CAMILA RIBEIRO CAETANO Separação de pesticidas através da...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA – EEL/USP

CAMILA RIBEIRO CAETANO

Separação de pesticidas através da técnica Cromatografia

Eletrocinética Micelar.

Lorena - SP

2014

3

Separação de pesticidas através da técnica Cromatografia

Eletrocinética Micelar

Monografia apresentada à Escola de

Engenharia de Lorena da Universidade de

São Paulo para obtenção da Graduação em

Engenharia Química.

Método quantitativo: Ex- post facto

Área de concentração: Tecnologia Química

Orientadora: Profa. Jayne Carlos de Souza

Barboza

Lorena 2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA AFONTE

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Caetano, Camila Ribeiro Separação de pesticidas através da técnicaCromatografia Eletrocinética Micelar / CamilaRibeiro Caetano; orientadora Jayne Carlos de SouzaBarboza. - Lorena, 2014. 50 p.

Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaQuímica - Escola de Engenharia de Lorena daUniversidade de São Paulo. 2014Orientadora: Jayne Carlos de Souza Barboza

1. Pesticidas. 2. Triazinas. 3. Contaminação deáguas subterrâneas. 4. Cromatografia eletrocinéticamicelar. I. Título. II. Barboza, Jayne Carlos deSouza, orient.

2

“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades,

lembrai-vos de que as grandes coisas do homem

foram conquistadas do que parecia impossível.”

Charles Chaplin

4

RESUMO

CAETANO, C. R. Separação de pesticidas através da técnica Cromatografia

Eletrocinética Micelar. Projeto de monografia – Escola de Engenharia de Lorena,

Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.

A contaminação de solos e de águas subterrâneas com pesticidas é um sério problema

ambiental. Para detectar e separar baixas concentrações de pesticidas, são necessárias técnicas

cromatográficas. A Cromatografia Eletrocinética Micelar foi utilizada para encontrar um

método para separar cinco pesticidas: ametrina, atrazina, simazina, terbutilazina e terbutrina a

uma concentração de 2,5 ppm. Esta técnica é um tipo de eletroforese capilar, que emprega

como surfatante o Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTAB) e padrão o Tetraborato de disódio

decahidratado (BORAX). O método eletroforético desenvolvido para a melhor separação dos

pesticidas utilizou 12,5 mM de padrão BORAX + 5 mM de surfatante CTAB. A solução

padrão foi introduzida sob pressão de 0,3 psi durante 3 s e a amostra sob pressão de 0,5 psi

durante 5 s e a separação conduzida em um capilar de sílica fundida sob um potencial de 15

kv.

Palavras-chave: Pesticidas, Triazinas, Contaminação de águas subterrâneas, Cromatografia

Eletrocinética Micelar.

5

ABSTRACT

CAETANO, C. R. Separation of pesticides by the technique Micellar Electrokinetic

Chromatography. Projeto de monografia – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de

São Paulo, Lorena, 2014.

Contamination of soils and groundwater with pesticides is a serious environmental

problem. To separate and detect low concentrations of pesticides, chromatographic techniques

are required. Micellar Electrokinetic Chromatography was used to find a method to separate

five pesticides: ametryn, atrazine, simazine, terbuthylazine and terbutryne at concentration 2.5

PPM. This technique is a type of capillary electrophoresis that uses cetyltrimethylammonium

bromide (CTAB) as surfactant and disodium tetraborate decahydrate (BORAX) as standard

solution. The eletrophoretic method developed uses 12,5 mM standard solution BORAX + 5

mM surfactantant CTAB. The standard solution was inject in the eletrophoretic system under

pressure of 0,3 psi during 3 s and the sample solution under pressure of 0,5 psi during 5 s and

the separation was carried out in a fused silica capillary under a potential of 15 kv.

Keywords: Pesticides, Triazines, Contamination of groundwater, Micellar Electrokinetic

Chromatography.

6

Lista de figuras

Figura 1: Processos e zonas de águas de superfície .................................................................. 14

Figura 2: Estrutura da ametrina ................................................................................................ 16

Figura 3: Estrutura da atrazina .................................................................................................. 17

Figura 4: Estrutura da simazina ................................................................................................ 17

Figura 5: Estrutura da Terbutilazina ......................................................................................... 18

Figura 6: Estrutura da Terbutrina .............................................................................................. 19

Figura 7: Processos que determinam a velocidade dos pesticidas no solo. .............................. 20

Figura 8: Forças atuantes em um íon e sua esfera iônica durante sua migração eletroforética 26

Figura 9: Representação da formação do fluxo eletroosmótico ............................................... 27

Figura 10: Ilustração esquemática do princípio de separação de uma cromatografia

eletrocinética micelar (MEKC) ................................................................................................ 29

Figura 11: Representação da janela de eluição de solutos ........................................................ 30

Figura 12: Equipamento Beckman P/ ACE MDQ .................................................................... 31

Figura 13: Eletroferograma da separação de triazinas com padrão Borax 12,5 mM ................ 34

Figura 14: Eletroferograma da separação de triazinas com solução padrão Borax 12,5 mM +

CTAB 1 mM ............................................................................................................................. 34


CTAB 2 mM ............................................................................................................................. 35


CTAB 3mM .............................................................................................................................. 35


CTAB 5 mM ............................................................................................................................. 36

Figura 18: Representação gráfica da variação da mobilidade do fluxo eletroosmótico em

função de diferentes concentrações da solução de CTAB. ....................................................... 37

Figura 19: Mobilidade efetiva das diferentes triazinas em função da concentração da solução

de CTAB. .................................................................................................................................. 40

Figura 20: Representação do agregado micelar ........................................................................ 41

Figura 21: Separação das triazinas com injeção da solução padrão BORAX 12,5 mM + CTAB

5 mM à pressão 0,1 psi por 1 s. ............................................................................................... 42

7


5 mM à pressão 0,5 psi por 5 s. ................................................................................................ 42


5 mM à pressão 0,5 psi por 10 s. .............................................................................................. 43


5 mM à pressão 0,5 psi por 20 s ............................................................................................... 43


5 mM à pressão 0,5 psi por 30 s. .............................................................................................. 44

Figura 26: Comparação das separações das triazinas com injeção da solução padrão à: 0,1 psi

1s; 0,3 psi 3 s, 0,5 psi 5 s. ......................................................................................................... 45

Figura 27: Comparação da separação das triazinas com injeção de padrão à: 0,5 psi 10 s; 0,5

psi 20 s; 0,5 psi 30 s. ................................................................................................................. 45

Figura 28: Gráfico comparativo entre o comportamento das triazinas em diferentes condições

de injeção e os respectivos picos formados. ............................................................................. 46

8

Lista de tabelas

Tabela 1: Distribuição das diferentes formas de água .............................................................. 13

Tabela 2: Diferença entre as técnicas de separação mais usadas. ............................................. 23

Tabela 3- Soluções e suas respectivas concentrações ............................................................... 33

Tabela 4: Cálculo da mobilidade a partir de diferentes concentrações da solução de CTAB ... 37

Tabela 5: Mobilidades aparentes e efetivas, das diferentes triazinas, em diferentes

concentrações da solução de CTAB. ......................................................................................... 39

Tabela 6: Altura dos picos de cada um dos pesticidas como função das diferentes condições de

injeção da amostra. ................................................................................................................... 46

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Lista de abreviaturas e siglas

BORAX - Tetraborato de Disódio Decahidratado CE – Eletroforese Capilar

CEC – Eletrocromatografia capilar

CG – Cromatografia Gasosa

CGE – Eletroforese capilar em gel

CIEF – Focalização Isoelétrica Capilar

CITP – Isatacoforese Capilar

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLC – Cromatografia Líquida Clássica

CMC – Concentração Micelar Crítica

CSC – Cromatografia Supercrítica

CTAB – Cetyltrimethyllammonium bromide (Brometo de Cetiltrimetilamônio)

CZE – Eletroforese Capilar de Zona

HPLC- High-performance liquid chromatography IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry

MEKC – Micellar Electrokinetic Chromatography (Cromatografia Eletrocinética Micelar)

nL - Nanolitro

10

Sumário 1. Introdução ...........................................................................................................................11

1.1. Contextualização ......................................................................................................... 11

1.2. Justificativa ................................................................................................................ 12

1.3. Objetivos .................................................................................................................... 12

2. Revisão Bibliográfica .........................................................................................................13

2.1 Águas subterrâneas ..................................................................................................... 13

2.2. Pesticidas .................................................................................................................... 14

2.3. Triazinas ..................................................................................................................... 15

2.3.1. Ametrina ................................................................................................................. 16 2.3.2. Atrazina .................................................................................................................. 16 2.3.3. Simazina ................................................................................................................. 17 2.3.4. Terbutilazina (TBA) ............................................................................................... 18 2.3.5. Terbutrina................................................................................................................ 19

2.4. Contaminações de águas subterrâneas por pesticidas ................................................ 19

2.5. Separações Cromatográficas ...................................................................................... 21

2.6 Cromatogramas e eletroferogramas ........................................................................... 23

2.7. Eletroforese Capilar ................................................................................................... 24

2.8. Cromatografia Eletrocinética Micelar ........................................................................ 27

2. Metodologia ........................................................................................................................30

3.2. Instrumentação ............................................................................................................... 31

3.3. Condições da coluna do capilar .................................................................................. 31

3.4. Condições de separação ............................................................................................. 32

3.5. Preparo das soluções .................................................................................................. 32

4. Resultados e discussões ......................................................................................................34

5. Conclusão ...........................................................................................................................47

REFERÊNCIAS .......................................................................................................................48

11

1. Introdução

1.1. Contextualização

Em torno de 12 mil anos atrás, a agricultura revolucionou a sociedade e a maneira em que

as pessoas viviam. Esse desenvolvimento foi chamado de “Revolução Neolítica”. O Estilo de

vida dos caçadores e coletores tradicionais foi deixado para trás em favor de assentamentos

permanentes e uma fonte de alimento confiável. Fora da agricultura, cidades e civilizações

cresceram e culturas e animais precisaram ser explorados para atenderem a demanda. Assim, a

população mundial cresceu, de cinco milhões de pessoas há dez mil anos atrás para sete bi-

lhões hoje (NATIONAL GEOGRAPHY, 2005).

Hoje, para o controle de pragas, há a prática de cultivos geneticamente modificados,

feitos com o objetivo de produzir inseticidas próprios ou com resistência a grandes herbicidas

de espectro ou pragas. O Brasil tem se destacado no consumo de agroquímicos sendo que, em

2012, consumiu 823,2 milhões de toneladas destes produtos (SINDAG, 2013).

Embora tenham contribuído significantemente para reduzir perdas causadas por pragas

na colheita, os pesticidas são nocivos à saúde humana. Sua nocividade deve-se não somente à

sua toxidade, mas também à sua biodisponibilidade. Um pesticida ligado ao solo e que não

tem potencial de lixiviar para águas subterrâneas, não representa ameaça à saúde humana, in-

dependente da sua toxidade (ERNY et al., 2011).

Cerca de trinta e cinco por cento dos pesticidas produzidos são herbicidas e, destes,

destaca-se o grupo de triazinas. Para entender o comportamento dos herbicidas no solo e seu

longo tempo de permanência, é necessário conhecer os processos que governam a acumulação

e mobilidade dos mesmos no solo. Após a entrada do herbicida no solo, os perigos de conta-

minação de águas subterrâneas são resultados dos processos de adsorção-dessorção, transfor-

mação e transporte de pesticidas, das suas propriedades físico-químicas e, também, das condi-

ções hidrogeológicas no solo (DORFLER; FEICHT; SCHEUNERT, 1997).

12

1.2. Justificativa

Pela persistência e degradação dos pesticidas, é importante determiná-los e separá-los.

A maioria dos herbicidas triazínicos é determinada por técnicas cromatográficas como croma-

tografia líquida de alta performace (HPLC) ou cromatografia gasosa (CG). Ultimamente, a

eletroforese capilar (CE) tem sido uma técnica analítica muito usada. Esta técnica possui van-

tagens em relação ao HPLC e a CG como: a alta eficiência de separação dos compostos em

menores tempos; um menor volume de amostras; e baixo consumo de solventes orgânicos na

detecção de compostos polares. A técnica CG não consegue determinar, diretamente, compos-

tos polares devido à sua baixa volatilidade. A técnica usada é um tipo de eletroforese capilar,

mas como possui duas fases, a pseudo estacionária e a móvel, é também considerada uma téc-

nica de cromatografia, por isso chama-se Cromatografia Eletrocinética Micelar.

1.3. Objetivos

Devido à contaminação de águas superficiais por pesticidas e também à dificuldade de

detectá-los quando em baixas concentrações, este trabalho visa encontrar o melhor método de

separação de cinco pesticidas em baixas concentrações (2,5 ppm) através da técnica

cromatografia eletrocinética micelar. Os pesticidas estudados são: ametrina, atrazina,

simazina, terbutilazina e terbutrina.

13

2. Revisão Bibliográfica

2.1 Águas subterrâneas

A substância mais abundante do planeta Terra é a água. Ela é um fator importante para

manter a temperatura do nosso planeta adequada para a existência de vida humana e, também,

no progresso e evolução da civilização.

Apesar de ser abundante, a sua maior parte, 96,5%, está localizada nos oceanos e, se

excluirmos a água congelada dos polos, somente 0,76% é doce e destes, 98% está localizado

no subsolo (CHOW; MAIDMENT; MAYS, 1988). A tabela 1 mostra a distribuição das

diferentes formas de água encontradas na Terra.

Tabela 1: Distribuição das diferentes formas de água

Fonte: ADAPTADA DE CHOW; MAIDMENT; MAYS, 1988 Por ser a maior fonte de água doce do planeta, as águas subterrâneas são estratégicas

para o desenvolvimento econômico da sociedade e essenciais para a nossa sobrevivência.

Item Área (106 km2) Volume (km3) Porcentagem total de água

Porcentagem total de água doce

Oceanos 361.3 1,338,000,00 96.5 Água Subterrânea Doce Salgada

134.8 134.8

10,530,000 12,870,000

0.76 0.93

30.1

Umidade/solo 82 16,500 0.0012 0.05 Geleiras e Calotas Polares

16 24,023,500 1.7 68.6

Outros tipos de gelo e neve

0.3 340,600 0.025 1.0

Lagos Doce Salgado

1.2 0.8

91,000 85,400

0.007 0.006

0.26

Pântanos 2.7 11,470 0.0008 0.03 Rios 148.8 2,120 0.0002 0.006 Atmosfera/Vapor d água

510.0 12,900 0.001 0.04

Total de água 510.0 1,385,984,610 100 Água doce 148.8 35,029,210 2.5 100

14

A sua ocorrência depende de três fatores (figura 1) a infiltração da água superficial no

solo, o escoamento da superfície pelo solo e o fluxo de água subterrânea entre o solo e suas

formações rochosas.

A água subterrânea pertence a um processo iterativo e dinâmico do ciclo hidrológico,

em que se infiltra e se torna subterrânea e, de acordo com o tipo de aquífero, passa por

recargas constantes, como de chuvas ou corpos de água e, também, sofre influência indireta e

direta das ações humanas (RIBEIRO, 2007).

Figura 1: Processos e zonas de águas de superfície

Fonte: ADAPTADO DE CHOW; MAIDMENT; MAYS, 1988

2.2. Pesticidas

Pesticidas são compostos químicos usados para matar pragas como insetos, fungos,

roedores e ervas daninha. Apesar da sua nocividade, o uso de pesticidas tem aumentado muito

nos últimos 50 anos, pois é uma das melhores formas de controle de pragas que danificam as

colheitas no setor agrícola e vetores de doenças na área da saúde. (CABRAL et al., 2003)

A Lei nº 7.802 de 11.07.89 (BRASIL, 1989) afirma que:

Agrotóxicos são os produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes ur-banos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flo-ra e da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considera-dos nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfo-lhantes, dessecantes estimuladores e inibidores do crescimento.

15

Sua função na agricultura é o aumento da produtividade, melhoria da qualidade dos

produtos e redução do trabalho e dos gastos com energia.

Podem ser classificados de acordo com sua estrutura química, grau de toxidade ou seu

modo de ação.

Ao agrupar segundo sua estrutura química, os pesticidas são separados de acordo com

a estrutura molecular de seu princípio ativo. Podem ser: Organoclorados, organofosforados,

carbamatos, triazinas, dinitroanilinas e cloroacetaminas.

De acordo com seu grau de toxidade, são classificados pela OMS como: Extremamente

tóxico, altamente tóxico, medianamente e pouco tóxico.

Ao separá-los de acordo com o organismo que atacam, tem-se: Acaricida,

antimicrobiano, avicida, fungicida, herbicida, inseticida, moluscicida, piscicida e rodenicidas.

2.3. Triazinas

Dentre as diversas classes de pesticidas, a mais produzida é a de herbicidas, usada no

controle de ervas daninhas. Trinta por cento de toda a produção de herbicidas pertence ao

grupo de triazinas. As s-triazinas possuem, geralmente, um anel heterocíclico de seis

membros, em que átomos de carbono e nitrogênio estão localizados simetricamente e os

substituintes, localizados nas posições 2, 4 e 6, constituem-se no diferencial entre as diversas

formulações existentes no mercado (CABRAL et al., 2003).

As triazinas são usadas no controle pré e pós-emergente de ervas daninhas. Uma apli-

cação pré-emergente é feita antes da emergência de plantas daninhas e podem ser em pré-

plantio incorporado juntamente ou logo após a semeadura sem incorporação. A aplicação pós-

emergente é realizada após a emergência de ervas daninhas e antes de interferir no desenvol-

vimento da cultura, em razão da competição.

Algumas trazinas serão destacadas:

16

2.3.1. Ametrina

Segundo a IUPAC, sua nomenclatura é: N2-etil-N4-isopropil-6-metiltio-1,2,5-triazina-

2,4-diamina. Bioquimicamente, é um herbicida sistêmico que age como inibidor fotossintético

de transporte de elétrons e é absorvido pela raiz e pelas folhas (Figura 2).

Figura 2: Estrutura da ametrina

Fonte: TOMLIN, 2009

Segundo Tomlin (2009, p. 25) “Usado no controle de ervas daninhas, pré e pós-

emergentes, em abacaxi, frutas cítricas, café, mandioca, milho, cana-de-açúcar, sisal, cacau,

plantas de chás, banana, e azeites.” No Brasil, a triazina é mais usada no cultivo de cana-de-

açúcar.

Para o meio ambiente, a ametrina é tóxica e a perda de solo é devido à sua degradação

microbiana. Pela sua elevada persistência nos solos, hidrólise lenta, alto potencial de escoa-

mento, baixa a moderada solubilidade em matéria orgânica e argila e baixa pressão de vapor,

ela é um contaminante potencial ao solo e águas subterrâneas.

2.3.2. Atrazina

Sua nomenclatura, segundo a IUPAC, é 6-cloro-N2-etil-N4-isopropil-1,3,5-triazina-2,4-

diamina (Figura 3). É um herbicida sistêmico que age como inibidor fotossintético de

transporte de elétrons e é absorvido principalmente pela raiz, mas também pelas folhas,

transportando da base ao ápice pelo xilema e acumula-se nos meristemas apicais e folhas

(TOMLIM, 2009).

17

Figura 3: Estrutura da atrazina

Fonte: TOMLIN, 2009

É usada como herbicida pré e pós-emergente, em cultura de sorgo, milho, abacaxi,

cana-de-açúcar, castanha de macadâmia, coníferas. É também usada em combinação com

outros diversos herbicidas.

Os seus resíduos têm potencial de contaminar águas subterrâneas, solo e pequenos

córregos devido à sua moderada solubilidade, baixa pressão de vapor, moderada adsorção a

matéria orgânica e argila, hidrólise lenta, elevada persistência em solos e alto potencial de

escoamento superficial. Sua composição, nesses ambientes, raramente passa de 2 μg/L e

normalmente é abaixo de 0,1 μg/L. Pode, ainda, em águas superficiais, ser degradada por

fotólise, N-desalquilação por microrganismos e hidrólise do cloro substituinte (CARMO et al.,

2013).

2.3.3. Simazina

Segundo a IUPAC, sua nomenclatura é 6-cloro-N2,N4-dietil-1,3,5-triazina-2,4-

diamina (Figura 4). É um inibidor fotossintético de transporte de elétrons no fotossistema re-

ceptor. Assim como a atrazina, é absorvida principalmente pela raiz, mas também pela folha-

gem, transportando da base ao ápice pelo xilema e acumula-se nos meristemas apicais e folhas

(TOMLIN, 2009).

Figura 4: Estrutura da simazina

Fonte: TOMLIN, 2009

18

Usada no controle de ervas daninhas em culturas de ervilhas, milho, aspargo, sementes,

oliva, abacaxi, morango, frutas cítricas, uva, oleaginosas, tremoço, alcachofra, cana de açúcar,

café, cacau, borracha, ervas para chás.

A decomposição microbiana nos solos resulta em variadas taxas de sua degradação,

que dependem da temperatura e umidade do solo (TOMLIN, 2009). Em condições agrícolas,

possui um baixo potencial de lixiviação. Pode ser degradada por hidrólise ou N-desalquilação.

Sua perda por fotodecomposição direta é insignificante, contudo, deve-se considerar sua

fotodecomposição indireta por fotossensibilizadores, como o ácido húmico.

2.3.4. Terbutilazina (TBA)

Segundo a IUPAC, sua nomenclatura é N2-terc-butil-6-cloro-N4-etil-1,3,5-triazina-2,4-

diamina (Figura 5). Assim como a simazina, é um inibidor fotossintético de transporte de

elétrons no fotossistema receptor e é absorvido principalmente pela raiz da planta (TOMLIN,

2009).

Figura 5: Estrutura da Terbutilazina

Fonte: TOMLIN, 2009

É usada como herbicida pré ou pós-emergente, no controle de ervas daninhas em

culturas de sorgo, milho, uva, frutas cítricas, café, oliva, cacau, ervilhas, batata, sementes,

borracha e cana de açúcar.

É fortemente absorvida pelo solo, mas possui fraca mobilidade. Em água, a sua

degradação depende da atividade biológica e da presença de sedimentos.

19

2.3.5. Terbutrina

Sua nomenclatura pela IUPAC é N2-terc-butil-N4-etil-6-metiltio-1,3,5-triazina-2,4-

diamina (Figura 6). Tomlin (2009, p. 943) afirma que

[...] assim como a simazina e a terbutilazina, é um inibidor fotossintético de transporte de elétrons no fotossistema receptor. E também, como atrazina e simazina, é absorvida principalmente pela raiz, mas também pelas folhas, transportando da base ao ápice pelo xilema e acumula-se nos meristemas apicais e folhas.

Figura 6: Estrutura da Terbutrina

Fonte: TOMLIN, 2009

É usada como herbicida pré-emergente em trigo, cevada, girassóis e cana de açúcar e,

se misturado com terbutilazina, também é usada em batata, ervilha e feijão. Usado como pós-

emergente em cereais, cana de açúcar e em aplicação direta em milho.

Seus resíduos em solo dependem do tipo de solo, clima e taxa da sua aplicação.

Degrada-se em ambientes aquáticos devido aos processos microbiológicos e à fotólise e no

solo principalmente pela atuação de microrganismos. Quantidades consideráveis de terbutrina

são removidas da água pela absorção por sedimentos (TOMLIN, 2009).

2.4. Contaminações de águas subterrâneas por pesticidas

Segundo Dores e Freire (2001, p. 27), no meio científico tem crescido a preocupação em

relação à contaminação de águas superficiais e subterrâneas por pesticidas. Há um grande

número de estudos que mostram a presença de herbicidas em água potável, aumentando

dúvidas sobre os efeitos da sua toxidade para a saúde humana. Dentre os diversos herbicidas,

as triazinas destacam-se como contaminantes do meio ambiente e, além disso, possuem

potencial efeito carcinogênico. A triazina atrazina, por exemplo, é um dos herbicidas mais

20

aplicados no mundo e tem sido detectada frequentemente em reservas de água potável na

Europa (KARABELAS et al., 2009).

Como essa contaminação não é visível e sua exploração é distribuída, há dificuldade

em identificar o problema. Normalmente, essa contaminação é notada quando atingiu larga

extensão (RIBEIRO, 2007).

Segundo Ribeiro (2007, p. 691): “A volatilização, degradação, lixiviação, absorção e

sorção pelas plantas são os fatores que determinam a velocidade e o transporte dos pesticidas

no meio ambiente.”. A interação entre os constituintes do solo e os pesticidas está relacionada

a fatores como: Acidez, temperatura, textura do solo, estrutura molecular, solubilidade e

hidrofobicidade dos pesticidas (Figura 7).

Figura 7: Processos que determinam a velocidade dos pesticidas no solo.

Fonte: RIBEIRO, 2007

Dos processos de transporte entre compartimentos ambientais, são destacados o

escoamento superficial e a lixiviação. O primeiro favorece a contaminação das águas

superficiais através do transporte do agrotóxico adsorvido nas partículas do solo erodido ou

dissolvido em água. A lixiviação dos agrotóxicos, dependendo do tipo de solo, resulta em

contaminação de águas subterrâneas, pois substâncias químicas são levadas junto com a água

que alimenta os aquíferos (MARTINI et al., 2012).

21

2.5. Separações Cromatográficas

Até o início do século 20, as separações analíticas eram, em sua maioria, feitas por

métodos clássicos como destilação, precipitação e extração. Atualmente, essas separações são

feitas, normalmente, por cromatografia e eletroforese, particularmente em amostras complexas

e com muitos componentes.

A cromatografia é um método de separação aplicado em diversos ramos da ciência. Foi

desenvolvida no início do século 20 por Mikhail Tswett. Em seus primeiros experimentos, as

substâncias separadas apareciam como bandas coloridas na coluna, o que levou a nomear a

técnica dessa forma (em grego, chroma significa “cor” e graphein significa “escrita”)

(SKOOG; HOLLER; CROUCH, 2009).

Para a separação e detecção de pesticidas, a cromatografia é a técnica mais usada e

indicada devido aos seus detectores muito sensíveis e seletivos. A baixa concentração em que

se encontram os pesticidas em amostras do meio ambiente exige elevada detectabilidade.

Em relação à instrumentação analítica, a ciência das separações contemplou, nas

últimas décadas, grandes avanços tecnológicos. A cromatografia em fase gasosa (CG) foi

introduzida nos anos 50, a cromatografia em fase líquida (HPLC) foi introduzida na década de

70. A grande técnica de instrumentação de separação, a eletroforese capilar, foi introduzida

nos anos 80. O grande e rápido avanço da eletroforese capilar decorre, em parte, da sua

simples parte instrumental, mas em especial, da variedade dos modos de separação que podem

ser realizados em uma única coluna capilar e da variedade de compostos suscetível de análise

em cada modo (TAVARES, 1997).

Ultimamente, métodos de separação baseados em técnicas cromatográficas e

eletroforéticas têm sido empregados nas diversas áreas da ciência. Eles estão disponíveis em

diferentes modos de operação e de arranjos instrumentais e apresentam ampla aplicabilidade

por possibilitarem a separação de analitos muito semelhantes em matrizes complexas, como

amostras biológicas e ambientais, fármacos e alimentos.

A cromatografia é um método de separação de componentes de uma mistura, em que a

separação depende da distribuição das diferentes moléculas entre duas fases: uma fase

estacionária e uma fase móvel. A cromatografia pode ser usada para identificar compostos,

comparando com padrões previamente existentes, para purificar compostos, separando-se

22

compostos indesejáveis e para separar componentes de uma mistura. Os tipos de

cromatografia se classificam, considerando vários critérios, como técnica empregada,

mecanismo de separação, tipo de fase utilizada e tipo de superfície que ocorre a separação.

Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em

cromatografia em coluna e cromatografia planar. Em termos de fase móvel empregada, são

três os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa (CG), a cromatografia líquida (CL) e a

cromatografia supercrítica (CSC). A cromatografia líquida se subdivide em cromatografia

líquida clássica (CLC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), mundialmente

conhecida por HPLC. A classificação quanto ao modo de separação pode ser por afinidade,

adsorção, exclusão de tamanhos, partição, permuta iônica, ou por uma combinação de alguns

destes. Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e

quimicamente ligadas.

As técnicas que mais se destacam na indústria é a cromatografia gasosa (CG) e a

líquida de alta eficiência (HPLC). A tabela 2 mostra as vantagens e desvantagens das duas

técnicas mais usadas e da eletroforese capilar.

23

Tabela 2: Diferença entre as técnicas de separação mais usadas.

Técnica Vantagens Desvantagens Soluções CG -Alta Capacidade de

separação dos picos; -Alta sensibilidade e seletividade.

-Inadequado para análises de compostos polares, termolábeis e de baixa volatilidade; -Consumo de gases de alta pureza.

-Uso de reações de derivatização.

HPLC -Permite a análise de compostos orgânicos, mesmo os termoinstáveis; -Maior flexibilidade para otimização das separações, por permitir a variação tanto da fase móvel quanto da fase estacionária; -Facilidade de automação e acoplamento a sistemas de preparo de amostras “online”.

-Menor capacidade de separação; -Grande consumo de solventes orgânicos; -Elevado custo operacional (exige o uso de colunas e solventes caros de alta pureza).

-Desenvolvimento de colunas analíticas mais eficientes e de menor tamanho, permitindo melhores separações e menor consumo de solventes.

CE -Alta capacidade de separação; -Baixo consumo de solventes; -Menor necessidade de preparo de amostras.

-Baixa sensibilidade. -Preparo de amostras com etapa de pré-concentração; -Uso de procedimentos eletroforéticos de pré-concentração “online”; -Utilização de detectores altamente seletivos (como os detectores de fluorescência induzida a laser ou espectrômetros de massas).

Fonte: ADAPTADA DE COSTA, 2008

2.6 Cromatogramas e eletroferogramas

Nas análises feitas em cromatógrafos e em sistemas de eletroforese, os resultados são

gerados em forma de cromatogramas e eletroferogramas, respectivamente.

São gráficos úteis para análises quantitativas e/ou qualitativas. As posições dos picos

no eixo do tempo são usadas para identificar os componentes e as áreas sob os picos fornece

uma medida da quantidade de cada um dos componentes (SKOOG; HOLLER; CROUCH,

2009).

24

Na análise qualitativa, fornecem apenas o tempo de retenção de cada espécie na

amostra ou a sua posição na fase estacionária depois de certo tempo de eluição. Devido a essa

característica, a cromatografia é uma técnica usada para reconhecer ausência ou presença de

componentes de misturas que contém um número limitado de substâncias possíveis.

A análise quantitativa é baseada na comparação da altura ou área do pico do analito com a

de um ou mais padrões. É importante ver que as alturas dos picos são inversamente

proporcionais as suas larguras; portanto, a exatidão dos resultados obtidos utilizando a altura

de pico vai depender das variações nas condições da coluna. A vazão do eluente, a temperatura

e a velocidade de injeção da amostra não podem alterar a largura do pico durante o tempo

necessário para obter o cromatograma da amostra e do padrão (SKOOG; HOLLER;

CROUCH, 2009).

Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito ou de uma

propriedade como, por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o menor valor de

concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado pelo método. O limite de

detecção do equipamento (LDE) é definido como a concentração do analito que produz um

sinal de três a cinco vezes a razão ruído/sinal do equipamento. O Limite de Quantificação

(LDQ) é a menor concentração do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de

precisão e veracidade e deve ser maior que dez vezes a razão ruído/sinal do equipamento

(RIBANI et al., 2004).

2.7. Eletroforese Capilar

Segundo Saito (2011, p. 20), a eletroforese capilar (CE), é uma técnica de separação

em que compostos carregados migram diferenciadamente por ação de um campo elétrico.

Dessa forma, a separação ocorre por diferenças nas propriedades das espécies como carga e

massa.

A separação é deslocada em capilares de 10 a 100 µm de diâmetro interno e 30 a 100

cm de comprimento, preenchidos com eletrólito condutor e submetido à ação de campo

elétrico de corrente contínua. É feita uma injeção de uma quantidade pequena de amostra, em

torno de 0,1 a 10 nL, em uma solução tampão no tubo, em seguida aplica-se uma alta

diferença de potencial, normalmente entre 5 a 30 kV, sobre a extensão do tampão, com um par

de eletrodos que estão em cada extremidade do sistema. Os íons da amostra migram em

25

direção uns aos outros devido à ação do campo elétrico (SKOOG; HOLLER; CROUCH,

2009).

O uso de capilar oferece muitos benefícios em relação aos outros meios utilizados para

eletroforese como papel, placas de gel, etc. Um capilar permite a perda do excesso de calor

gerado pela passagem de corrente elétrica através do meio condutor, no caso, a solução tampão

(Efeito Joule). A alta resistência elétrica do capilar permite o estabelecimento de campos

elétricos, o que resulta em uma separação muito eficiente e resolução incomparável em curtos

tempos de análise com alta eficiência (TAVARES, 1997).

A forma como a amostra é injetada no capilar reflete diretamente em sua análise

quantitativa. Ela pode ser introduzida eletrocineticamente ou hidrodinamicamente e a

reprodutibilidade da área ou altura do pico no eletroferograma implica na precisão da técnica

escolhida. Na injeção eletrocinética, a quantidade de amostra introduzida no capilar depende

da mobilidade eletroforética do soluto, das condutividades da amostra e meio condutor, como

também da magnitude do fluxo eletroosmótico. Na injeção hidrodinâmica, o volume depende

da diferença de pressão estabelecida, do tempo de injeção, da viscosidade da solução tampão e

das dimensões do capilar (TAVARES, 1996).

Em quase todas as separações eletroforéticas estão presentes dois mecanismos: a

mobilidade eletroforética (µe) e a mobilidade eletroosmótica (µFEO).

Quando uma diferença de potencial é aplicada, as espécies iônicas são atraídas pelo

polo de carga oposta e tendem a se separar devido às suas diferentes mobilidades

eletroforéticas (µe). Contudo, há uma força de atrito contrária à força de atração causada pelo

movimento do íon da solução tampão (Figura 8). Durante a separação eletroforética das

espécies, essas forças se igualam e o estado de equilíbrio é atingido e, assim, a velocidade de

migração dos íons e a mobilidade eletroforética tornam-se constantes.

26

Figura 8: Forças atuantes em um íon e sua esfera iônica durante sua migração eletroforética

Fonte: TAVARES, 1996

O capilar de sílica fundida, normalmente, apresenta a superfície carregada

negativamente, pois o aumento do valor de pH causado pela solução tampão ioniza os grupos

silanóis (SiOH) presentes no capilar. Dessa forma, os cátions presentes na solução tampão são

atraídos a essa superfície negativa formando uma dupla camada elétrica, mantendo o balanço

de cargas (Figura 9). A concentração de cargas opostas à superfície decresce com a distância e

eventualmente se aproxima ao valor de concentração dos íons da solução. Quando o campo

elétrico é aplicado, as forças elétricas atuam nos íons que estão na solução causando um

movimento unilateral deles em direção ao eletrodo de carga oposta. Durante a migração, as

moléculas de água são transportadas junto aos íons, induzindo o fluxo da solução como um

todo (fluxo eletroosmótico). Quando o pH da solução é alto e ioniza substancialmente o grupo

silanol presente no capilar, o fluxo eletroosmótico torna-se extremamente alto e nesse ponto a

sua mobilidade (µFEO) torna-se maior que a mobilidade eletroforética das espécies,

possibilitando a separação das moléculas catiônicas, aniônicas e neutras (TAVARES, 1996). O

fluxo eletroosmótico, dentro do capilar, é caracterizado por um perfil radial de velocidade

constante, o que não contribui para o alargamento das bandas.

27

Figura 9: Representação da formação do fluxo eletroosmótico

Fonte: SKOOG; HOLLER; CROUCH, 2009

Na prática, os problemas da eletroosmose são mais complicados. Para melhorar as

condições de separação, usa-se soluções contendo surfatantes iônicos, como o docecil sulfato

de sódio, que possui velocidade eletroosmótica mais ou menos constante em extensas faixas

de pH. Surfatantes catiônicos, como Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTAB), normalmente

reverte a direção do fluxo eletroosmótico, direcionando-o ao eletrodo positivo (fluxo aniodico)

(GUZMAN, 1993).

Há seis subdivisões da eletroforese capilar: Eletroforese capilar de zona (CZE),

Focalização isoelétrica capilar (CIEF), Eletroforese capilar em gel (CGE), Isatacoforese

capilar (CITP), Eletrocromatografia capilar (CEC) e Cromatografia eletrocinética micelar

(MECK) (COSTA, 2008).

2.8. Cromatografia Eletrocinética Micelar

A cromatografia eletrocinética micelar é um tipo de separação por eletroforese capilar,

que possibilita a separação de analitos eletricamente neutros. Este método pode ser realizado

ao adicionar micelas iônicas em uma solução de eletroforese capilar em andamento, sem

modificar o instrumento. O princípio de separação é baseado na migração diferencial de

micelas iônicas e a carga do tampão em condições eletroforéticas, com interação entre o

analito e a micela (TERABE, 2009).

28

O diâmetro interno de um capilar é em torno de 50 µm e seu comprimento é em torno

de 50 cm, ou seja, aproximadamente 1 µL de volume interno. Assim, o volume de amostra

injetada deve ser menos do que alguns nanolitros.

É uma técnica muito usada para separação de pequenas moléculas, ambas neutras e

carregadas e com rendimentos de alta eficiência de separação em curto espaço tempo, com

mínimas quantidades de amostra e reagentes.

A separação acontece devido à interação das espécies com uma fase pseudoestacioná-

ria. O processo, na verdade, é uma cromatografia, por isso o seu nome. Na prática, um eletróli-

to é adicionado a um meio que contém surfatante iônico em quantidade acima da sua concen-

tração micelar crítica (CMC). Assim, há duas fases dentro do interior do tubo capilar, uma fase

móvel aquosa e uma fase micelar pseudoestacionária. A maioria dos tampões apresenta velo-

cidade do fluxo eletroosmótico alta em direção ao eletrodo negativo, inclusive tensoativos que

formam micelas iônicas carregadas negativamente, como o docecil sulfato de sódio, conhecido

como SDS que é muito empregado nessas separações. Para esses tensoativos, suas micelas

aniônicas são também arrastadas para o eletrodo negativo, mas com uma velocidade mais re-

duzida. Assim, durante a análise, a mistura tampão é a fase aquosa que se move mais rapida-

mente e a fase micelar se movimenta mais lentamente (SKOOG; HOLLER; CROUCH, 2009).

Micelas são agregados organizados, principalmente de forma esférica. São formadas

rapidamente, quando a concentração de surfatantes, que possui uma cauda formada por um

hidrocarboneto de cadeia longa, aumenta acima de um específico valor, conhecido como con-

centração micelar crítica (CMC) (TAVARES, 1997). Nesse ponto, o tensoativo forma agrega-

dos esféricos, que possuem de 40 a 100 íons com caudas hidrofóbicas voltadas para o interior

do agregado e suas extremidades carregadas expostas à agua na parte externa.

É possível entender melhor o processo de separação através da figura 10. A micela é

adicionada à solução de base e migra por eletroforese em um campo elétrico. O soluto neutro,

normalmente, migra com a mesma velocidade do fluxo eletroosmótico, mas se incorporado à

micela, migra na mesma velocidade desta, adquirindo alguma mobilidade eletroforética. O

equilíbrio da distribuição entre o soluto e a micela é rapidamente estabelecido. Moléculas neu-

tras e altamente hidrofóbicas são fortemente incorporadas no interior da micela e apresentam

mobilidade eletroforética menor, se comparadas às espécies neutras menos hidrofóbicas. De-

29

vido a essas possibilidades de interação, a separação de moléculas de carga neutra torna-se

possível (SKOOG; HOLLER; CROUCH, 2009).

Figura 10: Ilustração esquemática do princípio de separação de uma cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)

Fonte: TERABE, 2009

As micelas estão em movimento e consequentemente, todos os solutos, inclusive os

totalmente retidos pela micela, são eluídos. Isso limita o tempo que deve ocorrer a separação.

Como mostra a figura 11, os solutos só podem eluir entre os tempos t0 (soluto não retido pela

micela) ou simplesmente um soluto neutro que migra em função do fluxo eletroosmótico e tM

(tempo de migração de micela). Assim, entre t0 e tM deve ocorrer o intervalo útil de separação.

30

Figura 11: Representação da janela de eluição de solutos

Fonte: TAVARES, 1997

Provavelmente está técnica terá um futuro promissor. Sua vantagem está na eficiência das

suas colunas, que são muito grandes. Além disso, a troca de fases é simples, envolvendo

apenas a mudança da composição das micelas no tampão.

3. Metodologia

Neste trabalho foi determinada uma metodologia adequada para obter a melhor

separação de cinco triazinas: Ametrina, atrazina, simazina, terbutrina e a terbutilazina. A

técnica usada é a Cromatografia Eletrocinética Micelar. Os dados deste projeto foram

coletados em 2012, na Universidade de Aveiro, Portugal.

Na primeira parte das análises definiu-se a melhor concentração do tensoativo CTAB

para separação eficiente e com boa resolução. Em sequência, foram testados os diversos

tempos e pressões de injeção da amostra para criar um método que defina a melhor condição

de separação das cinco triazinas. O tempo e a pressão de injeção da amostra, além da

viscosidade da solução tampão e as dimensões do capilar, definem a quantidade de amostra

injetada. Silva (2010), em sua tese de doutorado, variou todos esses parâmetros para verificar

a melhor condição de separação dos seus solutos estudados. No presente trabalho, escolheu-se

variar apenas o tempo e a pressão de injeção e verificar a influência destes dois parâmetros na

separação da amostra de pesticidas.

31

3.1. Amostras analisadas

Cinco pesticidas diferentes: Ametrina, atrazina, simazina, terbutilazina e terbutrina, à

concentração de 2,5 ppm, cada em um frasco com padrão Tetraborato de Disódio Decahidra-

tado (BORAX) 12,5 mM e tensoativo CTAB, mantidos em câmara climática à 10ºC para evi-

tar degradação por efeitos da luz e do calor.

3.2. Instrumentação

A experiência foi realizada utilizando o equipamento Beckman P / ACE MDQ (Figura

12), sistema de eletroforese capilar, equipado com um detector de arranjos de fotodiodos UV.

A separação foi efetuada em um capilar de sílica fundida, 50 cm de comprimento total (40 cm

de comprimento efetivo), 75 µm de diâmetro interno.

Figura 12: Equipamento Beckman P/ ACE MDQ

Fonte: UNIVERSIDADE DE AVEIRO

3.3. Condições da coluna do capilar

Antes de cada injeção, o capilar foi lavado três vezes. Lavagem de 2 minutos a 20 psi

com acetronitrila, água pura e tampão. Injeção da amostra de pesticida a 0,3 psi por 3 s.

Injeção do tampão a 0,3 psi por 3 s.

32

3.4. Condições de separação

Na primeira fase a solução e a amostra com pesticidas foram injetadas a 0,3 psi por 3 s

para determinar o tempo do fluxo eletroosmótico.

Na segunda fase, o tampão foi injetado a 0,3 psi por 3s e as amostras foram injetadas

de diferentes formas: 0,1 psi por 1 s; 0,5 psi por 5 s; 0,5 psi por 10 s; 0,5 psi por 20 s e 0,5 psi

por 30s.

A separação ocorreu com uma voltagem de 15,0 kV por 12 minutos, com polaridade

direta para a amostra de BORAX 12,5 mM. Para as amostras de BORAX 12,5 mM, com dife-

rentes concentrações de CTAB, a polaridade foi reversa.

3.5. Preparo das soluções

Para o desenvolvimento do método, foi necessário, inicialmente, definir a concentração

do tensoativo a ser usado. Preparou-se 5 soluções com diferentes concentrações do tensoativo

CTAB e, como o Borax foi usado em conjunto, também preparou-se 5 soluções de 12,5 mM

deste. As 10 amostras foram preparadas a partir de uma solução-mãe.

BORAX: Foi preparada uma amostra de 50 mL com concentração de 50 mM. Assim, era pre-

ciso 2,5.10-3 mol de BORAX. Pesou-se 0,9534g do composto, adicionou a um béquer com 30

mL de água deionizada. Adicionou essa solução a um balão volumétrico de 50 mL e aferiu-o.

CTAB: Foi preparada uma amostra de 20 mL com concentração de 20 mM. Assim, era preciso

4.10-4 mol de CTAB. Pesou-se 0,1458g do composto, adicionou a um béquer com 10 mL de

água deionizada. Adicionou essa solução a um balão volumétrico de 20 mL e aferiu-o.

A partir das soluções mães, preparou-se outras 5 novas soluções de 20 mL cada (Tabe-

la 3).

33

Tabela 3- Soluções e suas respectivas concentrações

Solução Borax CTAB 1 12,5 mM 0 2 12,5 mM 1 mM 3 12,5 mM 2 mM 4 12,5 mM 3 mM 5 12,5 mM 5 mM Fonte: O PRÓPRIO AUTOR

Calculou-se o volume necessário da solução-mãe para preparar as cinco amostras (RUSSEL,

2008) (Equação 1).

�� = �� …………………………………………………………………….....(1)

Onde:

Ci= Concentração inicial

Vi= Volume inicial

Cf= Concentração final

Vf= Volume final

Para Borax:

Ci Cf Vf Calculo de Vi:

50 mM 12,5 mM 20 mL 5 mL

Para CTAB:

Ci Cf Vf Calculo de Vi:

20 mM 1,0 mM 20 mL 1,0 mL

20 mM 2.0 mM 20 mL 2,0 mL

20 mM 3,0 mM 20 mL 3,0 mL

20 mM 5,0 mM 20 mL 5,0 mL

Separou-se 10 balões volumétricos de 20 mL cada, identificou-os e com uma pipeta

automática para baixos volumes, adicionou-se a quantidade calculada da solução mãe a cada

balão volumétrico e aferiu-os com água deionizada. Todas as amostras foram mantidas a 10ºC.

34

4. Resultados e discussões

Para a separação de triazinas:

Para a primeira parte da análise, as triazinas foram injetadas a 0,3 psi por 3 s. Os

eletroferogramas, representam a separação das triazinas com a solução padrão BORAX 12,5

mM, variando-se as concentrações da solução de CTAB. A experiência foi realizada em

duplicata (Figuras 13 a 17):

Figura 13: Eletroferograma da separação de triazinas com padrão Borax 12,5 mM

Fonte: O PRÓPRIO AUTOR

Figura 14: Eletroferograma da separação de triazinas com solução padrão Borax 12,5 mM + CTAB 1 mM


35



Figura 16: Eletroferograma da separação de triazinas com solução padrão Borax 12,5 mM + CTAB 3mM


36



Nos eletroferogramas, observa-se a separação das cinco triazinas em diferentes

condições de solução padrão. A separação das espécies é devido à diferença nas mobilidades

iônicas dos analitos, que estão relacionadas com suas densidades de carga, isto é, às razões

carga/raio. Desta forma, formam-se zonas de amostras distintas de acordo com a mobilidade.

O tempo necessário para um composto percorrer o capilar até o ponto de detecção é chamado

de tempo de migração. A mobilidade (μ) aparente do soluto é a medida da mobilidade na

presença do fluxo eletroosmótico, e pode ser calculada pela equação 2 (GUZMAN, 1993):

μ = � . = .�

� .�…………….………………………………...……………………………….(2)

Onde:

V = voltagem aplicada;

E = campo elétrico;

L = comprimento total do capilar;

l = comprimento efetivo (distância até o detector);

t= tempo de migração.

Nos eletroferogramas obtém-se o tempo de migração da banda que detecta o soluto

neutro e têm-se o comprimento total do capilar, L= 0,5 cm; o efetivo, l= 0,4 cm e a voltagem

37

aplicada, V= 15 kV. Usando a equação 2, calculou-se a mobilidade do fluxo eletroosmótico

para verificar sua variação de acordo com a concentração de CTAB. Na tabela 4, tem-se os

valores obtidos a partir do cálculo.

Tabela 4: Cálculo da mobilidade a partir de diferentes concentrações da solução de CTAB

Concentração de CTAB (mM)

Teof (min) µFEO (10-8 cm2 s-1 V-1)

0 3,69 -6,02 1 3,06 7,27 2 3,01 7,37 3 3,00 7,40 5 3,21 6,93


Sendo Teof o tempo de migração do soluto não retido pela micela, ou simplesmente, o

soluto neutro que migra pela ação do fluxo eletroosmótico e µFEO a mobilidade do fluxo

eletroosmótico. Nesse caso, o soluto neutro é a acetonitrila, pois além de não reagir com as

micelas, esse marcador permite verificar o tempo do fluxo eletroosmótico devido à mudança

do índice de refração entre o tampão e o solvente usado pelo detector (SILVA, 2010).

A figura 18 mostra o gráfico obtido a partir dos dados da tabela 4.

Figura 18: Representação gráfica da variação da mobilidade do fluxo eletroosmótico em função de diferentes concentrações da solução de CTAB.


-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6

µe

f (1

0-8

cm2

s-1

V-1

)

[CTAB](10-³Mol/L)

38

Na figura 18 observa-se uma mobilidade aparente negativa para concentrações de

brometo de hexadecil trimetil-amônio (CTAB) próximas a 0,1.10-3 M. Isso deve-se ao fato de

não haver interação entre o surfatante e a superfície do capilar. A mobilidade aparente é

estabilizada em concentrações de brometo de hexadecil trimetil-amônio (CTAB) acima de 0,8

mM, ou seja, essa é a sua Concentração Micelar Crítica, conhecida como CMC, na qual o

surfatante começa a formar micelas e essas interagem com o analito levando a diferentes

velocidades de migração, para diferentes analitos.

Na ausência de CTAB, os pesticidas são detectados no mesmo tempo de migração, pois

possuem mobilidade eletroforética igual a zero, dessa forma, migram na mesma velocidade

do fluxo eletroosmótico. Com a adição do CTAB, surge o meio micelar originando uma fase

pseudoestacionária, onde ocorrem diferentes graus de interação de cada pesticida com a

micela, resultando na migração diferencial dos solutos. Este é um dos fatores determinantes

para a eficiência da separação.

Através dos tempos de migração de cada pesticida e do tempo do início de separação,

pode-se calcular a mobilidade efetiva do pesticida, pela equação 3 (GUZMAN, 1993):

μ� = μ� + μ��…………………………………………………………………………...(3)

Onde:

µa = mobilidade aparente;

µe = mobilidade efetiva;

µFEO = mobilidade do fluxo eletroosmótico.

A Tabela 4 apresenta os valores do tempo de migração do soluto neutro (Teof) e

também a mobilidade do fluxo eletroosmótico (µFEO). Pela equação 2, pode-se calcular a

mobilidade aparente de cada triazina (µ a), usando o tempo de migração de cada analito/triazina

(Tm), o comprimento total e o efetivo do capilar, L e l respectivamente, e também a voltagem

aplicada, que é a mesma. Obtendo os valores de µa e a mobilidade do fluxo eletroosmótico

(µFEO), a mobilidade efetiva (µe) do pesticida pode ser encontrada pela equação 3. Para melhor

entendimento, os valores obtidos nos cálculos são mostrados na tabela 5.

39

Tabela 5: Mobilidades aparentes e efetivas, das diferentes triazinas, em diferentes concentrações da solução de CTAB.

[CTAB] Tm (min) Teof (min) µa (10-8) µFEO (10-8) µe (10-9) 1 3,19 3,06 6,97 7,27 2,96 1 3,33 3,06 6,67 7,27 6.00 1 3,83 3,06 5,79 7,27 14,75 1 4,14 3,06 5,37 7,27 19,01 2 3,26 3,01 6,81 7,37 5,64 2 3,55 3,01 6,26 7,37 11,12 2 4,26 3,01 5,22 7,37 21,52 2 4,66 3,01 4,77 7,37 25,98 2 5,68 3,01 3,92 7,37 34,53 3 3,44 3,00 6,45 7,40 9,41 3 3,85 3,00 5,77 7,40 16,30 3 4,68 3,00 4,75 7,40 26,58 3 5,09 3,00 4,37 7,40 30,29 3 5,99 3,00 3,71 7,40 36,84 5 3,96 3,21 5,62 6,93 13,12 5 4,57 3,21 4,87 6,93 20,57 5 5,63 3,21 3,96 6,93 29,73 5 6,11 3,21 3,65 6,93 32,78 5 7,05 3,21 3,17 6,93 37,62


Através dos valores encontrados da mobilidade efetiva de cada triazina em função da concentração do surfatante CTAB, na tabela 5, foi plotado o gráfico dessa função, na figura 19, para melhor compreensão dos dados.

40

Figura 19: Mobilidade efetiva das diferentes triazinas em função da concentração da solução de CTAB.


Na figura 19, é possível observar claramente a separação das triazinas, para

concentrações de CTAB maiores que 3 mmol/L.

A separação por cromatografia eletrocinética micelar deve-se a interações entre o

analito neutro e as micelas formadas.

Simplificando: Para cada triazina, a mobilidade efetiva é igual à (Equação 4 e 5)

(GUZMAN, 2013):

μ� = μ��. � ��……………………………………………………………………………(4)

Onde:

µmic: é a mobilidade (velocidade) da micela.

E

� = �. (�� ! – �#�) …………………………………………………………………….(5)

Onde:

K: é a constante de ligação da triazina;

Cctab: é a concentração do CTAB (C19H42BrN);

CMC: é a concentração crítica de CTAB na micela. Neste caso, a concentração é em torno de

0,8 mM, como observado na figura 18.

As triazinas são separadas devido às suas diferentes constantes de ligação.

Ao adicionar o tensoativo na solução tampão, e este estiver acima da sua concentração

0

5E-09

1E-08

1,5E-08

2E-08

2,5E-08

3E-08

3,5E-08

4E-08

0 2 4 6

Mo

bil

ida

de

efe

tiv

a (

cm2

s-1V

-1)

Concentração de CTAB (mmol/L)

Atrazine

Simazine

Terbutylazine

Ametryn

Terbutryn

41

micelar crítica (CMC), formam-se micelas. Micelas são agregados moleculares de dimensões

coloidais que possuem regiões estruturais hidrofílicas e hidrofóbicas.

Abaixo da CMC, o surfatante, no caso o CTAB, está predominantemente na forma de

monômeros e quando a concentração do surfatante está abaixo, porém próxima da CMC,

existe um equilíbrio dinâmico entre monômeros e micelas (Figura 20).

Figura 20: Representação do agregado micelar

Fonte: MANIASSO, 2001

Os surfatantes (tensoativos) são moléculas anfifílicas constituídas por uma cadeia

carbônica apolar ou hidrofóbica e uma cabeça polar ou hidrofílica podendo ser iônica

(catiônica ou aniônica), não iônica ou anfótera.

As micelas formadas no início do capilar entram na zona de solução da amostra (desde

que a mobilidade do fluxo eletroosmótico seja maior que a mobilidade da micela do

surfatante) e interagem com os analitos. Na zona da amostra, o complexo CTAB-ANALITO

migrará rapidamente até atingir a fronteira da solução da amostra e o tampão de separação.

Neste ponto, os analitos serão focalizados e a separação ocorrerá normalmente.

Analisando os eletroferogramas (figuras 13 a 17), observa- se que a melhor separação

dos pesticidas ocorre com a solução padrão BORAX 12,5 mM + CTAB 5 mM, figura 17. Para

aprimorar esta separação e ver qual a melhor condição de detecção das diferentes triazinas,

variou-se a pressão e o tempo de injeção da amostra, utilizando a solução padrão BORAX

12,5 mM + CTAB 5 mM. Os resultados desse teste podem ser vistos nos eletroferogramas das

figuras 21, 22, 23, 24 e 25.

42

Figura 21: Separação das triazinas com injeção da solução padrão BORAX 12,5 mM + CTAB 5 mM à pressão 0,1 psi por 1 s.




43



Figura 24: Separação das triazinas com injeção da solução padrão BORAX 12,5 mM + CTAB 5 mM à pressão 0,5 psi por 20 s


44



Para analisar os eletroferogramas é importante lembrar que na injeção hidrodinâmica a

relação pressão.tempo implica na quantidade de amostra introduzida no capilar, aumentando a

sensibilidade do método. Segundo Skoog; Holler; Crouch (p. 885, 2009), a diferença de

pressão direciona a amostra para dentro do capilar e o tempo de injeção controla a quantidade

de amostra a ser injetada. Analisando os eletroferogramas, observa-se na figura 21, pressão

0.1 psi e tempo 1 s, picos muito baixos impossíveis de serem analisados. Na figura 22, pressão

0,5 psi e tempo 5 s, os picos estão altos e bem definidos. Na figura 23, manteve-se a pressão

de injeção e o tempo aumentou para 10 s, observa-se que os picos aproximam-se bastante. Na

figura 24, a pressão também foi mantida e o tempo de injeção passou para 20 segundos, o

eletroferograma mostra que a separação não está bem definida. No eletroferograma da figura

25, o tempo aumentou ainda mais, para 30 segundos e a pressão também foi mantida. Nesse

último, não é possível detectar uma separação.

Uma vez que o tempo controla a quantidade de amostra injetada, foi possível observar

que aumentando o tempo, para uma mesma pressão, aumentou a quantidade de analito no

capilar saturando o caminho ótico para a detecção das espécies. Consequentemente, dificultou

a separação e quantificação dos pesticidas.

Para um melhor entendimento do resultado dessa pesquisa, comparou-se os

cromatogramas nas figuras 26 e 27.

45

Figura 26: Comparação das separações das triazinas com injeção da solução padrão à: 0,1 psi 1s; 0,3 psi 3 s, 0,5 psi 5 s.


Analisando a figura 26, observa-se que apesar da condição de injeção com pressão 0,3

psi por 3 s apresentar uma boa separação, quando a condição de injeção muda para 0,5 psi por

5 s, os picos são mais finos e definidos e apresentam uma melhor separação entre as triazinas.

Analisando a figura 27, vê-se que quando a amostra é submetida à pressão 0,5 psi e

tempo de injeção 10 s, a separação das triazinas começa a ficar ruim, pois seus picos estão

muito próximos. E fica claro que quando submetidas à pressão 0,5 psi e tempos de injeção de

20 s e 30 s os picos são totalmente indefinidos e não há separação.

Figura 27: Comparação da separação das triazinas com injeção de padrão à: 0,5 psi 10 s; 0,5 psi 20 s; 0,5 psi 30 s.


46

Para cada corrida mediu-se a altura dos picos de cada pesticida. A tabela 6 mostra que a

altura dos picos do pesticida é uma função do carregamento da amostra.

Tabela 6: Altura dos picos de cada um dos pesticidas como função das diferentes condições de injeção da amostra.


Na figura 28, plotou-se a altura dos picos de cada pesticida em função do carregamento

da amostra para melhor compreensão dos dados.

Figura 28: Gráfico comparativo entre o comportamento das triazinas em diferentes condições de injeção e os respectivos picos formados.


Carregamento da amostra (psi.s)

Altura do pico da

Atrazina (AU)

Altura do pico da

Simazina (AU)

Altura do pico da

Terbutilazina (AU)

Altura do pico da

Ametrina (AU)

Altura do pico da

Terbutrina (AU)

0,1 365 278 187 192,5 225

0,9 1340 1234,5 1089,5 955 795

2,5 1727 1488 1320 1110 973

5 1946 1843,5 1465 1423,5 1150,5

10 2150,5 2014,5 1876 1700,5 934

15 2426 1995 2660 438 71

47

Fica mais claro, através da figura 28, observar que até o ponto 2,5 psi.s, que

correspondente a carregamento da amostra com tempo de injeção 5 s e pressão de injeção 5

psi, as triazinas estão bem separadas e bem definidas. A partir deste ponto e até o ponto 5 psi.s,

ainda há uma separação, mas não é definida, pois começa a ocorrer o alargamento de suas

bandas. Isso pode ser confirmado observando o eletroferograma correspondente a essas

condições (figura 23). A partir do ponto 5 psi.s, não há mais separação, as curvas decaem e

nos eletroferogramas correspondentes, figura 27, vê-se que não há separação.

5. Conclusão

Após analisar todos os eletroferogramas, é possível concluir que os pesticidas

apresentam a melhor separação quando sujeitos as seguintes condições: Injeção do padrão

BORAX 12,5 mM + CTAB 5 mM a 0,5 psi por 5 s. Isso é evidenciado pelos tempos de

migração característicos de cada pesticida e seus picos bem definidos, altos e finos.

Ao aumentar a condição de carregamento, isto é, tempo e pressão de injeção da

amostra, os picos ficaram indefinidos, ou seja, não foi possivel quantificar o analito. Para

volumes maiores de amostra injetadas ocorre a saturação do caminho ótico da janela de

detecção do capilar (SILVA, 2010).

O método se mostrou seletivo, rápido e de alta eficiência analítica, pois conseguiu

separar cinco pesticidas em baixissimas concentrações em menos de 7 minutos. É possível

compreender que para separar pesticidas com concentrações menores que 2,5 ppm, a condição

de carregamento da amostra deve ser maior para aumentar a quantidade de analito no capilar e,

assim, obter uma detecção e separação eficiente.

O objetivo deste trabalho foi encontrar a melhor condição de separação para analisar

amostras com a menor concentração possível de pesticidas, uma vez que estes pesticidas

encontram-se em concentrações em ppm em águas subterrâneas.

48

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