Biotecnologia ACH5545 Engenharia Genética e Biologia ... · Isto é possível por: -Universalidade...
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Docentes: Prof. Dr. Felipe S. Chambergo – [email protected] Prof. Dr. Luiz P. M. Andrioli – [email protected] Monitores: MSc. Patrícia Pereira Adriani - [email protected] Bchr. Gustavo Roncoli - [email protected] Bchr. Daniela De Lucena Pedroso - [email protected] Servidores não-docentes: Sr. Tec. Clarino do Divino Vieira Local: Laboratório de Biotecnologia, 1° andar bloco didático A2 - EACH/USP.
USP – 2019
Biotecnologia ACH5545 Engenharia Genética e Biologia Molecular
Atividades de Laboratório 2º Semestre 2019
Como produzir uma proteína recombinante?
10 to 70% of cellular
protein
0.1 to 1% of cellular
protein
https://www.southampton.ac.uk/
Vetores de Expressão e Proteínas de Fusão
1-Clonagem do cDNA da proteína de interesse num vetor de expressão -Seleção do vetor e proteína a expressar 2-Transformação e seleção de Bactérias ou células competentes -Seleção de organismo hospedeiro e técnica de transformação 3-Testes de Expressão -Identificar o clone que expressa a proteína recombinante 4-Produção em grande escala da proteína recombinante -Empregando um grande volumem de cultura 5-Recuperação e análises da proteína recombinante -Técnicas para recuperar a proteína a partir da cultura 6-Purificação -Técnicas de purificação de proteínas 7-Aplicação
Isto é possível por: -Universalidade do código genético. -Similaridade da maquinaria de transdução (ribossomos) -Rápido avanço das técnicas de biologia molecular e/ou engenharia genética:
– Clonagem de DNA – Sequenciamento de DNA – Enzimas para cleavagem, ligação, sínteses de moléculas de DNA, RNA, síntese de
nucleotídeos, etc Deve-se obter plasmídios para clonagem que garantissem um alto nível de
expressão da proteína de interesse (Vetor de Expressão)
Vetor de Expressão
1 2 3 5 4 6 7
1-Regulador do promotor: Proteína que modula o promotor 2-Promotor: Deve ser forte (lac, trp, tac, λpL, gene 10 do fago T7) 3-Seqüência Shine-dalgarno: Sitio de ligação do ribossomo, (RBS). 4-Região codificadora: sítios de múltipla clonagem 5-Terminador de transcrição: Estabiliza o mRNA 6-Marcador genético (antibiótico de seleção) 7-Ori: Origem de replicação.
Elementos de um vetor de expressão procariótico
Start Codon
Stop Codon
-10 TATAAT
ATG TAG
Enzima2 Enzima1
ATG-TCC-GCT-ATG TAG-TCC-GCT-CTG
AUG UAG
Oligo-Enzima1
Oligo-Enzima2
RT-PCR (Transcriptasa reversa)
Cliva e liga no vetor de expressão
Vetor de Expressão Vetor de Expressão
Seqüência Codificadora
mRNA
cDNA
Clonagem da Sequencia de Interesse
Manter o passo de leitura !!!!!!!
Proteína de Interesse
Fusão Proteína de Interesse
Sitio de clivagem de Protease
(lacZ, GST, His, CBD,etc)
Sinal Proteína de Interesse
(ompA, ompT)
A)Expressão da proteína de interesse
B)Expressão da proteína de interesse fusionada com outra Proteína
C)Expressão da proteína de interesse com sinal para secreção
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DNA templates: •Supercoiled plasmid DNA (recommended to obtain the highest yields) •Linear DNA •PCR product
Expressway Cell-Free E. coli Expression System:
Com um molde de DNA contendo um promotor T7 transcrito, ribossomos ligam-se ao extremo 5´ do mRNA nascente e sendo traduzido. Um sistema renovável de energia ATP acoplado para ligação estável dos ribossomos resulta em alto nível de proteína produzida.
-Transformação: Introdução de DNA em células procarióticas e levedura. -Transfecção: Introdução de DNA em células eucarióticas. Pode ser por: 1-Eletroporação 2-Microinjeção 3-Liposomos 4-Virus eucarióticos 5-Biobalistica
Expressão da Proteína de interesse O vetor de expressão é empregado para transformar Bactérias competentes (E. coli deficientes em Proteasas). Após cultura é Testada a expressão
Figure 11.13
Well-developed genetics Many strains available Best known bacterium
Easily transformed Nonpathogenic Naturally secretes proteins Endospore formation simplifies culture
Well-developed genetics Nonpathogenic Can process mRNA and proteins Easy to grow
Potentially pathogenic Periplasm traps proteins
Genetically unstable Genetics less developed than in E. coli
Plasmids unstable Will not replicate most bacterial plasmids
Advantages Disadvantages
Escherichia coli Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae
Bacteria Eukaryote
© 2012 Pearson Education, Inc.
Expression of cloned proteins in bacterial cells
Escherichia coli is one of the most popular hosts for overexpression of cloned
proteins because of its fast and efficient growth.
The most widely used E. coli strains in expression of cloned proteins are BL21
and its derivatives.
This is mainly because BL21 strains are deficient in a cytoplasmic protease,
Lon, and an outer membrane protease, OmpT.
Both of these mutations (lon and ompT) allow intracellular accumulation of
heterologous proteins (i.e., proteins derived from species or cell types different
from the host) at a high rate while minimizing protein degradation during
purification.
4 – 12 ºC
pFLAG-ATS™ Expression Vector Bacterial vector for periplasmic expression of N-terminal FLAG fusion proteins
Sistema de Expressão bacteriano - pET
BL21(DE3)
Induce lac promoter with IPTG
T7 RNA polymerase
Gene product
Chromosome
Cloned gene
T7 promoter
pET plasmid
Gene for T7 RNA
polymerase
lac operator
lac promoter
lacl
Citoplasma Meio
Membrana Externa Membrana Interna
Periplasma
+ Secreção
Secreção
A)Proteínas Citoplasmáticas
B)Secreção de Proteínas
Met
Precipita Proteína Nativa Degrada
Precipita Degrada
Seqüência Sinal
Precipita ou
degrada
Lise celular: SONICAÇÂO
Figura 1 – Eletroforeses SDS-PAGE (12,5%) da expressão e purificação da proteína recombinante TrEH2, em E. coli BL21. (1) Amostra de 20 µL da bactéria não induzida; (2) Amostra de 20 µL da bactéria induzida com 0,5 mM de IPTG; (3) Amostra de 20 µL do precipitado do lisado bacteriano (não solúvel); (4) Amostra de 20 µL do sobrenadante do lisado bacteriano (solúvel); (5) Amostra de 20 µL das frações coletadas após a purificação. (PM) peso molecular BenchMark protein ladder (Invitrogen).
PM
Purificação
Histidine-tagged proteins are commonly purified using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)
https://www.gelifesciences.com/
DOI: 10.1039/C5TB02505B - J. Mater. Chem. B, 2016,4, 1960-1967
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Etapas de Purificação
1 2 3 Q-Sepharose Phenyl Chromatofocus Mono-Q
1-Periplasma 2-Preparação Anterior 3-Controle
Sítios de múltipla clonagem no Vetor de expressão pTRC-His
Ensaio de Atividade Enzimática
Product name Protein type Application Company
Adagen (Adenosine deaminase )
An enzyme Severe combined immunodeficiency
disease (SCID)
Enzon
Genotropin (Recombinant growth
hormone)
A hormone Growth hormone deficiency (GHD) in
children
Pharmacia & Upjohn
Humalog (Recombinant human insulin)
A hormone Diabetes Eli Lilly
Nabi-HB (Anti-Hepatitis B)
An antibody Hepatitis-B Nabi
Novo Seven (Recombinant
coagulation factor VIIa)
A modified factor Hemophillia patients with inhibitors
Novo Nordisk
Ontak (Diphtheria toxin-interleukin-2)
A fusion protein Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)
Ligand Pharmaceuticals
Roferon-A (Recombinant interferon alfa-2a)
A modifier Hairy cell leukemia or AIDS-related Kaposi's
sarcoma
Hoffmann-La Roche
Proteínas Humanas produzidas pela tecnologia de DNA recombinante
Proteína Doença α1-antitrypsin Emphysema B-cell growth factors Immune disorders Epidermal growth factors Burns Erythropoyetin Anemia, kidney disorders Factor VIII, Factor IX Hemophilia Growth Hormone Growth defects Insulin Diabetes