da classe 3, a substância podeser submetida a um ensaio de perda por secagem ou pode serefectuada uma determinação específica. Se um solvente daclasse 3 apresenta um limite justificado e autorizado superiora 0,5 por cento, é necessário proceder à determinaçãoespecífica desse solvente.

Em caso de utilização de solventes residuais das classes 1 e 2(ou solventes da classe 3 cujo teor seja superior a 0,5 porcento), deve ser aplicada, sempre que possível, a metodologiadescrita no método geral (2.4.24.). Nos restantes casos, deverecorrer-se a um método validado apropriado.

Quando é efectuada a determinação quantitativa de umsolvente residual, esta é tida em conta para o cálculo do teorda substância, a não ser que também se efectue um ensaio deperda por secagem.

IMPUREZAS: NOTA EXPLICATIVA RELATIVA AOS SOLVENTES RESIDUAIS

(CSP/ICH/283/95)

1. INTRODUÇÃO2. ÂMBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA3. PRINCÍPIOS GERAIS

3.1. Classificação dos solventes residuais em função da avaliaçãodo risco

3.2. Métodos que permitem estabelecer os limites de exposição3.3. Opções que permitem descrever os limites dos solventes da

classe 23.4. Procedimentos analíticos3.5. Declaração de conformidade dos limites em solventes residuais

4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS4.1. Solventes a evitar4.2. Solventes de utilização limitada4.3. Solventes com baixo potencial tóxico4.4. Solventes para os quais não foram encontrados dados toxicoló-

gicos adequadosGLOSSÁRIOANEXO 1. Lista dos solventes incluídos nesta nota explicativaANEXO 2. Informações complementares

A2.1. Regulamentação ambiental para os solventesorgânicos voláteis

A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacêuticosANEXO 3. Métodos relativos ao estabelecimento de limites de exposição

1. INTRODUÇÃO

A presente nota explicativa tem por objectivo recomendar asquantidades de solventes residuais admissíveis nos produtos deutilização farmacêutica por forma a excluir qualquer risco paraa saúde do paciente. Preconiza a utilização de solventes de menor toxicidade e descreve, para alguns solventes, as taxas residuaisconsideradas aceitáveis sob um ponto de vista toxicológico.

Os solventes residuais nos produtos de utilização farmacêuticasão aqui definidos como produtos químicos orgânicos voláteisutilizados ou produzidos no fabrico de substâncias activas eexcipientes ou entrando na preparação de medicamentos. Osprocessos de fabrico correntes não permitem a eliminaçãocompleta dos solventes. A escolha apropriada do solvente paraa síntese da substância activa pode melhorar o rendimento oudeterminar características como a forma cristalina, a pureza ea solubilidade. Assim, o solvente pode, por vezes, constituirum elemento crítico do processo de síntese. A presente notaexplicativa não se refere aos solventes exclusivamente utili-zados como excipientes nem aos solvatos. É, contudo, conve-niente avaliar e justificar o teor em solventes de tais produtos.

Sabendo que os solventes residuais não apresentam qualquervantagem terapêutica, é conveniente eliminá-los, sempre quepossível, para satisfazer às exigências da qualidade (especifica-ções, Boas Práticas de Fabrico de Medicamentos). Os medica-mentos não devem apresentar teores de solventes residuaissuperiores aos previstos nos dados de segurança.

Os solventes da classe 1 (quadro 1), pela elevada toxicidadeque possuem, não devem ser utilizados na fabrico de subs-tâncias activas, de excipientes, ou de medicamentos, a não serque se justifique claramente após uma avaliação risco/benefício.Os solventes da classe 2 (quadro 2), cuja toxicidade é menor,devem ter utilização limitada, tendo em vista a protecção dospacientes de reacções adversas. Idealmente, devem ser utili-zados sempre que possível os solventes da classe 3 (quadro 3),menos tóxicos. A lista completa dos solventes figura no Anexo1 da presente nota explicativa.


5. T

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5.4. Solventes residuais

17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 579

As listas apresentadas neste documento não são exaustivas,podendo outros solventes em uso actualmente vir a ser acres-centados às diferentes listas. Os limites recomendados para ossolventes das classes 1 e 2, ou a classificação dos solventes,podem variar em função do aparecimento de novos dados desegurança. Os dados de segurança que permitem suportar opedido de colocação no mercado de um novo medicamento,contendo um novo solvente, podem-se inspirar nas informa-ções apresentadas neste documento ou nas Guideline ICH--Q3A («Impurezas nas novas substâncias activas») GuidelineICH-Q3B («Impurezas nos novos medicamentos»), ou, ainda,no conjunto dos três documentos.

2. ÂMBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA

Esta nota faz o inventário dos solventes residuais presentesnas substâncias activas, nos excipientes e nos medicamentos.Por consequência, deve ser realizado um ensaio dos Solventesresiduais sempre que os processos de fabrico ou de purifica-ção decorrem na presença de tais solventes. A pesquisaincidirá apenas sobre os solventes utilizados ou produzidosdurante o processo de fabrico ou na purificação das substân-cias activas, dos excipientes ou dos medicamentos. Mesmoque os fabricantes possam escolher efectuar a determinaçãosobre o medicamento, é possível utilizar um método cumula-tivo que permite calcular os teores de solventes residuais nomedicamento a partir dos teores existentes nos diferenteselementos constitutivos. Se este cálculo der um resultadoinferior ou igual ao nível de solvente indicado nesta notaexplicativa, a determinação dos solventes residuais nomedicamento não é exigida. Pelo contrário, se o teor desolventes residuais for superior ao nível recomendado, oensaio deve ser efectuado no medicamento para assegurar queo teor de solventes residuais foi conduzido a valoresadmissíveis durante a formulação. Os medicamentos devemigualmente ser submetidos a este ensaio sempre que umsolvente for utilizado durante o fabrico.

A presente nota explicativa não se aplica às novas substânciasactivas, excipientes ou medicamentos potenciais utilizadosnos estádios de desenvolvimento de pesquisa clínica, nem aosmedicamentos já comercializados.

A presente nota explicativa aplica-se a todas as formas farma-cêuticas e a todas as vias de administração. Teores elevados desolventes residuais são admissíveis em certos casos, porexemplo em tratamentos de curta duração (30 dias ou menos)ou em aplicações tópicas. Estes teores devem ser objecto deuma justificação caso a caso.

Para complementar as informações relativas aos solventesresiduais ver o anexo 2.

3. PRINCÍPIOS GERAIS

3.1. CLASSIFICAÇÃO DOS SOLVENTES RESIDUAIS EMFUNÇÃO DA AVALIAÇÃO DO RISCO

O International Program on Chemical Safety (IPCS) utiliza aexpressão «dose diária tolerável» (DDT) (em inglês TDI =tolerable daily intake) para descrever os limites de exposiçãoaos produtos químicos tóxicos. Para este mesmo conceito, aOMS e outras autoridades ou institutos (nacionais ouinternacionais) de saúde pública utilizam a expressão «dosediária admissível» (DDA) (em inglês ADI = acceptable dailyintake). A «exposição diária admissível» (EDA) (em inglêsPDE = Permitted daily intake) é a nova expressão consagradapara o presente documento, a qual permite evitar qualquerconfusão entre os diferentes valores de DDA para uma mesmasubstância.

Os solventes residuais referidos neste documento estãolistados no anexo 1 por nomes e estrutura, e foram avaliadosem função do risco que apresentam para a saúde humana.Subdividem-se em três classes:

Classe 1: Solventes a evitar.

Carcinogénios humanos conhecidos ou fortemente suspeitos,perigosos para o ambiente.

Classe 2: Solventes cuja utilização está submetida alimitações.

Carcinogénios animais não genotóxicos oueventuais agentes causadores de outros efeitostóxicos irreversíveis como a neurotoxicidade ou ateratogenicidade.

Solventes suspeitos de estarem na origem de outrosefeitos tóxicos importantes mas reversíveis.

Classe 3: Solventes com baixo potencial tóxico.

Solventes com baixo potencial tóxico para o homemnão sendo exigido qualquer limite em relação àexposição. Os solventes da classe 3 apresentamvalores de EDA iguais ou superiores a 50 mg.

3.2. MÉTODOS QUE PERMITEM ESTABELECER OSLIMITES DE EXPOSIÇÃO

O método utilizado para estabelecer os valores de EDA aossolventes residuais está apresentado no Anexo 3. Os resumosdos dados de toxicidade que serviram para estabelecer estesvalores estão publicados em Pharmeuropa, Vol. 9, nº 1, suple-mento do mês de Abril de 1997.

3.3. OPÇÕES QUE PERMITEM DESCREVER OS LIMITESDOS SOLVENTES DA CLASSE 2

Duas opções permitem fixar os limites que se aplicam aossolventes da classe 2.

Opção 1: Podem ser utilizados os limites de concentração(em ppm) indicados no quadro 2. Estes limites foram deter-minados com ajuda da expressão (1) a seguir apresentada e tomam como referência uma dose de 10 g administrada quoti-dianamente.

Concentração (ppm) = (1)

Neste caso o valor da EDA é indicado em mg/dia e a dose emg/dia.

Estes limites são considerados aceitáveis para todas assubstâncias, excipientes ou medicamentos. Em consequência,esta opção pode ser aplicada quando a dose diária édesconhecida ou variável. Se o conjunto dos excipientes e dassubstâncias activas de uma formulação satisfizerem aoslimites da opção 1 estes componentes podem ser utilizadosem quaisquer proporções. Não é necessário qualquer outrocálculo desde que a dose diária não ultrapasse 10 g. Osmedicamentos administrados em doses superiores a 10 g pordia devem ser considerados na opção 2.

Opção 2: Não se considera necessário que cada componentedo medicamento satisfaça aos limites indicados na opção 1. Ovalor da EDA, expresso em mg/dia, tal como se mostra noquadro 2, pode ser utilizado com a dose diária máxima conhe-cida e a equação (1), atrás apresentada, pode ser usada paradeterminar a concentração de solvente residual autorizadanum medicamento. Tais limites são considerados aceitáveis seficar demonstrado que a presença de solvente residual foi

1000 � EDA��

dose



5. Textos gerais

17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 580

reduzida ao mínimo possível. Os limites devem ser realistasem relação à precisão analítica, à capabilidade no decurso dofabrico e a uma variação razoável no processo de fabrico. Emsuma, os limites devem reflectir os padrões de fabrico actuais.

É possível utilizar a opção 2 adicionando as quantidades de sol-ventes residuais presentes em cada um dos componentes domedicamento. A soma das quantidades de solventes admissíveispor dia deve ser inferior à indicada pelo valor de EDA.

A título de exemplo, consideremos a aplicação das opções 1 e 2ao acetonitrilo contido num medicamento. A exposição diáriaadmissível ao acetonitrilo é de 4,1 mg/dia, por consequência olimite preconizado pela opção 1 é de 410 ppm. A quantidademáxima de medicamento administrada por dia é de 5,0 g eeste medicamento contém dois excipientes. A composição domedicamento e o cálculo do teor máximo em acetonitriloresidual estão apresentados no quadro seguinte:

Componente Quantidade na Teor em ExposiçãoFormulação acetonitrilo diária

Substância activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mgExcipiente 1 0,9 g 400 ppm 0,36 mgExcipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mgMedicamento 5,0 g 728 ppm 3,64 mg

O excipiente 1 satisfaz ao limite imposto pela opção 1, mas asubstância activa, o excipiente 2 e o medicamento nãocorrespondem às exigências deste limite. No entanto, omedicamento satisfaz ao limite da opção 2 (4,1 mg por dia) e,consequentemente, às recomendações desta nota explicativa.

Consideremos um segundo exemplo de acetonitrilo residual.A quantidade máxima de um medicamento administrada diaria-mente é de 5,0 g e este medicamento contém dois excipientes.A composição do medicamento e o cálculo do teor deacetonitrilo residual estão indicadas no quadro seguinte:

Componente Quantidade na Teor em ExposiçãoFormulação acetonitrilo diária

Substância activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mgExcipiente 1 0,9 g 2000 ppm 1,80 mgExcipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mgMedicamento 5,0 g 1016 ppm 5,08 mg

Neste caso, acontece que pela soma dos teores de cada consti-tuinte, o medicamento não respeita nem o limite da opção 1,nem o da opção 2. O fabricante pode então analisar o medica-mento com vista a saber se o processo de fabrico permitiu redu-zir o teor de acetonitrilo. Se o teor de acetonitrilo não foi redu-zido para o limite autorizado durante a formulação, o fabricantedeve tomar outras medidas para reduzir a quantidade de aceto-nitrilo no medicamento. Se todos estes procedimentos nãopermitirem a redução do teor de solvente residual, o fabricantepode, a título excepcional, relatar as medidas tomadas parareduzir o teor de solvente para o limite preconizado e apresen-tar uma análise avaliadora dos riscos e dos benefícios que justi-fiquem a utilização do medicamento com um teor de solventeresidual superior ao limite autorizado.

3.4. PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS

Os teores de solventes residuais são habitualmente determina-dos por técnicas cromatográficas, como, por exemplo, acromatografia em fase gasosa. Para determinar os teores desolventes residuais é conveniente aplicar, na medida do possível,os procedimentos harmonizados descritos nas farmacopeias.Em caso de impossibilidade, os fabricantes podem escolher umprocedimento analítico validado e apropriado a uma aplicaçãoparticular. Em presença de solventes exclusivamente da classe

3, pode utilizar-se um método não específico, como por exemploa perda por secagem. A validação dos métodos de determinação dos níveis de solventes residuais deve obedecer às normas ICHseguintes: Text of Analytical Procedures e Extension onValidation of Analytical Procedures.

3.5. DECLARAÇÃO DE CONFORMIDADE DOS LIMITES EMSOLVENTES RESIDUAIS

A fim de respeitar os critérios descritos nesta nota explicativa,os fabricantes de produtos farmacêuticos necessitam de infor-mações sobre os teores de solventes residuais contidos nosexcipientes e substâncias activas. As seguintes afirmações sãodadas como exemplos aceitáveis da informação que deve serfacultada pelos fornecedores de excipientes ou de substânciasactivas aos fabricantes de produtos farmacêuticos. Conforme ocaso, o fornecedor deve escolher uma das seguintes:

– provavelmente só estão presentes solventes da classe 3. Aperda por secagem é inferior a 0,5 por cento,

– provavelmente só estão presentes os solventes X, Y, … daclasse 2. Todos se encontram abaixo dos limites preconi-zados na opção 1. (Neste caso o fornecedor deve indicar onome dos solventes da classe 2 representados por X, Y, …),

– provavelmente só estão presentes os solventes X, Y, … daclasse 2 e solventes da classe 3. Os teores de solventes resi-duais da classe 2 encontram-se abaixo dos limites preconi-zados na opção 1 e os teores dos solventes residuais daclasse 3 são inferiores a 0,5 por cento.

Se solventes da classe 1 estiverem provavelmente presentes,devem ser identificados e quantificados. «Provavelmentepresente» refere-se simultaneamente ao solvente utilizado nopasso final do fabrico e aos solventes que são usados no decursodas etapas precedentes do fabrico e que não são removidossistematicamente recorrendo a um processo validado.

Se solventes da classe 2 ou classe 3 estiverem presentes emquantidade, respectivamente, superior ao limite da opção 1 ou superior a 0,5 por cento, devem ser identificados e quantificados.

4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS

4.1. SOLVENTES A EVITAR

Os solventes da classe 1 não devem ser utilizados no fabrico desubstâncias activas, excipientes e medicamentos devido à suatoxicidade inaceitável ou ao seu efeito nocivo no ambiente.Contudo, se a utilização destes solventes for incontornávelpara a produção de um medicamento que corresponda a umavanço terapêutico importante, os seus teores não devemultrapassar os valores apresentados no quadro 1, salvo excep-ção justificada.

O 1,1,1-tricloroetano está incluído no quadro 1 devido ao seuefeito nocivo sobre o ambiente. O limite assinalado de 1500 ppmestá fundamentado na avaliação dos dados de segurança.

QUADRO 1 – Solventes da classe 1 em produtos farmacêuticos(solventes que devem ser evitados)

SolventeConcentração

Nocividadelimite (ppm)

Benzeno 2 CarcinogénicoTetracloreto de carbono 4 Tóxico e nocivo

para o ambiente1,2-Dicloroetano 5 Tóxico1,1-Dicloroetano 8 Tóxico1,1,1-Tricloroetano 1500 Nocivo para o ambiente



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4.2. SOLVENTES DE UTILIZAÇÃO LIMITADA

Os solventes apresentados no quadro 2 devem estar limitadosnos produtos farmacêuticos, devido à sua toxicidade intrínseca.Os valores das EDA são apresentados com a aproximação de 0,1 mg/dia e as concentrações são apresentadas com a aproxi-mação de 10 ppm. Os valores apresentados não reflectem neces-sariamente a precisão analítica da determinação. A precisão deveser calculada e fazer parte da validação do método.

QUADRO 2 – Solventes da classe 2 em produtos farmacêuticos

Solvente EDA (mg/dia) Concentração limite (ppm)

Acetonitrilo 4,1 410Ciclo-hexano 38,8 3880Clorobenzeno 3,6 360Clorofórmio 0,6 601,2-Dicloroeteno 18,7 1870Diclorometano 6,0 600N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090N,N-Dimetilformamida 8,8 8801,2-Dimetoxietano 1,0 1001,4-Dioxano 3,8 380Etilenoglicol 6,2 6202-Etoxietanol 1,6 160Formamida 2,2 220Hexano 2,9 290Metanol 30,0 3000Metilbutilcetona 0,5 50Metilciclo-hexano 11,8 1180N-Metilpirrolidona 5,3 5302-Metoxietanol 0,5 50Nitrometano 0,5 50Piridina 2,0 200Sulfolano 1,6 160Tetra-hidrofurano 7,2 720Tetralina 1,0 100Tolueno 8,9 8901,1,2-Tricloroetano 0,8 80Xileno* 21,7 2170

* Habitualmente 60 por cento de m-xileno, 14 por cento de p-xileno, 9 porcento de o-xileno com 17 por cento de etilbenzeno.

4.3. SOLVENTES COM BAIXO POTENCIAL TÓXICO

Os solventes da classe 3 (apresentados no quadro 3) podemser considerados como os de menor toxicidade e de menorrisco para a saúde humana. A classe 3 não inclui qualquersolvente que se saiba ser nocivo para a saúde humana noslimites autorizados para os produtos farmacêuticos. Contudo,não existem estudos de toxicidade a longo prazo nem estudosde carcinogenicidade para muitos dos solventes da classe 3.Os dados disponíveis indicam que eles apresentam baixatoxicidade em estudos de toxicidade aguda ou de curtaduração e resultados negativos nos estudos de genotoxicidade.O limite admissível, sem justificação particular, para ossolventes desta classe é inferior ou igual a 50 mg/dia(correspondendo a 5000 ppm ou a 0,5 por cento de acordocom a opção 1). Quantidades superiores à referida podemtambém ser aceites desde que sejam realistas em relação àcapabilidade de fabrico e às boas práticas de fabrico.

QUADRO 3 – Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas BPF ou outros requisitos de qualidade

Acetato de butilo EtanolAcetato de etilo Éter etílicoAcetato de isobutilo terc-butilmetiléter

QUADRO 3 – Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas BPF ou outros requisitos de qualidade (continuação)

Acetato de isopropilo EtilmetilcetonaAcetato de metilo Formato de etiloAcetato de propilo HeptanoAcetona IsobutilmetilcetonaÁcido acético 3-Metil-l-butanolÁcido fórmico 2-Metil-l-propanolAnisol Pentano1-Butanol 1-Pentanol2-Butanol 1-PropanolCumeno 2-PropanolDimetilsulfóxido

4.4. SOLVENTES PARA OS QUAIS NÃO FORAM ENCON-TRADOS DADOS TOXICOLÓGICOS ADEQUADOS

Os solventes seguintes (quadro 4) podem também ter interessepara os fabricantes de excipientes, substâncias activas ou demedicamentos. Contudo, não foram ainda encontrados dadostoxicológicos adequados que permitam determinar uma EDA.Os fabricantes devem fornecer uma justificação relativa aosníveis residuais destes solventes nos produtos farmacêuticos.

QUADRO 4 – Solventes para os quais não foram encontrados dadostoxicológicos adequados

Ácido tricloracético Éter de petróleoÁcido trifluoracético Éter isopropílico1,1-Dietoxipropano Isoctano1,1-Dimetoxietano Isopropilmetilcetona2,2-Dimetoxipropano Metiltetra-hidrofurano

GLOSSÁRIO

Carcinogénios genotóxicos: Carcinogénios que produzemcancro por afectarem genes ou cromossomas.

LOEL: Abreviatura de «lowest-observed effect level».

Lowest-observed effect level: A menor dose de substância que,num estudo ou grupo de estudos, produz aumentos biologica-mente significativos na frequência ou gravidade de qualquerefeito nos animais ou humanos expostos.

Factor de modificação: Um factor determinado por umtoxicologista profissional e aplicado aos resultados de umbioensaio para obter a relação com os dados humanos nascondições de segurança satisfatórias.

Neurotoxicidade: A capacidade de uma substância paraprovocar efeitos indesejáveis sobre o sistema nervoso.

NOEL: Abreviação de «no-observed-effect level»

No-observed-effect level: A dose mais elevada de substânciapara a qual não se verificam aumentos biologicamentesignificativos da frequência ou da gravidade de qualquer efeitono homem ou nos animais expostos.

EDA: Abreviatura de exposição diária admissível (em inglêsPDE = «permitted daily exposure»).

Exposição diária admissível: a dose máxima diária de solventeresidual admitida num produto farmacêutico.

Toxicidade reversível: Ocorrência de efeitos nocivos causadospor uma substância e que desaparecem uma vez que cesse aexposição à substância.

Carcinogénio humano fortemente suspeito: Uma substância



5. Textos gerais

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para a qual as provas epidemiológicas de carcinogénese nãopuderam ser estabelecidas, ainda que existam dados genotóxicospositivos e provas evidentes de carcinogénese em roedores.

Teratogenicidade: Aparecimento de malformações estruturaisno decurso do desenvolvimento fetal quando se administrauma substância durante a gravidez.



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ANEXO 1. LISTA DOS SOLVENTES INCLUÍDOS NESTA NOTA EXPLICATIVA

Solvente Outras Designações Fórmula Química Classe

acetato de etilo éster etílico do ácido acético CH3COOCH2 CH3 Classe 3acetona 2-propanona CH3COCH3 Classe 3acetonitrilo CH3CN Classe 2ácido acético ácido etanóico CH3COOH Classe 3ácido fórmico HCOOH Classe 3acetato de butilo éster butílico do ácido acético CH3COO(CH2)3 CH3 Classe 3acetato de isobutilo éster isobutílico do ácido acético CH3COOCH2CH(CH3)2 Classe 3acetato de isopropilo éster isopropílico do ácido acético CH3COOCH(CH3)2 Classe 3acetato de metilo éster metílico do ácido acético CH3COOCH3 Classe 3acetato de propilo éster propílico do ácido acético CH3COOCH2CH2CH3 Classe 3

anisol metoxibenzeno Classe 3

benzeno benzol Classe 1

1-butanol álcool n-butílico ou butan-1-ol CH3(CH2)3OH Classe 32-butanol álcool sec-butílico ou butan-2-ol CH3CH2CH(OH)CH3 Classe 3terc-butilmetiléter 2-metoxi-2-metilpropano (CH3)3COCH3 Classe 3

ciclo-hexano hexametileno Classe 2

clorobenzeno Classe 2

clorofórmio triclorometano CHCI3 Classe 2

cumeno isopropilbenzeno (1-metiletil)benzeno Classe 3

1,2-dicloroetano sim-dicloroetano, dicloreto de etileno, CH2CICH2Cl Classe 1cloreto de etileno

1,1-dicloroeteno 1,1-dicloroetileno, cloreto de vinilideno H2C = CCl2 Classe 1

1,2-dicloroeteno 1,2-dicloroetileno, dicloreto de acetileno CIHC = CHCl Classe 2Diclorometano cloreto de metileno CH2Cl2 Classe 2N,N-dimetilacetamida DMA CH3CON(CH3)2 Classe 2N,N-dimetilformamida DMF HCON(CH3)2 Classe 2dimetilsulfóxido Metilsulfinilmetano, sulfóxido de metilo (CH3)2SO Classe 3

DMSO

1,2-dimetoxietano Éter dimetílico do etilenoglicol H3COCH2CH2OCH3 Classe 2monoglimadimetilcelossolve

1,4-dioxano p-dioxano1,4-dioxano Classe 2

etanol álcool etílico CH3CH2OH Classe 3

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5. Textos gerais

ANEXO 1. LISTA DOS SOLVENTES INCLUÍDOS NESTA NOTA EXPLICATIVA (continuação)

Solvente Outras Designações Fórmula Química Classe

éter etílico éter dietílico ou etoxietano ou 1,1’-oxibisetano CH3CH2OCH2CH3 Classe 3etilenoglicol 1,2-di-hidroxietano ou 1,2-etanodiol HOCH2CH2OH Classe 22-etoxietanol celossolve CH3CH2OCH2CH2OH Classe 2formamida metanamida HCONH2 Classe 2formato de etilo éster etílico do ácido fórmico HCOOCH2CH3 Classe 3heptano n-heptano CH3(CH2)5CH3 Classe 3hexano n-hexano CH3(CH2)4CH3 Classe 3metanol álcool metílico CH3OH Classe 23-metil-1-butanol álcool isoamílico (CH3)2CHCH2CH2OH Classe 3

álcool isopentílico3-metilbutan-1-ol

metilbutilcetona 2-hexanona CH3(CH2)3COCH3 Classe 2hexan-2-ona

metilciclo-hexano ciclo-bexilmetano Classe 2

metiletilcetona 2-butanona CH3CH2COCH3 Classe 3MEKbutan-2-ona

metilisobutilcetona 4-metilpentan-2-ona CH3COCH2CH(CH3)2

4-metil-2-pentanonaMIBK

2-metil-1-propanol álcool isobutílico (CH3)2CHCH2OH Classe 32-metilpropan-1-ol

N-metilpirrolidona 1-metil-2-pirrolidona Classe 21-metilpirrolidin-2-dona

2-metoxietanol metilcelossolve CH3OCH2CH2OH Classe 2nitrometano CH3NO2 Classe 2pentano n-pentano CH3(CH2)3CH3 Classe 31 -pentanol álcool amílico CH3(CH2)3CH2OH Classe 3

pentan-1-olálcool pentílico

piridina Classe 2

1-propanol álcool propílico CH3CH2CH2OH Classe 3propan-1-ol

2-propanol álcool isopropílico (CH3)2CHOH Classe 3propan-2-ol

sulfolano 1,1-dióxido de tetra-hidrotiofeno Classe 2

tetracloreto de carbono tetraclorometano CCl4 Classe 1

tetra-hidrofurano óxido de tetrametileno Classe 2oxaciclopentano

tetralina 1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno Classe 2

tolueno metilbenzeno Classe 2

1,1,1-tricloroetano metilclorofórmio CH3CCl3 Classe 11,1,2-tricloroeteno tricloroeteno HClC = CCl2 Classe 2

xileno(*) dimetilbenzenoxilol Classe 2

(*) Habitualmente 60% m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno com 17% de etilbenzeno.

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ANEXO 2. INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES

A2.1. REGULAMENTAÇÃO AMBIENTAL PARA OSSOLVENTES ORGÂNICOS VOLÁTEIS

Um certo número de solventes residuais, correntementeutilizados no fabrico de produtos farmacêuticos, éconsiderado como substâncias tóxicas nas monografias EHC(Environmental Health Criteria) relativas aos critérios desaúde e de ambiente e no sistema IRIS (Integrated RiskInformation System). Faz parte dos objectivos dos organis-mos como o International Programme on Chemical Safety(IPCS), o United States Environmental Protection Agency(USEPA) e o United States Food and Drug Administration(USFDA), a determinação dos teores de exposição admissíveis.O objectivo desta determinação é proteger a saúde pública epreservar o ambiente contra os eventuais efeitos nocivosresultantes de uma exposição prolongada a estas substâncias.Os métodos utilizados para a avaliação dos limites máximosde exposição sem causar efeitos nocivos assentam geralmenteem estudos conduzidos a longo prazo. Se não se dispuser deresultados de estudos a longo prazo, podem utilizar-se osresultados obtidos em estudos de curto prazo, com a condiçãode certos parâmetros serem modificados (por exemplo, autilização de factores de segurança mais elevados). Acontribuição aqui descrita baseia-se numa exposição a longoprazo ou à exposição durante o tempo de vida da populaçãono seu meio ambiente, ou seja, ao ar ambiente, àalimentação, à água potável e a outros meios.

A2.2. SOLVENTES RESIDUAIS NOS PRODUTOS FAR-MACÊUTICOS

Os limites de exposição contidos nesta nota explicativa sãodefinidos a partir de métodos e dados de toxicidadeapresentados nas monografias ECH e IRIS. Contudo, aoestabelecer estes limites, deve ter-se em conta algunspostulados relativos aos resíduos dos solventes utilizados nasíntese e no fabrico de produtos farmacêuticos. Os postuladossão os seguintes:

1) Apenas os pacientes (e não a população em geral) utilizamprodutos farmacêuticos com o objectivo de se tratarem ouprevenir as infecções e doenças.

2) Para a maior parte dos produtos farmacêuticos, o princípiode uma exposição durante toda a vida não é necessária, maspode servir de hipótese de trabalho com vista à redução deriscos para a saúde.

3) Os solventes residuais entram inevitavelmente na fabricaçãodos produtos farmacêuticos e fazem frequentemente parteintegrante dos medicamentos.

4) Excepção feita para casos muito particulares, o teor emsolventes residuais não deve ultrapassar os limites prescritos.

5) Os resultados dos estudos toxicológicos utilizados paradeterminar os teores aceitáveis de solventes residuais devemter origem em protocolos experimentais apropriados, taiscomo os descritos pela OCDE e pelo «Red Book» da FDA.

ANEXO 3. MÉTODOS RELATIVOS AO ESTABELECIMENTODE LIMITES DE EXPOSIÇÃO

O método de Gaylor-Kodell, relativo à avaliação do risco(Gaylor, D. W. and Kodell, R. L.: Linear Interpolation algo-rithm for low dose assessmerzt of toxic substance, J. Environ.Pathology, 4,305,1980), está apropriado para os solventescarcinogénicos da classe 1. No estabelecimento de limites deexposição, apenas os dados de carcinogenicidade fiáveis

podem justificar uma extrapolação por aplicação de modelosmatemáticos. Os limites de exposição dos solventes da classe1 podem ser determinados combinando factores de segurançaelevados (ex. 10 000 a 1000 000) e os dados de no-observed--effect level (NOEL). A detecção e quantificação destessolventes deve responder aos últimos desenvolvimentos emmatéria de técnicas analíticas.

Os teores de exposição aceitáveis apresentados nesta notaexplicativa para os solventes da classe 2 foram estabelecidosapós calcular os valores de EDA, de acordo com os procedi-mentos que permitem estabelecer os limites aplicáveis aosprodutos farmacêuticos (Pharmacopeia Forum, Nov-Dez1989) e o método adoptado pela IPCS para avaliação do riscoapresentado pelas substâncias químicas (Assessing HumanHealth Risk of Chemicals-Environmental Health Criteria170, WHO, Geneve, 1994). Estes métodos são semelhantes aosutilizados pela EPA (ÍRIS), FDA (Red Book) e por outrosorganismos. O método é aqui apresentado para permitir umamelhor compreensão da origem dos valores de EDA. Não énecessário efectuar estes cálculos para utilizar os valores deEDA indicados no ponto 4 do presente documento. A EDA écalculada a partir do no-observed-effect level (NOEL), ouainda do lowest-observed-effect level (LOEL), obtidos noestudo mais relevante realizado com animais, com a ajuda daexpressão:

EDA � (1)

Preferencialmente a EDA deve ser derivada do NOEL. Se oNOEL não puder ser obtido, deve utilizar-se o LOEL. Osfactores de modificação aqui propostas, que permitem aplicaraos seres humanos as dados obtidos, assemelham-se aos«factores de incerteza» utilizados nas EHC (EnvironmentalHealth Criteria 170, WHO, Geneve, 1994), e aos «factores demodificação» ao «factores de segurança» mencionados noPharmacopeial Forum. A hipótese de uma exposição sistémicade 100% é utilizada em todos as cálculos, sem distinção dasdiferentes vias de administração.

Os factores de modificação são as seguintes:

F1 = um factor que permite a extrapolação entre as espécies:F1 = 2 para extrapolar do cão para o homemF1 = 2,5 para extrapolar do coelho para a homemF1 = 3 para extrapolar da macaco para a homemF1 = 5 para extrapolar da rato para a homemF1 = 10 para extrapolar dos outros animais para o homemF1 = 12 para extrapolar do ratinho para o homem.

F1 permite ter em conta as relações comparativas superfície//massa corporal para as espécies em questão e para o homem.

A superfície (S) é calculada com ajuda da expressão seguinte:

S = k M0,67 (2)

em que M corresponde à massa corporal e k é uma constantecujo valor está fixado em 10. As massas corporais utilizadasna equação estão no quadro A3.1, apresentado mais à frente.

F2 = 10 e representa o factor que tem em conta a variabilidade entreos indivíduos. Em regra, um factor de 10 está indicado para oconjunto dos solventes orgânicos. Este valor é aplicado siste-maticamente na presente nota.

F3 = um factor variável que corresponde aos estudos de toxicidaderelativos a uma exposição a curto prazo:F3 = 1, para os estudos cuja duração corresponde pelo menos a

um tempo de semi-vida (1 ano para os roedores oucoelhos; 7 anos para os gatos, cães e macacos)

NOEL � Ajuste ponderal��F1 � F2 � F3 � F4 � F5



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F3 = 1, para os estudos relativos à reprodução, no decurso dosquais está coberto todo o período da organogénese

F3 = 2, para um estudo de 6 meses com roedores ou de 3,5anos com não roedores

F3 = 5, para um estudo de 3 meses com roedores ou de 2 anoscom não roedores

F3 = 10, para os estudos de curta duração.

Quando os estudos têm uma duração que se situa entre oinício e o fim de períodos acima determinados, utiliza-se ofactor mais elevado, por exemplo, um factor de 2 para umestudo de 9 meses com roedores.

F4 = um factor que pode ser utilizado em todos os casos de toxici-dade elevada, por exemplo carcinogenicidade não genotóxica,neurotoxicidade ou teratogenicidade. Nos estudos de toxicidadeligada à reprodução devem utilizar-se os factores indicados aseguir:F4 = 1, para a toxicidade associada ao feto ou à mãeF4 = 5, para a toxicidade associada ao feto sem a mãeF4 = 5, para um efeito teratogénico com efeito tóxico para a mãeF4 = 10, para um efeito teratogénico sem efeito tóxico para a mãe.

F5 = um factor variável que pode ser utilizado se a dose não efectivanão foi estabelecida.

Quando apenas se conhece o valor LOEL, pode utilizar-se umfactor que pode ir até 10, em função do grau de toxicidade.

O ajustamento do peso é efectuado assumindo o valorarbitrário de 50 Kg para a massa corporal de um adulto dosexo masculino ou feminino. Este valor, relativamente baixo,oferece uma margem de segurança acrescida em relação aopeso padrão, 60 ou 70 kg, frequentemente utilizado nestetipo de cálculo. Para os adultos com menos de 50 kg, consi-dera-se que estão protegidos pela acumulação dos factores desegurança utilizados na determinação da EDA. Se o solventeestiver presente num medicamento exclusivamente para usopediátrico, deve proceder-se à correcção do peso, ajustando-opara o valor inferior adequado.

Para ilustrar a aplicação desta equação, tomemos, a título deexemplo, um estudo de toxicidade do acetonitrilo no rato, queé apresentado no suplemento de Abril de 1997 de Pharmeuropa,vol. 9, nº 1, página S24 (versão inglesa). O valor de NOEL éestimado 50,7 mg kg–1 dia–1. Neste caso concreto, o valor daEDA é calculado como se segue:

EDA = 50,7 mg kg–1 dia–1 � 50 kg/12 � 10 � 5 � 1 � 1EDA = 4,22 mg dia–1

Neste exemplo,

F1 = 12, para ter em conta a extrapolação do rato para o homemF2 = 10, para ter em conta as diferenças entre os indivíduosF3 = 5, uma vez que a duração do estudo está limitada a apenas

13 semanasF4 = 1, porque não se verifica qualquer toxicidade graveF5 = 1, porque foi determinada a dose não efectiva

QUADRO A3.1 Valores utilizados para os cálculos apresentadosneste documento

Massa corporal do rato 425 gMassa corporal de uma rata em gestação 330 gMassa corporal do ratinho 28 gMassa corporal de uma ratinha em gestação 30 gMassa corporal do cobaio 500 gMassa corporal do macaco Rhesus 2,5 kgMassa corporal do coelho (em gestação ou não) 4 kgMassa corporal do cão beagle 11,5 kgVolume respiratório do rato 290 1/diaVolume respiratório do ratinho 43 1/diaVolume respiratório do coelho 1440 1/diaVolume respiratório do cobaia 430 1/diaVolume respiratório do homem 28800 1/diaVolume respiratório do cão 9000 1/diaVolume respiratório do macaco 1150 1/diaConsumo de água do ratinho 5 ml/diaConsumo de água do rato 30 ml/diaConsumo alimentar do rato 30 g/dia

No que se refere às concentrações de gás utilizadas nosestudos de inalação, a equação dos gases perfeitos, PV = nRT,permite converter ppm em mg/l ou mg/m3. A título deexemplo, o estudo de toxicidade reprodutiva do rato porinalação de tetracloreto de carbono (massa molecular 153,84)é apresentado no Suplemento de Abril de 1997 dePharmaeuropa, vol. 9, nº 1, página S9.

n/V = P/RT = 300 � 10–6 atm � 153840 mg mol–1/0,082 atm K–1

mol–1 � 298K = 46,15 mg/24,45 1 = 1,89 mg/l

Foi utilizada a correspondência 1 000 1 = 1 m3, para convertero resultado em mg/m3.



5. Textos gerais

17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 586


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5.5. TABELASALCOOMÉTRICAS

5.5. Tabelas alcoométricas ................................................ 589

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 587

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5.5. TABELAS ALCOOMÉTRICAS

A fórmula geral fixada pelo Conselho das ComunidadesEuropeias nas suas Directivas de 27 de Julho de 1976 sobre aalcoometria serviu de base para estabelecer as tabelasseguintes.

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

0,0 0,0 998,200,1 0,08 998,050,2 0,16 997,900,3 0,24 997,750,4 0,32 997,590,5 0,40 997,440,6 0,47 997,290,7 0,55 997,140,8 0,63 996,990,9 0,71 996,85

1,0 0,79 996,701,1 0,87 996,551,2 0,95 996,401,3 1,03 996,251,4 1,11 996,111,5 1,19 995,961,6 1,27 995,811,7 1,35 995,671,8 1,43 995,521,9 1,51 995,38

2,0 1,59 995,232,1 1,67 995,092,2 1,75 994,942,3 1,82 994,802,4 1,90 994,662,5 1,98 994,512,6 2,06 994,372,7 2,14 994,232,8 2,22 994,092,9 2,30 993,95

3,0 2,38 993,813,1 2,46 993,663,2 2,54 993,523,3 2,62 993,383,4 2,70 993,243,5 2,78 993,113,6 2,86 992,973,7 2,94 992,833,8 3,02 992,693,9 3,10 992,55

4,0 3,18 992,414,1 3,26 992,284,2 3,34 992,144,3 3,42 992,004,4 3,50 991,874,5 3,58 991,734,6 3,66 991,594,7 3,74 991,464,8 3,82 991,324,9 3,90 991,19

5,0 3,98 991,065,1 4,06 990,925,2 4,14 990,79


5.5. Tabelas alcoométricas

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

5,3 4,22 990,655,4 4,30 990,525,5 4,38 990,395,6 4,46 990,265,7 4,54 990,125,8 4,62 989,995,9 4,70 989,86

6,0 4,78 989,736,1 4,86 989,606,2 4,95 989,476,3 5,03 989,346,4 5,11 989,216,5 5,19 989,086,6 5,27 988,956,7 5,35 988,826,8 5,43 988,696,9 5,51 988,56

7,0 5,59 988,437,1 5,67 988,307,2 5,75 988,187,3 5,83 988,057,4 5,91 987,927,5 5,99 987,797,6 6,07 987,677,7 6,15 987,547,8 6,23 987,427,9 6,32 987,29

8,0 6,40 987,168,1 6,48 987,048,2 6,56 986,918,3 6,64 986,798,4 6,72 986,668,5 6,80 986,548,6 6,88 986,428,7 6,96 986,298,8 7,04 986,178,9 7,12 986,05

9,0 7,20 985,929,1 7,29 985,809,2 7,37 985,689,3 7,45 985,569,4 7,53 985,449,5 7,61 985,319,6 7,69 985,199,7 7,77 985,079,8 7,85 984,959,9 7,93 984,83

10,0 8,01 984,7110,1 8,10 984,5910,2 8,18 984,4710,3 8,26 984,3510,4 8,34 984,2310,5 8,42 984,1110,6 8,50 983,9910,7 8,58 983,8810,8 8,66 983,7610,9 8,75 983,64

11,0 8,83 983,5211,1 8,91 983,4011,2 8,99 983,29

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 589

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

11,3 9,07 983,1711,4 9,15 983,0511,5 9,23 982,9411,6 9,32 982,8211,7 9,40 982,7011,8 9,48 982,5911,9 9,56 982,47

12,0 9,64 982,3512,1 9,72 982,2412,2 9,80 982,1212,3 9,89 982,0112,4 9,97 981,8912,5 10,05 981,7812,6 10,13 981,6712,7 10,21 981,5512,8 10,29 981,4412,9 10,37 981,32

13,0 10,46 981,2113,1 10,54 981,1013,2 10,62 980,9813,3 10,70 980,8713,4 10,78 980,7613,5 10,87 980,6413,6 10,95 980,5313,7 11,03 980,4213,8 11,11 980,3113,9 11,19 980,19

14,0 11,27 980,0814,1 11,36 979,9714,2 11,44 979,8614,3 11,52 979,7514,4 11,60 979,6414,5 11,68 979,5214,6 11,77 979,4114,7 11,85 979,3014,8 11,93 979,1914,9 12,01 979,08

15,0 12,09 978,9715,1 12,17 978,8615,2 12,26 978,7515,3 12,34 978,6415,4 12,42 978,5315,5 12,50 978,4215,6 12,59 978,3115,7 12,67 978,2015,8 12,75 978,0915,9 12,83 977,98

16,0 12,91 977,8716,1 13,00 977,7616,2 13,08 977,6516,3 13,16 977,5516,4 13,24 977,4416,5 13,32 977,3316,6 13,41 977,2216,7 13,49 977,1116,8 13,57 977,0016,9 13,65 976,89

17,0 13,74 976,7917,1 13,82 976,6817,2 13,90 976,57

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

17,3 13,98 976,4617,4 14,07 976,3517,5 14,15 976,2517,6 14,23 976,1417,7 14,31 976,0317,8 14,40 975,9217,9 14,48 975,81

18,0 14,56 975,7118,1 14,64 975,6018,2 14,73 975,4918,3 14,81 975,3818,4 14,89 975,2818,5 14,97 975,1718,6 15,06 975,0618,7 15,14 974,9518,8 15,22 974,8518,9 15,30 974,74

19,0 15,39 974,6319,1 15,47 974,5219,2 15,55 974,4219,3 15,63 974,3119,4 15,72 974,2019,5 15,80 974,0919,6 15,88 973,9919,7 15,97 973,8819,8 16,05 973,7719,9 16,13 973,66

20,0 16,21 973,5620,1 16,30 973,4520,2 16,38 973,3420,3 16,46 973,2420,4 16,55 973,1320,5 16,63 973,0220,6 16,71 972,9120,7 16,79 972,8020,8 16,88 972,7020,9 16,96 972,59

21,0 17,04 972,4821,1 17,13 972,3721,2 17,21 972,2721,3 17,29 972,1621,4 17,38 972,0521,5 17,46 971,9421,6 17,54 971,8321,7 17,62 971,7321,8 17,71 971,6221,9 17,79 971,51

22,0 17,87 971,4022,1 17,96 971,2922,2 18,04 971,1822,3 18,12 971,0822,4 18,21 970,9722,5 18,29 970,8622,6 18,37 970,7522,7 18,46 970,6422,8 18,54 970,5322,9 18,62 970,42

23,0 18,71 970,3123,1 18,79 970,2023,2 18,87 970,09



5. Textos gerais

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 590

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

23,3 18,96 969,9823,4 19,04 969,8723,5 19,13 969,7623,6 19,21 969,6523,7 19,29 969,5423,8 19,38 969,4323,9 19,46 969,32

24,0 19,54 969,2124,1 19,63 969,1024,2 19,71 968,9924,3 19,79 968,8824,4 19,88 968,7724,5 19,96 968,6624,6 20,05 968,5524,7 20,13 968,4324,8 20,21 968,3224,9 20,30 968,21

25,0 20,38 968,1025,1 20,47 967,9925,2 20,55 967,8725,3 20,63 967,7625,4 20,72 967,6525,5 20,80 967,5325,6 20,88 967,4225,7 20,97 967,3125,8 21,05 967,1925,9 21,14 967,08

26,0 21,22 966,9726,1 21,31 966,8526,2 21,39 966,7426,3 21,47 966,6226,4 21,56 966,5126,5 21,64 966,3926,6 21,73 966,2826,7 21,81 966,1626,8 21,90 966,0526,9 21,98 965,93

27,0 22,06 965,8127,1 22,15 965,7027,2 22,23 965,5827,3 22,32 965,4627,4 22,40 965,3527,5 22,49 965,2327,6 22,57 965,1127,7 22,65 964,9927,8 22,74 964,8827,9 22,82 964,76

28,0 22,91 964,6428,1 22,99 964,5228,2 23,08 964,4028,3 23,16 964,2828,4 23,25 964,1628,5 23,33 964,0428,6 23,42 963,9228,7 23,50 963,8028,8 23,59 963,6828,9 23,67 963,56

29,0 23,76 963,4429,1 23,84 963,3229,2 23,93 963,20

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

29,3 24,01 963,0729,4 24,10 962,9529,5 24,18 962,8329,6 24,27 962,7129,7 24,35 962,5829,8 24,44 962,4629,9 24,52 962,33

30,0 24,61 962,2130,l 24,69 962,0930,2 24,78 961,9630,3 24,86 961,8430,4 24,95 961,7130,5 25,03 961,5930,6 25,12 961,4630,7 25,20 961,3330,8 25,29 961,2130,9 25,38 961,08

31,0 25,46 960,9531,1 25,55 960,8231,2 25,63 960,7031,3 25,72 960,5731,4 25,80 960,4431,5 25,89 960,3131,6 25,97 960,1831,7 26,06 960,0531,8 26,15 959,9231,9 26,23 959,79

32,0 26,32 959,6632,1 26,40 959,5332,2 26,49 959,4032,3 26,57 959,2732,4 26,66 959,1432,5 26,75 959,0132,6 26,83 958,8732,7 26,92 958,7432,8 27,00 958,6132,9 27,09 958,47

33,0 27,18 958,3433,1 27,26 958,2033,2 27,35 958,0733,3 27,44 957,9433,4 27,52 957,8033,5 27,61 957,6633,6 27,69 957,5333,7 27,78 957,3933,8 27,87 957,2633,9 27,95 957,12

34,0 28,04 956,9834,1 28,13 956,8434,2 28,21 956,7034,3 28,30 956,5734,4 28,39 956,4334,5 28,47 956,2934,6 28,56 956,1534,7 28,65 956,0134,8 28,73 955,8734,9 28,82 955,73

35,0 28,91 955,5935,1 28,99 955,4535,2 29,08 955,30



5. T

exto

s ge

rais

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 591

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

35,3 29,17 955,1635,4 29,26 955,0235,5 29,34 954,8835,6 29,43 954,7335,7 29,52 954,5935,8 29,60 954,4435,9 29,69 954,30

36,0 29,78 954,1536,1 29,87 954,0136,2 29,95 953,8636,3 30,04 953,7236,4 30,13 953,5736,5 30,21 953,4236,6 30,30 953,2836,7 30,39 953,1336,8 30,48 952,9836,9 30,56 952,83

37,0 30,65 952,6937,1 30,74 952,5437,2 30,83 952,3937,3 30,92 952,2437,4 31,00 952,0937,5 31,09 951,9437,6 31,18 951,7937,7 31,27 951,6337,8 31,35 951,4837,9 31,44 951,33

38,0 31,53 951,1838,1 31,62 951,0238,2 31,71 950,8738,3 31,79 950,7238,4 31,88 950,5638,5 31,97 950,4138,6 32,06 950,2538,7 32,15 950,1038,8 32,24 949,9438,9 32,32 949,79

39,0 32,41 949,6339,1 32,50 949,4739,2 32,59 949,3239,3 32,68 949,1639,4 32,77 949,0039,5 32,86 948,8439,6 32,94 948,6839,7 33,03 948,5239,8 33,12 948,3739,9 33,21 948,21

40,0 33,30 948,0540,1 33,39 947,8840,2 33,48 947,7240,3 33,57 947,5640,4 33,66 947,4040,5 33,74 947,2440,6 33,83 947,0840,7 33,92 946,9140,8 34,01 946,7540,9 34,10 946,58

41,0 34,19 946,4241,1 34,28 946,2641,2 34,37 946,09

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

41,3 34,46 945,9341,4 34,55 945,7641,5 34,64 945,5941,6 34,73 945,4341,7 34,82 945,2641,8 34,91 945,0941,9 35,00 944,93

42,0 35,09 944,7642,1 35,18 944,5942,2 35,27 944,4242,3 35,36 944,2542,4 35,45 944,0842,5 35,54 943,9142,6 35,63 943,7442,7 35,72 943,5742,8 35,81 943,4042,9 35,90 943,23

43,0 35,99 943,0643,1 36,08 942,8843,2 36,17 942,7143,3 36,26 942,5443,4 36,35 942,3743,5 36,44 942,1943,6 36,53 942,0243,7 36,62 941,8443,8 36,71 941,6743,9 36,80 941,49

44,0 36,89 941,3244,1 36,98 941,1444,2 37,07 940,9744,3 37,16 940,7944,4 37,25 940,6144,5 37,35 940,4344,6 37,44 940,2644,7 37,53 940,0844,8 37,62 939,9044,9 37,71 939,72

45,0 37,80 939,5445,1 37,89 939,3645,2 37,98 939,1845,3 38,08 939,0045,4 38,17 938,8245,5 38,26 938,6445,6 38,35 938,4645,7 38,44 938,2845,8 38,53 938,1045,9 38,62 937,91

46,0 38,72 937,7346,1 38,81 937,5546,2 38,90 937,3646,3 38,99 937,1846,4 39,08 937,0046,5 39,18 936,8146,6 39,27 936,6346,7 39,36 936,4446,8 39,45 936,2646,9 39,54 936,07

47,0 39,64 935,8847,1 39,73 935,7047,2 39,82 935,51



5. Textos gerais

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 592

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

47,3 39,91 935,3247,4 40,00 935,1447,5 40,10 934,9547,6 40,19 934,7647,7 40,28 934,5747,8 40,37 934,3847,9 40,47 934,19

48,0 40,56 934,0048,1 40,65 933,8148,2 40,75 933,6248,3 40,84 933,4348,4 40,93 933,2448,5 41,02 933,0548,6 41,12 932,8648,7 41,21 932,6748,8 41,30 932,4748,9 41,40 932,28

49,0 41,49 932,0949,1 41,58 931,9049,2 41,68 931,7049,3 41,77 931,5149,4 41,86 931,3149,5 41,96 931,1249,6 42,05 930,9249,7 42,14 930,7349,8 42,24 930,5349,9 42,33 930,34

50,0 42,43 930,1450,1 42,52 929,9550,2 42,61 929,7550,3 42,71 929,5550,4 42,80 929,3550,5 42,90 929,1650,6 42,99 928,9650,7 43,08 928,7650,8 43,18 928,5650,9 43,27 928,36

51,0 43,37 928,1651,1 43,46 927,9651,2 43,56 927,7751,3 43,65 927,5751,4 43,74 927,3651,5 43,84 927,1651,6 43,93 926,9651,7 44,03 926,7651,8 44,12 926,5651,9 44,22 926,36

52,0 44,31 926,1652,1 44,41 925,9552,2 44,50 925,7552,3 44,60 925,5552,4 44,69 925,3552,5 44,79 925,1452,6 44,88 924,9452,7 44,98 924,7352,8 45,07 924,5352,9 45,17 924,32

53,0 45,26 924,1253,1 45,36 923,9153,2 45,46 923,71

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

53,3 45,55 923,5053,4 45,65 923,3053,5 45,74 923,0953,6 45,84 922,8853,7 45,93 922,6853,8 46,03 922,4753,9 46,13 922,26

54,0 46,22 922,0654,1 46,32 921,8554,2 46,41 921,6454,3 46,51 921,4354,4 46,61 921,2254,5 46,70 921,0154,6 46,80 920,8054,7 46,90 920,5954,8 46,99 920,3854,9 47,09 920,17

55,0 47,18 919,9655,1 47,28 919,7555,2 47,38 919,5455,3 47,47 919,3355,4 47,57 919,1255,5 47,67 918,9155,6 47,77 918,6955,7 47,86 918,4855,8 47,96 918,2755,9 48,06 918,06

56,0 48,15 917,8456,1 48,25 917,6356,2 48,35 917,4256,3 48,45 917,2056,4 48,54 916,9956,5 48,64 916,7756,6 48,74 916,5656,7 48,84 916,3556,8 48,93 916,1356,9 49,03 915,91

57,0 49,13 915,7057,1 49,23 915,4857,2 49,32 915,2757,3 49,42 915,0557,4 49,52 914,8357,5 49,62 914,6257,6 49,72 914,4057,7 49,81 914,1857,8 49,91 913,9757,9 50,0] 913,75

58,0 50,11 913,5358,1 50,21 913,3158,2 50,31 913,0958,3 50,40 912,8758,4 50,50 912,6558,5 50,60 912,4358,6 50,70 912,2258,7 50,80 912,0058,8 50,90 911,7858,9 51,00 911,55

59,0 51,10 911,3359,1 51,19 911,1159,2 51,29 910,89



5. T

exto

s ge

rais

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 593

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

59,3 51,39 910,6759,4 51,49 910,4559,5 51,59 910,2359,6 51,69 910,0159,7 51,79 909,7859,8 51,89 909,5659,9 51,99 909,34

60,0 52,09 909,1160,1 52,19 908,8960,2 52,29 908,6760,3 52,39 908,4460,4 52,49 908,2260,5 52,59 908,0060,6 52,69 907,7760,7 52,79 907,5560,8 52,89 907,3260,9 52,99 907,10

61,0 53,09 906,8761,1 53,19 906,6461,2 53,29 906,4261,3 53,39 906,1961,4 53,49 905,9761,5 53,59 905,7461,6 53,69 905,5161,7 53,79 905,2961,8 53,89 905,0661,9 53,99 904,83

62,0 54,09 904,6062,1 54,19 904,3762,2 54,30 904,1562,3 54,40 903,9262,4 54,50 903,6962,5 54,60 903,4662,6 54,70 903,2362,7 54,80 903,0062,8 54,90 902,7762,9 55,00 902,54

63,0 55,11 902,3163,1 55,21 902,0863,2 55,31 901,8563,3 55,41 901,6263,4 55,51 901,3963,5 55,61 901,1563,6 55,72 900,9263,7 55,82 900,6963,8 55,92 900,4663,9 56,02 900,23

64,0 56,12 899,9964,1 56,23 899,7664,2 56,33 899,5364,3 56,43 899,2964,4 56,53 899,0664,5 56,64 898,8364,6 56,74 898,5964,7 56,84 898,3664,8 56,94 898,1264,9 57,05 897,89

65,0 57,15 897,6565,1 57,25 897,4265,2 57,36 897,18

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

65,3 57,46 896,9465,4 57,56 896,7165,5 57,67 896,4765,6 57,77 896,2365,7 57,87 896,0065,8 57,98 895,7665,9 58,08 895,52

66,0 58,18 895,2866,1 58,29 895,0566,2 58,39 894,8166,3 58,49 894,5766,4 58,60 894,3366,5 58,70 894,0966,6 58,81 893,8566,7 58,91 893,6166,8 59,01 893,3766,9 59,12 893,13

67,0 59,22 892,8967,1 59,33 892,6567,2 59,43 892,4167,3 59,54 892,1767,4 59,64 891,9367,5 59,74 891,6967,6 59,85 891,4567,7 59,95 891,2067,8 60,06 890,9667,9 60,16 890,72

68,0 60,27 890,4868,1 60,37 890,2368,2 60,48 889,9968,3 60,58 889,7568,4 60,69 889,5068,5 60,80 889,2668,6 60,90 889,0168,7 61,01 888,7768,8 61,11 888,5268,9 61,22 888,28

69,0 61,32 888,0369,1 61,43 887,7969,2 61,54 887,5469,3 61,64 887,2969,4 61,75 887,0569,5 61,85 886,8069,6 61,96 886,5569,7 62,07 886,3169,8 62,17 886,0669,9 62,28 885,81

70,0 62,39 885,5670,1 62,49 885,3170,2 62,60 885,0670,3 62,71 884,8270,4 62,81 884,5770,5 62,92 884,3270,6 63,03 884,0770,7 63,13 883,8270,8 63,24 883,5770,9 63,35 883,32

71,0 63,46 883,0671,1 63,56 882,8171,2 63,67 882,56



5. Textos gerais

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 594

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

71,3 63,78 882,3171,4 63,89 882,0671,5 63,99 881,8171,6 64,10 881,5571,7 64,21 881,3071,8 64,32 881,0571,9 64,43 880,79

72,0 64,53 880,5472,1 64,64 880,2972,2 64,75 880,0372,3 64,86 879,7872,4 64,97 879,5272,5 65,08 879,2772,6 65,19 879,0172,7 65,29 878,7572,8 65,40 878,5072,9 65,51 878,24

73,0 65,62 877,9973,1 65,73 877,7373,2 65,84 877,4773,3 65,95 877,2173,4 66,06 876,9673,5 66,17 876,7073,6 66,28 876,4473,7 66,39 876,1873,8 66,50 875,9273,9 66,61 875,66

74,0 66,72 875,4074,1 66,83 875,1474,2 66,94 874,8874,3 67,05 874,6274,4 67,16 874,3674,5 67,27 874,1074,6 67,38 873,8474,7 67,49 873,5874,8 67,60 873,3274,9 67,71 873,06

75,0 67,82 872,7975,1 67,93 872,5375,2 68,04 872,2775,3 68,15 872,0075,4 68,26 871,7475,5 68,38 871,4875,6 68,49 871,2175,7 68,60 870,9575,8 68,71 870,6875,9 68,82 870,42

76,0 68,93 870,1576,1 69,04 869,8976,2 69,16 869,6276,3 69,27 869,3576,4 69,38 869,0976,5 69,49 868,8276,6 69,61 868,5576,7 69,72 868,2876,8 69,83 868,0276,9 69,94 867,75

77,0 70,06 867,4877,1 70,17 867,2177,2 70,28 866,94

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

77,3 70,39 866,6777,4 70,51 866,4077,5 70,62 866,1377,6 70,73 865,8677,7 70,85 865,5977,8 70,96 865,3277,9 71,07 865,05

78,0 71,19 864,7878,1 71,30 864,5078,2 71,41 864,2378,3 71,53 863,9678,4 71,64 863,6978,5 71,76 863,4178,6 71,87 863,1478,7 71,98 862,8678,8 72,10 862,5978,9 72,21 862,31

79,0 72,33 862,0479,1 72,44 861,7679,2 72,56 861,4979,3 72,67 861,2179,4 72,79 860,9479,5 72,90 860,6679,6 73,02 860,3879,7 73,13 860,1079,8 73,25 859,8379,9 73,36 859,55

80,0 73,48 859,2780,1 73,60 858,9980,2 73,71 858,7180,3 73,83 858,4380,4 73,94 858,1580,5 74,06 857,8780,6 74,18 857,5980,7 74,29 857,3180,8 74,41 857,0380,9 74,53 856,75

81,0 74,64 856,4681,1 74,76 856,1881,2 74,88 855,9081,3 74,99 855,6281,4 75,11 855,3381,5 75,23 855,0581,6 75,34 854,7681,7 75,46 854,4881,8 75,58 854,1981,9 75,70 853,91

82,0 75,82 853,6282,1 75,93 853,3482,2 76,05 853,0582,3 76,17 852,7683,4 76,29 852,4882,5 76,41 852,1982,6 76,52 851,9082,7 76,64 851,6182,8 76,76 851,3282,9 76,88 851,03

83,0 77,00 850,7483,1 77,12 850,4583,2 77,24 850,16



5. T

exto

s ge

rais

18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 595

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

83,3 77,36 849,8783,4 77,48 849,5883,5 77,60 849,2983,6 77,72 848,9983,7 77,84 848,7083,8 77,96 848,4183,9 78,08 848,11

84,0 78,20 847,8284,1 78,32 847,5384,2 78,44 847,2384,3 78,56 846,9384,4 78,68 846,6484,5 78,80 846,3484,6 78,92 846,0584,7 79,04 845,7584,8 79,16 845,4584,9 79,28 845,15

85,0 79,40 844,8585,1 79,53 844,5585,2 79,65 844,2585,3 79,77 843,9585,4 79,89 843,6585,5 80,01 843,3585,6 80,14 843,0585,7 80,26 842,7585,8 80,38 842,4485,9 80,50 842,14

86,0 80,63 841,8486,1 80,75 841,5386,2 80,87 841,2386,3 81,00 840,9286,4 81,12 840,6286,5 81,24 840,3186,6 81,37 840,0086,7 81,49 839,7086,8 81,61 839,3986,9 81,74 839,08

87,0 81,86 838,7787,1 81,99 838,4687,2 82,11 838,1587,3 82,24 837,8487,4 82,36 837,5287,5 82,49 837,2187,6 82,61 836,9087,7 82,74 836,5987,8 82,86 836,2787,9 82,99 835,96

88,0 83,11 835,6488,1 83,24 835,3288,2 83,37 835,0188,3 83,49 834,6988,4 83,62 834,3788,5 83,74 834,0588,6 83,87 833,7388,7 84,00 833,4188,8 84,13 833,0988,9 84,25 832,77

89,0 84,38 832,4589,1 84,51 832,1289,2 84,64 831,80

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

89,3 84,76 831,4889,4 84,89 831,1589,5 85,02 830,8289,6 85,15 830,5089,7 85,28 830,1789,8 85,41 829,8489,9 85,54 829,51

90,0 85,66 829,1890,1 85,79 828,8590,2 85,92 828,5290,3 86,05 828,1990,4 86,18 827,8590,5 86,31 827,5290,6 86,44 827,1890,7 86,57 826,8590,8 86,71 826,5190,9 86,84 826,17

91,0 86,97 825,8391,1 87,10 825,4991,2 87,23 825,1591,3 87,36 824,8191,4 87,49 824,4791,5 87,63 824,1391,6 87,76 823,7891,7 87,89 823,4491,8 88,02 823,0991,9 88,16 822,74

92,0 88,29 822,3992,1 88,42 822,0492,2 88,56 821,6992,3 88,69 821,3492,4 88,83 820,9992,5 88,96 820,6392,6 89,10 820,2892,7 89,23 819,9292,8 89,37 819,5792,9 89,50 819,21

93,0 89,64 818,8593,1 89,77 818,4993,2 89,91 818,1293,3 90,05 817,7693,4 90,18 817,4093,5 90,32 817,0393,6 90,46 816,6693,7 90,59 816,3093,8 90,73 815,9393,9 90,87 815,55

94,0 91,01 815,1894,1 91,15 814,8194,2 91,29 814,4394,3 91,43 814,0694,4 91,56 813,6894,5 91,70 813,3094,6 91,84 812,9294,7 91,98 812,5494,8 92,13 812,1594,9 92,27 811,77

95,0 92,41 811,3895,1 92,55 810,9995,2 92,69 810,60



5. Textos gerais

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% V/V % m/m �20 (kg/m3)

95,3 92,83 810,2195,4 92,98 809,8295,5 93,12 809,4295,6 93,26 809,0295,7 93,41 808,6395,8 93,55 808,2395,9 93,69 807,82

96,0 93,84 807,4296,1 93,98 807,0196,2 94,13 806,6196,3 94,27 806,2096,4 94,42 805,7896,5 94,57 805,3796,6 94,71 804,9696,7 94,86 804,5496,8 95,01 804,1296,9 95,16 803,70

97,0 95,31 803,2797,1 95,45 802,8597,2 95,60 802,4297,3 95,75 801,9997,4 95,90 801,5597,5 96,05 801,1297,6 96,21 800,6897,7 96,36 800,24

% V/V % m/m �20 (kg/m3)

97,8 96,51 799,8097,9 96,66 799,35

98,0 96,81 798,9098,1 96,97 798,4598,2 97,12 798,0098,3 97,28 797,5498,4 97,43 797,0898,5 97,59 796,6298,6 97,74 796,1598,7 97,90 795,6898,8 98,06 795,2198,9 98,22 794,73

99,0 98,38 794,2599,1 98,53 793,7799,2 98,69 793,2899,3 98,86 792,7999,4 99,02 792,3099,5 99,18 791,8099,6 99,34 791,2999,7 99,50 790,7999,8 99,67 790,2899,9 99,83 789,76

100,0 100,0 789,24



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5.6. AFERIÇÃO DOS INTERFERÕES

1. Introdução .................................................................. 6012. Aferição da actividade antivírica (redução do efeito

citopatogénico)............................................................ 6013. Aferição de um interferão por meio de células Hep2c

e do vírus da encefalomiocardite infecciosa .............. 6013.1. Cultura e preparação das células Hep2c............ 6013.2. Multiplicação do vírus EMC .............................. 6013.3. Método de aferição.............................................. 602

3.3.1. Determinação do intervalo de medida .... 602

3.3.2. Aferição .................................................... 6023.3.3. Análise dos resultados.............................. 602

4. Validação de outros métodos ...................................... 6024.1. Escolha da linha celular e do vírus.................... 6024.2. Escolha da técnica de coloração vital ................ 6034.3. Validação estatística............................................ 6034.4. Validação do plano de ensaio.............................. 603

5. Reagentes e meios de cultura .................................... 603

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5.6. AFERIÇÃO DOS INTERFERÕES

Esta secção é fornecida a título de informação e conselho;não constitui parte obrigatória da Farmacopeia.

1. INTRODUÇÃO

As monografias relativas aos interferões humanos incluem,geralmente, uma aferição biológica fundamentada na acçãoinibidora, exercida pelos interferões, sobre o efeito citopato-génico de um vírus sobre uma cultura celular. Entretanto,geralmente, não dão especificações pormenorizadas no que serefere ao vírus, à linha celular e à técnica a utilizar, de modoa permitir uma certa flexibilidade, indispensável nos casos emque a monografia inclui várias subclasses de interferões.

A presente monografia tem por finalidade fornecer ao analistaindicações gerais sobre a técnica, a optimização e a validaçãodeste tipo de ensaios, uma vez escolhida uma combinaçãoapropriada de linha celular e vírus citopatogénico. Descreveem pormenor, a título de exemplo de método apropriado, umprocesso analítico aplicável a uma aferição de actividade anti-vírica particular, fornecendo informações sobre outras combi-nações vírus-linha celular e indicações sobre as modalidadesde adaptação e de validação do processo para essas outrascombinações.

2. AFERIÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIVÍRICA (REDUÇÃO DOEFEITO CITOPATOGÉNICO)

A aferição da actividade antivírica dos interferões humanosbaseia-se na avaliação da resposta induzida em células humanaspelos interferões que suprimem ou reduzem o efeito citopatogé-nico produzido nessas células por um vírus infeccioso. A activi-dade do interferão é avaliada por comparação da sua capacidadede proteger células da acção citopatogénica de um vírus com ade uma preparação padrão apropriada, calibrada em UnidadesInternacionais.

3. AFERIÇÃO DE UM INTERFERÃO POR MEIO DE CÉLULASHep2c E DO VÍRUS DA ENCEFALOMIOCARDITEINFECCIOSA

O método de aferição que se descreve a título de exemplobaseia-se na redução do efeito citopatogénico. Utiliza célulashumanas Hep2c que são infectadas com o vírus da encefalo-miocardite infecciosa (EMC) com a finalidade de avaliar aactividade de diferentes preparações de interferão humano.Este método foi empregado desde que foram feitos estudospatrocinados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) paraestabelecimento de padrões internacionais dos interferõeshumanos alfa, beta e gama e a sua sensibilidade, fiabilidade ereprodutibilidade para estimulação da actividade dessesdiferentes tipos de interferões humanos foram demonstradospor variadas vezes.

Para as culturas de células de mamíferos, todas as operaçõessão conduzidas segundo os métodos padronizados estabele-cidos para estas culturas celulares. Os volumes de reagentes autilizar são aqui indicados para culturas efectuadas em frascosde 75 cm2; podem utilizar-se outros tipos de recipientes(frascos ou caixas de cultura) e, nesse caso os volumes devemser, então, consequentemente adaptados.

3.1. CULTURA E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS HEP2C

As células Hep2c são mantidas e repicadas em meio de cultura A.


5.6. Aferição dos interferões

As células são conservadas na forma congelada seguindométodos padronizados. Podem ser mantidas em cultura até,no máximo, 30 passagens após o que devem preparar-se novasculturas a partir dos lotes congelados.

Para iniciar a aferição, proceda à recolha das células quandoos tapetes celulares apresentarem uma confluência de 90 porcento, pelo método de tratamento com tripsina que sedescreve a seguir.

– Remova o meio de cultura dos frascos.

– Junte a cada frasco 5 ml de solução de tripsina aquecida a37ºC, preparada extemporaneamente por diluição a 1/50com tampão salino de fosfato a partir de uma solução-mãeconcentrada contendo 4 mg/ml de tripsina R e 4 mg/ml deedetato de sódio R. Rolhe os frascos e agite com movimentoscirculares para lavar o tapete celular. Elimine o excesso desolução de tripsina.

– Coloque os frascos na incubadora a 37ºC durante 5-10 min.Proceda a um exame visual ou microscópico para observaros sinais de separação das células. Ao microscópio, estasaparecem ou aglutinadas ou separadas flutuando livremente.Agite energicamente os frascos para separar todas as célulase, de seguida, junte cerca de 5 ml de meio de cultura A. Agiteenergicamente para obter uma suspensão de célulasseparadas.

– Para preparar as suspensões celulares para a aferição,disperse as células com precaução aspirando e expirandocom uma pipeta para desfazer os agregados celulares econte as células ajustando a concentração das suspensõesem 6 � 105 células por mililitro.

3.2. MULTIPLICAÇÃO DO VÍRUS EMC

O vírus EMC é multiplicado em células L-929 de rato demodo a obter-se uma suspensão-mãe do vírus. A manutençãodas células L-929 deve ser efectuada por tratamento comtripsina e repicagem como se descreve para as células Hep2c(NOTA: em caso de crescimento celular fraco, pode sernecessário substituir o soro de vitela recém-nascida por sorofetal de vitela).

Tome vários frascos contendo culturas confluentes de célulasL-929. Retire o meio de cultura contido nos frascos. Introduzaem cada frasco 2 ml de suspensão do vírus EMC, previamentediluído até uma concentração de cerca de 2,5 � 108 UFP/mlcom meio de cultura B. Em cada frasco contendo 4-6 � l07

células L-929 a multiplicidade da infecção será aproximada-mente de 10 UFP/célula. Disperse com precaução a suspensãovírica na superfície de um tapete celular, agitando commovimentos circulares, e coloque de novo na incubadoradurante cerca de 1 h. Mantenha o pH do meio entre 7,4 e 7,8.

Após a adsorção do vírus EMC, junte a cada frasco cerca de 40 ml de meio de cultura B e volte a colocar na incubadora a37°C durante cerca de 30 h. Mantenha o pH do meio entre7,4 e 7,8 para obter um rendimento máximo em vírus.Recolha o sobrenadante da cultura e conserve-o a cerca de 40°C.

Coloque os frascos a -20°C para congelar os tapetes celularese, de seguida, aqueça até à temperatura ambiente. Junte cercade 5 ml de meio de cultura e agite para romper as membranascelulares. Passe o conteúdo de cada frasco para o recipienteque contém o sobrenadante da cultura e transfira esta misturapara tubos de centrífuga de plástico de 50 ml e centrifugue acerca de 500 g durante, aproximadamente 10 min, para separaros resíduos celulares. Reparta o sobrenadante límpido em tubosde vidro de tampa roscada em fracções de 20, 10, 5, 1, 0,5 ou

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0,2 ml por tubo, segundo as necessidades. Conserve a -70°C. Osvolumes mais altos podem ser descongelados e divididos emquantidades mais pequenas e recongelados, se necessário.Convém, entretanto, notar que esta suspensão-mãe do vírusEMC não conserva o seu título inicial a não ser que sejaconservada ininterruptamente a cerca de -70°C; ciclos decongelação-descongelação repetidos ou a conservação atemperaturas mais elevadas (por exemplo, da ordem de -20°C)conduzem a uma perda progressiva do título.

3.3. MÉTODO DE AFERIÇÃO

3.3.1. Determinação do intervalo de medida

Preparação das soluções de interferão

Dilua o padrão de interferão apropriado (por exemplo, umpadrão OMS de um subtipo de interferão específico) no meiode cultura A de modo a obter uma série de diluições de razão10 cobrindo o intervalo de doses de 1 000-0,001 UI/ml. Utilizeplacas de microtitulação de 96 cavidades. Introduza em cadacavidade 100 µl de meio de cultura A. Junte a todas as cavi-dades, com excepção das que servirão de testemunhas«vírus», cerca de 100 µl de cada uma das diluições dapreparação padrão. Misture cuidadosamente o conteúdo dascavidades com uma pipeta multicanais regulada para 100 µl.

Distribuição da suspensão celular

Verta numa placa de Petri estéril a suspensão de célulasHep2c ajustada de modo a conter cerca de 6 � 105 células pormililitro de meio de cultura A e reparta o conteúdo da placade Petri nas cavidades da placa de microtitulação utilizandouma pipeta multicanais regulada para 100 µl.

Coloque as placas na incubadora a 37°C em atmosfera com 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h.

Infecção pelo vírus

Nesta etapa, verifique ao microscóprio que os tapetes de célulasHep2c são confluentes, que apresentam uma distribuiçãocelular relativamente uniforme, que a morfologia estácorrecta e que as células estão de boa saúde.

Esvazie, então, a maior parte do meio de cultura contido nascavidades, procedendo do seguinte modo: inverta a placa,sacuda-a e seque-a com papel absorvente (deve proceder-sesempre do mesmo modo para esvaziar o líquido contido nascavidades). Dilua a suspensão-mãe do vírus EMC com meio decultura A fresco de modo a obter um título infeccioso decerca de 3 x 107 UFP/ml (NOTA: são necessários cerca de 20 ml de vírus diluído para cada placa, mais 5-10 por centode volume suplementar). Coloque a suspensão diluída numaplaca de Petri estéril de 9 cm e, de seguida, com uma pipetamulticanais regulada para 200 µl, reparta o conteúdo da placapor todas as cavidades (compreendendo as que servem detestemunhas «vírus»), com excepção das previstas comotestemunhas «células»; nestas últimas, junte cerca de 200 µlde meio de cultura A que não contenha vírus.

Volte a colocar as placas na incubadora a 37°C, em atmosferacom 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h.

Coloração

Examine as placas ao microscópio para confirmar o efeitocitopatogénico produzido pelo vírus EMC sobre as testemunhas«vírus». O tempo necessário para obter um efeito citopatogé-nico máximo pode variar de uma aferição para outra devido àvariabilidade intrínseca da reacção das células Hep2c à provavírica num determinado período da cultura em contínuo.

Remova a maior parte do meio de cultura contido nas cavidades

para uma solução descontaminante apropriada (por exemplo,hipoclorito de sódio). Junte nas cavidades solução salinatamponada de pH 7,4 R e remova-a para uma soluçãodescontaminante. Introduza em cada cavidade 150 µl de soluçãode coloração e deixe a coloração das células efectuar-sedurante cerca de 30 min à temperatura ambiente; de seguida,remova a solução de coloração para uma solução descontami-nante. Junte nas cavidades cerca de 150 µl de solução defixação, deixe agir durante 10 min à temperatura ambiente eremova a solução de fixação para uma solução descontaminante.Lave os tapetes celulares colocando as placas num recipientede plástico em água corrente. Seque superficialmente asplacas com papel absorvente. Seque, de seguida, a umatemperatura compreendida entre 20 e 37°C até evaporaçãototal da humidade.

Junte em cada cavidade 150 µl de hidróxido de sódio 0,1 M.Elua o corante agitando suavemente as placas ou batendocom elas repetidas vezes na palma da mão. Assegure-se que arepartição da coloração é uniforme no conjunto das cavidadesantes de proceder às determinações espectrofotométricas.

Determine a absorvência em 610-620 nm usando um leitor deplacas de microtitulação, utilizando como «branco» umacavidade, ou uma linha de cavidades, que não contenhamcélulas mas 150 µl de hidróxido de sódio 0,1 M. Calcule asconcentrações do padrão de interferão que corresponde,respectivamente, à redução máxima e à redução mínima doefeito citopatogénico. Estas concentrações definem ointervalo de medida que será utilizado para a aferição.

3.3.2. Aferição

Efectue a aferição segundo o método que antes se descreveu,utilizando:

– Como soluções problema, uma série de diluições a 1/2 daamostra em meio de cultura A, cujas concentraçõesnominais preencham o intervalo de medida da aferição,

– como soluções padrão, uma série de diluições a 1/2 emmeio de cultura A do padrão apropriado (por exemplo, umpadrão OMS de um subtipo de interferão específico), cujasconcentrações nominais preencham o intervalo de medidada aferição.

3.3.3. Análise dos resultados

Os resultados das aferições da actividade antivírica ajustam-segeralmente a uma curva dose-resposta de tipo sigmóide,quando se constrói o gráfico da concentração em interferão(logaritmo do inverso da diluição) em função da absorvência.

Construa a curva da concentração em interferão (logaritmo doinverso da diluição) em função da absorvência determinada,para as soluções padrão e para as soluções problema. Conside-rando só a zona linear da curva, calcule o teor em interferãoda amostra por comparação das respostas obtidas com assoluções problema e as soluções padrão, segundo os métodosestatísticos habituais para os ensaios em linhas paralelas.

4. VALIDAÇÃO DE OUTROS MÉTODOS

4.1. ESCOLHA DA LINHA CELULAR E DO VÍRUS

Para a aferição da actividade antivírica dos interferões podemser utilizados um certo número de outras combinações linhacelular/vírus, por exemplo, o vírus EMC com células doepitelioma pulmonar A549, o vírus Forest Semliki (vírus SF)ou o vírus Sindbis com fibroblastos humanos, o vírus daestomatite vesicular com fibroblastos diplóides humanos, a



5. Textos gerais

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linha celular amniótica humana WISH ou a linha de células renais bovinas de Madin-Darby. A combinaçãolinha celular/vírus escolhida deve ser, geralmente, aquela cuja resposta à preparação de interferão a titular apresentar a sensibilidade máxima e que permita obter respostas paralelascom preparações da amostra e do padrão do interferão.

4.2. ESCOLHA DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO VITAL

A técnica de coloração atrás descrita permite determinar onúmero residual de células viáveis. Podem ser igualmenteutilizadas outras técnicas, nomeadamente a coloração comvioleta de metilo ou com violeta de cristal, ou o método deconversão do azul de tiazol (MTT). Em todos os casos, ocritério de escolha do método deve ser a obtenção, entre acoloração e o número de células viáveis, de uma relação queapresente uma linearidade e uma sensibilidade satisfatórias.

4.3. VALIDAÇÃO ESTATÍSTICA

Como todas as aferições biológicas efectuadas segundo omodelo de linhas paralelas, a aferição da actividade antivíricadeve satisfazer às condições estatísticas habituais de linearidadeda resposta, de paralelismo e de variância.

4.4. VALIDAÇÃO DO PLANO DE ENSAIO

Como para todas as aferições em placas de microtitulação, énecessária uma validação do plano do ensaio utilizado. Éimportante, nomeadamente, despistar os erros resultantes deuma ordem de distribuição não aleatória nas cavidades ou oefeito de bordo da placa, e eliminá-los efectuando um plano deaferição aleatória ou evitando utilizar cavidades com bordos.

5. REAGENTES E MEIOS DE CULTURA

Meio de cultura A (soro de vitela recém-nascida: 10 por cento)

Meio de cultura RPMI 1640, se necessário adicionado de antibióticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina 10 ng/ml) 450 mlL-Glutamina, 200 mM, estéril 5 mlSoro de vitela recém-nascida 50 ml

Meio de cultura B (soro fetal de vitela: 2 por cento

Meio de cultura RPMI 1640, se necessário adicionado de antibióticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina 10 ng/ml) 490 ralL-Glutamina, 200 mM, estéril 5 mlSoro fetal de vitela 10 ml

Solução de coloração

Negro de naftaleno 0,5 gÁcido acético glacial 90 mlAcetato de sódio anidro 8,2 gÁgua q.b.p 1 000 ml

Solução de fixação

Formaldeído (40 por cento) 100 mlÁcido acético glacial 90 mlAcetato de sódio anidro 8,2 gÁgua q.b.p. 1 000 ml



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5.7. QUADRO DAS CARACTERÍSTICASDOS RADIONUCLIDOS

CITADOS NA FARMACOPEIA

PORTUGUESA5.7. Quadro das características dos radionuclidos

citados na Farmacopeia Portuguesa ........................ 607

20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 605

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5.7. QUADRO DAS CARACTERÍSTICASDOS RADIONUCLIDOS CITADOS NA FARMACOPEIA PORTUGUESA

O quadro seguinte é publicado para completar a monografiageral «Preparações radiofarmacêuticas».

Os valores foram obtidos a partir da base de dados do NationalNuclear Data Center (NNDC) situado no Brookhaven NationalLaboratory, Upton, NY., Estados Unidos da América,directamente acessível pela Internet:

«http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html».

Se for preferida uma outra fonte de informações (valores maisrecentes), deve ser mencionada explicitamente.

Outras fontes de dados:

* DAMRI (Département des Applications et de la Métrologiedes Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, França),


5.7. Quadro das características dos radionuclidos

** PTB (Physikalisch-Technishe Bundesanstalt,Braunschweig, Alemanha),

*** NPL (National Physical Laboratory, Teddington,Middlesex, Reino Unido).

A incerteza da semi-vida é dada entre parêntesis. Emprincípio, o número entre parêntesis é o valor numérico daincerteza-padrão dos últimos dígitos correspondentesao valor indicado («Guide to the Expression of Uncertainty in measurement», International Organisation forStandardisation (ISO), 1993, ISBN 92-67-20188-3).

São utilizadas as abreviaturas seguintes:

eA = electrões Auger,ec = electrões de conversão,�– = electrões,�+ = positrões,� = raios gama,X = raios X

Azoto-13 (13N)

Césio-137 (137Cs)em equilíbrio com Bário-137m(137mBa)

Carbono-11 (11C)

Chumbo-203 (203Pb)

9,965 (4) min �+ 0,492 (I) (máx: 1,198) 99,8 � 0,511 199,6 (II)

20,385 (20) min �+ 0,386 (I) (máx: 0,960) 99,8 � 0,511 199,5 (II)

30,04 (3) anos eA 0,026 0,8 X 0,005 10,032-0,036 7

(137mBa: ec 0,624 8,02,552 (1) min) 0,656 1,4 � 0,662 85,1

�– 0,174 (I) 94,40,416 (I) 5,6

9,33 (3) h eA 0,055 3 X 0,070-0,073 690,083 19

ec 0,246 8,50,276 2 � 0,331 790,316 2,3 0,361 9,9

0,406 2,00,585 3,60,692 4,30,767 3,20,826 2,40,908 5,70,946 7,91,099 1,81,277 1,6

51,873 (9) h eA 0,055 3,0 X 0,010 37,00,071-0,073 69,6

ec 0,194 13,3 0,083 19,4

� 0,279 80,80,401 3,4

(I) Energia média do espectro �.(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.

Radionuclido Semi-vidaTipo

Emissão electrónica

Energia (MeV)

Probabilidade de emissão(por 100

desintegrações)

Tipo

Emissão fotónica

Energia (MeV)


desintegrações)

Chumbo-201 (201Pb)(produz Tálio-201radioactivo)

20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 607



5. Textos gerais


Crípton-81m (81mKr)

Crómio-51 (51Cr)

Enxofre-35 (35S)

Flúor-18 (18F)

Fósforo-32 (32P)

Fósforo-33 (33P)

Estrôncio-89 (89Sr)em equilíbrio comÍtrio-89m (89mY)

Estrôncio-90 (90Sr)em equilíbrio com

Ítrio-90 (90Y)

77,27 (3) dias eA 0,006 47 X 0,006-0,007 25

�+ 0,179 (I) 0,9 � 0,511 38,0 (II)

0,631 (I) 18,1 0,847 100,01,038 14,11,175 2,21,238 66,11,360 4,31,771 15.52,015 3,02,035 7,82,598 17,03,202 3,13,253 7,6

271,79 (9) dias eA + ec 0,006-0,007 177,4 X 0,006-0,007 57

ec 0,014 7,4 � 0,014 9,20,115 1,8 0,122 85,60,129 1,3 0,136 10,7

0,692 0,15

70,86 (7) dias eA 0,006 49,4 X 0,006-0,007 26,3

�+ 0,201 (I) 14,9 � 0,511 29,9 (II)

0,811 99,40,864 0,71,675 0,5

5,2714 (5) anos �– 0,096 (I) (máx. 0,318) 99,9 � 1,173 100,01,333 100,0

13,10 (3) s ec 0,176 26,4 X 0,012-0,014 17,00,189 4,6

� 0,190 67,6

27,7025 (24) dias eA 0,004 67 X 0,005 22,3

� 0,320 9,9

87,51 (12) dias �– 0,049 (I) (máx: 0,167) 100

50,53 (7) dias �– 0,583 (I) (máx: 1,492) 99,99 � 0,909 0,01

(89mY: 16,06 (4) s)

28,74 (4) anos �– 0,196 (I) (máx: 0,546) 100

(90Y: 64,l0 (8) h)

109,77 (5) min �+ 0,250 (I) (máx: 0,633) 96,7 � 0,511 193,5(II)

14,26 (4) dias �– 0,695 (I) (máx: 1,71) 100

25,34 (12) dias �– 0,076 (I) (máx: 0,249) 100



Energia (MeV)


desintegrações)

Tipo

Emissão fotónica

Energia (MeV)


desintegrações)

Cobalto-57 (57Co)

Cobalto-58 (58Co)

Cobalto-60 (60Co)

Cobalto-56 (56Co)

20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 608



5. T

exto

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rais


Gálio-66 (66Ga)

Gálio-67 (67Ga)

Germânio-68 (68Ge)em equilíbrio comGálio-68 (68Ga)

Gálio-68 (68Ga)

Índio-110 (110In)

Índio-110m (110m In)

Índio-114m (114mIn)em equilíbrio comÍndio-114(114In)

Índio-111 (111In)

9,49 (7) h eA 0,008 21 X 0,009-0,010 19,1

�+ 0,157 (I) 1 � 0,511 112 (II)

0,331 (I) 0,7 0,834 5,90,397 (I) 3,8 1,039 370,782 (I) 0,3 1,333 1,21,90 (I) 50 1,919 2,1

2,190 5,62,423 1,92,752 23,43,229 1,53,381 1,53,792 1,14,086 1,34,295 4,14,807 1,8

3,2612 (6) dias eA 0,008 62 X 0,008-0,010 57

ec 0,082-0,084 30,4 � 0,091-0,093 42,40,090-0,092 3,6 0,185 21,2

0,175 0,3 0,209 2,40,300 16,80,394 4,70,888 0,15

67,629 (24) min eA 0,008 5,1 X 0,009-0,010 4,7

�+ 0,353 (I) 1,2 � 0,511 178,30,836 (I) 88,0 1,077 3,0

270,82 (27) dias eA 0,008 42,4 X 0,009-0,010 44,1

�+ 0,353 (I) 1,2 � 0,511 178,3(68Ga: 67,629 (24) min) 0,836 (I) 88,0 1,077 3,0

4,9 (1) h eA 0,019 13,4 X 0,023-0,026 70,5

� 0,642 25,90,658 98,30,885 92,90,938 68,40,997 10,5

69,1 (5) min eA 0,019 5,3 X 0,023-0,026 27,8

�+ 1,015 (I) 6,1 � 0,511 123,4 (II)

0,658 97,82,129 2,1

2,8047 (5) dias eA 0,019 15,6 X 0,003 6,90,023-0,026 82,3

ec 0,145 7,80,167-0,171 1,3 0,171 90,2

0,219 4,9 � 0,245 94,00,241-0,245 1,0

49,51 (1) dia eA 0,162 40 X 0,023-0,027 36,30,186-0,190 40

� 0,190 15,6*�– 0,777 (I) (máx: 1,985) 95 0,558 3,2

(114In: 71,9 (1) s) 0,725 3,2



Energia (MeV)


desintegrações)

Tipo

Emissão fotónica

Energia (MeV)


desintegrações)

20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 609



5. Textos gerais


Iodo-133 (133I) (produz Xénon-133radioactivo)

Iodo-135 (135I)(produz Xénon-135radioactivo)

Molibdénio-99 (99Mo)em equilíbrio comTecnécio-99m (99mTc)

13,27 (8) h eA 0,023 12,3 X 0,004 9,30,027-0,031 86,6

lc 0,127 13,60,154 1,8 � 0,159 83,30,158 0,4 0,346 0,1

0,440 0,40,505 0,30,529 1,40,538 0,4

59,402 (14) dias eA + ec 0,004 80 X 0,004 15,50,023-0,035 33 0,027 114

0,031 26

� 0,035 6,7

13,11 (5) dias eA 0,023 6 X 0,027-0,031 42,2

ec 0,354 0,5 � 0,388 340,634 0,1 0,491 2,9

0,511 2,3 (II)

�– 0,109 (I) 3,6 0,666 330,290 (I) 32,1 0,754 4,20,459 (I) 8,0 0,880 0,8

1,420 0,3�+ 0,530 (I) 1

8,02070 (11) dias ec 0,46 3,5 X 0,029-0,030 3,90,330 1,6

� 0,080 2,60,284 6,1

�– 0,069 (I) 2,1 0,365 81,70,097 (I) 7,3 0,637 7,20,192 (I) 89,9 0,723 1,8

20,8 (1) h �– 0,140 (I) 3,8 � 0,530 870,162 (I) 3,2 0,875 4,50,299 (I) 4,2 1,298 2,40,441 (I) 83

6,57 (2) h �– 0,140 (I) 7,4 � *0,527 13,80,237 (I) 8 0,547 7,20,307 (I) 8,8 0,837 6,70,352 (I) 21,9 1,039 8,00,399 (I) 8 1,132 22,70,444 (I) 7,5 1,260 28,90,529 (I) 23,8 1,458 8,7

1,678 9,61,791 7,8

64,10 (8) h �– 0,934 (I) (máx: 2,280) 100

65,94 (1) h �– 0,133 (I) 16,4 X 0,018-0,021 3,60,290 (I) 1,1

0,443 (I) 82,4 � 0,041 1,10,141 4,50,181 60,366 1,2

(99mTc: 6,01(1) h) 0,740 12,10,778 4,3



Energia (MeV)


desintegrações)

Tipo

Emissão fotónica

Energia (MeV)


desintegrações)

Iodo-123 (123I)

Iodo-125 (125I)

Iodo-126 (126I)

Iodo-131 (131I)

Ítrio-90 (90Y)

20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 610



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Tálio-200 (200Tl)

Tálio-201 (201Tl)

Tálio-202 (202Tl)

Tecnécio-99m (99mTc)

Tecnécio-99 (99Tc)

Telúrio-121 (121Te)

Oxigénio-15 (15O) 122,24 (16)s �+ 0,735 (I) (máx: 1,732) 99,9 � 0,511 199,8 (II)

4,576 (5) h eA 0,011 31,3 X 0,013-0,014 57,2

ec 0,176 25,0 � 0,190 640,188 4,3 0,446 23,2

0,457 3,0�+ 0,253 (I) 1,8 0,510 5,3

0,447 (I) 25,0 0,511 54,2(81mKr: 13,10 (3) s 0,538 2,2

39,26 (2) dias eA + ec 0,017 12 X 0,020-0,023 9,0

ec 0,030-0,039 88,3 � 0,497 910,610 5,8

�– 0,031 (I) 6,6(103mRh: 0,064 (I) 92,9

56,144 (20) min)

26,1 (1) h ec 0,285 3,4 X 0,010 32,00,353 1,4 0,069-0,071 63,3

0,08 17,5�+ 0,495 (I) 0,3

� 0,368 87,20,579 13,80,828 10,81,206 29,91,226 3,41,274 3,31,363 3,41,515 4,0

72,912 (17) h ec 0,016-0,017 17,7 X 0,010 46,00,027-0,029 4,1 0,069-0,071 73,7

0,052 7,2 0,080 20,40,084 15,4

0,153 2,6 � 0,135 2,60,167 10,0

12,23 (2) dias eA 0,054 2,8 X 0,010 31,00,069-0,071 61,6

ec 0,357 2,4 0,080 17,1

� 0,440 91,4

2,11 � 105 anos �– 0,085 (I) (máx: 0,294) 100

6,01(1) h ec 0,002 74 X 0,018-0,021 7,3

eA 0,015 2,1 � 0,141 89,1

ec 0,120 9,40,137-0,140 1,3

**19,16 (5) dias eA 0,022 11,6 X 0,026-0,030 75,6

� 0,470 1,40,508 17,7



Energia (MeV)


desintegrações)

Tipo

Emissão fotónica

Energia (MeV)


desintegrações)

Ruténio-103 (103Ru)em equilíbrio com Ródio-103m(103mRh)

Rubídio-81 (81Rb)em equilíbrio comCripton-81m (81mKr)

20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 611



5. Textos gerais

154,0 (7) dias eA 0,003 88,0 X 0,026-0,031 50,50,022-0,023 7,4

� 0,212 81,4ec 0,050 33,2 1,102 2,5

(121Te: 19,16(5) dias 0,077 40,00,180 6,1

*12,33 (6) anos *�– *0,006 (I) (máx: 0,019) *100

11,84 (7) dias eA 0,025 6,8 X 0,004 8,30,030 44,0

ec 0,129 61 0,034 10,20,159 28,5

0,163 8,3 � 0,164 2,0

5,243 (1) dias eA 0,026 5,8 X 0,004 6,30,031 40,3

ec 0,045 55,1 0,035 9,40,075-0,080 9,9

� 0,080 38,3�– 0,101 (I) 99,0

2,19 (1) dias eA 0,025 7 X 0,004 7,80,030 45,9

ec 0,199 64,0 0,034 10,60,228 20,7

0,232 46 � 0,233 10,0

9,14 (2) h ec 0,214 5,5 X 0,031-0,035 5,0

�– 0,171 3,1 � 0,250 90,20,308 96,0 0,608 2,9



Energia (MeV)


desintegrações)

Tipo

Emissão fotónica

Energia (MeV)


desintegrações)

Trítio (3H)

Xénon-131m (131mXe)

Xénon-133 (133Xe)

Xénon-133m (133Xe)(produz Xénon-133radioactivo)

Xénon-135 (135Xe)

Telúrio-121m (121mTe)em equilíbrio comTelúrio-121 (121Te)


20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 612


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5.8. HARMONIZAÇÃO DAS FARMACOPEIAS

5.8. Harmonização das Farmacopeias.............................. 615

21. Ponto 5.8(613-616) 11/18/05 1:02 PM Page 613

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5.8. HARMONIZAÇÃO DAS FARMACOPEIAS

Este capítulo geral serve somente como informação. Contémindicações sobre o grau de harmonização e, por consequência,da possibilidade de intermutação dos diversos capítulos geraise monografias da Farmacopeia dos Estados Unidos da Américado Norte, da Farmacopeia Europeia e da Farmacopeia Japo-nesa. Não modifica em nada o estatuto das monografias ecapítulos gerais que fazem fé em caso de dúvida ou litígioquando a conformidade com a Farmacopeia é solicitada.

A Comissão da Farmacopeia Europeia reconhece a utilidade deuma cooperação com outras farmacopeias para a elaboração demonografias e capítulos gerais harmonizados. Esta harmoni-zação é totalmente compatível com os objectivos da Comissãoe apresenta diversas vantagens, nomeadamente a simplificaçãoe a racionalização dos métodos de controlo da qualidade e osprocessos de registo. Aliás, esta harmonização auxilia positi-vamente os trabalhos da Conferência Internacional sobre aHarmonização (ICH) e a Cooperação Internacional sobre aHarmonização Veterinária (VICH) na medida em que certasnotas explicativas dependem dos capítulos gerais da Farmaco-peia para a sua aplicação.

Os trabalhos de harmonização são realizados de uma formabem definida, mas informal, no Grupo de Discussão das


5.8. Harmonização das Farmacopeias

Farmacopeias (PDG) que associa a Farmacopeia dos EstadosUnidos, a Farmacopeia Europeia e a Farmacopeia Japonesa.Informações sobre os pontos que serão tratados pelo PDGfigurarão nas versões posteriores do presente capítulo.

A harmonização dos capítulos gerais tem como fim a obtençãode métodos ou normas intercambiáveis; tal implica que aconformidade estabelecida com ajuda de uma das farmacopeiasserá exactamente a mesma se o capítulo correspondente deuma qualquer das outras farmacopeias tiver sido utilizado.Qualquer diferença residual entre os capítulos gerais harmoni-zados das três farmacopeias será descrita nas sucessivas versõesdo presente capítulo.

A harmonização das monografias tem como fim obter normasidênticas para todas as características de uma substância. Aharmonização integral de certas monografias pode revelar-sedifícil por causa, por exemplo, de diferenças de estatuto jurídicoou de interpretações divergentes. Se tal acontecer, a PDGdecidiu aprovar e publicar monografias em que o maior númeropossível de elementos terão sido harmonizados. Os elementosdivergentes que subsistem nas monografias harmonizadas serãodescritos nas sucessivas versões do presente capítulo.

As três farmacopeias decidiram não modificar unilateralmenteas monografias e capítulos gerais harmonizados; as revisõesserão efectuadas simultaneamente pelas três farmacopeiassegundo o processo mais conveniente.

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5.9. POLIMORFISMO5.9. Polimorfismo.............................................................. 619

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5.9. POLIMORFISMO

O polimorfismo (ou polimorfismo cristalino) é a capacidadede um composto no estado sólido se apresentar em váriasformas cristalinas diferentes enquanto que a sua composiçãoquímica não varia. O estado sólido de uma molécula podeapresentar-se igualmente numa forma não cristalinadesignada pelo termo amorfa.

Quando o fenómeno é observado para um corpo simples ouelemento (enxofre, por exemplo) o termo polimorfismosubstitiu-se por alotropia.

O termo pseudomorfismo é utilizado para os solvatos(incluindo os hidratos) nos quais um solvente participa namalha cristalina em proporções estequiométricas; por vezes,por extensão, este termo é empregado igualmente para oscompostos de inclusão nos quais o solvente está englobado namalha em proporções variáveis. Por isso, o termo«pseudopolimorfismo» é ambíguo dada a sua utilização emsituações diferentes; é, portanto, preferível só reter os termos«solvatos» e «hidratos».

Quando uma monografia indica que a substância apresentapolimorfismo, pode tratar-se de um polimorfismo cristalinoverdadeiro, da existência de um solvato, de alotropia ou daexistência de uma forma amorfa.

A constância da composição química implica que todas asformas cristalinas e a forma amorfa de uma dada espécieapresentam um comportamento químico idêntico em soluçãoou à fusão; pelo contrário, as suas características físico--químicas e físicas (solubilidade, dureza, compressibilidade,massa volúmica, ponto de fusão, etc.) e, por consequência, asua reactividade e a sua biodisponibilidade poderão serdiferentes no estado sólido.

Quando uma molécula apresenta polimorfismo, a forma maisestável termodinamicamente é aquela cuja entalpia livre émínima a uma dada temperatura e pressão. As outras formasencontram-se num estado chamado metastável. Nascondições normais de temperatura e pressão, uma forma noestado metastável pode manter-se imutável ou poderepresentar uma transição para uma formatermodinamicamente mais estável.

Se existem várias formas cristalinas, uma de entre elas étermodinamicamente mais estável a uma certa pressão etemperatura. Uma dada forma cristalina pode constituir umafase que é susceptível de se encontrar em equilíbrio comoutras fases sólidas e também com as fases líquida e gasosa.

Se cada uma das formas cristalinas é a mais estável adeterminada temperatura, a passagem de uma para outra éreversível: neste caso, a transição é chamada de


5.9. Polimorfismo

enanteotrópica. Ao contrário, se só uma das formas é estável aqualquer temperatura, a transição é irrreversível oumonotrópica. A passagem de uma fase a outra é um equilíbriode variância 1 o que explica que a uma dada pressão esteestado é caracterizado por uma temperatura chamada detemperatura de transição.

As formas cristalinas diferentes ou solvatos podem ser geradaspor variação das condições de cristalização (temperatura,pressão, solvente, concentração, velocidade de cristalização,indução do meio de cristalização, presença e concentração deimpurezas, etc.).

O estudo do polimorfismo pode ser realizado utilizando asseguintes técnicas:

– difracção de raios-X dos pós,

– difracção de raios-X de um só cristal,

– análise térmica (2.2.34) (calorimetria diferencial,termogravimetria, termomicroscopia),

– microcalorimetria,

– análise de absorção da água,

– microscopias óptica e electrónica,

– ressonância magnética nuclear no estado sólido,

– espectrofotometria de absorção no infravermelho (2.2.24),

– espectrometria de Raman (2.2.48),

– determinação da solubilidade e da velocidade intrínseca dedissolução,

– determinação da massa volúmica.

Estas técnicas são muitas vezes complementares e éindispensável utilizar várias.

Os diagramas pressão/temperatura e energia/temperaturabaseados nos dados analíticos são ferramentas úteis paraconhecer as relações energéticas (enanteotropismo,monotropismo) e a estabilidade termodinâmica de cadamodificação de um composto polimórfico.

No caso dos solvatos, a análise calorimétrica diferencial e atermogravimetria devem ser privilegiadas, associadas adeterminações da solubilidade e da velocidade intrínseca dedissolução e à difracção de raios-X.

No caso dos hidratos, o estabelecimento das isotérmicas deabsorção/desabsorção da água deve ser efectuado paraconhecer as zonas de estabilidade relativa.

Em geral, os hidratos são menos solúveis na água que asformas anidras e os solvatos são menos solúveis no seusolvente que as formas não solvatadas.

22. Ponto 5.9(617-620) 11/18/05 1:03 PM Page 619


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5.10. CONTROLODAS IMPUREZAS NAS

SUBSTÂNCIAS PARA USOFARMACÊUTICO

5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para usofarmacêutico ............................................................ 623

23. Ponto 5.10(621-626) 11/18/05 1:03 PM Page 621

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5.10. CONTROLO DAS IMPUREZAS NAS SUBSTÂNCIAS PARA USO FARMACÊUTICO

Preâmbulo

As monografias das substâncias para uso farmacêutico daFarmacopeia têm como objectivo assegurar uma qualidadedestas substâncias que seja aceite pelos utilizadores. Tendoem conta a missão que a Farmacopeia desempenha emmatéria de saúde pública, é indispensável que as suasmonografias permitam um controlo adequado das impurezas.As exigências de qualidade são estabelecidas na base deconsiderações de ordem científica, técnica e regulamentar.

As exigências relativas às impurezas figuram, por um lado,nas monografias específicas e, por outro, na monografia geral«Substâncias para uso farmacêutico» que sãocomplementares: as monografias específicas fixam os critériosde aceitação das impurezas, enquanto que a monografia geraldefine as exigências relativas à qualificação, identificação edeclaração das impurezas orgânicas eventualmente presentesnos princípios activos.

Os limiares de declaração, de identificação e de qualificaçãoespecificados na monografia geral «Substâncias para usofarmacêutico» aplicam-se a todas as substâncias aparentadas.Entretanto, se uma monografia não inclui ensaio dassubstâncias aparentadas apoiado num método quantitativo, apresença de impurezas novas de teor superior a um doslimites arrisca-se a passar desapercebida porque o ensaio nãopermite detectá-la.

As exigências da rubrica «Substâncias aparentadas» damonografia «Substâncias para uso farmacêutico»,nomeadamente no que respeita aos limiares, não se aplica aosexcipientes, como também são excluídos das disposições destarubrica os produtos biológicos, os peptidos, osoligoelementos, os produtos radiofarmacêuticos, os produtosde fermentação e produtos semi-sintéticos derivados, osprodutos à base de plantas e os produtos brutos de origemanimal ou vegetal. Se os limiares indicados na monografiageral não se aplicam, os conceitos gerais de declaração, deidentificação (na medida do possível) e de qualificação dasimpurezas são em compensação válidos para estas classes desubstâncias.

Bases da elaboração das monografias da Farmacopeia

A elaboração das monografias visa as substâncias presentesnos medicamentos que foram autorizados pelas Autoridadescompetentes que aderiram à Farmacopeia Europeia. Estasmonografias não incluem, portanto, necessariamente todas assubstâncias para uso farmacêutico presentes no mercadomundial.

As impurezas orgânicas e inorgânicas presentes nassubstâncias objecto de avaliação pelas Autoridadescompetentes são, por este facto, qualificadas do ponto de vistada sua inocuidade no teor máximo autorizado (dose diáriamáxima), a menos que novos dados sobre a inocuidade,posteriores à avaliação, justifiquem limites mais baixos.

As monografias das substâncias para uso farmacêutico daFarmacopeia Europeia são elaboradas por grupos de peritos egrupos de trabalho que funcionam em colaboração com asAutoridades nacionais da Farmacopeia, as autoridadescompetentes em matéria de autorização de entrada no


5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico

mercado, os laboratórios nacionais de controlo e o laboratórioda Farmacopeia Europeia; eles são igualmente assistidos nassuas tarefas pelos produtores das substâncias e/ou fabricantesda indústria farmacêutica que as utilizam.

Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico

A qualidade das substâncias no que respeita às impurezas écontrolada por um conjunto de ensaios prescritos nasmonografias. Estes ensaios têm como finalidade incluir asimpurezas orgânicas e inorgânicas pertinentes em vista dasorigens donde provieram as substâncias activas contidas nosmedicamentos autorizados.

O controlo dos solventes residuais é objecto das disposiçõescontidas na monografia geral «Substâncias para usofarmacêutico» e no capítulo geral «Solventes residuais». Ocertificado de conformidade para uma monografia daFarmacopeia Europeia indica, para uma substância de uma dadaorigem, quais são os solventes residuais controlados assimcomo os critérios de aceitação específicos e o método decontrolo validado se for diferente dos métodos descritos nocapítulo geral «Identificação e controlo dos solventes residuais».

As monografias das substâncias químicas orgânicascomportam geralmente um ensaio intitulado «Substânciasaparentadas» que abarca as impurezas orgânicas pertinentes.Pode ser completado por outros ensaios, específicos, quando oensaio de carácter geral não permite controlar uma dadaimpureza ou quando razões particulares (por exemplo, emrelação com a inocuidade) justificam que seja prescrito umcontrolo especial.

Quando a monografia cobre substâncias que apresentamperfis de impurezas diferentes, pode conter um ensaio dassubstâncias aparentadas único que inclua todas as impurezasmencionadas na rubrica «Impurezas» ou incluir váriosensaios que permitam o controlo de todos os perfis deimpurezas. É, então, possível verificar a conformidade damonografia aplicando somente os ensaios que são pertinentescom vista ao perfil de impurezas conhecido para a substânciae a origem consideradas.

Podem, assim, figurar instruções relativas ao controlo dasimpurezas na rubrica «Produção» numa monografia, porexemplo, quando só um método de controlo de uma impurezaé utilizado pelo fabricante porque é tecnicamente demasiadocomplexo para ser de uso geral ou não pode ser aplicado àsubstância farmacêutica final e/ou quando a validação doprocesso de produção (compreendendo a etapa de purificação)constitui uma garantia de controlo suficiente.

Rubrica «lmpurezas» das monografias de princípios activos

A rubrica «Impurezas» de uma monografia apresenta a listadas impurezas (com estrutura e denominação química, namedida do possível), geralmente orgânicas, de que se sabe quesão detectadas pelos ensaios prescritos na monografia. Estainformação é baseada nos dados disponíveis quando daelaboração ou da revisão da monografia e não énecessariamente exaustiva. A rubrica compreende asimpurezas especificadas e, se for caso disso, as outrasimpurezas detectáveis.

A todas as impurezas especificadas está associado um critériode aceitação que não é superior ao autorizado pelasAutoridades competentes.

As outras impurezas detectáveis são impurezas potenciais deestrutura definida que não são normalmente presentes para

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além de um limiar de identificação nas substâncias queentram na composição de medicamentos autorizados pelasAutoridades competentes. São citadas para informação narubrica «Impurezas».

Se além das impurezas especificadas e outras impurezasdetectáveis de um princípio activo aparecer qualquer outraimpureza, incumbe ao utilizador da substância verificar, emfunção do teor e da natureza dessa impureza bem como dadose diária máxima e do limiar de identificação/qualificaçãoapropriado se a sua identificação/qualificação é ou nãonecessária em termos da monografia geral «Substâncias parauso farmacêutico», rubrica «Substâncias aparentadas».

É importante notar que limiares específicos são aplicados àssubstâncias para uso exclusivamente veterinário.

Interpretação do ensaio das substâncias aparentadas nasmonografias dos princípios activos

Qualquer monografia específica de uma substância para usofarmacêutico deve ser lida e interpretada conjuntamente coma monografia geral «Substâncias para uso farmacêutico».

Quando uma monografia estabelece, para as impurezas, umcritério de aceitação geral («qualquer outra impureza»,«outras impurezas», «qualquer impureza») que equivale a umteor nominal superior ao limiar de identificação aplicável paraa substância considerada (ver monografia geral «Substânciaspara uso farmacêutico») este limite aplica-se unicamente àsimpurezas especificadas citadas na rubrica «Impurezas». Sesão presentes outras impureza, convém determinar, à luz dasdisposições da monografia geral, se é necessário identificá-las(na medida do possível), declará-las, especificá-las e qualificá-las. Incumbe ao utilizador da substância determinara validade dos critérios de aceitação para as impurezas nãocitadas na rubrica «Impurezas» ou citadas como outrasimpurezas detectáveis.

Os exemplos juntos são apresentados com a finalidade deajudar à interpretação dos critérios de aceitação dasimpurezas nas monografias específicas. Estes exemploscorrespondem a diversas apresentações redaccionaisactualmente empregadas nas monografias na expectativa deuma harmonização para uma futura edição.

Exemplo 1

A monografia de uma substância para uso humano incluiuma rubrica «Impurezas» onde estão incluídas 8 impurezas(A-H) das quais 2 (G,H) mencionadas como outras impurezasdetectáveis e especifica os critérios de aceitação seguintes:

– impureza A: no máximo, a área do pico principal do croma-tograma obtido com a solução padrão (b) (0,5 por cento),

– qualquer outra impureza: no máximo, a área do picoprincipal do cromatograma obtido com a solução padrão(c) (0,2 por cento),

– total: no máximo, 2 vezes a área do pico principal do croma-tograma obtido com a solução padrão (b) (1,0 por cento),

– limite de exclusão: 0,25 vezes a área do pico principal do croma-tograma obtido com a solução padrão (c) (1,0 por cento),

Uma substância satisfará ao ensaio se:

– a impureza A está presente numa concentração nominalinferior ou igual a 0,5 por cento,

– as impurezas B, C, D, E e F estão cada uma presentes numaconcentração nominal inferior ou igual a 0,2 por cento,

– qualquer outra impureza está presente numa concentração

nominal inferior ou igual ao limiar de identificaçãoaplicável para a substância activa considerada,

– a soma das concentrações nominais das impurezaspresentes num teor superior ao limite de exclusão éinferior ou igual a 1,0 por cento.

Exemplo 2

A monografia de uma substância para uso humano incluiuma rubrica «Impurezas» onde são incluídas 6 impurezas (A-F) com os critérios de aceitação seguintes:

Se, no cromatograma obtido com a solução problema,aparecerem outros picos, além do pico principal, nenhumtem área superior à área do pico principal do cromatogramaobtido com a solução padrão (b) (0,5 por cento) e a soma dassuas áreas não é superior a 2 vezes a área do pico principal docromatograma obtido com a solução padrão (b) (1,0 porcento). Não considere um pico devido ao «branco» nem picosde área inferior a 0,1 vezes a área do pico principal docromatograma obtido com a solução padrão (b).


– as impurezas A, B, C, D, E e F estão cada uma presentes numaconcentração nominal inferior ou igual a 0,5 por cento,

– qualquer outra impureza está presente numa concentraçãonominal inferior ou igual ao limiar de identificaçãoaplicável para a substância activa considerada,


Exemplo 3

A monografia, mais explícita, de uma substância para usohumano cuja dose diária máxima não ultrapassa 2 g/dia incluiuma rubrica «Impurezas» onde estão incluídas 7 impurezas(A-F) definidas como Impurezas especificadas e 1 (G)mencionada como Outras impurezas detectáveis.

Limites:

– factor de correcção: para o cálculo do teor, multiplique aárea do pico da impureza A por 2,3,

– impureza B: no máximo, 3 vezes a área do pico principaldo cromatograma obtido com a solução padrão (a) (0,3 por cento),

– impureza E: no máximo, 4 vezes a área do pico principal do cromatograma obtido com a solução padrão (a) (0,4 por cento),

– impurezas A, C, D e F: para cada impureza, no máximo, 2vezes a área do pico principal do cromatograma obtido coma solução padrão (a) (0,2 por cento),

– qualquer outra impureza: para cada impureza, no máximo,a área do pico principal do cromatograma obtido com asolução padrão (a) (0,1 por cento),

– total: no máximo, a área do pico principal do cromatogramaobtido com a solução padrão (b) (1,0 por cento),

– limite de exclusão: 0,5 vezes a área do pico principal do croma-tograma obtido com a solução padrão (a) (0,05 por cento).


– a impureza B está presente numa concentração nominalinferior ou igual a 0,3 por cento,

– a impureza E está presente numa concentração nominalinferior ou igual a 0,4 por cento,



5. Textos gerais

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– as impurezas A, C, D e F estão cada uma presentes numaconcentração nominal inferior ou igual a 0,2 por cento,sendo a área do pico da impureza A multiplicada por 2,3para o cálculo do teor,

– qualquer outra impureza está presente numa concentraçãonominal inferior ou igual a 0,10 por cento (limiar deidentificação),


Recomendações aos utilizadores de monografias deprincípios activos

As monografias fornecem especificações que visam garantirque as substâncias cujos perfis de impurezas correspondemaos tomados em conta quando da elaboração e/ou revisão damonografia são de qualidade apropriada. Incumbe aoutilizador da substância verificar se a monografia permite umcontrolo adequado das impurezas para uma substância dedeterminada origem, nomeadamente por meio do processo de certificação de conformidade das monografias da Farmacopeia.

Uma monografia que inclui um ensaio de substânciasaparentadas baseado num método quantitativo (por exemplo,a cromatografia líquida, a cromatografia em fase gasosa e aelectroforese capilar) assegura um controlo adequado dasimpurezas, para uma substância de uma determinada origem,se as impurezas presentes num teor superior ao limiar deidentificação aplicável são impurezas especificadasmencionadas na rubrica «Impurezas».

Se a substância contém outras impurezas além dasmencionadas na rubrica «Impurezas», há que verificar se elassão detectáveis pelo método descrito na monografia. Se nãofor esse o caso, será necessário desenvolver um novo métodoe solicitar a revisão da monografia. Segundo os teoresdetectados e os limites propostos, será de encarar aidentificação e/ou a qualificação destas impurezas.

Quando um ensaio de substâncias aparentadas único cobrevários perfis de impurezas, só são de mencionar no certificadode análise as impurezas pertinentes para o perfil conhecidoassociado a uma origem particular, a menos que o detentor daautorização de colocação no mercado não utilize substânciasactivas que apresentem perfis de impurezas diferentes.

Identificação das impurezas (atribuição dos picos)

Quando uma monografia especifica um limite individual parauma impureza, é muitas vezes necessário definir um meio deidentificar essa impureza, por exemplo, com a ajuda desubstâncias de referência, de um cromatograma representativoou da retenção relativa. O utilizador pode julgar necessárioidentificar impurezas para além daquelas para as quais amonografia fornece um meio de identificação, por exemplo,com o objectivo de verificar a aplicabilidade da especificaçãode um determinado perfil de impurezas por comparação com arubrica «Impurezas». A Farmacopeia não fornece outrassubstâncias de referência, cromatogramas representativos ouinformações sobre as retenções relativas além dos indicados namonografia. Cabe, pois, aos utilizadores escolher as técnicascientíficas de identificação disponíveis.

Novas impurezas/impurezas especificadas presentes numteor superior ao limite indicado

Quando a utilização de um novo método de produção ou amodificação de um processo já utilizado conduz ao

aparecimento de uma nova impureza, é necessário aplicar asprescrições da monografia geral «Substâncias para usofarmacêutico», no que respeita a identificação e qualificação,e verificar a capacidade da monografia de permitir o controlodessa impureza. Os certificados de conformidade constituemum meio de confirmar, para uma substância de determinadaorigem, que a nova impureza é adequadamente controlada,ou fazer a proposta de um método de controlo com umcritério de aceitação definido. Neste último caso, serádeterminada uma revisão da monografia.

Quando a utilização de um novo método de produção ou amodificação de um processo já utilizado conduz à presença deuma impureza especificada com um teor superior ao limiteespecificado, é necessário aplicar as disposições da monografiageral «Substâncias para uso farmacêutico» no que respeita àqualificação.

Métodos cromatográficos

O capítulo geral 2.2.46. Técnicas de separação cromatográficatrata de diferentes aspectos do controlo das impurezas.

Para todos os fins úteis, estão disponíveis no site da DEQM(www.pheur.org) informações sobre o nome comercial dascolunas e outros reagentes e equipamentos que demonstraramserem convenientes quando da elaboração das monografias.

GLOSSÁRIO

Outras impurezas detectáveis: impurezas potenciais deestrutura definida de que se sabe que são detectadas pelosensaios da monografia mas que não são normalmentepresentes acima do limiar de identificação nas substânciasque entram na composição dos medicamentos autorizadospelas Autoriidades competentes. Fazem parte das impurezasnão especificadas e são, portanto, limitadas por um critério deaceitação global.

Concentração nominal: concentração de uma impurezacalculada a partir da concentração da solução padrão prescritae tendo em conta o factor de correcção prescrito.

Impureza: numa substância para uso farmacêutico, qualquercomposto além da entidade química definida como sendo essasubstância.

Impureza identificada: impureza cuja caracterizaçãoestrutural foi realizada.

Impureza não identificada: impureza cuja caracterizaçãoestrutural não foi realizada e que é unicamente definida porpropriedades analíticas de ordem qualitativa (retençãorelativa, por exemplo).

Impureza não especificada: impureza limitada por umcritério de aceitação global e não individualmente citada comum critério de aceitação específico.

Impureza potencial: impureza teoricamente susceptível deaparecer quando da produção ou da conservação. Pode ounão estar efectivamente presente na substância. Quando sesabe que uma impureza potencial é detectada pelos ensaiosda monografia mas não é normalmente presente nassubstâncias que entram na composição dos medicamentosautorizados pelas Autoridades competentes, ela será citadapara informação na rubrica «Impurezas» nas Outrasimpurezas detectáveis.



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Impureza especificada: impureza individualmente citada e limi-tada numa monografia por um critério de aceitação específico.Uma impureza especificada pode ser ou não ser identificada.

Limite de exclusão: nos ensaios cromatográficos, teor nominalaté ao dos picos/sinais não são considerados para o cálculo dasoma das impurezas. O limite de exclusão e o limiar dadeclaração têm geralmente o mesmo valor numérico.

Qualificação: processo de aquisição e de avaliação dos dadosque estabelecem a inocuidade biológica de uma impurezaespecificada ou de um determinado perfil de impurezas noteor ou teores especificados.

Limiar de declaração: limite a partir do qual uma impurezadeve ser declarada.

Limiar de qualificação: limite a partir do qual tem lugar aqualificação de uma impureza.

Limiar de identificação: limite a partir do qual uma impurezadeve ser identificada.

Substâncias aparentadas: nas monografias, título dado aosensaios de carácter geral para as impurezas orgânicas.



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5.11. CARACTERÍSTICASNAS MONOGRAFIAS

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5.11. Características nas monografias

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5.11. CARACTERÍSTICAS NAS MONOGRAFIAS

Como se indica nas Prescrições Gerais, as indicações quefiguram na rubrica «Características» não são para interpretarde modo rigoroso e não constituem exigências. A título deinformação para os utilizadores, os métodods recomendadospelos autores das monografias como base para as indicaçõesdizendo respeito à higroscopicidade, cristalinidade esolubilidade são apresentadas a seguir.

HIGROSCOPICIDADE

Este método é para ser realizado nos produtos em cujamonografia se exige que satisfaçam aos ensaios de perda porsecagem ou de água. Dá indicação da higroscopicidade dasubstância sem ser uma verdadeira determinação desta.

Utilize uma caixa de pesagem de vidro de 50 mm de diâmetroexterno e 15 mm de altura. Pese a caixa e a tampa (m1).Introduza a quantidade de substância especificada no ensaiode perda por secagem ou água e pese de novo (m2). Coloque acaixa não fechada num exsicador apropriado contendo umasolução saturada de cloreto ou de sulfato de amónio, a 25°C,ou numa estufa climática regulada para 25°C e 80 ± 2 porcento de humidade relativa. Deixe em repouso durante 24 h.Coloque a tampa na caixa e pese (m3).

Calcule o aumento de massa em percentagem usando aexpressão:

� 100

O resultado é expresso do seguinte modo:

– deliquescente: absorção de água suficiente para que hajaformação de uma solução,

– muito higroscópico: aumento de massa superior ou igual a15 por cento,

– higroscópico: aumento de massa inferior a 15 por cento esuperior ou igual a 2 por cento,

– ligeiramente higroscópico: aumento de massa inferior a 2por cento e superior ou igual a 0,2 por cento.

CRISTALINIDADE

Este método é empregado para estabelecer o caráctercristalino ou amorfo de uma substância.

m3 � m2�m2 � m1

Numa lâmina de vidro limpa coloque algumas partículas daamostra em óleo mineral. Examine ao microscópiopolarizante. As partículas cristalinas apresentam umabirrefringência e observam-se posições de extinção quando darotação do suporte da lâmina.

SOLUBILIDADE

A quantidade máxima de substância necessária para esteensaio é de 111 mg (para cada solvente) e o volume máximode solvente é de 30 ml.

Procedimento de dissolução

Agite energicamente durante 1 min e coloque numa mantatermostatada à temperatura de 25,0 ± 0,5°C durante 15 min.Se a dissolução da amostra for incompleta, agite novamentedurante 1 min e coloque na manta termostatada durante mais15 min.

Método

Pese para um tubo com rolha esmerilada (160 mm � 160 mm)100 mg da amostra finamente pulverizada (90). Junte 0,1 mldo solvente e proceda como descrito no procedimento dedissolução. Se a dissolução for completa, a amostra é muitosolúvel.

Se a dissolução for incompleta, junte 0,9 ml do solvente eproceda como descrito no procedimento de dissolução. Se adissolução for completa a amostra é facilmente solúvel.

Se a dissolução for incompleta, junte 2,0 ml do solvente eproceda como descrito no procedimento de dissolução. Se adissolução for completa a amostra é solúvel.

Se a dissolução for incompleta, junte 7,0 ml do solvente eproceda como descrito no procedimento de dissolução. Se adissolução for completa a amostra é ligeiramente solúvel.

Se a dissolução for incompleta, pese 10 mg da amostrafinamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte 10,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimentode dissolução. Se a dissolução for completa a amostra é poucosolúvel.

Se a dissolução for incompleta, pese 1 mg da amostrafinamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte 10,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimentode dissolução. Se a dissolução for completa a amostra é muitopouco solúvel.

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