O Obí Gbanjá, possui dois cotilédones (gomos) e não deve ...
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Universidade de Évora
2002
Biotecnologia Vegetal
BIOTECNOLOGIA VEGETAL I
Prof. Amely Zavattieri
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MicropropagaçãoMicropropagação
!Introdução !Multiplicação conforme !Etapas !Automatização
!Dupla fase !Robotização !Bioreactores
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A Micropropagation é a propagação fiel de um genótiposeleccionado por meio das técnicas da cultura in vitro.Geralmente a micropropagação é também associada com a produção em grande escala a preços competitivos. O Prof. Murashige (Univ. de California, Riverside) definiu 3 fases principais na multiplicação in vitro de plantas, tanto para os laboratórios comerciais como para os de investigação.Estas fases descrevem passos a seguir no processo, como assim também momentos na cultura nos quais as necessidades do ambiente da cultura devem ser modificados. A figura seguinte representa um esquema das diferentes fases do processo de micropropagação como proposto por Deberg e Maene (1981).
Fase 4: aclimataçãoin vivo
Fase 3b: Indução radicular e pre-aclimatação
Fase 3a: Alongamento
Fase 2: multiplicação
Fase 1: Iniciação assépticain vitro
Fase 0: preparação da planta mãe in vivo
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Com o aumento do número de sub-culturas o meio que originalmente tinha sido preparado para dar rebentos axilares pode ser mudado para a produção de rebentos adventícios. Como consequência o número de variação somaclonal se incrementa.
Teoricamente as plantas que não são quimereas podem ser propagadas usando diferentes técnicas: rebentos axilares; rebentos adventícios; embriogénese,...Para efeitos da micropropagação a técnica de multiplicação via rebentos axilares é a preferida para a maioria das plantas. Isto em princípio produz plantas conformes. É a única técnica que pode ser aplicada á propagação de quimeras.
Rebentos axilares obtidos de uma
Dracaena(quimera).
Desenvolvimento de gomos adventícios
em Dracaena(quimera).
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Fases da Fases da MicropropagaçãoMicropropagação
"Fase 0 "Fase 1 "Fase 2 "Fase 3 "Fase 4
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1. Plantas saudáveis
2. Evitar rega excessiva das plantas mães
3. Induzir crescimento vigoroso nas plantas
mães
Fase 0. Preparação das plantas mãeFase 0. Preparação das plantas mãe
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Fase 0. Foi originalmente concebido para melhorar as condições higiénicas das plantas mãe.. Prévio ao inicio da cultura deverá prestar-se uma atenção especial da planta da qual serão retirado/s o/s explants. As plantas mães poderão ser previamente tratadas com hormonas, desinfectantes, fazer testes de viroses, etc. todo em vista ao êxito da cultura invitro.A desinfecção do material vegetal é essencial nesta fase. O crescimento, a morfogénese e as taxas de crescimento e propagação da cultura dependerão do tratamento prévio da planta mãe.
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Fase O Fase O
Rega gota -a gota das plantas mães.
Injecção de citocininas
EtiolamentoSoluções forçadas contendo GA3; citocininas; hidroxiquinoleina
Poda; perda da dominância apical
Enxertia em cascada
Possíveis pre-tatamentos
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Condições ambientais a considerarTemperatura
1. Afecta o crescimento das culturas2. Efeito sobre a morfogénese
Humidade relativaLuz
1. Qualidade2. Quantidade3. Efeito sobre a morfogénese
1. Selecção do explant
2. Desinfecção superficial
3. Meio de cultura
4. Acastanhamento do meio
5. Consistência do meio
6. Condições ambientais
Fase1: Estabelecimento da culturaFase1: Estabelecimento da cultura
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Fase 1Fase 1Estabelecimento da culturaEstabelecimento da cultura
Objectivos#Dar início á cultura #Em princípio o método usado deve ser reproduzível Deve existir um compromisso entre uma adequada desinfecção do material vegetal e uma boa taxa de sobrevivência dos explants �não contaminados�.
ProcedimentoFrequentemente para o início da cultura são usados gomos axilares ou meristemas. Em certos casos são usados outras partes da planta. Ex. Sendo difícil obter gomos axilares não contaminados em Ficuslyrata e Anthurium spp. Gomos adventícios são primeiramente obtidos sobre folhas, os rebentos assim obtidos são então seccionados para ser os explants iniciais da fase 2.É recomendável não iniciar a propagação durante a fase de iniciação.
Exemplo: início da cultura em Roseira
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Exemplo: Fase de iniciação em roseirasExemplo: Fase de iniciação em roseiras
São retiradas as folhas ficando os pecíolos nas secções cortadas.
Lavar com 80% etanol, desinfectar em lexivia comercial 10% (NaOCl) por 15 minutos
São retirados ramos jovens. Cortar os ápices e as bases dos ramos
Colocação de um nó em um tubo de ensaio.
Plantas mãe com rega gota -a gota
Entre nós cortados. Cada nó contêm um meristema axilar.
Transladar os tubos para a sala de cultura
Lavar 3x com água estéril
Cortar os extremos o mais próximo possível do nó.
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1. Produção de rebentos adventícios
2. Produção de rebentos axilares
3. Embriogénese somática
Fase 2. MultiplicaçãoFase 2. MultiplicaçãoO objectivo desta fase é a multiplicação propriamente dita dos órgãos e estruturas que são capazes de dar origem a plantas completas. De acordo com os métodos de propagação que sejam empregues estas estruturas poderão ser: rebentos axilares ou adventícios, embriões o órgãos em miniatura como microtubérculos, cormos, etc. Em alguns programas de micropropagação este estado inclui uma indução prévia de centros ou zonas meristemáticas a partir da qual se desenvolverão os órgãos adventícios.Os rebentos produzidos na fase 2 são considerados como propágulos pois podem ser propagados ou multiplicados para aumentar o seu número em sucessivas subculturas.
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Multiplicação Vegetativa por Gomos Multiplicação Vegetativa por Gomos (rebentos) Adventícios(rebentos) Adventícios.
A- O explant é constituído de um fragmento de órgão, de uma porção de tecido ou mesmo de células isoladas (grãos de pólen, protoplastos, etc.
B- Os rebentos são neo-formados (formados de novo) a partir de células do explant inicial.
C- Estes rebentos desenvolvem-se em caules, geralmente sobre um meio de alongamento
D- As células do explant inicial dividem-se rapidamente e formam, de maneira desorganizada, um calo primário ligado ao explant de partidaE- O calo primário pode ser subcultivado
em meio sólido para crescimento do calo
F- O calo forma rebentos sob um meio de indução apropriado
G- Todos os ramos obtidos são transferidos para um meio neutro ou
enriquecido em auxinas que provocam o posterior enraizamento.
A conformidade do material das plantas obtidas por este método, não pode ser garantida.
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Multiplicação Vegetativa por gomos (rebentos) Axilares.
A- O explant pode conter um meristema isolado, um gomo terminal ou axilar, uma extremidade de um ramo, um fragmento de ramo que possua pelo menos 1 gomo axilar
B- Num meio com citocininas o meristema cresce, o gomo desenvolve-se em um ramo folhoso
C- Este ramo pode ser cortado em fragmentos (nós que permanecem sobre o mesmo meio dando novos ramos folhosos
D- Se o explant inicial é depositado num meio rico em citocininas, os gomos desenvolvem-se dando um ramo folhoso que se ramifica ele próprio dando ramos secundários e posteriormente terciários, e assim sucessivamente
E- Os tufos de rebentos são fragmentados e a multiplicação realiza-se nesta fase
F- Os rebentos são transferidos para meio de alongamento para preparar os mesmos para a fase de enraizamento
G- Os ramos podem ser agora transferidos par um meio neutro (S/hormonas) ou com auxinas para enraizarem.
A taxa de multiplicação pode variar entre 2 a mais de 20 por mês.
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Fig. 1. Teoricamente o numero de plantas que podem ser produzidas em 1 ano quando a taxa de multiplicação é de 2 (A) ou 4 (B) por mes.
Para a maioria dos sistemas de micropropagação os sistemas de ramificação axilar são os mais favoráveis. Em outros sistemas mais avançados podem ser usados embriões, gomos adventícios, nós, conjuntos meristemáticos.
Fase 2 Fase 2 MultiplicaçãoMultiplicação
A
B
Taxa de Multiplicação
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Multiplicação porEmbrigéneseSomática.
A embriogénese somática aparece a maior parte das vezes em suspensões celulares, ocasional-mente sobre calos, e mais raramente directamente sobre órgãosA- O explant de partida pode ser um fragmento de órgão, de tecido, ou células isoladas.
B- Forma-se um calo primário (em órgãos) ou um micro calo (em células isoladas).
C- Subcultura de calo primário ou de micro-calos
D- O calo pode dissociar-se e multiplicar-se sob a forma de suspensão celularE- Em certas condições, as culturas celulares em meio líquido ou sólido organizam-se em pequenos maciços de estruturas bipolares chamados embrióides, ou embriões somáticosF- Os embriões somáticos se desenvolvem directamente em plântulas com raiz como as derivadas de uma semente.
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Exemplo: multiplicação de roseiras.Exemplo: multiplicação de roseiras.
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Fase 3: EnraizamentoFase 3: Enraizamento
B
Fase 3 Fase 3 EnraizamentoEnraizamento
Os rebentos ou plântulas derivadas da fase 2, são muito pequenas e incompletas, não sendo possível a sua transferência directa para o solo ou outro substrato, pelo que nesta fase, são seguidos certos procedimentos para que estas pequenas plantas desenvolvam a sua capacidade fotossintética e sejam capazes de sobreviver em condições naturais sem a adição artificial de carbohidratos.
É recomendável dividir esta fase em fase de alongamento (3a) e fase de indução radicular e pre-aclimatação (3b).
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Frequentemente são as auxinas os reguladores de crescimentos usados para induzir enraizamento. No entanto, há que ter em conta que as auxinas inibem o posterior crescimento das raízes. Melhor enraizamento é geralmente obtido em meios com baixa concentração de sais (ex. Knop 1/2).$As raízes que se desenvolvem em condições in vitro, não são frequentemente aptas para as condições de estufa e podem ocasionar problemas no momento do transplante (stress hídrico).$A indução pode ser feita em caules simples ou em caules em rosetas $Para além do enraizamento esta fase deve favorecer a aclimatação posterior das plantas. Para isto pode-se: favorecer as condições autotróficas; suplementar as plantas com carbohidratos, diminuir a humidade relativa dos recipientes da cultura, micorrização, utilização de substratos inertes (e.g. rockwool, tacos de celulose, espuma de poliuretano.
Fase 3b: indução radicular e pre-aclimatação
Em certos casos o alongamento dos caules é um pre-requisimopara a fase de enraizamento $Os meios de cultura desta fase geralmente não contêm citicininas como as usadas na fase 2$Nesta fase pode ser necessário adicionar carvão activado para neutralizar os efeitos das citicininas da fase 2$Dependendo do tipo de planta, o alongamento pode pode ser feito em caules singulares ou em caules agrupados (roseta).
Fase 3a: alongamento
Enraizamento (Enraizamento (contcont.).)
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Fase 4: AclimataçãoFase 4: Aclimatação
Factores ambientaisHumidade relativaLuzEnfermidades patogénicas
Factores da PlantaMorfologia estomáticaFuncionamento estomáticoDormênciaFormação da cera epi-cuticularCapacidade fotossintética
Fase 4 Fase 4 AclimataçãoAclimatação
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Fase 4: aclimatação Fase 4: aclimatação ((contcont.) .)
O objectivo desta fase é a de optimizar a transferência das plantas da condição in vitro as condições de campo ou de estufa.A maior preocupação deverá ser a de minimizar as perdas e acelerar os procedimentos.
Exemplo: aclimatação em roseirasVer também: aclimatação
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Fases da micropropagação
(esquema geral)
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Técnica da Técnica da dupladupla--fasefase
Os ingredientes clássicos usados na técnica de dupla fase são: macro nutrientes de Knop ½ concentração;
"carvão activado; "açúcares; "auxinas
Sistema de dupla fase aplicado á multiplicação in vitro de Cordyline terminalis.
Adicionar 20 ml de meio líquido sobre o meio da fase final (sólido) (inicialmente 100 ml), de maneira a evitar as subculturas. Isto reduz os custos do processo. O sistema é usado :
�Durante a fase 2 para plantas que requerem um longo período de subculturas (e.g. orquídeas, uma subcultura leva aproximadamente 6 meses, meio fresco é adicionado aos 3 meses em cultura); �Na fase final para induzir alongamento e/ou enraizamento.
Rosas em contendor de plástico
Enchimento com meio para dupla-fase
Desenvolvimento posterior
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0.2690.191 ± 0.022
51.4 ± 6.928.0 ± 1.6
Fase 2 cultura na qual foi adicionado meio fresco na Fase 3
0.1740.139 ± 0.013
22.4 ± 5.5
23.3 ± 5.5
Fase 2 cultura transferidas para meio fresco no início da Fase 3
Peso médio dos rebentos
(g) 4 semanas depois do
transplante (g)
Peso médio dos rebentos
no transplant
e (g)
Nº médio de
rebentos com > 2.5 cm
Peso meio por
contenedor
(g)
Tratamento
Efeito do sistema de dupla fase no crescimentoin vitro de Cordyline terminalis.
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Vantagens da Vantagens da MicropropagaçãoMicropropagação
! As plantas são frequentemente mais uniformes
! Pode ser a única forma de as propagar vegetativamente
! As plantas tem geralmente um crescimento mas rápido
! Maduram mais rápido que as propagadas por sementes
! Pode ser usada para produzir linhas parentais para produzir sementes. Para manter as linhas parentais. Para prevenir depressão por consanguinidade
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Desvantagens da Micropropagação
! A propagação massiva não pode ser aplicada actualmente em todas as espécies vegetais
! A regeneração pode não ser possível. Especialmente para árvores lenhosos adultos. Existem mais problemas para obter raízes que rebentos
! Podem não ter um crescimento uniforme e em lugar disso ter diferentes taxas de crescimento e maduração in vitro
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Aplicações da Aplicações da MicropropagaçãoMicropropagação
%%1. Propagação clonal1. Propagação clonal
%%2. Propagação de plantas difíceis de 2. Propagação de plantas difíceis de propagar por outra via ou plantas muito propagar por outra via ou plantas muito valiosasvaliosas
%%3. Introdução de novos cultivares3. Introdução de novos cultivares
%%4. Propagação vegetativa de plantas mães 4. Propagação vegetativa de plantas mães ou parentaisou parentais
%%5. Eliminação de patogenias5. Eliminação de patogenias
%%6. Armazenamento de 6. Armazenamento de germoplasmasgermoplasmas
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Alguns exemplosAlguns exemplos
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Robotização Robotização
A mão de obra representa aproximadamente 70% do custo de uma planta micropropagada. Por este motivo muitos laboratórios de micropropagação estão instalando-se em países onde a mão de obra é mais barata. Uma alternativa é a utilização de robots. Existem no entanto, alguns problemas específicos com a robotização da cultura de tecidos, alguns destes são:
!Os tecidos vegetais são frágeis !Não estão presentes tecidos vegetais idênticos !È necessária uma manipulação asséptica
A figura seguinte representa a configuração de um sistema robótico totalmente automatizado para a multiplicação de Chrysanthemum. Neste sistema o braço do robot efectua as operações de corte e transplante.
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Bio reactores a pequena escalaBio reactores a pequena escala
Bio reactores em grande escala não são favoráveis á micropropagação pois são demasiado caros e representam um sistema com alto risco em perdas de grande número de plantas simultaneamente. Pequenos bio reactores dão maior flexibilidade e permitem um controlo individual dos componentes. São exemplos: Nalgene TM unidades de filtração, o RITA TM (Cirad, Montpellier) e LifeReactor TM da Osmotek.
Lifereactor TM
RITA TM
NalgeneTM filterunits